CN109486892B - 一种提高机体免疫力的鲍鱼肽及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高机体免疫力的鲍鱼肽及其制备方法与应用，所述鲍鱼肽的制备包括如下步骤：(1)取鲍鱼肉，加入去离子水通过打浆得含粗蛋白的浆液；(2)向所述浆液中加入去离子水，以得到蛋白浓度为1mg/ml‑5mg/ml的蛋白溶液；(3)向所述蛋白溶液中加入4000‑8000U/g的蛋白酶，在45‑65℃的温度下酶解1‑5h，得鲍鱼肽粗品。本发明所提供的方法利用蛋白酶对鲍鱼蛋白进行酶解，得到所述鲍鱼肽，具有提高免疫力和应激能力的优势。

Description

一种提高机体免疫力的鲍鱼肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种提高机体免疫力的鲍鱼肽及其制备方法与应用。
背景技术
鲍鱼自古被誉为海味珍品之冠，素有“一口鲍鱼一口金”之说，是一类符合现代人追求的高蛋白、低脂肪的高级海鲜。
鲍鱼其名为鱼，实则非鱼，是种属原始海洋贝类，单壳软体动物。是名贵的“海珍品”之一，味道鲜美，营养丰富，被誉为“软黄金”。鲜品可以食用的部分蛋白质24％，脂肪0.44％；干品含蛋白质40％，糖元33.7％，脂肪0.9％以及多种维生素和微量元素，是一种对人体非常有利的高蛋白，低脂肪食物。因富含谷氨酸，味道非常鲜美。被誉为“餐桌黄金，海珍之冠”，其肉质细嫩，营养丰富。
鲍鱼一直是中国的传统名贵食材，具有很高的营养价值，并且具有很高的药用价值，富含蛋白质、肝糖、多种氨基酸、维生素、微量元素及其他生理活性物质(其中,具有双向性调节血压的作用)。在中国古代，《本草纲目》中就有记载，鲍鱼味甘，性平，有清热明目、补虚滋阴、养血益胃、补肝益皆，故有＂明目鱼＂之棘。有关鲍鱼记载的还有《药典》、《名医别录》和《黄帝内经》等等。随着对鲍鱼的深入研究，鲍鱼的药用价值也为现代医学认可。
多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，具有安全、副作用小、用量小、功能多样、特异性强等特点，在细胞生理及代谢功能的调节上具有重要的作用。肽具有极强的活性和多样性，可全面调节人体生理功能，增强人体生理活性。肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，而且具有特殊的生物学功能，可防治血栓、高血脂、高血压、延缓衰老，抗疲劳，提高机体免疫力，促进人体对蛋白质、维生素、氨基酸等营养物质和钙、铁、锌、硒、镁、铜等多种有益的微量元素的吸收。经酶解鲍鱼蛋白产生的鲍鱼肽更易吸收利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鲍鱼肽的制备方法。具体地，该方法包括如下步骤：
1)取鲍鱼肉，加入去离子水通过打浆得含粗蛋白的浆液；
2)向所得浆液中加入去离子水，以得到蛋白浓度为1mg/ml-5mg/ml的蛋白溶液；
3)向所得蛋白溶液中加入4000-8000U/g的蛋白酶，在45-65℃的温度下酶解1-5h，得鲍鱼肽粗品。
优选地，所述蛋白酶选自以下中的一种或多种：中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶.
