FI115528B - Menetelmä rekombinanttisen, liukoisen tyypin I komplementtireseptorimolekyylin puhdistamiseksi - Google Patents

Description

115528

Menetelmä rekombinanttisen, liukoisen tyypin I komplementtireseptorimole-kyylin puhdistamiseksi Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta 904842.

5 35 U.S.C. § 202:n edellyttämällä tavalla ilmoitetaan, että Yhdysvaltain hallituksella on tiettyjä oikeuksia tähän keksintöön, joka tehtiin osittain laitoksesta National Institutes of Health saadulla rahoituksella.

1 Johdanto Tämä keksintö liittyy menetelmään C3b/C4b-reseptori (CR1) proteiinin puhdistami-10 seksi. Tämä keksintö mahdollistaa CRl-proteiinin ja sen fragmenttien ilmentämisen. CR1-nukleiinihapoilla ja -proteiineilla on käyttöä sellaisten sairauksien diagnoosissa tai hoidossa, joihin liittyy komplementtiaktiivisuutta, sekä useissa tulehdussairauksissa ja immuunijärjestelmän sairauksissa.

2 Keksinnön tausta 15 2.1 Komplementtijärjestelmä

Komplementtijärjestelmä on proteiiniryhmä, joka muodostaa noin 10 prosenttia ih- I · ; : ·’ misen normaalin seerumin proteiineista (Hood, L. E. et ai. (1984) Immunology, '·’ toinen painos, Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, California, s. 339).

: · Komplementilla (C) on tärkeä osuus immuuni- ja allergisten reaktioiden välittäjänä : 20 (Rapp, H. J. ja Borsos, T, (1970) Molecular Basis of Complement Action, Appleton-

Century-Crofts (Meredith), New York). Komplementin komponenttien aktivaatio * 1 · johtaa siihen, että muodostuu ryhmä tekijöitä, joihin kuuluu kemotaktisia peptidejä, * t t joiden välityksellä komplementista riippuviin sairauksiin liittyvä tulehdus tapahtuu. : , Komplementtireaktiosarjan vaiheittainen aktivaatio voi tapahtua klassista reaktiotie- 25 tä, johon antigeeni-vasta-ainekompleksit ottavat osaa, tai vaihtoehtoista tietä, johon liittyy tiettyjen solunseinän polysakkaridien tunnistaminen. Aktiivisuuksiin, joissa I · i • '. ·' aktivoidut komplementtiproteiinit toimivat välittäjinä, kuuluvat kohdesolujen hajo- : : tus, kemotaksia, opsonisointi, verisuonten ja muiden sileiden lihassolujen stimu- ’,; lointi, ja toiminnalliset häiriötilat, kuten syöttösolujen degranulaatio, pienten veri- . 30 suonten läpäisevyyden lisääntyminen, leukosyyttien ohjautuminen ja B-lym- > k 2 115528 fosyyttien ja makrofagien aktivaatio (Eisen, H. N. (1974) Immunology, Harper & Row Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland, s. 512).

Proteolyyttisen reaktiosarjan aikana vapautuvat biologisesti aktiiviset peptidifrag-mentit, anafylatoksiinit C3a, C4a ja C5a (ks. WHO Scientific Group (1977) WHO 5 Tech. Rep. Ser. 606:5 ja tässä siteeratut viitteet), kolmannesta (C3), neljännestä (C4) ja viidennestä (C5) natiivista komplementin komponentista (Hugh, T. E., (1981) CRC Crit. Rev. Immunol. 1, 321, Bult, H. ja Herman, A.G., (1983) Agents Actions 13, 405).

2.2 Komplementtireseptori C3b/C4b (CR1) 10 Ihmisen C3b/C4b-reseptori, jota nimitetään CRl .ksi, esiintyy erytrosyyteissä, mo-nosyyteissä/makrofageissa, granulosyyteissä, B-soluissa, joissakin T-soluissa, pernan imukerästen dendriittisoluissa ja munuaiskeräsen podosyyteissä (Fearon, D. T., (1980) J. Exp. Med. 152, 20, Wilson, J. G. et ai., (1983) J. Immunol. 135, 684, Reynes, M. et ai., (1985) J. Immunol. 135, 2687, Gelfand, M. C. et ai., (1976) N. 15 Engl. J. Med. 295, 10, Kazatchkine, M.D. et ai., (1982) Clin. Immunol. Immunopathol. 27, 170). CR1 sitoo spesifisesti C3b:tä, C4b:täjaiC3b:tä. Plasmassa on havaittu tämän reseptorin liukoinen muoto, jolla on samanlainen ligandia sitova aktivisuus kuin kalvoon liittyneellä CRl:llä (Yoon, S. H. ja Fearon, D. T., (1985) J' Immunol. 134, 3332). CR1 sitoo C3b:tä ja C4b:tä, jotka ovat liittyneet kovalentti-20 sesti immuunikomplekseihin ja muihin komplementin aktivaattoreihin ja näiden vuorovaikutusten seuraukset riippuvat siitä solutyypistä, jossa reseptori on (Fearon, D. T. ja Wong, W. W., (1983) Ann. Rev. Immunol. 1, 243) Erytrosyyttien CR1 : sitoo immuunikomplekseja niiden kuljettamiseksi maksaan (Comacoff, J. B. et ai., 1 (1983) J. Clin. Invest. 71, 236 ja Medof, M.E. et ai., (1982) J. Exp. Med. 156, \ 25 1739). Sitoutuneet kompleksit siirtyvät solun sisälle neutrofiileissä ja monosyyteissä , · olevan CRl :n toimesta joko adsorptiivisella endosytoosilla peitteisten kuopakkeiden !kautta (Fearon, D. T. et ai., (1981) J. Exp. Med. 153, 1615 ja Abrahamson, D.R. ja • _ ;;; Fearon, D. T., (1983) Lab. Invest. 48, 162) tai fagosytoosilla reseptorien aktivaation ···’ jälkeen forboliestereillä, kemotaktisilla peptideillä tai solunulkoisessa matriisissa 30 esiintyvillä proteiineilla kuten fibronektiini ja laminiini (Newman, S. L. et ai., ’...· (1980) J. Immimol. 125, 2236, Wright, S. D. ja Silverstein, S. C., (1982) J. Exp.

\‘j Med. 156, 1149 ja Wright, S. D. et ai., (1983) J. Exp. Med. 158, 1338). CRl:n fosforylaatiolla voi olla osuutta fagosyyttisen aktiivisuuden syntymiseen (Chan-gelian, P. S. ja Fearon, D. T., (1986) J. Exp. Med. 163, 101). B-lymfosyyteissä I · 35 olevan CRl:n toiminta tunnetaan huonommin, vaikkakin näiden solujen käsittely • · · • · 115528 3 CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-aineella vahvisti niiden vastetta kermesmaijan mitogeenille (Daha, M. R. et ai., (1983) Immunobiol. 164, 227 (Abstr.). Imukeräsen dendriittisoluissa olevan CRl:n osuus voi olla toiminta antigeenin esittäjänä (Klaus, G.G.B., et ai., (1980) Immunol. Rev. 53, 3).

5 CR1 voi myös inhiboida C3/C5-konvertaasien klassista reaktiotietä ja toimia kofak-torina tekijän 1 suorittamassa C3b:n ja C4b:n pilkkomisessa, mikä viittaa siihen, että CRl:llä on myös komplementtia sääteleviä toimintoja sen lisäksi, että se toimii myös reseptorina (Fearon, D. T., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 5867 ja Iida, K. ja Nussenzweig, V., (1981) J. Exp. Med. 153, 1138). Komplementin akti-10 vaation vaihtoehtoisessa reaktiotiessä bimolekulaarinen C3b, Bb -kompleksi on C3:a aktivoiva entsyymi (konvertaasi). CR1 (ja korkeammissa pitoisuuksissa tekijä H) voi sitoa C3b:tä ja myöskin edistää C3b, Bb:n dissosiaatiota. Lisäksi C3b, CRl:n (ja C3b, H:n) muodostuminen tekee C3b:n alttiiksi tekijän I toimesta tapahtuvalle palautumattomalle proteolyyttiselle inaktivaatiolle, jonka tuloksena on inaktivoitunut 15 C3b (iC3b). Komplementin aktivaation klassisessa reaktiotiessä kompleksi C4b, 2a on C3-konvertaasi. CR1 (ja C4:ää sitova proteiini, C4bp, esiintyessään korkeahkoissa pitoisuuksissa) voi sitoutua C4b:hen ja myöskin edistää C4b, 2a:n dissosioitumis-ta. Tämä sitoutuminen tekee C4b:n alttiiksi tekijän I toimesta tapahtuvalle palautumattomalle proteolyyttiselle inaktivaatiolle niiden pilkkoutuessa C4c:ksi ja C4d:ksi 20 (inaktivoidut komplementtiproteiinit).

CR1 on yhdestä polypeptidiketjusta koostuva glykoproteiini. On löydetty neljä CRl:n allotyyppistä muotoa, jotka eroavat molekyylipainoltaan -40 000-50 000 daltonin suuruisten lisäosien verran. Kahdella yleisimmällä muodolla, F- ja S-allo-': · tyypillä, joita nimitetään myös A- ja B-allotyypeiksi, on 250 000:n ja 290 000:n 25 suuruinen molekyylipaino (Dykman, T. R. et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei: · U.S.A. 80, 1698 ja Wong, W. W. et ai., (1983) J. Clin. Invest. 72, 685), tässä jäqes- : ’·: tyksessä mainittuna, ja kahdella harvinaisemmalla muodolla on 210 000:n ja >290 000:n suuruiset molekyylipainot (Dykman, T. R. et ai., (1984) J. Exp. Med. 159, 691 ja Dykman, T. R. et ai., (1985) J. Immunol. 134, 1787). Nämä eroavuudet 30 edustavat ilmeisesti pikemminkin CRl:n polypeptidiketjussa kuin glykosylaatio-···. tilassa esiintyviä vaihteluja, koska ne eivät hävinneet puhdistetun reseptoriproteii- niin käsittelyssä endoglykosidaasi F:llä (Wong, W. W. et ai., (1983) J. Clin. Invest 72, 685) ja ne havaittiin, kun reseptorin allotyyppejä biosyntetisoitiin tunikamysii-nin läsnäollessa (Lublin, D. M. et ai., (1986) J. Biol. Chem. 261, 5736). Kaikilla ·:··: 35 neljällä CRl-allotyypillä on C3b:tä sitovaa aktiivisuutta (Dykman, T. R. et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, 1698, Wong, W. W. et ai., (1983) J. Clin.

» » · 1 · 115528 4

Invest. 72, 685, Dykman, T. R. et al., (1984) J. Exp. Med. 159, 691 ja Dykman, T.R. et al., (1985) J. Immunol. 134, 1787).

Kahden CRl-cDNA:n restriktiofragmentin, jotka eivät olleet toistensa suhteen limittäin, osoitettiin ristiinhybridisoituvan olosuhteiden ollessa hyvin rajoittavat (Wong 5 W. W. et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711). Molemmat cDNA-koettimet hybridisoituivat myös useisiin genomin DNA:n restriktiofragmentteihin, joista useimmat olivat yhteisiä molemmille koettimille (id.). CRlissä olevien toistuvien koodaavien jaksojen olemassaolo vahvistettiin sekvenssejä vertaamalla (Klickstein, L.B. et al., (1985) Complement 2, 44 (Abstr.)). Lisäksi CRl:n on osoi-10 tettu omaavan toistuvia välijaksoja osoittamalla, että genomista peräisin oleva koetin hybridisoituu ristiin useiden sellaisten genomin restriktiofragmenttien kanssa, joista koodaavat jaksot puuttuvat (Wong, W. W. et al., (1986) J. Exp. Med. 164, 1531). Koehenkilöllä, jolla oli suurempi S-allotyyppi, oli lisäksi yksi tähän genomikoet-timeen hybridisoituva ylimääräinen restriktiofragmentti F-allotyypin koehenkilöstä 15 saatuun DNA:han verrattuna, joka viittaa siihen, että suurempimolekyylipainoisen CRl-alleelin kyseessäollessa oli tapahtunut genomijaksojen duplikaatio (id.).

CRl:n on osoitettu omaavan homologiaa komplementtireseptorityypille 2 (CR2) (Weiss, J. J. et al., (1986) Proc. Nad. Acad. Sei. U.S.A. 83, 5639-5643).

2.3 CRl:n epänormaali käyttäytyminen ihmisessä esiintyvissä sairauksissa 20 Havaintoja systeemistä punahukkaa (SLE) sairastavien potilaiden erytrosyyteissä olevan CRl:n ilmentymisen alenemisesta ovat raportoineet tutkijat, jotka ovat peräisin useilta eri maantieteellisiltä alueilta mukaan lukien Japani (Miyakawa, et al., " (1981) Lancet 2, 493-497 ja Minota et al., (1984) Arthr. Rheum. 27, 1329-1335),

Yhdysvallat (Iida et al., (1982), J. Exp. Med. 155, 1427-1438) ja Wilson et al., :· ; 25 (1982) N. Engl. J. Med. 307, 981-986) ja Eurooppa (Walport, et al., (1985) Clin.

Exp. Immunol. 59, 547, Jouvin, et al., (1986) Complement 3, 88-96), Holme et al., (1986) Clin. Exp. Immunol. 63, 41-48). Kokonaisuutena otettuna näillä potilailla on keskimääräinen reseptorien lukumäärä solua kohti sellainen, että se on 50-60 % normaalin populaation vastaavasta määrästä. Yhdessä ensimmäisistä raporteista esitet-: ’' 1: 30 tiin se huomio, että erytrosyyteissä oleva CRl-luku vaihteli kääntäen verrannollises- . 1 · ’. ti sairauden aktiivisuuteen siten, että lukumäärä oli pienimmillään SLE:n pahimpien * · · • , vaiheiden aikana ja korkeampia lukumääriä havaittiin sairauden uudelleen puhkea- » »· t · misten aikoihin samassa potilaassa (Iida et al. 1982, J. Exp. Med. 155, 1427-1438). ‘ 1 CRl-luvun on myös havaittu korreloivan kääntäen immuunikompleksien seerumi- ; 35 tasojen suhteen, C3d:n seerumitasojen suhteen ja erytrosyytteihin liittyneen C3dg:n • · 115528 5 määrien suhteen, jotka ehkä heijastavat komplementtia aktivoivien immuunikomp-leksien ottoa solun sisään ja niiden siirtymistä erytrosyytin pinnalle "viattomina sivustakatsojina" (Ross et ai., (1985) J. Immunol. 135, 2005-2014, Holme et ai., (1986) Clin. Exp. hnmunol. 63, 41-48 ja Walport, et ai., (1985) Clin. Exp. 5 Immunol. 59, 547). SLE:n saaneella potilaalla, jolta puuttui erytrosyyteissä oleva CR1, havaittiin muodostavan vasta-ainetta omaa CRl:tä vastaan (Wilson, et ai., (1985) J. Clin. Invest. 76, 182-190.

CRl:tä vastaan syntyvän vasta-aineen tiitterien aleneminen tapahtui samanaikaisesti potilaan kliinisen tilan paranemisen kanssa ja tähän liittyi reseptorien epänormaalin 10 tilan osittainen palautuminen. CR1 :tä vastaan muodostuvaa vasta-ainetta on havaittu kahdessa muussa SLE-potilaassa (Cook, et ai., (1986) Clin. Immunol. Tmmuno-pathol. 38, 135-138). Äskettäin osoitettiin erytrosyyttien CRl:n hankittu häviäminen olosuhteissa, joissa esiintyi aktiivinen SLE ja hemolyyttinen anemia, siten, että seurattiin reseptorien nopeata häviämistä verensiirrossa siirretyistä erytrosyyteistä 15 (Walport et ai., (1987) Clin. Exp. Immunol. 69, 501-507).

CRl:n suhteellinen häviäminen on myös havaittu potilaissa, joilla on ihmisen im-muunipuutostautivirus (HTV) -infektioita (Tausk, F. A. et ai., (1986) J. Clin. Invest. 78, 977-982) ja kyhmyisessä spitaalissa (Tausk, F. A. et ai., (1985) J. Invest. Dermat. 85, s. 58-61).

20 Komplementtireseptorin ilmentymisen epänormaalit muodot SLE:ssä eivät rajoitu erytrosyyttien CRl:een. SLE-potilaiden neutrofiilien solussa esiintyvän kokonais-CRl:n ja B-lymfosyyttien solukalvon CRl:n suhteen on havaittu esiintyvän suh-.. ; teellistä niukkuutta (Wilson et ai., (1986) Arthr. Rheum. 29, 739-747).

Potilaissa, joilla on tyypin IV SLE-nefriitti, katoaa podosyyteistä kaikki havaitta-: * ; 25 vissa oleva CRl-antigeeni, kun taas vähemmän vakavissa SLE-nefnittimuodoissa ja '· sellaisissa etenevissä nefriittimuodoissa, jotka eivät ole SLE-tyyppisiä, mukaan luet- tuna tyypin I ja Π membraaniproliferatiivinen glomerulonefriitti, CRl:n ilmentymi-: ,.: nen munuaiskeräsen podosyyteissä ei eroa normaalista (Kazatchkine et ai., (1982) J.

Clin. Invest. 69, 900-912, Emancipator et ai., (1983) Clin. Immunol. Immunopathol.

; 30 27, 170-175). Potilailla, joilla on tyyppiä IV oleva SLE-nefriitti, ei kuitenkaan erytrosyyttien CRl-lukumäärä ole pienempi kuin SLE-potilailla, joilla on muun ‘ . tyyppinen munuaislupus tai joilla ei ole ollenkaan nefriittiä (Jouvin et ai., (1986)

Complement 3, 88-96).

OMI • · * • 115528 6

Komplementin in vivo -aktivaatio säätelee CRL.n ilmentymisen laukeamista neutro-fiilisolujen solukalvossa (Lee, et ai., (1984) J. Clin. Exp. Immunol. 56, 205-214, Moore, F. D. Jr. et ai., (1986) N. Engl. J. Med. 314, 948-953).

3 Keksinnön yhteenveto 5 Tämä keksintö liittyy C3b/C4b-reseptori (CR1) -proteiinin ja sen fragmenttien ilmentämiseen. Tämän keksinnön mukaisesti saaduilla proteiineilla on käyttöä sellaisten sairauksien diagnoosissa tai hoidossa, joihin liittyy komplementtiaktiivi-suutta, sekä useissa tulehdussairauksissa ja immuunijärjestelmän sairauksissa.

Tämän keksinnön mukaisissa spesifisissä sovellutusmuodoissa, jotka esitetään yksilö tyiskohtaisesti esimerkkijaksossa, kuvataan täyspitkän CRl-cDNA:n ja sen fragmenttien kloonaus, nukleotidijakso ja siitä johdettu aminohappojakso. Kuvataan myös CR1-proteiinin ja sen fragmenttien ilmentäminen. On kyetty ilmentämään CR1-proteiinia ja sen fragmentteja, jotka sitovat C3b:tä ja/tai C4b:tä ja joissa esiintyy tekijän I kofaktoriaktiivisuutta.

15 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit esitetään oheisissa patenttivaatimuksissa.

Esimerkeissä kuvataan myös liukoisen CR1-proteiinin tuotto ja puhdistus, joiden molekyylien osoitetaan olevan terapeuttisesti käyttökelpoisia tulehdusreaktioiden : ’ : hoidossa ja pienentämään sydäninfarktin kokoa ja estämään perfuusion palautumis- ·:··· vaurio.

• · :20 3.1 Määritelmät • · • · • ·

Ad2 MLP = adenovirus 2:n myöhäinen pääpromoottori • · · C = komplementti • · · C3(ma) = metyyliamiinilla käsitelty C3 .·. ; C4bp = C4:ää sitova proteiini :./25 CMV = sytomegalovirus ·;* CR1 = tyypin 1 komplementtireseptori, ·".·/ C3b/C4b-reseptori CR2 = tyypin 2 komplementtireseptori DCFDA = dikloorifluoreskeiinidiasetaatti .30 HPLC = korkeasuoritteinen nestekromatografia 115528 7 iC3b = inaktivoitu C3b LHR = pitkä homologinen toistojakso mAb = monoklonaalinen vasta-aine PAGE = polyakryyliamidigeelielektroforeesi 5 RPAR = käänteinen passiivinen Arthrus-reaktio SCR = lyhyt konsensus-toistojakso sCRl = liukoinen CRl-molekyyli 4 Kuvien selitys

Kuva 1. CRl:n koko koodaavan alueen nukleotidi- ja aminohappojaksot. Jakso 10 alkaa ensimmäisestä nukleotidistä, joka on EcoRl-kytkijäjakso-oktameerin jälkeen kloonissa λΤ 109.1. Tämän jakson nukleotidi numero 1531 on kuvassa 3 esitetyn jakson nukleotidin numero 1 ensimmäinen 5'-puoleinen nukleotidi. Kuvassa on esitetty lähetti-RNA:ta vastaava nauha, jonka alla esitetään siitä johdettu aminohappo-jakso. Ehdolla oleva signaalijakso, jota koodaavat nukleotidit n:o 28-147 on esitetty 15 suluissa.

Kuva 2. Restriktiokartta ihmisen CRl-cDNA:n 5,5 keistä. Musta palkki tarkoittaa cDNAita, restriktiokohdat ovat: H: Hind ΙΠ, B: BamH I, R: EcoR I, P: Pst I, A: Apa I, S: Sac I, G: Bgl Π, K: Κρη I. Ne cDNA-kloonit, joista jakso oli johdettu, esitetään kartan alapuolella. Nuolet osoittavat dideoksinukleotidiketjun terminaatiomenetel-20 mällä suoritetun sekvensointianalyysin suunnan ja pituuden. cDNA-kloonit orientoitiin restriktiokarttojen ja jaksojen limittäisen identiteetin perusteella.

Kuva 3. Ihmisen CRl-cDNA:n 5,5 kein muodostama nukleotidijakso. Kuvassa esi- 1 ‘ ; tetään lähetti-RNA:ta vastaava nauha ja emäs numero 1 (vastaa kuvan 1 emäsnume- roa 1532) on ensimmäinen emäs EcoRI-kytkijäjakson jälkeen 5’-suunnassa äärim- : · 25 mäisessä olevassa asemassa kloonissa. Pysäytyskodoni on alleviivattu. Kehystettynä » · i oleva 110 ep:n jakso löydettiin nukleotidien 147 ja 148 välistä (nuoli) ja sen usko- : : taan edustavan osaa välijaksosta.

Kuva 4. Pistematriisianalyysi ihmisen CRl-cDNA:n 5,5 ke:n muodostamasta nuk-leotidijaksosta. Piste tulostettiin, jos ainakin 40 emästä 90:stä sopi yhteen. Tumma 30 neliön kulmittain lävistävä ja puolittava viiva osoittaa jakson identiteettiä itsensä kanssa. Kaksi muuta yhdensuuntaista tummaa viivaa l,35:n ja 2,7:n ke:n etäisyy-:’! dellä identiteettiviivasta edustavat kahta peräkkäistä, pitkää homologista toistuma- ·:··: jaksoa (LHR:ää), jotka kumpikin ovat 1,35 ke:n suuruisia. Kuusi vaaleampaa pilk- *. kuviivaa kahden LHR:n välissä vastaavat lyhyitä, ~0,2 kein konsensus-toistumajak- 8 115528 soja. Lyhyet konsensus-toistumajaksot (SRC:t) ulottuvat 0,4 ke pitkien homologisten toistumajaksojen ulkopuolelle.

Kuva 5. Ihmisen CRl:n johdettu aminohappojakso. Kukin ryhmä esitetään yksikirjaimisella merkintätavalla (Lehninger A. L., (1975) Biochemistry 2. painos, Worth 5 Publishers, Inc. New York, s. 72). Pitkissä homologisissa toistumajaksoissa olevat ryhmät on asetettu toistensa suhteen samaan kohtaan niiden homologian kuvaamiseksi. Kaikki LHR-B:ssä olevat ryhmät on esitettyjä LHR-C:n ja LHR-D:n suhteen mainitaan vain ne ryhmät, jotka poikkeavat LHR-B:ssä olevista ryhmistä. Hydro-paattisuusprofiili on ryhmitetty proteiinin COOH-terminaalisesta päästä tämän ala-10 puolelle otaksutun kalvon läpäisevän alueen kuvaamiseksi. Välittömästi hydrofobisen alueen jälkeen tuleva alue, jossa on neljä positiivisen varauksen omaavaa ryhmää, on merkitty näiden päällä olevalla viivalla. Epidermaalisessa kasvutekijä-reseptorissa olevan proteiinikinaasi C:n fosforylaatiokohdan suhteen 67-prosentista homologiaa osoittava, kuudesta aminohaposta koostuva alue on alleviivattu. Jakson 15 yläpuolella on esitetty kaavio CRl-proteiinista. (TM) kalvon läpäisevä alue, (Cyt) sytoplasmassa oleva alue, (3TJT) translaatioon osallistumaton 3'-alue.

Kuva 6. (A) CRl:n SCR-alueiden ryhmittyminen toistensa suhteen. Toistumajaksot on merkitty numeroilla 1-23, jotka alkavat NH2-terminaalisesta päästä ja päättyvät COOH-terminaaliseen päähän. Tyhjiä välejä on lisätty ryhmittymisen maksimoimi-20 seksi. Suorakaiteet edustavat muuttumattomia ryhmiä ja pystysuuntaiset nuolet osoittavat säilyvien aminohappojen esiintymisen. Ryhmän katsotaan olevan säilynyt, jos se tai sen säilyttävästi tapahtunut korvautuminen esiintyy ainakin puolessa SRC-alueista. Poikkisuuntainen nuoli merkitsee sellaista SCRrää, joka sekvensoitiin : myös CRl:n genomista valmistetusta kloonista 2.38 ja se on yhden eksonin koodaa- ' : 25 ma. (B) Genomista saadun kloonin -2.38 restriktiokartta, sekvensointistrategia ja \ ositttainen jakso. Restriktiokohdat ovat: (B) BamH I„ (S) Sac I, (E) Eco RV, (K) : .: Κρη I ja (P) Pst I. Poikkisuuntainen nuoli osoittaa sekvensoinnin suunnan ja sen ’: kattaman alueen ja pystysuuntaiset nuolet osoittavat eksoni-introni -rajakohtia.

•

Kuva 7. SCR-jaksojen konsensusjakson ryhmittyminen proteiineissa, joissa tiede-30 tään olevan tämä rakenne. Tyhjiä välejä lisättiin ryhmittymisen maksimoimiseksi.

• Ryhmän katsottiin olevan säilynyt kuvan 5 yhteydessä käytetyllä tavalla paitsi « * ’ .silloin, kun kyseessä ovat ainoastaan yhden tai kaksi SCR-jaksoa omaavat proteiinit, . ..: joissa ryhmä on säilynyt, jos se esiintyy ainakin puolessa muista proteiineista.

,.,.: Poikkiviivat vastaavat säilymättömiä kohtia. Alleviivatut CR2:n ja C2b:n osa-alueet 35 tarkoittavat sitä, että näille proteiineille ei ole tästä alueesta julkaistu sekvenssi- I · · • I » I · 115528 9 tietoa. Suorakaiteet tarkoittavat muuttumattomia kysteiinipuolikkaita. Sekvenssin oikeanpuoleinen numero tarkoittaa niiden SCR-jaksojen määrää, jota käytettiin konsensus-jakson muodostamiseksi. Proteiinien lyhenteet ja konsensus-sekvenssien määrittämiseen käytettyjen sekvensointitulosten kirjallisuusviitteet ovat: (CR1) tyy-5 pin 1 komplementtireseptori, (H), H-tekijä (Kristensen, T. et ai., (1986) J. Immunol. 136, 3407, (C4bp) C4:ää sitova proteiini (Chung, L. P. et ai., (1985) Biochem. J. 230, 133), (CR2) tyypin 2 komplementtireseptori (Weis, J. J. et ai., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83, 5639), (Ba) B-tekijän proteolyyttinen fragmentti (Morley, B. J. ja Campbell, R.D., (1984) EMBO J. 3, 153), (C2b) C2:n pro-10 teolyyttinen fragmentti (Gagnon, J., (1984) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 306, 301), (Clr) Cl:n r-alayksikkö (Leutys, S.P. et ai., (1986) Biochemistry 25, 4633), (P2GP1) p2-glykoproteiini I (Lozier, J. et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. 81, 3640), (Hap) haptoglobiini (Kurosky et ai., (1980) Proc. Nad. Acad. Sei. U.S.A. 77, 3388), (IL-2-R) interleukiini-2 -reseptori (Leonard, W. J. et ai., (1985) 15 Science 230, 633). Asteriski tarkoittaa sitä, että saatavilla oleva jakso on epätäydellinen.

Kuva 8. Kaavioihmisen CRl:n ehdotetusta rakenteesta. COOH-terminaalinen sytoplasmassa oleva alue on lipidikaksoiskerroksen oikealla puolella. 30 SCR-jaksoa on järjestetty lineaarisesti solukalvon solunulkoisella puolella. Hakasulut tarkoittavat 20 LHR-jaksoja. Sisäkuva on suurennus yhdestä SCR-jaksosta kolminkertaisen mutka-rakenteen valaisemiseksi.

Kuva 9. Ihmisen CRl:tä koodaavan plasmidin pBSABCD:n liittymäjakson restrik-tiokartta. Suorakaiteen rajoittamalla alueella, joka käsittää koodaavan jakson sisäl-:: : tävän alueen, on osoitettu yhdeksän fragmenttia kahdeksasta cDNA-kloonista, jotka , ; : 25 liitettiin yhteen ligaasireaktiolla CRl-konstruktion muodostamiseksi. Hakasulut ; osoittavat LHR-A:n, -B:n, -C:n ja -D:n asemat, tässä järjestyksessä mainittuna.

: Suorakaiteen alla olevat viivat edustavat uusia 5'-puoleisia cDNA-klooneja. Restrik- tiokohdat ovat: A, Apa I, B, B, BamH I, G, Bgl Π, H, Hind ΙΠ, K, Κρη I, M, Bsp '. Mil, P, Pst I, R Eco Rl ja S, Sac I.

30 Kuva 10. LHR-A:n seitsemää SCR-jaksoa koodaavien 5'-puoleisten cDNA-kloo-,nien johdettu aminohappojakso ja tämän jakson ryhmittely LHR-B:n, -C:n ja -D:n vastaavien SCR-jaksojen suhteen. Neljä kysteiiniä, jotka ovat säilyviä ryhmiä kus-sakin SCR-jaksossa, on alleviivattu. LHR-B:n, -C:n ja -D:n ollessa kyseessä esite-.,.: tään ryhmä vain siinä tapauksessa, että se poikkeaa LHR-A:ssa olevasta ryhmästä.

j * · »»* t * 115528 ίο

Kuva 11. Hmentämisplasmidien piABCD ja pMTABCD restriktiokartat. Pihmt ja Pcmv tarkoittavat hiiren metaUotioneiinin promoottoria ja sytomegaloviruksen esi-varhaista promoottoria tässä järjestyksessä mainittuna.

Kuva 12. piABCD:llä (paneelit aja b) ja pelkällä CDM8-vektorilla (paneelit c ja d) 5 transfektoitujen ja epäsuorasti monoklonaalisella YZ-1 CRl-vasta-ainetta vastaan valmistetulla vasta-aineella ja fluoreskeiinilla leimatulla vuohen hiiren F(ab')2:ta vastaan valmistetulla vasta-aineella värjättyjen COS-solujen faasikontrastianalyysi (paneelit a ja c) ja immunofluoresenssimikroskooppianalyysi (paneelit b ja d), tässä jäijestyksessä mainittuna.

10 Kuva 13. Yhdistelmä-CRl:tä ilmentävien COS-solujen C3b:tä ja C4b:tä sitovan aktiivisuuden analyysi. piABCD:llä (paneelit a ja c) tai pelkällä CDM8-vektorilla (paneelit b ja d) transfektoidut COS-solut inkuboitiin EAC4b(lim),3b:n (paneelit a ja b) tai EAC4b:n (paneelit c ja d) kanssa ja niistä tutkittiin rosettien muodostus faasikontrastimikroskoopilla.

15 Kuva 14. Transfektoitujen COS-solujen ilmentämän yhdistelmä-CRl:n analyysi SDS-PAGE:lla. Pelkällä CDM8-vektorilla (kanavat 1 ja 4) ja piABCD:llä (kanavat 2 ja 5), tässä järjestyksessä mainittuna, transfektoidut COS-solut ja CRl:n F-ja S-al-lotyypit omaavalta koehenkilöltä saadut erytrosyytit (kanavat 3 ja 6) leimattiin pinnastaan 125I:llä. Näiden solujen detergenttilysaateille suoritettiin immuuniadsorptio 20 Sepharose-UPC 10:llä (kanavat 1-3) ja Sepharose-YZ1 :llä (kanavat 4-6) ja eluaatit analysoitiin SDS-PAGE:lla pelkistämättömissä olosuhteissa ja autoradiografisesti.

, Kuva 15. I-C3(ma):n pilkkoutuminen tekijällä I immuuni-immobilisoidun yhdis- * j 125 telmä-CRl:n läsnäollessa. Rinnakkaiset I-C3(ma)-näytteet käsiteltiin tekijällä I tekijän H läsnäollessa (kanava 1), pelkällä CMD8-vektorilla transfektoitujen COS- » • 25 solujen lysaatin kanssa esi-inkuboidun Sepharose-UPC 10:n läsnäollessa (kanava 2), : piABCD:llä transfektoitujen COS-solujen lysaatin kanssa esi-inkuboidun Sepharo- se-UPC10:n läsnäollessa (kanava 3) CDM8:lla transfektoitujen COS-solujen lysaatin kanssa esi-inkuboidun Sepharose-YZl:n läsnäollessa (kanava 4) ja piABCD:llä transfektoitujen COS-solujen lysaattien kanssa esi-inkuboidusta Sepharose-YZ-l:stä 30 koostuvien 6 μ1:η (kanava 5), 12 μ1:η (kanava 6) ja 25 μ1:η (kanava 7) erien läsnä- *: ollessa. Näytteitä I:llä leimatusta C3(ma):sta käsiteltiin myös tekijän I puuttuessa • • , 25 pl:lla Sepharose-YZl:tä, joka oli esi-inkuboitu piABCD:llä transfektoitujen COS-solujen lysaatin kanssa (kanava 8). Pelkistyksen jälkeen 125I-C3(ma) analysoi-' ‘ tiin SDS-PAGE:lla ja autoradiografialla.

t » · « * * > · * • M IM 1 · 115528 π

Kuva 16. CRl-deleetiomutantteja koodaavat cDNA-konstruktiot. Neljää LHR:ää koodaavien cDNA-segmenttien asemat on osoitettu täyspitkän piABCD-konstruk-tion yllä olevien hakasulkujen avulla ja jossa on esitetty deleetiomutanttien valmistukseen käytetyt restriktiokohdat. Kuhunkin mutanttiin jäävät cDNA-restriktiofrag-5 mentit on osoitettu yhtenäisillä viivoilla. Restriktiokohdat ovat: A, Apa I, B, Bsm I, E, Bst ΕΠ ja P, Pst I.

Kuva 17. CRl:n yhdistelmädeleetiomutanttien vertailu CRl:n F-ja S-allotyyppei-hin. Detergenttilysaateille, jotka oli saatu I25I:llä pinnasta leimatuista erytrosyyteistä (kanavat 1 ja 7) ja COS-soluista, jotka on transfektoitu pelkällä CMD8-vektorilla 10 (kanavat 2 ja 8), piABCD:llä (kanavat 3 ja 9), piBCDillä (kanavat 4 ja 10), piCDillä (kanavat 5 ja 11), piDillä (kanavat 6 ja 12), tässä järjestyksessä suoritettuna, suoritettiin immuunisaostus levaania vastaan valmistetulla Sepharose-UPCIO -vasta-aineella (kanavat 1-6), CRl:tä vastaan valmistetulla monoklonaalisella Sepharose-YZl-vasta-aineella (kanavat 7-11) ja kanin CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-15 aineella ja Sepharose-proteiini-A:lla (kanava 12), tässä järjestyksessä suoritettuna. Eluaateille suoritettiin SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa sekä autoradiografia.

Kuva 18. I-C3(ma):n pilkkoutuminen tekijällä I COS-solujen läsnäollessa, jotka ilmentävät kokonaista CRlitä ja sen deleetiomutantteja. Rinnakkaiset 125I-C3(ma) -näytteet inkuboitiin sellaisten COS-solujen kanssa, jotka on transfektoitu pelkällä 20 CMD8-vektorilla (kanavat 1 ja 7), piABCD:llä (kanavat 2 ja 8), piAD:llä (kanavat 3 ja 9), piBD:llä (kanavat 4 ja 10), piCDillä (kanavat 5 ja 11) ja piD:llä (kanavat 6 ja 12), tässä järjestyksessä suoritettuna, siten että tekijää I ei ollut läsnä (kanavat 1-6) tai tekijän I läsnäollessa (kanavat 7-12). 125I-C3(ma)-näytteet inkuboitiin myös teki-: jän H ja tekijän I kanssa (kanava 13) ja pelkän tekijän I kanssa (kanava 14), tässä

’· : 25 järjestyksessä suoritettuna. Pelkistyksen jälkeen 125I-C3(ma) analysoitiin SDS

\ l PAGE:llaja autoradiografialla.

» » e * I • ' * I,Kuva 19. Kaavio mallista, joka esittää CRl:n kunkin LHR:n SCR-tyypit ja ennus-*;;* tetut kohdat, jotka määräävät reseptorin spesifisyydet C3b:tä tai C4b:tä kohtaan.

’ * *1 Näiden toissijaiset sitoutumisspesifisyydet on osoitettu sulkumerkeillä.

. 30 Kuva 20. Kaavio liukoisiin CRl:n DNA-konstruktioihin jäävistä DNA-alueista.

• * * . ·. Täyspitkän CRl:n cDNA:n alueet on osoitettu kuvan yläosassa olevilla suora- • ‘ _ kaiteilla.

! I » -; - · j Kuva 21. Kaavio ilmentämisvektorien pTSC-sarjan tärkeimmistä rakenneosista.

» f · ! I » 1 · t * I , « 115528 12

Kuva 22. Kaavio ilmentämisvektorista pTCSgpt. Polyadenylaatiokohta on peräisin hiiren IgG:n kappa-jakoista (NBRF nukleiinihappotietokanta, hakunumero Kcms, ep 1 306-1 714), Ad2 MLP ja kolmiosaiset alueet ovat Ad2-jaksosta (NBRF nukleiini-happotietokanta, hakunumero Gdad2, ep. 5 791-6 069, SV40-varhainen promoottori 5 on SV40-genomista (NBRF nukleiinihappotietokanta, hakunumero GSV40W). gpt-ja ampisilliinigeenit ja bakteerin replikaatioalkukohta ovat vektorista pSV2gpt (ATCC:n hakunumero 37 145).

Kuva 23. Vasta-aineafFmiteettikromatografisesti puhdistetun sCRl:n 4-20-prosent-tinen SDS-PAGE. Olosuhteet pelkistämättömät (kanavat 1, 2 ja 3) ja pelkistävät 10 (kanavat 4, 5 ja 6). Kanavat 1 ja 3: molekyylipainomarkkerit, kanavat 3 ja 5: lähtö-materiaalina oleva soluviljelmäsupematantti, kanavat 4 ja 6: sCRl, joka on puhdistettu vasta-aineaffmteettikromatografialla.

