WO2000064938A2 - Von interleukin 12 abgeleitete peptid-homodimere und peptid-heterodimere - Google Patents

Von interleukin 12 abgeleitete peptid-homodimere und peptid-heterodimere Download PDF

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WO2000064938A2
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Definitions

  • the present invention relates to homodimers or heterodimers from peptide monomers which have the amino acid sequence KHYSCTAEDID (Monomer I), PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II), AALQNHNHQQIILDK (Monomer III), IRDIIKPDPPKN (Monomer IV), SLTFCRQQDOMWLLT or RFTTCVQDWLGLT (RFTQVDQWWLL) or SLTFCRQQDQWLGT (RFTQVDQWL) Variants thereof, the homodimers or heterodimers binding to the interleukin 12 (IL12) receptor and possibly being able to trigger a cellular signal.
  • the present invention also relates to medicaments containing these homodimers or heterodimers.
  • the present invention further relates to diagnostic compositions or diagnostic methods in which the homodimers or heterodimers according to the invention or antibodies directed against them are used.
  • cytokines are endogenous messenger substances that are synthesized by different cells and then secreted.
  • the biological tasks of these cytokines are very diverse, but so far only partially understood. In any case, cytokines mainly have fundamental immunoregulatory effects.
  • IL12 interleukin 12
  • IL12 is mainly produced in vivo by B cells, less by T cells (D'Andrea et al., J.Exp.Med. 176 (1992), 1387-1398) and has a variety of biological effects. The following effects are particularly noteworthy, since they play an important role in the therapeutic effect: stimulation of the proliferation of human lymphoblasts (Gateley et al., J. Immunol. 147 (1991), 874), Akti- crossing of NK cells (Manetti et al., J.Exp.Med. 177 (1999), 1199) and induction of the synthesis of IFN-gamma, IL2 and TNF (Chan et al., J.Exp.Med. 173 ( 1991), 869).
  • the dose of IL2 in the presence of IL12 can be drastically reduced in the case of adoptive immunotherapy for the generation of lymphokine-activated killer cells, so that the serious side effects of IL2 can be significantly reduced.
  • IL12 is a heterodimer consisting of a p40 and p35 chain (Stern et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 6808).
  • p40 has certain homologies to the extracellular domain of the IL6 receptor (Gearing and Cosman, Cell ⁇ (1991), 9), while p35 appears to be a homologue of IL6 (Mersberg et al., Im unol. Today .13 (1992 ), 77).
  • the p35 chain is apparently responsible for signaling at the IL12 receptor, while the p40 subunit is likely to determine species specificity.
  • the IL12 subunits also have certain short domains that interact with the receptor.
  • the administration of a short IL12 domain that interacts with the receptor could possibly be sufficient to achieve the desired cellular effects (e.g. immunostimulatory effect).
  • IL12 for example with synthesized peptides, which could provide information about suitable IL12 domains.
  • cytokines are generally only present in extremely low concentrations in the serum, it is not possible to isolate therapeutically usable amounts from this medium. Therefore, the therapeutically used cytokines have been recombinantly used in Bacteria or yeast. However, this procedure has a number of serious disadvantages.
  • cytokines require a lot of effort in the "set-up". For example, it must be clarified whether the host cell expresses the protein exactly or in the exact native conformation, which is the best host cell or the best expression vector and under which conditions the protein is not proteolytically degraded. It should be noted here that generally recombinantly produced proteins are from the native protein. have a different tertiary structure and are therefore recognized as "foreign" by the human immune system. The antibodies induced thereby neutralize the protein, for example the cytokine, and thus lead to a loss of its effectiveness.
  • cytokines normally have to be administered in a regular sequence during therapy, it must be ensured that they are absolutely free of contamination, i.e. especially components of the host cell. As a result, complex procedures must be used that have an unfavorable effect on pricing.
  • messenger substances e.g. cytokines
  • cytokines messenger substances not only have a binding site for the receptor, but that other - currently. yet domains that are not fully understood may exist that may induce signaling pathways other than those that are intended.
  • this could explain the frequently occurring side effects of the cytokines used to date, which in some cases make treatment with these impossible.
  • the invention is essentially based on the technical problem of providing compounds with a biological activity of interleukin 12 (IL12) in such a way that the previous disadvantages of the prior art are avoided, i.e. when administered as a medicinal product, fewer side effects, a longer half-life and high biological activity are obtained.
  • IL12 interleukin 12
  • One embodiment of the present invention relates to a synthetic homodimer or heterodimer composed of peptide monomers which have the amino acid sequence KHYSCTAEDID (Monomer I), PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II), AALQNHNHQQIILDK (Monomer III), IRDIIKPDPPKN (Monomer IV), VGTLKTQMDQTLKTQVQQWLTLKTQQQQQWLLKTQVQQQQWLLKTQVQQQQWLLKLQQQQWLQWLKVQQQQQWLQWLQWLQWLVLQVLQWLQWLQWLQWLQWLQWLKVLQLQLQLQQQQQQQQWLQKVQQQQVLQKVLQKVQQQQVLQKVLQKVQQQQVLQKVLQKVQQQQVLQKVLQKVLQKVLQK
  • peptides according to the invention represent the binding regions of the IL12 subunits p40 and p35 and take advantage of the knowledge that the peptides from p35 and p40 must be used in a dimerized form for a biological effect, since the receptors must also lie together twice in order to Triggering the intracellular signals to be able to.
  • Monomers I-III comprise 3 loops which are located at the point of contact of p35 with the interleukin 12 receptor, while analogously the monomers IV-VI represent the contact points for p40 with the receptor.
  • the dimers according to the invention have the following advantages: They are easy to use using standardized methods synthesize and purify them and they can be used immediately for the necessary tests (e.g.
  • peptides represent the minimal structures of the respective cytokine that are required for its biological effectiveness. This ensures the highest specificity and high biological activity combined with the least side effects. Due to the small size of the peptides, they can be microcapsulated, which results in depot forms with different duration of action - depending on the pore size of the capsules. The depot form can be applied locally, so that the highest concentration of the active ingredient is guaranteed over a long period of time at the desired location (eg cancer focus).
  • all combinations of the monomers I - VI with one another are capable of forming dimers, and the dimers formed achieve the object.
  • the peptides according to the invention are usually synthesized by known solid-phase synthesis processes, for example as described in Example 1 below.
  • the biological activity (binding to the receptor, triggering a cellular signal and proliferation-stimulating effect) is investigated by methods known to the person skilled in the art, e.g. according to Lewis, J. Immuno1. Methods 185 (1995), 9-17; Grander et al., Eur. J. Cancer 28A (1992), 815-818 or, for example, also according to the methods described in the examples below.
  • the peptides described above are homodimers or heterodimers in which the monomers are linked via their C-terminus or N-termini or the N-terminus of one monomer is linked to the C-terminus of the other monomer is linked.
  • the C-terminus of monomer I is linked to the N- or C-terminus of monomer II, or the N-terminus of monomer I is linked to the N- or C-terminus of monomer II.
  • the desired N-terminal peptide in a side-function-protected form is activated after removal of the protective group (preferably Fmoc) by treatment with, for example, piperidine with a crosslinker, and the product is purified by HPLC.
  • the protective group preferably Fmoc
  • Another previously synthesized monomer is also provided (either at the C- or N-terminus - depending on the desired dimer) in its enfunction-protected form with a group which only reacts with the N-terminal group of the bound peptide.