优选地，所述蛋白酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶以重量比1-2:1(优选为1.5:1)组成的复合酶。该复合酶的水解能力最大，因此将该复合酶作为酶解法制备鲍鱼肽的最佳酶制剂。
优选地，所述蛋白酶的加入量为5000-7000U/g，更优选为6000U/g。在该加入量下，能够得到最大的肽得率，之后随着酶加量的增加肽得率的变化趋势趋于缓慢。
优选地，所述酶解在50-60℃的温度下进行，优选为55℃。该温度下，鲍鱼肽的得率最大，具有维持复合酶分子结构次级键稳定的优点，进一步维持复合酶的活力。
优选地，所述酶解的时间为2-4h，优选为3h。
酶解时间会影响蛋白的酶解反应，时间短酶解反应不彻底，时间过长又有可能出现过度水解，因此确定酶解时间很重要，在该酶解时间内，随着酶解时间的延长，鲍鱼肽得率逐渐升高，在3h时肽得率的变化趋势趋于缓慢。所以，从肽得率和成本两方面考虑，酶解时间优选为3h。
优选地，步骤2)中，当所述蛋白酶为中性蛋白酶时，所述蛋白溶液的pH为7-8；当所述蛋白酶为碱性蛋白酶时，所述蛋白溶液的pH为9-12；当所述蛋白酶为风味蛋白酶时，所述蛋白溶液的pH为6-8；当所述蛋白酶为胃蛋白酶时，所述蛋白溶液的pH为2-3；当所述蛋白酶为木瓜蛋白酶时，所述蛋白溶液的pH为7-9；当所述蛋白酶为胰蛋白酶时，所述蛋白溶液的pH为7-9。
优选地，步骤2)中，所述pH用HCl和/或NaOH进行调整。
优选地，所述方法还包括对步骤3)所得鲍鱼肽粗品进行纯化的步骤。
优选地，所述纯化步骤具体为：酶解完成后，在80-120℃的热水浴中保持10-20min使所述蛋白酶失活，将所得酶解液经过2000-6000r/min离心10-30min，得到酶解上清液，冷冻干燥，即得所述鲍鱼肽。
本发明同时提供了上述方法制备得到的鲍鱼肽，所述鲍鱼肽的分子量范围为：1#分子量0.5kDa-1.0kDa，2#分子量1.0kDa-1.5kDa，3#分子量1.5kDa-2.0kDa或4#分子量2.0kDa-，优选所述鲍鱼肽的分子量为1.5kDa-2.0kDa(具有更理想的应用活性)。
本发明同时提供了上述鲍鱼肽在提高机体免疫力和应激能力的应用，尤其是在制备提高机体免疫力和应激能力的食品、药品及保健品中的应用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明所用到的材料及设备的名称及来源如下：
蛋白酶：
Figure BDA0001936379910000041
实验仪器：
Figure BDA0001936379910000042
①指标的测定
a.蛋白质的总氮含量测定(采用GE/T5009.5-2003)
准确称取鲍鱼粗蛋白0.5-1.0g，置于干燥洁净的500ml凯氏定氮消化管中。然后加入经过研磨的硫酸铜0.2g、硫酸钾6g和浓硫酸10ml，轻轻摇匀后，把消化管放入消化炉进行消化操作。首先设定250℃，待全部炭化消化管中内容物，泡沫几乎不再产生，然后再改为450℃，保持瓶内液体微沸进行消化处理，使液体变为蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min后停止加热(特别注意：这里继续通冷却水直至完全冷却)。冷却，把消化管放在自动凯氏定氮仪进行自动蒸馏操作，蒸馏结束后，然后用少量去离子水清洗氨气和硫酸出口管下端外部，接着取下接收瓶，再向接收瓶内加入1-2滴混合指示剂(甲基红和溴甲酚绿)。然后用盐酸标准溶液(0.1mol/L)滴定至粉红色为终点，记录所滴定的盐酸标准溶液体积。同时，准确吸取相同量的试剂空白消化液按上述方法操作。
计算公式如下：
X(100％)＝(V1-V2)*C*0.014*6.25*100/W
式中：X：粗蛋白中蛋白质总氮的百分含量；
V1：粗蛋白试样消耗盐酸标准溶液的体积，mL；
V2：试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积，mL；
C：盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
0.014：与1.0mL盐酸标准滴定溶液(1.000mol/L)相当的氮质量
b.氨基态氮的测定
酸度计甲醛滴定法的原理；氨基酸含有氨基和羧基，具有酸碱两性，加入甲醛的氨基酸中的氨基作用，可消除其碱性，使羧基显示出酸性，然后用氨氧化钠标准溶液滴定，以酸度计指示为终点，即可对氨基酸的含量进行测定。
反应式如下：
R-CH(NH2)-COOH+HCHO→R-CH(NH2-CH2OH)+H2O
试剂：36％甲醛溶液；0.05mol/L氢氧化钠标准溶液
仪器：酸度计；磁为揽拌器；10ml微量碱式滴定管