Kuva 24. Eluutioprofiili kationinvaihto-HPLC:stä. Eluoituvaa proteiinia monitoroitiin absorbanssin suhteen 280 nmissä (y-akseli). Sekä läpimenevä materiaali (0-100 15 minuuttia) että eluoitunut sCRl) (150-165 minuuttia) antoivat kumpikin yli käytetyn asteikon menevän vasteen. X-akseli edustaa eluutioaikaa minuutteina.

Kuva 25. 4-20-prosenttisessa gradientissa tehty SDS-PAGE kationin- ja anionin-vaihto-HPLC:llä puhdistetusta sCRl:stä. Ajo SDS-polyakryyliamidigeelissä suoritettiin pelkistämättömissä olosuhteissa. Kanava 1, näyte bioreaktorisupematantista, 20 kanava 2, näyte bioreaktorisupematantista, joka dialysoitiin kationinvaihto-HPLC:n lähtöpuskuria vastaan, kanava 3, näyte kationinvaihto-HPLC -pylväästä saadusta ., : eluoituneesta sCRl-piikistä, kanava 4, näyte kationinvaihto-HPLC -pylväästä saa- •; · dusta eluoituneesta sCRl-piikistä, joka dialysoitiin anioninvaihto-HPLC.n lähtöpus- : '. kuria vastaan, kanavat 5 ja 6, näytteet anioninvaihto-HPLC:stä eluoituneen sCRl:n ’ : 25 eri fraktioista.

• · · . > » : Kuva 26. C5a:n aiheuttama happipurkaus ihmisen neutrofiileissä. C5a:n aiheutta- · man happipurkauksen jälkeen DCFDA hapettui ja muuttui voimakkaasti fluoresoivaksi. Virtaussytometrimittauksilla saatu fluoresenssin intensiteetti on esitetty x-‘ : akselilla ja solujen määrät y-akselilla. Paneeli a, profiili ja portti soluille, paneeli b,

I I

“: 30 0 minuuttia C5a-lisäyksestä, paneeli c, 1 minuutti, paneeli d, 2 minuuttia, paneeli e, • · · • . 3 minuuttia, paneeli f, 4 minuuttia, paneeli g, 20 minuuttia. Tällä DCFDA-määri- > r « t · tyksellä saadaan C5a:n esiintyminen osoitetuksi herkästi.

> >«· f # Kuva 27. Ihmisen komplementin aktivaatio sCRl:n läsnäollessa osoittaa alentunutta • · · C5a-aktiivisuutta DCFDA-määrityksessä. Paneeli a, stimuloimattomat solut, paneeli • * 115528 13 b, ilman sCRl:tä suoritettu kontrolli, joka osoittaa korkeanasteista fluoresenssia, paneeli c, sCRl:n läsnäollessa suoritettu DCFDA-määritys, joka osoittaa 75-pro-senttisen vähenemisen fluoresenssin intensiteetissä.

Kuva 28. sCRl:n aikaansaama klassisen reaktiotien kautta tapahtuvan C5a:n ja 5 C3a:n tuotannon inhibitio ihmisen seerumissa. Samanlaiset profiilit havaittiin joko vasta-aineafFiniteettikromatografialla puhdistetulla tai HPLC:llä puhdistetulla sCRldlä.

Kuva 29. Komplementin välittämän hemolyysin inhibitio yhdistelmä-sCRlillä. Vasta-aineaffiniteettikromatografialla puhdistetulla tai HPLC:llä puhdistetulla 10 sCRl :llä havaittiin samanlaiset profiilit.

Kuva 30. RPAR:n yleiset morfologiset piirteet sCRl:llä käsitellyillä (vasemmalla) ja käsittelemättömillä (oikealla) rotilla. Molemmat rotat saivat ovalbumiinia suonensisäisenä ruiskeena, jonka jälkeen annettiin ihonsisäinen ruiske seosta, joka koostui joko sCRl:stä (vasen rotta) tai PBS:stä (oikea rotta), jossa oli mukana laimentama-15 tonta ovalbumiinia vastaan valmistettua vasta-ainetta (vasen antokohta), suhteessa 1/2 laimennettua ovalbumiinia vastaan valmistettua vasta-ainetta (keskimmäinen antokohta) tai kaniinin IgG:tä (oikea antokohta). Ruiskeiden anto suoritettiin rin-nakkaisruiskeina ja ylä- ja alariveistä saatiin identtiset tulokset. Rotilla, jotka saivat sCRl:tä, esiintyi juuri näkyviä muutoksia, kun taas käsittelemättömiin rottiin kehit- « · ! 20 tyivät täysimittaiset RPAR:n oireet, (b) ihon pinta (a):sta saaduissa ihobiopsioissa.

Käsittelemättömästä rotasta (oikealla) otetussa biopsiassa nähtiin kehittyneen sel-| västi havaittava vaurio, kun taas sCRldlä käsitellyn rotan (vasemmalla) biopsiassa esiintyivät normaalit morfologiset piirteet.

.···. Kuva 31. Valomikroskooppinen analyysi sCRldlä käsitellyistä (a) ja käsittelemät-25 tömistä (b) rotista otetuista ihobiopsioista. (a) Havaittiin polymorfonukleaaristen ja . . mononukleaaristen solujen kerääntymistä verisuonten ympärille, mutta ei lainkaan laajamittaista neutrofiilien keräytymistä tai erytrosyyttien pääsyä verisuonten ulko-·;·’ puolelle, (b) Havaittiin laajamittaista polymorfonukleaarisolujen keräytymistä ja : erytrosyyttien joutumista verisuonten ulkopuolelle.

I* 30 5 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • · ....: Tämä keksintö liittyy menetelmään C3b/C4b-reseptori (CR1) -proteiinin ja sen frag menttien ilmentämisen. Näillä CR1-jaksoilla ja proteiineilla on käyttöä sellaisessa 14 115E28 diagnoosien teossa ja hoidossa, joka koskee tulehdussairauksia tai immuunijärjestelmän sairauksia tai sairauksia, joihin liittyy komplementtiaktiivisuutta.

Yksi tämän keksinnön erityinen sovellutusmuoto liittyy liukoisiin CRl-molekyylei-hin ja niiden ilmentämiseen, puhdistukseen ja käyttömuotoihin. Tässä patenttihake-5 musjulkaisussa termiä "liukoiset CR1-molekyylit" käytetään tarkoittamaan CR1-proteiinin sellaisia osia, jotka natiiveista CR1-proteiineista poiketen eivät ilmenny solun pinnassa kalvoproteiineina. Erityisenä esimerkkinä tästä on se, että CRl-mole-kyylit, jotka ovat oleellisesti vaillinaisia kalvon läpäisevän alueen suhteen, ovat liukoisia CR1-molekyylejä. Yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa liukoisia CR1-10 molekyylejä erittää solu, jossa niitä ilmennetään.

Tämän keksinnön mukaisissa erityisissä sovellutusmuodoissa, jotka käsitellään yksityiskohtaisesti esimerkit sisältävässä jaksossa, kuvataan täyspitkän CRl-cDNA:n ja sen fragmenttien kloonaus ja täydelliset nukleotidijaksot ja näistä johdetut amino-happojaksot ja CRl:n koodaamien tuotteiden ilmentäminen. Kuvataan myös CRl:n 15 ja sellaisten sen fragmenttien ilmentäminen, joissa on C3b:n ja/tai C4b:n sitomiseen tarvittavat kohdat ja jotka inhiboivat tekijän 1 kofaktoriaktiivisuutta. Tämän keksinnön valaisemiseksi esitetään vielä liukoisten ja lyhennettyjen CR1-molekyylien tuotto ja puhdistus. Näiden molekyylien osoitetaan erityisissä esimerkeissä olevan terapeuttisesti käyttökelpoisia tulehduksen rajoittamiseen ja sydäninfarktin koon : *: 20 vähentämiseen ja ehkäisemään perfuusion palautumisvaurioita.

• · · · .* .* 5.1 CRl-geenin eristys • · • · · •« · CRl-geenin täydellinen koodaava jakso ja siitä johdettu aminohappojakso on esi-tetty kuvassa 1.

• · · ’···’ Mikä tahansa ihmisen soluista voi potentiaalisesti toimia nukleiinihappolähteenä 25 CRl-geenin molekulaarisessa kloonauksessa. CRl-geenin eristykseen kuuluu niiden DNA-jaksojen eristys, jotka koodaavat proteiinia, jossa ilmenee CRl:een liittyvä '...· rakenteellinen piirre tai siihen liittyvät ominaisuudet, esim. C3b:n tai C4b:n tai . immuunikompleksien sitominen, fagosytoosin modulointi, immuunijärjestelmän

stimulaatio tai sen solujen lisääntymisen edistäminen ja komplementin säätely. DNA

• * ’I' 30 voidaan saada tällä alalla tunnetuilla vakiomenetelmiä käyttäen kloonatusta ’:‘· DNA:sta (esim. DNA-"kirjastosta"), kemiallisella synteesillä, cDNA-kloonauksella • · 115528 15 tai halutusta ihmisen solusta puhdistetun genomin DNA:n tai sen fragmenttien kloonauksella. (Ks. esimerkiksi Maniatis, et ai. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Sprang Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M., (toim.) (1985) DNA-cloning: A practical Approach, MRL 5 Press, LTD., Oxford, U.K. Osat I ja Π). Soluihin, jotka voivat toimia nukleiini-happolähteenä CRl-geenin cDNA-kloonauksessa, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, monosyytit/makrofagit, granulosyytit, B-solut, T-solut, pernan imuke-rästen dendriittisolut ja munuaiskeräsen podosyyttisolut. Genomista johdetut solut voivat koodaavien alueiden lisäksi sisältää säätely- ja introni-DNA-alueita, 10 cDNA:sta johdetut kloonit taas sisältävät ainoastaan eksonijaksoja. CRl-geeni tulee kloonata molekulaarisesti sopivaan vektoriin geenin lisäämiseksi riippumatta siitä, mitä lähdettä on käytetty.

Genomin DNA:sta tehtävässä geenin molekulaarisessa kloonauksessa muodostetaan DNA-fragmentteja, joista jotkin koodaavat haluttua CRl-geeniä. DNA voidaan 15 pilkkoa tietyistä kohdista useita eri restriktioentsyymejä käyttäen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää DNaasia mangaanin läsnäollessa DNA:n pilkkomiseksi osiin, tai DNA voidaan hajottaa fysikaalisesti, kuten esimerkiksi ultraäänikäsittelyllä. Lineaariset DNA-fragmentit voidaan sitten erottaa koon mukaan vakiomenetelmillä, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, agaroosi- ja polyakryyliamidigeeli-20 elektroforeesi ja pylväskromatografia.

Kun DNA-fragmentit on muodostettu, voidaan nimenomaisesti CRl-geenin sisältävien DNA-fragmenttien tunnistus suorittaa useilla tavoilla. Jos on saatavissa pääosa ::: i CR1-geenistä tai sille spesifisestä RNAista, tai näiden fragmentti, ja tämä voidaan ‘; : puhdistaa ja leimata, muodostuneet DNA-fragmentit voidaan seuloa nukleiinihappo- : : 25 hybridisoinnilla leimattuun koettimeen (Benton, W., ja Davis, R., (1977) Science :* 196, 180, Grunstein, M. ja Hogness, D., (1975) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72, 3961). Tässä hybridisoituvat vain ne DNA-fragmentit, jotka ovat huomattavan . ·. homologisia koettimen suhteen. Jos saatavilla ei ole puhdistettua CR1-spesifistä koetinta, CRl:n suhteen rikastettuja nukleiinihappoja voidaan käyttää koettimina 30 alkuun käytettävässä valikointimenetelmässä. Tästä esimerkkinä on se, että voidaan käyttää B-solun cDNA.ta edustavaa koetinta, josta on poistettu fibroblastien ilmen-;·’ tämät lähetit. On myös mahdollista tunnistaa asianmukainen fragmentti pilkkomalla : · *se restriktioentsyym(e)illä ja vertaamalla fragmenttien kokoja odotettuihin, tunnetun ··’: restriktiokartan mukaisiin fragmentteihin, jos tällainen kartta on käytettävissä.

35 Alkuun suoritetun selektion lisäksi voidaan käyttää muunlaisia selektioita, jotka perustuvat tämän geenin ominaisuuksiin tai sen ilmentämän tuotteen fysikaalisiin, 115528 16 kemiallisiin tai immunologisiin ominaisuuksiin myöhemmin esitettävien kuvausten mukaisesti.

CRl-geeni voidaan myös tunnistaa nukleiinihappohybridisoinnilla tapahtuvalla mRNA:n selektiolla, jonka jälkeen suoritetaan in vitro -translaatio. Tässä menetel-5 mässä käytetään fragmentteja komplementaaristen mRNA-molekyylien eristämiseksi hybridisoinnin avulla. Nämä DNA-molekyylit voivat edustaa saatavissa olevaa puhdistettua CRl-DNA:ta tai DNAita, joka on rikastettu CRl-jaksojen suhteen. Eristettyjen mRNA-molekyylien in vitro -translaatiotuotteille suoritetulla immuuni-saostusanalyysilla tai toiminnallisilla määrityksillä (esim. C3b:n tai C4b:n sitomi-10 nen, fagosytoositoiminnan edistäminen, immuunijäijestelmän stimulointi tai komplementin säätely jne.) tunnistetaan kyseinen mRNA ja tätä kautta ne komplementaariset DNA-fragmentit, jotka sisältävät CRl-jaksoja. Spesifisiä mRNA-mole-kyylejä voidaan lisäksi valikoida adsorboimalla soluista eristetyt polysomit immobi-lisoitujen, spesifisesti CRl.tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden pintaan. Radio-15 aktiivisesti leimattu mRNA tai cDNA voidaan syntetisoida käyttäen valikoitua mRNA-molekyyliä templaattina. Radioaktiivisella leimalla varustettua mRNAita tai cDNAita voidaan sitten käyttää koettimena CRl-DNA-fragmenttien tunnistamiseksi muiden genomin DNA-fragmenttien joukosta.

Genomin CRl-DNA:n eristämisvaihtoehtoihin kuuluu, tähän kuitenkaan rajoittu- 20 matta, se, että tämä geenijakso syntetisoidaan tunnetusta jaksosta kemiallisesti tai että tehdään CR1-geeniä koodaavaa mRNA vastaava cDNA. Kuten edellä kuvattiin, voidaan esimerkiksi CR1-geenin cDNA-kloonaukseen tarkoitettu RNA eristää : soluista, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, monosyytit/makro- : '· fagit, granulosyytit, B-solut, T-solut, dendriittisolut, ja podosyyttisolut. Edullisessa : : 25 sovellutusmuodossa cDNA-kloonaukseen tarkoitettuna mRNA-lähteenä voivat olla • · : nielurisojen solut (ks. myöhempänä oleva kappale 6.1.2). Myös muut menetelmät . · ‘; ovat mahdollisia ja nämä kuuluvat tämän keksinnön suojapiiriin.

Tunnistettu ja eristetty geeni voidaan sitten liittää sopivaan kloonausvektoriin. Voidaan käyttää suurta määrää tällä alalla tunnettuja vektori-isäntäsysteemejä. 30 Mahdollisiin vektoreihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, plasmidit * ,’.ϊ tai modifioidut virukset, mutta vektorisysteemin täytyy olla yhteensopiva käytetyn isäntäsolun kanssa. Näihin vektoreihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittu- . matta, bakteriofagit, kuten lambda-johdannaiset, tai plasmidit, kuten pBR322, pUC- . plasmidi tai CDM8-plasmidi (Seed, B., (1987) Nature 329, 840-842) tai näiden » » I · • · · t · · » · 115528 17 johdannaiset. Yhdistelmämolekyylit voidaan tuoda isäntäsoluihin transformaatiolla, transfektiolla, infektoimalla, elektroporaatiollajne.

Vaihtoehtoisessa "haulikkoammuntaperiaatetta" käyttävässä menetelmässä voidaan CRl-geeni tunnistaa ja eristää sopivaan kloonausvektoriin tehdyn liittämisen 5 jälkeen. CR1-geenin rikastus, joka tapahtuu esimerkiksi koon mukaan suoritetulla fraktioinnilla, voidaan suorittaa ennen kloonausvektoriin liittämistä.

CRl-geeni liitetään kloonausvektoriin, jota voidaan käyttää sopivien isäntäsolujen transformointiin, transfektointiin tai infektointiin ja tämän avulla saadaan geeni-jaksoista useita kopioita. Yhdessä erityisessä sovellutusesimerkissä tämä kloonaus-10 vektori voi olla CDM8-vektori, jota voidaan käyttää ilmentämisen suorittamiseksi nisäkässolussa. Liittäminen kloonausvektoriin voidaan suorittaa esimerkiksi liittämällä DNA-fragmentti ligaasireaktiota käyttäen kloonausvektoriin, jossa on komplementaariset kohesiiviset päät. Jos kloonausvektorissa ei kuitenkaan esiinny DNA:n pilkkomisessa käytetyille restriktiokohdille komplementaarisia kohtia, voidaan 15 DNA-molekyylien päät muokata entsymaattisesti. Vaihtoehtoisesti voidaan valmistaa mikä tahansa kohta liittämällä DNA:n päihin nuldeotidijaksoja (kytkijäjaksoja); nämä liitetyt kytkijäjaksot voivat käsittää kemiallisesti syntetisoituja oligonukleo-tideja, jotka koodaavat restriktioendonukleaasien tunnistuskohtia. Vaihtoehtoisessa menetelmässä voidaan katkaistu vektori ja CRl-geeni muokata käyttäen homopoly-20 meerisiä jatkeita.

Kloonatun CRl-geenin tunnistaminen voidaan suorittaa useilla eri tavoilla, jotka . ; perustuvat tämän DNA:n ominaisuuksiin tai sen koodaaman proteiinin fysikaalisiin, • · · * ... : immunologisiin tai toiminnallisiin ominaisuuksiin. DNA sinänsä voidaan havaita : ·. leimattuihin koettimiin suoritettavalla nukleiinihappojen plakki- tai pesäkehybridi- ". 25 soinnilla (Benton, W., ja Davis, R., (1977) Science 196, 180, Grunstein, M. ja

Hogness, D., (1975) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72, 3961). Vaihtoehtoisesti ‘’ voidaan CRl-geenin esiintyminen havaita määrityksillä, jotka perustuvat sen ilmen- , · ·’ tämän tuotteen ominaisuuksiin. Voidaan esimerkiksi valita sellaista proteiinia tuottavia cDNA-klooneja, tai DNA-klooneja, jotka hybridisoitumisen avulla vali-30 koivat asianmukaisia mRNA-molekyylejä, joilla on esimerkiksi samanlainen tai • identtinen elektroforeettinen liikkuvuus, isoelektrisessä fokusoinnissa esiintyvä “käyttäytyminen, proteolyyttisessä pilkkoutumisessa saatavat pilkkoutumiskartat, C3b:n ja/tai C4b:n ja/tai immuunikompleksien sitomisaktivisuus, komplementtia säätelevä aktiivisuus, vaikutukset, jotka ilmenevät fagosytoosissa tai immuunijärjes-: ·.· 35 telmän stimuloitumisessa tai antigeeniset ominaisuudet, jotka tiedetään kuuluvan

f I I » I

115528 18 CRLlle. CRl-proteiini voidaan tunnistaa CRlrtä vastaan valmistetulla vasta-aineella sen perusteella, että leimattu vasta-aine sitoutuu ehdokkaina oleviin CRl:tä syntetisoiviin klooneihin ELISA (entsyymivälitteinen immuunisorbenttimääritys) -tyyppisessä määrityksessä.

5 Erityisissä sovellutusesimerkeissä mahdollistaa CRl-geenin useiden kopioiden muodostamisen se, että isäntäsolut transformoidaan yhdistelmä-DNA-molekyyleilla, joihin on Eitetty eristetty CRl-geeni, cDNA tai syntetisoitu DNA-jakso. Geeniä voidaan siten saada suuria määriä kasvattamalla transformantteja, eristämällä trans-formanteista yhdistelmä-DNA-molekyylit ja poistamalla tarvittaessa liitetty geeni 10 yhdistelmä-DNA:sta.

Yhdessä nimenomaisessa sovellutusesimerkissä CDM8-vektorissa olevat CR1-cDNA-kloonit voidaan transfektoida COS (apinan munuais-) -soluihin ilmentämisen suorittamiseksi suuressa mittakaavaisessa sytomegaloviruksen promoottorin ohjaamana (ks. myöh. kappale 8).

15 Jos lopullisena päämääränä on geenin liittäminen virusilmentämisvektoreihin, kuten vacciniavirus- tai adenovirusvektoreihin, voidaan CRl-geenin sisältävä yhdistelmä-DNA-molekyyli muokata siten, että geenin molemmilla puolilla on virusjaksoja, joiden avulla geneettinen rekombinaatio geenin liittämiseksi viruksen genomiin viruksen infektoimissa soluissa on mahdollista.

20 Sitten kun CRl-DNA:ta sisältävä klooni on tunnistettu, kasvatettu ja otettu talteen, siihen Eitetty DNA voidaan luonnehtia jäljempänä kappaleessa 5.4.1 kuvatulla : : ; tavalla.

• * • ‘: Kun CRl-geenin geneettinen rakenne on tunnettu, tätä rakennetta voidaan käsitellä sen optimaaEsta käyttöä varten tässä keksinnössä. Promoottori-DNA voidaan esi-.··. 25 merkiksi Eittää Egaasia käyttäen CRl:tä koodaavan jakson 5-puoleUe natnvin · ·, promoottorin lisäksi tai tämän korvaten, jotta proteiinin ilmentämistä voitaisiin nostaa. Voidaan myös valmistaa CRl-deleetiomutantteja ilmentäviä ilmentämis-vektoreita, jotta CRl-jakson rajattujen fragmenttien ilmentäminen kävisi mahdolli-;*·' seksi (ks. myöhempänä olevat esimerkkejä käsittelevät kappaleet). Yhdessä erityi- 30 sessä sovellutusesimerkissä voidaan valmistaa deleetiomutantteja, jotka koodaavat • ;·· niitä CRl-proteiinin fragmentteja, joissa esiintyy haluttu C3b:tä ja/tai C4b:tä sitova aktiivisuus (ks. myöh. kappale 9), esim. LHR-A C4b:n sitomiseksi ja LHR-B C3b:n sitomiseksi. Edullisessa sovellutusesimerkissä voidaan liukoisen CR1-molekyylin ' ·tuottamiseksi käyttää ilmentämisvektoria, joka koodaa kalvon läpäisevän alueen kä- (Iti* 115528 19 sittävän deleetion sisältävää CRl-molekyyliä (ks. myöh. esimerkkeihin sisältyvät kappaleet 11-14). On mahdollista käyttää useanlaisia muokkaustapoja ja nämä kuuluvat tämän keksinnön suojapiiriin.

5.2 Kloonatun CRl-geenin ilmentäminen 5 CRl-proteiinia koodaava nukleotidijakso (kuva 1) tai sen osa voidaan liittää sopivaan ilmentämisvektoriin, ts. vektoriin, joka sisältää tarpeelliset rakenneyksiköt liitetyn proteiinia koodaavan jakson transkriptiota ja translaatiota varten. Tarvittavat transkriptio-ja translaatiosignaalit voidaan myös saada natiivista CRl-geenistä ja/tai sen viereisiltä alueilta. Proteiinia koodaavan jakson ilmentämiseen voidaan käyttää 10 useita eri isäntä-vektorijäqestelmiä. Näihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, viruksella infektoidut nisäkässolusysteemit (esim. vacciniavirus, adenovirus jne.), viruksella infektoidut hyönteissolujärjestelmät (esim. baculovirus) ja mikro-organismit, kuten hiivavektoreita sisältävät hiivat tai bakteriofaagien, plasmidien tai kosmidien DNA:lla transformoidut bakteerit. Näiden vektorien ilmentämiseen liitty-15 vät rakenneyksiköt eroavat toisistaan vahvuuksiensa ja spesifisyyksientä suhteen. Käytetyn isäntä-vektorijäijestelmän mukaisesti voidaan käyttää mitä tahansa monista sopivista transkription ja translaation rakenneyksiköistä. Esimerkiksi nisäkässolu-systeemeissä kloonattaessa voidaan käyttää nisäkässolujen genomista tai näissä soluissa kasvavista viruksista (esim. adenovirus, simian virus 40 tai sytomegalovi-20 rus) eristettyjä promoottoreja. Voidaan myös käyttää yhdistelmä-DNA-tekniikoilla tai synteettisillä menetelmillä valmistettuja promoottoreja liitettyjen jaksojen transkription aikaansaamiseksi.

., : Tarvitaan myös spesifisiä aloitussignaaleja liitettyjen proteiineja koodaavien jakso- : , jen tehokasta translaatiota varten. Näihin signaaleihin kuuluvat ATG-aloituskodoni | » 25 ja sen viereiset jaksot. Niissä tapauksissa, joissa sopiviin ihnentämisvektoreihin liitetään koko CRl-geeni oma aloituskodoninsa ja sen viereiset jaksot mukaan- » luettuna, voi olla tarpeetonta käyttää muita translaation ohjaussignaaleja. Kuitenkin * niissä tapauksissa, joissa liitetään vain osa CRl:tä koodaavasta jaksosta, on tarjottava käyttöön ulkopuolisia translaation ohjaussignaaleja, ATG-aloituskodoni mukaan-30 lukien. Aloituskodonin on lisäksi oltava proteiineja koodavien jaksojen suhteen : oikeassa lukukehyksessä, jotta voitaisiin varmistua koko liitetyn jakson osallistu- , ‘,; misesta translaatioon. Nämä ulkopuoliset translaation ohjaussignaalit ja aloituskodo- nit voivat olla alkuperältään vaihtelevia ja olla sekä luonnosta peräisin olevia että synteettisiä.

115528 20

Mitä tahansa edellä kuvattua menetelmää DNA-fragmenttien liittämiseksi vektoriin voidaan käyttää sellaisen kimeerisen geenin sisältävien ilmentämisvektoreiden vai- i mistamiseksi, joka muodostuu asianmukaisista transkription/translaation ohjaussignaaleista ja proteiinia koodaavista jaksoista. Näihin menetelmiin voi kuulua in vitro 5 -yhdistelmä-DNA-tekniikat ja synteettiset menetelmät ja in vivo -rekombinaatiot (geneettinen rekombinaatio).

Yhdessä erityisessä sovellutusesimerkissä voidaan ilmentää liukoista CRl-mole-kyyliä. Tämä liukoinen molekyyli voidaan tuottaa käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikoita kalvon läpäisevää aluetta koodaavan alueen poistamiseksi CRl:n jak-10 sosta (ks. myöh. kappaleet 11-14). Kuten jäljempänä osoitaan, kyky liukoisen CR1-molekyylin ilmentämiseen ei rajoitu mihinkään CRl:n nukleiinihappojakson geneettisistä modifikaatioista; mikäli olennainen osa CRl:n kalvon läpäisevää osaa koo-daavasta nukleiinihappojaksosta on poistettu, voidaan saada liukoisia CRl-konstruk-tioita.

15 Liitetyn CRl-geenin sisältävät ilmentämisvektorit voidaan tunnistaa kolmella yleisellä lähestymistavalla: (a) DNA-DNA-hybridisoinnilla, (b) "markkeri"-geenitoi-mintojen esiintyminen tai puuttuminen ja (c) liitettyjen jaksojen ilmentäminen. Ensimmäisessä lähestymistavassa ilmentämisvektoriin liitetyn vieraan geenin läsnäolo voidaan havaita DNA-DNA-hybridisoinnilla käyttäen koettimia, jotka käsittävät 20 liitetyn CRl-geenin suhteen homologisia jaksoja. Toisessa lähestymistavassa vekto-ri/isäntäyhdistelmäjäqestelmä voidaan tunnistaa ja valikoida esiin tiettyjen "markke-ri''geenitoimintojen (esim. tymidiinikinaasiaktiivisuus, resistenssi antibiootteja vas-; · taan, transformaatiofenotyyppi, okkluusiokappaleen muodostuminen baculovirus- • i systeemissä) perusteella, jotka aiheutuvat siitä, että vektoriin on liitetty vieraita ‘ 25 geenejä. Jos CRl-geeni liitetään esimerkiksi vektorin markkerigeenijaksoon, voi- : daan liittyneen CRl:n sisältävät rekombinantit tunnistaa markkerigeenin toiminnan ·. puuttumisen perusteella. Kolmannessa lähestymistavassa yhdistelmäilmentämis- • t vektorit voidaan tunnistaa määrittämällä rekombinantin ilmentämä vieraan geenin tuote. Nämä määritykset voivat perustua geenituotteen fysikaalisiin, immunologisiin 30 tai toiminnallisiin ominaisuuksiin·

Kun erityinen yhdistelmä-DNA-molekyyli on tunnistettuja eristetty, voidaan käyt-' . tää useita tällä alalla tunnettuja keinoja sen lisäämiseksi. Kun sopiva isäntäjärjestel- . mä ja kasvatusolosuhteet on vakiinnutettu, voidaan ilmentämisvektoreita lisätä ja valmistaa suuria määriä.

* 1 · I I · HIM t · 115528 21

Erityisessä sovellutusesimerkissä, joka esitetään yksityiskohtaisesti tämän keksinnön mukaisissa esimerkeissä, voidaan liitetyn CRl-cDNA:n sisältäviä CDM8-vektoreita transfektoida COS-soluihin, joissa liittynyt CRl-cDNA ilmentyy ja tuottaa CR1-proteiinia. Muissa erityisissä sovellutusesimerkeissä, jotka esitetään yksityiskoh-5 taisesti esimerkkikappaleissa, voidaan CDM8-vektoreita, joihin on liitetty CRl:tä koodaavan alueen osaa vastaava CRl-cDNA, transfektoida COS-soluihin, joissa CR1 tai sen fragmentti ilmentyy. Käyttämällä vielä yhtä esimerkkiä (ks. jäljempänä) voidaan lyhennettyjä ja liukoisia CR1-molekyylejä ilmentää nisäkässoluissa käyttämällä ilmentämisvektoreita, kuten kappaleessa 11.3.1 kuvattuja pTCS-vektoreita. 10 Kuten edellä on selitetty, kuuluvat ilmentämisvektoreihin, joita voidaan käyttää, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, seuraavat vektorit ja niiden johdannaiset: ihmis- tai eläinvirukset, kuten vacciniavirus tai adenovirus, hyönteisvirukset, kuten baculovirus, hiivavektorit, bakteriofagivektorit (esim. lambda) ja plasmidi- ja kosmidivektorit joidenkin esimerkkien mainitsemiseksi.

15 Voidaan lisäksi valita isäntäsolukanta, joka moduloi liitettyjen jaksojen ilmentymistä tai modifioi ja muokkaa kimeeristä geenituotetta tietyllä halutulla tavalla. Tietyistä promoottoreista tehty ilmentäminen voidaan kohottaa tiettyjen indusoiden läsnäollessa ja geneettisesti muokatun CRl-proteiinin ilmentämistä voidaan näin ollen säädellä. Eri isäntäsoluilla on lisäksi luonteenomaisia ja spesifisiä mekanis-20 meja proteiinien translaation aikaiseen ja translaation jälkeen tapahtuvaa muokkausta varten. Sopivat solulinjat tai isäntäsysteemit voidaan valita sen varmistamiseksi, että ilmennetty heterologinen proteiini modifioituu ja muokkautuu halutulla , : tavalla. Yhdessä sovellutusmuodossa voidaan esimerkiksi käyttää ilmentämistä bak- : teerisysteemissä sellaisen glykosyloimattoman CRl-proteiinin tuottamiseksi, jolla : 25 on kuvan 1 mukainen aminohappojakso. Hiivassa suoritettu ilmentäminen tuottaa glykosyloidun tuotteen. Toisessa sovellutusesimerkissä voidaan käyttää COS-nisä-kässoluja heterologisen CRl-proteiinin natiivin glykosyloitumisen varmistamiseksi. ; Eri vektori/isäntäjäijestelmissä voi lisäksi tapahtua prosessointireaktioita, kuten eriasteisia proteolyyttisiä pilkkoutumisia. Voidaan tuottaa useita tällaisia eri tavoin 30 prosessoituja CRl-proteiineja, jotka myös kuuluvat tämän keksinnön suojapiiriin.

> · ‘ * , ·. Tämän keksinnön mukaisessa edullisessa sovellutusmuodossa liukoisten CRl-pro- • ’ φ teiinien suuressa mittakaavassa tapahtuva tuotanto voidaan suorittaa myöhempänä kohdassa 12.1 et seq. kuvatulla tavalla.

. ·»· ► » » « · » · #

( l II I

115528 22 5.3 Ilmennetyn geenituotteen tunnistaminen ja puhdistus

Kun CRl-geeniä ilmentävä rekombinantti on tunnistettu, tulisi geenituote analysoida. Tämä voidaan suorittaa määrityksillä, jotka perustuvat tuotteen fysikaalisiin, immunologisiin tai toiminnallisiin ominaisuuksiin.

5 CR1-proteiinit voidaan eristää ja puhdistaa vakiomenetelmillä, joihin kuuluvat kromatografia (esim. ioninvaihto-, affiniteetti- ja koon mukaan vaikuttava pylväs-kromatografia ja nestekromatografia), sentrifugointi, liukoisuuserojen käyttö, tai mikä tahansa muu proteiinien puhdistuksessa käytetty vakiomenetelmä.

Esimerkeissä yksityiskohdittain esitetyssä tämän keksinnön mukaisessa edullisessa 10 sovellutusmuodossa voidaan suuria määriä liukoista CRl-proteiinia puhdistaa menetelmillä, joihin liittyy HPLC:n käyttö (ks. kohta 12.2 et seq.). Kuten edellä kuvattiin, puhdistetun CRl:n tuotanto suuressa mittakaavassa voidaan suorittaa käyttämällä ilmentämissysteemiä, joka tuottaa liukoista CRl:tä lähtöaineena käytettäväksi, jolloin kalvoon sitoutuneen CRl:n solubilisointi detergenteillä jää tarpeetto-15 mana vaiheena pois. Sikiökautisen vasikan seerumipitoisuuden alentaminen bioreak-toriviljelmissä ja/tai vaihtoehtoisten kasvatusliuosten käyttö näissä viljelmissä poistaa tarpeen erottaa liukoista CRl:tä sisältävästä lähtömateriaalista suuria pitoisuuksia ylimääräisiä proteiineja myöhemmissä puhdistusvaiheissa. Tässä edullisessa vaihtoehdossa on puhdistukseen edullista käyttää joko kationinvaihto-HPLC.tä tai 20 kationinvaihto-HPLCitä yhdistettynä sitä seuraavaan anioninvaihto-HPLCihen. Huomattavan puhdasta liukoista CRl .tä voidaan siten saada talteen ainoastaan yhtä :: j tai kahta vaihetta käyttäen samalla kun saanto on korkea.

• · ; Toisena vaihtoehtona on se, että kun rekombinantin tuottama CRl-proteiini on »» · : tunnistettu, rekombinantin sisältämän kimeerisen geenin nukleotidijärjestyksestä ,··, 25 voidaan johtaa proteiinin aminohappojakso. Tästä seuraa se, että tämä proteiini : voidaan syntetisoida tunnetuilla kemiallisilla vakiomenetelmillä (esim. ks. Hunka- ‘ piller, M. et ai., (1984) Nature 310, 105-111).

: *: Erityisessä tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuodossa tällaisiin CRl-proteii- neihin, huolimatta siitä, onko ne tuotettu yhdistelmä-DNA-tekniikoilla vai synteetti-' . 30 sillä kemiallisilla menetelmillä, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, ne proteiinit, joihin sisältyy primäärinen aminohappojakso, joka on kokonaisuudessaan tai osittain olennaisesti kuvassa 1 esitetyn jakson mukainen ja johon sisältyvät ; : muunnetut jaksot, joissa tässä jaksossa olevat ryhmät on korvattu toiminnallisesti

I I |U

23 115523 samanarvoisilla ryhmillä siten, että tuloksena on neutraali muutos. Säilyttämättömis-tä korvaamisista voi myös olla tuloksena toiminnallisesti samanarvoisia proteiineja.

Yhdessä sovellutusmuodossa voivat CRl-jaksossa olevia aminohappoa korvaavina ryhminä olla muita jäseniä siitä ryhmästä, johon aminohappo kuuluu. Esimerkiksi 5 poolittomiin (hydrofobisiin) aminohappoihin kuuluvat alaniini, leusiini, isoleusiini, väliini, proliini, fenyylialaniini, tryptofaani ja metioniini. Polaarisiin neutraaleihin aminohappoihin kuuluvat glysiini, seriini, treoniini, kysteiini, tyrosiini, asparagiini ja glutamiini. Positiivisen varauksen omaaviin (emäksisiin) aminohappoihin kuuluvat arginiini, lysiini ja histidiini. Negatiivisen varauksen omaaviin (happamiin) 10 aminohappoihin kuuluvat asparagiinihappo -ja glutamiinihappo. Tämä keksinnön suojapiiriin kuuluvat myös ne proteiinit, jotka modifioitavat eri tavoin translaation aikana tai tämän jälkeen, esimerkiksi glykosylaation tai proteolyyttisen hajoamisen jne. vaikutuksesta.

Yhdessä jäljempänä yksityiskohtaisesti kuvattavassa tämän keksinnön mukaisessa 15 esimerkissä transfektoitajen solujen ilmentämän kloonatun yhdistelmä-CRl:n osoitettiin olevan sellainen, että sitä ei voita erottaa erytrosyyttien F-allotyypistä SDS-PAGE:lla (kuva 14), sillä oli kyky välittää joko C4b:tä tai C3b:tä sisältävien lampaan erytrosyyttien sitoutumista, että CRl:n ligandispesifisyys pystyi siinä säilymään (kuva 13) ja että se osoitti C3(ma):n alfa-polypeptidin pilkkomisena ilmene-20 vää tekijän I kofaktoriaktiivisuutta (kuva 13).

5.4 CRl-geenin ja -proteiinin rakenne ; CRl-geenin ja -proteiinin rakenne voidaan analysoida useilla erilaisilla tunnetuilla j ; menetelmillä, joihin kuuluvat seuraavassa kuvattavat menetelmät mutta jotka eivät • * . | rajoita näihin.

t * *· *’ 25 5.4.1 Geneettinen analyysi I · CRl-geeniä vastaava kloonattu DNA tai cDNA voidaan analysoida menetelmillä, ,··. joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Southem-hybridisointi /·'·. (Southern, E. M. (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517), Northem-hybrisoisointi (ks.

1’ esim. Freeman, et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, 4094-4098,

30 restriktioendonukleaasikartoitus (Maniatis, T., (1982) Molecular Cloning, A

:"· Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New , . York) ja DNA-jakson analyysi. Southern- ja Northem-hybridisoinneissa käytettyjen » · · olosuhteiden rajoittavuutta voidaan muokata sen varmistamiseksi, että niissä 24 1 1 5528 havaitaan ne nukleiinihapot, joiden läheisyys käytetyn spesifisen CRl-koettimen suhteen on haluttua suuruusluokkaa. Esimerkiksi lievästi rajoittavissa olosuhteissa suoritettua hybridisointia koettimella, joka sisältää LHR-B:tä ja LHR-C:tä koodaa-vat CRl-geenijaksot, voidaan käyttää CR2-nukleiinihappojaksojen havaitsemiseen.

5 Restriktioendonukleaasikartoitusta voidaan käyttää CR1-geenin geneettisen rakenteen karkeaan määrittämiseen. Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa voidaan restriktioentsyymeillä suoritettua pilkkomista käyttää kuvassa 2 esitetyn restriktio-kartan aikaansaamiseksi. Restriktioendonukleaaseilla pilkkomisesta saadut restrik-tiokartat voidaan vahvistaa DNA:n jakson analysoinnilla.