  • the dimers which differ significantly from the monomers in terms of elution behavior, are purified and isolated after removal of the side protecting groups by standard methods using reverse phase HPLC. If the amino acid addition permits, the activation groups and crosslinkers can also be selected in such a way that dimerization of free monomers can be carried out directly in solution after removal of the side chain protective groups.
  • the synthesis strategy can be carried out on the HYCHRON anchor as described in the example, so that the side chain protective groups are retained and dimerization can be carried out in aqueous solution.
  • This linkage can be carried out, for example, using the method described in the examples below or other standard methods, it being necessary to ensure that the dimerization takes place in such a way that binding to the receptor pair is still possible effectively.
  • the dimerization can be carried out on a lysine residue as a branch point (Wrighton et al., Nature Biotechnology 15 (1997), 1261-1265).
  • the homomers of the dimers according to the invention are preferably covalently linked to one another via linkers, such as polyethylene glycol, peptide (s), activated benzodiazepines, oxazolones, azalactones, amine imides, diketopiperazines, or (a) monosaccharide (s).
  • the present invention also relates to homodimers or heterodimers which are characterized in that the monomers have deletions, additions or substitutions of one or more amino acids and / or (a) modified amino acid (s) with respect to the corresponding starting monomers I to VI. Homo- or heterodimers are obtained, which (a) compared to the original. Can bind forms similar or better to the IL12 receptor and / or can trigger a cellular signal, or (b) can still bind to the IL12 receptor, but have an antagonistic effect, ie after administration, the biologically active form becomes this form, the no longer leads to the triggering of a cellular signal after binding to the receptor.
  • Natural amino acids are preferably introduced in the case of the amino acid substitutions or additions, with modified amino acids not being excluded.
  • the preferred modifications include glycosylations with mono- or disaccharides of serine, threonine and asparagine, farnesylation and palmitoylation of cysteine, phosphorylation of threonine, serine and tyrosine, the modifications which affect the central amino acids mostly leading to antagonistic forms.
  • the deletions, additions, substitutions and / or modifications relate to at most 10, preferably at most 7, more preferably at most 3 and most preferably at most 1 amino acid (s) per monomer.
  • the inventive, from modified monomers Existing homo- or heterodimers contain, in addition to the domain responsible for receptor binding, no other domains which are characteristic of the natural cytokine.
  • the dimer according to the invention or consisting of modified monomers is preferably the following homodimers: [AALQNHNHQQIILDK] 2 or [AALQNHNKQQIILDK] 2 , which even have a significantly higher specific activity than IL12. Both monomers are linked to both CC and CN.
  • the homodimers or heterodimers according to the invention can be present as such, but can also be linked to other further compounds, for example (poly) peptides.
  • These (poly) peptides include, for example, carrier proteins, e.g. Transferin or albumin, which the body does not recognize as foreign.
  • the homodimers or heterodimers according to the invention can also be fused with other (poly) peptides, for example a leader peptide which enables or supports the penetration of the peptide according to the invention into the cell.
  • a leader peptide is Penetrin from Drosophila.
  • the present invention relates to the above homodimers or heterodimers, which are further characterized in that one or more amino acids are covalently modified by fatty acids, mono- and / or oligosaccharides.
  • one or more amino acids are covalently modified by fatty acids, mono- and / or oligosaccharides.
  • This can be done by generally known methods, for example during the synthesis of the monomers through the use of amino acids which already carry the above modifications.
  • the modifications can also be made retrospectively. These modifications can, for example, achieve a higher resistance to proteolytic degradation and thus an even longer biological half-life.
  • the present invention further relates to an antibody or a fragment thereof against the dimers according to the invention described above.
  • These antibodies can also be used in diagnostic assays, for example.
  • These antibodies can be monoclonal, polyclonal or synthetic antibodies or fragments thereof.
  • fragment means all parts of the monoclonal antibody (for example Fab, Fv or "single chain Fv" fragments) which have the same epitope specificity as the complete antibody. The production of such fragments is known to the person skilled in the art.
  • the antibodies according to the invention are preferably monoclonal antibodies.
  • the antibodies according to the invention can be produced according to standard methods, the homodimers or heterodimers according to the invention serving as antigen. Methods for obtaining monoclonal antibodies are known to the person skilled in the art.
  • the monoclonal antibody according to the invention is an antibody derived from an animal (for example a mouse), a humanized antibody or a chimeric antibody or a fragment thereof.
  • Chimeric, human antibody-like or humanized antibodies have a reduced potential antigenicity, but their affinity for the target is not reduced.
  • the production of chimeras and humanized antibodies or of antibodies similar to human antibodies has been described in detail (see, for example, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, and Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534).
  • Humanized immunoglobulins have variable scaffold areas, which essentially come from a human immunoglobulin (called acceptor immunoglobulin) and the complementarity of the determining areas, which essentially come from a non-human immunoglobulin (e.g. from the mouse) (called donor) Immunoglobulin).
  • acceptor immunoglobulin human immunoglobulin
  • donor non-human immunoglobulin
  • humanized (as well as human) antibodies offer a number of advantages over antibodies from mice or other species: (a) the human immune system should not recognize the framework or constant region of the humanized antibody as foreign, and therefore should Antibody response against one injected antibodies are lower than against a completely foreign mouse antibody or a partially foreign chimeric antibody; (b) since the effector area of the humanized antibody is human, it interacts better with other parts of the human immune system, and (c) injected humanized antibodies have a half-life that is substantially equivalent to that of naturally occurring human antibodies, which allows to administer smaller and less frequent doses compared to antibodies from other species.
  • the present invention also relates to a hybridoma that produces the monoclonal antibody described above.
  • the present invention relates to the medicaments containing homodimers or heterodimers according to the invention and their use for the treatment of diseases of the immune system, of diseases which are associated with decreased cell proliferation, or of infectious or inflammatory processes (for example HIV, leishmaniasis): Mountford et al., J. Immuol. 156 (996), pp. 4739-4745). Certain modified forms of the dimers according to the invention can also have an antagonistic effect.
  • the present invention thus also relates to the medicaments containing the homodimers or heterodimers according to the invention and their use for the treatment of diseases which are associated with increased cell proliferation, e.g.
  • the present invention also relates to medicaments containing the dimers according to the invention and their use for reducing the IL2 side effects in the case of therapy with IL2, for example immunotherapy.
  • the medicament according to the invention is optionally in combination with a suitable pharmaceutical carrier.
  • suitable carriers and the formulation of such drugs are known to the person skilled in the art.
  • Suitable carriers include, for example, phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions, etc.
  • the medicament according to the invention can be in the form of a solution for injection, tablet, ointment, suspension, emulsion, suppository, etc. It can also be administered in the form of depots (microcapsules, zinc salts, liposomes, etc.).
  • the mode of administration of the drug depends, among other things, on the form in which the active ingredient is present, and can be administered orally or parenterally.
  • Methods for parenteral administration include topical, intra-arterial (e.g. directly to a tumor), intramuscular, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, transdermal or transmucosal (nasal, vaginal, rectal, sublingual) administration.
  • the appropriate dosage is determined by the attending physician and depends on various factors, for example the age, gender, weight of the patient, the type and stage of the disease, the type of administration, etc.
  • the present invention relates to a diagnostic composition which contains the homodimer or heterodimer according to the invention or the antibody according to the invention and can be used to diagnose diseases which are associated with an altered or too high or too low expressed IL12 receptor or with a too high or low concentration of IL12.
  • the homodimers or heterodimers according to the invention can be present in generally customary assay formats for diagnostic detection.
