CN107530393A - 水溶性鲍鱼提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过鲍鱼材料的酶水解而产生的水溶性鲍鱼提取物。所述提取物包含高比例的低分子量肽，并且证明具有抗炎性质。

Description

水溶性鲍鱼提取物
本申请要求于2015年3月24日提交的新西兰临时申请706301的优先权，所述新西兰临时申请通过引用并入本文。
1.发明领域
本发明涉及水溶性鲍鱼提取物，包含所述水溶性鲍鱼提取物的组合物，以及它们在营养品和医疗应用中的用途。
2.发明背景
已知贝类富含支持健康的化合物。贝类提取物是全球市场中已建立的营养品类别。
贝类的一些提取物具有抗炎作用和其他药用作用，所述作用常被声称来源于脂质部分。炎症与很多种疾病状态有关，包括关节炎、动脉粥样硬化和癌症。目前对炎症的医学治疗很大程度上依赖于诸如阿司匹林的非甾体抗炎药物(NSAID)，其中很多种具有不期望的副作用。因此，具有较少副作用的营养品贝类制剂是非常理想的。
已经描述了贝类的多种营养品制剂。此类制剂的实际化学组成取决于多种因素，包括：
(a)源材料，包括贝类的种类、其年龄、及其生长的环境条件；以及
(b)用于获得组合物的方法–例如，选择性地排除或保留某些种类的化合物的步骤以及积极地破坏或改变一些种类的化合物的步骤将会影响最终组合物的化学组成。
迄今为止，贝类的营养品制剂集中在整个的动物提取物或该材料的脂质部分。冻干材料的超临界CO2提取已广泛地用于产生贻贝脂质提取物，特别是青口贝脂质提取物。以这种方式制备的营养品组合物以商标名LyprinolTM出售。
然而，完整的贻贝粉是不溶的，并且通常具有令人不快的“鱼腥”味，这使得它们不适于包含在许多食品中。贻贝脂质提取物也是不溶的，并且“鱼腥”味/气味随着氧化会更恶化，这在许多标准的食品加工步骤期间很可能会出现。通常必须将它们以填装脂质的胶囊形式施用，以掩蔽令人不快的气味和味道。
因此，提供具有药用益处的水溶性鲍鱼提取物是有利的，该水溶性鲍鱼提取物不受制于与可比的完整的贻贝粉和/或脂质提取物或其他类似的贝类产品相关的缺点。
本发明的目的是提供这样的提取物，或者至少为公众提供有用的选择。
3.发明概述
一方面，本发明提供了水溶性鲍鱼提取物。
在一个实施方案中，基于固体，水溶性鲍鱼提取物包含至少约45wt％的肽，优选低分子量的肽。
在一个实施方案中，基于固体，水溶性鲍鱼提取物包含约45wt％至约65wt％的肽，优选约50wt％至约60wt％的肽。
在一个实施方案中，大于90wt％，优选大于95wt％的肽小于5KDa。
在一个实施方案中，大于75wt％，优选大于80wt％的肽小于2KDa。
在一个实施方案中，大于35wt％，优选大于40wt％的肽小于1KDa。
在一个实施方案中，基于固体，水溶性鲍鱼提取物包含不大于约5wt％的脂质。
在一个实施方案中，水溶性鲍鱼提取物具有抗炎活性。
另一方面，本发明提供了产生水溶性鲍鱼提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用一种或多种蛋白水解酶水解鲍鱼材料的水性悬浮液；
(b)使水解混合物中的酶变性，以及
(c)从所述水解混合物中去除不溶材料，以提供水溶性鲍鱼提取物。
在一个实施方案中，在酶的变性后将水解混合物调节至pH 4。
在一个实施方案中，水溶性鲍鱼提取物是纯化的和/或浓缩的。
在一个实施方案中，鲍鱼选自但不限于黑足鲍(Haliotis iris/Blackfootpaua)、澳洲鲍(Haliotis australis/Silver paua/Yellow foot paua)和少女鲍(Haliotis virgenea)。
在一个实施方案中，鲍鱼材料是去除可食用的肌肉组织后留下的内脏和/或生殖腺。
另一方面，本发明提供了营养品组合物，其包含本发明的水溶性鲍鱼提取物和一种或多种可消耗的赋形剂。
在一个实施方案中，营养品组合物包含麦芽糖糊精和/或抗氧化剂。
在一个实施方案中，营养品组合物包括食品组合物、食品添加剂组合物、膳食补充剂或医疗食品。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的水溶性鲍鱼提取物和一种或多种药物可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，药物组合物包含口服剂型，优选粉末。
另一方面，本发明提供了用于减轻有需要的个体的炎症的方法，所述方法包括向该个体施用治疗有效量的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
另一方面，本发明提供了预防、治疗或管控有需要的个体的与炎症相关的疾病状态的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
在一个实施方案中，与炎症相关的疾病状态是慢性疾病状态。
在一个实施方案中，与炎症相关的疾病状态包括哮喘，脑炎，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎在内的炎性肠病，慢性阻塞性肺病(COPD)，变应性病症，纤维化，包括青少年关节炎、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎和骨关节炎在内的关节炎，银屑病，多肌痛，肌腱炎，滑囊炎，喉炎，齿龈炎，胃炎，耳炎，乳糜泻，憩室炎，动脉粥样硬化，心脏疾病，肥胖，糖尿病，癌症和阿尔兹海默病。
在一个实施方案中，与炎症相关的疾病状态升高了炎性TNFα和/或IL-1β的水平。
在一个实施方案中，本发明的水溶性鲍鱼提取物以口服施用。