10 DNA:n jakson analysointi voidaan suorittaa millä tahansa tunnetuista menetelmistä, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Maxamin ja Gilbertin menetelmä ((1980) Meth. Enzymol. 65, 499-560), Sangerin dideoksimenetelmä (Sanger, F., et ai., (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 5463) tai automaattisen DNA-sekvensointilaitteen käyttö (esim. Applied Biosystems, Foster City, CA). 15 CRl-geenin cDNA-jakso käsittää jakson, joka on olennaisesti kuvassa 1 esitetyn jakson mukainen ja joka on kuvattu kappaleissa 6 ja 7.

5.4.2 Proteiinin analyysi CR1-proteiinin aminohappojakso voidaan johtaa päättelemällä tämä DNA-jaksosta tai vaihtoehtoisesti sekvensoimalla proteiini suoraan automaattisella aminohappojen 20 sekvensointilaitteella. Edustavana esimerkkinä oleva CRl-proteiinin aminohappo-,, > jakso käsittää jakson, joka on olennaisesti kuvassa 1 esitetyn jakson mukainen ja I i » ,. : joka on esitetty yksityiskohtaisesti kappaleessa 6. Kuten jäljempänä on kuvattu, F- ; . allotyyppiä olevan CRl:n koodaava jakso on kloonattu kokonaisuudessaan ja 41 t * aminohaposta koostuvan signaalijakson pilkkomisen jälkeen valmistunut reseptori « * 25 sisälsi 1998 aminohappoa, mukaan lukien 1930 ryhmästä koostuvan solunulkoisen alueen, joka muodostaa 30 SCR:ää, joista 28 on organisoitunut LHR-A-, -B-, -C-ja ! » -D-alueiksi (kuva 10), yhden kalvon läpäisevän 25 aminohappoa käsittävän alueen ja suhteellisen lyhyen 43 aminohappoa käsittävän sytoplasmassa olevan alueen.

• , *. Useita SCR-alueita sisältävien C3/C4:ää sitovien proteiinien joukossa CR1 on 30 ainutlaatuinen siinä suhteessa, että siinä on LHR-alueiksi järjestyneitä SCR-alueiden 1 » » » ryhmiä. CRl:n neljän LHR:n vertailu osoittaa, että kukin näistä on tyyppiä a, b, c ja d olevien neljän tyyppisen SCR:n yhdistelmä (kuva 19). Esimerkiksi LHR-A:n , . SCR-1 ja -2 -alueiden jaksot ovat vain 62 %, 62 % ja 57 % identtisiä LHR-B:n, -C:n i I · ,,,,: ja -D:n kahden ensimmäisen SCR-alueen suhteen, tässä järjestyksessä mainittuna.

115528 25

Alueet SCR-3:sta SCR-7:ään eroavat LHR-B:n vastaavista SCR-alueista kuitenkin vain yhdessä asemassa ja SCR-3 ja SCR-4 eroavat LHR-C:n vastaavista alueista vain kolmessa asemassa (kuva 10). Siten jotkin LHR-A:n "a"-tyyppiset SCR-alueet esiintyvät myös LHR-B:ssä ja -C:ssä. LHR-B:n kaksi ensimmäistä SCR-aluetta, 5 jotka eroavat LHR-A:n vastaavista alueista, ovat 99 % identtisiä näissä asemissa olevien LHR-C:n SCR-alueiden suhteen, joten tyyppiä "b" olevat SCR-alueet ovat LHR-B- ja -C-alueiden yhteisenä piirteenä. LHR-C:n viides, kuudes ja seitsemäs SCR ovat vain 77 % identtisiä näissä asemissa olevien LHR-A- ja -B-alueiden "a"-tyypin SCR-alueiden suhteen ja näiden katsotaan olevan "c"-tyyppisiä SCR-alueita. 10 LHR-D:n SCR-alueet ensimmäisestä neljänteen ovat suhteellisen ainutlaatuisia ja ne ovat tyyppiä "d", kun taas SCR-alueet viidennestä seitsemänteen ovat noin 93 % identtisiä LCR-C:ssä olevien "c"-tyypin jaksojen kanssa.

CRl-proteiinin jaksoa voidaan lisäksi luonnehtia hydrofiihsyysanalyysilla (Hopp, T. ja Woods, K., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78, 3824). Hydrofiilisyyspro-15 fiilia voidaan käyttää hydrofobisten ja hydrofiilisten alueiden tunnistamiseen CR1-proteiinissa ja näitä alueita koodaavien geenijaksojen vastaavissa alueissa. CRl-proteiinin COOH-terminaalisen osan hydrofiilisyysprofiili on esitetty kuvassa 5.

Voidaan myös tehdä sekundaarirakenteen analyysi (Chou, P. ja Fasraan, G., (1974) Biochemistry 13, 222) niiden alueiden ennustamiseksi, joissa CRl:llä on spesifisiä 20 sekundaarirakenteita.

Voidaan myös käyttää muita rakenneanalyysimenetelmiä. Näihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, röntgensädekristallografia (Engstom, A., (1974) Biochem. Exp. Biol. 11, 7-13) ja tietokonemallitus (Fletterick, R. ja Zoller, M. >j (toim.), (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, teoksessa Current .·. 25 Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold t · . : Spring Harbor, New York).

5.5 CRl:n läheiset johdannaiset, analogit ja peptidit • I · CRl:n läheisten johdannaisten, analogien ja peptidien tuotantoja käyttö muodostaa ... kuviteltavissa olevan mahdollisuuden ja näiden on tarkoitus kuulua tämän keksinnön 30 suojapiiriin. Näitä johdannaisia, analogeja ja peptidejä, joilla on halutut immuno-·;* geenisyys- tai antigeenisyysominaisuudet, voidaan käyttää esimerkiksi immuuni- määrityksissä, immunisointia varten, terapeuttisesti jne. Molekyylejä, joissa haluttu ·:··: CRl:n ominaisuus on säilynyt tai jotka vaihtoehtoisesti inhiboivat kyseistä ominai- ‘.t suutta, esim. C3b:n tai C4b:n sitoutumista, komplementtiaktiivisuuden säätelyä tai 115528 26 immuunijäijestelmäii stimulaation tai fagosytoositoiminnan vahvistumista jne, voidaan käyttää näiden ominaisuuksien indusoreina tai inhibiittoreina, tässä järjestyksessä mainittuna.

Tämän keksinnön mukaisia CRl:n läheisiä johdannaisia, analogeja tai peptidejä 5 voidaan tuottaa useilla tunnetuilla menetelmillä. Näiden syntymiseen johtava muokkaus voi tapahtua geeni- tai proteiinitasolla. Kloonattu CRl-geeni voidaan esimerkiksi muuntaa millä tahansa tunnetuista useista eri strategioista (Maniatis, T., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). CRl-jakso voidaan pilkkoa sopivista kohdista restriktio-10 endonukleaas(e)illa, jonka jälkeen suoritetaan haluttaessa muita entsymaattisia muunnoksia, eristää ja liittää ligaasin avulla in vitro (ks. kappale 8). Tuotettaessa CRl:n läheistä johdannaista, analogia tai peptidiä koodaavaa geeniä on pidettävä tarkoin huolta siitä, että muunnettu geeni pysyy samassa lukukehyksessä kuin CR1 ja että translaation lopetussignaalit eivät keskeytä sitä sillä geenialueella, jossa ha-15 luttu CRl-spesifinen aktiivisuus on koodattuna.

CRl-geeniin voidaan lisäksi haluttaessa aiheuttaa in vitro- tai in vivo -olosuhteissa mutaatioita, joilla luodaan ja/tai hävitetään translaation aloitus- ja/tai lopetusjaksoja tai luodaan variaatioita koodaaville alueille ja/tai muodostetaan uusia tai hävitetään entisiä restriktioendonukleaasikohtia myöhempien in vitro -muokkausvaiheiden hel-20 pottamiseksi. Voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua mutageneesimenetelmää, joihin kuuluvat in vitro -kohdemutageneesi (Hutchison, C. et ai., (1978) J. Biol. Chem. 253, 6551), TAB®-kytkijäjaksojen (Pharmacia) käyttö jne.

; : CRl-jakson muokkaus voidaan suorittaa myös proteiinitasolla. Voidaan suorittaa ·: mikä tahansa useista kemiallisista modifioinneista tunnetuilla menetelmillä, joihin 25 kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, spesifinen kemiallinen pilkkominen . : syanogeenibromidilla, trypsiinillä, kymotrypsiinillä, papaiinilla, V8-proteaasilla,

NaBH^llä, asetyloinnilla, formyloinnilla, hapetuksella, pelkistyksellä, metabolisella synteesillä tunikamysiinin läsnäollessa jne.

> * · CRLlle läheisiä analogeja ja peptidejä voidaan lisäksi syntetisoida kemiallisesti. 30 Peptidisyntetisointilaitetta käyttäen voidaan esimerkiksi syntetisoida peptidi, joka vastaa haluttua aktiivisuutta välittävää CRl:n osaa (esim. C3b:n ja/tai C4b:n ' . sitominen, immuunijäijestelmän stimuloiminen, komplementin säätely jne).

» I • · • · · • · 27 1 1 5528 5.6 CRl:n käyttötavat 5.6.1 Määritykset ja diagnoosi CRl-proteiineilla, -analogeilla, -johdannaisilla ja näiden osana olevilla jaksoilla sekä CRl:tä vastaan valmistetuilla vasta-aineilla on käyttöä määrityksissä ja diag-5 nostiikassa. Tämän keksinnön mukaisia molekyylejä, joissa esiintyy haluttu CRl:n ominaisuus tai toiminto, voidaan käyttää tämän ominaisuuden tai toiminnon määritykseen. Esimerkiksi vapaana tai kompleksoituneissa muodoissa esiintyvän C3b:n ja/tai C4b:n sitomiskykyä osoittavia CR1-proteiineja tai näiden fragmentteja voidaan käyttää määrityksissä mittaamaan näiden aineiden määrä näytteessä, esim. 10 potilaan ruumiinnesteessä.

Erityisessä sovellutusmuodossa voidaan näytteessä olevien C3b-, iC3b- tai C4b-tasoja mittaavissa määrityksissä käyttää täysimittaista CRl.tä tai solun pinnalla ilmennettyä CRl:n deleetiomutanttia (esim. sellaisia mutantteja, jotka on kuvattu kappaleessa 8), joilla on kyky sitoa C3b:tä (ks. esim. taulukko 2, kappale 9), iC3b:tä 15 tai C4b:tä (ks. esim. taulukko 2), tässä järjestyksessä mainittuna. Toisessa sovellutusmuodossa voidaan käyttää CRl-proteiinia tai sen fragmenttia, joka on konstruoitu yhdistelmä-DNA-tekniikalla siten, että siitä puuttuu kalvon läpäisevä jakso ja joka siten erittyy solusta.

Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa tällainen C3b:n ja/tai C4b:n mittaus voi 20 kuvata luotettavalla tavalla komplementtiaktiivisuutta ja tämä voi olla käyttökelpoinen tulehdus- ja immuunijäijestelmän sairauksien diagnoosissa. Näihin sairauksiin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kudosvaurio, joka johtuu palon tai sydäninfarktin aiheuttamasta traumasta, aikuisiän hengityssyndrooma (shokkikeuh-ko), autoimmuunisairaudet, kuten nivelreuma, systeeminen punahukka ja muut ; 25 taudit tai sairaudet, joihin liittyy haitallinen tai sopimaton komplementtiaktiivisuus '· (ks. esim. Miesher, P. A. ja Muller-Eberhard, H.J. (toim.), (1976) Text Book of ..: Immunopathology, 2. painos Osat I ja Π, Grune ja Stratton, New York, Sandberg, A.

,L., (1981) teoksessa Cellular Functions in Immunity and Inflammation, Oppenheim, J. J., et al. (toim.), Elsevier/North Holland, New York, s. 373, Conrow, et al., : 30 (1980) J. Med. Chem. 23, 242, Regal, J. F. ja Pickering, R. H., (1983) Int. J.

Immunopharmacol. 5, 71, Jacobs, H.S., (1980) Arc. Pathol. Lab. Med. 104, 617).

•

Epitoopin sisältävillä CRl-proteiinilla tai sen fragmenteilla on käyttöä määrityk-•: · * i sissä, joihin kuuluvat immuunimääritykset tähän kuitenkaan rajoittumatta. Immuuni- , määrityksiin, joita voidaan käyttää, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, I < » » ♦ * »

» I

28 ^ ^ 5528 kompetitiiviset ja ei-kompetitiiviset määritysjäijestelmät, joissa käytetään menetelmiä kuten radioimmuunimääritykset, ELISA (entsyymivälitteinen immuunisorbentti-määritys), kerTOsimmuunimääritykset, presipitiinireaktiot, geehdiffriusiopresipitiini-reaktiot, immuunidiffriusiomääritykset, agglutinaatiomääritykset, komplementin si-5 tomismääritykset, immuuniradiometriset määritykset, fluoresenssi-immuunimääri-tykset, proteiini-A-immuunimääritykset ja immuunielektroforeesimääritykset joidenkin esimerkkien mainitsemiseksi.

CRl-geenejä ja näille läheisiä nukleiinihappojaksoja ja jaksojen osia voidaan käyttää hybridisointimäärityksissä. Näitä hybridisointimäärityksiä voidaan käyttää 10 silloin, kun tarkoituksena on seurata tulehdus- tai immuunireaktioita, joihin liittyy CRl:n ilmentyminen, diagnosoida tiettyjä tautitiloja, joihin liittyy CRl:n ilmentymisen muutoksia, määrittää potilaan CRl-allotyyppi ja havaita CRl-geenin ja läheisesti yhteen kuuluvien geenien (esim. CR2) esiintyminen ja/tai ilmentyminen.

5.6.2 Terapia 15 CRl-proteiini ja sen fragmentit, johdannaiset ja analogit voivat olla terapeuttisesti käyttökelpoisia CRl:n välittämien toimintojen moduloinnissa. Näihin toimintoihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, vapaassa tai kompleksoituneissa muodoissa olevien C3b:n ja/tai C4b:n sitominen, fagosytoosin vahvistaminen, komplementin säätely, immuunijärjestelmän stimuloiminen jne. Tämän keksinnön 20 mukaisten CR1-proteiinien ja sitä läheisesti muistuttavien molekyylien tehokkailla annoksilla on terapeuttista arvoa monissa taudeissa ja sairauksissa, jotka liittyvät näihin toimintoihin, kuten immuunijärjestelmän sairauksissa tai tulehdussairauksissa . (esim. kohdassa 5.6 kuvatut sairaudet). Esimerkiksi täysimittaisella CRl:llä tai sen • I fragmenteilla ja sitä läheisesti muistuttavilla molekyyleillä, joissa esiintyy haluttu : 25 aktiivisuus, voi olla terapeuttista käyttöä komplementin inhibitiossa sen johdosta, , : että niillä on kyky toimia tekijän I kofaktorina, joka edistää komplementin kompo- nenttien C3b tai C4b palautumatonta inaktivoitumista (Fearon, D. T., (1979) Proc. ;; Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 5867, Iida, K. ja Nussenzweig, V., (1981) J. Exp.

Med.153, 1138) ja/tai sen johdosta, että niillä on kyky inhiboida vaihtoehtoisia tai 30 klassisia C3- tai C5-konvertaaseja.

··. Yhdessä erityisessä tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuodossa voidaan • . ilmentymisvektori konstruoida koodaamaan CRl-molekyyliä, jolta puuttuu kalvon läpäisevä alue (esim. deleetiolla, joka poistaa C-terminaalista osaa lähimpänä olevan ‘ · SCR-alueen arginiinista lukien C-terminaalisella puolella olevan osan), jolloin : 35 tuloksena on liukoisen CR1-fragmentin muodostuminen. Yhdessä sovellutusmuo- • · 115528 29 dossa tässä fragmentissa voi säilyä kyky sitoa vapaata tai kompleksoituneissa muodoissa olevaa C3b:tä ja/tai C4b:tä. Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa tämä liukoinen CRl-proteiini ei saata enää kyetä osoittamaan tekijän I kofaktoriaktiivi-suutta. Liukoista CRl-tuotetta voidaan antaa potilaalle in vivo, jotta liukoinen CR1 5 voisi tehokkaasti syrjäyttää solun pinnalla olevan natiivin CRl:n kilpailussa C3b:n ja/tai C4b:n sitomisesta ja ehkäistä siten täysin solun pinnalla olevan CRl:n tekijän I kofaktoriaktiivisuuden ja lisätä komplementtiaktiivisuutta.

Kun C3b on liittynyt kovalenttisesti partikkeleihin ja liukoisiin immuunikomplek-seihin, C3b:n inaktivoitumisella proteolyyttisellä prosessoinnilla iC3b:ksi ja 10 C3dg:ksi on kaksi biologista seurausta: komplementtisysteemin vahvistavaa reaktio-tietä käyttävän liiallisen aktivoitumisen estäminen ja sellaisten ligandien muodostuminen, jotka voivat kytkeytyä muihin reseptoreihin kuin CRl:een. iC3b-fragmentti ei voi sitoa B-tekijää, joten tähän tilaan johtava muunnos ehkäisee komplementin aktivoitumisen edelleen vaihtoehtoisen reaktiotien kautta kulkevaa vahvistumis-15 kiertoa käyttäen. CR1 ja CR3, jotka edustavat kahta myelomonosyyttisolujen fago-sytoositoimintaa välittävää reseptoria, voivat kuitenkin sitoa iC3b:tä. Tämän vuoksi ensisijaisena seurauksena C3b:n muuttumisesta iC3b:ksi on komplementin aktivoitumisen lakkaaminen ilman, että tämä häiritsee CRl:n ja CR3:n välittämää C3:n päällystämän kompleksin poistamista. Sitä vastoin iC3b:n muuntuminen edelleen 20 C3dg:ksi muodostaa fragmentin, joka osallistuu vuorovaikutukseen ainoastaan CR2:n kanssa mutta ei CRl:n tai CR3:n kanssa. Tämä asiantila rajoittaa C3dg:tä sisältävän kompleksin komplementista riippuvan sitoutumisen CR2:ta ilmentäviin solutyyppeihin, joihin kuuluvat B-lymfosyytit, imukerästen dendriittisolut ja ehkä ihon epiteelisolut, ja sulkee pois vuorovaikutuksen fagosyyttisten solutyyppien ' j 25 kanssa. Tämän muuttuneen soluassosiaatiojärjestyksen biologinen seuraus olisi ehkä C3dg:tä sisältävien kompleksien ohjautuminen ensisijaisesti soluihin, jotka liittyvät ; immuunivasteen muodostumisen kehittymisvaiheeseen eikä soluihin, jotka liittyvät partikkelien ja kompleksien poistamiseen ja hajottamiseen. CRl-molekyylejä voidaan siksi käyttää terapeuttisesti ei ainoastaan vaikuttamaan poistoprosesseihin vaan 30 myös kohdistamaan kompleksit CR2-solutyyppeihin, jotka osallistuvat antigeenin esittämiseen ja vasta-aineiden tuotantoon.

::: Vaihtoehtoisessa sovellutusmuodossa voidaan komplementin inaktivoinnin edistä- T miseen käyttää CR1-proteiinia tai sen fragmenttia, joka voi sitoa C3b:tä tai C4b:tä ja/tai jossa on säilynyt kyky vaihtoehtoisten tai klassisten C3- tai C5-konvertaasien : 1 1: 35 inhibitioon tai jossa on säilynyt tekijän I kofaktoriaktiivisuus. Tässä sovellutusmuo- .·. dossa CRl-proteiini tai sen fragmentti voi olla arvokas sellaisten sairauksien hoi- h » » I t » » » « 30 1 1 5 5 2 8 dossa, joihin liittyy haitallinen tai sopimaton komplementtiaktiivisuus (esim. sokki-keuhko, kudosvaurio, joka johtuu palovamma- tai sydäninfarktitiloista, autoimmuunisairauksista, tulehdustiloista jne.).

Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa, joka on esitetty yksityiskohtaisesti kappa-5 leissa 11-14 esitetyissä esimerkeissä, voidaan ilmentää liukoista CRl-proteiinia; jossa haluttu toiminnallinen aktiivisuus on säilynyt, mistä on osoituksena se, että niillä on esimerkiksi kyky inhiboida klassista komplementista riippuvaa hemolyysiä, klassista C5a:n tuottoa, klassista C3a:n tuottoa tai neutrofiilista hapetuspurkausta in vitro. Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa tällaista liukoista CRl-molekyyliä 10 voidaan käyttää tulehduksen ja siihen liittyvien vaurioittavien vaikutusten vähentämiseen tai pienentämään sydäninfarktin kokoa tai estämään perfuusion palautumis-vaurioita jne. Tällaiset in vivo -terapiassa käyttökelpoiset CRl-molekyylit voidaan testata useissa erilaisissa tunnetuissa mallisysteemeissä, joihin kuuluu, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, käänteinen passiivinen Arthus-reaktio (ks. kappale 14.1) ja 15 sydäninfarktin rottamalli (ks. kappale 14.3.).

Vielä yhdessä tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuodossa voidaan käyttää CRl:n fragmenttia tai sen johdannaista, jonka on osoitettu inhiboivan haluttua CRl:n ominaisuutta tai toimintaa, tähän toimintaan liittyvien tautien tai häiriötilojen ehkäisemiseen tai hoitoon.

20 Tunnetaan useita annostelujärjestelmiä ja näitä voidaan käyttää CRl:n ja sitä läheisesti muistuttavien molekyylien annostelemiseksi, esim. kapselointi liposomei-hin, ilmentäminen hematopoieettisten kantasolujen jälkeläissoluissa geeniterapiassa . ’: jne. Muihin annostelujäijestelmiin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, . ; antaminen ihonsisäisiä, lihaksensisäisiä, vatsaontelonsisäisiä, suonensisäisiä, ihon- : ·. 25 alaisia ja nenänsisäisiä annosteluteitä ja suun kautta tapahtuvaa annostelua käyttäen.

6 Esimerkki: Ihmisen C3b/C4b-reseptorin (CR1) kloonaus ja sekvensointi Näissä yksityiskohtaisissa esimerkeissä kuvaamme 5,5 kiloemäsparin (ke) pituisen CRl:n koodaavan alueen kloonauksen ja nukleotidijakson (Klickstein L.B. et ai., (1987) J. Exp. Med. 165, 1095-1112).

30 Kymmenen limittäistä CRl:n cDNA-kloonia, jotka kattavat 5,5 ke, eristettiin nielu-,,.: risakirjastosta ja ne sekvensoitiin kokonaan tai osittain. Näistä tunnistettiin yksi pitkä avoin lukukehys, joka alkoi kloonien 5'-puolelta ja ulottui myötäsuuntaisesti * · . 4,7 ke:n verran lopetuskodoniin). Tämä jakso edustaa noin 80 % CRl:n F-allotyypin • · 31 115528 arvioidusta koodaavasta jaksosta. Tunnistettiin kolme suoraa, pitkää homologista 450 aminohaposta koostuvaa toistumajaksoa (LHR). Trypsiinikäsittelyllä saatujen peptidisekvenssien analyysi antoi todisteita neljännen LHR:n esiintymisestä CRl:n F-allotyypissä. LHR-jaksojen välinen aminohappojen identiteetti ulottui ensimmäi-5 sen ja kolmannen toistumajakson 70-prosenttisesta identiteetistä ensimmäisen ja kolmannen toistumajakson 250 ensimmäisen NH2-terminaalisen aminohapon 99-prosenttiseen identiteettiin. Kukin LHR käsittää seitsemän lyhyttä konsensus-toistumajaksoa (SCR:t), jotka ovat kooltaan 60-70 aminohapon mittaisia ja jotka muistuttavat SCR-jaksoja muissa C3/C4:ää sitovissa proteiineissa, kuten tyypin 2 10 komplementtireseptori, B- ja H-tekijät, C4:ää sitova proteiini ja C2. Kaksi muuta SCR-jaksoa liittävät LHR-jaksot yhteen 25 aminohaposta koostuvaan kalvon läpäisevään alueeseen, joten CRl:n F-allotyyppi luultavasti sisältää ainakin 30 SCR-jaksoa, joista 23 on sekvensoitu. Kunkin SCR-jakson ennustetaan muodostavan kohnoissilmukkarakenteen, jossa neljä säilyvää puolikystiiniä muodostaa disul-15 fidisidokset. Suoraksi järjestyneenä näiden 30 SCR-jakson muodostama jäykähkö rakenneyksikkö pistäisi esiin 114 nm solukalvosta ja saattaisi helpottaa CRl:n vuorovaikutusta immuunikompleksien ja mikrobien soluseinien välisessä tiloissa olevien C3b:n ja C4b:n kanssa. Sytoplasmassa oleva 43 ryhmän muodostama COOH-terminaalinen alue sisältää kuuden aminohapon muodostaman jakson, joka 20 on homologinen epidermaalisessa kasvutekijässä olevan proteiinikinaasi C:llä fosforyloituvan jakson suhteen.

6.1 Materiaalit ja menetelmät 6.1.1 CRl:n trypsiinipeptidien eristys ja sekvenssit • · · CR1 puhdistettiin ihmisen eiytrosyyttien kalvoista peräkkäisillä Matrex Red A- ja ; ·. 25 monoklonaalisella YZ-l-vasta-aineaffiniteettikromatografialla (Wong, W. W., et ai.; , : (1985) J. Immunol. Methods 82, 303). Trypsiinipeptidit valmistettiin ja eristettiin peräkkäisillä gradientti- ja isokraattisilla käänteisfaasi-HPLC:illä (korkean suoritus-kyvyn nestekromatografia) kuten julkaisussa Wong, W. W., et ai., (1985) Proc.

' Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711 on kuvattu. Trypsiinipeptidien analyysi suoritettiin 30 mallin 470A Protein Sequencer -laitteella (Applied Biosystems, Inc. Foster City, : ..: CA) käyttäen 120 PTH-aminohappoanalysaattoria (Applied Biosystems, Inc.).

>» · 1 t a » , 6.1.2. cDNA-kloonien ja genomista saatujen kloonien eristys • · *:··: cDNA kirjasto konstruoitiin Xgtll:ssä ihmisen nielurisojen poly(A)+-RNA:sta julkaisun Wong, W. W., et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711 32 115528 mukaan. RNA-blottaushybridisoinnin mukaan nielurisojen luovuttaja oli homo-tsygoottinen CRl:n F-alleelin (id.) suhteen. cDNA valittiin ennen kloonausvaiheita agaroosigeelissä siten, että siihen tuli mukaan 2 ja 7 ke:n fraktiot. Kiijaston kompleksisuus oh alussa 4.5 x 106 rekombinanttia 100 ng cDNA:ta kohti ja kirjasto 5 monistettiin Escherichia coli -kannassa Y1088. Kiijasto seulottiin (Maniatis, T., et ai., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) CR-koettimilla CR1-1 (ATCC hakunumerot 57330 (E. coli, joka sisältää plasmidin CR1-1), 57331 (puhdistettu CR1-1 DNA) ja CR1-2 (Wong, W. W., et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82,7711), jotka 10 oh leimattu radioaktiivisella leimalla spesifiseen aktiivisuuteen 2-8 x 108 cpm/pg käyttäen katkostranslaatiota. Hybridisointi suoritettiin liuoksessa, jonka koostumus oh 50 % formamidia, 5 x SSC (1 x SSC: 15 mM natriumsitraatti ja 150 mM natriumkloridi) 43 °C:ssa ja suodattimet pestiin 60 °C:ssa 0,2 x SSC:ssa, olosuhteissa, joissa CR2 cDNA kloonien havaitseminen ei ole mahdollista (Weis, J. J., et 15 ai., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83, 5639). Positiiviset kloonit puhdistettiin plakkieristyksen kautta kahdesti ennen restriktiokartoitusta ja DNA-sekvenssin analyysia.

EMBL-3:een konstruoitiin genomikiijasto 15-20 ke:n fragmenteista, jotka oh saatu Sau3AI:Uä osittain pilkotusta ihmisen leukosyytti-DNA:sta. Lähtö vaiheen komplek-20 sisuus oh 1,2 x 106 ja kirjasto monistettiin E. coh -kannassa P239-2. Kirjasto seulottiin cDNA koettimilla CR1-1 ja CR1-2 (Wong, W. W., et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711).

6.1.3 DNA-sekvenssin analyysi •| cDNA-kloonien restriktiofragmentit jatkokloonattiin M13mpl8:ssa tai ; ·. 25 M13mpl9:ssa ja sekvensoitiin dideoksinukleotidiketjun terminaatiomenetehnällä . : (Sanger, F., et ai., (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 5463). Toiset klooneista sekvensoitiin kokonaan tai osittain siten, että ensin muodostettiin järjestyksessä ;; deleetiomutantteja eksonukleaasi III:a käyttäen (Henikoff, S., (1984) Gene 28, 351); ·1 Kukin alue sekvensoitiin molempia nauhoja käyttäen ja useimmissa tapauksissa 30 kukin alue sekvensoitiin M13-jatkoklooneissa, jotka oh konstruoitu kahdesta toi-sistaan riippumatta eristetystä cDNA kloonista (kuva 2). Sekvensointitulokset ana- I · · lysoitiin Wisconsinin yliopiston Genetics Computer Group -analyysiohjelmana (Madison, WI).

I t · · » • · » » 115528 33 6.2 Tulokset 6.2.1. CRl-geenin nukleotidijakso

Koon mukaan valittu nielurisojen cDNA-kiijasto seulottiin CR1-1- ja CR1-2-koettimilla, jotka oli saatu CRl:n cDNA-kloonista λΤ8.3 (Wong, W. W., et ai., 5 (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711). Viisitoista posiitivista faagia tunnistettiin 1.5 x 106 rekombinantin joukosta ja näistä 13 edusti itsenäisiä klooneja. Näistä kymmenelle suoritettiin restriktiokartoitus ja kokonais- tai osittaissekven-sointi dideoksinukleotidiketjun terminaatiomenetelmällä. cDNA kloonien keskinäinen jäij esty s määrättiin sekvenssien yhteisten limittäisten osien perusteella (kuva 10 2) ja niiden havaittiin kattavan 5,5 ke:n suuruisen alueen (kuva 3). Tunnistettiin cDNA-kloonien 5'-päästä alkava yksi pitkä avoin lukukehys, joka ulottui 4,7 ke:n verran myötäsuuntaisesti ja päättyi lopetuskodoniin. Tässä khjastossa olevan CRl:tä vastaavan koodaavan jakson odotetaan olevan 6 ke:n pituinen glykosyloitumattoman reseptorin arvioidun 220 000 daltonin molekyylimassan perusteella (Wong, W. W., 15 et ai., (1983) J. Clin. Invest. 72, 685). Siten nämä kloonit kattavat noin 80 % arvioidusta koodaavasta jaksosta.

Kloonit T49.1 ja T55.1 sisältävät koodaavaa jaksoa 5'-puoleisissa päissään, joka viittaa siihen, että muita 5'-puoleisia koodaavia ja koodaamattomia jaksoja on tunnistamatta. 3'-puoleisella alueella esiintyvät limittäiset kloonit T8.2, T43.1 ja 20 T87.1 sisältävät kalvon läpäisevän ja sytoplasmassa olevan alueen, jotka ovat kussakin kloonissa olevan identtisen jakson koodaamia. Pisimmälle 3'-puoleiseen suuntaan ulottuva klooni T8.2 sisältää 807 ep:n translaatioon osallistumattoman , : jakson, jossa ei ole poly(A) -jaksoa. Klooni T8.3 sisältää 91 ep:n pituisen nukleoti- diasemien 1 406-1 497 välisen deleetion ja klooni T40.1 sisältää 9 ep:n pituisen ; .·. 25 nukleotidiasemien 1 498-1 507 välisen deleetion klooneissa T6.1 ja T55.1 havait- • tuun jaksoon verrattuna. Nämä deleetiot esiintyivät alueilla, joissa oli sekvenssi- homologiaa 5'-puoleisten katkaisukohtien suhteen ja ne voivat edustaa mRNA:ssa olevia katkaisuvirheitä. Kloonit T49.1 ja T55.1 sisältävät 110 ep:n insertion avoi-messa lukukehyksessä olevien nukleotidien 147 ja 148 välissä (kuva 3). Tämän 30 jakson katsotaan olevan osa intronia, koska se ei hybridisoitunut nielurisojen : ..· poly(A)+-RNA-blotteihin, se sisältää 5'-puolella olevan katkaisukohdan *(Breathnach, R., et ai., (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75, 4853) (kuva 3), genomista saaduissa klooneissa sen molemmilla puolilla on esiintyy cDNA-jaksoja ja se siirtää lukukehyksen. Klooni T9.4 sisältää 3'-puoleisessa päässä olevan 0,88 35 ke:n pituisen välijakson, joka ei hybridisoidu nielurisojen poly(A)+-RNA -blotteihin.

» · * • · 115528 34 6.2.2 CRl:n nukleiinihappo-ja aminohappojakson analyysi CRl:n mukleotidijakson pistematriisianalyysi (kuva 3) paljasti kahden tyyppistä sisäistä homologiaa (kuva 4). Ensimmäistä sisäisen homologian tyyppiä edustavat paksut ja yhtenäiset viivat, jotka vastaavat kolmea peräkkäin sijaitsevaa, suoraa ja 5 erittäin homologista toistumajaksoa, jonka koko on 1,35 ke. Nämä nukleotidijaksot koodaavat CRl:n pitkiä homologisia toistumajaksoja (LHR-jaksot). Toista toistuma-jaksotyyppiä edustavat yhdensuuntaiset katkoviivat, jotka vastaavat vähemmän homologisia alueita. Nämä jaksot esiintyvät 190-210 nukleotidin välein ja ne koodaavat CRl:n lyhyitä konsensustoistumajaksoja (SCR-jaksot).

10 cDNA-jaksosta johdettu aminohappo jakso esitetään kuvassa 5 ja kolme LHR-jaksoa, joita merkitään LHR-B:llä, LHR-C:llä ja LHR-D:llä, on asetettu toistensa suhteen samoihin asemiin niiden homologian osoittamiseksi. LHR-B ulottuu ryhmästä 1 ryhmään 438, LHR-C vastaa ryhmiä 439-891 ja LHR-D ulottuu ryhmästä 892 ryhmään 1,341. LHR-C:n ryhmät 451-694 ovat 99-prosenttisesti identtisiä 15 LHR-B:n ryhmien 1-244 suhteen mutta ainoastaan 61-prosenttisesti identtisiä LHR-D:n vastaaviin ryhmiin verrattuna. Sen sijaan LHR-C:n ryhmät 695-891 ovat 91-prosenttisesti identtisiä LHR-D :n ryhmien 1 148-1 341 suhteen mutta vain 76-pro-senttisesti identtisiä LHR-B :n vastaavan alueen suhteen. Siten LHR-C vaikuttaa olevan hybridi, joka käsittää jaksoja, jotka ovat pääasiassa homologisia LHR-B:n 20 ensimmäisen puolikkaan suhteen ja LHR-D:n toisen puolikkaan suhteen. Näitä LHR-jaksoja seuraa kaksi SCR-jaksoa, jotka eivät toistu, 25 ryhmästä koostuva hydrofobinen segmentti ja 43 aminohaposta muodostunut COOH-terminaalinen alue, jolla ei ole sekvenssihomologiaa SCR-jaksojen suhteen (kuva 5).

• CRl:n koodaavan jakson 5'-puoleinen 1,3 ke:n osa edustaa neljättä LHR-jaksoa, : ·. 25 LHR-A:ta (ks. kuva 1 ja kappale 7). Tätä johtopäätöstä vahvisti erytrosyyttien j CRl:n trypsiinipeptidien analyysi. Kymmenellä trypsiinipeptidillä ovat jaksot, jotka ovat identtisiä cDNA-klooneista johdettujen aminohappojaksojen suhteen (tauluk-ko 1).

·· » * * » · •» · ) t I t 35 115528

Taulukko 1

Johdetussa aminohappojaksossa esiintyvät CRl:n trypsiinipeptidit*

Peptidi- Aminohappojakso Ryhmien numerot numero johdetussa jaksossa 5 66 VDFVCDEGFQLKGS-A 330-345 28 GAASL—QG-WSPEAP 732-749, 1,185-1,202 49 ------------IFC-NP-AIL 805-826, 1,258-1,279 35 CQALNKWEPELPSCSR 228-243,678-693 41c DKDNFSPGQEVFYSCEPGYDLR 260-281 10 34b AV-YTCDPHPDRGTSFDLIGESTIR 393-417 44d VCQPPPEILHG 694-704, 1,147-1,157 54d VFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQ 152-179,602-629 57b YECRPEYYGRPFS 19-31, 469-481 39b LIGHSSAECILSGNAA 85-100 15 * Johdetusta aminohappojaksosta havaitut ihmisen erytrosyyttien CRl:n trypsiini-peptidit. Oikeanpuoleisessa sarakkeessa olevat lukualueet osoittavat peptidin sijaintia johdetussa aminohappojaksossa. Kukin väliviiva peptideissä 66, 28 ja 49 osoittaa, että tässä syklissä tunnistettiin useita ryhmiä. Väliviiva peptidissä 34b osoittaa 20 sitä, että tässä syklissä ei tunnistettu ryhmää lainkaan.

Kukin LHR käsittää seitsemän 60-70 aminohapon SCR-jaksoa, jotka ovat luonteenomainen piirre C3:a ja C4:ää sitoville proteiineille (C4bp) (kuva 6A). Maksimaa-: linen CRl:n 23 SCR-jaksojen välinen homologia havainnollistettiin asettamalla tyhjiä välejä keskenään järjestettyihin jaksoihin (kuva 6A). Kussakin toistuma-·. 25 jaksossa esiintyvästä keskimäärin 65 ryhmästä on säilyviä yhteensä 29 ryhmää.

| Näistä ryhmistä on kuusi sellaista, jotka esiintyvät kaikissa SCR-jaksoissa: neljä »· puolikystiiniä, joiden suhteelliset asemat ovat samanlaisia, mikä viittaa siihen, että kukin niistä voi olla osallisena kriittisessä disulfidisidoksessa, ja tryptofaani ja toisen puolikystiinin jälkeinen toinen glysiini (kuva 6A). Muuttumattomien puoli-30 kystiinien välisten jaksojen sekundaarirakenteen analyysi Choun ja Fassmanin '·algoritmia (Chou, P.Y. ja Fasman, G.D., (1974) Biochemistry 13, 222) käyttäen ennustaa suurta todennäköisyyttä β-taipeen muodostumiselle ja pientä todennäköi-syyttä α-kierteen muodostumiselle. Kahden CRl:n genomikloonin, 2.38:n (kuva t < . 6B) ja 2.46:n, sekvenssianalyysi viittaa siihen, että SCR-14 (kuva 6A) on yhden * · . 3 5 eksonin koodaama ja että SCR-23 :n COOH-terminaalinen pää vastaa eksonin päätä.

• I

t t t tili 115528 36

Siten erilliset eksonit voivat koodata CRl:n SCR-jaksoja, jollaista on osoitettu tapahtuvan B-tekijän SCR-jaksojen ollessa kyseessä (Campbell, R.D. ja Bentley, D.R., (1985) Immunol. Rev. 87, 19) ja IL-2-R:n ollessa kyseessä (Leonard, W.J., et ai., (1985) Science 230, 633).

