CN110016482A - Ldlr突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用 - Google Patents

Ldlr突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种LDLR突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用，涉及治疗血脂异常药物技术领域。制备方法为将肝细胞接种在含有胎牛血清的培养基中，将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染肝细胞；突变体为低密度脂蛋白受体基因氧连接糖链结构域单碱基突变导致的终止突变；转染后，更换无血清培养基继续培养，再收集上清液；将所述上清液进行离心，去除漂浮活细胞，即得到含有外泌体的上清液；再进行分离纯化，得到过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。本发明所述外泌体为内源细胞产生的天然载体，以外泌体作为转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强以及能跨越血脑屏障等独特优势。

Description

LDLR突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用
技术领域
本发明涉及治疗血脂异常药物技术领域，具体涉及一种过表达LDLR突变体的细胞外泌体及制备与应用，尤其是过表达人类低密度脂蛋白受体基因突变体(mutant low-density lipoprotein receptor,mLDLR)的细胞外泌体及其制备方法和用于制备治疗血脂异常药物的应用。
背景技术
血脂异常主要包括总胆固醇(Tch)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)升高和/或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低。纯合子家族性高胆固醇血症(HomozygousFamilial Hypercholesterolemia,HoFH)是一类引起血脂异常的单基因病，HoFH患者低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)表达降低，血清Tch与LDL-C水平显著升高，并导致动脉粥样硬化和心脑血管疾病。除单基因突变导致的血脂异常外，由于环境和生活方式的变化，2015年《中国居民营养与慢性病调查报告》显示2012年中国成人血脂异常患病率为40.40％，呈现为国民血脂异常的普遍暴露状态。
血脂异常，特别是LDL-C或Tch升高是动脉粥样硬化性心血管疾病(导致全球致残致死的首要病因，包括冠心病、脑卒中和外周动脉疾病等)的重要危险因素。人群血清胆固醇水平升高将导致我国心血管病事件增加约920万(2010年～2030年)；而LDL-C水平每降低1mmol/L，全因病死率可下降19％，冠状动脉事件下降23％，心脏事件下降21％，降低LDL-C水平可稳定、延缓或消退动脉粥样硬化病变，并显著减少这些致死致残性疾病的发生率。因此，降低LDL-C水平是防控动脉粥样硬化性心血管病危险的首要干预靶点，发现并精准调控LDL-C水平的新型药物对维护人类健康具有重大意义。
LDLR基因位于第19号染色体短臂(Chl9p13.1.13.3)，全长45kb，由18个外显子和17个内含子组成，编码含有839个氨基酸的前体蛋白。LDLR基因外显子区域可与LDLR蛋白7个结构域相对应：(1)启动子翻译信号区域；(2)外显子l编码的5’端序列及信号肽；(3)外显子2-6编码LDLR配体结合域；(4)外显子7-14编码EGF前体结构域；(5)外显子15编码LDLR氧连接糖链结构域；(6)外显子16和17编码跨膜结构域；(7)外显子17和18编码的胞浆区。
细胞内新合成的LDLR前体由860个氨基酸残基组成，分子量120KDa，在由内质网向尔基体转运中，切去由21个氨基酸残基组成的信号肤，加上18个氧连接和2个氮连接的寡糖链，成熟LDLR分子量160KDa，于合成后约45分钟时到达细胞表面，并丛集于由细胞内陷形成的特殊有被小窝(coatediPt)内。
外泌体是由细胞主动向细胞外分泌的双层囊泡小体，可携带多种蛋白质、核酸和脂质等在体液中循环，具有物质“运输载体”的作用，能够将内含物质运输到周围细胞中进行细胞间的物质运输和信息交流，从而参与多种生理及病理学过程。以外泌体作为转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好、靶向性强、并能跨越血脑屏障等独特优势。因此，以外泌体为载体，针对病因进行精准靶向治疗具有广阔的应用前景。
专利ZL201711044797.5(LDLR基因突变体及其应用)中，公开了包含LDLR突变体的重组腺病毒注射LDLR-/-小鼠，可显著降低小鼠的血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，能够有效地用于筛选治疗高胆固醇血症的药物。但是，以腺病毒为载体的基因治疗具有一定的免疫源性，其感染靶细胞后，仍有少量病毒蛋白表达，从而作为异己抗原引发机体对腺病毒载体的特异性免疫反应。此外，腺病毒基因组不能整合到宿主细胞基因组上，外源基因易随着细胞分裂或死亡而消失，不能持续表达。
发明内容
本发明解决了现有技术中以腺病毒为载体进行治疗时产生的免疫原性治疗以及基因表达持续时间较短的问题，提供了一种过表达LDLR突变体的外泌体及制备与应用。
按照本发明的第一方面，提供了一种过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，含有以下步骤：
(1)将肝细胞接种在含有胎牛血清的培养基中培养，将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体腺病毒转染所述肝细胞；所述突变体为低密度脂蛋白受体基因氧连接糖链结构域单碱基突变导致的终止突变；
