KR101398545B1 - Ｃｄ93 또는 이의 가용성 단편을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 진단용 마커 - Google Patents

Ｃｄ93 또는 이의 가용성 단편을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 진단용 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 진단용 마커, ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 염증성 질환 진단 키트, 및 생물학적 시료에서 염증성 질환 진단용 마커인 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CD93 또는 이의 가용성 단편은 염증 유도 물질에 의한 또는 염증성 환경에서 ＣＤ93 발현이 증가하고 ＣＤ93 가용성 단편의 양이 증가한다. 따라서, 본 발명에 따른 CD93 또는 이의 가용성 단편은 염증성 질환의 진단 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 진단용 마커{Marker for diagnosis of inflammatory disease comprising CD93 or soluble fragment thereof}
본 발명은 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 진단용 마커, ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 염증성 질환 진단 키트, 및 생물학적 시료에서 염증성 질환 진단용 마커인 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편을 검출하는 방법에 관한 것이다.
인간 CD93(C1qRp, AA4.1(mouse))은 염색체 20번, p11.21에 위치한 타입 1 막 통과 당단백질이다(Malhotra, R.et al., 1993. Immunology 78: 341-348; Nepomuceno, R. R. et al., 1997. Immunity 6: 119-129; Steinberger, P. et al., 2002. Biol. 71: 133-140). 상기 단백질은 B 세포 발달에 있어서 세포-세포간 상호작용과 식세포작용(phagocytosis)에 관련되어진 것으로 보고되어 있다(Petrenko, O. et al., 1999. Immunity 10: 691-700; Norsworthy, P. J. et al., 2004. J. Immunol. 172: 3406-3414; Nepomuceno, R. R. et al., 1997. Immunity 6: 119-129; McGreal, E. P. et al., 2002. J. Immunol. 168: 5222-5232).
CD93은 총 652개 아미노산으로 구성되어지며, 리더서열, c-타입 탄수화물-인지 도메인, 5개의 EGF-유사 도메인, 뮤신 도메인, 하나의 막 통과 도메인, 47개 아미노산의 세포내 도메인을 포함하고 있다(Nepomuceno R. R. et al., 1997. Immunity 6:119-129; Park, M. et al., 2003. J. Cell Physiol. 196: 512-522; Nepomuceno, R. R. et al., J. Immunol. 162:3583). 또한, CD93은 골수계(myeloid lineage), 조혈모세포(hematopoietic stem cell), NK 세포, 혈소판, 소교세포 (microglia) 및 혈관내피세포(endothelial cell) 등에서 발현되어진다(Nepomuceno, R. R. et al., 1997. Immunity 6:119; Nepomuceno, R. R. et al., 1998. J. Immunol. 160:1929; Danet G. H. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:10441-5; Lovik G. et al., J Immunol 2000; 30:3355-62; Fonseca M. I. et al., J Leukoc Biol 2001; 70:793-800; Webster, S. D. et al., 2000. J. Leukocyte Biol. 67:109). 또 다른 연구결과에서는 CD93이 대식세포(tissue macrophage)에서는 발현되지 않으나, 혈관내피(vascular endothelial) 세포에서는 많이 발현된다고 보고되어 있다(Petrenko, O. et al., 1999. Immunity 10:691; Dean, Y. D. et al., J. Immunol. 31:1370; Fonseca, M. I. et al., 2001. J. Leukocyte Biol. 70:793.). CD93은 원래 항-CD93 항체를 이용한 결과에서 식세포작용의 C1q-매개 증강(C1q-mediated enhancement of phagocytosis)에 관여한다고 하여 C1q에 대한 수용체로서의 가능성이 제기되어 왔다. 그러나 연이은 실험에서 C1q와 직접 결합하지 않는 것 으로 여러 그룹에서 보고되었다(Nepomuceno, R. R. et al. 1999. J. Immunol. 162:3583; McGreal, E. P. et al., 2002. J. Immunol. 168:5222; Steinberger, P. et al., 2002. J. Leukocyte Biol. 71:133).