4.附图简述
现在将参考附图描述本发明的实施方案，其中：
图1为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中抑制IL-1β的阳性(地塞米松)和阴性(二甲基亚砜，DMSO)测定对照的图。
图2为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中来自鲍鱼渣粉的水溶性提取物对IL-1β的抑制的作用的图。
图3为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中来自完整的鲍鱼粉的水溶性提取物对IL-1β的抑制的作用的图。
图4为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中来自鲍鱼渣粉(中试规模)的水溶性提取物对IL-1β的抑制的作用的图。
图5为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中抑制TNFα的阳性(地塞米松)和阴性(DMSO)测定对照的图。
图6为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中来自鲍鱼渣粉的水溶性提取物对TNFα的抑制的作用的图。
图7为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中来自完整的鲍鱼粉的水溶性提取物对TNFα的抑制的作用的图。
图8为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中来自鲍鱼渣粉(中试规模)的水溶性提取物对TNFα的抑制的作用的图。
图9为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中未水解的鲍鱼渣粉对IL-1β的抑制的作用的图。
图10为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中未水解的鲍鱼全粉对IL-1β的抑制的作用的图。
图11为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中未水解的鲍鱼渣粉对TNFα的抑制的作用的图。
图12为示出了在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中未水解的鲍鱼全粉对TNFα的抑制的作用的图。
图13为通过本发明的水溶性提取物(PAR 44)的LC-MS分析而产生的阳性产物离子基峰色谱。
图14为通过本发明的水溶性提取物(PAR 36)的LC-MS分析而产生的阳性产物离子基峰色谱。
图15为通过未水解的鲍鱼渣粉的LC-MS分析而产生的阳性产物离子基峰色谱。
图16为通过未水解的鲍鱼全粉的LC-MS分析而产生的阳性产物离子基峰色谱。
图17为通过本发明的水溶性提取物(PAR 44)的LC-MS分析而产生的阴性产物离子基峰色谱。
图18为通过本发明的水溶性提取物(PAR 36)的LC-MS分析而产生的阴性产物离子基峰色谱。
图19为通过未水解的鲍鱼渣粉的LC-MS分析而产生的阴性产物离子基峰色谱。
图20为通过未水解的鲍鱼全粉的LC-MS分析而产生的阴性产物离子基峰色谱。
5.发明详述
5.1定义
本文使用的“一个/种(a)”或“一个/种(an)”意指至少一个/种，除非另外明确指明。
本文使用的术语“约”是指不超过由该术语修饰的值的以上或以下10％的值。
本说明书和权利要求中使用的术语“包含(comprising)”意指“至少部分地由...组成”。当解释本说明书和权利要求中的包括术语“包含”的表述时，在各个表述中除了前置有该术语的特征之外也可以存在的其他特征。诸如“包含(comprise)”和“包含(comprised)”的相关术语将以类似的方式解释。
本文使用的术语“治疗有效量”在向个体施用疗法的语境下意指足以减轻或缓解疾病状态或其一种或多种症状的严重性、持续时间，防止疾病状态发展，引起疾病状态消退，防止疾病状态的复发、发展或发作，或者增强或改进另一疗法的预防作用或治疗作用的量。
本文使用的术语“管控(manage)”、“管控(managing)”和“管控(management)”在向个体施用疗法的语境下是指个体得自该疗法的有益效果，同时不导致疾病状态的治愈。例如，疾病状态的管控包括防止疾病状态的恶化。
本文使用的术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”在向个体施用疗法的语境下是指由施用该疗法所产生的防止或抑制疾病状态的复发、发作或发展。
本文使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”在向个体施用疗法的语境下是指由施用该疗法所产生的减轻或缓解疾病状态的进展、严重性和/或持续时间，或者缓解其一种或多种症状。
本文使用的术语“水溶性”当应用于材料时意指所述材料具有至少45％(w/v)的溶解度。
在本说明书中，引用了专利说明书、其他外部文件或者其他信息来源，这通常是为了提供讨论本发明特征的环境。除非另外具体说明，对此类外部文件的引用不应被解释为承认此类文件、或此类信息来源在任何司法管辖权内是现有技术，或构成本领域公知常识的一部分。
在本说明书的描述中，可以引用不落入当前申请要求保护的范围内的主题。该主题应当是本领域技术人员容易辨别的，并且可以有助于将本申请权利要求中定义的发明投入实践。
5.2产生本发明的水溶性鲍鱼提取物的方法
使用如下所述的常规加工技术，容易地制备本发明的水溶性鲍鱼提取物。