(2)待步骤(1)所述转染6h-8h后，更换无血清培养基继续培养48h-72h，再收集上清液；将所述上清液进行离心，去除漂浮活细胞，即得到含有外泌体的上清液；
(3)将步骤(2)得到的含有外泌体的上清液进行分离纯化，得到过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。
优选地，所述低密度脂蛋白受体基因突变体与SEQ ID NO:1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.G2146T、c.C2164T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。
优选地，所述外泌体与SEQ ID NO:2相比，具有选自下列的突变：p.D716X、p.Q722X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X或p.E763X。
优选地，步骤(1)所述培养的时间为18h-24h，步骤(1)中待所述肝细胞生长至汇合率为30％-50％时，再将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染所述肝细胞。
优选地，步骤(1)所述肝细胞为HepG2细胞系。
按照本发明的另一方面，提供了所述方法制备得到的过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。
优选地，所述过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体为囊泡状，直径为30nm-200nm。
按照本发明的另一方面，提供了所述过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体用于制备预防或治疗血脂异常药物中的应用。
优选地，所述血脂异常为高脂血症。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)LDLR基因突变体(简称mLDLR)可表达生成LDLR突变蛋白，具有如下氨基酸序列，与SEQ ID NO:2相比，所述分离的多肽具有选自下列的至少一种突变：p.D716X、p.Q722X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X以及p.E763X。这些突变蛋白可以外泌体的形式分泌到细胞外，进入血液循环后结合LDL-C，通过内吞进入肝细胞并分解LDL-C，从而达到降低血LDL-C水平、治疗血脂异常的效果。
(2)本发明优选地提供了一种过表达mLDLR蛋白的HepG2细胞外泌体，能够靶向肝脏部位，能够有效降低血液中LDL-C水平，发挥治疗血脂异常的作用。
(3)外泌体是由细胞主动向外分泌的双层囊泡小体，可携带多种蛋白质、核酸和脂质等在体液中循环，具有物质“运输载体”的作用，能够将内含物质运输到周围细胞中进行细胞间的物质运输和信息交流，从而参与多种生理及病理学过程。本发明中外泌体在肝细胞中产生，因其为内源细胞产生的天然载体，可以与免疫系统有很好的生物适应性，应用于体内时，不易引起毒性与免疫反应。外泌体有自身天然的内含物，可以转移至受体细胞并功能性改变受体细胞，且不同来源的外泌体表面分子不一样，对受体细胞有一定选择性，在治疗上更有利。本发明所述外泌体为内源细胞产生的天然载体，以外泌体作为转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强以及能跨越血脑屏障等独特优势。
(4)本发明中LDLR基因氧连接糖链结构域单基因突变导致的终止突变的突变体，相对于SEQ ID NO:1相比，具有选自下列的至少一种突变c.G2146T、c.G2164T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T，这些突变的位点均位于氧链接糖结构域中的第15号外显子，因此这些突变对应氨基酸为相对于SEQ ID NO:2相比，具有下列的突变p.E716X、p.Q722X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X或p.E763X，这些突变产生的截短蛋白中，包含有完整的配体结合域，表皮生长因子前体结构域，仅仅存在多肽长度上的差异。所以，产生的截短蛋白具有结合血液中低密度脂蛋白胆固醇LDL-C的能力，进而清除血液中的LDL-C。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的腺病毒转染LDLR-/-肝原代细胞和Dil-LDL摄取的荧光照片(400倍)；其中图1(a)为过表达mLDLR腺病毒GFP荧光图；图1(b)为过表达mLDLR腺病毒Dil-LDL摄取图；图1(c)为图1(a)与图1(b)合并图；图1(d)为对照GFP腺病毒GFP荧光图；图1(e)为对照GFP腺病毒Dil-LDL摄取图；图1(f)为图1(d)与图1(e)合并图。
图2(a)和图2(b)分别为本发明实施例2提供的过表达mLDLR的HepG2细胞外泌体透射电镜检测和粒径检测图。
图3为本发明实施例2提供的过表达mLDLR的HepG2细胞外泌体及对照空载腺病毒转染的外泌体其表面LDLR突变蛋白和分子标记的表达。
图4为本发明实施例3提供的配体-受体结合实验图；其中图4(a)为抗体LDLRwestern blot图；图4(b)为抗体APOB western blot图。
图5为本发明实施例4提供的过表达mLDLR的HepG2细胞外泌体结合LDL-C及其网格蛋白介导的内吞图；其中图5(a)为mLDLR与LDL-C内吞western blot图；图5(b)为LDL-C内吞western blot的统计分析图；图5(c)为mLDLR内吞western blot的统计分析图。
图6为本发明实施例5提供的过表达mLDLR的HepG2细胞外泌体经尾静脉注射LDLR-/-基因敲除小鼠后血LDL-C水平变化图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：LDLR突变蛋白促进LDL的摄取