  • This detection includes, for example, (a) obtaining a cell sample from the patient, (b) contacting the cell sample thus obtained with the homo- or. Heterodimer or antibody as a probe under conditions that allow specific binding to the target and (c) detection of binding to the target. This detection can be performed using standard techniques known to those skilled in the art.
  • the compounds according to the invention can be bound, for example, in the liquid phase or to a solid support. They will be marked in different ways. Suitable markers and marking methods are known to the person skilled in the art. These are also known cell disruption methods which allow IL12 or the receptor to be brought into specific contact with the antibody or homo- or heterodimer according to the invention.
  • the present invention relates to a diagnostic kit for carrying out the diagnostic method described above, which contains a dimer according to the invention or the antibody according to the invention or the fragment thereof.
  • the dimer or the antibody or the fragment thereof can be immobilized.
  • PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II), AALQNHNHQQIILDK (Monomer III), IRDIIKPDPPKN (Monomer IV).
  • SLTFCVOVOGKSKR (Monomer V) and RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI)
  • the monomers I-VI were prepared according to a standard solid phase synthesis (Seitz et al., Angew. Chem. 107 (1995), 901). The synthesis was carried out on a HYCHRON anchor with an Fmoc-protected amino acid starting from the C-terminus.
  • the carboxyl groups of glutamic acid and aspartic acid were protected in the form of tert-butyl esters.
  • the protecting groups of the side chains of Tyr included tetrahydropyranyl, tert-butyl (Boc) and trityl groups.
  • the complete monomers were synthesized in this order.
  • the finished monomers were separated from the column by a palladium (0) catalyzed allyl transfer, the protecting groups on the side chains being retained.
  • the Fmoc group was then replaced by morpholine, the remaining protective groups were removed by treatment with TFA.
  • the dimerization of the monomers I was carried out by dissolving 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succinimidyl propionate, MW approx. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml of PBS, pH 7.5, after which a triple molar excess of monomers was dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid. After 3 hours of incubation on ice, lyophilized monomers were again added, so that at the end there was a ratio of 3.5 mol of monomer to 1 mol of PEG. The mixture was incubated on ice for an additional 17 hours. PEG was inactivated by adding 1 M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice). The mixture was subjected to both analytical and preparative HPLC (see Example 5).
  • PEG-succinimidyl propionate activated bifunctional polyethylene glycol
  • PBS pH
  • the dimerization of the monomers II was carried out by dissolving 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succinimidyl propionate, MW approx. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml of PBS, pH 7.5, after which a triple molar excess of monomers was dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid. After 3 hours of incubation on ice, lyophilized monomers were again added, so that at the end there was a ratio of 3.5 mol of monomer to 1 mol of PEG. The mixture was incubated on ice for an additional 17 hours. PEG was inactivated by adding 1 M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice). The mixture was subjected to both analytical and preparative HPLC (see Example 5).
  • PEG-succinimidyl propionate activated bifunctional polyethylene glycol
  • PBS pH
  • the monomers were dimerized by dissolving 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succinimidyl propionate, MW approx. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml of PBS, pH 7.5, after which a triple molar excess of monomers, dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid was added. After 3 hours of incubation on ice, lyophilized monomers were again added, so that at the end there was a ratio of 3.5 mol of monomer to 1 mol of PEG. The mixture was incubated on ice for an additional 17 hours. PEG was inactivated by adding 1 M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice). The mixture was subjected to both analytical and preparative HPLC (see Example 5).
  • the monomers were used in a ratio of 1: 1, the separation was carried out using reverse phase HPLC, since the two dimers differ significantly in their elution behavior (depending on the composition, a difference in the elution peak of between 4 and 9 minutes) and can therefore be separated from one another.
  • the formation of the dimers described in the previous examples was checked by analytical reverse phase HPLC.
  • the analysis was performed using a Vydac-C18 protein peptide column (0.46 x 25 cm) (The Separation Group, USA), a BioRad HPLC system and a dual-wavelength detector from Perkin-Elmer.
  • the column was washed with 0.1% TFA in dist. Water equilibrated, and 10 min. after the sample was injected (usually 6 ml), a 45-minute linear gradient (0-100) of acetonitrile was run with 0.1% TFA. The flow rate became continuous at 1 ml / min. held. Under these conditions the cross-linker appeared in the flow.
  • the reaction product eluted after 37 min.
  • the dimer was further purified on a preparative reverse HPLC column (2.2 ⁇ 25 cm) on the same HPLC system. The column was run at a constant flow rate of 8 ml / min. with dist. Water: 80:20 acetonitrile (both contained 0.1% TFA) equilibrated. 20 min. after injection of the sample (6 ml), a 60-minute linear gradient was run on 100% acetonitrile / 0.1% TFA. The main peak was collected and lyophilized.
  • the dimers were iodinated as described below. 20 ul chloramine T (0.5 mg / ml) were added to 20 ul Na 1 5 I (2 mCi, Amersham Buchler, Braunschweig), the mixture was 2 min. later mixed to 50 ⁇ l dimer (5 ⁇ g in PBS) and 15 sec. incubated. To terminate the reaction, 30 ⁇ l sodium metabulfite (1 mg / ml in PBS) and after 30 sec. 50 ⁇ l KI (10 mg / ml in PBS) were added. Gelatin (50 ⁇ l, 1 mg / ml.
  • the stimulated cells (7.5 x 10 5 cells / ml RPMI medium) were incubated for 90 minutes with radiolabelled dimer in various concentrations (0.01 to 1 ng) and then washed by means of 3 centrifugation steps in PBS and the cell-bound radioactivity measured in the liquid scintillation counter. The extent of non-specific binding was determined in the presence of a 100-fold higher concentration of IL12, with labeled homodimer and IL12 being added to the cells at the same time. The results are shown in Table I.
  • Example 9 Production and detection of an antibody according to the invention
  • the heterodimer prepared in Example 4 was subjected to 18% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4 M sodium acetate, an approximately 6.5 kB band was cut out of the gel and boiled in phosphate-buffered Incubated saline. The dimer is eluted from the gel using an electroeluctor (BioRad) and lyophilized overnight after kB dialysis. The peptide is taken up in a concentration of 5 mg / ml PBS and mixed with the carrier protein albumin in a ratio of 1 mol peptide / p. 02 mol carrier in a total of 2 ml PBS.
  • the rabbit's serum was tested in the immunoblot.
  • a heterodimer according to the invention from Example 4 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209).
  • Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al. , Virus Genes 8, (1994), 215-229.
  • the nitrocellulose filter was incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody was the serum of the Rabbit (1: 10,000 in PBS).
  • the nitrocellulose filter was incubated with a second antibody.
  • This antibody was an alkaline phosphatase-coupled goat monoclonal anti-rabbit IgG antibody (Dianova) (1: 5000) in PBS. After 30 minutes of incubation at 37 ° C, several washing steps with PBS followed and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 ⁇ M 5 'Bronio-4-ch.loro--3-indolylphosph.at, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mm Tris HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ) at room temperature until bands were visible.
  • Antibodies were extracted from egg yolk and tested in a Western blot. Polyclonal antibodies according to the invention have been detected.

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Abstract

Beschrieben werden Homodimere oder Heterodimere aus Peptid-monomeren, die die Aminosäuresequenz KHYSCTAEDID (Monomer I), PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II), AALQNHNHQQIILDK (Monomer III), IRDIIKPDPPKN (Monomer IV), SLTFCVQVQGKSKR (Monomer V) oder RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI) haben oder Varianten davon, wobei die Homodimere oder Heterodimere an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor binden und gegebenenfalls ein zelluläres Signal auslösen können. Diese Dimere eignen sich einerseits zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, von Erkrankungen, die mit einer erhöhten oder erniedrigten Zellproliferation in Zusammenhang stehen, von infektiösen oder entzündlichen Prozessen, andererseits zum Nachweis von Erkrankungen, die beispielsweise mit einem veränderten oder zu hoch bzw. zu niedrig exprimierten IL12 Rezeptor in Verbindung stehen.