CD93 녹-아웃 마우스 실험에서는 CD93의 부재에 의해 사멸세포의 제거 기능에 문제가 생기는 것으로 밝혀졌고, in vitro 실험에서는 그런 기능 이상이 보여지지 않는 상반된 결과가 도출되었다(Guan, E. et al., 1994. J. Immunol. 152: 4005-4016; Norsworthy, P. J. et al., 2004. J. Immunol. 172: 3406-3414; Norsworthy, P. J. et al., 2004. J. Immunol. 172: 3406-3414). 이러한 식세포작용 기능은 면역반응에서 초기에 중요한 역할을 담당하고 있으며, 아폽토시스된 세포들의 제거에 중요한 역할을 하고 있다(Brown, E. J. (1995) Phagocytosis. Bioessays 17, 109-117).
이런 기능들에 대한 실마리를 푸는 최근 연구 결과에서, CD93이 TNF-α, LPS 등의 초기 염증단계(pro-inflammatory state)에서 세포외 부분(ectodomain)이 잘려지는 단편화(shedding)가 일어난다는 보고가 있었다(Park, M. et al., 2003. J. Cell Physiol. 196: 512-522.; Suzanne S. Bohlson et al., 2005. J. immunol. 175: 1239-1247). 또한, CD93과 같은 계열 세포인 U937 세포에서 PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate) 처리에 의해 단편화가 일어나 가용성 단편으로 잘려진다는 보고도 있었다(Ikewaki N., Tamauchi H., and Inoko H. 2007. Decrease in CD93 expression in a human monocyte-like cell line (U937) treated with various apoptosis-inducing chemical substances. Microbiol. Immunol., 51(12):1189- 1200). 또한, 국제공개특허 WO 2008/082519호에는 CD93-관련 다형체가 제 1형 당뇨병과 홍반성 낭창의 진단에 유용하다고 기재되어 있다. 그러나, CD93을 염증성 질환 진단용 마커로 이용한 연구는 전무한 상태이다.
따라서, CD93을 염증성 질환 진단용 마커로서 개발할 필요성이 요구되고 있다.
본 발명자들은 염증성 질환의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있는 염증성 질환 진단용 마커에 대해 연구하던 중, 염증 유도 물질에 의한 또는 염증성 환경에서 ＣＤ93 발현이 증가하고 ＣＤ93 가용성 단편의 양이 증가함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 진단용 마커를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 염증성 질환 진단 키트를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에서 염증성 질환 진단용 마커인 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편을 검출하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 진단용 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 염증성 질환 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 생물학적 시료 및 대조군의 단백질을 고정체에 코팅시키는 단계,
2) 상기 고정체에 염증성 질환 진단용 마커인 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계,
3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합 반응물을 2차 항체 접합체의 표지체 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및
4) 생물학적 시료와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는, ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편의 검출 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 ＣＤ93의 발현은 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포에서 LPS, TNF-α에 의해 증가하고, PMA 처리에 의해서는 별로 증가하지 않는다. 그러나, CD93 가용성 단편의 양은 LPS, TNF-α, PMA 처리에 의해 모두 증가한다. 또한, 마우스에 PBS, 티오글리콜레이트, LPS를 주사한 후, 복막세포 중 대식세포에서의 마우스 CD93 발현은 LPS 처리에 의해 가장 많이 증가하며, 티오글리콜레이트 처리에 의해서도 유사하게 증가한다. 또한, 혈청 내 CD93 가용성 단편의 양은 LPS나 티오글리콜레이트에 의해 크게 변화되지 않으나, 복막액 내의 CD93 가용성 단편의 양은 LPS나 티오글리콜레이트 처리에 의해 현저히 증가한다. 또한, 퇴행성 관절염 환자로부터 얻은 활막 조직보다 류마티스성 관절염 환자로부터 얻은 활막 조직에서 CD93의 발현이 현저히 높게 나타나며, 류마티스성 관절염 환자로부터 얻은 활막액 내에서의 CD93 가용성 단편의 양이 퇴행성 관절염 환자군 보다 현저히 높게 나타난다. 본 발명에서 CD93 가용성 단편은 막 통과 단백질인 CD93 단백질이 세포배양 후 방출된 세포외 부분(ectodomain)으로서, 95kDa 정도의 단편을 포함하는 것을 의미한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 CD93 또는 이의 가용성 단편은 염증 유도 물질에 의한 또는 염증성 환경에서 ＣＤ93 발현이 증가하고 ＣＤ93 가용성 단편의 양이 증가한다. 따라서, 본 발명에 따른 CD93 또는 이의 가용성 단편은 염증성 질환의 진단 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.