具体操作步骤：取5ml酶解溶液的上清液置于50ml的容量瓶中，加去离子水至刻度线，即得到待测溶液。准确量取20ml的溶液置于200ml烧杯中，加去离子水60ml，然后插入pH计的玻璃电极，启动磁力揽拌器使溶液揽拌均匀，再用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定到酸度计指示到pH值8.2，然后再向上述液体中加入36％甲醛溶液10ml，混匀半分钟，再用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定到pH值9.2，记录后一操作用去的氢氧化钠标准溶液的体积，用作计算氨基酸态氮含量。
同时，做一空白组实验，除不加样液外，其他同上。
计算：
Figure BDA0001936379910000061
式中：
V1：测定用的样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准液的体积，mL；
V2：试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准液的体积，mL；
V3：样品稀释液取用体积，mL；
C：氢氧化钠标准液的浓度，mol/L；
0.014：1ml浓度为1.000mol/L氢氧化钠标准溶液相当于氮的质量(g)
e.水解度的计算公式
Figure BDA0001936379910000062
实施例1
本实施例提供了一种鲍鱼肽的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)取鲍鱼肉，加入去离子水通过打浆机打浆得含粗蛋白的浆液；
2)向所得浆液中加入去离子水并用HCl和/或NaOH调节pH为5.5，以得到蛋白浓度为4％的蛋白溶液；
3)向所得蛋白溶液中加入胰蛋白酶和碱性蛋白酶以6:4的重量比的复合酶，复合酶的加入量为6000U/g，在55℃的温度下酶解3h，得鲍鱼肽粗品；
4)酶解完成后，在100℃的热水浴中保持15min使所述蛋白酶失活，将所得酶解液经过4000r/min离心20min，得到酶解上清液，冷冻干燥，即得所述鲍鱼肽。
本实施例所制得的鲍鱼肽粗品经分析纯度为87.4％。
实施例2
本实施例提供了一种鲍鱼肽的制备方法。与实施例1相比，区别仅在于，本实施例所述蛋白酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶以5:4的重量比的复合酶。
本实施例所制得的鲍鱼肽的纯度为75％，杂质占比较大。这不仅为后期的纯化增加了成本同时缺乏鲍鱼肽的安全性，其限制了鲍鱼肽的应用。
实施例3
本实施例提供了一种鲍鱼肽的制备方法。与实施例1相比，区别仅在于，本实施例的酶解时间为2h。
本实施例所制得的鲍鱼肽酶解不彻底，肽得率较低。这无形中增加了成本和不利用工业化大生产。
对比例1-6
对比例1-6提供了一种鲍鱼肽的制备方法。与实施例1相比，区别仅在于，分别以单一的风味蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶酶替换实施例1中的复合酶(用量相当)，并相应地调整pH和温度，其水解度如表1所示：
表1
Figure BDA0001936379910000081
对比例7
本实施例提供了一种鲍鱼肽的制备方法。与实施例1相比，区别仅在于，本对比例复合酶中胰蛋白酶和碱性蛋白酶的用量比为4：6。
本对比例制得的鲍鱼肽的纯度为65％，纯度较低。未知杂质带来的副作用无法控制，因此无法在进行下一步的应用。
对比例8
本实施例提供了一种鲍鱼肽的制备方法。与实施例1相比，区别仅在于，本对比例中的离心条件为2000r/min离心10min，得到酶解上清液，冷冻干燥。
本对比例制得的鲍鱼肽的纯度为80％。
实验例1活性成分测定
1.测活-初筛
将之前复合蛋白酶酶解的鲍鱼粗蛋白，利用被分离的分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点，采用有一定孔径的网络结构的交联葡聚凝胶，大分子物质先出，小分子物质后出。分别标记为四个片段：1#分子量0.5kDa-1.0kDa，2#分子量1.0kDa-1.5kDa，3#分子量1.5kDa-2.0kDa，4#分子量2.0kDa-。
根据《保健食品检验与评价技术规范》(卫生部2003年版)，对活性片段免疫力功能的增强进行测定。
1.1碳粒吞噬实验
小鼠末次使用30min后，尾静脉注射印度墨汁5ml/kg.bw，1min和5min后分别从眶后静脉丛取血20μl，溶于2ml 0.1％Na2CO3中，用721A分光光度计于540nm测吸光度，计算吞噬指数，结果见表2。
表2
组别 剂量(ml/kg.bw) 吞噬指数 提高率％
空白 5 3.02±0.21
1# 5 3.44±0.25 6.6
2# 5 3.54±0.28 7.9
3# 5 3.85±0.33 14.8
4# 5 3.50±0.26 8.7
1.2血清溶血素测定