5 CRl:n SCR-jaksojen konsensusjaksoa voidaan verrata SCR-jaksoihin tämän suuren molekyyliperheen muihin jäseniin, joilla tämä luonteenomainen piirre esiintyy (kuva 7). Näihin jäseniin eivät ainoastaan kuulu proteiinit, joilla on C3/C4:ää sitova toiminto, CR2 (Weis, J.J., et ai., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83, 5639), C4bp (Chung, L.P., et ai., (1985) Biochem. J. 230, 133), H-tekijä (Kristensen, T., et ai., 10 (1986) J. Immunol. 136, 3407), B-tekijä (Morley, B. J. ja Campbell, R. D., (1984) EMBO J. 3, 153; Mole, J. E., et ai., (1984) J. Biol. Chem. 259, 3407) ja C2 (Bentley, D. R. ja Porter, R. R., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 1212, Gagnon, J., (1984) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 306, 301), vaan myös proteiinit, joiden ei tunneta omaavan tätä toimintoa, kuten interleukiini-2-reseptori 15 (Leonard, W.J., et ai., (1985) Science 230, 633), β2-glykoproteiini I (Lozier, J., et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 3640), Clr (Leytus, S. P., et ai., (1986) Biochemistry 25, 4855), haptoglobiinin α-ketju (Kurosky, A., et ai., (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77, 3388), ja tekijä XDIb (Ichinose, A., et ai., (1986) Biochemistry 25, 4633). Puolikystiiniryhmät ovat muuttumattomia kaikkien proteiinien 20 SCR-jaksoissa paitsi haptoglobiinissa, jolta puuttuu kolmas puolikystiini. Tiypto-faani on myös muuttumaton muissa paitsi p2-glykoproteiini I:n viidennessä SCR-jaksossa ja Xmb-tekijän kahdessa toistumajaksossa. Muut ryhmät, jotka säilyvät mutta eivät esiinny jokaisessa SCR-jaksossa, pyrkivät ryhmittymään puolikystiinien lähettyville. B-tekijässä ja C2:ssa on vain yksi vapaa tioliryhmä (Christie, D.L. ja 25 Gagnon, J., (1982) Biochem. J. 201, 555; Parkes, C., et ai., (1983) Biochem. J. 213, 201) ja p2-glykoproteiini I:n SCR-jaksoissa ensimmäinen puolikystiini on liittynyt disulfidisidoksella kolmanteen ja toinen neljänteen (Lozier, J., et ai., (1984) Proc. ‘1 i Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 3640).

i CRl:n johdetussa aminohapposekvenssissä on 17 potentiaalista kohtaa N:n välityk-30 sellä liittyville oligosakkarideille ja kaikki näistä ovat solunulkoisella alueella (kuva .. t 6A). Molekyylimassassaero tunikamysiinin läsnä- ja poissaollessa syntetisoitunees- sa CRl:ssä (Lublin, D.M., et ai., (1986) J. Biol. Chem. 261, 5736) ja glukoosiamii- » nipitoisuusanalyysi (Sim, R.B., (1985) Biochem. J. 232, 883) viittaavat siihen, että :··: tässä molekyylissä esiintyy vain 6-8 kappaletta N:n välityksellä sitoutuneita kom- ;··· 35 pleksisia oligosakkarideja, mikä merkitsee sitä, että kaikki potentiaaliset kohdat ei- *, vät ole käytössä. Esimerkiksi asparagiini, joka on johdetun aminohappojakson ryh- > * I « t % .tili k > 115528 37 män 263 kohdalla (kuva 5), tunnistettiin peptidissä 41c (taulukko 1), joka viittaa siihen, että tässä kohdassa ei esiinny glykosylaatiota. Sitä vastoin tunnistamaton aminohappo peptidissä 34b luultavasti vastaa ryhmän 395 kohdalla olevaa glykosy-loitua asparagiinia.

5 Ainoat tunnistetut 5,5 keissä cDNA:ta toistumajaksoja sisältämättömät CRl-jaksot esiintyvät COOH-terminaalisessa alueessa. Tämän alueen sekundaarirakenteen analyysi paljastaa yhden 25 ryhmästä koostuvan otaksutun kalvon läpäisevän segmentin, jolla on vahva hydrofobinen luonne ja suuri α-kierteen muodostamisen todennäköisyys (kuva 5). Tätä jaksoa seuraa välittömästi neljä positiivisen varauk-10 sen omaavaa ryhmää, mikä on useiden kalvoproteiinien tunnusomainen piirre. CRl:n otaksuttu sytoplasmassa oleva osa käsittää 43 ryhmää ja se sisältää kuuden aminohapon muodostaman jakson VHPRTL, joka on homologinen jakson VRKRTL suhteen, joka on proteiinikinaasi C:llä tapahtuvan fosforylaation kohta epideimaali-sen kasvutekijän (EGF) reseptorissa ja erb B -onkogeenituotteessa (Hunter, T., et 15 ai., (1984) Nature 311, 480; Davis, R. J. ja Czech, M. P., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, (1974). Nielurisojen CRl:n sytoplasmassa olevalta alueelta puuttuvat tyrosiiniryhmät.

6.3 Tarkastelu

Noin 80 % F-allotyyppiä olevan CRl:n primäärirakenteesta on saatu selville limit-20 täisiä cDNA klooneja sekvensoimalla. Epätavallisin tässä analyysissä havaittu . CRl:n piirre on perättäisten, suorien ja 450 aminohaposta koostuvien LHR-jaksojen ; esiintyminen, joista neljän ennustetaan esiintyvän F-allotyyppisessä CRlissä, jonka . arvioitu polypeptidiketjun pituus on 2 000 ryhmää (Wong, W. W., et ai., (1983) J.

; Clin. Invest. 72, 685; Sim, R. B., (1985) Biochem. J. 232, 883). Kolme näistä LHR- I · ’ 25 jaksoista on kloonattuja sekvensoitu, kun taas todisteita neljännen esiintymisestä ' .* saatiin trypsiinipeptidien analyysilla. Kukin LHR-jakso käsittää seitsemän SCR- : jaksoa, jotka ovat muiden C3/C4:ää sitovien proteiinien rakenteen peruselementtejä.

Neljän puolikystiinin säilyminen kussakin SCR-jaksossa, ensimmäisen ja kolman- : nen ja toisen ja neljännen puolikystiinin otaksuttu osallistuminen disulfidisidoksiin • ‘ ; 30 (Lozier, J., et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 3640) ja säilyvien amino- • . happojen, kuten β-taipeissa usein havaittujen proliinin, glysiinin ja asparagiinin » * * * · esiintyminen (Rose, G.D., et ai., (1985) Adv. Protein Chem. 37, 1) ovat perusteina ’ * sille ehdotukselle, että SCR-jakso muodostaa kolmoissilmukkarakenteen, jota disul- : fidisidokset pitävät yllä (kuva 8). Tätä puolikystiinien osuutta tukee havainto, että .;.·· 35 lievästi trypsiinikäsitelty CR1 (Sim, R.B., (1985) Biochem. J. 232, 883) ja H-tekijä 115528 38 (Sim, R.B. ja DiScipio, R.G., (1982) Biochem. J. 205, 285) kulkeutuvat ehyinä molekyyleina, kun ne analysoidaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (PAGE) pelkistämättömissä olosuhteissa ja monina trypsiinifragmentteina pelkistyksen jälkeen.

5 Tämän perättäisesti toistuvien SCR-jaksojen ryhmän ennustetaan muodostavan pitkänomaisen rakenteen (kuva 8), jollainen on esitetty H-tekijälle ja ihmisen C4bp:n kullekin alayksikölle (Sim, R. B. ja DiScipio, R. G., (1982) Biochem. J. 205, 285; Whaley, K. ja Ruddy, S., (1976) J. Exp. Med. 144, 1147; Dahlback, B., et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, 3461). C4bp:n alayksiköiden elekt-10 ronimikroskooppitutkimukset viittaavat siihen, että niiden ulkomitta on 30 x 3 nm (Dahlback, B., et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, 3461). Koska kukin alayksikkö koostuu kahdeksasta SCRs-jaksosta (Chung, L. P., et ai., (1985) Biochem. J. 230, 133), yhden SCR-jakson lasketaan olevan 3x3 nm. Jos oletetaan, että CRl:n SCR-jaksoilla on samanlaiset ulkomitat, ja että F-allotyypillä on 30 SCR-15 jaksoa, niin reseptori voisi ulottua jopa 114 nm päähän solukalvosta. Tämän CRl:n rakenteesta tehdyn ehdotuksen kanssa yhdenmukaista on se aiempi havainto, että neutrofulien pinnalla olevan CRlieen sitoutuneen ferritiinillä leimatun vasta-aineen havaittiin usein olevan 50 nm päässä solukalvon ulommasta puoliskosta (Abraham-son, D. R. ja Fearon, D. T., (1983) Lab. Invest. 48, 162). Tämä CRl:n pitkänomai-20 nen rakenne on omiaan helpottamaan reseptorin sisältävien solujen vuorovaikutusta C3b:n kanssa, joka on kovalenttisesti sitoutunut suhteellisen vaikeapääsyisiin kohtiin immuunikomplekseissa ja mikrobisolujen pinnoilla.

•; : Se havainto, että SCR-jakso on CRl:n pääasiallisin ja ehkä ainoa sytoplasman uiko·: \ ; puolinen elementti, antaa rakenteeseen pohjautuvia todisteita läheisestä suhteesta . : 25 tämän reseptorin ja H-tekijän ja C4bp:n välillä, jotka kaksi viimemainittua ovat , yksinomaan tai pääasiassa SCR-jaksoista koostuvia plasmaproteiineja (Chung, L. P., et ai., (1985) Biochem. J. 230, 133; Kristensen, T., et ai., (1986) J. Immunol. 136, I * 3407). CR1 eristettiin ensimmäiseksi erytrosyytin kalvoproteiinina, jolla oli H-tekijän kaltaista aktiivisuutta detergentillä suoritetun solubilisoinnin jälkeen (Fearon, ‘ 30 D.T., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 5867), ja sen havaittiin myöhemmin omaavan H-tekijän ja C4bp:n säätelytoimintoja plasmamembraaniin liittyneenä ol-. ..· lessaan (Iida, K. ja Nussenzweig, V., (1981) J. Exp. Med. 153, 1138). Analysoi- ..maila CRl:n, H-tekijän ja C4bp:n rakenteellisten polymorfiapiirteiden periytymistä näitä kolmea proteiinia koodaavien geenien osoitettiin olevan kytkeytyneitä (de 35 Cordoba, R., et ai., (1985) J. Exp. Med. 161, 1189), ja tämän kytkentäryhmän lo-kuksen ja sille rakenteellisesti sukulaisuutta osoittavan reseptorin, CR2:n, lokuksen 115528 39 on äskettäin osoitettu sijaitsevan kromosomi l:n pitkässä käsivarressa kohdassa b ja q 32 käyttäen in situ -hybridisointia ja somaattisten soluhybridien analyysia (Weis, J.H., et ai., (1987) J. Immunol. 138, 312). Ennen tämän tutkimuksen tekoa ainoana todisteena näiden proteiinien välisestä rakenteellisesta sukulaisuussuhteesta oli 5 niiden aminohappokoostumusten merkittävä samankaltaisuus (Wong, W. W., et ai., (1985) J. Immunol. Methods 82, 303). Tässä hakemusjulkaisussa esitetty havainto, että CRl:ssä on ainakin 23 SCR-jaksoa, muodostaa suoran ja muodollisen osoituksen tämän reseptorin rakenteellisesta sukulaisuussuhteesta H-tekijään ja C4bp:hen (Chung, L.P., et ai., (1985) Biochem. J. 230, 133; Kristensen, T., et ai., (1986) J.

10 Immunol. 136, 3407), jotka ovat samanlaisia toiminnallisia ominaisuuksia omaavia proteiineja, ja B-tekijän Ba- ja C2b-fragmentteihin ja C2:een (Morley, B.J. ja Campbell, R.D., (1984) EMBO J. 3, 153; Mole, J.E., et ai., (1984) J. Biol. Chem. 259, 3407; Bentley, D.R. ja Porter, R.R., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 1212; Gagnon, J., (1984) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 306, 301), jotka 15 ovat C3b:n ja C4b:n kanssa entsymaattisia komplekseja muodostavia komponentteja. SCR-jakso on kuitenkin havaittu myös useissa proteiineissa, jotka eivät kuulu komplementtiin (Campbell, R.D., ja Bentley, D.R., (1985) Immunol. Rev. 87, 19; Lozier, J., et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3640; Leytus, S.P., et al., (1986) Biochemistry 25, 4855; Kurosky, A., et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 20 U.S.A. 77, 3388; Ichinose, A., et al., (1986) Biochemistry 25, 4633) (kuva 7), mikä viittaa siihen, että se ei ehdottomasti edusta C3/C4:ää sitovaa rakennetta. SCR-jak-soja sisältävien proteiinien joukossa SCR-jaksoja omaavien proteiinien joukossa . CR1 on ainutlaatuinen siinä suhteessa, että sillä tämä perusrakenne ja geneettinen ; yksikkö on organisoitu korkeammanasteiseksi LHR-jaksosta koostuvaksi rakenne- . 25 yksiköksi. S-allotyypin ilmentymiseen liittyvän genomista saadun DNA:n 14,5 ke:n •; ; BamHI-fragmentin analyysi viittaa siihen, että CRlissä ainakin yksi toistuva geno- missa oleva yksikkö on pitkä DNA-segmentti, joka sisältää ainakin viittä SCR-jak- * *’ soa koodaavat eksonit ja niiden ulkopuoliset intronijaksot (Wong, W. W., et al., .· (1986) J. Exp. Med. 164, 1531). Nämä tutkimukset ovat myös antaneet aiheen 30 ehdottaa, että S-alleeli sisältää yhden ylimääräisen kappaleen tätä genomissa olevaa ; ': yksikköä verrattuna F-alleelissa esiintyvien yksikköjen lukumäärään. Tämä havainto • yhdessä trypsiinipeptidikartoitustutkimuksen (Nickells, M. W., et al., (1986) Mol.

* . Immunol. 23, 661) ja tässä käsiteltävänä olevan havainnon kanssa, että LHR-jakso edustaa noin 40-50 kD:n suuruista peptidiä, antaa mahdollisuuden ennustaa sen, että 35 S-allotyypissä (290 kD) on yksi ylimääräinen LHR-jakso, kun tätä verrataan siihen : arvioon, että F-allotyypissä (250,000 daltonin molekyylimassa) on neljä LHR-jak- •; · ·: soa.

115528 40

Sen lisäksi, että LHR-jaksojen sekvenssi tarjoaa todisteita duplikaatiotapahtumien esiintymisestä, se myös viittaa siihen, että CR1-geenissä on tapahtunut konversioita. LHR-B ja -D ovat kauttaaltaan keskenään 67-prosenttisesti identtisiä, kun taas LHR-C on 99-prosenttisesti identtinen LHR-B:n kanssa neljän NH2-terminaalisen 5 SCR-jakson suhteen ja 91-prosenttisesti identtinen LHR-D:n kanssa kolmen COOH-terminaalisen SCR-jakson suhteen. Tämä organisaatio ei olisi voinut muodostua yhdessä rekombinaatiotapahtumassa identtisten parentaalisten alleelien välillä tämän hybridi-LHR-jakson syntyessä. Pikemminkin hybridi-LHR-jakso on voinut syntyä geenikonversion kautta (Atchison, M. ja Adesnik, M., (1986) Proc. Natl. 10 Acad. Sei. U.S.A. 83, 2300), jossa LHR-C:n esimuodon sekvenssit korvautuivat LHR-B:ssä tai LHR-D:ssä esiintyvillä sekvensseillä. Näissä LHR-jaksoissa oleva lähes täydellinen identiteetti ja homologisten jaksojen tarkka samapalkkaisuus (kuva 5) voi myös olla kyennyt säilymään sellaisen mekanismin myötävaikutuksella, johon on liittynyt geenikonversio. LHR-jaksoja koodaavien CRl-geenisegmenttien välissä 15 olevien jaksojen homologian suuruuden analyysillä saataisiin määritetyksi se, onko sekvenssien divergenssiä jyrkästi rajoittavana tekijänä ollut geenikonversio vai toiminnallisten tekijöiden asettamat rajoitukset.

Vaikkakin yksi aiempi tutkimus viittasi siihen, että CR1 on yksiarvoinen (Wilson, J.

G., et ai., (1982) N. Engl. J. Med. 307, 981), kukin LHR-jakso voisi edustaa yhtä 20 C3b/C4b:tä sitovaa aluetta, joka tekisi reseptorin multivalentiksi ja soveltuvaksi sitomaan komplekseja, joissa on useita C3b- ja C4b-molekyylejä. Vaihtoehtoisesti erilliset LHR-jaksot voisivat toimia C3b:n ja C4b:n sitomisessa, tässä jäijestyksessä mainittuna (ks. kappale 9), josta saataisiin rakenteellinen peruste H-tekijä- ja C4bp-: aktiivisuuksien yhdistymiselle CRl:ssä. Lopuksi CRl:n LHR-jaksot voivat edustaa : 25 rakenteellisia alueita, joiden tehtävänä on viedä CR1 ulommaksi plasmamembraa- . ί nista, johon viittaavat ehdotettu rakenteellinen malli (kuva 8) ja se, että NH2-termi- naalisen alueen SCR-jaksot sitovat C3b:tä ja C4b:tä, minkä on havaittu pätevän H-tekijän suhteen (Sim, R.B. ja DiScipio, R.G., (1982) Biochem. J. 205, 285; Alsenz, J., et ai., (1984) Biochem. J. 224, 389).

< · ' .30 Proteiinikinaasi C:n aktivaatio forboliestereillä indusoi CRl:n fosforylaation neutro-Hileissä, monosyyteissä ja eosinofiileissä (Changelian, P.S. ja Fearon, D.T., (1986) . J. Exp. Med. 163, 101) ja CRl:n sytoplasmassa olevassa 43 aminohaposta muodos- . ..: tuneessa alueessa on jakso, joka on homologinen epidermaalisessa kasvutekijäresep- torissa olevan kohdan kanssa, joka fosforyloituu proteiinikinaasi C:llä (Hunger, T., :.i.: 35 et ai., (1984) Nature 311, 480; Davis, R. J. ja Czech, M.P., (1985) Proc. Natl. Acad.

Sei. U.S.A. 82, 1974). Tämä sytoplasmassa oleva jakso, joka havaittiin nielurisa- 115528 41 kirjaston kolmessa toisistaan riippumatomassa kloonissa on kuitenkin todennäköisemmin B-solun CRl-jaksoon kuuluva alue, joka ei fosforyloidu proteiinikinaasi C:n aktivaation jälkeen (Changelian, P. S. ja Fearon, D. T., (1986) J. Exp. Med. 163, 101).

5 7 Esimerkki: CRl:n DNA:n 5'-puoleiset jaksot sisältävät neljännen pitkän ho mologisen toistumajakson CRl:n cDNA-jakson osittainen analyysi paljasti rakenteen, jossa kolme 450 aminohapon pituista LHR-jaksoa LHR-B, LHR-C ja LHR-D käsittivät kukin seitsemän 65 aminohapon pituista lyhyttä konsensustoistumaa (SCR-jakso), joka on C3/C4:ää 10 sitovien proteiinien luonteenomainen tunnusmerkki (ks. kappale 6). Tässä patentti-hakemusjulkaisussa kuvatuissa esimerkeissä kuvaamme neljännen aminoterminaa-lisen LHR-jakson, LHR-A:n, kloonauksen ja nukleotidijakson (Klickstein, L. B., et ai., (1987) Complement 4, 180) käyttäen 5'-cDNA-kloonien sekvensointia. LHR-A:n analyysi paljasti, että se on 99-prosenttisesti homologinen LHR-B:n suh-15 teen viiden 3'-SCR-jakson alueella, mutta vain 6Ι-prosenttisesti homologinen kahden 5-SCR-jakson alueella.

7.1 Materiaalit ja menetelmät 7.1.1 cDNA-kirjaston konstruointi

Valikoivalla alukkeella varustettu cDNA-kiijasto, λΗΗ, konstruoitiin 3 pg:sta poly-·. 20 (A)+-RNA:ta, joka oli puhdistettu DMSO.lla indusoiduista soluista, kuten julkai- • suissa Chirgwin, J. M. et ai., (1979) Biochemistry 18, 5290; Aviv, H. ja Leder, P., : . (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 69, 1408; Ausubel, F. M., et ai., (1987)

Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) on kuvat-/ tu, käyttäen seuraavia modifikaatioita. LK35.1:tä, 35-meeristä oligonukleotidia :* 25 5-TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-3' käytettiin oligo- (dT)12-18:n tilalla ja 40 pCi 32P-dCTP;tä lisättiin toisen nauhan synteesin aikana. Kolmasosa cDNA:sta kloonattiin Xgtllissa ja cDNA-kirjasto konstruoitiin ihmisen : nielurisojen poly(A)+-RNA:sta kuten kappaleessa 6.1.2 on kuvattu. Talteen saatiin ’,..: 750 000 toisistaan riippumatonta rekombinanttia.

I · · * · 30 7.1.2 Kloonien ja koettimien eristys ja DNA-jakson analyysi » · · » • cDNA kirjastojen seulontaan käytetyt koettimet olivat CR1-1 (Wong, W. W., et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711) (ATCC hakunumero 57 331), CR-2 '(Wong, W. W., et al„ ks. edellä), CR1-4 (Wong, W. W. et ai., (1986) J. Exp. Med.

115528 42 164, 1531) ja CR1-18, 252 ep:n Sau3AI-fragmentti, joka oli saatu cDNA kloonin λΗ3 0,5 ke:n pituisesta EcoRI-fragmentista λΗ.1, joka vastaa nukleotidejä 101-352 kuvassa 1. Olosuhteiden ollessa jyrkästi rajoittavia CR1-18 hybridisoituu ainoastaan niiden cDNA-kloonien kanssa, jotka koodaavat joko NH2-terminaalista LHR-A:n 5 SCR-jaksoa tai signaalipeptidiä. cDNA-kloonin insertit sekvensoitiin dideoksinukr leotidimenetelmällä (Sanger, F., et ai., (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 5463) sen jälkeen kun fragmentit oli jatkokloonattu M13mpl8:aan ja M13mpl9:ään (Yanisch-Perron, C. et ai., (1985) Gene 28, 351).

7.2 Tulokset 10 Erityisillä alukkeilla varustettu Xgtl 1 cDNÄ-kiijasto, λΗΗ, joka sisälsi 7.5 x 105 rekombinanttia, valmistettiin poly(A)+-RNA:sta, joka oli saatu DMSOilla indusoiduista HL-60-soluista. Nämä solut ilmentävät vain CRl:n F-allotyyppiä (Lublin, D.M., et ai., (1986) J. Biol. Chem. 261, 5736), jonka ennustetaan omaavan neljä LHR-jaksoa (Lapata, M. A., et ai., (1984) Nucl. Acids Res. 12, 5707). Aluke, 15 LK35.1, oli "antisense" -tyyppinen 35-meeri, joka vastasi kuvassa 3 esitettyjä nukle otidejä 896-930 CRl:n osittaisessa cDNA-jaksossa. Tämän oligonukleotidin osoitettiin hybridisoituvan LHR-B:hen, LHR-C:hen ja LHR-D:hen käänteisen transkription olosuhteissa. Kaksisataaviisikymmentä positiivista kloonia tunnistettiin maljaamalla 3.8 x 105 amplifioimatonta yhdistelmä-faagia ja suorittamalla seulonta CRl-cDNA-20 koettimien CR1-1 ja CR1-4 seoksella. Poimittiin kolmekymmentäkahdeksan positiivista kloonia, jotka puhdistettiin käyttämällä plakkieristystä. Näistä klooneista ; ; saatujen EcoRI:llä pilkottujen DNA-näytteiden Southem-blotit seulottiin 23-meeri- ; ! setiä oligonukleotidillä KS23.1, 5-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG-3', joka • ; vastaa nukleotidejä 763-785 kuvassa 3 esitetyssä CRl-cDNA:n osittaisessa jaksossa.

. : 25 Tämä koetin hybridisoituu jyrkästi rajoittavissa olosuhteissa yhteen kohtaan . ·. LHR-B:tä koodaavassa jaksossa, mutta ei LHR-C:tä tai LHR-D:tä koodaaviin jaksoihin. Kloonin λΗ7.1 liittymäjakso (kuva 9) sisälsi kolme EcoRI-fragmenttia, joiden koko oli 1,0 ke, 0,9 ke ja 0,4 ke ja kaksi suuremmista fragmenteista hybridi-soitui KS23. l:een, mikä viittaa siihen, että tämä klooni sisälsi jaksot, jotka koodaa- * ; * 30 vat 5/7 LHR-A:n 3'-puoleisesta jaksosta ja kaikki LHR-B :tä koodaavat jaksot. Tämä '..havainto vahvisti sen, että LHR-A on hyvin homologinen LHR-B:n suhteen. Klooni .;| λΗ3.1 (kuva 9) sisälsi yhden KS23.1-positiivisen EcoRI-fragmentin, jonka koko oli . ..: 1,0 ke ja 5'-puoleisen 0,5 ke:n suuruisen fragmentin, joka hybridisoitui heikosti CRl-4:n kanssa olosuhteiden ollessa jyrkästi rajoittavia. Tämän kloonin ajatellaan -’··* 35 sisältävän vielä lisää 5'-puoleisesta jaksosta, joka muodostaa kokonaisen LHR-A- ’ : jakson, mukaanlukien SCR-jaksot -1 ja -2 ja 0,1 ke vastakkaisessa suunnassa ole- 115528 43 vasta jaksosta. Yhtäkään jäljellä olevista 36 kloonista, jotka kaikki hybridisoituivat CRl-l:n kanssa, ei havaittu koettimella CR1-18, joka on 252 ep:n Sau3AI-firag-mentti kloonin λΗ3.1 0,5 ke:n suuruisesta EcoRI-fragmentista, joka ei hybridisoidu LHR-B:tä, -C:tä tai -D:tä koodaavaan jaksoon.

5 λΗ3.1:η DNA-jakson analyysi paljasti se, että avoin lukukehys jatkui cDNAtn 5'- päähän, joka viittasi siihen, että klooni ei ulottunut translaation aloituskohtaan. Tämän vuoksi suoritettiin cDNA-kiijastojen λΗΗ ja XS2T seulonta uudelleen koettimella CR1-18, ja näin kummastakin tunnistettiin yksi klooni, λΗ10.3 ja λΤ 109.1, tässä järjestyksessä mainittuna. Näiden kloonien EcoRI-fragmentit, jotka hybridi-10 soituivat CRl-18:n kanssa, sekvensoitiin rinnan klooneista XH3.1 ja λΗ7.1 saatujen inserttien kanssa. Koostettu jakso esitetään kuvassa 1 siten, että kuvassa 1 oleva numeron 1531 jälkeinen nukleotidi on kuvassa 3 oleva nukleotidi 1. HL-60:stä ja ihmisen nielurisakirjastosta saatujen cDNA-ldoonien limittäiset jaksot ovat identtisiä.

15 Välittömästi LHR-A:sta vastakkaiseen suuntaan olevat kloonit λΗ10.3 ja λΤ109.1 sisältävät identtiset hydrofobisiksi johtojaksoiksi otaksutut jaksot (Von Heijne, G., (1986) Nucl. Acids Res. 14, 4683), jotka koodaavat 41 aminohappoa, mukaan lukien ATG:n, joka on yhdenmukainen konsensusjakson NNA/GNNATGG suhteen, jonka jakson on esitetty olevan eukaryoottien translaation aloituskohtajakso (kuva 20 10) (Kozak, M., (1986) Cell 44, 283). Toinen ATG, joka sijaitsee vastakkaisessa suunnassa kuusi kodonia valitun ATG:n etupuolella ja välittömästi myötäsuuntaan ;; · * lukukehyksessä olevan lopetuskodonin jälkeen, sopii huonosti yhteen tämän konsen- ·: : sus-jakson kanssa. Tämän CRl:n johtojakson ensimmäiset kolme aminohappoa, • ': MGA, ovat samat kuin mitä on raportoitu CR2-jaksolle. Näiden kahden kloonin I I · .· : 25 jaksoissa esiintyy eroavuuksia ATG:n vastakkaissuuntaisella puolella ja kloonista .··*. λ10.3 peräisin olevan jakson ajatellaan edustavan osaa välissä olevasta jaksosta, t! ‘ _ jollainen on kuvattu kappaleessa 6 kuvattujen muiden CRl:n cDNA-kloonien • · ollessa kyseessä.

: _ *: Signaalipeptidaasin suorittaman pilkkomisen ennustetaan (Von Heijne, G., (1986) ·”*: 30 Nucl. Acids Res, 14;4683) tapahtuvan glysiini-46:n ja glutamiini-47:n välistä, joka ‘ . viittaa siihen, että CRl:n suojauksen sisältävä NH2-terminaalinen pää CR1 (Wong., W. W., et ai., (1985) J. Immunol. Methods 82, 303; Holeis, V. M., et ai., (1986) Complement 3, 63) saattaa johtua pyrrolidoniamidin esiintymisestä. Näiden kloo-: nien sisältämien NH2-tenninaalisen LHR-A:n ensimmäiset kaksi SCR-jaksoa ovat ·;··· 35 vain 61-prosenttisesti identtisiä vastaavan LHR-B:n alueen suhteen, kun taas LHR- 115528 44 S:n SCR-jaksot 3-7 ovat 99-prosenttisesti identtisiä LHR-B:n vastaavien SCR-jakso-jen suhteen (kuva 10). LHR-A:n vertaus LHR-C:hen paljastaa, että kuminastakin vain kolmas ja neljäs SCR-jakso on erittäin homologinen (99-prosenttinen identtisyys). LHR-A:lla ja -D:llä on keskimääräisesti vain 68-prosenttinen identtisyys 5 maksimaalisen identtisyyden ollessa 81 % näiden molempien LHR-jaksojen kuudennen SCR-jakson välillä. Täysin selville saatu CRl:n 5'-cDNA-jakso viittaa siten siihen, että F-allotyyppi käsittää 2039 aminohappoa, joihin kuuluu 41 aminohaposta koostuva signaalipeptidi, neljä LHR-jaksoa, joista kukin sisältää seitsemän SCR-jaksoa, kaksi COOH-terminaalista SCR-lisäjaksoa, 25 ryhmää sisältävä kalvon 10 läpäisevä alue ja 43 aminohappoa sisältävä sytoplasmassa oleva alue. Molekyylissä esiintyy 25 potentiaalista kohtaa N:n välityksellä tapahtuvalle glykosylaatiolle.

7.3 Tarkastelu CRl:n F-allotyypin NH2-terminaalisen pään ja sigaalipeptidin primaarirakenne on johdettu eristämällä ja sekvensoimalla 5'-cDNA-klooneja. Koska CRl-jakso oh 15 luonteeltaan runsaasti toistumia sisältävä, tästä seurasi se, että sopivan strategian kehittäminen oh kriittinen vaihe reseptorin tätä aluetta koodaavien cDNA-kloonien valmistamiseksi ja tunnistamiseksi. Valmistettiin cDNA-kirjasto käyttäen alukkeena 35-meeristä ohgonukleotidiä, jonka tiedettiin hybridisoituvan käänteistranskriptio-olosuhteissa LHR-B:hen, -C:hen ja -D:hen; harkittiin sitä mahdollisuutta, että tämä 20 aluke saattaisi hybridisoitua myös LHR-A:han, jonka oh voitu ennustaa olevan hyvin homologinen LHR-B:n suhteen (ks. kappale 6). Sopivat cDNA-kloonit tunnis-* tettin käyttäen toista ohgonukleotidiä, KS23.1:tä, joka hybridisoituu ainoastaan : : LHR-B:hen rajoittavissa olosuhteissa ja lisää siten todennäköisyyttä löytää 5'- * ; cDNA-klooneja. Löydettiin kaksi kloonia, jotka sisälsivät miltei kaiken jäljellä ole- ; j 25 vasta CRl-jaksosta ja yhden tällaisen kloonin Sau3AI-fragmentin, CRl-18:n, jakso . ·. oh riittävän ainutlaatuinen tämän käyttämiseen muiden 5'-kloonien tunnistamiseksi (kuvat 9 ja 10).

LHR-A:n 5'-alueelta oleva 250 ep:n suuruinen koetin CR1-18, hybridisoitui ei vain : *. 7,9 ja 9,2 ke:n CRl-transkriptiotuotteisiin vaan myös ihmisen nielurisojen RNA:n 2 30 ke:n transkriptiotuotteeseen rajoittavissa olosuhteissa. Tätä ristiinhybridisoituva^ mRNA:ta ei havaittu muilla LHR-jaksoista saaduiha CRl-cDNA-koettimiUa tai . dimetyylisulfoksidilla indusoiduista HL-60-soluista ja HSB-2-T-lymfoblastoidiso- l I t luista saadun RNA:n Northem-bloteissa. CR1 sisältää siten jaksoja, jotka ovat : thomologisia kahden muun B-solujen proteiinin suhteen, joista yksi on tämän juuri •; · *: 35 tunnistetun mRNA:n koodaama ja toinen on CR2.

115528 45 8 Esimerkki: Ihmisen yhdistelmä-CRl:n ilmentäminen

Kuten edellä on kuvattu, on eristetty ihmisen CRl-cDNA-klooneja, jotka kattavat 7.0 ke ja sisältävät avoimen lukukehyksen, joka koodaa 2039 aminohappoa (kuva 1). Reseptorin ehdotettu prekursorimuoto sisältää 41 aminohaposta koostuvan signaali- 5 peptidin, neljä pitkää homologista toistumajaksoa (LHR-jaksoa), joiden koko on 450 aminohappoa ja kukin LHR-jakso käsittää 7 lyhyttä konsensustoistumajaksoa (SCR-jaksoa), kaksi 65 aminohappoa sisältävää COOH-terminaalista SCR-jaksoa, 25 aminohaposta koostuvan solukalvon läpäisevän osan ja 43 aminohapon suuruisen sytoplasmassa olevan alueen. CRl:n F-allotyyppi sisältää 30 SCR-jaksoa. NH2-termi-10 naalinen LHR-jakso, LHR-A (ks. kappale 7), on 61-prosenttisesti identtinen vastaavalla LHR-B:n alueella kahden ensimmäisen SCR-jakson suhteen ja 99-prosentti-sesti identtinen viiden COOH-terminaälisen SCR-jakson suhteen. Kahdeksan CR1-cDNA-kloonin restriktiofragmentit katkaistiin siten, että ne muodostivat 6,9 ke:n täysimittaisen konstruktion ja ne sijoitettiin myötäsuuntaan hiiren metallotioneiinip-15 romoottorin tai sytomegaloviruksen promoottorin jälkeen ja transfektoitiin L (hiiri) -soluihin tai COS (apina) -soluihin. Solun pinnan yhdistelmä-CRl havaittiin epäsuoralla radioimmuunimäärityksellä ja immuunifluoresenssilla. Antigeeniä ei havaittu ollenkaan soluissa, jotka oli transfektoitu pelkällä lähtömuotoisella vektorilla (CR1). Transfektoitujen, I-pintaleimalla varustettujen COS (apina) -solujen 20 immuunisaostuksesta CRl:tä vastaan valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja saostuman analyysistä pelkistämättömissä olosuhteissa suoritetulla natriumdode-kyylisulfaatti (SDS) -polyakryyliamidigeelielektroforeesilla saatiin tulokseksi 190 000 daltonin molekyylimassaisen vyöhyke, joka kulkeutui rinnan ihmisen erytrosyyteistä saadun F-allotyypin kanssa. Oikean molekyylimassan omaavan yh-25 distelmä-CRl-antigeenin ilmentäminen (Klickstein, L. B., et ai., (1988) FASEB J: : 2:A1833) on todisteena siitä, että tämä cDNA sisältää ihmisen CRl:n kokonaisen ' koodaavanjakson.

» 8.1 CRl:n kokonaisen koodaavan alueen sisältävän plasmidin pBSABCD konstruktio « · 30 Kuvaamme plasmidin pBSABCD, joka on täysimittaista (SCR-jaksot 1-30) CR1-proteiinia koodaava vektori, konstruktion. cDNA kloonista λΤ8.2 (Klickstein, L. B., . et ai., (1987) J. Exp. Med. 165, 1095, ks. kappale 6) saatu 2,3 ke:n liittymäjakso jatkokloonattiin pUC18:aan EcoRI-fragmenttina siten, että 5'-pää oli lähimpänä plasmidin moninkertaisen liitosjakson Hindlll-kohtaa. Tälle plasmidille annettiin :*: 35 nimitys pl88.2. pl88.2 katkaistiin Apal:llä ja HindllLlla, ja tämä suuri 4,7 ke:n 115528 46 fragmentti, joka sisälsi CRl-jakson, joka alkoi SCR-jaksosta 26 ja ulottui translaatioon osallistumattomaan 3'-alueeseen sekä vektorijaksot, puhdistettiin geelissä.

cDNA kloonista λΤ50.1 (Klickstein, L. B., et ai., (1987) J. Exp. Med. 165, 1095, ks. kappale 6) peräisin oleva liittymäjakso jatkokloonattiin EcoRI-fragmenttina M13-5 mpl8:aan. Tälle faagille annettiin merkintä 18R50.1. Tämän kloonin replikaatioky-kyinen muoto katkaistiin HindllLlla ja ApaLllä ja 1,45 ke:n fragmentti, joka sisälsi CRl:n SCR-jaksot 18-25, eristettiin, liitettiin ligaasin avulla 4,7 ke:n fragmenttiin pl88.2:sta ja liitoksen tulokseksi saatu molekyyli transformoitiin E. coli DH5Q -kantaan. Tälle plasmidille annettiin merkintä p8.250.1.

10 0,75 kein ja 0,93 kein EcoRI-fragmentit cDNA-kloonista λΤ8.3 (Wong, W. W., et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 22, 7711) jatkokloonattiin plasmidiin pBR327. Näille jatkoklooneille annettiin merkinnät pCRl-1 ja pCRl-2, tässä jäqes-tyksessä mainittuna, ja ne sisälsivät SCR-jaksot 11-14 ja SCR-jaksot 17-21, tässä jä-qestyksessä mainittuna. EcoRI-liittymäjaksot puhdistettiin näistä molemmista. 0,75 15 ke:n pCRl-1-fragmentti pilkottiin SmaLllä ja pilkkoutumistulokset liitettiin ligaasin avulla pUC18:n DNAihan, joka oli katkaistu EcoRLllä ja Smalillä. Eristettiin yksi jatkoklooni, pl81-1.1, johon oli liitetty SCR-jaksoja 12-14 vastaava 0,5 kein jakso. pCRl-2:n 0,93 kein fragmentti pilkottiin HindllLlla, ja liitettiin ligaasin avulla EcoRLllä ja HindllLlla katkaistuun pUC19:ään ja eristettiin jatkoklooni, pl91-2.1, 20 joka sisälsi 0,27 kein liittymäjakson, joka sisälsi SCR-jakson 17.

, cDNA-klooni λΤ6.1 (ks. kappale 6, Klickstein, L.B., et ai., (1987) J. Exp. Med.