상기 염증성 질환은 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 퇴행성 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 복막염, 포도막염, 피부염, 습진, 다발성 경화증 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 염증성 질환 진단 키트는, 상기 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 상기 앱타머는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다.
상기 염증성 질환 진단 키트는 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있다.
상기 2차 항체 접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein), 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.
상기 발색 기질 용액은 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충용액(0.1M NaOAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02M 인산염 완충용액, 0.13M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3회 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에서 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편을 검출하여, 염증성 질환의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 복막액, 활막액, 타액, 소변 또는 대변을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 생물학적 시료 내 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편을 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분획하고 고정체로 옮겨 고정시킨 후, 고정된 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행하고, ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편의 발현 수준을 측정한다. 즉, 생물학적 시료에서 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편의 발현 수준이 높으면, 염증성 질환을 갖는 것으로 진단하거나 염증성 질환의 가능성을 가질 것으로 예측하는 것이다.
상기 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막 (polyvinylidene difluoride membrane), 폴리비닐 수지 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있다.
상기 항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 ELISA법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR (surface plasmon resonance), 바이오칩(DNA, RNA), 전기영동법, PCR, RT-PCR 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 사람 단핵구 세포인 THP-1 세포에서의 CD93 발현 및 CD93 가용성 단편의 양 측정(in vitro)
여러 가지 염증 유도 물질에 의한 또는 염증성 환경에서의 CD93 발현과 이의 단편화 양상을 알아보기 위하여, 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포에서의 CD93 발현과 배양 상등액 내에서의 CD93 가용성 단편의 양을 측정하였다.
1-1. 사람 단핵구 세포인 THP-1 세포에서의 CD93 발현 양상 : FACS 실험
THP-1 세포는 10% 우태아 혈청, 페니실린 G(100 IU/㎖), 스트렙토마이신 (100㎍/㎖), L-글루타민(2mM), HEPES(10mM), 피루빈산나트륨(1.0mM)을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 배양된 THP-1 세포를 PBS, LPS(1.0㎍/㎖), TNF-α(0.5㎍/㎖) 또는 PMA(0.1㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하고, 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정하였다. PBS로 1회 세척하고 3% NGS(normal goat serum)를 이용하여 30분간 차단한 후 다시 3회 세척하였다. 여기에 염소 항-인간 CD93 항체(R&D systems)를 1시간 동안 차갑게 냉각하여 반응시켰다. PBS로 다시 3회 세척한 후, 항-염소 IgG-FITC 항체로 1시간 동안 차갑게 냉각하여 형광염색하였다. 대조군으로는 각각의 실험군에 대해 항-CD14-FITC 항체로 따로 형광염색하였다. 