本发明提供了产生水溶性鲍鱼提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用一种或多种蛋白水解酶水解鲍鱼材料的水性悬浮液；
(b)使水解混合物中的酶变性，以及
(c)从所述水解混合物中去除不溶材料，以提供水溶性鲍鱼提取物。
本文使用的术语“鲍鱼”是指鲍螺科(仅存在鲍属)的可食用的海洋腹足类软体动物，在美国和澳大利亚被称为鲍贝(abalone)，在英国被称为鲍贝(ormer shells)。
在一个实施方案中，鲍鱼材料是干的鲍鱼粉(全粉)。其通常通过将新鲜鲍鱼的内脏和生殖腺干燥(通常通过冷冻干燥)，并且研磨成粉来获得，但可以包含鲍鱼肉。
在另一个实施方案中，鲍鱼材料是鲍鱼超临界渣体(渣粉)。术语“渣/渣体”通常指在提取诸如植物材料或动物材料的生物材料之后剩余的有机材料。本文使用的术语“超临界渣体”意指超临界流体提取之后剩余的有机材料
本文使用的术语“鲍鱼超临界渣体”意指在超临界流体提取鲍鱼材料、优选内脏和生殖腺之后剩余的有机材料。
在一个实施方案中，鲍鱼材料是鲍鱼超临界渣体，优选黑足鲍(Haliotis iris)。
在所述方法的第一步中，使用一种或多种蛋白水解酶将鲍鱼材料的水性悬浮液水解。
通过在对于所使用的酶或酶系统而言优化的条件下，用蛋白水解酶孵育鲍鱼材料的水性悬浮液来进行水解。通常，pH值应当调节至约5.5至约8。任选地，可以将抗氧化剂添加至水性悬浮液，所述抗氧化剂例如Oxyless U。
根据所使用的酶系统，通常将水性悬浮液加热至约30℃至约65℃，持续1至24小时。通常，将鲍鱼材料悬浮于冷水中，并且将混合物加热至需要的温度。然而，可选择地，可以将鲍鱼材料悬浮于已加热的水中。
在水解过程中，鲍鱼材料中存在的蛋白质将被水解为低分子量肽。水解必须酶促地进行，以得到具有适当分子量范围的肽。化学水解，例如使用酸的水解，是非选择性的。不受理论束缚，认为本发明的水溶性鲍鱼提取物的抗炎性质存在于所存在的特定的低分子量肽中。破坏这些肽或阻止它们形成的加工步骤将会改变提取物的抗炎活性。
蛋白水解酶可以为任何类型，例如，内切-蛋白酶/肽酶、外切-蛋白酶/肽酶、氨基肽酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶等。在一个实施方案中，蛋白水解酶各自具有弱酸性至约中性的pH最佳条件。在一个实施方案中，蛋白水解酶是非动物酶。
适合的蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、Alcalase(碱性蛋白酶)(枯草杆菌蛋白酶)、Enzidase FP(来源于所选的米曲霉变种(Aspergillus oryzae var.)的菌株的内切肽酶/外切肽酶)以及Enzidase Neutral(来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的非基因修饰菌株的受控发酵的金属中性肽链内切酶)。
在一个实施方案中，蛋白水解酶选自木瓜蛋白酶、Enzidase FP、EnzidaseNeutral、Alcalase等。
在另一个实施方案中，蛋白水解酶包括Alcalase、Enzidase Neutral和EnzidaseFP。
在水解过程中，鲍鱼材料的水性悬浮液的温度不应过热以至于使酶降解或抑制其活性。水解的持续时间将取决于所使用的酶的活性以及鲍鱼材料。
在搅拌下进行水解步骤以优化酶与鲍鱼材料之间的接触。
一旦水解完全，使酶变性。在一个实施方案中，在足以使蛋白水解酶变性的条件下加热水解混合物。在一个实施方案中，将水解混合物在约80℃至约95℃下加热约20min至约40min.
在一个实施方案中，经水解的鲍鱼材料的水性悬浮液可以任选地进行处理，以在酶变性之前去除脂质。可以使用本领域已知的任何方法来实现脂质的去除，例如，使用诸如离心的物理技术或化学提取。
在化学提取中，从经水解的鲍鱼材料的水性悬浮液中去除水，然后使其与脂质部分可溶的溶剂接触。然后将脱脂的产物再悬浮于水中，并且使水解酶变性。
在另一个实施方案中，将经水解的鲍鱼材料的水性悬浮液冻干以形成粉末，使用有机溶剂漂洗所述粉末以去除脂质。可以使用的溶剂的实例包括但不限于丙酮、乙醇、异丙醇、己烷、乙酸乙酯和二甲基甲酰胺。
在另一个实施方案中，干燥经水解的鲍鱼材料的水性悬浮液，并使用诸如CO2或CO2/乙醇的超临界溶剂提取以去除脂质部分。然后将脱脂的产物再悬浮于水中，并且使水解酶变性。
当鲍鱼材料的脂质相当高时，可以使用任选的脱脂步骤。当鲍鱼材料具有低的脂质含量时，可以省略脱脂步骤。
在水解酶变性之后，可以将混合物的pH值调节到约3.5至约4.2，优选约4，以防止微生物腐败。诸如磷酸、柠檬酸或盐酸的试剂可以用于调节pH值。
然后将水解混合物中存在的不溶材料去除，以提供本发明的水溶性鲍鱼提取物。
可以通过本领域已知的任何方法来去除不溶材料。在一个实施方案中，通过离心水解混合物并回收上清液来去除不溶材料。
通常在去除不溶材料之前调节pH值，但是如果后者含有壳碎片，则应当首先去除这种不溶材料以防止所述壳被酸溶解。
可以处理本发明的水溶性鲍鱼提取物以去除产生不期望的颜色和/或气味的杂质，例如，通过与活性炭接触。可以使炭置于容器中，并且使产物通过所述炭。或者，可以使用覆盖有硅藻土的压滤器或等同物来去除剩余的细粒和脂质残余物的碳。
也可以通过去除所存在的部分或全部水来浓缩水溶性鲍鱼提取物。
在一个实施方案中，将水溶性鲍鱼提取物干燥以提供粉末状提取物。可以使用本领域已知的任何技术来进行干燥，包括冷冻干燥。
可以将诸如麦芽糖糊精和抗氧化剂的试剂添加至本发明的水溶性鲍鱼提取物。
实施例1至3描述了产生本发明的水溶性鲍鱼提取物的方法。