I 165, 1095; Wong, W. W„ et ai., (1987) J. Exp. Med. 164, 1531) pilkottiin EcoRLllä ja CR1 SCR -jaksoja 15 ja 16 vastaava 0,37 kein fragmentti jatkokloonattiin pBR322:een. Tälle kloonille annettiin merkintä pCRl-4. Klooni pl81-l. 1 katkaistiin » ’· 25 EcoRLllä ja Scalillä ja eristettiin 1,4 kein fragmentti. Klooni p 191-2.1 (Klickstein, L.B., et ai., (1987) J. Exp. Med. 165, 1095, ks. kappale 6) pilkottiin EcoRLllä ja Scalillä ja 2,0 kein fragmentti eristettiin, liitettiin ligaasin avulla pl81-1.lista saatuun 1,4 kein fragmenttiin ja seos transformoitiin E. coli DH5a -kantaan. Tulokseksi saadulle plasmidille annettiin merkintä pl-11-2. Plasmidi pl-11-2 pilkottiin 30 EcoRLllä, ja pCRl-4:stä saatu 0,37 kein liittymäjakson fragmentti liitettiin ligaasin ‘ . avulla. Saatua plasmidia käytettiin E. coli DH5a -kannan transformaatioon.

» ·

Valittiin jatkoklooni, joka sisälsi 0,39 kein BamHI-Hindlll-fragmentin. Tälle plas- ’·. midille annettiin merkintä pl42 ja se sisälsi CRlin SCR-jaksot 12-17. p8.250.1:stä l · . saatu 3,5 kein EcoRI-HindDI-liittymäjaksofragmentti siirrettiin pGEM3b:hen. Tälle 35 plasmidille annettiin merkintä pG8.250.1. pl42:sta saatu 1,2 Hindlll-fragmentti 115528 47 puhdistettiin ja liitettiin ligaasin avulla pG8.250.1:een, joka oli katkaistu Hindni:lla. Valittiin jatkoklooni, joka sisälsi 2,4 ke:n Pstl-Apal-liittymäjakson ja joka valikoi siten oikean orientaation. Tälle plasmidille annettiin merkintä pCD ja se sisälsi CRl-jaksot SCR-jaksosta 12 CRl:n 3-puoleiseen päähän asti.

5 cDNA-klooni λ5’7.1 (Klickstein, L.B., et ai., Syysk. (1987) Complement 4, 180; ks. kappale 7,) katkaistiin Pstlillä ja SCR-jaksoja 6-12 vastaava 1,35 ke:n fragmentti eristettiin ja liitettiin ligaasin avulla Pstlillä katkaistuun pCDihen. Seos transformoitiin ja valittiin jatkoklooni, joka sisälsi 1,35 ke:n ja 1,1 ke:n Hindlll-fragmentit. Tälle kloonille annettiin merkintä pBCD.

10 cDNA-klooni λ5'3.1 (Klickstein, L.B., et ai., (1987, Complement 4, 180; ks. kappale 7, ) katkaistiin EcoRI:llä ja pilkkoutumistulokset liitettiin ligaasin avulla EcoRIillä katkaistuun pUC18:aan. Eristettiin jatkoklooni p3.11-1, joka sisälsi SCR-jaksoja 3-7 vastaavan 1,0 kein liittymäjakson, joka liittymäjakso puhdistettiin geelissä. cDNA klooni λ5Ί0.3 (Klickstein, L.B., et ai., (1987) Complement 4, 180; ks. 15 kappale 7) katkaistiin EcoRIillä ja SCR-jaksot 1 ja 2 sisältävä 0,63 ke:n liittymä-jakso jatkokloonattiin pUC18:aan. Tälle kloonille annettiin merkintä pl0.3.5. Plas-midi p 10.3.5 pilkottiin osittain EcoRIillä ja lineaarista plasmidia vastaava 3,4 kein fragmentti eristettiin ja se liitettiin ligaasin avulla p3.11-l:stä saatuun 1 kein fragmenttiin. Poimittiin talteen jatkoklooni, pLA, joka sisälsi 1,3 kein Pstl-fragmentin 20 oikeassa liittymäkohdassa ja oikein orientoituneena.

t i ; cDNA-klooni λΤ109.4 (Klickstein, L.B., et ai., (1987) Complement 4, 180; ks.

* * * , ; kappale 7) pilkottiin EcoRIillä ja jatkokloonattiin pUC18:aan. Valittiin jatkoklooni, ; , joka sisälsi translaatioon osallistumattomasta 5'-alueesta alkavaa ja johtojaksoon ja • * 1 SCR-jaksoihin 1 ja 2 ulottuvaa aluetta vastaavan 0,55 kein EcoRI-fragmentin. Plas- 25 midi p 109.4 katkaistiin Pstlillä ja BspMII.lla ja eristettiin 3,0 kein fragmentti, joka * sisälsi vektorin, johtojakson ja SCR-jakson 1. Tämä fragmentti liitettiin ligaasin » _ avulla pLAista saatuun SCR-jaksot 2-5 sisältävään 0,81 kein Pstl-BspMH-fragment- tiin. Tälle uudelle plasmidille annettiin merkintä pNLA. Plasmidi pNLA pilkottiin < » ,· osittain EcoRIillä ja täydellisesti Pstlillä ja CRl-jakson johtojaksosta alkava ja SCR- 30 jaksoon 5 ulottuva 1,1 kein EcoRI-Pstl-fragmentti eristettiin ja liitettiin ligaasin avulla pBluescript KS+ tuotteeseen (Stratagene, San Diego, CA) Xhol-kohdan liit-tämiseksi cDNAin 5'-puolelle. Tälle plasmidille annettiin merkintä pXLA.

, » , , Plasmidi pBCD katkaistiin EcoRVillä ja se pilkottiin sitten osittain Pstlillä ja SCR- ,, ’: jaksosta 6 alkavan ja 3'-puoleiseen translaatioon osallistumattomaan alueeseen päät- 35 tyvän CRl-jakson sisältävä 6,0 kein Pstl-EcoRV-fragmentti eristettiin ja liitettiin li- 48 115528 gaasin avulla PstI + Smal -pilkottuun pXLA:han. Tuloksena olevalle bakteeriperus-taiselle ilmentämisplasmidille, joka sisältää CRl-cDNA:n kokonaisen koodaavan jakson, annettiin merkintä pBSABCD.

8.2 Plasmidin piABCD:n, CRl:n kokonaisen koodaavan jakson sisältävän nisä-5 käsilmentämisvektorin konstruktio ja määritys

Plasmidi pBSABCD pilkottiin XhoI:llä ja Notl.llä ja liittymäjakso liitettiin ligaasin avulla myötäsuuntaisesti ilmentämisvektorin CDM8 4,4 ke:n fragmentissa olevan CMV-promoottorin perään (Seed, B., (1987) Nature 329, 840-842), joka fragmentti oli myös katkaistu näillä restriktioentsyymeillä. Tulokseksi saadulle konstruktiolle 10 annettiin merkintä piABCD (kuva 11). Toisen vaihtoehdon mukaan 6,9 ke:n XhoI-Notl-fragmentti liitettiin ligaasin avulla myötäsuuntaisesti ilmentämisvektoris-sa pMT.neol olevan metallotioneiinipromoottorin jälkeen, joka vektori oli myös katkaistu näillä restriktioentsyymeillä. Tulokseksi saadulle konstruktiolle annettiin merkintä pMTABCD (kuva 11).

15 Valmistettiin lampaan erytrosyyttejä, jotka oli herkistetty kaniinin vasta-aineella (EA) ja pienillä määrillä C4b:tä [EAC4b(lim)j ja 12 000 cpm 125I-C3b:tä solua kohti [EAcC4b(lim),3b] suorittamalla EAC4b(lim):n (Diamedix) peräkkäiset käsittelyt Cl:llä, C2:lla ja I-C3:11a, minkä jälkeen suoritettiin 60 minuutin pituinen inku-bointi 37 °C:ssa gelatiinissa ja veronaalilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuok-20 sessa, joka sisälsi 40 mM EDTA. Toisena vaihtoehtona oli se, että metyyhamiinilla käsitelty C3 [C3(ma)j liitettiin kovalenttisesti lampaan E:hen (erytrosyytit), joka oli ! käsitelty 3-(2-pyridyyliditio)- propionihappo-N-hydroksisukkiini-imidiesterillä (Sig- , . ma) (Lambris, J.D., et ai., (1983, J. Immunol. Methods 65, 277). EAC4b valmistet- : ; tiin käyttäen C4:ää (Hammer, C.H., et ai., (1981) J. Biol. Chem. 256, 3995).

t · , ‘: 25 Sekä piABCD että pMTABCD transfektoitiin DEAE (dietyyliaminoetyyli) -dekst- raanimenetelmällä COS (apina) -soluihin. Yhdistelmä-CRl havaittiin transfektoitu-jen solujen pinnalla immuunifluoresenssilla käyttäen CRl:tä vastaan valmistettua monoklonaalista vasta-ainetta YZ-1 ja 125I-leimattujen solujen immuunisaostusta, ;! jonka jälkeen suoritettiin pelkistämättömissä olosuhteissa tehty SDS-PAGE, jolla ; · ’ 30 saatiin esille proteiini, jonka liikkuvuus oli identtinen sellaiseen CR1 :een verrattuna, ‘ “: joka oli saatu immuunisaostuksella ihmisen erytrosyyteistä, jotka olivat peräisin F- ·;··: allotyypin suhteen homotsygoottisen luovuttajan (Wong, W. W., et ai., (1983) J.

Clin. Invest. 72, 685) ja rosettien muodostuksella C3b:llä päällystettyjen lampaan erytrosyyttien kanssa (Fearon, D. T., (1980, J. Exp. Med. 152, 20). Natiivin ja » · 115528 49 yhdistelmä-CRl-proteiinien identtiset elektroforeettiset liikkuvuudet vahvistivat sen, että CRl:n F-allotyyppi sisältää SCR-jaksot 1-30.

Lisäksi hiiren L-soluille suoritettiin rinnakkaistransfektio DEAE-dekstraanimene-telmällä (Ausubel, F.M., et ai., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, 5 Seidman, J.G. ja Struhl, K., (toim.), John Wiley & Sons, New York, Seed, B., (1987, Nature 329, 840) rinnakkaiskokeina käyttäen 0, 2 tai 4 pg joko piABCD:tä tai pMTABCDitä ja 2 pg pXGH5:tä, ilmaisijaplasmidia, joka ohjaa kasvuhormonin ilmentymistä (Selden, R.F., et ai., (1986) Mol. Cell. Biol. 6, 3173). Solut kerättiin talteen kahden päivän kuluttua ja niistä määritettiin CRl:n ilmentyminen sen peras-10 teella, että ne sitoivat CR1 :tä vastaan valmistettua monoklonaalista YZ 1-vasta-ainet- ta. Havaittiin annos-vastesuhde yhdistelmäplasmidi-DNA:n ja CRl-antigeenin ilmentymisen välillä (taulukko 2).

Taulukko 2

Yhdistelmä-CRl:n ja ihmisen kasvuhormonin annosvasteet rinnakkaistransfor-15 moiduissa L-soluissa YZ1 Anti- CRl-mAB Kasvu-

Maljan pXGH5 pMTABCD pIABCD RIA* hormoni numero (pg) (pg) (pg) (cpm) (ng/ml) 20 1 2 0 0 1444 120 : : 2 2 0 2 6058 130 * : 3 2 0 2 6531 140 i 4 2 0 4 10620 180 ; 5 2 0 4 9898 80 ; *: 25 6 2 2 0 3111 180 . 7 2 2 0 2747 160 8 2 4 0 3547 160 9 2 4 0 3337 140 .,.*· * Radioimmuunimääritystä (RIA) varten käytettiin rinnakkaisia näytteitä, joissa oli , 30 3 x 105 transfektoitua solua 0,1 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua fysiologista suola- liuosta, joka sisälsi 1 % naudan seerumin albumiinia ja 0,02 % natriumatsidia ja joita inkuboitiin 0 °C:ssa 60 minuutin ajan 3 pg/ml YZ-1 IgGl anti-CRl:n kanssa (Changelian, P.S., et ai., (1985) J. Immunol. 134, 1981). Solut pestiin ja suspendoi- * 1 ne : ·': tiin uudelleen 0,1 mkaan puskuria, joka sisälsi 1-2 pCi/ml I-F(ab')2 vuohen hiirtä 115528 50 vastaan valmistettua IgG.tä tai 125I-proteiini-A:ta. 1-2 tunnin kuluttua 0 °C:ssa solut pestiin ja niistä määritettiin 125I.

Plasmidi piABCD ohjasi CRI-antigeenin ilmentymistä lähes kolme kertaa paremmin kuin pMTABCD. Kasvuhormonin pitoisuus kasvatusliuoksessa vaihteli vähem-5 män kuin kaksikertaisesti maljaa 5 lukuunottamatta. Muissa kokeissa tuli ilmi, että piABCD ohjasi CRI-antigeenin hetkellistä ilmentymistä kolme kertaa paremmin COS-soluissa kuin L-soluissa.

CRI-antigeeni esiintyi ryhminä transfektoitujen COS-solujen pinnalla, kun se määritettiin epäsuoralla immuunifluoresenssillä soluista, jotka oli väqätty YZ1 anti-CRl 10 mAB:lla (kuva 12). Tämä yhdistelmä-CRlrn jakautuma COS-soluissa muistuttaa villityyppisen CRl:n jakautumaa ihmisen leukosyyteissä (Fearon et ai., (1981) J. Exp. Med. 153, 1615).

Yhdistelmä-CRl:n molekyylimassa määritettiin suorittamalla piABCD:lla transfektoitujen COS-solujen pinnan käsittely jodin kiinnittämiseksi, solulysaattien immuu-15 nisaostus Sepharose-YZlillä, SDS-PAGE ja autoradiografia. Yhdistelmä-CRl:n molekyylimassa oli pelkistämättömänä 190 000, joka on sama kuin erytrosyyttien CRl:n F-allotyypin ja vähemmän kuin S-allotyypin molekyylimassa (kuva 14).

Yhdistelmä-CRl:n C3b:tä sitova ja C4b:tä sitova toiminto määritettiin rosettien muodostumisella transfektoitujen COS-solujen ja EAC4b:n tai EAC4b(lim),3b:n 20 välillä. Suoritetuissa 31 erillisessä transfektiossa 5-50 % piABCD-plasmidilla trans- | fektoiduista COS-soluista sitoi viittä tai useampaa EAC4b:tä tai EAC4b(lim),3b:tä : (kuva 13). CRl:tä ilmentävät COS-solut eivät muodostaneet rosetteja EAC4b(lim),-

: 3bi:n kanssa, vaikka tämä välituote muodosti rosetteja CR2:ta ilmentävien Raji B

| -lymfoblastoidisolujen kanssa.

25 8.3 CRl-fragmenttien ilmentäminen < *

Konstraoitiin ilmentämisvektoreita, jotka koodasivat osaa CRl:tä koodaavasta jak-: ‘: sosta (deleetiomutantteja) edellä kuvatulla tavalla ja niiden havaittiin ilmentävän *" ‘: näitä vastaavia liittymäjaksoja, kun ne transformoitiin COS-soluihin. CRl-fragmen- ' . tit ilmentyivät solun pintaproteiineina.

» · • · » t · 51 115528 8.3.1 Deleetiomutanttien piBCD, piABD, piACD, piAD, piBD, piCD ja piD konstruointi Näiden deleetiomutanttien konstruointi suoritettiin käyttäen hyödyksi yhden ainoan BsmI-kohdan esiintymistä homologisessa asemassa lähellä kunkin neljän CRl:n pit-5 kän homologisen toistumajakson (LHR-jakson) NH2-terminaalista päätä ja Bsml-kohtien puuttumista muualla CRl-cDNA:ssa ja Bluescript-vektorissa (Stratagene, San Diego, CA). Kymmenen mikrogrammaa plasmidia pBSABCD pilkottiin osittain 50 yksiköllä restriktioentsyymiä BsmI 45 minuutin ajan ja pilkkoutumistuotteet fraktioitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Puhdistettiin 8,55 ke:n, 7,20 ke:n ja 5,85 ke:n 10 DNA-fragmentit, jotka vastasivat parentaalisen plasmidin lineaarisia segmenttejä, joista puuttui yksi, kaksi tai kolme LHR-jaksoa, tässä järjestyksessä mainittuna. Kukin näistä kolmesta fragmentista liitettiin ligaasin avulla itseensä ja ligaatiotulok-sia käytettiin erillisissä kokeissa kompetentin E. coli DH5a -kannan transformaatioon ampisilliiniresistentiksi.

15 Muodostettiin 8,55 ke:n fragmentti, joka oli tulosta pBSABCDin pilkkomisesta kahdesta vierekkäisestä BsmI-kohdasta, joten ligaation jälkeen on mahdollista saada tuloksesi kolme plasmidia, pBCD, pACD ja pABD, joissa isot kirjaimet edustavat plasmidiin jääviä LHR-jaksoja. Nämä voitiin erottaa toisistaan Smal:llä suoritetulla restriktiokartoituksella. DNA valmistettiin 12 pesäkkeestä, pilkottiin SmaLllä ja ero-20 tettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Viidessä kloonissa oli kaksi Smal-fragmenttia, joiden koko oli 2,5 ke ja 6,1 ke, jotka vastaavat LHR-A:ta koodaavan jakson ; *; deleetiota ja jotka siten edustavat pBCD.tä. Kolmella klooneista oli yksi lineaarinen : i 8,5 ke:n kokoinen fragmentti, joka vastasi pACD:tä. Neljällä kloonilla oh kaksi \ ; Smal-fragmenttia, joiden koko oli 1,2 ke ja 7,4 ke ja jotka olivat sen mukaisia kuin . : 25 mitä LHR-C:tä koodaavan jakson deleetiosta odotettiin ja ne muodostivat pABD:n.

, Kunkin näiden kolmen konstruktion 5,6 ke:n suuruinen liittymäjakso puhdistettiin 1 geelissä XhoI:llä ja NotI:llä suoritetun kaksinkertaisen pilkkomisen jälkeen ja liitet- F · tiin hgaasin avulla ilmentämisvektoriin CDM8, joka oli puhdistettu geelissä samoilla restriktioentsyymeillä suoritetun pilkkomisen jälkeen. E. coli DK1/P3 transfor-' ·' 30 moitiin näillä ligaatioseoksilla ja DNA valmistettiin kutakin kloonia edustavasta ..** viidestä pesäkkeestä. Deletoidun CRl-cDNA:n esiintyminen ilmentämisvektorin li- • ··· ittymäjaksossa osoitettiin kaikissa tapauksissa pilkkomalla SacLllä, jossa havaittiin . odotetut kaksi fragmenttia, joiden koko oli 4,20 ke ja 5,75 ke. Näille plasmideille annettiin merkinnät piB CD, piACD ja piABD.

« »» 52 115528 pBSABCDin osittaisesta pilkkomisesta saatu 7,20 ke:n kokoinen fragmentti oli seurausta Bsmlillä suoritetusta pilkkomisesta kolmessa vierekkäisessä kohdassa, tai tämän suhteen samanarvoisessa tapauksessa suuren fragmentin suhteen, kahdessa kohdassa, joiden välille oli jäänyt yksi katkaisemaan kohta ja näin ollen oli mah-5 dollista saada transformaation jälkeen kaksi tulosta, pAD ja pCD. Nämä erotettiin toisistaan kaksinkertaisella pilkkomisella XhoLllä ja PstLllä, joista pAD:n ollessa kyseessä saatiin kaksi fragmenttia, joiden koko oli 1,0 ke ja 6,2 ke, ja pCD:n ollessa kyseessä saatiin lineaarinen fragmentti, jonka koko oli 7,2 ke. Näistä plasmideista saatu 4,2 ke:n suuruinen liittymäjakso puhdistettiin geelissä XhoLllä ja NotLllä 10 suoritetun kaksinkertaisen pilkkomisen jälkeen ja se jatkokloonattiin CDM8:aan kuten edellä. Deletoidun CRl-cDNA:n esiintyminen ilmentämisvektorissa osoitettiin PstLllä ja BgllLlla suoritetulla kaksinkertaisella pilkkomisella. Kloonilla piAD oli 2,4 kein ja 6,2 kein suuruiset fragmentit, kun taas piCDillä oli yksi fragmentti, jonka koko oli 8,6 ke.

15 pBSABCDin pilkkomisesta Bsmlillä saatu 5,85 kein suuruinen fragmentti edustaa täydellisen pilkkoutumisen tuotetta ja E. coli DH5a:n transformaation jälkeen saatiin yksi klooni, pD. Tämä vahvistettiin suorittamalla kaksinkertainen pilkkominen Hindlllilla ja BgllLlla, joista oli tuloksena odotetut 3,7 kein ja 2,2 kein suuruiset fragmentit. Tämän kloonin 2,9 kein kokoinen liittymäjakso puhdistettiin geelissä 20 XhoLllä ja NotLllä suoritetun kaksinkertaisen pilkkomisen jälkeen ja se liitettiin ligaasin avulla ilmentämisvektoriin edellä esitetyn tavan mukaisesti. Saadun piD-kloonin Hindlllilla suoritetusta pilkkomisesta saatiin odotettu 7,3 kein suuruinen ; fragmentti, XhoI + Bglll -pilkkomisesta saatiin 2,2 kein ja 5,1 kein fragmentit ja

SacLllä suoritetusta pilkkomisesta oli tuloksena odotetut 1,5 kein ja 5,8 kein frag-: 25 mentit.

, ·. Plasmidi pBD valmistettiin pilkkomalla pBCD osittain Bsmlillä. Kahdesta vierek- ^ käisestä BsmI-kohdasta suoritettua pilkkomista vastaava lineaarinen 7,2 kein frag- ' mentti puhdistettiin geelissä, liitettiin ligaasin avulla itseensä kuten edellä ja käytet tiin E. coli DH5a:n transformoimiseksi ampisilliiniresistentiksi. pBD tunnistettiin k · ' ·* 30 1,2 kein ja 6,0 kein fragmenttien esiintymisestä Smalillä suoritetun pilkkomisen ..’· jälkeen. 4,2 kein kokoinen liittymäjakso puhdistettiin XhoLllä ja NotLllä suoritetun . ..: kaksinkertaisen pilkkomisen jälkeen ja se siirrettiin CDM8:aan kuten edellä. Klooni . ..: piBD vahvistettiin oikeaksi havaitsemalla, että Hindlllilla suoritetusta pilkkomisesta oli tuloksena odotetut 0,8 kein ja 7,8 kein kokoiset fragmentit.

» » 115528 53 COS-solut, jotka ilmensivät hetkellisesti piABCD-, piBCD-, piCD- ja piD-konstruk-tioita, tässä jäqestyksessä mainittuna, leimattiin pinnastaan 125I:llä ja immuunisaos-tettiin CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-aineella. Pelkistyksen jälkeen suoritetussa SDS-PAGE:ssa piABCD-konstruktion tuottama tuote kulkeutui rinnakkain CRl:n F-5 allotyypin kanssa, kun taas deleetiomutantit osoittivat portaittaista pienentymistä, joka oli suuruudeltaan noin 45 000 daltonia ja joka viittasi yhden, kahden ja kolmen LHR-jakson deleetioon, tässä järjestyksessä mainittuna (kuva 17).

8.3.2 Deleetiomutanttien piPl, piEl, piE2, piE-2, piUl, piU-2 ja piA/D konstruointi 10 Plasmidi piABCD pilkottiin täydellisesti BstEILlla ja kaksi fragmenttia, joiden koko oli 1,35 ke (dupletti) ja 8,6 ke, puhdistettiin geelissä, sekoitettiin ja liitettiin ligaasin avulla, ja E. coli DK1/P3 transformoitiin ampisilliini- ja tetrasykliiniresistentiksi. Pesäkkeet seulottiin hybridisoimalla ne CRl-cDNA-koettimella CR1-4 (ks. kappale 8.1) ja vahvasti positiiviset kloonit poimittiin talteen ja seulottiin vielä pilkkomalla 15 Smalillä. piEl tunnistettiin siitä, että siinä esiintyi kaksi fragmenttia, joiden koko oli 2,7 ke ja 7,3 ke, ja piE2 tunnistettiin yhden 10,0 ke:n suuruisesta lineaarisesta fragmentista. piE-2 tunnistettiin heikosti CR1-4 positiivisena kloonina, joka sisälsi yhden 8,6 kein kokoisen Smal-fragmentin.

Plasmidi piPl saatiin piABCDin täydellisestä pilkkomisesta Pstlillä ja puhdistamalla 20 geelissä suuri 10,0 kein kokoinen fragmentti. Tämä fragmentti liitettiin ligaasin avulla ja E. coli DK1/P3 transformoitiin tällä seoksella. Tästä saatu plasmidi, piPl, , : sisälsi yhden 10,0 kein kokoisen Smal-fragmentin.

: PlasmiditpiUl ja piU-2 valmistettiin transformoimalla ensin dcm'-kanta GM271/P3 » _ _ * plasmidilla pXLA ja eristämällä DNA. Tämä DNA pilkottiin samanaikaisesti : 25 Stulillä ja Notlillä ja 3,3 kein suuruinen fragmentti puhdistettiin geelissä. Plasmidi : \* pBSABCD pilkottiin osittain Nsilillä ja saadut neljän emäsparin suuruiset ylimää räiset 3'-puoleiset nauhan osat poistettiin käsittelemällä E. coliin DNA-polymeraasi . *. Iin Klenow-fragmentilla. Tämä DNA pilkottiin sitten täysin Notlillä ja 5,4 kein ja • # 4,0 kein suuruiset fragmentit puhdistettiin geelissä. Nämä liitettiin ligaasin avulla !’ 30 pXLAin 3,3 kein kokoiseen StuI-Notl-fragmenttiin ja ligaatioseosta käytettiin ’ ' ’: transformoimaan E. coli DH5cc ampisilliiniresistentiksi. Pesäkkeet seulottiin hybri- disoimalla niihin CRlin cDNA-koetin CR1-4, ja positiiviset kloonit tarkistettiin . vielä restriktiopilkkomisella Hindlllilla, josta oli tuloksena kolme fragmenttia, joiden koko oli 0,8 ke, 1,3 ke ja 6,5 ke. pUlin ollessa kyseessä ja kaksi fragmenttia, 35 joiden koko oli 0,8 ke. ja 6,5 ke pU-2:n ollessa kyseessä. Stulillä tasoitetun Nsil- 115528 54 katkaisutuloksen vahvistettiin olevan oikeassa lukukehyksessä sekvensoimalla näiden plasmidien DNA. pU linja pU-2:n liittymäjaksot, jotka olivat kooltaan 5,6 ke ja 4,2 ke, tässä jäijestyksessä mainittuna, puhdistettiin geelissä samanaikaisen pilkkoa misen jälkeen Xholillä ja Notlillä ja nämä liitettiin ligaasin avulla ilmentämisvekto-5 riin CDM8 aiemmin kuvatulla tavalla. Kloonien piU 1- ja piU-2-rakenteet vahvistettiin restriktiopilkkomisella XhoI + Pstlillä, josta saatiin odotetut kaksi fragmenttia, joiden koko oli 1,2 ke ja 8,8 ke piUl:n ollessa kyseessä ja lineaarinen 8,7 kein fragmentti piU-2in ollessa kyseessä.

Plasmidi piA/D valmistettiin pilkkomalla piABCD ensin täydellisesti Pstlillä. Pstl-10 pilkkoutumistuotteet pilkottiin sitten osittain Apalillä ja nauhan vapaat 3'-osat poistettiin E. colin DNA-polymeraasi Iin Klenow-fragmentilla. DNA fraktioitiin sitten agaroosigeelielektroforeesilla ja tästä eristettiin 7,5 kein fragmentti, liitettiin ligaasin avulla ja tätä käytettiin transformoimaan E. coli DK1/P3 ampisilliini- ja tetrasyklii-niresistentiksi. Tämä konstruktio vahvistettiin pilkkomalla samanaikaisesti Kpnl + 15 Saclillä ja tästä oli tuloksena odotetut neljä fragmenttia, joiden koot olivat 0,8 ke, 1,5 ke, 1,7 ke ja 3,3 ke.

9 Esimerkki: C3b:tä ja C4b:tä sitovien alueiden tunnistaminen 9.1. Määritykset ja tulokset

Plasmidit piABCD, piAD, piCD ja piD, jotka sisältävät nimitystensä mukaiset iso-20 jen kirjainten osoittaman(mat) LHR-jakson(sot), transformoitiin COS-soluihin, joita : : käytettiin määrityksissä, joiden tarkoituksena oli määrittää niiden koodaamien CR1- ‘ fragmenttien kyky sitoa C3b:tä tai C4b:tä. Sitoutumismääritykset suoritettiin havait- i ’: semalla erytrosyyttien rosetinmuodostus, joka on seurausta siitä, että täysimittaista CRl-molekyyliä tai CRl-deleetiomutaatiota pinnallaan ilmentävät (hetkellinen 25 ilmentyminen) COS-solut sitovat C3b:llä tai C4b:llä päällystettyjä punasoluja.

. Transfektoituja soluja, joiden pitoisuus oli 1-4 x 106/ml, inkuboitiin C3:a tai C4:ää * »* » ft sisältävien erytrosyyttien kanssa, joiden pitoisuus oli 2-6 x 10 /ml, 0,02 mlin tilavuudessa 60 minuutin ajan 20 °C:ssa. Rosetteja muodostavien transfektoitujen solu-jen prosentuaalinen osuus arvioitiin mikroskooppia käyttämällä siten, että transfek-;·* 30 toitu solu katsottiin rosetiksi, jos siihen oli liittynyt ainakin viisi erytrosyyttiä.

•. · : Tulokset on esitetty taulukossa 3.

t t I » · t * 55 1 1 5 5 2 8

Taulukko 3

Rosettien muodostus CRl:n yhdistelmämuotoja ilmentävien COS-solutransfektant-tien ja C3(ma):ta tai C4(ma):ta sisältävien lampaan erytrosyyttien välillä % Rosetteja muodostavia transfektantteja 5 ---------------------------------------------------------- % Anti-CRl :llä fluoresoivia transfektantteja COS-solutrans- transfektantti EC3 (ma)* EC4 (ma)# piABCD 109 (3)* 62 (2) 10 piAD 8 " 107 piBD 107 " 12 piCD 127 " 32 piD 0 " 0 piA/D 11 (2) 83 (2) 15 piE-2 1 (1) 102 (1) * C3(ma):n lukumäärät erytrosyyttiä kohti olivat 60 000, 350 000 ja 900 000, tässä jäijestyksessä mainittuna, kolmessa kokeessa, joissa tätä välituotetta käytettiin # C4(ma):n lukumäärät erytrosyyttiä kohti olivat 160 000 ja 140 000, tässä jäijestyksessä mainittuna, kahdessa kokeessa joissa tätä välituotetta käytettiin , 20 π Kokeiden lukumäärä

Kussakin kolmessa erillisesä kokeessa EC3(ma):n kanssa rosetteja muodostavien 4 * täysimittaista piABCD-konstruktiota ilmentävien COS-solujen osuus oli samanlai-:: nen kuin se osuus, jolla oli havaittavissa oleva yhdistelmäreseptori, joka määritettiin :immuunifluoresenssilla käyttäen CRl:tä vastaan valmistettua monoklonaalista YZ1-: : 25 vasta-ainetta tai CRl:tä vastaan valmistettua kaniinin antiseerumia (taulukko 3). Sitä vastoin solut, jotka ilmensivät piD.tä, eivät muodostaneet rosetteja, joka viittasi ; siihen, että C3:a sitovan(ien) kohta(ien) on oltava LHR-A:ssa, -B:ssä tai -C:ssä tai . ·. tarvittava näiden läsnäoloa. Yhden kohdan osoitettiin esiintyvän sekä LHR-B:ssä • että -C:ssä osoittamalla, että joko piBD- tai piCD -konstruktioita ilmentävät solut * 30 muodostivat rosetteja EC3(ma):n kanssa. piADitä, piA/D:tä tai piE-2:ta ilmentävillä • soluilla ei ollut vastaavaa C3:a sitovaa toimintoa. Koska piE-2-konstruktio eroaa ; piCD:stä vain sen suhteen, että sillä on LHR-A:n SCR-1- ja -2-jaksot LHR-C:n » * *»

1 I

56 115528 ensimmäisen kahden SCR-jakson tilalla, näiden NH2-terminaalisten SCR-jaksojen täytyy olla tarpeellisia LHR-C:ssä olevan C3:a sitovan kohdan toiminnalle.

Niiden EC4(ma):n kanssa rosetteja muodostavien COS-solujen osuus, jotka ilmensivät täysimittaista piABCD-yhdistelmämolekyyliä oli pienempi kuin se osuus, joka 5 muodosti rosetteja EC3(ma):n kanssa, mikä mahdollisesti heijasti sitä, että C4(ma)-molekyylejä oli vähemmän erytrosyyttiä kohti (taulukko 3) tai että C4:ää sitovia kohtia oli reseptoria kohti vähemmän. Deleetiomutantit, joilla oli kokonainen tai osittainen LHR-A-, piAD-, piA/D- ja piE-2 -konstruktio, sitoivat EC4(ma):aa paremmin kuin deleetiomutantit piBD ja piCD; tämä toiminto puuttui piDiltä. CRl:n 10 C4:ää sitova kohta sijaitsee siten ensisijaisesti LHR-A:ssa, vaikkakin sekundaarisia kohtia voi esiintyä LHR-B:ssä ja -C:ssä. piE-2-konstruktion kohonnut rosetinmuo-dostuskyky piCD:n vastaavan kykyyn verrattuna viittaa siihen, että LHR-A:n SCR-1 ja -2 liittyvät C4:ää sitovaan kohtaan.

CRl:tä vastaan valmistetulla monoklonaalisella YZl-vasta-aineella suoritettu radio-15 immuunimääritys osoitti, että sitä liittyi merkittävästi COS-soluihin, jotka ilmensivät piABCD-, piAD-, piBD- ja piCD -konstruktioita (taulukko 4). piD:llä tai piA/D:llä, joka käsittää LHR-A:n viisi NH2-terminaalista SCR-jaksoa ja LHR-D:n kolme COOH-terminaalista SCR-jaksoa, transfektoidut solut eivät sitoneet CRl:tä vastaan valmistettua YZ1-vasta-ainetta, vaikkakin näiden konstruktioiden tuotteet sitoivat 20 CRl:tä vastaan valmistettua polyklonaalista antiseerumia (taulukko 4). YZl-epi-tooppi esiintyy toistumana LHR-A:ssa, -B:ssä ja -C:ssä, se ei esiinny LHR-A:n NH2-terminaalisissa SCR-jaksoissa eikä se esiinny tai se on saavuttamattomissa , LHR-D:ssä.

t · I » * * » ; · · » i ; » t * 115528 57

Taulukko 4 CRl:tä vastaan valmistetun monoklonaalisen ja polyklonaalisen CRl-vasta-aineen sitoutuminen COS-sohitransfektanttieihin, jotka ilmentävät CRl:n yhdistelmämuo-toja 5 Sitoutunut Sitoutunut COS-solu- monoklonaalinen kaniinin polyklonaa- transfektantti YZl-vasta-aine* linen vasta-aine* piABCD 2362 12277 piAD 2879 19891 10 piBD 3646 21922 piCD 2189 19926 piA/D 410 23052 piD 404 16386 CDM8 428 4886 15 * Rinnakkaisnäytteitä, jotka sisälsivät 3 x 105 solua 0,1 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 1 % naudan seerumin albumiinia ja 0,02 % natriumatsidia inkuboitiin 0 °C:ssa 60 minuuttia CRl:tä vastaan valmistetun YZ1 IgGl -mAb:n kanssa, jonka pitoisuus oli 3 μg/ml (Changelian, P.S., et ai., (1985, J. Immunonol. 134, 1851) tai CRl:tä vastaan valmistetun kaniinin IgG-vasta-aineen 20 kanssa, jonka pitoisuus oli 90 μg/ml. Solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen 0,1 ml:aan puskuriliuosta, joka sisälsi 1-2 pCi/ml 125I-F(ab')2 vuohen hiirtä vastaan vai- • 1 Λί ; mistettua IgG:tä tai I-proteiini-A:ta. 1-2 tunnin kuluttua 0 °C:ssa solut pestiin ja * 1· 125 niistä määritettiin I. Esitetyt luvut ovat kahdesta rinnakkaisesta määrityksestä las- • kettuja keskiarvoja, cpm/3 x 105 COS-solua.

• » · 25 9.2 Tarkastelu ‘ · * Säilyvä BsmI-kohta, joka esiintyi kunkin LHR-jakson ensimmäistä SCR-jaksoa koo- daavan jakson puohvälissä teki mahdolliseksi konstruoida deleetiomutanttien saijan, '· joka vastasi tarkasti LHR-jaksojen rajoja ja piti yllä avoimen lukukehyksen ja neljän • ' : kysteiinien sopivia asemia, jotka ovat taipeen otaksutulle disulfidisidosten muodos- . 30 tuuliselle (kuva 16). Näiden deleetiomutanttien C3(ma):ta ja C4(ma):ta sitovien * · . toimintojen vertailun avulla erotettiin toisistaan ei vain nämä spesifiteetit omaavat LHR-jaksot vaan myös ne SCR-jaksot, jotka ovat kriittisiä ligandispesifisyyden määräytymisen kannalta. Reseptorin piAD-, piA/D- ja piE-2-muotojen kyky, mutta ·:··: ei piD-muodon kyky, välittää transfektoitujen COS-solujen ja EC4(ma):n välistä 58 1 1 5528 rosettimuodostusta osoitti siten, että LHR-A:n kaksi NH2-termmaalista SCR-jaksoa sisälsi kohdan tämän komplementtiproteiinin kanssa tapahtuvaa vuorovaikutusta varten (taulukko 3). Tämä kohta oli vain suhteellisen spesifinen C4(ma):ta kohtaan, koska transfektantit, jotka ilmensivät piAD:tä ja piA/D:tä, pystyivät myös sitomaan 5 EC3(ma):ta (taulukko 3). piBD- ja piCD-konstruktioiden koodaama reseptorin C3(ma):a sitova toiminto, joka osoitettiin rosettimäärityksellä ja tekijän I kofaktori-toiminnolla C3(ma):n pilkkomiseksi (taulukko 3; kuva 18), viittasi siihen C3 (ma):ta kohtaan spesifisten kohtien esiintymiseen Näiden LHR-jaksojen ensimmäisessä kahdessa SCR-jaksossa. Nämä kohdat pystyivät myös vuorovaikutukseen C4(ma):n 10 kanssa (taulukko 3). LHR-A:ssa, -B:ssä ja -C:ssä on siten ensisijaisia mutta toistensa kanssa päällekkäisiä C4:ää ja C3:a sitovia aktiivisuuksia.

Vaihtoehtoisesti on piBD- ja piCD-konstruktioita ilmentävien COS-solujen kyky sitoa EC4(ma):ta voinut aiheutua niiden nukleotidien siirtymisestä, jotka koodaavat LHR-A:n SCR-l:n 36 NH2-terminaalista aminohappoa LHR-B:hen ja -C:hen Bsml- 15 fragmenttien ligaation välityksellä. Nämä 36 aminohappoa eivät kuitenkaan yksin tuoneet mukanaan piD:n tuotteelle C4-rosettimuodostustoimintoa. Emme voi sulkea pois näissä reaktioissa esiintyvää LHR-D:n sekundaarista toimintoa, koska tämä LHR-jakso esiintyi kaikissa konstruktioissa, joille tehtiin toimintakyvyn määritys.