각각 염색한 세포를 유세포 분석기(EPICS Elite (Coulter))를 이용하여 분석하였다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, THP-1 세포에서 CD93의 세포 표면 발현이 LPS, TNF-α에 의해 증가하였고, PMA 처리에 의해서는 별로 증가하지 않았다. 또한, 대 조군으로 사용한 CD14의 세포 표면의 발현은 LPS, TNF-α, PMA 처리에 의해 모두 감소하였는데, 이는 CD14의 단편화에 의한 것으로 생각된다. CD14의 단편화는 단핵구-대식세포 활성화를 하향-조절(down-modulation)하는데 있어서 중요한 메커니즘으로 알려져 있다(Schutt, C. 1999. Cd14. Int. J. Biochem. Cell Biol. 31:545. 23. Le-Barillec, K., M. Si-Tahar, V. Balloy, and M. Chignard. 1999. Proteolysis of monocyte CD14 by human leukocyte elastase inhibits lipopolysaccharide-mediated cell activation. J. Clin. Invest. 103:1039. Bazil, V., and J. L. Strominger. 1991. Shedding as a mechanism of down-modulation of CD14 on stimulated human monocytes. J. Immunol. 147:1567). 지금까지의 여러 연구결과에 따르면, 콜라게나제, 뉴트로필 엘라스타제(neutrophil elastase)와 카텝신 G 등이 세포 표면의 CD14 분자를 단편화시킴이 보고되어져 있다(Bryniarski, K., K. Maresz, M. Szczepanik, M. Ptak, and W. Ptak. 2003. Modulation of macrophage activity by proteolytic enzymes. Differential regulation of IL-6 and reactive oxygen intermediates (ROIs) synthesis as a possible homeostatic mechanism in the control of inflammation. Inflammation 27:333. Le-Barillec, K., M. Si-Tahar, V. Balloy, and M. Chignard. 1999. Proteolysis of monocyte CD14 by human leukocyte elastase inhibits lipopolysaccharide-mediated cell activation. J. Clin. Invest. 103:1039. Coyne, C. P., T. Howell III, H. Smodlaka, C. Willetto, B. W. Fenwick, and E. Chenney. 2002. Alterations in membrane-associated CD14 expression and the simultaneous liberation of soluble CD14 fragment in adherent macrophages mediated by a leukocyte carboxyl/aspartate protease. J. Endotoxin. Res. 8:273.)
1-2. 웨스턴 블롯 실험
THP-1 세포는 10% 우태아 혈청, 페니실린 G(100 IU/㎖), 스트렙토마이신 (100㎍/㎖), L-글루타민(2mM), HEPES(10mM), 피루빈산나트륨(1.0mM)을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 배양된 THP-1 세포를 PBS, LPS(1.0㎍/㎖), TNF-α(0.5㎍/㎖) 또는 PMA(0.1㎍/㎖)로 24시간 동안 처리한 후, 용해물(lysate)과 배양 상등액을 얻었다. 5분간 시료를 끓인 후, 냉동 보관하였다. 시료를 8% SDS-PAGE 겔에 로딩한 후, 전기영동하였다. 겔을 다시 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, 4% 탈지우유로 차단하였다. 이후, 염소 항-CD93 항체(R&D systems)를 0.5㎍/㎖로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 또한 PBST로 3회 세척한 후, 항-염소 IgG-HRP 항체(Santa cruz)를 0.5㎍/㎖로 하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 내부 대조군으로 anti-β actin(Santa cruz)과 항-염소 IgG-HRP(Santa cruz)를 이용하였다. 이후 ECL 키트(ECL Plus, Amersham, USA)를 제조사의 방법대로 처리하였다.
결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, CD93 분자의 자체 발현은 FACS 결과와 동일하게 LPS, TNF-α 처리에 의해 증가하였으나, PMA 처리에 의해서는 증가하지 않았다. 그러나, CD93 가용성 단편의 양은 LPS, TNF-α, PMA 처리에 의해 모두 증가하였다. 상기 결과에 의해, 염증성 환경 혹은 염증 유도 물질에 의해 THP-1 세포와 Jukat 세포에서의 발현증가라는 측면에서 보면, CD93 자체의 발현도 증가하고, 특히 CD93 가용성 단편의 양 또한 증가한다는 점을 고려하면, CD93 또는 이의 가용성 단편이 염증성 질환의 진단 마커로서의 활용이 가능할 것으로 생각된다.