5.3本发明的水溶性鲍鱼提取物
上文描述的本发明的方法产生了富含肽、特别是低分子量肽的水溶性鲍鱼提取物。本文使用的术语“低分子量肽”意指重量为5kDa或更小的肽。
提取物具有可接受的味道，无苦味。可以不使用冷冻沉淀法冷冻提取物。干燥储存时鲍鱼提取物的粉末溶解特性不变。
本发明的水溶性鲍鱼提取物主要包含肽，特别是低分子量肽。由实施例1至3中产生的提取物的分子量分布中可见，所述提取物中存在的超过90％的肽小于5KDa。
本发明的水溶性鲍鱼提取物相比未水解的鲍鱼材料包含更多的化合物，如图13至20可见，其显示出对本发明的提取物以及鲍鱼渣和鲍鱼全粉起始材料进行的LC-MS分析的结果。
在一个实施方案中，基于固体，水溶性鲍鱼提取物包含至少约45wt％的肽，优选低分子量的肽。
在另一个实施方案中，基于固体，水溶性鲍鱼提取物包含至少约45wt％至约65wt％的肽，优选约50wt％至约60wt％的肽。
在一个实施方案中，大于90wt％，优选大于95wt％的肽小于5KDa。
在一个实施方案中，大于75wt％，优选大于80wt％的肽小于2KDa。
在一个实施方案中，大于35wt％，优选大于40wt％的肽小于1KDa。
还可以存在一些碳水化合物材料、脂质以及其他材料和矿物质。
所述提取物的肽含量是基于所存在的“固体”进行计算的，以便不受其浓度影响。提取物中存在的“固体”构成了当去除所存在的包括水在内的任何溶剂时剩余的材料。存在的“固体”包括肽、碳水化合物和脂质，以及任何其他非溶剂材料。
本发明的提取物的溶解度为至少45％(w/v)。可以通过使水饱和提取物(1:1比例)，离心，然后将得到的上清液干燥以确立溶解的重量，从而测定溶解度。
在一个实施方案中，本发明的水溶性鲍鱼提取物是干燥的粉末。
排除添加至提取物中的诸如麦芽糖糊精和抗氧化剂的固体赋形剂来计算提取物中存在的肽的wt％。
在一个实施方案中，本发明提供了水溶性鲍鱼提取物，基于固体，其包含至少约45wt％的肽，其中大于90wt％的肽小于5KDa。
在另一个实施方案中，本发明提供了水溶性鲍鱼提取物，基于固体，其包含约50wt％至约60wt％的肽，其中大于95wt％的肽小于5KDa。
5.4本发明的水溶性肽提取物的用途
炎症是涉及改变有机体的生理学的分子信号和细胞信号的复杂生物级联的过程。虽然急性炎症在物理损伤或感染之后保护并治愈身体，但是慢性炎症导致了在许多变性疾病中发挥关键作用的变化。慢性炎症主要由单核细胞和长寿命的巨噬细胞介导。巨噬细胞释放化学介质，包括IL-1、IL-6家族、TNFα和前列腺素。这些介质触发其他促炎细胞因子的上调。IL-1、IL-6和TNFα是主要的在发炎细胞中比在静息细胞中具有更高水平的炎性生物标记。
细菌或外来颗粒的吞噬作用与中性粒细胞摄取的氧的增加(其被称为呼吸爆发)有关。在该期间，产生了活性氧(ROS)，例如羟基自由基、过氧化物阴离子、单线态氧和过氧化氢。这些物质杀死了入侵的微生物或寄生虫。
营养品可以通过多种机制抑制或减轻炎症过程，所述机制包括阻断诸如IL-1和TNFα的促炎性细胞因子的表达，抑制ROS生成酶的活性或者增强ROS清除能力。
如实施例4所述，已经发现本发明的水溶性鲍鱼提取物对已知的炎症标记具有活性，因此认为其减轻或预防炎症。显示出的活性比未水解的起始鲍鱼材料(例如全粉或渣体)的抗炎活性大数倍，如表5和表6所示。
一方面，本发明提供了减轻有需要的个体的炎症的方法，所述方法包括向该个体施用治疗有效量的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
另一方面，本发明提供了预防、治疗或管控有需要的个体的与炎症相关的疾病状态的方法，所述方法包括向该个体施用治疗有效量的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
另一方面，本发明提供了本发明的水溶性鲍鱼提取物在制备用于减轻有需要的个体的炎症的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了本发明的水溶性鲍鱼提取物在制备用于预防、治疗或管控有需要的个体的与炎症相关的疾病状态的药物中的用途。
本发明还提供了用于减轻有需要的个体的炎症的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
本发明还提供了用于预防、治疗或管控有需要的个体的与炎症相关的疾病状态的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
在一个实施方案中，与炎症相关的疾病状态是慢性疾病状态。
在另一个实施方案中，与炎症相关的疾病状态升高了炎性标记TNFα和/或IL-1β的水平。
根据本发明可以预防、治疗或管控的与炎症相关的疾病状态的实例包括但不限于哮喘，脑炎，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎在内的炎性肠病，慢性阻塞性肺病(COPD)，变应性病症，纤维化，包括青少年关节炎、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎和骨关节炎的关节炎，银屑病，多肌痛，肌腱炎，滑囊炎，喉炎，齿龈炎，胃炎，耳炎，乳糜泻，憩室炎，动脉粥样硬化，心脏疾病，肥胖，糖尿病，癌症和阿尔兹海默病。
本发明还提供了降低有需要的个体的炎性标记TNFα和/或IL-1β的水平的方法，所述方法包括向该个体施用治疗有效量的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