Description

Von Interleukin 12 abgeleitete Peptid-Homodimere und Peptid-Heterodimere
Die vorliegende Erfindung betrifft Homodimere oder Heterodimere aus Peptidmonomeren, die die Aminosäuresequenz KHYSCTAEDID (Monomer I) , PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II) , AALQNHNHQQIILDK (Monomer III) , IRDIIKPDPPKN (Monomer IV) , SLTFCVQVQGKSKR (Monomer V) oder RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI) haben oder Varianten davon, wobei die Homodimere oder Heterodimere an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor binden und gegebenenfalls ein zelluläres Signal auslösen können. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus diese Homodimere bzw. Heterodimere enthaltende Arzneimittel. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Zusammensetzungen bzw. Diagnoseverfahren, bei denen die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere oder gegen diese gerichtete Antikörper eingesetzt werden.
Die Tumortherapie stützt sich bisher im wesentlichen immer noch auf die drei Hauptsäulen: Chirurgie, Chemo- und Radiotherapie. In den letzten Jahren hat sich jedoch die Erkenntnis durchgesetzt, daß eine primäre (d.h. ausschließliche) oder adjuvante (unterstützende) Behandlung mit Cytokinen in vielen Fällen eine Verlängerung der Lebenserwartung bewirkt, oftmals sogar eine vollständige Heilung. Bei den Cytokinen handelt es sich um körpereigene Botenstoffe, die von unterschiedlichen Zellen synthetisiert und anschließend sezerniert werden. Die biologischen Aufgaben dieser Cytokine sind sehr vielfältig, werden jedoch bisher nur zum Teil verstanden. In der Hauptsache besitzen Cytokine jedenfalls fundamentale immunregulatori- sche Wirkungen. Eines dieser Cytokin, das Interleukin 12 (IL12), wird zunehmend in der Therapie verschiedener Tumore eingesetzt. IL12 wird in vivo hauptsächlich von B-Zellen, weniger von T-Zellen hergestellt (D'Andrea et al . , J.Exp.Med. 176 (1992), 1387-1398) und hat eine Vielzahl biologischer Effekte. Besonders hervorzuheben sind folgende Wirkungen, da sie unmittelbar für den therapeutischen Effekt eine wichtige Rolle spielen: Stimulation der Proliferation humaner Lympho- blasten (Gateley et al . , J.Immunol. 147 (1991), 874), Akti- vierung von NK-Zellen (Manetti et al . , J.Exp.Med. 177 (1999), 1199 ) und Induktion der Synthese von IFN-gamma, IL2 und TNF (Chan et al . , J.Exp.Med. 173 (1991), 869). Durch einen Synergie-Effekt mit IL2 kann die Dosis von IL2 in Gegenwart von IL12 bei einer adoptiven Immuntherapie zur Erzeugung von Lymp- hokin-aktivierten Killerzellen drastisch gesenkt werden, so daß die gravierenden Nebenwirkungen von IL2 deutlich reduziert werden können .
IL12 ist ein Heterodimer, das aus einer p40- und p35-Kette besteht (Stern et al . , Proc .Natl . Acad. Sei . USA 87 (1990), 6808) . p40 weist gewisse Homologien zu der extrazellulären Domäne des IL6-Rezeptors auf (Gearing und Cosman, Cell ββ (1991), 9), während p35 ein Homologes von IL6 zu sein scheint (Mersberg et al . , Im unol . Today .13 (1992), 77). Die p35-Kette ist offenbar für die Signalauslösung am IL12-Rezeptor verantwortlich, während die p40-Untereinheit wahrscheinlich die Species-Spezifität bestimmt. Offenbar gibt es aber auch Rezeptor-Isoformen, die durch die p40-Kette alleine stimuliert werden können (Presky et al . , Proc .Natl .Acad. Sei .USA 9_3_ (1996), 14002) . Da bisher keine Röntgenstrukturanalysen der beiden IL12 -Untereinheiten vorliegen, kann über die IL-12- Tertiärstruktur nur spekuliert werden.
Wie bei anderen Cytokinen oder Wachstumsfaktoren gibt es auch bei den IL12-Untereinheiten bestimmte kurze Domänen, die mit dem Rezeptor interagieren. Die Verabreichung einer kurzen IL12-Domäne, die mit dem Rezeptor interagiert, könnte eventuell völlig ausreichen, um die gewünschten zellulären Effekte (z.B. immunstimulatorische Wirkung) zu erzielen. Allerdings gibt es bisher zu IL12 keine Untersuchungen, beispielsweise mit synthetisierten Peptiden, die Aufschluß über geeignete IL12-Domänen geben könnten.
Da Cytokine allgemein nur in äußerst geringen Konzentrationen im Serum vorkommen, ist eine Isolierung therapeutisch einsetzbarer Mengen aus diesem Medium nicht möglich. Daher wurden bisher die therapeutisch eingesetzten Cytokine rekombinant, in Bakterien oder Hefe, hergestellt. Diese Vorgehensweise weist jedoch eine Reihe von gravierenden Nachteilen auf.
Die rekombinante Herstellung von Cytokinen erfordert einen hohen Aufwand beim "set-up" . So muß beispielsweise geklärt werden, ob die Wirtszelle das Protein genau bzw. in der exakten nativen Konformation exprimiert, welches überhaupt die beste Wirtszelle bzw. der beste Expressionsvektor ist und unter welchen Bedingungen das Protein nicht proteolytisch abgebaut wird. Hier ist festzuhalten, daß allgemein rekombi- nant hergestellte Proteine eine vom nativen Proteir. abweichende Tertiärstruktur aufweisen und deswegen vom menschlichen Immunsystem als "fremd" erkannt werden. Die dadurch induzierten Antikörper neutralisieren das Protein, beispielsweise das Cytokin, und führen so zu einem Verlust von dessen Wirksamkeit .
Die Isolierung und Reinigung rekombinanter Proteine gestaltet sich schwierig, da sich prinzipiell immer die gleichen, für jedes neue Produkt spezifischen Fragen stellen, nämlich wie kann verhindert werden, daß das Protein proteolytisch abgebaut wird und/oder nach der Isolierung ausfällt. Allgemein zeigen rekombinant hergestellte Proteine eine auffällige Labilität gegenüber Proteasen. Dies erfordert eine häufige und/oder hochdosierte Verabreichung, die einerseits den Patienten sehr belastet, andererseits aber auch die Therapie sehr kostspielig gestaltet .
Da die Cytokine normalerweise bei der Therapie in regelmäßiger Folge verabreicht werden müssen, muß gewährleistet sein, daß sie absolut frei von Kontaminationen, d.h. vor allem von Bestandteilen der Wirtszelle, sind. Dadurch müssen komplexe Verfahren eingesetzt werden, die sich ungünstig auf die Preisgestaltung auswirken.
Inzwischen hat sich weitgehend die Erkenntnis durchgesetzt, daß Botenstoffe (z.B. Cytokine) nicht nur eine Bindungsstelle für den Rezeptor besitzen, sondern daß weitere - z.Zt. noch nicht vollständig verstandene - Domänen vorhanden sind, die möglicherweise andere Signalwege induzieren können als die, die eigentlich beabsichtigt sind. Damit könnten unter anderem auch die häufig auftretenden Nebenwirkungen der bisher eingesetzten Cytokinen erklärt werden, die teilweise eine Behandlung mit diesen unmöglich machen.