1-3. RT-PCR 실험
THP-1 세포를 6 웰 플레이트에 배양한 후, 각각 PBS, LPS(1.0㎍/㎖, InvivoGen), PMA(0.1㎍/㎖, Sigma)를 처리하였다. 처리 24시간 후 RNA 동정 키트 (Qiagen)를 이용하여 RNA를 동정하였다. 역전사를 위해 역전사효소(Bio-Rad)와 dNTP를 혼합하여 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 각각의 cDNA를 얻었다. real-time PCR 분석을 위해 CFX96 system(Bio-Rad)이 이용되었다. 95℃에서 3분 동안 초기 변성하고, 이어서 95℃에서 15초 동안 어닐링, 60℃에서 1분 동안 신장화를 40~45 주기로 하여 PCR을 수행하였다. 형광 측정은 각 어닐링 단계에서 기록되며, 데이터들은 각 단계마다 자동으로 저장되었다. 구체적으로는, 2㎕의 cDNA 주형과 CD93 프라이머를 23㎕의 iQ SYBR Supermix(Bio-Rad)와 혼합하여 반응시켰다. 모든 반응은 2번 반복하였다. 상대적 mRNA 발현을 측정하기 위하여 평균 Ct(average threshold cycle) 값을 기준값으로 하였다. 모든 Ct 값의 기준은 GAPDH를 이용하여 표준화하였다. 프라이머 세트는 다음과 같다[CD93: 정방향 CTC TGG GGC TAC TGG TCT ATC, 역방향 TGT CGG ACT GTA CTG GTT CTC; GAPDH: 정방향 CAT GTT CGT CAT GGG TGT GAA, 역방향 GGA CTG TGG TCA TGA GTC CTT].
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, THP-1 세포에서의 CD93 발현은 LPS와 PMA 처리에 의해 유의하게 증가하였다.
실시예 2 : 마우스 말초혈액단핵세포와 복막세포에서의 CD93 발현 양상 및 혈청과 복막액에서의 CD93 가용성 단편의 양 측정(in vivo)
in vitro 실험에서의 CD93 발현 양상에 대해 in vivo 실험에서도 같은 발현 양상과 단편화 현상이 일어나는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 즉, 마우스에 복막염을 일으키거나 염증 유발 물질[티오글리콜레이트 (thioglycollate) 또는 LPS]을 주사한 후, 마우스 말초혈액단핵세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cell)와 복막세포(peritoneal cell)에서의 CD93 발현 양상, 및 혈청(serum)과 복막액(peritoneal lavage fluid, PLF)에서의 CD93 가용성 단편의 양을 측정하였다.
2-1. 마우스 말초혈액단핵세포와 복막세포에서의 CD93 발현 양상 : FACS 실험
6주령 balb/C 마우스에 1㎖의 PBS, 4% 티오글리콜레이트 또는 0.1㎎/㎖의 LPS를 주사한 다음, 3일 동안 유지하였다. 3일 후, 마우스로부터 후안와정맥 (retro-orbital vein)을 통해 헤파린-코팅된 유리 모세관 튜브를 이용하여 혈액을 채혈하고 원심분리하여 혈청과 PBMC 세포를 얻었다. 곧바로 마우스를 희생시켜, 복강내로부터 복막액(PLF)과 복막세포(대부분 복강내 대식세포)를 얻었다. 각각의 세포들에 포함된 적혈구를 제거하기 위하여, 10㎖의 적혈구 용해용액(red blood cell lysing buffer, Sigma)을 37℃에서 10분간 두 번 반응시켜 완전히 적혈구를 제거하였다. 그 다음 상기 실시예 1-1에서 전술한 것과 동일한 방법으로 형광염색하였다. 다만, 항체의 경우 양 항-마우스 CD93 항체(R&D systems)와 항-양 IgG-FITC(Santa Cruz)를 사용하였다. 또한 대식세포 분화 정도를 알아보기 위하여, 분화마커인 CD11b 항체(BD sciences)를 이용하여 이중 염색을 하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 복막세포 중 대식세포에서의 마우스 CD93 발현은 LPS 처리에 의해 가장 많은 증가를 보였고, 티오글리콜레이트 처리에 의해서도 유사하게 증가하였다. 따라서, 마우스에 티오글리콜레이트와 LPS 처리에 의해 PBMC에 존재하던 대식세포들이 복막으로 옮겨간 것을 알 수 있다.