需要预防、治疗或管控与炎症相关的疾病状态的个体是诊断患有此类疾病状态、处于患有此类疾病状态的风险或者已从此类疾病状态恢复的个体。个体可以由于基因因素和/或环境因素易患有所述疾病状态和/或处于患有所述疾病状态的风险。
在一个实施方案中，个体是哺乳动物，优选是人。在另一个实施方案中，个体是陪伴动物或马。
本发明的水溶性鲍鱼提取物的施用可以经由药物组合物或营养品组合物进行。
一方面，本发明提供了营养品组合物，其包含本发明的水溶性鲍鱼提取物和一种或多种可消耗的赋形剂。
在一个实施方案中，本发明的营养品组合物是食品组合物、食品添加剂组合物、膳食补充剂或医疗食品组合物。
本文使用的术语“可消耗的”通常意指适于或者经政府监管机构批准被动物和人所消耗。
本文使用的术语“食品”意指任何的旨在被包括人在内的动物消耗的经加工的、半加工的或未加工的物质，并且包括但不限于饮料和咀嚼胶。本发明的食品组合物包含与食品组合的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
本文使用的术语“食品添加剂”是指任何的通常不单独作为食品被消耗但为了技术目的被添加至食品中的物质。实例是天然的和人造的甜味剂、着色剂、固化剂和酸洗剂、调味剂、乳化剂、脂肪替代物、硬化剂、发酵剂、润滑剂、湿润剂、防腐剂、稳定剂和增稠剂。本发明的食品添加剂组合物包含与一种或多种食品添加剂组合的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
本文使用的术语“膳食补充剂”是指旨在补充饮食的产品，其包括一种或多种以下成分：维生素、矿物质、草本植物、代谢物、提取物等。膳食补充剂通常不旨在用作膳食的唯一项目，但可以独立于任何食品被消耗。本发明的膳食补充剂包含与一种或多种膳食补充剂组合的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
本文使用的术语“医疗食品”是指在医师的监督下被配制为肠内消耗或施用的食品。医疗食品旨在用于具有特殊营养要求的疾病状态的膳食管理。医疗食品的实例包括但不限于唯一来源的营养产品、口服补液溶液以及旨在用于代谢紊乱的膳食管理的产品。本发明的医疗食品组合物包含与医疗食品组合的本发明的水溶性鲍鱼提取物。
在一个实施方案中，本发明的营养品组合物是食品组合物。本发明的水溶性提取物适用于食品应用，因为其气味和味道是可接受的，并且因此可以直接添加至食品中。不同于其他的鲍鱼产品，其不需要被包封。
在一个实施方案中，食品组合物是焙烤食品，包括但不限于面包、比萨饼饼底、蛋糕、松饼、炸面圈、饼干、玉米饼、卷饼、印度烤饼、面条和意大利面。
在另一个实施方案中，食品组合物是液体食品，包括奶、果汁、冰沙、酸奶、汤和软饮料。还可以将本发明的水溶性鲍鱼提取物添加至诸如速溶汤、饮料、布丁和蛋糕粉的干燥的混合物中。
一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的水溶性鲍鱼提取物和一种或多种药物可接受的赋形剂。
本文使用的术语“药物可接受的”意指由政府监管机构批准用于动物，特别是人。
本文使用的术语“赋形剂”包括储存、运输或施用本发明的水溶性鲍鱼提取物时使用的介质、载体、稀释剂、佐剂、稳定剂或填充剂。适合的赋形剂是药学领域的技术人员所熟知的，并且包括但不限于淀粉(及其衍生物，例如麦芽糖糊精)、葡萄糖、蔗糖、面粉、硅胶、甘油、氯化钠、水、抗坏血酸和乙醇。具体的赋形剂是否适于掺入本发明的药物组合物将取决于施用剂型的方式。
本发明的药物组合物可以通过任何适合的途径施用，包括但不限于肠胃外、口服、鼻内、局部、经皮、经粘膜和经直肠的途径。
剂型的组成和形状通常根据用法而改变。剂型的实例包括但不限于片剂、胶囊、丸剂(pills)、小丸剂(pellets)、含液体的胶囊、锭剂、糖锭剂、分散剂、栓剂、鼻用喷雾剂或吸入剂、胶体、悬浮液、乳剂、溶液剂和酏剂。
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的水溶性鲍鱼提取物的口服剂型。因为其容易施用，无论作为营养品组合物还是药物组合物，口服剂型是优选的。通过将干燥的本发明的水溶性鲍鱼提取物与至少一种适用于固体口服剂型的赋形剂组合来制备典型的口服剂型。然后将产物成形为期望的剂型。
此类赋形剂包括但不限于稀释剂、制粒剂、润湿剂、助悬剂、填充剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。
粘合剂的实例包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉；明胶；诸如阿拉伯胶和瓜尔胶的胶；海藻酸钠；粉末状黄芪胶；纤维素及其衍生物，包括羧甲基纤维素、预胶化的纤维素、羟丙基纤维素和微晶纤维素。填充剂的实例包括但不限于滑石、碳酸钙颗粒或粉末、微晶纤维素、粉末状纤维素、葡萄糖结合剂、高岭土、甘露醇、山梨醇和淀粉。崩解剂确保了片剂在暴露于水性环境时崩解。实例包括但不限于琼脂、碳酸钙、海藻酸、交联羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、预胶化的淀粉、黏土和胶。润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、月桂基硫酸钠、氢化植物油和琼脂。润湿剂包括但不限于卵磷脂和聚氧乙烯硬脂酸酯。助悬剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、甲基纤维素和海藻酸钠。
可以通过压制或模印来制备片剂。本发明的口服应用的剂型还包括咀嚼片剂、硬胶囊或软胶囊。