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Verbindungen mit einer biologischen Aktivität von Interleukin 12 (IL12) in einer Weise bereitzustellen, daß die bisherigen Nachteile des Stands der Technik vermieden werden, d.h. bei Verabreichung als Arzneimittel geringere Nebenwirkungen, eine höhere Halbwertszeit und hohe biologische Aktivität erhalten werden.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein synthetisches Homodimer oder Heterodimer aus Peptidmonomeren, die die Aminosäureseguenz KHYSCTAEDID (Monomer I) , PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II) , AALQNHNHQQIILDK (Monomer III) , IRDIIKPDPPKN (Monomer IV) , SLTFCVQVQGKSKR (Monomer V) oder RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI) haben, wobei das Homodimer oder Heterodimer an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor binden und ggf. ein zelluläres Signal auslösen kann. Diese erfindungsgemäßen Peptide stellen die Bindungsregionen der IL12-Untereinheiten p40 und p35 dar und machen sich die Erkenntnis zunutze, daß für eine biologische Wirkung der Einsatz der Peptide aus p35 und p40 in dimerisierter Form erfolgen muß, da auch die Rezeptoren zweifach zusammenliegen müssen, um zur Auslösung der intrazellulären Signale fähig zu sein. Die Monomere I-III umfassen 3 Schleifen, die an der Kontaktstelle von p35 mit dem Interleukin 12-Rezeptor liegen, während analog die Monomere IV-VI die Kontaktstellen für p40 mit dem Rezeptor darstellen. Die erfindungsgemäßen Dimere weisen folgende Vorteile auf: Sie sind über standardisierte Verfahren einfach zu synthetisieren und zu reinigen und können unmittelbar den erforderlichen Tests (z.B. strukturelle Untersuchungen, biologische Tests, präklinische und klinische Studien) zugeführt werden. Diese Peptide stellen die minimalen Strukturen des jeweiligen Cytokins dar, die für seine biologische Wirksamkeit erforderlich sind. Dadurch ist höchste Spezifität und hohe biologische Aktivität in Verbindung mit geringsten Nebenwirkungen gewährleistet. Aufgrund der geringen Größe der Peptide können sie mikrokapsuliert werden, wodurch sich Depotformen mit unterschiedlich langer Wirkungsdauer - abhängig von der jeweiligen Porengröße der Kapseln - ergeben. Die Depotform kann lokal appliziert werden, sodaß an der gewünschten Stelle (z.B. Krebsherd) die höchste Konzentration des Wirkstoffs über einen langen Zeitraum gewährleistet ist.
Erfindungsgemäß sind alle Kombinationen der Monomere I - VI untereinander zur Bildung von Dimeren befähigt und die entstehenden Dimere lösen die Aufgabe.
Die Synthese der erfindungsgemäßen Peptide erfolgt üblicherweise nach bekannten Festphasen-Syntheseverfahren, beispielsweise wie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben. Die Untersuchung der biologischen Aktivität (Bindung an den Rezeptor, Auslösung eines zellulären Signals und proliferationsstimulie- rende Wirkung) erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfahren, z.B. gemäß Lewis, J. Immuno1. Methods 185 (1995), 9-17; Grander et al., Eur. J. Cancer 28A (1992), 815-818 oder beispielsweise auch gemäß den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei den vorstehend beschriebenen Peptiden um Homodimere oder Heterodimere, bei denen die Monomere über ihre C-Ter- mini oder N-Termini verknüpft sind oder der N-Terminus eines Monomers mit dem C-Terminus des anderen Monomers verknüpft ist. Vorzugsweise ist der C-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II, oder der N-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II verknüpft. Dabei wird beispielhaft das gewünschte N-terminale Peptid in Seitenfunktion-geschützter Form nach Entfernen der Schutzgruppe (bevorzugt Fmoc) durch Behandlung mit z.B. Piperidin mit einem Crosslinker aktiviert und das Produkt über HPLC gereinigt. Ein anderes zuvor synthetisiertes Monomer wird ebenfalls (entweder am C- oder N-Terminus - je nach gewünschtem Dimer) in Sei enfunktion-geschützter Form mit einer Gruppe versehen, die ausschließlich mit der N-terminalen Gruppe des gebundenen Peptids reagiert. Nach Zugeben dieses Monomers zum aktivierten Monomer werden die Dimere, die sich im Elutions- verhalten deutlich von den Monomeren unterscheiden, nach Entfernen der Seitenschutzgruppen nach Standardverfahren über Umkehrphasen-HPLC gereinigt und isoliert. Falls es die Amino- säurenzusa mensetzung zuläßt, können die Aktivierungsgruppen und Crosslinker auch so ausgewählt werden, daß eine Dimerisierung an freien Monomeren nach Entfernen der Seitenketten- Schutzgruppen direkt in Lösung durchgeführt werden kann. Alternativ kann die Synthesestrategie wie im Beispiel beschrieben am HYCHRON-Anker durchgeführt werden, sodaß die Seitenketten-Schutzgruppen erhalten bleiben und eine Dimerisierung in wässriger Lösung durchgeführt werden kann.
Diese Verknüpfung kann beispielsweise mittels dem in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren oder anderen Standardverfahren durchgeführt werden, wobei darauf geachtet werden muß, daß die Dimerisierung so erfolgt, daß eine Bindung an das Rezeptorpaar noch wirksam möglich ist. So kann z.B. die Dimerisierung an einem Lysin-Rest als Verzeigungspunkt (Wrighton et al . , Nature Biotechnology 15 (1997), 1261-1265) durchgeführt werden. Vorzugsweise sind die Homomere der erfin- dungsgemäßen Dimere über Linker, wie Polyäthylenglykol , Pep- tid(e), aktivierte Benzodiazepine, Oxazolone, Azalactone, Aminimide, Diketopiperazine, oder (ein) Monosaccharid(e) , kovalent miteinander verknüpft. Die entsprechend durchzuführenden chemischen Reaktionen sind dem auf diesem Gebiet arbeitenden Fachmann bekannt (z.B. Hermannson, Bioconjugate Techniques (1996), Academic Press, San Diego; Peeters et al . , J. Immunol. Meth. 120, (1989), 133-144; Inman et al . , Biocon- j ugate Chem . 2 ( 1991 ) , 458 -463 ) .