CRl:n kolmen erillisen ligandin tunnistuskohdan löytyminen, joista kaksi on C3b:tä 20 ja yksi C4b:tä varten (kuva 19), viittaa siihen, että kukin reseptorimolekyyli voi kyetä sitomaan tehokkaasti komplekseja, joissa on useita C4b- ja C3b-molekyylejä huolimatta siitä, että niillä on suhteellisen matala affiniteetti monovalentteja ligan- : i deja kohtaan (Amaout, M. A., et ai., (1983) Immunology 48, 229). Tämä havainto ·: taijoaa myös selityksen sille, että liukoinen C4b ei kykene inhiboimaan rosettien : 25 muodostusta C3b:tä sisältävien erytrosyyttien ja ihmisen B-lymfoblastoidisolulinjan . : kesken (Gaither, T. A., et ai., (1983) J. Immunol. 131, 899). Mahdolliset ligandit, . ·. joita varten CR1 olisi voinut erityisesti sopeutua, voivat olla molekulaarisia komple- , ··, kseja C4b/C3b ja C3b/C3b, jotka muodostuvat klassisen ja vaihtoehtoisen reaktio- * » tien aktivaation aikana, tässä järjestyksessä mainittuna. Koska erilliset sitoutumis-30 kohdat esiintyvät kolmessa neljästä LHR-jaksosta, LHR-jaksojen lukumäärän suh- t · ' teen toisistaan poikkeavilla CRl:n rakenteellisilla allotypeillä voi olla merkittäviä toiminnallisia eroavuuksia, jotka aiheutuvat ligandia sitovien kohtien määrän .vaihteluista. Vaikkakaan in vitro -tutkimuksissa ei ole raportoitu erilaisia F, S ja F' ,,..: (A, B ja C, tässä järjestyksessä mainittuna) allotyyppien sitoutumisaktiivisuuksia, ·. 35 pienehköllä F'-allotyypillä, jolla otaksuttavasti on vain kolme LHR-jaksoa, saattaa » ♦ » ^ olla heikentynyt kyky immuunikompleksien poistoon. F'-allotyypin on raportoitu » ♦ 115528 59 mahdollisesti liittyvän systeemiseen punahukkaan (van Dyne, S., et ai., (1987) Clin. Exp. Immunol. 68, 570).

10 Esimerkki: Tekijän I kofaktoriaktiivisuuden osoittaminen

Yhdistelmä-CRl proteiinin ja sen spesifisten fragmenttien sekä solun pintaan sitou-5 tuneiden että solubilisoitujen muotojen osoitettiin omaavan C3b:n tekijän I kofakto-riaktiivisuutta.

Tekijän I kofaktoriaktiivisuusmääritykset suoritettiin käyttäen modifikaatiota julkaistusta menetelmästä (Fearon, D. T., (1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 5867).

10 Solubilisoidun CRl:n ja sen fragmenttien tekijän I kofaktoriaktiivisuuden määrittämiseksi solun pintaan sitoutunut CRl-proteiini ja sen fragmentit solubilisoitiin Nonidet P-40:llä ja lysaatti immuunisaostettiin CRl:tä vastaan valmistetulla mono-klonaalisella vasta-aineella YZ-1, joka oli kytketty Sepharose-rakeisiin. Detergentti-lysaatit, jotka valmistettiin 1 x 106 transfektoidusta COS-solusta immuunisaostettiin 15 peräkkäin Sepharose-UPCIO-antilevaanilla ja Sepharose-YZ-l:llä. Immuunisaostu-masta määritettiin sitten tekijän I kofaktoriaktiivisuus inhiboimalla pestyjä rakeita 60 minuuttia 37 °C:ssa seoksessa, jossa oli 0,5 μg 125I-C3(ma) ja 200 ng tekijää I, 0,05 ml PBS ja 0,5 % NP-40. Inkuboinnin jälkeen radioaktiivisella leimalla leimattua C3(ma):ta sisältävä supematantti analysoitiin SDS-polyakiyyliamidigeelielektro-20 foreesilla ja autoradiografialla. Tekijän I kofaktoriaktiivisuutta osoitti autoradio-: grammissa esiin tulevat C3(ma):n alfa-ketjun alemman molekyylimassan omaavat • i muodot, jotka johtuvat tekijän I proteolyyttisestä pilkkoutumisesta.

t · * *

Solun pinnassa olevan CRl:n ja sen fragmenttien tekijän I kofaktoriaktiivisuuden ,/ määrittämiseksi inhiboitiin transfektoidut CRl-ilmentämisvehorin (piABCD;n, * * ‘ 25 piAD:n, piBD:n, piCD:n, tai piD:n) sisältävät COS-solut seoksen kanssa, jossa oli : ·' 0,5 pg 125I-C3(ma) ja 0,2 pg tehjää I (Fearon, D.T., (1977, J. Immunol. 119, 1248) ja analysoitiin edellä kuvatulla tavalla.

» · , Solun pinnassa esiintyvän yhdistelmä-CRl:n tekijän I kofaktoriaktiivisuus esitetään ·’ kuvassa 15. Tekijä I pilkkoi C3(ma):n alfa-ketjun molekyylimassaltaan 76 000 ja 30 46 000 oleviin fragmentteihin ainoastaan immuuni-immobilisoidun yhdistelmä- » CRl:n tai H-tehjän läsnäollessa (kuva 15). Alueet, jotka vastasivat autoradiogram-. miossa olevia vyöhykkeitä, irroitettiin geelistä ja niistä määritettiin 125I alfa-ketjun . * * *: pilkkoutuneen määrän määrittämiseksi. H-tehjän läsnäollessa pilkkoutui alfa-ketjus- 115528 60 ta 91 %, kun taas kasvavien yhdistelmä-CRl-määrien läsnäollessa pilkkoutui 26 %, 41 %, ja 55 %, tässä järjestyksessä mainittuna. Vaikka pelkästään CDM8-vektorilla transfektoidut COS-solut sisälsivät jonkin verran endogeenistä tekijän I kofaktoriaktiivisuutta, tämän toiminnan lisäys kävi selvästi ilmi piABCDillä, piBDillä ja 5 piCD:llä transfektoiduissa COS-soluissa (kuva 18). 125I-c3 (ma):n pilkkoutumisen ei havaittu käyvän yhtään tehokkaammin piADillä tai piD:llä transfektoiduissa COS-soluissa. Näissä konstruktioissa siten vain niillä deleetiomutanteilla, piBD:llä ja piCDillä, jotka toivat COS-soluihin mukanaan kyvyn C3:n sitomiseen, oli myös tekijän I kofaktoriaktiivisuutta C3:n pilkkomiseksi. Tekijän I kofaktoriaktiivisuus-10 määritysten tulokset, jotka saatiin CRl:n ja sen fragmenttien solun pintaan sidottua ja solubilisoitua muotoa käyttäen, on esitetty taulukossa 5.

Taulukko S

CRl:n ja CRl:n fragmenttien solun pintaan kiinnittyneiden ja solubilisoitujen muotojen tekijän I kofaktoriaktiivisuus 15 Tekijän I kofaktoriaktiivisuus1*

Plasmidi* Solun pinnassa Solubilisoituna piABCD + +

piAD

piBD + ND° 20 piCD + + piD - NDd i a Koodaa määritettyä CR1-proteiinia tai sen fragmenttia ja transfektoitu COS-solui- : ‘ j hin ilmentymistä varten.

i I

« J i (+) merkitsee kofaktoriaktiivisuuden nousua sen endogeenisen tason yläpuolelle, t * ' 25 joka havaitaan transfektoitaessa pelkästään CDM8-vektorilla.

k I

I · c ei määritetty • * j ‘ · ·* ei määritetty, koska LHR-D:stä puuttuu epitooppi, jonka CRl:tä vastaan valmistet- \: tu monoklonaalinen vasta-aine YZ-1 tunnistaa.

a » » «

Kuten taulukossa 5 on osoitettu, piABCDin (koodaa täysimittaista CRl-proteiinia), 30 piBD:n (koodaa LHR-B:tä ja -D:tä) tai piCD:n (koodaa LHR-C:tä ja -D:tä) ilmenty-; :': minen tuotti CRl-tuotteen, jolla oli C3b:n tekijän I kofaktoriaktiivisuutta. Taulukon a » t i · > i 115528 61 5 tulokset antavat siten todisteita siitä, että CRl-proteiini tai sen fragmentti voi edistää komplementin inaktivoitumista.

11 Esimerkki: Liukoisen yhdisteImä-CRl:n ilmentäminen CRl-cDNA modifioitiin yhdistelmä-DNA-menetelmillä siten, että muodostui CRl:n 5 tai CRl:n fragmenttien liukoinen muoto (sCRl). sCRl konstruktiot ilmennettiin nisäkässysteemissä, jossa ilmennetty proteiini erittyi soluista. Tuotettiin suuria määriä liukoisia polypeptidejä, joita kalvoon sitoutuneista CR1-proteiinien muodoista poiketen ei ollut tarpeen solubilisoida, jotta ne olisi saatu liuokseen.

11.1 Materiaalit ja menetelmät 10 11.1.1 Pilkkominen entsyymeillä

Kaikki pilkkomiset restriktioentsyymeillä, kytkijäjaksojen ligaatiot ja T4 DNA-ligaasi- ja E. coli DNA -polymeraasireaktiot suoritettiin valmistajan antamien suositusten mukaan (New England Biolabs, Inc., Beverley, MA). E. Coli DH1- tai DH5a-kannat tehtiin kompetenteiksi Morrisonin menetelmällä, (Morrison, D.A., 15 (1979) Meth. Emymol. 68, 326-331). Kompetentit bakteerisolut transformoitiin DNA:lla Maniatisin, T., et ai., mukaan, (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Plasmidit puhdistettiin alkalisessa liuoksessa suoritetulla solujen hajotuksella tai keittomene-telmällä (Maniatis, T., et ai., ks. yllä).

; 20 11.1.2 DNA-fragmenttien eristys i * > : DNA-fragmentit puhdistettiin agaroosi (BioRad, Richmond, CA) -geeleistä seuraa- I vasti. Sopiva DNA-vyöhyke irrotettiin geelistä veitsen terällä ja agaroosisuikale , *, asetettiin parafilmipalaselle, leikattiin hyvin pieniksi kappaleiksi ja siirrettiin uudelle t I # parafilmipalaselle. Agaroosipalaset rikottiin ja agaroosi siirrettiin 1,5 ml:n vetoiseen i * 25 putkeen. Lisättiin samansuuruinen tilavuus fenolia (Ultra pure, BRL, Gaithersburg, MD) ja seos sekoitettiin pyörresekoittajassa ja pakastettiin sitten -70°C:ssa 10 mi- « » ’ ·** nuuttia ja sentrifugoitiin 10 minuuttia. Vesipitoinen faasi uutettiin vielä kahdesti fenoli/kloroformi-seoksella (1 : 1) ja kahdesti kloroformilla. DNA saostettiin sitten i . _. ; etanolilla, sakka pestiin, kuivattiin tyhjiössä ja suspendoitiin uudelleen liuokseen , 30 jonka koostumus oli 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 ja 1 mM EDTA.

» DNA-fragmentit eristettiin matalassa lämpötilassa hyytyvästä agaroosista (FMC, -;·· Corp., Rockland, ME) seuraavasti. Asianmukainen DNA-vyöhyke irrotettiin aga- 115528 62 roosigeelistä, asetettiin 1,5 ml:n putkeen ja sulatettiin 65°C:ssa 15 minuuttia. Nes-teytynyt geeli uutettiin fenolilla, joka sisälsi 0,1-prosentista natriumdodekyylisul-faattia (SDS, ultra pure, BRL, Gaithersburg, MD). Vesifaasi uutettiin vielä kerran fenoli-SDS-seoksella ja kahdesti kloroformilla. DNA saostettiin sitten etanolilla 2,0-5 molaarisessa NFLt-asetaatissa, kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen veteen.

11.1.3 Transfektio nisäkässoluihin DNA:n transfektio nisäkässoluihin suoritettiin CaP04-saostus- ja glyserolisokkime-netelmällä, jonka ovat kuvanneet Graham ja van der Eb ((1973) Virology 52, 456-467). Kun DUX Bll CHO -soluja oli inkuboitu DNA-kalsiumfosfaattipreparaatissa 10 4-6 tuntia, ne altistettiin glyserolisokille poistamalla kasvatusliuos imulla ja lisää mällä 5 ml 20-prosentista glyserolia sisältävää DMEM-liuosta 1 minuutiksi. Solut pestiin sitten kahdesti täydellisessä alfa-MEM-liuoksessa ja niitä irikuboitiin tässä liuoksessa 48 tuntia.

11.1.4 CHO-transfektanttisolujen viljely 15 DUX Bll CHO -transfektanttisolut kasvatettiin DHFR (dihydrofolaattireduktaasi) -selektioliuoksessa, joka koostui alfa-MEM -liuoksesta (Gibco), josta puuttuivat nukleosidit ja joka oli täydennetty 10-prosentilla dialysoidulla vasikansikiön seerumilla (Gibco) ja 4-millimolaarisella L-glutamiinilla. Amplifiointi suoritettiin kasvattamalla solut nousevissa metotreksaattipitoisuuksissa (Sigma, A- 6770, Amethopte-20 rin) (Kaufman, R.J., et ai., (1985) Molec. Cell Biol. 5, 1750-1759).

11.1.5 Liukoisen CRl-tasojen määritykseen soveltuva ELISA

11.1.5.1 CRl-standardit • * CRl-standardina ELISAissa (entsyymivälitteinen immuunisorbenttimääritys) käytet-tiin hemoglobiinista puhtaiden punasolujen (RBC) kuorien detergenttilysaatteja. 25 Kuoret valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Wong, W. W. ja Fearon D.T., (1987) Meth. Enzymol. 150, 579-585). Lyhyesti, päiväyksen ylittänyt kokoveri ·'" hankittiin Punaisesta Rististä. Punasolut pestiin kolme kertaa PBS-liuoksessa ja tämän jälkeen ne hajotettiin 6 tilavuudessa hypotonista hajotuspuskuria (10 mM Tris pH 8, 0,1 mM PMSF (fenyylimetyyhsulfonyylifluoridi), 0,1 mM TPCK (tosyyli-30 amidifenyylietyyliklorometyyliketoni), aprotoniini, 2 mM EDTA). Kuoret pestiin : :': useita kertoja hajotuspuskuriliuoksessa, laskettiin hemosytometrissä, jaettiin eriin ja • :· i pakastettiin -70 °C:ssa kunnes niitä tarvittiin. CRl-ELISA-määritystä varten kuoret laimennettiin pitoisuuteen 1,6 x 108 kuorta/ml solubilisointipuskuriliuoksessa 115528 63 (10 mM Tris, pH 8, 50 mM KC1, 0,2 % NP40, 0,3 % DOC, 6,2 mM PMSF, 0,2 mM jodiasetamidi, aprotoniini, 0,1 mM TPCK, 2 mM EDTA, 0,2 % NaN3) ja sarj alaimennettiin pitoisuuteen 2,5 x 106 kuorta/ml käytettäväksi standardeina ELISA:ssa. Tehtiin kuvaaja absorbansseista 490 nm:ssa ja mitä tahansa tuntematto-5 maila näytteellä suoritettua määritystä verrattiin tähän kuvaajaan siinä olevien kuori-ekvivalenttien määrän määrittämiseksi millilitraa kohti.

11.1.5.2 CR1-ELISA

Immulon-n-levyt-päällystettiin 100 μΐ/kuoppa käyttäen CRl:tä vastaan valmistetun monoklonaalisen vasta-aineen (klooni J3D3, AMACIOT 17) (Cook, J. et ai., (1985) 10 Molec. Immunol. 22, 531-538) pitoisuutta 0,4 pg/ml PBS-liuoksessa ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa. Tämän jälkeen vasta-aineliuos heitettiin pois ja levyt blokattiin lisäämällä blokkauspuskuriliuosta (1,0 % BSA PBS:ssa) 300 μΐ/kuoppa ja inkuboitiin 37 °C:ssa 2 tuntia. Blokkauksen jälkeen levyt käytettiin välittömästi tai ne varastoitiin 4 °C:ssa kunnes niitä tarvittiin.

15 Levyt pestiin kolme kertaa käyttäen PBS:aa, joka sisälsi 0,05 % Tween-20:a. Näytteitä lisättiin 100 μΐ/kuoppa kahtena rinnakkaisnäytteenä ja ne inkuboitiin 2 tuntia 37 °C:ssa. Näytteet laimennettiin solubilisointipuskuriliuoksessa, mikäli tämä oli tarpeen. RBC-kuoristandardit lisättiin mukaan kuhunkin levyyn. Näytteen inkuboin-nin jälkeen levyt pestiin kolme kertaa ja piparjuuriperoksidaasi (HRP) -konjugaatti 20 (Wilson, M.B. ja NaKane, P.K., (1978) Immunofluorescence and Related Staining Techniques, North Holland Biomedical Press, sivut 215-224) ja monoklonaalinen ·:· vasta-aine YZ1 (Changelian, P.S. et al., (1985, J. Immunol 184, 1851-1858) laimen- I : nettiin 1:8000 liuoksessa, jonka koostumus oli 50 % FCS:ää ja 50 % blokkauspus- .·. kuria, ja tätä lisättiin 100 μΐ/kuoppa. Kahden tunnin pituisen inkuboinnin jälkeen 25 37°C:ssa levyt pestiin uudelleen kolme kertaa PBSillä, joka sisälsi 0,05% Tween-20:tä. Lisättiin ortofenyleenidiamiini (OPD) -substraattia, jonka pitoisuus oli 0,2 % substraattipuskuriliuoksessa (0,36 % sitruunahappo H2O, 1,74 % Na2HP04 x 7H20, 0,1 % timerosaali, 0,4 % H202, pH 6,3), 100 μΐ/kuoppa. Reaktio pysäytettiin 20 minuutin kuluttua huoneenlämmössä käyttäen 2-normaalista H2S04:ää ‘. 30 50 μΐ/kuoppa. Luettiin absorbanssit 490 nm:ssä.

11.2 CRl:tä koodaavien jaksojen geneettinen modifiointi . . CRl:n cDNA koostuu noin 6 951 nukleotidiemäsparista (kuva 1, kappaleet 6 ja 7).

• · *

Natiivin cDNA:n translationaalinen lopetussignaali sijaitsee emäsparin 6145 kohdalla. Tämä proteiini on kalvoon kiinnittynyt reseptorimolekyyli, joka koostuu 115528 64 neljästä pitkästä homologisesta toistumajaksosta (LHR-jaksosta), jotka esiintyvät vapaina solun kalvolla ja kalvon läpäisevästä alueesta, jonka koko on noin 25 aminohappoa ja jota seuraa karboksiterminaalinen sytoplasmaan ulottuva alue. Tämä sytoplasmassa sijaitseva alue käsittää neljäkymmentäkolme aminohappoa. 5 Liukoisten CR1-molekyylien (sCRl) tuottamiseksi käyttämämme strategia oli poistaa solukalvon läpäisevä alue, joka ankkuroi proteiini solukalvoon ja ilmentää sitten lyhennetyt konstruktiot erittyvinä polypeptideinä.

11.2.1 pBSCRlc:n konstruointi

Plasmidi pBSABCD (esimerkki 8) sisältää CRl-cDNA:n nukleotideistä 1-6860 ja 10 siitä puuttuvat translaatioon osallistumattomat jaksot, jotka sijaitsevat EcoRV-koh-dan 3'-puolella nukleotidin 6860 kohdalla. CRl-cDNA omaa yhden kerran esiintyvän Ball-restriktioendonukleaasin tunnistuskohdan emäsparin 5914 kohdalla ja kahdenkymmenenyhdeksän emäsparin etäisyydellä kalvon läpäisevän alueen alusta. PBSABCD pilkottiin ensin BalLllä sellaisen lineaarisen molekyylin muodostami-15 seksi, jolla oli tasaiset päät, ja se liitettiin sitten T4 DNA -ligaasia käyttäen synteettiseen oligonukleotidiin, joka koostui kahdesta 38 nukleotidia käsittävästä komplementaarisesta nauhasta, ja joilla oli seuraava jakso:

5': CCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTtaaCTCGAG

3': GGTTT AC AT GGAGAGC ACGT GTACTACGAATT GAGCT C

20 Tulokseksi saadulla molekyylillä oli ennalleen palautettu Ball-kohta ja muunnettu jakso, joka oli nathvin CRl-jakson mukainen kalvon läpäisevän alueen alussa • ( sijaitsevaan alaniinin asti tämä mukaan lukien. Tämän lisäksi oli välittömästi alanii- : ’ nin jälkeen muodostettu translaation lopetussignaali (pienillä kiijaimilla ja allevii- :" vattuna), jonka jälkeen seurasi XhoI-restriktiokohta muunnetun DNA:n jatkokloo- 25 nauksen helpottamiseksi.

Tämän plasmidin (jolle annettiin merkintä pBSCRlc) pilkkominen XhoLllä irrotti ...; cDNA-liittymäjakson (jolle annettiin merkintä sCRlc) katkaisemalla cDNA:ssa *...: olevan oligonukleotidin välityksellä lisätystä Xhol-kohdasta ja pBSKC+®:n monin- ....: keltaisessa liitosjaksossa olevasta Xhol-kohdasta, joka sijaitsee CRl-cDNA:n 5'- .,.,: 30 puoleisessa päässä. pBSCRlc sisältää seuraavat C-terminaaliset jaksot: • 115528 65

Emäs n:o 5911:

CT GGCC AAAT GTACCT CT CGT GC ACAT GAT GCTT AACT CGAG

Aminohapot: LAKCTSRAHDA END XhoI

-kohta 5 11.2.2. pBSCRls:n konstruointi

Toinen sCRl-konstruktio, jolta puuttui kalvon läpäisevä alue, muodostettiin seuraavasti. pBSABCD pilkottiin SacLllä, joka katkaisi yhdestä ainutlaatuisesta CR1-cDNA:ssa olevan nukleotidiemäsparin 5485 kohdalla sijaitsevasta Sacl-kohdasta ja Sacl-kohdasta, joka sijaitsi CRl-cDNA:n 3'-puoleisessa päässä olevassa isäntäplas-10 midin moninkertaisessa kloonauskohdassa. Tällä tavoin pilkkomalla saatiin erotetuksi 1375 nukleotidiä cDNA:n 3'-päässä olevasta DNA-jaksosta. Tämä fragmentti poistettiin sitten elektroforeettisesti. Vapaat päät saadussa plasmidissa, joka sisälsi jäljelläolevan sCRl-cDNA:n, tasoitettiin T4 DNA -polymeraasia käyttäen ja suoritettiin ligaatio tasoitettuihin päihin. Ligaatioon käytettiin myös Pharmacian yleisk-15 äyttöistä translaation lopetuskohtatuotetta (tuoteluettelon numero 27-4890-01, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ), joka on itsensä suhteen komplementaarinen oli-gomeeri ja joka sisältää translaation lopetussignaalit kaikissa kolmessa lukukehyksessä. Kun ligaatio oli tehty, sCRl-cDNA:han saatiin liitetystä oligomeerista käyttöön uusi translaation lopetussignaali.

20 11.2.3 pBM-CRlc:n konstruointi : pBMT3X on eukaryoottinen ilmentämisvektori (Krystal, M., et ai., (1986) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 83, 2709-2713) joka sisältää ihmisen metallotioneiini-lA-geenin, joka tekee solut vastustuskykyisiksi kohonneita raskasmetallitasoja vastaan, kuten esimerkiksi , kadmiumia vastaan. Vektori sisältää myös hiiren metallotione-25 iini-1-geenin, joka sisältää muokatun Mt-l-proteiinin aloituskodonia edeltävän Xhol-kohdan. Xhol-kohtaa käytetään liittymäjakson sijoituskohtana hiiren Mt-1-promoottorin ohjaamana tapahtuvaa geenien ilmentämistä varten.

< > I

sCRlc-liittymäjakso (noin 5,9 ke) irrotettiin pBSCRlc:stä käyttäen XhoI:tä ja ‘ liitettiin sitten ligaasin avulla pBMT3X-vektorin ainutkertaiseen Xhol-kohtaan.

30 pBMT3X:ssä olevan sCRlc-liittymäjakson oikea orientaatio määritettiin pilkkomal-: la restriktioentsyymeillä (Maniatis, T., et ai., (1982) Molecular Cloning, A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Tulokseksi saadulle plasmidille annettiin nimitys pBM-CRlc.

115528 66 11.2.4 Deleetiomutanttien pT-CRlcl, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 ja pT-CRlc5 konstruktio

Konstruoitiin myös useita eri deleetiomutantteja, joissa olevasta sCRl-cDNA:sta oli poistettu osia spesifisellä tavalla (kuva 20). Kustakin deleetiomutantista puuttui 5 täysimittaisen cDNA:n kalvon läpäisevä alue, jotta mutanttien ilmentäminen tuottaisi liukoisia polypeptidejä.

11.2.4.1 pT-CRlcl pBSCRlc pilkottiin Smalillä, mistä oli tuloksena kaksi fragmenttia, joiden koot olivat 2,56 ke ja 733 ke. Nämä fragmentit erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja 10 7,3 ke:n fragmentti puhdistettiin ja liitettiin ligaasin avulla takaisin itseensä. E. coli DH5a -solut tehtiin kompetenteiksi (Morrison, D.A. (1979) Meth. Enzymol. 68, 326-331) ja transformoitiin sitten ligaatioseoksella. Tulokseksi saadulle plasmidille annettiin nimitys pBL-CRlcl. Tämä konstruktio poisti 38% LHR-Bistä, 100% LHR-C:stä ja 51 % LHR-Distä, jotka kuuluivat CRlc-liittymäjaksoon.

15 Lisäksi se muodosti uudelleen Smal-kohdan 2335/4894 emäsparien liittymäkohdan ja säilytti oikean lukukehyksen. pBL-CRlcl pilkottiin XhoLllä ja CRl-liittymäjakso erotettiin pBluescript®-vektorista. Eristetty CRl-fragmentti liitettiin sitten ilmentä-misvektorin pTCSgpt:n vain kerran esiintyvään Xhol-kohtaan plasmidin pT-CRlc muodostamiseksi.

20 11.2.4.2 pT-CRlc2 i : pBSCRlc pilkottiin Clalillä ja Ballillä, josta saatiin tulokseksi kaksi fragmenttia, .·. joiden koko oli 3,96 ke ja 5,9 ke. Nämä fragmentit puhdistettiin agaroosigeelistä.

Plasmidi pBR322 pilkottiin Clalillä ja Ballillä ja 2,9 kein kokoinen pBR322-frag- ! ! mentti puhdistettiin ja siihen liitettiin ligaasin avulla 5,9 kein kokoinen fragmentti 25 pBSCRlcistä. E. coli DH5a -solut transformoitiin ligaatioseoksella ja tulokseksi saadulle plasmidille annettiin nimitys pBR8.8. Tämä plasmidi pilkottiin Xbalillä, • · ‘ josta muodostui kaksi fragmenttia, joiden koko oli 7,45 ke ja 1,35 ke. 7,45 kein ...: kokoinen fragmentti puhdistettiin agaroosigeelistä ja liitettiin uudelleen takaisin itseensä. Tulokseksi saatu plasmidi, pBR7.45, pilkottiin Clalillä ja Ballillä ja eris-....: 30 tetty sCRl-cDNA:ta sisältävä 4,5 kein kokoinen fragmentti liitettiin ligaasin avulla pBSCRlcistä saatuun 3,96 kein kokoiseen fragmenttiin, jonka tuloksena saatiin '·'·· plasmidi pBL-CRlc2. Tämä konstruktio poisti 90 % sCRl-liittymäjaksossa olevasta ‘:: LHR-B:stä, muodosti uudelleen emäsparien 1637/2987 yhtymäkohdassa sijaitsevan 115528 67

Xbal-kohdan ja piti yllä oikean lukukehyksen. pBL-CRlc2 pilkottiin Xholillä ja sCRl-liittymäjakso erotettiin pBluescript®-vektorista. Eristetty sCRl -fragmentti liitettiin sitten ilmentämisvektorissa pTCSgpt vain kerran esiintyvään Xhol-kohtaan plasmidin pT-CRlc2 muodostamiseksi.

5 11.2.4.3 pT-CRlc3 pBSCRlc pilkottiin NsiLllä, josta saatiin tulokseksi kolme fragmenttia, joiden koot olivat 1,09 ke, 1,35 ke ja 7,46 ke. 7,46 ke:n kokoinen fragmentti puhdistettiin agaroosigeelistä ja liitettiin takaisin itseensä ligaasin avulla, jolloin muodostui plas-midi pBL-CRlc3. Tämä konstruktio poisti 77 % LNR-A:sta ja loppuosan CR1-10 liittymäjaksosta. Nsil-kohta muodostettiin uudelleen emäsparien 463/2907 yhtymäkohtaan. Translaation kehysjakso muunnettiin siten, että "nonsense"-kodoni tuotiin välittömästi uudelleen muodostetun Nsil-kohdan jälkeen. pBL-CRlc3 pilkottiin Xholrllä ja sCRl-liittymäjakso erotettiin pBluescript®-vektorista. Eristetty sCRl-fragmentti liitettiin sitten ilmentämisvektorissa pTCSgpt vain kerran esiintyvään 15 Xhol-kohtaan plasmidin pT-CRlc3 muodostamiseksi.

11.2.4.4 pT-CRlc4 pBSCRlc pilkottiin Pstl:llä. pBluescript®:n moninkertaisella liitosjaksoalueella oleva Pstl-kohta oli poistettu tähän vektoriin suoritetun CR1 cDNA:n ligaation aikana (esimerkki 8.1). Tulokseksi saadut fragmentit, joiden koko oli 1,35 ke ja 8,5 ke, 20 erotettiin geelielektroforeesilla ja 8,5 ke:n kokoinen fragmentti puhdistettiin ja liitet tiin takaisin itseensä, jolloin muodostui plasmidi pBL-CRlc4. Tämä konstruktio : poisti CRl-liittymäjaksossa olevasta LHR-A:sta 31 % ja LHR-B:stä 69 %.

Pstl-kohta muodostettiin uudelleen emäsparien 1074/2424 liittymäkohtaan, jolloin oikea lukukehys säilyi. pBL-CRlc4 pilkottiin XhoI:llä ja sCRl-liittymäjakso erotet-25 tiin pBluescript®-vektorista. Eristetty sCRl fragmentti liitettiin sitten ilmentämis-vektori pTCSgpt:ssä vain kerran esiintyvään Xhol-kohtaan plasmidin pT-CRlc4 muodostamiseksi.

11.2.4.5 pT-CRlc5 •: · ·: pBL-CRlcl pilkottiin Smalillä, minkä seurauksena plasmidi linearisoitui siinä vain ·;.·· 30 kerran esiintyvästä Smal-kohdasta. Plasmidi defosforyloitiin ja se liitettiin fosfory- •. loituun Nhel-liitosjaksoon, joka sisälsi "nonsense"-kodonin (New England Biolabs,

Beverley, MA). Tämän tyyppinen liitosjakso sisältää translaation lopetuskodonin * ’ kaikissa kolmessa mahdollisessa lukuvaiheistusjaksossa ja se myös sisältää Nhel- 115528 68 restriktiokohdan, joka helpottaa "nonsense"-liitosjakson esiintymisen vahvistamista sCRl-cDNA:ssa. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pBL-CRlc5:ksi ja siinä säilyi sCRl-cDNA:n LHR-A ja 62 % LHR-B:stä. PBL-CRlc5 pilkottiin XhoI:llä ja sCRl-liittymäjakso erotettiin pBluescript®-vektorista. Eristetty sCRl-fragmentti 5 liitettiin sitten ilmentämisvektorissa pTCSgpt vain kerran esiintyvään Xhol-kohtaan plasmidin pT-CRlc5 muodostamiseksi.

11.3 Liukoisen CRl:n ilmentäminen

Kuten tässä työssä on osoitettu, sellaisen CRl:n liukoisen muodon ilmentäminen, joka voidaan erittää soluista saannon ollessa korkea, (i) ei rajoitu yhteen tarkasti 10 määräytyvään CRl-cDNA:ssa olevaan kohtaan, jota käytetään deleetion tai lyhentämisen aikaansaamiseksi ja (ii) ei myöskään rajoitu tietyn nimenomaisen ilmentämis-vektorin käyttöön (ks. myöh.). Kyky eritetyn sCRl:n tuottamiseen osoitettiin kahdessa erilaisessa ilmentämissysteemissä.

11.3.1 pTCS-ilmentämisvektorisarjan konstruktio 15 Käytetty pTCS-ilmentämisvektorisaija koostuu kolmesta plasmidista, joilla kaikilla on vain kerran esiintyvä Xhol-kloonauskohta cDNA-molekyylien liittämistä varten (kuva 21). Liitetyn cDNA:n transkriptiota ohjaa peräkkäisten promoottorien kokoelma. SV40:n varhainen promoottori, joka sijaitsee vastasuunnassa ennen adenovirus 2:n pääasiallista myöhäistä promoottoria (AD2 MLP). cDNA:n alkukohdan ja AD2 20 MLPa:n välissä on adenoviruksen kolmiosainen johtojakso. Transkriptiotuotteina olevat mRNA-molekyylit päättyvät polyadenylaatiosignaalin kohdalla, joka saadaan hiiren immunoglobuliini kappa (Igic) -jaksoista, jotka sijaitsevat myötäsuunnassa cDNA:n Xhol-kloonauskohdan jälkeen. Selektoivat markkerit ksantiini-guaniini-fosforibosyylitransferaasi (gpt), dihydrofolaattireduktaasi (dhfr) tai neomysiiniresis-25 tenssi (neo') saatiin liittämällä näitä vastaavat markkerit pSV2gpt:stä, pSV2dhfr:stä tai pSV2neo:sta, tässä jäijeslyksessä mainittuna. Nämä plasmidit taijosivat myös bakteerin replikaatioaloituskohdan ja beta-laktamaasigeenin ampisilliiniresistenssiä varten. Käytettävän vektorin valinta riippuu yleensä siitä, mitä selektoivaa markke-ria tai markkeriyhdistelmää pidetään muita edullisempana rekombinanttien selek-30 tioon.

'· Adenovirus 2:n (Ad2), SV40:n ja pSV2cat:n (Gorman, C., (1985) DNA Cloning, . Osa Π, A Practical Approach, toim. D.M. Glover, IRL Press, sivut 143-190) ja hiiren kappa-immunoglobuliinin täydelliset DNA-jaksot tunnetaan. Jaksot säilytetään GenBank®-tietokannassa ja ne on viety National Biomedical Research -laitok- 115528 69 seen tallennettuina ja viitteinä. Mikä tahansa näistä jaksoista voisi myös toimia sopivien pTCS-vektorisegmenttien lähteenä.

Vektorit pTCSgpt, pTCSneo ja pTCS dhfr konstruoitiin plasmidivälimuodoista pEAXgpt ja pMLEgpt seuraavasti.

5 11.3.1.1 pEAXgptrn konstruktio

Vaihe 1. Ad2 MLP DNA-fragmentti oli johdettu M13 mp9/MLP:stä (Concino, M.F., et ai., (1983) J. Biol. Chem. 258, 8493-8496). Tämä plasmidi sisältää adenovirus 2 -jaksot alkaen nukleotidistä 5778 (Xhol-kohta) ja ulottuen nukleotidiin 6231 (Hindlll-kohta) mukaan lukien PvuII-restriktiokohdan nukleotidin 6069 kohdalla ja 10 SacII-kohdan nukleotidin 5791 kohdalla (ks. NBRF nukleiinihappotietokanta, haku-koodi Gdad2). Xhol-kohdasta HindHI-kohtaan ulottuva fragmentti oli kloonattu M13mp9:n HindlH- ja Sali-kohtiin plasmidin M13mp9/MLP muodostamiseksi.

Plasmidi M13mp9/MLP pilkottiin EcoRIillä ja Hindlllilla ja pienempi MLP:n sisältävä fragmentti eristettiin. pUC-plasmidi (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) 15 pilkottiin myös EcoRIillä ja HindIII:lla ja suurempi fragmentti tästä plasmidista liitettiin sitten ligaasin avulla MLP:n EcoRI-Hindlll fragmenttiin. Tästä oli tuloksena uusi MLPin sisältävä plasmidi, jolla oli pUCin plasmidirunko. Tämä plasmidi pilkottiin Smalillä, liitettiin ligaasin avulla Sall-liitosjaksoihin ja siitä muodostettiin uudelleen rengasmainen plasmidi. Tämä uusi plasmidi pilkottiin sitten PvuIIilla, 20 joka katkaisi plasmidin PvuII-kohdasta, joka sijaitsi asemassa 6069 adenovirus 2 -liittymäjaksossa. Tulokseksi saatu lineaarinen fragmentti liitettiin ligaasin avulla Xhol-liitosjaksoihin ja siitä muodostettiin uudelleen rengasmainen plasmidi. Tämä plasmidi pilkottiin sitten Xholillä ja Sällillä ja pienempi MLP-DNA:ta sisältävä fragmentti eristettiin (fragmentti n: o 1).

: : 25 Vaihe 2. Plasmidi pSV2gpt (American Type Culture Collection (ATCC) hakunume- ro 37 145) pilkottiin PvuIIilla, liitettiin ligaasin avulla Sall-liitosjaksoihin ja pilkot-: tiin Sällillä. Lopullinen tuote oli lineaarinen pSV2gpt-fragmentti, jota käytettiin , ··. gpt-geeninlähteenä (fragmentti n:o 2).

v! Vaihe 3. Hiiren immunoglobuliini IgKin fragmentti (Hieter, P.A., et ai., (1980) Cell ·;··· 30 22, 197-207) pilkottiin Haelllilla ja AvalLUa ja polyadenylaatiojaksot sisältävä fragmentti eristettiin. Hiiren Igin kappa-jaksossa, joka on saatavilla NBRF nukleiini-happotietokannassa (hakukoodi Kcms), Igin lopetuskodoni on asemassa 1296, jota ’ ’ seuraa Avall-kohta asemassa 1306, polyadenylaatiokohta AATAAA asemassa 1484 115528 70 ja Haelll-kohta asemassa 1714. Tämän fragmentin vapaat päät täytettiin E. colin DNA-polymeraasilla ja fragmentti liitettiin sitten ligaasin avulla Xhol-liitosjaksoihin ja pilkottiin Xholillä. Tämä fragmentti (fragmentti n:o 3) toimi polyadenylaatiokoh-dan lähteenä.

5 Vaihe 4. Fragmentit 1, 2, ja 3 liitettiin yhteen T4 DNA -ligaasilla rengasmaisen plasmidin muodostamiseksi. Fragmenttien oikea orientaatio tässä plasmidissa vahvistettiin restriktioentsyymianalyysilla. Myötäsuunnassa cDNA-kloonauskohdan XhoI jälkeen oli hiiren kappa-polyadenylaatiokohta ja vielä kauempana tästä kohdasta oli SV40-promoottori ja gpt-geeni. Vastakkaiseen suuntaan Xhol-kohdasta oli 10 MLP-promoottori ja tässä suunnassa vielä kauempana tästä promoottorista oli bakteerin replikaation alkukohta ja ampisilliinigeeni. Tämä plasmidi pilkottiin sitten Sällillä ja vapaat päät täytettiin E. cölin DNA-polymeraasilla. Tulokseksi saatu päistään tasoitettu fragmentti liitettiin ligaasin avulla EcoRI-liitosjaksoihin ja muutettiin uudelleen rengasmaiseksi T4 DNA -ligaasilla. Tälle lopulliselle plasmidille 15 annettiin nimitys pEAXgpt.

11.3.1.2 pMLEgpt:n konstruktio

Vaihe 1. Plasmidi pMLP CAT (Lee, R.F., et ai., (1988) Virology, 165, 51-56) on ilmentämisplasmidi, jolla on pML-vektorin runko ja se sisältää adenovirus 2 MLPin ja kolmiosaiset johtojaksot CAT-geenin 5'-puolella. pMLP CAT pilkottiin Xholillä 20 ja SacIIilla, XhoI katkaisi kohdassa, joka oli CAT-geenin ja kolmiosaisen johtojak-son L3-alueen välissä ja SacII katkaisi asemasta 5791, joka oli adenovirus-DNAissa mutta MLPin 5'-puolella. AD2 MLP ja kolmiosainen johtojakso sijaitsivat siten i ; tässä pienessä XhoI-SacII -fragmentissa (fragmentti nio 4).