于给受试物第26天，给小鼠腹腔注射2％SRBC(0.2ml/只)，于免疫后第五天摘眼球采血，分离血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝板内，每孔100μl，再加人100μl 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，37℃孵育3小时进行血清溶血素测定。统计血球凝集度，计算相应抗体积数，各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析，结果见表3。
表3
Figure BDA0001936379910000091
由上表可见，中剂量组小鼠抗体积数较溶剂对照组显著增高，且与溶剂对照组比较差异有高度显著性(P＜0.01)高、低剂量组小鼠抗体积数与溶剂对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。综合上面两个实验，3#片段蛋白的应激能力和免疫能力最强。
实验例2
测定活性-免疫力实验
将上述的鲍鱼肽(实施例1制得，3#，分子量在1.5kDa-2.0kDa)测定活性，做完整的动物实验。
1、剂量选择
将200只雌性小鼠共五组(分8项试验)，每组用40只小鼠并随机分为4小组，每小组10只小鼠(其中抗体生成细胞检测和血清溶血素测定共用一组动物；ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验和NK细胞活性测定共用一组动物；小鼠迟发型变态反应(DTH)测定和脏/体比值测定共用一组动物；小鼠碳廓清试验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验各用一组动物)。剂量设计均为：20.0ml/kg.bw、13.3ml/kg.bw和6.7ml/kg.bw三个剂量组和一个蒸馏水对照组。其剂量分别相当于人体推荐用量的30倍、20倍和10倍。2、仪器与试剂
绵羊红细胞(SRBC)、鸡红细胞、YAC-1细胞、印度墨汁、琼脂糖、微量血凝板、可调微量加样器、微量注射器、电子天平、离心机、CO2恒温培养箱、恒温水浴箱、培养皿、胎牛血清、Hank′s液、MTT液、ConA、RPMI1640培养液、甲醇、丙酮、酸性异丙醇、生理盐水、磷酸盐缓冲液、青霉素、链霉素、乳酸锂、硝基化氯氮唑(ITN)、吩嗪二甲酯硫酸盐、Tris-HC、显微镜、血球计数盘、752-C紫外可见分光光度计、BIO-RAD酶标仪(MODEL680)、飞鸽牌离心机(水平转)、24孔培养板、96孔培养板、数显游标卡尺、补体、手术器械、玻片架等。
3、试验方法
高剂量组灌胃受试物浓缩液原液，中剂量及低剂量组分别为量取浓缩液原液(该浓缩原液为实施例1中冷冻干燥之前的酶解上清液)66.7ml、33.3ml各加蒸馏水至100ml配成的混悬液作为受试物，各组灌胃容量均为0.2ml/10g.bw，溶剂对照组灌等容量蒸馏水，连续30天后分别对动物进行各项免疫指标测定，试验方法如下：
①ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)
对各组小鼠无菌取脾，制备脾细胞悬液，将脾细胞悬浮于2.0ml完全培养液中。用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，用RPMI1640完全培养液调整脾细胞浓度为3×106个/ml。按照程序中MTT法进行淋巴细胞增殖反应，最后在752-N紫外可见分光光度计570nm波长处测其光密度值(OD)。计算ConA+与ConA－各孔的光密度值差，各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析。
②小鼠迟发型变态反应(DTH)测定
于给受试物第26天，给小鼠腹腔注射2％绵羊红细胞(SRBC)0.2ml/只进行致敏，于免疫后第四天每鼠左后足跖部皮下注射20％SRBC(20μl/只)进行攻击。并于攻击前和攻击后24小时分别测量每鼠左后足跖同一部位厚度，同一部位测量三次，取平均值。计算攻击前、后的足跖厚度差值，各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析。
③抗体生成细胞(PFC)检测(Jerne改良玻片法)