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Homodimere oder Heterodimere, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Monomere gegenüber den entsprechenden Ausgangmonomeren I bis VI Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure (n) aufweisen. Dabei werden Homo- bzw. Heterodimere erhalten, die (a) im Vergleich zu den ursprünglicher. Formen ähnlich oder besser an den IL12 Rezeptor binden und/oder ein zelluläres Signal auslösen können, oder (b) an den IL12 Rezeptor zwar noch binden können, jedoch eine antagonistische Wirkung aufweisen, d.h. nach Verabreichung wird die biologisch aktive Form durch diese Form, die nicht mehr zur .Auslösung eines zellulären Signals nach Bindung an den Rezeptor führt, verdrängt. Inwieweit diese veränderten Homo- bzw. Heterodimere die gewünschten biologischen Eigenschaften aufweisen, kann mittels der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren bzw. den vorstehend beschriebenen Verfahren untersucht werden. Vorzugsweise werden bei den Aminsosäuresubstitu- tionen bzw. Additionen natürliche Aminosäuren eingeführt, wobei modifizierte Aminosäuren nicht ausgeschlossen sind. Zu den bevorzugten Modifikationen zählen Glykosylierungen mit Mono- oder Disacchariden von Serin, Threonin und Asparagin, Farnesylierung und Palmitoylierung von Cystein, Phosphorylie- rung von Threonin, Serin und Tyrosin, wobei die Modifikationen, die die zentralen Aminosäuren betreffen, meist zu antagonistischen Formen führen. Bei den vorstehend beschriebenen veränderten erfindungsgemäßen Homodimeren bzw. Heterodimeren betreffen die Deletionen, Additionen, Substitutionen und/oder Modifikationen höchstens 10, vorzugsweise höchstens 7, stärker bevorzugt höchstens 3 und am meisten bevorzugt höchstens 1 Aminosäure (n) pro Monomer Die erfindungsgemäßen, aus veränderten Monomeren bestehenden Homo- bzw. Heterodimere enthalten neben der für die Rezeptorbindung verantwortlichen Domäne keine weiteren Domänen, wie sie für das natürliche Cytokin charakteristisch sind. Vorzugsweise handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen bzw. aus veränderten Monomeren bestehenden Dimer um folgende Homodimere: [AALQNHNHQQIILDK] 2 oder [AALQNHNKQQIILDK] 2 , welche gegenüber IL12 sogar eine deutlich höhere spezifische Aktivität aufweisen. Beide Monomeren sind sowohl C-C als auch C-N verknüpft .
Die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere können als solche vorliegen, aber auch mit anderen weiteren Verbindungen, beispielsweise (Poly) peptiden verknüpft sein. Zu diesen (Po- ly)peptiden zählen beispielsweise Trägerproteine, z.B. Trans- ferrin oder Albumin, die vom Körper nicht als fremd erkannt werden. Die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere können auch noch mit anderen (Poly) peptiden fusioniert sein, beispielsweise einem Leaderpeptid, das das Eindringen des erfindungsgemäßen Peptids in die Zelle ermöglicht oder unterstützt. Ein Beispiel für ein solches Leaderpeptid ist Penetra- tin von Drosophila.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die vorstehenden Homodimere oder Heterodimere, die weiter dadurch gekennzeichnet sind, daß eine oder mehrere Aminosäuren durch Fettsäuren, Mono- und/oder Oligosaccharide kovalent modifiziert sind. Dies kann durch allgemein bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise während der Synthese der Monomere durch den Einsatz von Aminosäuren, die bereits die vorstehenden Modifikationen tragen. Die Modifizierungen können aber auch nachträglich erfolgen. Durch diese Modifizierungen kann beispielsweise eine höhere Resistenz gegenüber einem proteolytischen Abbau und damit eine noch höhere biologische Halbwertszeit erreicht werden.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein Fragment davon gegen die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Dimere. Diese Antikörper können beispielsweise auch in diagnostischen Assays verwendet werden. Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z.B. Fab- , Fv- oder "single chain Fv" -Fragmente) , welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei die erfindungsgemäßen Homodimere oder Heterodimere als Antigen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z.B. Maus) stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnde oder humanisierte Antikörper besitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht herabgesetzt. Die Herstellung von Chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde ausführlich beschrieben (siehe beispielsweise Queen et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989), 10029, und Verhoeyan et al . , Science 239 (1988), 1534). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Immunglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nichtmenschlichen Immunglobulin (z.B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin) . Die (der) konstante (n) Bereich(e) stammt (stammen), falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabreichung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörperantwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell fremden Chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, interagiert er besser mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems , und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper erzeugt.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere enthaltende Arzneimittel bzw. deren Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, von Erkrankungen, die mit einer erniedrigten Zell- proliferation in Zusammenhang stehen, oder von infektiösen oder entzündlichen Prozessen (z.B. HIV, Leishmaniasis : Mount- ford et al., J. Immuol . 156 (996), S. 4739-4745). Bestimmte modifizierte Formen der erfindunggemäßen Dimere können auch eine antagonistische Wirkung aufweisen. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere enthaltenden Arzneimittel bzw. deren Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Zellproliferation in Zusammenhang stehen, z.B. Tu o- re, arthritische Prozesse, allergische Reaktionen oder bestimmte Formen von Hauterkrankungen, wie Psoriasis (Wigginton et al., J. Natl. Cancer Inst. 88 (1996), 38-43; Brunda et al . , J. Exp. Med. 178 (1993), 1223-1230). Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch die erfindungsgemäßen Dimere enthaltende Arzneimittel bzw. deren Verwendung zur Reduzierung der IL2-Nebenwirkungen bei einer Therapie mit IL2 , beispielsweise einer Immuntherapie.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel liegt gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger vor. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann in Form einer Injektionslösung, Tablette, Salbe, Suspension, Emulsion, eines Zäpfchens etc. vorliegen. Es kann auch in Form von Depots (Mikrokapseln, Zinksalze, Liposomen etc.) verabreicht werden. Die Art der Verabreichung des Arzneimittels hängt unter anderen davon ab, in welcher Form der Wirkstoff vorliegt, sie kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle (z.B. direkt zu einem Tumor), intramuskuläre, intramedulläre , intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, transdermale oder transmukosale (nasal, vaginal, rektal, sublingual) Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, der Art und dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Homodimer oder Heterodimer enthält oder den erfindungsgemäßen Antikörper und zur Diagnose von Erkrankungen verwendet werden kann, die mit einem veränderten oder zu hoch bzw. zu niedrig exprimierten IL12 Rezeptor in Zusammenhang stehen bzw. mit einer zu hohen oder geringen Konzentration von IL12. Dabei können die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere in allgemein üblichen Assayformaten zum diagnostischen Nachweis vorliegen. Dieser Nachweis beinhaltet beispielsweise (a) die Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten, (b) das Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit dem erfindungsgemäßen Homo- bz . Heterodimer oder Antikörper als Sonde unter Bedingungen, die die spezifische Bindung an das Ziel erlauben, und (c) den Nachweis der Bindung an das Ziel. Dieser Nachweis kann unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken durchgeführt werden. Dabei können die erfindungsgemäßen Verbindungen beispielsweise in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebun- den werden und auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Diesem sind auch Zellaufschlußverfahren bekannt, die es erlauben, daß IL12 bzw. der Rezeptor mit dem erfindungs- gemäßen Antikörper oder Homo- bzw. Heterodimer in spezifischen Kontakt gebracht werden kann.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens , der ein erfindungsmäßes Dimer oder den erfindungsgemäßen Antikörper oder das Fragment davon enthält. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können das Dimer bzw. der Antikörper oder das Fragment davon immobilisiert sein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Festphasensynthese von KHYSCTAEDID (Monomer I) ,
PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II) , AALQNHNHQQIILDK (Monomer III) , IRDIIKPDPPKN (Monomer IV) . SLTFCVOVOGKSKR (Monomer V) und RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI)
Die Monomere I-VI wurden nach einer Standard-Festphasensyn- these hergestellt (Seitz et al . , Angew. Chem. 107 (1995), 901) . Die Synthese erfolgte an einem HYCHRON-Anker mit einer Fmoc-geschützten Aminosäure mit Start über den C-Terminus. Die Carboxylgruppen von Glutaminsäure und Asparaginsäure wurden in Form von tert-butyl-Estern geschützt. Die Schutzgruppen der Seitenketten von Tyr beinhalteten tetrahydropyranyl-, tert- butyl(Boc)- und trityl-Gruppen. Die Seitenketten-Schutzgruppen von Serin und Threonin beinhalteten Acetyl-, Benzoyl- und Benzyloxycarbonyl- (=Cbz) -Gruppen. Die Schutzgruppen für die Seitenkette von Arginin beinhalteten Cbz, Mesitylen-2-sulfonyl (=Mts) oder tert-butyloxycarbonyl (=Boc) . Die Seitenkette von Lysin wurde durch Tosyl- (=Tos) oder Boc geschützt. Nach Entfernen der cc-Amino-Schutzgruppe und entsprechenden Wasch- schritten, gefolgt von Aktivierung der Carboxylgruppe der nächsten Aminosäure wurde diese an die vorhergehende Aminosäure gekoppelt. In dieser Reihenfolge wurden die kompletten Monomere synthetisiert. Die fertigen Monomere wurde durch einen Palladium ( 0 ) katalysierten Allyl-Transfer von der Säule gelöst, wobei die Schutzgruppen an den Seitenketten erhalten blieben. Anschließend wurde die Fmoc-Gruppe durch Morpholin abgelöst, die restlichen Schutzgruppen wurden durch Behandlung mit TFA abgespalten.