2-2. 웨스턴 블롯 실험
상기 2-1에서 사용하고 남은 절반의 세포를 용해시킨 후, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 마우스 CD93을 검출하기 위해 양 항-마우스 CD93 항체(R&D systems)와 항-양 IgG-HRP(Santa Cruz)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-2의 방법과 동일하게 하여 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. 또한 대식세포 분화 정도를 알아보기 위하여, 분화마커인 CD11b 항체(BD sciences)를 이용하여 이중염색을 하였다. 내부 대조군으로 anti-β actin(Santa cruz)과 항-염소 IgG-HRP(Santa cruz)를 이용하였다. 이후 ECL 키트(ECL Plus , Amersham, USA)를 제조사의 방법대로 처리하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, FACS 결과와 동일하게 마우스에 티오글리콜레이트와 LPS 처리에 의해 복막세포에서 CD93 분자의 발현이 현저히 증가하였다.
2-3. CD93 가용성 단편의 양 측정 : 샌드위치 ELISA 실험
FACS와 웨스턴 블롯 실험에 의해 CD93 분자 자체의 양이 증가되었음을 관찰한 후, CD93 가용성 단편은 어떻게 변화되는지를 확인하기 위하여, 샌드위치 ELISA 방법을 이용하여 혈청과 복막액(PLF)에서의 CD93 가용성 단편의 양을 측정하였다. 먼저, 93-웰 휄콘 플레이트(Becton Dickinson)에 100ng/well의 랫트 항-마우스 CD93 항체(R&D systems)를 밤새도록 코팅하였다. PBST로 3회 세척한 후, 3% 탈지우유로 상온에서 30분간 차단하였다. 다시 PBST로 3회 세척한 후, 모아둔 각각의 마우스 혈청과 복막액을 100㎕씩 로딩한 후 2시간 동안 방치하였다. 정량을 위한 표준 물질로는 마우스 CD93 가용성 단편이 사용되었다. 다시 3회 세척한 후, 1㎍/㎖의 양 항-마우스 CD93 항체(R&D systems)로 1시간 방치하였으며, 곧이어 1㎍/㎖ 의 항-양 IgG-HRP 항체(Santa cruz)로 다시 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 다시 3회 세척한 후, OPD(Sigma)를 이용하여 발색한 후, 분광광도계(VERSAmax tunable microplate reader, Molecular Devices)를 이용하여 OD값을 측정하였다. 측정한 값은 각각 표준곡선을 이용하여 절대 정량을 실시하였다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 혈청 내 CD93 가용성 단편의 양은 LPS나 티오글리콜레이트에 의해 크게 변화되지 않았다. 그러나, 복막액 내의 CD93 가용성 단편의 양은 LPS나 티오글리콜레이트 처리에 의해 현저히 증가하였다. 따라서, CD93 가용 성 단편은 염증성 질환의 진단 마커로서의 활용이 가능할 것으로 생각된다.
실시예 3 : 활막 조직 내에서의 CD93 발현 및 활막액 내에서의 CD93 가용성 단편의 양 측정
3-1. 활막 조직 내에서의 CD93 발현 : 면역조직화학(immunohistochemistry) 방법
3명의 류마티스성 관절염(rheumatoid-arthritis, RA) 환자와 2명의 퇴행성 관절염(osteo-arthritis, OA) 환자로부터 얻은 활막(synovium) 조직을 4% 파라포름알데히드로 밤새도록 고정하였다. 이후, 알콜로 탈수시키고 파라핀으로 임베딩 (embedding)하여 절단을 실시하였다. 이후 내재된 퍼옥시다제 활성을 없애기 위해 methanolic H2O2로 반응시켰다. 또한 비특이적 반응을 없애기 위해 3% NGS(normal goat serum)로 2시간 차단하였다. 이후 조직을 염소 항-인간 CD93 항체(R&D)와 비오티닐화된 항-염소 IgG, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체(Vector, Peterboredgh, UK)를 차례로 각 1시간씩 반응시켰다. 염색된 조직은 다시 헤마톡실린으로 대조염색(counter staining)하여, 올림푸스 현미경(Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 퇴행성 관절염 환자로부터 얻은 활막 조직보다 류마티스성 관절염 환자로부터 얻은 활막 조직에서 CD93의 발현이 현저히 높게 나타났다. 특히, 림프구의 침윤이 일어나는 윤활막(synovial lining), sublining, 및 혈관주위 부분(perivascular region)에서 CD93 분자의 발현이 현저히 높게 나타났다.