将长势良好的LDLR-/-小鼠的肝原代细胞接种在细胞培养皿中，在含有胎牛血清的培养基培养18-24小时，待LDLR-/-小鼠肝原代细胞生长融合至30～50％时，将过表达mLDLR腺病毒及GFP对照腺病毒转染LDLR-/-小鼠肝原代细胞。转染6h后，更换新鲜DMEM培养基继续培养48h。加入30mg/ml的红色荧光探针标记的Dil-LDL，培养箱中避光孵育4-5h。共聚焦显微镜观察细胞内Dil-LDL的摄取。
图1为本发明实施例1提供的腺病毒转染LDLR-/-肝原代细胞和Dil-LDL摄取的荧光照片(400倍)；其中图1(a)为过表达mLDLR腺病毒GFP荧光图；图1(b)为过表达mLDLR腺病毒Dil-LDL摄取图；图1(c)为图1(a)与图1(b)合并图；图1(d)为对照GFP腺病毒GFP荧光图；图1(e)为对照GFP腺病毒Dil-LDL摄取图；图1(f)为图1(d)与图1(e)合并图。由图1(b)可知，过表达mLDLR的肝原代细胞中，有红色荧光。由图1(e)可知，而过表达GFP的肝原代细胞中基本没有红色荧光。由此可知，与GFP对照腺病毒相比，mLDLR过表达腺病毒促进Dil-LDL的摄取。
实施例2：过表达LDLR基因突变体的外泌体的获得
(1)将HepG2细胞接种至含10％胎牛血清的DMEM培养基中进行培养。
(2)待HepG2细胞生长融合至30～50％时，将mLDLR过表达腺病毒转染HepG2细胞。本步骤中的mLDLR为相对于SEQ ID NO:1，发生的c.G2164T的终止突变。
(3)mLDLR过表达腺病毒转染HepG2细胞6h后，更换无血清DMEM培养基继续培养，48h后收集上清，离心去除漂浮活细胞，收集含外泌体细胞的上清液体。
(4)采用超速离心法对所述步骤(3)收集的含外泌体细胞上清液体进行分离纯化，收获过表达mLDLR的HepG2细胞外泌体。
步骤(2)中所述的mLDLR过表达腺病毒可通过现有技术中的方法制备得到，例如可参照公开号为CN 107699568B的发明专利中的方法。
步骤(4)中所述分离纯化含有以下步骤：
(1)将含有外泌体细胞的上清液加入到干净离心管中，300xg，4℃离心10min；
(2)吸取上清到一个新的离心管中，不要触碰到沉淀，将上清放于离心机中，2,000xg，4℃离心10min；
(3)吸取上清到一个新的离心管中，不要触碰到沉淀，将上清放于离心机中，10,000xg，4℃离心30min；
(4)吸取上清到一个新的离心管中，不要触碰到沉淀，将上清放于离心机中，100,000xg，4℃离心70min；
(5)去除上清，保留沉淀，沉淀中含有外泌体和部分杂蛋白，加入1xPBS重悬；
(6)重悬液100,000xg，4℃离心70min，去除上清，保留沉淀，沉淀可使用1xPBS重悬或直接保留备用。
透射电镜观察外泌体形态。图2(a)为过表达mLDLR的HepG2细胞外泌体的囊泡状结构(标尺为100nm)。图2(b)为粒径检测图，过表达mLDLR的HepG2细胞外泌体直径约为180nm。
Westernblot检测过表达mLDLR的HepG2细胞外泌体和对照外泌体的表面标记蛋白。如图3所示，过表达mLDLR的HepG2细胞外泌体和对照外泌体的标记CD9，CD63，TSG101均呈阳性表达；同时，过表达mLDLR的HepG2细胞外泌体中LDLR突变蛋白表达量显著升高，证明HepG2细胞外泌体可携带LDLR突变蛋白分泌到细胞外。
实施例3：LDLR突变蛋白结合LDL
将硝酸纤维素膜置于干净滤纸上，分别用实施例2得到的含有过表达mLDLR及GFP对照腺病毒外泌体的细胞上清液体点样于硝酸纤维素膜，带样本被硝酸纤维素膜吸收后，用25ug/ml的LDL溶液孵育硝酸纤维素膜2h后进行Western blot，LDLR显影结果显示样本成功附着于硝酸纤维素膜，如图4(a)所示；APOB显影结果亦显示LDLR突变蛋白具有结合LDL的能力，如图4(b)所示。
实施例4：LDLR突变蛋白结合LDL并内吞进入肝细胞
盐酸氯丙嗪(CPZ)是常用的内吞网格蛋白抑制剂。我们采用不同浓度的CPZ预处理LDLR-/-肝原代细胞1h，同时将含有过表达mLDLR外泌体的上清液体与LDL在反转摇床上孵育2h，以使LDL与上清液体中LDLR突变蛋白充分结合，将混合均匀的含外泌体上清液体孵育经CPZ处理过的LDLR-/-肝原代细胞，1h后收集细胞，western blot检测细胞内LDLR突变蛋白及LDL含量。其中图5(a)为mLDLR与LDL-C内吞western blot图；图5(b)为LDL-C内吞western blot的统计分析图；图5(c)为mLDLR内吞western blot的统计分析图。由此可知，随着CPZ浓度的上升，细胞吞入的LDLR突变蛋白及LDL含量降低。综合上述研究结果，提示LDLR突变蛋白能够结合LDL，并以网格蛋白介导的内吞进入肝细胞。
实施例5：小鼠体内注射细胞外泌体
含有实施例2得到的过表达mLDLR外泌体的细胞上清液，经尾静脉注射LDLR-/-基因敲除小鼠，每次200ul，每两天注射一次，14天后全自动生化分析仪检测小鼠血LDL-C水平。结果显示，与过表达对照GFP的细胞上清液相比，含有过表达mLDLR外泌体的上清液体可有效降低LDLR-/-基因敲除小鼠血LDL-C水平，由1.88mmol/L降低至1.73mmol/L，降低8％(图6)。