Beispiel 2 : Polyäthylenglykol-Dimerisierung von Monomer I
Die Dimerisierung der Monomere I erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykol (PEG- Succinimidylpropionat , MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals lyophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 5) .
Beispiel 3 : Polväthylenqlvkol-Dimerisierunq von Monomer II
Die Dimerisierung der Monomere II erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykol (PEG- Succinimidylpropionat, MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals lyophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 5).
Beispiel 4: Polväthylenqlvkol-Dimerisierunq der Monomere I und
II
Die Dimerisierung der Monomere erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykol (PEG-succi- nimidylpropionat , MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals lyophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 5).
Die Monomeren wurden im Verhältnis 1:1 eingesetzt, die Abtrennung erfolgte über Umkehrphasen-HPLC, da sich die beiden Dimere in ihrem Elutionsverhalten deutlich (je nach Zusammensetzung zwischen 4 und 9 Minuten Unterschied im Elutionspeak) unterscheiden und dadurch voneinander abtrennbar sind.
Beispiel 5: Analytische und präparative HPLC
Die Bildung der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Dimere wurde durch analytische Umkehrphasen-HPLC überprüft. Die Analyse wurde mittels einer Vydac-C18 Protein-Peptid-Säule (0,46 x 25 cm) (The Separation Group, USA), einem BioRad HPLC- System und einem Zweiwellenlängen-Detektor von Perkin-Elmer durchgeführt. Die Säule wurde mit 0,1% TFA in dest. Wasser äquilibriert, und 10 min. nach Injektion der Probe (in der Regel 6 ml) wurde ein 45-minütiger linearer Gradient (0-100) von Acetonitril mit 0,1% TFA gefahren. Die Flußrate wurde kontinuierlich bei 1 ml /min. gehalten. Unter diesen Bedingun- gen erschien der Quervernetzer im Durchfluß. Das Reaktionsprodukt eluierte nach 37 min. , während das unkonjugierte Monomer bereits nach 32 min. eluiert wurde und damit klar vom Dimer abgetrennt werden konnte Das Dimer wurde auf einer präparativen Umkehr-HPLC-Säule (2,2 x 25 cm) am gleichen HPLC- System weiter aufgereinigt . Die Säule wurde mit einer konstanten Flußrate von 8 ml/min. mit dest. Wasser: Acetonitril 80:20 (beide enthielten 0,1% TFA) äquilibriert. 20 min. nach Injektion der Probe ( 6 ml) wurde ein 60-minütiger linearer Gradient auf 100% Acetonitril/ 0 , 1% TFA gefahren. Der Hauptpeak wurde gesammelt und lyophilisiert . Für das Monomer II wurde ein flacherer Gradient (20-80% Acetonitril/0 , 1% TFA über 60%) gefahren, um so eine bessere Abtrennung zu erreichen. Die isolierten Dimere und die nativen Monomere wurden in Bindungs- studien (siehe Beispiel 7) und Proliferationstests (siehe Beispiel 8) eingesetzt.
Beispiel 6: Radioaktive Markierung der Dimere
Die Dimere wurden wie nachstehend beschrieben iodiert. 20 μl Chloramin T (0,5 mg/ml) wurden zu 20 μl Na1 5I (2 mCi, Amersham Buchler, Braunschweig) gegeben, das Gemisch wurde 2 min. später zu 50 μl Dimer (5 μg in PBS) zugemischt und 15 sec . inkubiert. Zur Beendigung der Reaktion wurden 30 μl Natrium-meta- bisulfit (1 mg/ml in PBS) und nach 30 sec. 50 μl KI (10 mg/ml in PBS) zugegeben. Als Carrier wurde Gelatine (50 μl, 1 mg/ml . In dest. Wasser) zugegeben und die Lösung sofort auf eine Bio- Sil SEC 125-5 Säule (BioRad, 10 ml) aufgetragen, die mit 0,25% Gelatine/0, 02% Natriumazid in PBS äquilibriert war. Die Fraktionen, die das radioaktive Produkt enthielten, wurden vereinigt und auf der Umkehrphasen-HPLC-Säule wie in Beispiel 5 beschrieben weiter aufgereinigt und isoliert. Die gereinigten Dimere wiesen eine spezifische Radioaktivität von 50-100 μCi/μg auf, ergaben in der Tricin-SDS-PAGE eine einzelne Bande und die Radioaktivität konnte zu 95-100% mit dem Chloroform/Methanol-Verfahren (Wessel et al . , Anal. Biochem. 138 (1984), 141-143) gefällt werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß das radioaktiv markierte Produkt aus einem reinen Dimer bestand und daß die Radioaktivität ausschließlich dem Dimer zuzuschreiben war.
Beispiel 7 : Zellbindun sstudien
Diese Studien geben Aufschluß darüber, ob die erfindungsgemäßen Dimere spezifisch an Zellen binden, die den IL12-Rezeptor exprimieren. In diesem Beispiel wurde das aus den Monomeren III bestehende Homodimer verwendet. Das Experiment wurde an PHA-stimulierten humanen Lymphoblasten nach einem modifizierten Protokoll gemäß Chizzonite et al . , J. Immuno1. 148 (1992), 3117-3124, durchgeführt.
Die stimulierten Zellen (7,5 x 105 Zellen /ml RPMI-Medium) wurden 90 Minuten mit radioaktiv markiertem Dimer in verschiedenen Konzentrationen (0,01 bis 1 ng) inkubiert und anschließend mittels 3 Zentrifugationsschritten in PBS gewaschen und die Zeil-gebundene Radioaktivität im Flüssigszintillationszäh- ler gemessen. Das Ausmaß der unspezifischen Bindung wurde in Gegenwart einer lOOfach höheren Konzentration von IL12 bestimmt, wobei markiertes Homodimer und IL12 gleichzeitig zu den Zellen gegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt .
Tabelle I Testsubstanz Bindunu f% maximale Bindung)
Interleukin 12 100
AALQNHNHQQIILDK
[AALQNHNHQQIILDK]: °ό
Beispiel 8: Proliferationsstudien
Diese Studien sollten zeigen, ob die erfindungsgemäßen Dimere ähnlich wie natives IL12 proliferationsstimulierende Wirkung besitzen. Sie wurden wiederum an PHA-stimulierten humanen Lymphoblasten in einem 48 Stunden Assay gemäß Gately und Chiz- zonite, Curr . Protocols in Immunology Voll (1992), S.6.16- 6.16.8, mit Monomer III durchgeführt. Dabei wurden die Zellen in 200 μl Kulturmedium in einer Zellzahl von 5 x 104 ausgesät und in Gegenwart verschiedener Konzentrationen (0,01 - 1 ng) der Dimere 48 Stunden kultiviert. Nach Zugaben von tritiiertem Thymidin (0,25 μCi/ml) wurden die Zellen weitere 4 Stunden kultiviert und anschließend über ein Zellernte-Gerät isoliert. Die eingebaute Radioaktivität wurde im Flüssigszintillations- zähler gemessen. Die Werte sind in Tabelle II als spezifische Aktivität in Einheiten x 10"7/mg IL12 dargestellt.