用于口服施用的液体制剂包括但不限于溶液、糖浆或悬浮液，并且可以作为在使用前用水或另一合适介质进行重组的干燥产品存在。
在预防、治疗或管控与炎症相关的疾病状态中有效的本发明的水溶性鲍鱼提取物的量将随着以下因素改变：疾病或疾病状态的性质和严重程度，以及施用提取物的途径，以及特定于个体的因素，例如其年龄、体重、性别和既往病史。
通常，在与炎症相关的疾病状态的急性治疗中使用的剂型将包含比用于治疗慢性疾病状态时更大量的本发明的水溶性鲍鱼提取物。类似地，肠胃外剂型可以含有比口服剂型更少的水溶性鲍鱼提取物。药学领域的技术人员容易了解具体剂型的配制。我们参考了Remington's Pharmaceutical Sciences,Allen,等人,第22版。ISBN 978-0-85711-062-6。
本领域技术人员可以从来源于体外或动物模型测试的剂量反应曲线预计有效量。通常，本发明的水溶性鲍鱼提取物的有效量为每天约100mg至约3000mg，作为单一日剂量，或者作为一天内的分剂量。
现在将通过参考以下实施例以非限制性方式示例性说明本发明的各方面。
6.实施例
6.1材料和方法
Oxyless U源自Naturex(Avignon,France)。麦芽糊精(Maltrin 100或150)来自New Zealand Starch(Auckland,NZ)。Celite HyFlo和Celite 545来自Imerys FiltrationMinerals Inc.(San Jose,California,USA)。Enzidase papain 6000L、Enzidase FP和Enzidase Neutral来自Zymus(Auckland,NZ)。Alcalase来自Novozymes(Bagsvaerd,Denmark)。
所有其它化学品和试剂为标准的实验室用品。
尺寸排阻HPLC设置
柱：YarraTM 3μm SEC-2000(Phenomenex)。
样品制备：
1.将冻干的提取物样品以10mg/mL的浓度溶解在100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中。
2.以在磷酸盐缓冲液中的4份样品与一份10％ SDS的比例稀释溶液以产生2％SDS的终浓度。
3.在50℃加热5分钟。
4.在13 000rpm下离心5分钟。
5.将上清液装入小瓶中以在HPLC上运行。
肽的SE-HPLC的运行条件：
参数 设置
运行缓冲液 100mM磷酸钠缓冲液，pH 6.8，以及0.5％ SDS
流速 1mL/min
温度 20℃
进样体积 推荐10μL，但如果需要，多达100μL。
上样 推荐上样约100μg
运行时间 20分钟
检测 205nm
最大压力 1000psi
6.2提取鲍鱼以产生本发明的水溶性提取物
根据下文提供的实施例处理各种鲍鱼(黑足鲍)源。方法和样品代码总结于下表1中：
表1：样品代码和方法的概述
实施例1：鲍鱼超临界渣体(PAR 39)的提取
将来源于冻干鲍鱼(160g)的超临界CO2提取的渣体悬浮在600ml水中。添加Oxyless U抗氧化剂(0.25g)。添加Alcalase(2.5ml)和Enzidase Neutral(2.5ml)，并将混合物在振荡水浴中加热至60℃，保持3hr。然后，添加Enzidase FP(0.125g)，并在60℃下于振荡水浴中继续水解另外1hr。
将水解混合物在95℃下加热另外30min，然后以10000rpm离心30分钟，然后回收上清液(500ml)。用磷酸将上清液的pH调节至pH 4。添加活性炭(2g)。使用硅藻土(20g预覆盖+20g主体加料)通过Seitz900过滤板过滤上清液。回收滤液(450ml)，并将其与麦芽糊精和Oxyless U抗氧化剂混合。将所得的溶液冻干以产生固体产物(鲍鱼渣提取物)。
鲍鱼渣提取物为完全水溶性的。回收了鲍鱼渣中存在的42％的固体。产品的分子量分布显示在下表2中：
表2：鲍鱼渣提取物的肽的分子量分布
实施例2：鲍鱼全粉(PAR 36)的提取
将冻干的粉末状鲍鱼内脏材料(160g)悬浮在600ml水中。添加Oxyless U抗氧化剂(0.25g)，并将pH从5.5调节至8.0。添加Alcalase(2.5ml)和Enzidase Neutral(2.5ml)，并将混合物在振荡水浴中加热至60℃，保持3hr。然后，添加Enzidase FP(0.125g)，并在60℃下于振荡水浴中继续水解另外1hr。
将水解混合物在95℃下加热另外40min，然后以10000rpm离心30分钟，然后回收上清液(505ml)。用磷酸将上清液的pH调节至pH 4。添加活性炭(2g)。使用硅藻土(20g预覆盖+20g主体加料)通过Seitz 900过滤板过滤上清液。回收滤液(435ml)，并将其与麦芽糊精和Oxyless U抗氧化剂混合。将所得的溶液冻干以产生固体产物(鲍鱼全粉提取物)。
GSM全粉提取物为完全水溶性的。回收了在鲍鱼材料中存在的41％的固体。产品的分子量分布显示在下表3中：
表3：鲍鱼全粉提取物的肽的分子量分布
实施例3：鲍鱼超临界渣体(中试规模)PAR 44的提取
将来源于鲍鱼(10.0kg)的超临界CO2提取的渣体悬浮在150L水中。添加Oxyless U抗氧化剂(16g)，并将pH从5.6调节至8.0。添加Alcalase(148ml)和Enzidase Neutral(160ml)，并将混合物在振荡水浴中加热至59℃，保持3hr。然后，添加Enzidase FP(32g)，并在60℃下于振荡水浴中继续水解另外1hr。