于给受试物第26天给小鼠腹腔注射2％SRBC 0.2ml/只，于免疫后第五天取脾制备脾细胞悬液，将脾细胞悬浮于2.0ml完全培养液中。用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，用RPMI1640完全培养液调整脾细胞浓度为5×106个/ml。按程序方法制备琼脂糖玻片，将表层培养基加热溶解后与等容量的pH7.4、2倍浓度的Hank′s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加入用SA缓冲液配制的10％SRBC 50μl(v/v)、20μl脾细胞悬液，迅速混匀。倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂糖凝固后，将玻片平水扣放在玻片架上。在二氧化碳培养箱(37℃、5％CO2)中温育1.5小时后再将用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入到玻片凹槽内，继续温育1.5小时。计数每张琼脂糖薄层玻片上形成的溶血空斑数，各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析。
④小鼠碳廓清试验
于给受试物后第31天，按顺序给各组小鼠尾静脉注射印度墨汁(用生理盐水4.0倍稀释)0.1ml/10g.bw。每鼠均于注射墨汁后2分钟及10分钟分别准时内眦静脉丛采血各20μl，并迅速加入到2ml0.1％碳酸钠溶液中并摇匀。以碳酸钠溶液作空白对照，用752—C紫外可见分光光度计600nm波长处测光密度值(OD)。取小鼠肝、脾称重，按公式计算吞噬指数(a)，各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析。
⑤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
于给受试物后第31天，各组小鼠均腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml/只，间隔30分钟，腹腔注入生理盐水2ml/只，转动鼠板一分钟后吸出腹腔洗液1ml平均分滴于2张载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，37℃温育30分钟。孵毕，再用生理盐水漂洗、晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定后4％(v/v)Giemsa-磷酸盐缓冲液染色，镜检。油镜下每张片计数100个巨噬细胞，计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数及其被消化的程度，以各剂量组吞噬率转换值和吞噬指数与溶剂对照组比较进行方差分析。
⑥NK细胞活性测定
试验前24h将YAC-1细胞(靶细胞)传代培养，以Hank′s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml(活细胞＞95％)。灌胃30天后对各组小鼠无菌取脾，制脾细胞悬液(效应细胞)，用RPMI1640完全培养液调整脾细胞浓度为2×107个/ml(活细胞＞95％)。按程序要求取靶细胞和脾细胞悬液各100μl加入96孔U型培养板中(效靶比50:1)，并设靶细胞自然释放孔和最大释放孔，各项均作3个平行孔。5％CO2培养箱中37℃培养4h、水平转离心(1500r/min)5min。每孔吸取上清100μl置96孔平底培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应7min后每孔加入1mol/L的HCl30μl。在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)，按公式求出NK细胞活性转换值，各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析。
⑦脏/体比值测定
称重后，取胸腺、脾脏称重，计算胸腺/体重比值及脾脏/体重比值，各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析。
4、结果
①对小鼠体重的影响
表4对小鼠体重的影响(MTT法、NK细胞活性)
Figure BDA0001936379910000131
由表4可见，各剂量组小鼠体重增重与溶剂对照组间差异均无显著性(P＞0.05)。
表5对小鼠体重的影响(DTH法、脏/体比值)
Figure BDA0001936379910000132
Figure BDA0001936379910000141
由表5可见，各剂量组小鼠体重增重与溶剂对照组间差异均无显著性(P＞0.05)。
表6对小鼠体重的影响(PFC、血清溶血素)
Figure BDA0001936379910000142
由表6可见，各剂量组小鼠体重增重与溶剂对照组间差异均无显著性(P＞0.05)。
表7对小鼠体重的影响(碳廓清试验)
Figure BDA0001936379910000143
由表7可见，各剂量组小鼠体重增重与溶剂对照组间差异均无显著性(P＞0.05)。
表8对小鼠体重的影响(吞噬鸡红细胞试验)
Figure BDA0001936379910000144
由表8可见，各剂量组小鼠体重增重与溶剂对照组间差异均无显著性(P＞0.05)。
②小鼠迟发型变态反应(DTH)测定