!. Vaihe 2. Plasmidi pEAXgpt pilkottiin Xholillä ja SacIIilla ja pienempi MLPin sisäl- 25 tävä fragmentti heitettiin pois. Suurempi fragmentti (fragmentti n: o 5) eristettiin. · ‘ Fragmentit 4 ja 5, joissa molemmissa oli SacII- ja Xhol-päät, liitettiin ligaasin avulla plasmidin pMLEgpt muodostamiseksi.

» , · · . 11.3.1.3 pTCSgptm konstruktio • :· : Vaihe 1. pMLEgpt pilkottiin SacIIilla ja päät täytettiin T4 DNA-polymeraasilla ·;··· 30 tasaiset päät omaavan fragmentin muodostamiseksi (fragmentti 6). Tämä SacII-kohta *. sijaitsee nukleotidin 5791 kohdalla adenovirus 2in jaksossa ja kolmiosaisen MLPr ' ·: * | johtojakson 5'-puolella.

115528 71

Vaihe 2. pSV2dhfr (ATCC hakunumero 37 146) pilkottiin HindllLlla ja PvuILlla. Pienempi 342 nukleotidin fragmentti, joka sisälsi SV40:n varhaisen promoottorin, muunnettiin tasapäiseksi käyttäen E. colin DNA-polymeraasin Klenow-fragmenttia (fragmentti 7). Fragmentit 6 ja 7 liitettiin T4 DNA-ligaasilla. Restriktioentsyymi-5 analyysi vahvisti, että fragmentit olivat orientoituneet oikein ja että niistä saatiin kaksi peräkkäistä promoottoria, jotka ovat vastasuunnassa ennen cDNA-kloonaus-kohtaa XhoI ja siten, että kumpikin promoottori kykenee aloittamaan RNA-syntee-sin samaan suuntaan. Tälle plasmidille annettiin nimi pTCSgpt (kuva 22).

11.3.1.4 pTCSdhfr:n konstruktio 10 Vaihe 1. pSV2dhfr pilkottiin HindllLlla ja PvuILlla ja suurempi fragmentti puhdistettiin sitten agaroosigeehstä (fragmentti n:o 8). Pienempi SV40:n varhaisen promoottorin sisältävä fragmentti heitettiin pois.

Vaihe 2. pTCSgpt pilkottiin EcoRLllä ja täytettiin sitten E. colin DNA-polymeraasin Klenow-fragmentilla tasaisten päiden muodostamiseksi. Tämä lineaarinen 15 fragmentti pilkottiin sitten HindllLlla ja tästä eristettiin fragmentti (noin 1600 nukleotidiä), joka sisälsi SV40-promoottorin pTCS-transkriptioyksikön, MLP:n kolmiosaisen johtojakson, cDNA-kloonauskohdan XhoI, hiiren IgX-jaksot ja toisen SV40-promoottorin (fragmentti n:o 9). Tällä fragmentilla oli yksi tasainen pää ja yksi vapaa Hindlll-pää. Fragmenttien 8 ja 9 liittäminen ligaasilla muodosti plasmi-20 din pTCSdhfr.

11.3.1.5 pTCSneo:n konstruktio

Vaihe 1. pSV2neo (ATCC No. 37149) pilkottiin HindllLlla ja BamHL.lla ja suurempi fragmentti (fragmentti n:o 10) eristettiin. Tämä fragmentti sisälsi plasmidirungon ,..: ja neo-geenin.

> I 1 , • » 25 Vaihe 2. pTCSdhfr pilkottiin HindllLlla ja BamHLllä ja pTCS-transkriptioyksikkö ... (fragmentti n:o 11) eristettiin agaroosigeelistä pilkkoutumistuotteiden elektroforee sin jälkeen. Fragmenttien 10 ja 11 liittäminen ligaasilla muodosti plasmidin ·;·1 pTCSneo.

* # » · 1 • · * » • · 115528 72 11.3.2 Plasmidien pBSCRlc, pBSCRls ja pBM-CRlc liukoista CRl:ta koodaa-vat jaksot sisältävien nisäkäsilmentämisvektorien ilmentäminen ja määritys 11.3.2.1 CRl-cDNA:n eri asemista lyhennettyjen CRl-konstruktioiden ilmentäminen 5 Konstruoitiin plasmidit pBSCRlc ja pBSCRls (kappale 11.1) siten, että suurin osa cDNA:n koodaavista alueista lukuun ottamatta kalvon läpäisevää ja sytoplasmassa olevia alueita säilyi (kuva 20). pBSCRls on lyhempi kuin pBSCRlc, koska siltä puuttuu myös osa LHR-D:tä ja SCR-jaksot 29 ja 30, jotka molemmat esiintyvät pBSCRlcissä. Näiden plasmidien sCRl-osat liitettiin pTCSgpthen, minkä jälkeen 10 suoritettiin transfektio ja ilmentäminen edellä kuvatulla tavalla.

PBSCRlc/pTCSgpt-konstruktio: pBSCRlc pilkottiin XhoLllä 5,9 ke:n kokoisen liittymäjakson, sCRlc.n, muodostamiseksi. sCRlc liitettiin pTCSgptin cDNA-kloo-nauskohtaan XhoI pBSCRlc/pTCSgptin muodostamiseksi.

PBSCRls/pTCSgpt konstruktio: pBSCRls pilkottiin XhoLllä ja Pvul.llä sCRls-liit- 15 tymäjakson vapauttamiseksi. Liittymäjakson päät tasoitettiin T4 DNA -polymeraa- silla. Tämä liittymäjakso puhdistettiin agaroosigeelistä. Vektori pTCSgpt pilkottiin

XhoI:llä ja vapaat Xhol-päät täytettiin E. colin DNA-polymeraasi Iillä. Seuraavaksi sCRls-liittymäjakso liitettiin ligaasin avulla tasaisilla pälliä varustettuun vektoriin pBSCRls/pTCSgptin muodostamiseksi. Plasmidit pBSCRlc/pTCSgpt ja 20 pBSCRls/pTCSgpt pilkottiin FspLllä ja saadut lineaariset DNA-molekyylit trans- fektoitiin kiinanhamsterin munasarjasoluihin, jotka olivat dhfr-geenin mutantteja (CHO DUX Bll -solut), kalsiumfosfaatilla suoritetun plasmidin pSV2dhfr rinnak- kaissaostuksen välityksellä. Transfektantit selektoitiin niiden kyvyn perusteella kasvaa DHFR-selektioliuoksessa. Transfektanttikloonien viljelmien supematanteista 25 määritettiin erittyvä sCRl käyttäen ELISAa. Määritettiin viidestäkymmenestä pBSCRlc/pTCSgpt-rekombinantista saadut viljelmien supematantit ja positiivisille rekombinanteille suoritettiin monistus viljelemällä niitä nousevissa metotreksaatti- '· pitoisuuksissa. Tämän lisäksi valmistettiin transfektanttien yhdistelmäviljelmä vilje- lemällä kahdeksaa pBSCRlc/pTCSgpt-transfektanttia yhdessä yhtä yhdistelmäviljel- / 30 mää kohti ja suorittamalla näille samanlainen monistus. Monistuksen tulokset on » · esitetty taulukossa 6.

* · * · · • t · 1 1 » » » · • · 115528 73

Taulukko 6 pBSCRlc/pTCSgpt:n ilmentäminen

Erittynyt liukoinen CR1 (μβ/πύ)

Klooni OMTX 20 nMMTX 50 nM MTX lOOnMMTX 500nMMTX

5 2* 0,7 3,4 11 10,9 4 0,04 0,1 6 0,04 9 0,02 10 0,2 10 11 0,12 12 0,14 13 0,07 14 0,2 15 0,45 1,1 7,3 9,0 15 21 0,07 30 0,27 <0,02 <0,02 35*t 0,82 6,3 8,4 10,9 10,9 40 0,05 41 0,05 20 50 0,12 52 0,12

Yhdistelmäviljely A 0,02 B 0,04 25 C 0,23 D <0,02 - <0,02 E 0,27 1,1 F 3,6 5,8 9,1 ;; ' G 0,27 30 H 0,04 * kloonit 2 ja 35 valittiin suuressa mittakaavassa tapahtuvaa sCRl :n tuotantoon, t klooni 35 jatkokloonattiin rajalaimennuksella ja liukoisen CRl:n tuotto määritet-: tiin kustakin jatkokloonista. pBSCRlc/pTCSgpt-klooni 35.6 oli suurin tuottaja, *: * ·; jonka tuottaman sCRl :n pitoisuus osoittautui olevan 17,7 pg/ml.

35 MTX: metotreksaatti 115528 74 pBSCRls/pTCSgptistä saaduista 12 rekombinantista määritettiin liukoisen CRl:n tuotto ELISA:lla. Kaikista 12 ehdokkasta havaittiin havaittavissa olevia eritetyn sCRl:n tasoja. Parhaat tuottajat tuottivat sCRl-tasoja, jotka olivat verrattavissa parhaimpien pBSCRlc/pTCSgpt-transfektanttien tuottamiin tasoihin.

5 PBSCRlc/pTCSgpt- ja pBSCRls/pTCSgp-rekombinantit tuottivat liukoista CRl:tä samanlaisilla tuotantotasoilla. Tämä viittasi siihen, että liukoisen CRl-polypeptidin tuottokyky ei riippunut CRl-cDNA:n lyhentämisestä tietystä tarkasti määräytyvästä kohdasta.

11.3.2.2 sCRlc:n ilmentäminen kahdessa eri ilmentämissysteemissä 10 Lyhennetty CRl-cDNA liittymäjakso, sCRlc, liitettiin ihnentämisvektoriin pTCSgpt ja ilmennettiin edellä kuvatulla tavalla. Se liitettiin myös ilmentämisvekto-riin pBMT3X kappaleessa 11.2.3 kuvatulla tavalla pBM-CRlc:n muodostamiseksi. Näillä molemmilla ilmentämisvektoreilla on hyvin vahvat promoottorit. Liukoisen CRl:n ilmentäminen testattiin molemmissa systeemeissä sen määrittämiseksi, 15 voisiko yksi systeemi tuottaa parempia erittyvän polypeptidin saantoja. Hiiren C127I-solut (ATCC hakunumero CR1 1616, Rockville, Maryland) transfektoitiin pBM-CRlc:llä käyttäen kalsiumfosfaattimenetelmää (Graham, F.L. ja van der Eb, A.J., (1973) Virology 52, 456-467). Glyserolisokin jälkeen soluille annettiin uudestaan D-MEM-ravintoliuosta, joka sisälsi 10-prosentista sikiökautisen naudan seeru-20 mia ja 2 mM L-glutamiinia, ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 48 tuntia. Tämän jälkeen solut trypsinisoitiin ja jaettiin suhteessa 1:5 ja 1:10 täydelliseen D-MEM-kasvatus-liuokseen, johon oli lisätty 10 μΜ kadmiumkloridia. Kadmiumresistenttejä pesäkkeitä ilmestyi 10 päivässä. Kymmenen pesäkettä poistettiin kloonaussylintereitä käyttäen. Kukin pesäke siirrettiin 60 mm:n petrimaljalle, joka sisälsi täydellistä 25 D-MEM-ravintoliuosta, ja inkuboitiin 37 °C:ssa, 5-prosenttisessa CXV.ssa kunnes solut saavuttivat konfluentin tilan. Tämän jälkeen kullakin maljalla olevat solut trypsinisoitiin ja jaettiin kolmeen 60 mm.n maljaan käytettäväksi pakastettujen varastosolukantojen valmistamiseen, RNA:n uuttamiseen ja solukasvatusliuoksen ELISA-testeihin erittyneen sCRlc:n esiintymisen määrittämiseksi.

» ··♦#♦· 30 Kun solujen kasvatusliuos poistettiin kustakin konfluentista petrimaljasta ja sille i suoritettiin ELISA-analyysi, olivat kaikki testatut pBM-CRlc-kloonit positiivisia ;. : liukoisen CR1 :n tuoton suhteen. Eritetyn sCRl :n tasot pBM-CRlc-rekombinanteista olivat verrattavissa pBSCRlc/pTCSgpt-rekombinanteista saatuihin tuottotasoihin.

J I ' ‘ ·: · 1 Tämä viittasi siihen, että eritetyn sCRl-polypeptidin korkeiden tasojen tuottokyky ei 1 35 riippunut vain tiettyjen promoottorien tai ilmentämissysteemien käytöstä.

115528 75 11.3.3 Plasmidien pT-CRlcl, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 ja pT-CRlc5 liukoista CRl:tä koodaavia jaksoja sisältävien nisäkäsilmentämisvektorien ilmentäminen ja määritys pT-CRlc-deleetiomutanttisaijasta puuttuivat kalvon läpäisevät ja sytoplasmassa 5 olevat alueet samalla tavoin kuin konstruktioiden pBSCRlc:n ja pBSCRlsrn suhteen oli laita. Tämän lisäksi deleetiomutantit sisälsivät myös melko suuria CRl-cDNA:n useiden eri LHR-alueiden deleetioita (ks. kuva 20). Deleetiomutantteja ilmennettiin CHO DUX Bll -soluissa ja tuotetut liukoisen CRl-polypeptidin tasot mitattiin. Kustakin deleetiokonstruktiosta valittiin neljäkymmentä eri kloonien yhdistelmävil-10 jelmää ELISA-analyysiin sen määrittämiseksi, tapahtuiko liukoisten CRl-polypepti-dien tuottoa. Kaikkien viiden pT-CRlc-konstruktion havaittiin erittävän sCRl:tä solujen kasvatusliuokseen joko ELISAilla tai solujen kasvatusliuoksessa esiintyvän toiminnallisen aktiivisuuden määrityksellä määritettynä. Supematantit soluista, jotka oli transfektoitu neljällä viidestä pT-CRlc-konstruktiosta, tuottivat sCRlitä, joka oli 15 toimintakykyinen hemolyyttisellä määrityksellä määritettynä (ks. taulukko 7 ja kappale 13.2).

Taulukko 7

Toimintakykyisten sCRl-fragmenttien tuotto*

Konstruktio ELISA Hemolyyttinen määritys 20 pT-CRlcl - + pT-CRlc2 + + pT-CRlc3 - + pT-CRlc4 + ei määritetty ·,; pT-CRlc5 - + !! 25 ELISA.n tai hemolyyttisten määritysten suhteen testatut supematantit saatiin joko • ·' viljelmistä, jotka kasvoivat T75-pulloissa tai 24-kuoppaisissa kuoppalevyissä. Koska eri määriä liukoista CRl:tä oli saattanut kertyä viljelmäsupematantteihin näissä olo-:: suhteissa, esitetyt tulokset ovat kvalitatiivisia.

»· * * , (+) tarkoittaa toiminnallisen sCRl:n muodostumista osoitetulla määrityksellä määri- 30 tettynä.

• * * * · '. Se seikka, että deleetiomutantit kykenivät myös tuottamaan liukoista CRl:tä, osoitti lisäksi sen, että kyky ilmentää sCRlitä ei riippunut yhdestä CRl-cDNA:n tarkkara- 115528 76 jäisestä geneettisestä modifikaatiosta. Sikäli kuin kalvon läpäisevät alueet oli dele-toitu, kaikki konstruktiot kykenivät tuottamaan liukoista polypeptidiä.

12 Esimerkki: Liukoisen CRl:n tuotto ja puhdistus

Suuria sCRl-määriä tuotettiin ontelokuitubioreaktorisysteemissä. Saadut sCRl:n 5 määrät olivat suhteessa ympättyjen rekombinanttikloomen suhteelliseen saantoon. Optimaalisten puhdistustulosten saavuttamiseksi valittiin sellainen seerumia sisältämätön ravintoliuos, josta oli tuloksena korkeat sCRl:n tuottotasot samalla kun vältyttiin käyttämästä suurta määrää ulkopuolelta lisättyjä sikiökautisen vasikan seerumin polypeptidejä.

10 12.1 Liukoisen CRl:n tuotto suuressa mittakaavassa

Steriileissä olosuhteissa koottiin Cell-Pharm™ Cell Culture System I (CD Medical, Inc., Miami Lakes, FL), joka oli varustettu mallin IV-L ontelokuitubioreaktorilla (30 kD:n molekyylimassainen päästöraja). Kaksi kloonia (pBSCRlc/pTCSgptn klooni 2 ja klooni 35) laajennettiin kahdeksaan T-225-pulloon. Konfluenttisen tilan saavutta-15 neet solut trypsinisoitiin, pestiin, kerättiin napiksi sentrifugiputkeen ja suspendoitiiir uudelleen kasvatusliuokseen. Noin 5 x 108 solua kloonista 2 ja 10 x 108 solua kloonista 35 ympättiin kahteen erilliseen ontelokuitubioreaktoriin. Käytettiin 20 litran syöttösäiliötä, jossa oli alfa-MEM-kasvatusliuosta, johon oli lisätty 10-prosenttista sikiökautisen vasikan seerumia, 8 mM L-glutamiinia, 100 μg/ml penisilliini-strepto-20 mysiiniä ja sopiva pitoisuus metotreksaattia (50 nM kloonin 2 ollessa kyseessä, 500 nM kloonin 35 ollessa kyseessä). Esisekoitettua kaasua (5-prosenttinen C02 ilmassa) kuplitettiin säiliössä olevaan liuokseen hapettimen läpi pH:n ylläpitämisek-,; si. Liuoksen kierrätys, korvaus ja kaasun virtausnopeudet säädettiin maksimaalisen : 1 ; tuoton aikaansaamiseksi. Näytteet kerättiin talteen ymppäysläpivientien kautta, 25 sentrifugoitiin 1000 kierroksen minuuttinopeudella 10 minuuttia, suodatettiin :'' 1; 0,22 pm:n huokoskokoisen suodattimen läpi ja säilytettiin 4 °C:ssa ennen puhdistus ta. Talteenotetun erän tilavuutta ja ottotiheyttä nostettiin vähitellen viljelmän , · · . alkuvaiheessa käytetystä 25 ml.sta ja kolmesti viikossa tapahtuvasta talteenotosta 40 « « ml:aan ja viisi kertaa viikossa tapahtuvaan talteenottoon 2-3 kuukauden kuluttua. ;1 30 sCRl:n tuotto määritettiin CRl-ELISA:lla. Kloonin 2 ja kloonin 35 saannot ensim- mäisen kuukauden jälkeen ymppäyksestä olivat 66 μg/päivä ja 1060 μg/päivä, tässä •: “ i järjestyksessä mainittuna. Nämä saannot suurenivat viljelmien vakiinnuttua.

· 115528 77 12.1.1 sCRl:n tuotto seerumittomissa kasvatusliuoksissa

Kahdesta kaupallisesti saatavilla olevasta seerumittomasta kasvatusliuoksesta testattiin niiden kyky ylläpitää solujen kasvua ja sCRl:n tuottoa. Konfluentti pBSCRlc/pTCSgptkloonin 35 T75-pullo jaettiin kahteen T75-pulloon. Toisen 5 pullon viljelyyn käytettiin alfa-MEM-liuosta, jota oli täydennetty 10-prosenttisella sikiökautisen vasikan seerumilla, L-glutamiinilla, antibiooteilla ja 500-nanomolaa-risella metotreksaatilla. Toisessa pullossa oleva viljelmä totutettiin kasvamaan vaiheittain 5-prosenttisessa, 1-prosenttisessa, 0,5-prosenttisessa ja O-prosenttisessa sikiökautisen vasikan seerumissa, joka oli lisätty alfa-MEM-kasvatusliuokseen, 10 jossa oli täydennyksenä L-glutamiinia, antibiootteja, 500 nM metotreksaattia ja HB CHO -kasvatuslisäaineita (Hana Biologies, Inc., Alameda, CA). Näissä kahdessa pullossa esiintyvää solujen kasvua ja sCRlrn tuottotasoja verrattiin toisiinsa. Solujen kasvu seerumittomissa kasvatusliuoksissa ei koskaan saavuttanut konfluenssia. sCRlrn tuottotasot on esitetty taulukossa 8. Kummassakin tapauksessa sCRl:n 15 tuottotasot olivat parhaat, kun solut kasvatettiin 10-prosenttisessa sikiökautisen vasikan seerumissa. Vertailun vuoksi 14. päivänä havaitut tasot seerumittomassa liuoksessa olivat 1,4 x 1010 kuorta/ml verrattuna 10-prosenttisella sikiökautisen vasikan seerumilla täydennettyyn liuokseen, josta saatiin 4,2 x 1010 kuorta/ml.

Taulukko 8 20 sCRlrn tuotto seerumittomassa kasvatusliuoksessa, jota on täydennetty CHO-kasvatuslisäaineilla verrattuna 10-prosentista sikiökautisen vasikan seerumi sisältävään liuokseen* 4. päivä 7. päivä 11. päivä 14. päivä

Pullo 1 25 CHO-kasvatus-lisäaine

ynnä 5%FCS 1%FCS 0,5%FCS 0%FCS

.-. 2,6 2,4 2,95 1,4 *...· Pullo 2 30 10 % FCS 4,8 3,85 4,3 4,2 * ilmoitettuna 1010 kuorta/ml

• t I

‘. Solujen kasvu ja sCRlrn tuotto rekombinanteissa testattiin käyttäen toista seerumit- toman kasvatusliuoksen lähdettä (CHO-1, Ventrex Laboratories, Inc., Portland, 78 1 1 5528 ME). Koska seerumissa kasvatettuja soluja ei ollut tarpeen totuttaa tähän kasvatus-liuokseen, solut sulatettiin ja viljeltiin suoraan tässä seerumittomassa kasvatusliuok-sessa. Tämä kasvatusliuos koostuu DME-F12-perusliuoksesta ja kasvatuslisäainees-ta. Sulatettiin sama määrä soluja, jotka vietiin 24-kuoppaisen levyn erillisiin kuop-5 piin. Sen jälkeen kun solut olivat kiinnittyneet, kasvatusliuos heitettiin pois ja joko 10-prosentista sikiökautisen vasikan seerumia sisältävä kasvatusliuos tai seerumiton kasvatusliuos lisättiin asianmukaisiin kuoppiin. Kummankin olosuhteen testaus suoritettiin kahtena rinnakkaisena testinä. Aiemmin testatusta seerumittomasta kasvatusliuoksesta poiketen valmistajan Ventrex Laboratories toimittama CHO-1-10 kasvatusliuos sai aikaan samanlaisen solujen kasvutason kuin sikiökautisen vasikan seerumia sisältävä kasvatusliuos.

12.1.2 Johtopäätökset

Edellä kuvatut tulokset viittasivat siihen, että sCRl:tä tuottavia CHO-soluja voitiin kasvattaa määritellyssä seerumittomassa kasvatusliuoksessa. Tästä oli tuloksena kus-15 tannussäästöjä, jotka kohdistuivat suurimittakaavaisissa tuotantokasvatuksissa käytettäviin kasvatusliuoksiin. Vielä yhtenä etuna oli se, että sCRl:n puhdistus solu-viljelmäsupematanteista tuli yksikertaiseksi, koska sikiökautisen vasikan seerumi-proteiineja ei ollut tarpeen poistaa.

12.2 Liukoisen CRl:n puhdistus 20 Kun saatiin käytettäväksi spesifiset CRl:tä vastaan valmistetut vasta-aineet, kävi mahdolliseksi korvata puhdistetun CRl:n tuottamiseen tarvittavat monet kromatografiset vaiheet yksinkertaisella kaksivaiheisella menetelmällä. Tämä lisäsi saavutettavissa olevia CRl-proteiinien saantoja noin 1-5 mg:aan CRl:tä 5,9 x 10^ erytro-: syytää kohti (Wong, W. W., et ai., (1985) J. Immunol. Methods 82, 303-313). Kos- : 25 ka tämä raportoitu puhdistus koski kalvoon sitoutuneita CRl-muotoja, oli aina . tarpeen solubilisoida CRl:tä sisältävä materiaali detergentteihin.

Rekombinanttitransfektanttien tuottamaa liukoista CRl:tä ei tarvitse solubilisoida ..,: detergentteihin sen puhdistamiseksi; se on valmiiksi liukoinen. Vaikkakin liukoinen CR1 voidaan puhdistaa CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-aineella suoritettavalla ,,..: 30 kromatografialla (katso jäljempänä), tämä menetelmä ei sovellu helposti suurimitta- kaavaiseen tuotantoon. Mittakaavan nostoa rajoittaa se CRl:tä vastaan valmistetun vasta-aineen määrä, joka voidaan saada talteen vasta-ainepuhdistuspylväiden vasta-:.i.: ainematriisin valmistamiseksi. Tämän lisäksi vasta-aineen kuten YZ-l:n korkea ' ♦' ‘ · sitoutumisaffiniteetti CR1 :tä kohtaan merkitsee sitä, että melko voimakkaasti vaikut- 115528 79 tavia olosuhteita, kuten esimerkiksi pH:ta 12,2, on käytettävä sitoutuneen sCRl-tuotteen erottamiseksi vasta-ainematriisista (Wong, W. W., et ai., (1985) J. Immunol. Methods 82, 303-313).

Jotta saataisiin kapasiteettia puhdistaa hyvin suuria liukoisen CRl:n määriä, kehitet-5 tiin puhdistusmenetelmiä, joissa käytettiin HPLC-pylväitä. Näissä HPLC-pylväissä voidaan helposti nostaa mittakaavaa yhä suurempien puhdistetun liukoisen CRl:n määrien tuottamiseksi. Lisäksi niissä ei tarvita voimakkaasti vaikuttavia olosuhteita sCRl:n eluoimiseksi ja saamiseksi talteen.

12.2.1 Puhdistus vasta-aineaffiniteettipylväässä 10 12.2.1.1 Menetelmät sCRlin vasta-aineaffiniteettipuhdistusta varten kytkettiin 100 mg monoklonaalista vasta-ainetta YZ-1 kovalenttisesti 7 mgiaan A£SGel-10:tä (BioRad, Richmond, CA) valmistajan ohjeiden mukaan. CRl:tä sisältävä soluviljelmistä saatu supematantti inkuboitiin immobilisoidun YZ-l:n kanssa pullossa, jota heiluteltiin 4 °C:ssa yön 15 yli. Tämä materiaali kaadettiin lasipylvääseen ja pestiin hyvin liuoksella, jonka koostumus oli 10 mM Hepes ja 0,1 M NaCl, pH 7. sCRl eluoitiin käyttäen liuosta, jonka koostumus oli 20 mM natriumfosfaatti ja 0,7 M NaCl, pH 12 (Yoon, S.H. j&

Fearon, D.T., (1985) J. Immunol. 134, 3332-3338). Eluoiduista fraktioista testattiin proteiinin esiintyminen käyttäen Biorad Protein Assay (BioRad, Richmond, CA) 20 -tuotetta. Proteiinia sisältävät näytteet yhdistettiin välittömästi ja dialysoitiin yön yli ·- : 0,1 M Hepes -liuoksessa, jonka pH oli 7, (2 x 1 litraa) 4°C:ssa. Näyte dialysoitiin ’:sitten PBSissa. CR1 :n esiintyminen analysoitiin CR1-ELISAilia.

• * : 12.2.1.2 Tulokset • * » pBSCRlc/pTCSgpt -transfektanttikloonin 2 tuottamaa sCRlitä sisältävä soluviljel- • · · :... ·’ 25 mäsupematantti vietiin CR1 itä vastaan valmistettua vasta-ainetta käyttäen valmistet tuun affiniteettipylvääseen ja sCRl-fraktiot yhdistettiin piikin alueelta. Erä tätä : “ ‘: puhdistettua materiaalia ajettiin 4-20-prosenttisessa SDS-PAGE-geelissä (DAIICHI; .··; Inc., polyakryyliamidigeelit; modifioitu julkaisun Laemmli, U.K., (1970) Nature • . 227, 680-685 mukainen menetelmä). Liukoisen CRlin näennäinen molekyylimassa 30 pelkistävissä olosuhteissa oli noin 224 000 daltonia (kuva 24). Tämän puhdistetun ' ‘ CRlin osoitettiin myös olevan aktiivinen sen kyvyn perusteella inhiboida komple- : :’: mentin välittämää hemolyysia sekä C5a:n ja C3ain tuottoa (kappale 13).

115528 80 12.2.2 CRl:n puhdistus HPLC:lIä 12.2.2.1 Menetelmät 12.2.2.1.1 Lähtömateriaali

Kun lähdettiin bioreaktoreihin vasta perustetuista viljelmistä, sCRl:n tuoton tasot 5 olivat matalampia verrattuna siihen kun viljelmät olivat kasvaneet useita kuukausia: Kului yleensä useita viikkoja ennen kuin bioreaktorissa olevat solut saavuttivat konfluenssin ja tuottivat maksimaalisia tasoja sCRl:tä. Soluviljelmäsupematantit, joissa oli matala sCRl-taso, voitiin väkevöidä ennen puhdistusta joko ammonium-sulfaattisaostuksella tai ultrafiltraatiolla. Supematanttien ammoniumsulfaattifrak-10 tiointi 60-80 %:n kylläisyysalueella saosti sCRl:n saantojen ollessa oleellisesti ekvi-valenttisia. Sakka liuotettiin minimitilavuuteen ja dialysoitiin lähtöpuskuria vastaan kationinvaihto-HPLC.tä varten. Vaihtoehtoisesti CHO-soluviljelmäsupematantit voitiin väkevöidä ultrafiltraatiolla ja dialysoida lähtöpuskuria vastaan kationin-vaihtokromatografiaa varten.

15 Koska bioreaktorit tuottivat korkeampia liukoisen CRl:n pitoisuuksia, näistä viljelmistä saadut CHO-soluviljelmäsupematantit voitiin dialysoida suoraan lähtöpuskuria vastaan kationinvaihtokromatografiaa varten.

12.2.2.1.2 Kationinvaihto-HPLC-menetelmä Näytteet dialysoitiin lähtöpuskuriliuosta vastaan (0,02 M natriumfosfaatti ja 0,06 N 20 natriumkloridi, pH 7,0) ja suodatettiin sitten 0,2 pm:n suodattimen läpi minkä tahansa hiukkasmaisen materiaalin poistamiseksi. Näyte vietiin sitten kationinvaih-to-nestekromatografiapylvääseen (Raininin valmistama, 10 cm x 10 mm, Hydro-‘ pore-SCX HPLC -pylväs). Pylväs pestiin ja eluoitiin natriumkloridigradientilla ja

: kehitettiin käyttäen liuosta, jonka koostumus oli 0,02 M fosfaatti ja 0,5 N NaCl, pH

25 7,0. sCRl eluoitui alueella, joka sijoittui jollekin alueelle välillä 0,06 N-0,25 N

NaCl. Eluutiota monitoroitiin 280 nm:ssa mitatulla absorbanssilla ja ELISA:lla.

12.2.2.1.3 Anioninvaihto-HPLC-menetelmä ....: Haluttaessa voitiin kationi-HPLC:llä puhdistetun sCRl.n jatkopuhdistukseen käyttää anioni-HPLC:tä. Anioni-HPLCrtä varten kationi-HPLC:stä saaadut huipun alaiset 30 fraktiot dialysoitiin lähtöpuskuriliuosta vastaan. Näytteet vietiin pylvääseen ja pylväs (Rainin valmistama Hydropore-AX) pestiin 0,01 M fosfaatissa, pH 7,5.

‘:' ‘: Pylväs eluoitiin vaiheittain ja gradientit kehitettiin käyttäen 0, 01 M fosfaattia ja 0,5 115528 81 N NaCliää, pH 7,5. sCRl eluoitui alueella 0,0-0,3 N NaCl. Eluutiota monitoroitiin kuten kationinvaihto-HPLC:ssä. Kationi- ja anioni-HPLC-pylväiden puskuriliuosten pitoisuudet ja pH ovat vain esimerkkejä. Muut puskuriliuospitoisuudet, suolaolosuh-teet tai pH-olosuhteet voivat olla käyttökelpoisia.

5 12.2.2.1.4 Western blot -analyysi

Westem-blottaus suoritettiin käyttäen modifioitua menetelmää, jonka ovat julkaisseet Towbin, H., et ai., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 4350-4354. Lyhyesti esitettynä, puhdistettu sCRl ajettiin 4-20 % SDS-PAGE:ssa, siirrettiin nitroselluloo-salle, sille suoritettiin koetinkäsittely spesifisellä CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-10 aineella (hiiren mAb YZ-1 tai J3D3) ja se havaittiin vuohen hiirtä vastaan valmistetulla vasta-aineella, joka oli konjugoitu alkaliseen fosfataasiin.

12.2.2.2 Tulokset

Tyypillisessä suorituksessa käytettiin 50-100 ml:n bioreaktoriviljelmästä saatua supematanttia, joka dialysoitiin lähtöpuskuriliuosta vastaan ja vietiin 10 cm x 15 10 mm:n kationinvaihto-HPLC-pylvääseen. Huipun fraktiot määritettiin ELISA.lla ja absorbanssilla 280 nmrssä ja nämä yhdistettiin. Yhdistetyn erän proteiinipitoisuus määritettiin absorbanssilla 280 nm:ssä (ε(1 %) 280 nnr.ssä = 10, arvioituna CRlc.n aminohappokoostumuksesta). Useita kymmeniä milligrammoja puhdistettiin 100 ml:sta monistetun viljelmän supematanttia.

: 20 Yhtenä esimerkkinä voidaan mainita, että 100 ml viljelmäsupematanttia : pBSCRlc/pTCSgpt-transfektanttikloonista 2 tuotti 22 mg puhdistettua sCRlitä : ·. määritettynä absorbanssilla 280 nm.ssä, kun käytettiin puhdistusta kationi-HPLCillä VJ (kuva 24). CRl-ELISA:lla monitoroituna saannon laskettiin olevan 202 % ja lisäksi I » · 13 % läpivirranneessa tai pylvään pesufraktiossa. 100 % ylittävä saanto heijastaa ’;;; ’ 25 mahdollisesti matriisivaikutuksia ELISA: ssa.

Kun lähdetään niistä viljehnäsupematanttimääristä, joita voidaan ottaa bioreakto-;: rista, tulisi tällä metotreksaattimonistuksen tasolla olla mahdollista tuottaa noin 100 .···. mg puhdistettua liukoista CRl:tä bioreaktoria kohti viikossa. On joitakin keinoja, ’ joilla tätä tuottotasoa voidaan nostaa ja näihin kuuluvat lähtöviljelmien monistami- 30 nen maksimaalisesti metotreksaatilla ennen niiden lisäystä bioreaktoriin, kulloinkin : tuotannossa olevien bioreaktorien määrän lisääminen ja suuremman kapasiteetin . omaavien HPLC-pylväidenkäyttö.

115528 82 12.2.2.3 Puhdistetun liukoisen CRl:n luonnehtiminen

Kationi-HPLC:stä saatu sCRl:tä sisältävä huipun fraktio (kuva 24) puhdistettiin edelleen anioni-HPLC:llä. sCRl-materiaalin puhtaus eri vaiheissa testattiin SDS-PAGE:lla (kuva 25). Näissä suurta näytemäärää käyttäen tutkituissa geeleissä 5 havaitut pienemmät vyöhykkeet edustavat sCRl fragmentteja sellaisella Westem-blottausanalyysillä määritettynä, jossa käytettiin CRl:tä vastaan valmistettuja mo-noklonaalisia vasta-aineita YZ1 tai J3D3. sCRl:n fragmenttivyöhykkeitä ei havaittu useimmissa preparaateissa.

Puhdistetun sCRl:n toiminnallinen aktiivisuus testattiin käyttäen sen kykyä inhi-10 hoida klassista komplementtivälitteistä hemolyysiä 50-prosenttisesti puhdistetun sCRl.n pitoisuuden ollessa 0,25 pg/ml. Puhdistettu liukoinen CR1 kykeni myös inhiboimaan klassista komplementin C5a tuottoa 50-prosenttisesti pitoisuudessa 5 pg/ml ja C3a:n tuottoa 50-prosenttisesti pitoisuudessa 13 pg/ml (ks. kappale 13).

12.2.2.4 Johtopäätökset 15 Kuten edellä on kuvattu, kehitimme liukoisen CRl:n puhdistamiseksi parannetun menetelmän, jonka mittakaavaa voidaan helposti nostaa sellaisten sCRl-määrien tuottamiseksi, joita tarvitaan terapeuttisissa sovellutuksissa. Tämän menetelmän peruselementteihin kuuluivat lähtömateriaali, joka on jo valmiiksi liukoinen ja joka tekee tarpeettomaksi kalvoon sitoutuneen CRl:n detergenteillä tapahtuvan solubili-20 soinnin. Sikiökautisen vasikanseerumin pitoisuuksien pienentäminen bioreaktorivil-jelmissä ja/tai vaihtoehtoisten kasvatusliuosten käyttö näissä viljelmissä teki tarpeettomaksi suurten ulkopuolelta lisättyjen proteiinipitoisuuksien poiston sCRl:tä sisäl-: tävästä lähtömateriaalista myöhempien puhdistusten aikana. Lisäksi HPLC-puhdis- • tusmenetelmän kehittäminen tarjosi käyttöön menetelmän suuressa mittakaavassa ': 25 tapahtuvaan puhdistukseen. Puhdistukseen voidaan käyttää joko kationi-HPLCitä tai ·. yhdistelmää, jossa käytetään kationi-HPLC:tä ja tämän jälkeen tehtyä anioninvaih- to-HPLC:tä. Huomattavan puhdasta liukoista CRl.tä, jota saadaan korkealla saannolla, voidaan valmistaa tällä menetelmällä vain 1 tai 2 vaihetta käyttäen.

13 Esimerkki: Liukoisen CR1:n in vitro -aktiivisuuden osoittaminen ' * 30 13.1 Neutrofiilien hapettavan purkauksen inhibitio • > % · « · t »

Sydäninfarktin aikana syntyvän kudosvaurion perfuusion palautumisvauriomallissa '··** aiheuttavat aktivoidut komplementin komponentit neutrofiilien tarttumisen ja akti voitumisen. Aktivoidussa neutrofiilisolussa tapahtuu hapettava purkaus, joka muo- 115528 83 dostaa erittäin toksisia happiradikaaleja. Näitä ja muita potentiaalisia toksiineja vapautuu neutrofiilien degranulaation aikana, jolloin ympäröivä kudos vaurioituu. Liukoinen CR1 voi pienentää vaurioituneen kudosalueen kokoa estämällä C3a:n ja C5a:n, neutrofiilisolujen aktivaatioon liittyvien komplementin komponenttien, 5 muodostumista.

Jotta olisi voitu monitoroida liukoisen CRl:n kykyä estää C5a:n muodostuminen komplementin aktivaation aikana in vitro, käytettiin biomääritystä, jolla voidaan kvantitoida neutrofiilisolujen tuottamien happiradikaalien muodostuminen C5a:n aiheuttaman happipurkauksen aikana (Bass, D.A., et ai., (1983) J. Immunol. 130, 10 1910-1917). Tässä määrityksessä käytetään dikloorifluoreskeiinidiasetaattia (DCFDA), lipidiliukoista molekyyliä, joka pystyy tunkeutumaan soluihin, jäämään niiden sisään ja muuttumaan hapettuessaan erittäin fluoresoivaksi.