将水解混合物在80℃下加热另外20min，然后通过液体-沉渣分离器离心(2x)，然后回收上清液(135L)。用磷酸将上清液的pH调节至pH 4。添加活性炭(60g)。使用硅藻土(940g预覆盖+1070g主体加料)通过Seitz 900过滤板过滤上清液。回收滤液(144L)，并将其与麦芽糊精(1.6kg)和Oxyless U抗氧化剂(16g)混合直至溶解。将所得的溶液冻干以产生6.3kg固体产物(鲍鱼渣提取物)。
鲍鱼渣提取物为完全水溶性的。回收了鲍鱼材料中存在的66％的固体。产品的分子量分布显示在下表4中：
表4：鲍鱼渣提取物的肽的分子量分布
获得PAR 44的近似组成。如AOAC 945.15,19th Edition中所述的重量分析法，将样品在103℃下干燥16小时。如AOAC 942.05,19th Edition中所述的重量分析法，通过在600℃的马弗炉中燃烧6小时测定灰分。使用AOAC 992.15,19th Edition中所述的杜马斯燃烧法确定总氮。基于AOAC 992.15,19th Edition中的总氮×6.25计算总蛋白。还基于6.75的因数(其更适于高度水解的蛋白，其中横跨肽键已经添加了大量的水)给出了总蛋白的数值。使用Bligh,E.G.,&Dyer,W.J.(1959)"A rapid method of total lipid extractionand purification",Can.J.Biochem.and Physiol.,37(8),911-917中的方法测定脂质。
结果显示在下表5中。
表5：PAR 44的近似组成
数值为g/100g冻干的材料而无任何添加剂。
6.3本发明的水溶性鲍鱼提取物的抗炎活性
实施例4：在单核细胞THP-1细胞中TLR4(LPS)刺激的IL-1β和TNFα分泌的抑制
IL-1β和TNFα为炎症反应的关键介质。它们引发了一系列的调节身体自然防御入侵的微生物或创伤的事件。在正常条件下，这些促炎细胞因子是局部的和短暂的。然而，在慢性炎性疾病状态中，它们的表达被延长，并且在某些情况下，遍及全身散布。这保持促炎反应，并且成为免疫细胞的异常募集和活化的基础。
因此，在慢性炎性疾病状态中限制IL-1β和TNFα的表达和生物活性将抑制慢性炎症。此外，在慢性炎症期间，多种免疫细胞显示出表达IL-1β和TNFα。然而，它们的表达的触发因素是非常多样的，并且它们是针对入侵的微生物的异常免疫细胞信号传导的结果。
作为自然防御系统的一部分，人类已经开发了复杂的细胞表面标志物，包括被称为Toll样受体(TLR)的群组，其识别异物并引发适当的细胞防御过程。
利用在单核细胞性免疫细胞中活化TLR4的细菌配体以上调IL-1β和TNFα的表达，以探索鲍鱼提取物在抑制慢性炎性疾病状态中的这些促炎细胞因子的表达方面的功效。
方法学：在哺乳动物细胞培养条件下，将在含有10％FBS(胎牛血清)的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培养基中生长的单核细胞的细胞系THP-1(2×106个细胞/mL)与TLR4-脂多糖[LPS](0.5-50ng/mL)孵育6小时。收集上清液，并使用商购的ELISA测量IL-1β和TNFα的产生。使用最佳剂量的TLR4(～70％的最大生物活性)来检查鲍鱼提取物对IL-1β和TNFα分泌的作用。使用已知的免疫抑制剂-地塞米松(0.001-10uM或0-3.925μg/mL)来验证该生物测定。
评估了在慢性炎症情况下鲍鱼提取物在减弱IL-1β和TNFα表达中的有效性。最初用最佳剂量的TLR4刺激THP-1细胞30分钟以引起IL-1β和TNFα表达的上调。然后，添加鲍鱼提取物(通常为1-100μg/mL)并与细胞孵育另外6hr。然后，收集培养基(通过使细胞沉降)并通过ELISA测量IL-1β和TNFα分泌。数据被计算为细胞因子pg/mL，并且表示为TLR4-刺激的IL-1β或TNFα分泌的抑制百分数。
结果显示在图1-8中。所有测试的水溶性鲍鱼提取物均显示出抗炎活性。
图9-12显示了在上述测定中未水解的鲍鱼材料的作用。
下表5显示了当在测定中以100μg/mL应用时，在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中各种鲍鱼产物对IL-1β的抑制的作用。在添加至测定之前，将冻干的产物重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或二甲基亚砜(DMSO)中。
对于各列，相对于被指定为数值1的可溶性提取物的作用(最高抑制)来表示结果。
表5：相对抑制
下表6显示了当在测定中以100μg/mL应用时，在TLR4(LPS)刺激的单核细胞THP-1细胞中各种鲍鱼产物对TNFα的抑制的作用。在添加至测定之前，将冻干的产物重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或二甲基亚砜(DMSO)中。
对于各列，相对于被指定为数值1的可溶性提取物的作用(最高抑制)来表示结果。
表6：相对抑制
实施例5：鲍鱼渣、全粉和本发明的水溶性提取物的LC-MS分析
方法
在0.5％的甲酸水溶液中在涡流的帮助下，使样品成比例分配并混合以溶解极性组分，然而一些样品保持一些未溶解的固体，正如以下表7中所示。
表7：样品的浓度和溶解性
LC-MS系统由Thermo Electron Corporation(San Jose,CA,USA)FinniganSurveyor MS泵、Thermo Accela Open Auto取样器(带有DLW的PAL HTC-xt)、FinniganSurveyor PDA plus检测器和ThermaSphere TS-130柱加热器(Phenomenex,Torrance,CA,USA)组成。