Tabelle II Testsubstanz | Spezifische .Aktivität
Interleukin 12
AALQNHNHQQIILDK : 0.03
[AALQNHNHQQIILDK]2
[AALQNHNKQQIILDK]2 i 10.5
Beispiel 9 : Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Das in Beispiel 4 hergestellte Heterodimer wurde einer 18 % SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wurde eine ca. 6 , 5 kB Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Koch- Salzlösung inkubiert. Das Dimer wird mittels eines Elektroelu- tors (BioRad) aus dem Gel eluiert und nach einer kB-Dialyse über Nacht lyophilisiert . Das Peptid wird in einer Konzentration von 5 mg/ml PBS aufgenommen und mit dem Trägerprotein Albumin in einem Verhältnis 1 mol Peptid/p,02 mol Carrier in insgesamt 2 ml PBS gemischt. Zu dem Gemisch werden 2 ml Glu- tardialdehyd (0,2% in PBS) unter kontinuierlichem Rühren zugetropft und 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend wird das Gemisch 48 Stunden mit 12-stündigem Pufferwechsel in einem 20 kB-Dialyseschlauch gegen PBS dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Die Tiere werden mit dem Gemisch bestehend aus Dimer-BSA-Komplexen, BSA-BSA-Komplexen sowie Dimer-Komplexen mit 100 μg (Kaninchen und Huhn) bzw. mit 30 μg (Maus) immunisiert:
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung wurden 100 μg Gel-gereinigtes Heterodimer in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund 's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund ' s Adjuvans) Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund ' s Adjuvans; icFA)
Tag 28 3. Immunisierung (icFA) Tag 56 4. Immunisierung (icFA) Tag 80 Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Heterodimer von Beispiel 4 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys . Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al . , Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens (1:10000 in PBS) . Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG- Antikörper (Dianova) (1:5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bronio-4-ch.loro--3-indolylphosph.at , 400μM Nitroblau-tetrazolium, lOOmM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren .
Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung wurden 100 μg Gel-gereinigtes Heterodimer in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O. 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen .
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung wurden 30 μg Gel-gereinigtes Heterodimer in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusions- protein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0. 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 28 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56 3. Immunisierung (icFA) Tag 84 4. Immunisierung (PBS) Tag 87 Fusion
Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen,

Claims

Patentansprüche
1. Synthetisches Homodimer oder Heterodimer aus Peptidmono- meren, die die Aminosäuresequenzen KHYSCTAEDID (Monomer I) , PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II) , AALQNHNHQQIILDK (Monomer III), IRDIIKPDPPKN (Monomer IV), SLTFCVQVQGKSKR (Monomer V) oder RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI) haben bzw. Varianten davon, wobei das Homodimer oder Heterodimer an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor bindet.
2. Homodimer oder Heterodimer nach Anspruch 1, wobei die Monomere über ihre C-Termini oder N-Termini verknüpft sind oder der N-Terminus eines Monomers mit dem C-Terminus des anderen Monomers verknüpft ist.
3. Heterodimer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der C-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II, oder der N-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II verknüpft ist.
4. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis
3, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomere über Polyäthylenglykol, Peptid(e), aktivierte Benzodiazepine, Oxazolone, Azalactone, Aminimide, Diketopiperazine, oder (ein) Monosaccharid(e) kovalent miteinander verknüpft sind.
5. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis
4, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomere Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure (n) aufweisen, wobei die Homodimere oder Heterodimere im Vergleich zu den ursprünglichen Formen ähnlich oder besser (a) an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor binden und/oder (b) ein zelluläres Signal auslösen können.
6. Homodimer nach Anspruch 5, das das Homodimer [AALQNHNHQQIILDK] 2 oder [AALQNHNKQQIILDK] 2 ist
7. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomere Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure (n) aufweisen, wobei die Homodimere oder Heterodimere an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor binden können, jedoch eine antagonistische Wirkung aufweisen.
8. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere Aminosäuren durch Fettsäuren, Mono- und/oder Oligosaccharide kovalent modifiziert sind.
9. Antikörper oder Fragment davon, der (das) an das Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 8 spezifisch bindet.
10. Antikörper nach Anspruch 9, der ein monoclonaler Antikörper ist oder ein Fragment davon.
11. Verfahren zur Herstellung des in den Ansprüchen 1 bis 8 definierten Homodimers oder Heterodimers, umfassend eine Festphasensynthese der Monomere und anschließende Dimerisierung.
12. Verwendung des Homodimers oder Heterodimers nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 8, oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 11 hergestellten Homodimers oder Heterodimers zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, von Erkrankungen, die mit einer erniedrigten Zellprolife- ration in Zusammenhang stehen, von infektiösen oder entzündlichen Prozessen oder zur Reduzierung der IL2-Nebenwirkungen bei einer Therapie mit IL2.
13. Verwendung des Homodimers oder Heterodimers nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 7 und 8, oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 11 hergestellten Homodimers oder Heterodimers zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems oder von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Zellproli- feration in Zusammenhang stehen.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei es sich bei der Erkrankung um eine Krebserkrankung handelt.
15. Verwendung des Homodimers oder Heterodimers nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 11 hergestellten Homodimers oder Heterodimers oder des Antikörpers nach Anspruch 9 oder 10 oder des Fragments davon zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einem veränderten oder zu hoch bzw. zu niedrig exprimier- ten Interleukin 12 (IL12) Rezeptor bzw. einer zu hohen oder zu niedrigen Konzentration von Interleukin 12 in Zusammenhang stehen.
16. Kit zur Durchführung des in Anspruch 15 definierten Dia- gnoseverfahrens , das Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das nach dem Verfahren nach Anspruch 11 hergestellte Homodimer oder Heterodimer oder den Antikörper nach Anspruch 9 oder 10 oder das Fragment davon enthaltend.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2061489A2 (de) * 2006-09-15 2009-05-27 The Burnham Institute Hochaffine ephb-rezeptorbindende verbindungen und anwendungsverfahren dafür
US20140073556A1 (en) * 2011-03-14 2014-03-13 Serodus Asa Antagonists of the Interleukin-1 Receptor

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0640689A2 (de) * 1993-07-02 1995-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag P40 Homodimer von Interleukin-12
US5891680A (en) * 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0640689A2 (de) * 1993-07-02 1995-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag P40 Homodimer von Interleukin-12
US5891680A (en) * 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2061489A2 (de) * 2006-09-15 2009-05-27 The Burnham Institute Hochaffine ephb-rezeptorbindende verbindungen und anwendungsverfahren dafür
EP2061489A4 (de) * 2006-09-15 2009-12-23 Burnham Inst Hochaffine ephb-rezeptorbindende verbindungen und anwendungsverfahren dafür
US20140073556A1 (en) * 2011-03-14 2014-03-13 Serodus Asa Antagonists of the Interleukin-1 Receptor
US9359405B2 (en) * 2011-03-14 2016-06-07 Phlogo Aps Antagonists of the interleukin-1 receptor

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