本实施例中，我们验证了LDLR基因的突变体c.C2164T(p.Q722X)终止突变产生的突变蛋白的生物学功能。由于终止突变导致的截短蛋白虽然不能正确的锚定在细胞膜上，因其配体结合域，表皮生长因子前体结构域结构完整，产生的截短蛋白仍然具有结合血液中低密度脂蛋白胆固醇LDL-C的能力，进而清除血液中的LDL-C。LDLR基因氧连接糖链结构域单基因突变导致的终止突变的其他突变体c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T(对应氨基酸p.E716X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X以及p.E763X)，与c.C2164T一致，均位于氧链接糖结构域中的第15号外显子，因此这些突变对应的p.E716X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X以及p.E763X产生的截短蛋白中，包含有完整的配体结合域，表皮生长因子前体结构域，与p.Q722X截短蛋白相比，其他位点产生的截短蛋白仅存在多肽长度上的差异。所以，其他位点产生的截短蛋白具有与p.Q722X截短蛋白相同的生物学功能。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 华中科技大学
<120> LDLR突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2583
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 1
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gagttccact gcctaagtgg cgagtgcatc cactccagct ggcgctgtga tggtggcccc 660
gactgcaagg acaaatctga cgaggaaaac tgcgctgtgg ccacctgtcg ccctgacgaa 720
ttccagtgct ctgatggaaa ctgcatccat ggcagccggc agtgtgaccg ggaatatgac 780
tgcaaggaca tgagcgatga agttggctgc gttaatgtga cactctgcga gggacccaac 840
aagttcaagt gtcacagcgg cgaatgcatc accctggaca aagtctgcaa catggctaga 900
gactgccggg actggtcaga tgaacccatc aaagagtgcg ggaccaacga atgcttggac 960
aacaacggcg gctgttccca cgtctgcaat gaccttaaga tcggctacga gtgcctgtgc 1020
cccgacggct tccagctggt ggcccagcga agatgcgaag atatcgatga gtgtcaggat 1080
cccgacacct gcagccagct ctgcgtgaac ctggagggtg gctacaagtg ccagtgtgag 1140
gaaggcttcc agctggaccc ccacacgaag gcctgcaagg ctgtgggctc catcgcctac 1200
ctcttcttca ccaaccggca cgaggtcagg aagatgacgc tggaccggag cgagtacacc 1260
agcctcatcc ccaacctgag gaacgtggtc gctctggaca cggaggtggc cagcaataga 1320
atctactggt ctgacctgtc ccagagaatg atctgcagca cccagcttga cagagcccac 1380
ggcgtctctt cctatgacac cgtcatcagc agagacatcc aggcccccga cgggctggct 1440
gtggactgga tccacagcaa catctactgg accgactctg tcctgggcac tgtctctgtt 1500
gcggatacca agggcgtgaa gaggaaaacg ttattcaggg agaacggctc caagccaagg 1560
gccatcgtgg tggatcctgt tcatggcttc atgtactgga ctgactgggg aactcccgcc 1620
aagatcaaga aagggggcct gaatggtgtg gacatctact cgctggtgac tgaaaacatt 1680
cagtggccca atggcatcac cctagatctc ctcagtggcc gcctctactg ggttgactcc 1740
aaacttcact ccatctcaag catcgatgtc aacgggggca accggaagac catcttggag 1800
gatgaaaaga ggctggccca ccccttctcc ttggccgtct ttgaggacaa agtattttgg 1860
acagatatca tcaacgaagc cattttcagt gccaaccgcc tcacaggttc cgatgtcaac 1920
ttgttggctg aaaacctact gtccccagag gatatggttc tcttccacaa cctcacccag 1980
ccaagaggag tgaactggtg tgagaggacc accctgagca atggcggctg ccagtatctg 2040
tgcctccctg ccccgcagat caacccccac tcgcccaagt ttacctgcgc ctgcccggac 2100
ggcatgctgc tggccaggga catgaggagc tgcctcacag aggctgaggc tgcagtggcc 2160
acccaggaga catccaccgt caggctaaag gtcagctcca cagccgtaag gacacagcac 2220
acaaccaccc gacctgttcc cgacacctcc cggctgcctg gggccacccc tgggctcacc 2280
acggtggaga tagtgacaat gtctcaccaa gctctgggcg acgttgctgg cagaggaaat 2340
gagaagaagc ccagtagcgt gagggctctg tccattgtcc tccccatcgt gctcctcgtc 2400