13.1.1 Materiaalit ja menetelmät 13.1.1.1 Materiaalit 15 Käytetyt materiaalit olivat tuore koko veri, ihmisen komplementin lähttömateriaali (Beth Israel Hospital, Boston, MA), kuivattu leipomohiiva, PBS, jossa oli 0,1 % gelatiinia ja 5 mM glukoosia, 100 mM EDTA, 10 mM DCFDA HBSSissa (Kodak), punasolujen (RBC) hajotuspuskuriliuos (Ortho Diagnostics), puhdistettu C5a (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ja liukoinen CR1.

20 13.1.1.2 Neutrofiilisolujen valmistus

Neutrofiilisolut valmistettiin Bassin (1983, J. Immunol. 130, 1910-1917) kuvaa-: maila tavalla. 2,0 ml kokoverta pestiin 3 kertaa PBS-gelatiini-glukoosi-liuoksessa, suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan 10 μΜ DCFDA:ta, joka oli HBSSissä, johon oli lisätty 5 ml PBS-gelatiini-glukoosi-liuosta ja inkuboitiin 15 minuuttia 37 °C:ssa. ''': 25 Tämän jälkeen solut sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 2,0 ml:aan PBS-gela- tiini-glukoosi plus 5 mM EDTA -liuokseen.

*»· ;;;* 13.1.1.3 Hiivapartikkelien valmistus

Kuivattu leipomohiiva suspendoitiin uudelleen H20:hon, pestiin 2 kertaa ja keitet- > * . tiin 30 minuuttia. Partikkelit pestiin uudelleen 2 kertaa H20:ssa ja suspendoitiin 30 uudelleen H20:hon pitoisuuteen 0,5 g/ml (Simpson, P.J., et ai., ks. edellä).

I * » i i i » * * I * * 84 1 1 5528 13.1.1.4 Neutrofiilisolujen aktivaatio puhdistetulla C5a:lla 100 μΐ DCFDA:ta sisältäviä soluja käsiteltiin RBC-hajotuspuskuriliuoksella, pestiin kerran PBS-gelatiini-glukoosi-EDTA-liuoksessa ja suspendoitiin uudelleen 1,0 mliaan PBS-gelatiini-glukoosi-liuosta. 50 μΐ puhdistettua C5a:ta, pitoisuus 200 5 ng/ml, tai kontrolli lisättiin 0,5 ml:aan kohteena olevia soluja 37 °C:ssa ja analysoitiin virtaussytometrissä eri aikavälein.

13.1.1.5 Neutrofiilisolujen aktivaatio puhdistetulla C5a:lla ihmisen seerumissa tai plasmassa 100 μΐ DCFDAita sisältäviä soluja inkuboitiin 30 minuuttia 50 μ1:η kanssa C5a:ta, 10 joka oli laimennettu suhteessa 1:1 ihmisen seerumiin tai heparinisoituun plasmaan (100 ng/ml) tai kontrolliin 37 °C:ssa. RBC:t hajotettiin ja neutrofiilisolut analysoitiin virtaussytometrissä.

13.1.1.6 Neutrofiilisolujen aktivaatio hiivapartikkeleilla aktivoidulla ihmisen seerumilla tai plasmalla 15 425 μΐ tuoreena pakastettua seerumia ja plasmaa sekä 50 μ1 sCRl:tä tai kontrollia inkuboitiin 25 μ1:η kanssa hiivapartikkeleita 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Komplementilla aktivoidut ja kontrollinäytteet sentrifugoitiin sitten hiivapartikkelien poistamiseksi. Kukin näistä näytteistä laimennettiin kymmenellä 2-kertaisella laimennuksella PBS-gelatiini-glukoosi-EDTA-liuoksessa. 50 μΐ kontrollin ja aktivoidun seeru-20 min ja plasman kustakin saijalaimennuksesta lisättiin 50 pilaan DCFDAita sisältä-: viin kohdesoluihin ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia. Tämän jälkeen RBC:t ha- * . jotettim ja neutrofiilisolut analysoitiin virtaussytomerissä : 13.1.2. Tulokset ·. 13.1.2.1. C5a aiheuttaa ihmisen neutrofiilisoluissa happipurkauksen, joka voi- 25 daan mitata DCFDA:ta käyttäen I #

Kuva 26 esittää ihmisen neutrofiilisolujen fluoresenssivoimakkuuden nopean nou- ” : sun puhdistetulla C5a:lla suoritetun stimulaation jälkeen. Neljän minuutin kuluessa C5a-lisäyksestä (lopullinen pitoisuus 20 ng/ml), neutrofiilisolut olivat 10 kertaa . kirkkaampia kuin kontrollina olevat DCFDAita sisältävät neutrofiilisolut. 20 mi- , ’ 30 nuuttiin neutrofiilisolut olivat 20 kertaa kirkkaampia kuin kontrollit. Tämä määritys ' näyttää olevan herkkä C5a-indikaattori.

• m i · 115528 85 13.1.2.2 Ihmisen seerumi estää puhdistetun C5a:n happipurkausvaikutukset neutrofiilisoluihin

Fluoresenssin voimakkuuden ei havaittu lisääntyvän neutrofiilisoluissa, jotka sisälsivät DCFDA:ta ja jotka oli inkuboitu puhdistetun C5a:n kanssa, joka oli 5 laimennettu ihmisen seerumiin. Tämä vaikutus voi johtua verihiutaleista peräisin olevasta kasvutekijästä (PDGF), joka vapautuu verihiutaleista hyytymisen aikana. On osoitettu, että pienet PDGF-määrät voivat estää C5a:n aiheuttaman neutrofiili-solujen aktivaation (Wilson, E., et ai., (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 2213-2217).

10 13.1.2.3 Heparinisoitu plasma ei estä C5a:n vaikutuksia neutrofiilisoluihin

Heparinisoituun plasmaan laimennussuhteessa 1: 1 laimennettu C5a aiheutti happi-purkauksen DCFDAita sisältävissä neutrofiilisoluissa. Vaikkakin fluoresenssi-voimakkuuden lisäys ei ollut yhtä dramaattinen kuin puskuriliuokseeen tehdyllä C5a:lla, tämä lisäys oli kymmenkertainen neutrofiilisolujen 30 minuutin inkuboin-15 nin jälkeen. Pienentyneen signaalin on voinut aiheuttaa PDGF:n vapautuminen laskimon leikkauksen tai plasman eristyksen aikana. Hellävaraisempi ja nopeampi plasman eristys veren solukomponenteista voisi minimoida PDGFin vapautumisen ja mahdollistaa C5a:n paremman toiminnan.

13.1.2.4 Komplementin aktivaation aikana esiintyvä sCRl estää C5a:n muodos-20 tumisen

Tsymosaanin aiheuttamassa ihmisen komplementin aktivaatiossa esiintyi liukoisen CRl:n läsnäollessa alentunutta C5a-aktiivisuutta DCFDA-määrityksellä mitattuna.

! Kuten kuvasta 27 voidaan nähdä, suhteessa 1:16 laimennettu ihmisen plasma, joka oli aktivoitu sCRl:n läsnäollessa, synnytti 70 % vähemmän fluoresenssin voimak-;' 25 kuuden kohoamista neutrofiilisoluissa kuin laimennettu plasma, joka oli aktivoitu il man, että sCRl oli läsnä. Tämä tarkoittaa sitä, että sCRl inhiboi C5a:n muodostumista. Vielä pidemmälle viedyllä DCFDA-määrityksen ja plasman keruun optimoin-:,,,! nilla päästäisiin vielä dynaamisempaan ja herkempään liukoisen CR1-aktiivisuuden ·”*: määritykseen.

• · I » · » * 115528 86 13.2 Komplementin välittämän hemolyysin inhibitio 13.2.1 Menetelmät

Komplementin estokyky testattiin määrittämällä komplementin välittämän punasolujen hajoamisen (hemolyysin) inhibitio. Hemolyysin inhibitio määritettiin liukoisen 5 CR1-pitoisuuden funktiona. Testattavat sCRl-näytteet laimennettiin 0,1 M Hepes-puskuriliuoksessa (0,15 N NaCl, pH 7,4) ja jokaisesta näistä otetut 50 μ1:η erät lisättiin V-pohjaisen mikrotiitterilevyn kuoppiin tyypillisesti kolmena rinnakkaisena näytteenä. Komplementin lähteenä käytetty ihmisen seerumi laimennettiin suhteessa 1: 125 Hepes-puskuriliuokseen ja näistä otetut 50 μ1:η erät lisättiin kuhunkin kuop-10 paan. Seuraavassa vaiheessa käytettiin kaupallisesti saatavilla olevia lampaan eiytro-syyttejä lammasta vastaan valmistetun vasta-aineen kanssa (Diamedix tuoteluettelon n:o 789-002) toimittajalta saadussa muodossaan ja näitä lisättiin 100 μΐ/kuoppa hemolyysiin johtavan komplementin reaktioiden saqan käynnistämiseksi. Levyä inkuboitiin 60 minuuttia 37 °C:ssa, minkä jälkeen sentrifugoitiin 500 x g:ssä 10 mi-15 nuuttia. Supematantit poistettiin ja ne vietiin tasapohjaiseen mikrotiitterilevyyn. Hemolyysiaste niitattiin näytteen absorbanssin funktiona 410 nm:ssa. Maksimaalinen absorbanssi (maksimaalista hemolyysiä vastaava), Amax, saatiin vähentämällä vain ihmisen seerumia sisältävän erytrosyyttinäytteen absorbanssi, As, vain punasoluja sisältävän näytteen absorbanssista, Ao. Näin ollen Amax on As-Ao. Anäyte on 20 määritelty siten, että se vastaa sekä ihmisen seerumia että sCRlitä sisältävän erytrosyyttinäytteen absorbanssin ja vain sCRlitä sisältävän solunäytteen absorbanssin ; välistä erotusta. Inhibitio, IH, on ilmoitettu suhteena (Amax-Anäyte/Amax) ja IH50 on : määritelty sCRl:n pitoisuutena, joka tarvitaan tuottamaan IH-arvo 1/2. Kromato- . grafisten fraktioiden monitorointiin ei liitetty mukaan seerumittomia kontrolleja ja *. 25 komplementtia vastaan kohdistuvaa aktiivisuutta monitoroitiin kvalitatiivisesti näytteen absorbanssin alenemisena 410 nm:ssa.

Edellä kuvattua hemolyyttistä määritystä käytettiin arvioitaessa ihmisen yhdistel-mä-sCRl:n kykyä inhiboida myös muiden lajien kuten marsun tai rotan komple-.' ·. mentin aiheuttamaa lampaan punasolujen hajoamista. Kummankin lajin kyseessä ol- .· ·. 30 lessa käytettiin komplementtilähteenä tuoreena pakastettua seerumia tai tuoreena *·' lyofilisoitua seerumia tai plasmaa. Joissakin tapauksissa seerumit saatiin kaupalli- ': : sesta lähteestä (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).

1 t M I

Seerumista tiirattiin ensin sen kyky hajottaa aktivoituja punasoluja. Korkein laimen-nus, jolla saatiin ainakin 80 % maksimaalisesta punasolujen hajoamisesta, valittiin 35 käytettäväksi lisätyn ihmisen sCRl:n vaikutusten arvioimiseen. Tämän jälkeen 115528 87 suoritettiin määritys edellä kuvatulla tavalla käyttäen ihmisen seerumin tilalla edullista eläinseerumin laimennusta.

13.2.2 Tulokset

Kuten kuvasta 28 käy ilmi, puhdistettu sCRl inhiboi klassista komplementin välit-5 tämää hajoamista 50 % sCRl :n pitoisuuden ollessa 0,12 pg/ml. Vasta-aineaffiniteet- tikromatografialla puhdistetun sCRl:n inhibitiokykyä hemolyyttisessä määrityksessä verrattiin puhdistamattomassa materiaalissa (soluviljelmäsupematantissa oleva sCRl) esiintyvään vastaavaan kykyyn. Puhdistetulla sCRl:llä oli puhdistamattoman sCRl:n aktiivisuuteen verratavissa oleva aktiivisuus ja kummatkin aiheuttivat 10 50-prosenttisen inhibition hemolyyttisessä määrityksessä tasolla 1,6 x 108 kuorta/ml. Tämä viittasi siihen, että puhdistusmenetelmä ei vähentänyt oleellisesti lopputuotteena olevan sCRl:n toiminnallista aktiivisuutta.

Sen määrittämiseksi, voitiinko puhdistettu sCRl varastoida pakastettuna, varastoitiin erä tutkittavaa liuosta -70 °C:ssa yhden viikon ajan. Pakastetulla ja pakastamatto-15 maila sCRl:llä oli sama pitoisuus määritettynä absorbanssina 280 nm:ssä ja CRl-ELISA:lla. Pakastetulla ja pakastamattomalla sCRlrllä oli myös samanlaiset aktiivisuudet hemolyysin inhibitiolla määritettynä. Ihmisen yhdistelmä-sCRlrn kyky inhiboida useista eri eläinlajeista peräisin olevan komplementin välittämää hemolyy-siä on esitetty yhteenvetona taulukossa 9.

20 Taulukko 9 ; Herkistetyn lampaan RBC-valmisteen hemolyysi käyttäen eri eläinten seerumeista saatua komplementtia t * • Käytetyn seerumin Inhibitio : loppupitoisuus Inhibitio (IH)** IH50** : 25 Eläin sCRI:llä (kuorta/ml) (kuorta/ml) marsu* 1:500 Kyllä 66% (2,6x1ο9) Ι,ΟχΙΟ9 .··. ihminen 1:500 Kyllä 94%(2,5xl09) 2,0xl08 ihminen 1:312 Kyllä 94%(l,2xl09) Ι,ΟχΙΟ7 ;·' rotta 1:200 Kyllä 85%(2,6xl09 2,4xl08 ,:··· 30 rotta* 1:200 Kyllä 77%(3,8xl09) Ι,ΟχΙΟ9 *""· koira 1:50 Ei . kaniini* 1:20 Ei hiiri* 1:5 Ei I M I « * * 115528 88 * lyofilisoidut seerumit, jotka saatiin kaupallisesta lähtestä (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.

** tekstissä esitetyllä tavalla määritettynä (kappale 13.2) Kävi ilmi, että sekä marsun että rotan komplementti irihiboitui ihmisen sCRl.llä. 5 Selvän inhibition puute muissa lajeissa voi heijastaa sitä, (a) että käytetty systeemi ei ollut sopiva tai (b) että tässä systeemissä tarvitaan suurta seerumipitoisuutta 13.3 C3a:n ja C5a:n tuoton inhibitio 13.3.1 Menetelmät

Komplementin estokyky testattiin myös määrittämällä C3a:n ja C5a:n tuoton spesi-10 finen inhibitio. Kaikissa kokeissa komplementtilähteenä käytettäväksi aiottu yksi ihmisen seerumien yhdistelmä jaettiin eriin ja varastoitiin pakastettuna -70 °C:ssa. Ihmisen IgG aggregoitiin kuumentamalla, jaettiin eriin ja varastoitiin pakastettuna -70 °C:ssa. Kussakin kokeessa seerumieriä tasapainoitettiin 37 °C:ssa useiden eri testattavien sCRl-pitoisuuksien kanssa. Komplementtireaktioiden sarja käynnistet-15 tiin lisäämällä aggregoitua ihmisen IgG:tä. Kontrollinäytteet, jotka eivät sisältäneet lainkaan IgG:tä, olivat aina mukana. Kiinteän 15 minuutin reaktioajan kuluttua (joka oli määritetty aiemmassa reaktion jatkumista seuraavassa tutkimuksessa, jonka tarkoituksena oli saada käyttöön sopivan pituinen aikaväli, jona C5a:n tai C3a:n tuotto oli lähes täydellinen, ts. yli 90 %). Vapautuneiden komplementtipeptidien tasot 20 (C5a tai C3a) määritettiin radioimmunomäärityksellä käyttäen kaupallisesti saata-; villa olevaa radioimmunomääritys (RIA) -testipakkauksia (C5a RIA, Amersham, RPA.520, C3a RIA, Amersham, tuoteluettelo n:o RPA.518) modifioiduissa menetel- ; missä.

* *

Koska käytettiin kompetitiivista immunomääritystä, komplementtipeptidien (c5a ja : 25 C3a) pitoisuudet muuttuivat kääntäen verrannollisesti iskujen suhteen. Näytettä kohti sitoutuneet iskut (CB) määritettiin kokonaisiskumäärinä (iskuina minuuttia kohti, cpm) sentrifugoinnissa saadusta napista. Kuvan 29 y-akseli edustaa suhteel- » t lista inhibitiota. Suhteellinen inhibitio vastaa "näytettä" vastaavia sitoutuneita iskuja (CB), joista on vähennetty CB "sCRlrn kanssa oleva näyte" jaettuna CB.llä » : 30 "kontrolli ilman IgG.tä", josta on vähennetty CB "näyte, jossa ei ollut sCRlitä."

Hill * 1 > » f 1 1 i » : » t i · » » 115528 89

Inhibitio = IYCB-näyte) - (CB ei sCRITI [(CB ei IgG) - (CB ei sCRl)] 13.3.2 Tulokset

Puhdistetun sCRl:n aktiivisuus määritettiin testaamalla sen kyky inhiboida C5a:n ja 5 C3a:n tuottoa aktivoidussa ihmisen seeruminäytteessä.

Kuten kuvasta 29 käy ilmi, puhdistettu sCRl kykeni testatuissa olosuhteissa enimmillään inhiboimaan C5a:n muodostumisen 100-prosenttisesti ja C3a:n 60-prosent-tisesti. 50-prosenttinen inhibitio havaittiin sCRl-pitoisuuksissa 5 pg/ml C5a:n tuoton ollessa kyseessä ja 15-20 pg/ml C3a:n tuoton ollessa kyseessä. Nämä koe-10 tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmä-sCRl inhiboi C5-konvertaasia tehokkaammin kuin C3-konvertaasia.

14 Esimerkki: Liukoisen CRl:n toimivan terapeuttisen aktiivisuuden osoittaminen in vivo -olosuhteissa 14.1 Liukoisen CRl:n osoittaminen toimintakykyiseksi käänteisessä passiivises-15 sa Arthus-reaktiossa in vivo

Arthus-reaktio on klassinen immunologisesti indusoitu tulehdusvaste, jonka aiheuttaa paikallisesti injektoitu antigeeni, joka sitten reagoi kiertävien vasta-aineiden kanssa. Pääasiallisimmalle biologiselle vasteelle on luonteenomaista immuuniko n-pleksien kerääntyminen, komplementin sitominen, polymorfonukleaaristen (PMN) ; 20 leukosyyttien kerääntyminen, lysosomaalisten entsyymien vapautuminen, verisuo-

i I I

niin vaikuttava amiini ja kudoksen vaurioituminen paikallisesti (Uriuhura, T. ja '>'·· Movat, H. Z., (1966) Exp. Mol. Pathol. 5, 539-558, Cochrane, C.G., (1968) Adv.

'·: Immunol. 9, 97-162). Suoran Arthus-reaktion modifikaatiota, käänteistä passiivista :Arthus-reaktiota (RPAR), on käytetty mallina tulehdusta vastaan vaikuttavien ainei-: 25 den tunnistamiseksi (Pflum, L.R. ja Graeme, M.L., (1979) Agents and Actions 9, 184-189). RPAR:ssa vasta-aine injektoidaan paikallisesti ja antigeeni esiintyy veren-.'··. kierrossa.

·;·’ Kun liukoisia CRl-molekyylejä testattiin rotan RPAR-mallissa, ne kykenivät estä- ·:··: mään paikallisen tulehdusreaktion. Tämän liukoisen CRl:n toiminnan vaikutus- ·:··· 30 mekanismi in vivo -olosuhteissa voi tapahtua komplementtireaktiotien entsyymien inhibition välityksellä.

• t · » · 115528 90 14.1.1 Materiaalit ja menetelmät

Naaraspuoliset viiden viikon ikäiset Sprague Dawley -rotat (CD-kanta), jotka pai-noivat noin 100-125 grammaa (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) nukutettiin vatsaontelonsisäisellä Avertin-liuoksen injektiolla, jota annettiin 0,1-0,3 5 ml. Tämä liuos oli laimennettu 1 :2-suhteessa kantaliuoksesta, joka oli tehty 15 mkaan Amel-etanolia lisätystä 1 g:n erästä tribromietanolia. Eläinten turkki ajeltiin selkäpuolelta. Tämän jälkeen lämmitettiin häntä ensin lämpimällä vedellä ja sitten lämpölampulla. 1 ml:n ruiskua käyttäen injektoitiin 0,35 ml ovalbumiinia (Calbio-chem Corp., San Diego, CA), jonka pitoisuus oli 5 mg/ml ja joka oli valmistettu 10 0,15-molaarisella fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (PBS), suonensisäisesti häntälaskimoon noin 2,5-5 cm hännän päästä olevaan kohtaan. Viisi minuuttia myöhemmin rottiin injektoitiin ihonsisäisesti 0,08 ml kaniinin ovalbumiinia vastaan valmistetun vasta-aineen Ig-fraktiota, jonka pitoisuus oli 20 mg/ml ja jonka vasta-ainetiitteri oli 4 mg/ml (Organon Teknika Corp., Cappel Division, West 15 Chester, PA) tai 0,08 ml kaniinin IgG:tä (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), jonka pitoisuus oli 20 mg/ml, tai PBS:ää. Kukin injektio suoritettiin kahtena rinnakkaisena kokeena ja injektiokohdan ympärillä oleva alue rengastettiin merkkaus-kynällä. Tämän jälkeen rottia monitoroitiin 1, 4 ja 18 tunnin kohdalla. 24 tunnin kuluttua rotat tapettiin upottamalla ne kuivajäähän kolmeksi minuutiksi. Ihonäytteet 20 erotettiin leikkaamalla ne irti injektoiduista kohdista. Toinen rinnakkaisnäytteistä kiinnitettiin 10-prosenttisessa formaliinissa parafiinipetausta varten ja toinen pakastettiin kryostaattileikeitä varten. Kudosleikkeet valmistettiin ja ne värjättiin hema-: toksyliinilläja eosiinilla.

.·. 14.1.2 Tulokset : 25 Heikko RPAR-reaktio (ts. turvotus ja punoitus) alkoi olla näkyvissä 3-5 tunnin kuluttua ovalbumiinia vastaan valmistetun vasta-aineen ihonsisäisestä injektiosta. ' : Reaktion voimakkuus lisääntyi asteittain kunnes reagoinut alue saavutti 3-5 mm:n suuruisen läpimitan 24 tunnin kuluttua (kuva 30b). Reaktioita ei havaittu rotan • ·. ihossa silloin, kun injektoitiin vain ei-immunisoivaa kaniinin IgG:tä tai PBS:ää.

·;·' 30 Vauriokohdasta valmistettujen kudosleikkeiden mikroskooppitutkimuksessa näkyi ·:··: dermiksessä useita äkilliseen tulehdukseen liittyviä soluja erityisesti verisuonten ;>·'; ympärillä (kuva 3 Ib). Tätä pidetään tyyppillisesti vaskuliitin ja perivaskuliitin merk kinä. Kudoksesta näkyi tyypillinen tulehdustila, johon liittyi laajaa PMN-solujen * · · · * keräytymistä verisuonten ulkopuolelle, erytrosyyttien esiintymistä sidekudoksessa ja ’ ' 35 kollageenisäikeiden höltymistä.

115528 91 14.1.3 Ihonsisäisesti annetun liukoisen CRl:n vaikutus

Valmistettiin puhdistettua sCRlitä sisältävä seos ottamalla siihen 40 μΐ sCRlitä, jonka pitoisuus oli 0,75 mg/ml, ja yhtä suuri tilavuus ovalbumiinia vastaan valmistettua vasta-ainetta tai normaalia kaniinin IgGitä tai PBS:ää. Joko sCRl-antioval-5 bumiiniseos tai sCRl-kaniinin IgG -seos tai sCRl-PBS -seos injektoitiin ihonsisäisesti rottiin, joita oh esikäsitelty suonensisäisesti annetulla ovalbumiinilla. Niihin injektiokohtiin, joihin annettiin sCRlitä sekä ovalbumiinia vastaan valmistettua vasta-ainetta, kehittyi tuskin havaittava vaurio (kuva 30a). Kuten oli odotettua, vaurioita ei kehittynyt niihin injektiokohtiin, joihin annettiin sCRl-kaniinin IgGitä. Kun 10 sCRl-antiovalbumiini-injektiokohtia ympäröivästä kudoksesta valmistettuja leikkeitä tulkittiin mikroskooppisesti, voitiin havaita pikkulaskimoiden ympärillä olevia PMN- ja mononukleaarisolujen ryhmiä, mutta ei havaittu laajaa PMN-sohijen keräytymistä eikä erytrosyyttien joutumista verisuonten ulkopuolelle (kuva 31a). Nämä koetulokset osoittavat, että liukoisen CRlin antaminen aiheutti endoteeli-15 soluihin kohdistuvan vaurion inhiboitumisen ja tulehdusreaktion inhibition.

Sellaisen sCRl:n pienimmän tehokkaan annoksen määrittämiseksi, joka tarvitaan estämään RPAR tässä rotan ovalbumiinimallissa, testattiin kymmenkertaiset saija-laimennokset (laimentamaton, 1/10, 1/100, 1/1,000 ja 1/10,000) sCRl-varasto-liuoksesta, jonka pitoisuus oli 0,75 mg/ml. Kukin sCRl-laimennos sekoitettiin yhtä 20 suureen tilavuuteen laimentamatonta tai puoliksi laimennettua ovalbumiinia vastaan valmistettua vasta-ainetta. Kuhunkin kohtaan injektoitiin yhteensä 80 μΐ. sCRl:n *. kyky inhiboida RPARiää riippui annoksesta siten, että tehokas turvotuksen vähene minen havaittiin annoksella, joka oli 300 ng kohtaa kohti (taulukko 10).

• : : Taulukko 10 ··. 25 Annosvaikutus RPARrn inhibitiossa sCRlrllä sCRl (pg/kohta) Jäljellä olevan RPARrn määrä 30 +/- ; ;> 3 +/- ·*;*: 0,3 +/- 30 0,03 ++ ‘ 0,003 ++++ 0 ++++ 115528 92 14.2 Annetun sCRl:n farmakokinetiikka in vivo -olosuhteissa sCRlin biologinen puoliintumisaika in vivo -olosuhteissa määritettiin seuraavasti. Samanikäisiin (6 viikkoa) ja ruumiinpainoltaan samanlaisiin (110-125 g) rottiin injektoitiin suonensisäisesti 250 pg sCRlrtä 0,35 ml:n tilavuudessa. Rotat tapettiin 2 5 minuuttia, 5 minuuttia, 10 minuuttia, 60 minuuttia ja 24 tuntia injektion jälkeen ja veri otettiin neulalla onttolaskimosta. 1-2 ml.n erät kunkin rotan seerumeita saatiin sentrifugoimalla 1800 kierroksen minuuttinopeudella 10 minuuttia ja kussakin näyt— teessä olevan sCRl:n määrä määritettiin CRl-ELISA.Ua. CRl-standardeina käytettiin kaksinkertaisia laimennoksia puhdistetusta sCRlistä, jonka pitoisuus oli 1 10 pg/ml, jotka oli lisätty rotan kontrolliseerumiin tai hemoglobiinia sisältämättömien punasolujen kuorista valmistettuja detergenttilysaatteja (1,6 x 108 kuorta/ml). Tulokset esitetään taulukossa 11.

Taulukko 11

Farmakokineeettiset tulokset injektoidun sCRlrn pitoisuudesta seerumissa ajan suh-15 teen

Aika suonensisäisen sCRl-pitoisuus injektion jälkeen (pg/ml) kontrolli 0,01 2 min 0,17 20 5 min 0,80 : : lOmin 1,01 60 min 0,38 24 h 0,49 » · Nämä koetulokset osoittavat, että sCRl voidaan havaita 24 tuntia suonensisäisen ;; 25 injektion jälkeen. 24 tunnin kohdalla sCRlin taso seerumissa oli 50 % siitä huippu tasosta, joka havaittiin 10 minuuttia injektion jälkeen.

14.3 sCRl pienentää infarktin kokoa rotissa, joilla on perfuusion palautumisen - *. läpikäynyt infarktoitunut sydänlihas * · · :·*: Tässä esitetyn kuvauksen mukaan sCRl, joka kykeni inhiboimaan komplement- ·:··· 30 tireaktiosaijan C3/C5 konvertaasiaktiivisuutta in vitro, kykeni myös pienentämään perfuusion palautumisvaurion kokoa rotan sydäninfarktimallissa in vivo. Sydän-infarkti voidaan aiheuttaa rotassa sepelvaltimon sitomisella. Jos perfuusion palautta- * · »* · miseen ryhdytään muutamien ensimmäisten tuntien kuluessa sydäninfarktin jälkeen, 115528 93 perfuusion palautumisen on osoitettu vähentävän infarktin kokoa, parantavan vasemman kammion toimintaa ja vähentävän kuolleisuutta (Braunwald, E. ja Kloner, R.A., (1985) J. Clin. Invest. 76, 1713-1719). Perfuusion palautus sydänlihakseen, joka on pahasti iskeeminen mutta ei palautumattomasti vaurioitunut, voi 5 itse aiheuttaa ja laajentaa vauriota. Perfuusion palautumisen aiheuttamasta vauriosta vastuussa oleviin mekanismeihin voi kuulua vaurio, jota välittävät vapaat happi-radikaalit ja solujen saama kalsiumylimäärä. Leukosyytit, jotka toimivat joko yksinään tai yhdessä pienten verisuonten endoteelisolujen kanssa, voivat myötävaikuttaa tämän vaurion syntymiseen. Tähän tapahtumaan voi liittyä komplementin aktivaatio 10 (Rossen, R.D., et ai., (1985) Cir. Res. 57, 119-130, Crawford, M.H., et ai., (1988) Circulation 78, 1449-1458).

14.3.1 Menetelmät 14.3.1.1 Rotan sydäninfarktin induktio

Rotat (n=14), jotka painoivat 200-250 grammaa, nukutettiin antamalla metoksi-15 fluraani-inhalaatio ja niille suoritettiin oikean kaulalaskimon katkaisu ja kanyylin asettaminen siihen. Puolet rotista (n=7) saivat 2 ml (1 mg) sCRl:tä kanyylista ja toinen puoli sai 2 ml fysiologista suolaliuosta plasebona, joka valmistettiin ja annettiin samalla tavalla. Kaulakanyyli poistettiin eläimistä, kaulalaskimo suljettiin ja leikkauskohta suljettiin. Sitten suoritettiin rintakehän avaus vasemmalta puolelta 20 viidennen ja kuudennen kylkiluun välistä samalla kun annettiin jaksoittain hengi-tyskoneesta 95-prosenttista happea ja 5-prosenttista hiilidioksidia siten, että keuh-* korakkuloiden paine pysyi jatkuvasti positiivisena. Tämän jälkeen suoritettiin sydän- S · · pussin leikkaus ja vasen sepelvaltimo tukittiin sitomalla siihen ommel 2-3 mm • : aortan juuresta vasemmalle. Tämän sepelvaltimon sitomisen tarkoituksena oli •: 25 aiheuttaa suureen alueeseen kohdistuva riski saada sydänkammion etuosan seinämän läpi ulottuva infarkti. Rinta suljettiin väliaikaisesti rottien jäädessä nukutukseen. 35 #: minuuttia tukoksen teosta rinta avattiin uudestaan ja sidos purettiin. Tämän pituinen aika oli valittu sellaiseksi, että huomattava osa riskialttiista alueesta oli parannetta-vissa. Leikattu rinta suljettiin sitten pysyvästi ja eläinten annettiin herätä nukutuk-,·*·. 30 sesta, joka tavallisesti tapahtui 5-10 minuuttia leikkauksen jälkeen. 100 000 yksik- • köä bentsatiinipenisilliiniä G ja 0,25 mg/kg morfiinisulfaattia annettiin lihaksen-• »· · * ' ' sisäisesti. Eläimiä ruokittiin vedellä ja rotan normaaliravinnolla yksi viikko ja ’ tapettiin sitten heparinisoinnin ja metoksifluraaninukutuksen jälkeen poistamalla . sydän.

115528 94 14.3.1.2 Kokeellisten infarktien morfologinen analyysi: Sydänten preparointi tutkimusta varten

Sydämen irrottamisen jälkeen aortat kanyloitiin nopeasti ja sepelvaltimot perfusoi-tiin ensin Krebs Henseleit -liuoksella sydänten puhdistamiseksi verestä ja hyyty-5 mistä ja sitten 30 mM KCl:llä diastolisen sydämenpysähdyksen aikaansaamiseksi. Sydämet kiinnitettiin sepelvaltimonsisäisellä perfuusiolla ja upottamalla 10-prosent-tiseen puskuroituun formaliiniin. TäyttÖpaineen säätelemiseksi riittävällä tarkkuudella sydämet ilmastettiin hiippaläpän kautta muoviputkella. Kiinnityksen jälkeen sydämistä valmistettiin poikittaiset 2 mm paksut leikkeet yhdensuuntaisesti eteis-10 kammiouurteen suhteen sydämen kärjestä tyveen ja valmistettiin histologiset leikkeet.

14.3.2 Tulokset

Eloonjääminen oli sama molemmissa ryhmissä, ts. 6/7 rotista oli elossa 7 päivää ja nämä analysoitiin. Karkea histologisten leikkeiden tarkastelu paljasti, että viidellä 15 kuudesta plasebolla käsitellystä rotasta oli suuri kammion seinämän läpi ulottuva sydäninfarkti (tämän arvioitiin edustavan ainakin 15 % vasemman kammion kokonaismassasta) Vain yhdellä kuudesta henkiinjääneestä sCRl:llä käsitellystä eläimestä oli löydöksenä tämä suuri kammion seinämän läpi ulottuva infarkti. Muilla sCRl:llä käsitellyillä eläimillä oli pieniä laikukkaita infarkteja, jotka käsittivät 20 paljon pienemmän osan vasemman kammion massasta (vähemmän kuin 15 %). Itse asiassa useimmat näistä olivat havaittavissa vain mikroskooppisesti, kun taas : : ; plasebolla käsitellyissä rotissa infarktit näkyivät karkeassa tutkimuksessa.

14.3.3 Johtopäätökset * · .,/ Nämä tulokset viittaavat siihen, että sCRl-käsittely pienentää tehokkaasti perfuu- 25 sion palautumisvauriota in vivo ja parantaa sydäninfarktin vaikutukset. Siinä määrin kuin perfuusion palautumisvaurio voidaan parantaa, voidaan vaurioitumattomaksi jääneen sydänlihaksen absoluuttista määrää nostaa ja sitä aikaikkunaa, jossa perfuu- »· sion palautus on kliinisesti käyttökelpoinen, voidaan pidentää. sCRlillä suoritettu käsittely tulisi olemaan käyttökelpoinen rinnakkaishoito tukkeumaa liuottavien , ‘.; 30 aineiden j a sepelvaltimon ilma-angioplastian rinnalla akuutin infarktin aikana.

• 15. Mikro-organismien talletus ’···* E. coli -kanta DK1/P3, jossa oli plasmidi piABCD (varustettu merkinnällä ‘ ’ pCRl-piABCD), joka koodaa täysimittaista CRl-proteiinia, talletettiin talletuslai- 115528 95 tokseen Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, 31. maaliskuuta 1988 ja sille annettiin hakunumero B-18355. Kiinanhamsterin muna-sarjasolulinja DUX Bll, jossa oli plasmidin pBSCRlc/pTCSgpt klooni 35.6, joka koodaa liukoista CRl-molekyyliä, talletettiin talletuslaitokseen American Type 5 Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, 23. maaliskuuta 1989 ja sille annettiin hakunumero CR1 10052.

Tätä keksintöä ei ole tarkoitus käsittää siten, että talletetut mikro-organismit rajoittavat sitä, koska talletettujen sovellutusesimerkkien tarkoituksena on olla valaisevana esimerkkinä yhdestä tämän keksinnön osasta ja mitkä tahansa mikro-organis-10 mit, jotka ovat toiminnallisesti samanarvoisia, kuuluvat tämän keksinnön suojapii-riin. Itse asiassa useat tämän keksinnnön mukaiset eri modifikaatiot, tässä esitettyjen ja kuvattujen lisäksi, käyvät alan ammattimiehelle selviksi tästä kuvauksesta ja siihen liitetyistä piirroksista. Näiden modifikaatioiden on tarkoitus kuulua mukaan liitettyjen patenttivaatimusten suojapiiriin. On myös selvää, että kaikki mainitut 15 nukleotidien emäsparikoot ovat likimääräisiä ja näitä käytetään vain kuvaamistarkoi-tuksiin.

Tässä on siteerattu useita viitteitä, joiden sisältämät kuvaukset liitetään mukaan viittaamalla niihin kokonaisuudessaan.

Kaavake 134 (jatkoa) 20 Talletuslaitoksen nimi: i : Agricultural Research Culture Collection (NRRL) ' * · Talletuslaitoksen osoite: :': 1815 North University Street ·,· Peoria, IL 61604 • ·. 25 T alletuksen jättöpäivämäärä 31. maaliskuuta 1988 Hakunumero: B-18355 ’ · · > · ♦ »· · I » I t • · > * · · · # I · · » · ·

Claims (7)

115528 96

1. Menetelmä rekombinanttisen, liukoisen tyypin I komplementtireseptorimole-kyylin puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää sen, että (a) ilmennetään tyypin I komplementtireseptorimolekyyliä, jolla on aminohappo-5 sekvenssi käsittäen kuvassa 1 (A)-1 (P) esitetyn aminohapposekvenssin aminohaposta 42 aminohappoon 1972, tai sen fragmenttia, josta oleellisesti puuttuu transmembraa-nialue, rekombinanttisessa soluviljelmässä siten, että molekyyli erittyy viljelyalus-taan, (b) suoritetaan näytteelle soluviljelyalustasta kationinvaihtokromatografia, ja 10 (c) eluoidaan molekyyli kationinvaihtokromatografiapylväästä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen (c) jälkeen sen, että (d) suoritetaan vaiheesta (c) eluoidulle molekyylille anioninvaihtokromatografia, ja 15 (e) eluoidaan molekyyli vaiheen (d) anioninvaihtokromatografiapylväästä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kationinvaih-tovaihe (b) on korkeapainenestekromatografia (HPLC).

: 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe (b) on • j HPLC ja vaihe (d) on HPLC. ; 20

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, : että mainittu molekyyli on valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista pitkistä homo logisista toistojaksoista (LHR): LHR-A, LHR-B, LHR-C ja LHR-D.

6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu molekyyli käsittää tyypin I komplementtireseptorin lyhyitä konsensus-’ ' # 25 toistojaksoja (SCR), jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: : (i) SCR:t 1 ja 2; ! ,j (ii) SCR:t 1,2,3 ja4; (iii) SCR:t 1, 2, 3, 4, 5, 6 ja 7; : (iv) SCR:t6,7,8,9, 10, 11 ja 12; 30 (v) SCR:t 8 ja 9; (vi) SCR:t 8, 9, 10 ja 11; 115528 97 (vii) SCR:t 8, 9, 10, 11, 12, 13 ja 14; (viii) SCR:t 15 ja 16; (ix) SCR:t 12, 13, 14, 15, 16 ja 17; (x) SCR:t 15, 16, 17, 18 ja 19; 5 (xi) SCR:t 1-17; (xii) SCR:t 1-23; (xiii) SCR:tl-28;ja (xiv) SCR:t 1-30.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 10 että mainittu molekyyli vastaa liukoista tyypin I komplementtireseptoripolypeptidiä, jolla on kuvassa 1A-1P esitetty aminohapposekvenssi Gln42:sta Alaj972:een.