3-2. 활막액 내에서의 CD93 가용성 단편의 양 측정 : 샌드위치 ELISA 방법
8명의 류마티스성 관절염 환자와 8명의 퇴행성 관절염 환자로부터 얻은 활막액(synovial fluid) 내에서의 CD93 가용성 단편의 양을 샌드위치 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 먼저, 93-웰 휄콘 플레이트(Becton Dickinson)에 100ng/well의 랫트 항-인간 CD93 항체(R&D systems)를 밤새도록 코팅하였다. PBST로 3회 세척한 후, 3% 탈지우유로 상온에서 30분간 차단하였다. 다시 PBST로 3회 세척한 후, 모아둔 각각의 류마티스성 관절염 환자와 8명의 퇴행성 관절염 환자의 활막액(SF)을 100㎕씩 로딩한 후 2시간 동안 방치하였다. 정량을 위한 표준 물질로는 인간 가용성 CD93이 사용되었다. 다시 3회 세척한 후, 1㎍/㎖의 염소 항-인간 CD93 항체(R&D systems)로 1시간 방치하였으며, 곧이어 1㎍/㎖의 항-염소 IgG-HRP 항체(Santa cruz)로 다시 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 다시 3회 세척한 후, OPD(Sigma)를 이용하여 발색하고, 분광광도계를 이용하여 OD값을 측정하였다. 측정한 값은 각각 표준곡선을 이용하여 절대 정량을 실시하였다.
결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 류마티스성 관절염 환자로부터 얻은 활막액 내에서의 CD93 가용성 단편의 양이 퇴행성 관절염 환자군 보다 현저히 높음을 확인하였다. 따라서, CD93 분자 또는 이의 가용성 단편은 염증성 질환의 진단 마커로서의 활용이 가능할 것으로 생각된다.
본 발명에 따른 CD93 또는 이의 가용성 단편은 염증 유도 물질에 의한 또는 염증성 환경에서 ＣＤ93 발현이 증가하고 ＣＤ93 가용성 단편의 양이 증가한다. 따라서, 본 발명에 따른 CD93 또는 이의 가용성 단편은 염증성 질환의 진단 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포에 LPS, TNF-α 또는 PMA를 처리한 후, 세포 표면에서의 CD93 발현 양상을 FACS로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 THP-1 세포에 LPS, TNF-α 또는 PMA를 처리한 후, 세포 표면에서의 CD93 발현 양상과 이의 가용성 단편을 웨스턴 블롯으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 THP-1 세포에 LPS 또는 PMA를 처리한 후, 세포 표면에서의 CD93 mRNA 발현을 RT-PCR로 측정하여 정량한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 마우스에 PBS, 티오글리콜레이트, LPS를 주사한 후, 마우스 CD93의 발현 양상을 복막 대식세포에서 FACS로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 마우스에 PBS, 티오글리콜레이트, LPS를 주사한 후, 마우스 CD93의 발현 양상을 PBMC와 복막 대식세포에서 웨스턴 블롯으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 마우스에 PBS, 티오글리콜레이트, LPS를 주사한 후, 마우스 CD93 가용성 단편의 양을 혈청과 복막액에서 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 류마티스성 관절염 환자(RA)와 퇴행성 관절염 환자(OA)로부터 얻은 활막 조직을 CD93 항체로 염색하여 그 발현 양상을 면역조직화학 방법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 류마티스성 관절염 환자(RA)와 퇴행성 관절염 환자(OA)로부터 얻은 활막액에 존재하는 CD93 가용성 단편의 양을 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Marker for diagnosis of inflammatory disease comprising CD93 or soluble fragment thereof <130> 11p-10-01 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 324 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Gly Ala Asp Thr Glu Ala Val Val Cys Val Gly Thr Ala Cys Tyr 1 5 10 15 Thr Ala His Ser Gly Lys Leu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Asn His Cys 20 25 30 Asn Gln Asn Gly Gly Asn Leu Ala Thr Val Lys Ser Lys Glu Glu Ala 35 40 45 Gln His Val Gln Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Arg Arg Glu Ala Ala 50 55 60 Leu Thr Ala Arg Met Ser Lys Phe Trp Ile Gly Leu Gln Arg Glu Lys 65 70 75 80 Gly Lys Cys Leu Asp Pro Ser Leu Pro Leu Lys Gly Phe Ser Trp Val 85 90 95 Gly Gly Gly Glu Asp Thr Pro Tyr Ser Asn Trp His Lys Glu Leu Arg 100 105 110 Asn Ser Cys Ile Ser Lys Arg Cys Val Ser Leu Leu Leu Asp Leu Ser 115 120 125 Gln Pro Leu Leu Pro Ser Arg Leu Pro Lys Trp Ser Glu Gly Pro Cys 130 135 140 Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Asn Ile Glu Gly Phe Val Cys Lys 145 150 155 160 Phe Ser Phe Lys Gly Met Cys Arg Pro Leu Ala Leu Gly Gly Pro Gly 165 170 175 Gln Val Thr Tyr Thr