ttcctttgcc tgggggtctt ccttctatgg aagaactggc ggcttaagaa catcaacagc 2460
atcaactttg acaaccccgt ctatcagaag accacagagg atgaggtcca catttgccac 2520
aaccaggacg gctacagcta cccctcgaga cagatggtca gtctggagga tgacgtggcg 2580
tga 2583
<210> 2
<211> 860
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 2
Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe
20 25 30
Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly
35 40 45
Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu
50 55 60
Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn
65 70 75 80
Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp
85 90 95
Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp
100 105 110
Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys
115 120 125
Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro
130 135 140
Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys
145 150 155 160
Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly
165 170 175
Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly
180 185 190
Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp
210 215 220
Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu
225 230 235 240
Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp
245 250 255
Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn
260 265 270
Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu
275 280 285
Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp
290 295 300
Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp
305 310 315 320
Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr
325 330 335
Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys
340 345 350
Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys
355 360 365
Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln
370 375 380
Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr
385 390 395 400
Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg
405 410 415
Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu
420 425 430
Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln
435 440 445
Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser
450 455 460
Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala
465 470 475 480
Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly
485 490 495
Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe
500 505 510
Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His
515 520 525
Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile
545 550 555 560
Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr
565 570 575
Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly
580 585 590
Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro
595 600 605
Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile
610 615 620
Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn
625 630 635 640
Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His
645 650 655
Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu
660 665 670
Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn
675 680 685
Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu
690 695 700
Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala
705 710 715 720
Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val
725 730 735
Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu
740 745 750
Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser
755 760 765
His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro
770 775 780
Ser Ser Val Arg Ala Leu Ser Ile Val Leu Pro Ile Val Leu Leu Val
785 790 795 800
Phe Leu Cys Leu Gly Val Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Arg Leu Lys
805 810 815
Asn Ile Asn Ser Ile Asn Phe Asp Asn Pro Val Tyr Gln Lys Thr Thr
820 825 830
Glu Asp Glu Val His Ile Cys His Asn Gln Asp Gly Tyr Ser Tyr Pro
835 840 845
Ser Arg Gln Met Val Ser Leu Glu Asp Asp Val Ala
850 855 860

Claims (9)

1.一种过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，含有以下步骤：
(1)将肝细胞接种在含有胎牛血清的培养基中培养，将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染所述肝细胞；所述突变体为低密度脂蛋白受体基因氧连接糖链结构域单碱基突变导致的终止突变；
(2)待步骤(1)所述转染6h-8h后，更换无血清培养基继续培养48h-72h，再收集上清液；将所述上清液进行离心，去除漂浮活细胞，即得到含有外泌体的上清液；
(3)将步骤(2)得到的含有外泌体的上清液进行分离纯化，得到过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。
2.如权利要求1所述的过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述低密度脂蛋白受体基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.G2146T、c.C2164T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。
3.如权利要求1所述的过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述外泌体与SEQ ID NO:2相比，具有选自下列的突变：p.D716X、p.Q722X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X或p.E763X。
4.如权利要求1所述的过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述培养的时间为18h-24h，步骤(1)中待所述肝细胞生长至汇合率为30％-50％时，再将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染所述肝细胞。
5.如权利要求1所述的过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述肝细胞为HepG2细胞系。
6.权利要求1-5任一所述方法制备得到的过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。
7.如权利要求6所述的过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体，其特征在于，所述过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体为囊泡状，直径为30nm-200nm。
8.权利要求6所述过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体用于制备预防或治疗血脂异常药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述血脂异常为高脂血症。
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