表9对小鼠DTH测定结果(24h)
Figure BDA0001936379910000151
由表9可见，中剂量组小鼠用SRBC攻击后(间隔24h)小鼠足跖厚度差值较溶剂对照组明显增加，且与溶剂对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。高、低剂量组小鼠用SRBC攻击后(间隔24h)小鼠足跖厚度差值与溶剂对照组差异均无显著性(P＞0.05)。
③ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)
表10对小鼠脾淋巴细胞转化试验结果
Figure BDA0001936379910000152
由表10可见，高剂量组小鼠ConA+与ConA－OD差值较溶剂对照组明显增高，且与溶剂对照组比较差异有显著性(P＜0.05)，中、低剂量组小鼠ConA+与ConA－OD差值与溶剂对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。
④抗体生成细胞检测(PFC)
表11对小鼠抗体生成细胞检测结果
Figure BDA0001936379910000161
由表11可见，各剂量组小鼠溶血空斑数与溶剂对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。
⑤小鼠碳廓清试验
表12对小鼠碳廓清试验结果
Figure BDA0001936379910000162
由表12可见，各剂量组小鼠碳廓清吞噬指数与溶剂对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。
⑥小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
表13对小鼠巨噬细胞吞噬试验结果
Figure BDA0001936379910000163
由表13可见，各剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率转换值及巨噬细胞吞噬指数与溶剂对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。
⑦NK细胞活性测定
表14对小鼠NK细胞活性测定结果
Figure BDA0001936379910000171
由表14可见，中剂量组小鼠NK细胞活性明显高于溶剂对照组，且与溶剂对照组比较差异有高度显著性(P＜0.01)；高、低剂量组小鼠NK细胞活性与溶剂对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)⑧脏/体比值测定
表15对小鼠脏/体比值(％)测定结果
Figure BDA0001936379910000172
由表15可见，各剂量组小鼠胸腺/体、脾/体比值与溶剂对照组间差异均无显著性(P＞0.05)。
5、小结
①细胞免疫功能测定
a.小鼠迟发型变态反应(DTH)测定:中剂量组结果为阳性。
b.ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法):高剂量组结果为阳性。
②体液免疫功能测定
a.血清溶血素测定：中剂量组结果为阳性。
b.抗体生成细胞(PFC)检测：结果为阴性。
③单核-巨噬细胞功能测定
a.小鼠碳廓清试验：结果为阴性。
b.小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验：结果为阴性。
④NK细胞活性测定：中剂量组结果为阳性。
本次试验观察到鲍鱼肽对小鼠细胞免疫功能及NK细胞活性测定两项结果均为阳性，故可判定鲍鱼肽具有增强免疫力功能的作用。
从上述实验中可以得出，本发明制得的鲍鱼肽具有极强的免疫能力和应激能力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种鲍鱼肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取鲍鱼肉，加入去离子水通过打浆机打浆得含粗蛋白的浆液；
2)向所得浆液中加入去离子水并用HCl和/或NaOH调节pH为5.5，以得到蛋白浓度为4％的蛋白溶液；
3)向所得蛋白溶液中加入胰蛋白酶和碱性蛋白酶以6:4的重量比的复合酶，复合酶的加入量为6000U/g，在55℃的温度下酶解3h，得鲍鱼肽粗品；
4)酶解完成后，在100℃的热水浴中保持15min使所述蛋白酶失活，将所得酶解液经过4000r/min离心20min，得到酶解上清液，冷冻干燥，即得所述鲍鱼肽。
2.权利要求1所述方法制备得到的鲍鱼肽。
3.权利要求1所述方法制备得到的鲍鱼肽在制备提高机体免疫力的食品、保健品中的应用。
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