ITMI20080357A1 - Proteina da haliotis midae e suo uso come agente immunoterapico - Google Patents
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Description
Descrizione
“PROTEINA DA HALIOTIS MIDAE E SUO USO COME AGENTE IMMUNOTERAPICO”
La presente invenzione ha per oggetto una proteina estraibile da Haliotis midae e il suo uso come agente capace di prevenire manifestazioni della malattia allergica e di indurre tolleranza preventiva ed aspecifica della flogosi allergica.
Sfondo dell’invenzione
I cardini fondamentali della terapia delle malattie allergiche sono:
1. la prevenzione ambientale,
2. i farmaci sintomatici,
3. l’immunoterapia specifica iposensibilizzante.
Quest’ultima è solitamente attuata somministrando per lunghi periodi di tempo allergeni ritenuti responsabili della reazione allergica.
US 20040228850, GB 2400556 e WO 2004089405 (McEwen) descrivono l’uso della beta-glucuronidasi estratta dal mollusco marino Haliotis midae (Abalone sudafricano) come agente potenziante della terapia iposensibilizzante con allergeni.
EP 1228767, a nome della Richiedente, descrive invece l’uso di beta-glucuronidasi di per sé, non in associazione con allergeni, per il trattamento di malattie immuni e allergiche e come agente capace di stimolare la produzione di Interleuchina 12.
Descrizione dell’invenzione
Si è ora trovata una nuova proteina estraibile da Haliotis midae che è risultata in grado di inibire l’anafilassi e di prevenire l’infiammazione allergica. La proteina dell’invenzione può pertanto essere utilizzata come farmaco antiallergico. L’invenzione riguarda pertanto anche composizioni farmaceutiche comprendenti come ingrediente attivo la nuova proteina.
La proteina dell’invenzione può essere ottenuta a partire da un estratto grezzo di Haliotis midae disponibile in commercio sotto forma di un liofilizzato lievemente pigmentato, che in soluzione acquosa tamponata a pH neutro assume una colorazione beige più o meno marcata a seconda della concentrazione della stessa. La soluzione, per esempio in tampone fosfato di sodio 20 mM a pH 6,9, viene centrifugata per eliminare il materiale indisciolto ed eluita su colonna cromatografica contenente una resina adatta a separare un componente (lipo)polisaccaridico ad elevato peso molecolare: si utilizzano preferibilmente almeno due distinti stadi cromatografici di gel filtrazione, preferibilmente su resine di tipo poli([allildestran]-co-N,N′-metilenebisacrilamide), un primo stadio con una resina con campo di frazionamento teorico fra 1500 e 10 kDa, disponibile in commercio con la denominazione di Sephacryl S300 HR®, e un secondo stadio con una resina con campo di frazionamento teorico fra 100 e 1 kDa disponibile in commercio con la denominazione di Sephacryl S100 HR®.
Con questa eluizione si è arrivati ad una forma praticamente pura della proteina con attività immunostimolante, con peso molecolare di circa 30 kDa e punto isoelettrico attorno a 4,3-4,5.
La purificazione di questa proteina può essere ovviamente ottenuta con procedure alternative o complementari alla gel filtrazione quali l’uso di resine a scambio ionico, idrossilapatite, sistemi elettroforetici e di qualsiasi altra tecnica nota applicabile alla purificazione di proteine.
L’attività della proteina è stata valutata per mezzo del test di inibizione dell’anafilassi cutanea topo/ratto (mrPCAinib). Questo metodo è considerato predittivo dell’utilità clinica; infatti l’anafilassi cutanea nel ratto indotta da specifiche IgE di topo è la tipica espressione del danno indotto dall’infiammazione allergica.
Il target immunologico della proteina dell’invenzione che induce la tolleranza è stato inoltre identificato in vitro. Utilizzando le culture di cellule aderenti provenienti da cellule mononucleate isolate dal sangue dei soggetti allergici stimolate con l’antigene specifico, è stato evidenziato l’aumento della produzione di IFN-γ, l’aumento della produzione di IL-10 e la soppressione della produzione di IL-13.
Tale interferenza sulla produzione di queste citochine può giustificare l’efficacia clinica della proteina dell’invenzione.
Per i previsti impieghi terapeutici, la proteina potrà essere somministrata per via parenterale, ad esempio sottocutanea, oppure per via transdermica, opportunamente formulata con tecniche ed eccipienti convenzionali. I dosaggi saranno determinati in base alla documentazione pre-clinica e ai test clinici di fase 1 e 2 e potranno variare entro intervalli ampi, tipicamente compresi tra 0,1 µg e 10 mg per unità di dosaggio da ripetersi ad intervalli settimanali o mensili.
L’invenzione è descritta in maggior dettaglio nei seguenti Esempi.