Thr Pro Phe Gln Thr Thr Ser Ser Ser Leu Glu 180 185 190 Ala Val Pro Phe Ala Ser Ala Ala Asn Val Ala Cys Gly Glu Gly Asp 195 200 205 Lys Asp Glu Thr Gln Ser His Tyr Phe Leu Cys Lys Glu Lys Ala Pro 210 215 220 Asp Val Phe Asp Trp Gly Ser Ser Gly Pro Leu Cys Val Ser Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Gly Cys Asn Phe Asn Asn Gly Gly Cys His Gln Asp Cys Phe Glu 245 250 255 Gly Gly Asp Gly Ser Phe Leu Cys Gly Cys Arg Pro Gly Phe Arg Leu 260 265 270 Leu Asp Asp Leu Val Thr Cys Ala Ser Arg Asn Pro Cys Ser Ser Ser 275 280 285 Pro Cys Arg Gly Gly Ala Thr Cys Val Leu Gly Pro His Gly Lys Asn 290 295 300 Tyr Thr Cys Arg Cys Pro Gln Gly Tyr Gln Leu Asp Ser Ser Gln Leu 305 310 315 320 Asp Cys Val Asp

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. ＣＤ93 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 ＣＤ93 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 류머티스성 관절염 진단용 키트.
  5. 1) 생물학적 시료 및 대조군의 단백질을 고정체에 코팅시키는 단계,
    2) 상기 고정체에 ＣＤ93 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 ＣＤ93 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계,
    3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합 반응물을 2차 항체 접합체의 표지체 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및
    4) 생물학적 시료와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는, 류머티스성 관절염 진단의 정보를 제공하기 위한 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편의 검출 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 복막액, 활막액, 타액, 소변 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 류머티스성 관절염 진단의 정보를 제공하기 위한 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편의 검출 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 고정체는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막 (polyvinylidene difluoride membrane), 폴리비닐 수지 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드글라스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 류머티스성 관절염 진단의 정보를 제공하기 위한 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편의 검출 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 항원-항체 결합반응은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 ELISA법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR(surface plasmon resonance), 바이오칩(DNA, RNA), 전기영동법, PCR 및 RT-PCR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 류머티스성 관절염 진단의 정보를 제공하기 위한 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편의 검출 방법.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 2차 항체 접합체의 표지체는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 및 색소(dye)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 류머티스성 관절염 진단의 정보를 제공하기 위한 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편의 검출 방법.
  10. 제 5항에 있어서, 상기 발색 기질 용액은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], 및 OPD(o-phenylenediamine)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 류머티스성 관절염 진단의 정보를 제공하기 위한 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편의 검출 방법.
  11. 제 5항에 있어서, 상기 4)단계에서 생물학적 시료 내 ＣＤ93 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 ＣＤ93 가용성 단편의 발현 수준이 대조군보다 높으면 류머티스성 관절염을 갖는 것으로 진단하거나 류머티스성 관절염의 가능성을 가질 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는 류머티스성 관절염 진단의 정보를 제공하기 위한 ＣＤ93 또는 이의 가용성 단편의 검출 방법.
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