通过保持在30℃的水性正相色谱(CogentTMDiamond-HydrideTM,4μm,150×2.1mm,MicroSolvTMTechnologies Corporation,USA)，用由0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸的乙腈溶液(B)组成的流动相以200μl/min的流速分离各制备的提取物的2μL等分试样。施加以下梯度：0-2min，5％A；30-39.5min，90％A；40-45min，5％A。
对于具有进行MS的产物离子的在m/z为100–2000amu范围内的前体质量(precursor masses)，在负正模式中利用电喷雾电离(ESI)通过API-MS(LTQ,2D线性离子阱,Thermo-Finnigan,San Jose,CA,USA)获得数据。
结果显示在图13-20中。本发明的水溶性提取物的LC-MS色谱图(图13、14、17和18)表明更复杂的组成，具有比在起始的鲍鱼材料的LC-MS色谱图(图15、16、19和20)中观察到的更多的峰。
7.工业实用性
本发明的水溶性鲍鱼提取物和包含它们的组合物可以被添加至食品或膳食补充剂中以增加其健康益处。它们的水溶性和可接受的味道允许将它们直接掺入到广泛的可消耗的产品中。产品可能是以下形式：片剂、胶囊、饮料健康‘球’(beverage health‘shots’)、预混汤补品和作为功能性食品的组分，例如可口的健康食品棒。
也可以将它们用作药剂来帮助预防、治疗或管控与炎症相关的疾病状态。

Claims (18)

1.水溶性鲍鱼提取物。
2.如权利要求1所述的水溶性鲍鱼提取物，基于固体，其包含至少约45wt％的肽。
3.如权利要求1所述的水溶性鲍鱼提取物，基于固体，其包含约45wt％至约65wt％的肽。
4.如权利要求1至3中任一项所述的水溶性鲍鱼提取物，其中大于90wt％的肽小于5KDa。
5.如权利要求1至4中任一项所述的水溶性鲍鱼提取物，基于固体，其包含不大于约5wt％的脂质。
6.如权利要求1至5中任一项所述的水溶性鲍鱼提取物，其中所述鲍鱼选自黑足鲍(Haliotis iris/Blackfoot paua)、澳洲鲍(Haliotis australis/Silver paua/Yellowfoot paua)和少女鲍(Haliotis virgenea)。
7.产生水溶性鲍鱼提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用一种或多种蛋白水解酶水解鲍鱼材料的水性悬浮液；
(b)使水解混合物中的酶变性，以及
(c)从所述水解混合物中去除不溶材料，以提供水溶性鲍鱼提取物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述蛋白水解酶具有弱酸性至约中性的pH最佳条件。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述蛋白水解酶选自木瓜蛋白酶、Alcalase、Enzidase FP和Enzidase Neutral。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述鲍鱼材料选自完整新鲜鲍鱼、鲍鱼粉和鲍鱼超临界渣体。
11.如权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述鲍鱼选自黑足鲍(Haliotisiris/Blackfoot paua)、澳洲鲍(Haliotis australis/Silver paua/Yellow foot paua)和少女鲍(Haliotis virgenea)。
12.通过权利要求7至11中任一项所述的方法产生的水溶性鲍鱼提取物。
13.药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的水溶性鲍鱼提取物和一种或多种药物可接受的赋形剂。
14.营养品组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的水溶性鲍鱼提取物和一种或多种可消耗的赋形剂。
15.如权利要求14所述的营养品组合物，其为食品组合物、食品添加剂组合物、膳食补充剂或医疗食品。
16.减轻有需要的个体的炎症的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的权利要求1至6中任一项所述的水溶性鲍鱼提取物。
17.预防、治疗或管控有需要的个体的与炎症相关的疾病状态的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的权利要求1至6中任一项所述的水溶性鲍鱼提取物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述与炎症相关的疾病状态选自哮喘，脑炎，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎在内的炎性肠病，慢性阻塞性肺病(COPD)，变应性病症，纤维化，包括青少年关节炎、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎和骨关节炎在内的关节炎，银屑病，多肌痛，肌腱炎，滑囊炎，喉炎，齿龈炎，胃炎，耳炎，乳糜泻，憩室炎，动脉粥样硬化，心脏疾病，肥胖，糖尿病，癌症和阿尔兹海默病。
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