Esempio 1
Il grezzo proteico da mollusco marino Haliotis midae (Abalone Sudafricano) è stato acquistato dalla Seravac sotto forma di un liofilizzato lievemente pigmentato.
Da 150 mg di liofilo sciolti in 5 mL di tampone sodio fosfato 0,1 M pH 6,86, contenente NaCl 0,5 M, si elimina per centrifugazione un residuo gelatinoso e si eluiscono i 4 mL recuperati su una minicolonna di P6 (2,5 x 5 cm), raccogliendo un picco unico di 8 mL (teoricamente a 15 mgP/mL, da pesata). 4 mL degli 8 precedenti (a 10 mgP/mL al Biureto) sono stati rieluiti su una colonna di Sepharose CL 4B (2,5 x 15 cm; Vtot = 74 mL), in tampone sodio fosfato 0,1 M pH 6,86 (Figura 1).
Si sono raccolte 5 frazioni di cui la prima, ben separata, ha dato risposta negativa al saggio del Biureto, mostrando anche uno spettro da 400 a 250 nm assolutamente differente da quello normalmente mostrato da una qualsiasi proteina. Al saggio di Dubois (reazione con fenolo e acido solforico) ha dato un contenuto di 1 mg/mL, espresso come saccarosio equivalenti.
Il secondo picco è stato diviso in 3 parti (testa a 1,6, cuore a 4 e coda a 2,6 mg P/mL), per un recupero totale delle proteine caricate. La quinta frazione corrispondeva al volume che separava i due picchi.
La frazione centrale del picco proteico ottenuto dal passaggio su Sepharose CL 4B, ottenuta riunendo 4 eluizioni successive, è stata liofilizzata e quindi eluita su una resina Sephacryl S300 HR, con campo di frazionamento teorico fra 1500 e 10 kDa.
Si è impiegata una colonna da 172 mL totali (Φ 2 cm x circa 50 cm) equilibrata con tampone sodio fosfato 20 mM.
200 mg di liofilo della frazione centrale del passaggio su Sepharose CL 4B sono stati sciolti in 5 mL di acqua distillata e su di un’aliquota del campione si è controllata la presenza di attività di beta-glucuronidasi. L’eluizione della soluzione è riportata in Figura 2. Si sono raccolte frazioni da 2,5 mL, misurando l’attività di beta-glucuronidasi ogni 3 frazioni. La linea continua indica la lettura in flusso a 254 nm; la linea spezzata indica l’attività relativa di BG.
La frazione E è stata quindi eluita su una resina Sephacryl S100 HR, con un campo di separazione fra 100 e 1 kDa. La Figura 3 mostra l’eluizione della frazione “E” su una colonna da 160 mL totali (Φ 2 x circa 51 cm) equilibrata con tampone sodio fosfato 20 mM, pH 6,9 di Sephacryl S100 HS, con indicazione del contenuto proteico (A280 nm).
La componente proteica isolata nella frazione ε è risultata essere la responsabile dell’attività immunostimolante. In Figura 4 è mostrata a sinistra la separazione in SDS-PAGE (gel al 7,5%) e a destra la corsa isoelettroforetica (range 3,5-10) della proteina isolata.
La componente proteica di PM attorno a 30 kDa è praticamente unica (> del 98%), dato che si può ritenere reale, confrontando l’intensità relativa delle bande, tenendo conto che gli standard deposti sono di 5 µg per ogni proteina presente nello standard (lisozima, anidrasi carbonica, ovalbumina e sieroalbumina bovina).
A destra è mostrato lo sviluppo della corsa IEF della stessa frazione; il fatto che la proteina presenti due bande distanziate di circa 0,2 unità di pI, è tipico per proteine che hanno la stessa struttura amminoacidica di base, ma presentano differenze in uno o due amminoacidi che portano o meno una carica positiva o negativa.
Esempio 2 Inibizione dell’anafilassi cutanea topo/ratto I topi Balb/c femmina sono la specie di scelta per effettuare l’immunizzazione ed i ratti SD sono la specie di scelta per l’effettuazione dell’anafilassi passiva cutanea.
Protocollo sperimentale
Animali utilizzati: Balb/c mice (donatori) Animali challenge:
ratti SD (riceventi). Sesso, età all’arrivo: femmine, 4 settimane Sesso, età all’arrivo:
femmine, 8-12 settimane.
Quarantena ed acclimatazione: 1 settimana Quarantena ed acclimatazione: 1 settimana.
Stato sanitario: SPF Stato sanitario: SPF.
Numero d’animali: 40 Numero d’animali: 10 Topi Balb/c sono stati suddivisi in maniera casuale in 10 gruppi con numerosità pari a quattro topi per gabbia.
Gli animali forniti sono stati stabulati in isolatori ad ambiente controllato (SPF), posti all’interno di un locale climatizzato a T° di 20 - 22°C e umidificato a 55 - 60% U. R., alimentati ad libitum con mangime pellettato sterilizzato, abbeverati con acqua filtrata e sterilizzata ad libitum e alloggiati in gruppi di 4 in gabbie di policarbonato con griglia in acciaio.
FASE 1
La sensibilizzazione dei topi è stata effettuata il giorno T0, T14e T28con 0,25 ml [contenenti 20 µg di Ovoalbumina (OVA) 1 mg d’idrossido di alluminio] somministrati a ciascun topo per via intraperitoneale. Animali di controllo sono stati trattati agli stessi tempi con il veicolo.
Al Tempo T21gli animali sono stati trattati per via intradermica con 0,1 ml di una soluzione costituita da: tampone diluente a pH 5,9 e i composti in esame.
Al T30è stato effettuato il prelievo intracardiaco a ciascun topo di ciascun gruppo ed il siero raccolto è stato conferito in un pool per la fase successiva.
Al T37è stato effettuato il prelievo intracardiaco ai topi degli ultimi 2 sottogruppi ed il siero raccolto è stato conferito in un pool per la fase successiva.
FASE 2
La valutazione dell’avvenuta sensibilizzazione mediante anafilassi passiva cutanea eterologa (PCA) topo-ratto.
100 µl di diluizioni scalari del pool di siero raccolto al termine della fase 1, sono stati inoculati nel derma dorsale di un ratto precedentemente rasato.
Le diluizioni scalari considerate per la valutazione sono: Controllo positivo; 1:1; 1:20; 1:40; 1:60; 1:80; 1:100; 1:120.
Il controllo positivo è stato il siero alla diluizione 1:1.
In seguito (dopo 24 ore) sono stati iniettati nella vena caudale del ratto 0,5 ml (contenenti 200 µg di OVA e 10 mg/ml di blu Evans).
I topi si considerano sensibilizzati se il titolo della PCA sarà > di 1:80 (cioè l’ultima diluizione che mostra la fuoriuscita di colorante con un diametro maggiore di 7 mm).
Il programma di immunizzazione prevede le seguenti tappe:
- giorno 0: (tempo 0 =T0) - Inizio dell’immunizzazione.
Si procede all’inoculazione dell’antigene OVA effettuando il primo boost intraperitoneale a ciascun topo.
- giorno 14: (T14) - Primo richiamo.
Si procede all’inoculazione del secondo boost dopo 14 giorni dalla prima immunizzazione.
- giorno 21: (T21) - Trattamenti dei diversi gruppi in studio.
- giorno 28: (T28) - Secondo richiamo.
Si procede all’inoculazione del terzo boost dopo due settimane dalla seconda immunizzazione.
- giorno 30: (T30) - Prelievo analitico per il controllo del titolo anticorpale.
Se il titolo d’anticorpi è adeguato (diluizione 1.1000 OD >1.00) si procede con il Test PCA.
Gli animali saranno costituiti in 4 gruppi (1 di controllo e 3 sperimentali a loro volta divisi in sottogruppi). (4 topi/gruppo-sottogruppo).
Gruppo 1 Controllo
Gruppo 2 trattamenti (proteina dell’invenzione)
Diversi sottogruppi per ogni tipo di trattamento
- giorno 21 (T21): Trattamenti
Tutti i topi saranno trattati il 21° giorno con 0,1 ml contenenti le diverse frazioni proteiche con le dosi e le vie di somministrazioni previste dalla tipologia del gruppo d’appartenenza.
- giorno 30: (T30) - Prelievo del sangue totale da ciascun topo per via intracardiaca per ottenere il siero immune di tutti i gruppi.
Si procede alla determinazione delle IgE specifiche per OA con il metodo ELISA e PCA secondo Fase 2.
Un unico trattamento con 300 µg/topo effettuato in animali sensibilizzati 7 giorni prima di un richiamo è stato sufficiente ad inibire completamente la risposta allergica.
Claims (4)
- RIVENDICAZIONI 1. Una proteina ottenibile da un estratto grezzo di Haliotis midae, con peso molecolare di circa 30 kDa e punto isoelettrico attorno a 4,3-4,5 e dotata di attività inibente l’anafilassi cutanea passiva.
- 2. Una proteina secondo la rivendicazione 1 ottenibile da stadi di gel filtrazione.
- 3. Composizioni farmaceutiche comprendenti come ingrediente attivo la proteina delle rivendicazioni 1 o 2.
- 4. Uso della proteina delle rivendicazioni 1-2 per la preparazione di medicamenti per prevenire manifestazioni della malattia allergica e per indurre tolleranza preventiva ed aspecifica della flogosi allergica.
Priority Applications (4)
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