CN110353272B - 一种钙营养强化剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钙营养强化剂的制备方法，属于生物化工及食品添加剂领域。该方法以酪蛋白为原料，经胰蛋白酶水解后得酪蛋白磷酸肽，酪蛋白磷酸肽与二十八烷醇和磷酸钙在酸性磷酸酯酶的作用下反应，磷酯化后形成钙营养强化剂酪蛋白磷酸肽二十八烷醇酯‑磷酸钙，即CPP‑OOL‑ACP。本发明制备的钙营养强化剂CPP‑OOL‑ACP中钙元素含量达0.7％以上，酪蛋白磷酸肽与钙的螯合率可达96％，常温下呈固态的浅黄色粉末，无味，可溶于水，有效地促进钙的吸收以及钙在骨中的沉积，提高骨密度，强化骨强度。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工及食品添加剂领域，具体涉及一种钙营养强化剂的制备方法。
背景技术
通过食物强化解决钙等微营养不良问题是国际公认的最经济、有效的方法。国际上(WHO/FAO)批准使用的补钙制剂约有20余种，我国(《食品营养强化剂使用卫生标准》(GB14880))已批准使用的钙营养强化剂品种有碳酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙、L-乳酸钙、磷酸氢钙、L-苏糖酸钙、甘氨酸钙、天门冬氨酸钙、柠檬酸苹果酸钙、醋酸钙、氯化钙、磷酸三钙、维生素E琥珀酸钙、甘油磷酸钙、氧化钙、硫酸钙、骨粉等共18种。目前主要应用在面粉、大米、婴幼儿配方食品、婴幼儿辅食营养补充品、乳及乳制品、酱油、鱼露、咖啡粉、糖和饼干等食品的营养强化中。不同钙营养强化剂的特性和应用价值存在很大差异，衡量钙营养强化剂优劣的原则是强化剂的生物利用率和加入后对食物的颜色和味道的影响。钙的效价、溶解度决定了食品中钙的生物利用率，有机钙比无机钙对肠胃刺激性小且易于吸收。为此，研究者一直在致力于新型补钙材料的开发，利用生物技术开发新型高效钙营养强化剂为重要方向。如酪蛋白钙肽、酪蛋白磷酸肽等多种产品被研制并投放市场。
酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白为原料，经酶水解，再经分离纯化而得到的含有成簇磷酸丝氨酸残基的一族多肽。研究证实，酪蛋白磷酸肽具有极强的促钙吸收活性。根据酪蛋白磷酸肽具有促进钙吸收的功能特性，开发酪蛋白磷酸肽钙作为补钙制剂材料，具有生物利用率高、适口性好的显著特点，其产品应用前景广阔。譬如公开号为CN201910267584.1的中国专利公开了一种通过在碳酸钙中添加CPP制备促进骨骼生长、防龋齿、补充钙的制剂的制备工艺。然而，现有的制备工艺中仅考虑了如何通过钙的吸收提高血钙的浓度，但对于机体而言，可能会因为血钙浓度的升高，诱导出新的代偿机制，就是指血钙会通过代谢排出体外，而不是被机体利用。因此，有必要研发一种新型的补钙制剂，不仅能促进机体对钙的吸收，而且能促进钙在机体内的合成代谢。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种钙营养强化剂的制备方法，本发明通过将二十八烷醇与酪蛋白磷酸肽钙相结合，有效地促进钙的吸收以及钙在骨中的沉积，提高骨密度，强化骨强度。
为解决以上问题，本发明提供了一种钙营养强化剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将脱脂奶粉溶解于去离子水中，用盐酸溶液调节pH值至4.6，离心去上清液，得酪蛋白沉淀物；
步骤2：将所述酪蛋白沉淀物溶于去离子水中，得酪蛋白溶液，向所述酪蛋白溶液中加入胰蛋白酶后放置于58℃～60℃水浴锅中，用氢氧化钠溶液调pH值至7.4后保温酶解2.5h，然后用沸水浴处理15min灭酶，得酶解液；
步骤3：用盐酸溶液将所述酶解液pH值调至4.6，离心取上清液，得到酪蛋白酶解液；
步骤4：将磷酸钙、胞苷三磷酸二钠、酸性磷酸酯酶和二十八烷醇加入去离子水后用盐酸溶液调pH值至3.0～5.0，得到磷酸钙溶液；
步骤5：向所述磷酸钙溶液中加入所述酪蛋白酶解液，置于30℃～40℃水浴锅中进行磷酯化反应，反应40min～180min后取出，50℃条件下干燥得酪蛋白磷酸肽二十八烷醇酯-磷酸钙，即所述钙营养强化剂。
优选的，所述步骤1中所述脱脂奶粉与所述去离子水的质量比为(200～250):1000。
优选的，步骤1中所述离心去上清液具体为：在3500r/min条件下离心8min，弃去上清液。
优选的，步骤2中所述酪蛋白沉淀物、所述胰蛋白酶和所述去离子水的质量比为(19～21):(0.05～2):100。
优选的，步骤4中所述磷酸钙、所述胞苷三磷酸二钠、所述酸性磷酸酯酶、所述二十八烷醇和所述去离子水的质量比为(0.03～0.10):(0.05～0.10):(0.1～0.5):(0.05～0.10):1000。
优选的，所述胰蛋白酶的活力单位为250000U/g。
优选的，所述酸性磷酸酯酶的活力单位为1000U/g。
优选的，步骤3中所述离心取上清液具体为在5000r/min条件下离心15min，取上清液。
优选的，所述盐酸溶液的浓度为0.5mol/L。
优选的，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/L。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1、本发明采用酪蛋白磷酸肽和二十八烷醇制备酪蛋白磷酸肽二十八烷醇酯-磷酸钙，其中，二十八烷醇是降血钙素形成促进剂，可促进钙在机体内的合成代谢。本发明制备得到的酪蛋白磷酸肽二十八烷醇酯-磷酸钙中酪蛋白磷酸肽与钙的螯合率可达96％，其中钙元素含量达0.7％以上。
2、本发明在制备过程中克服了二十八烷醇水溶性不佳的问题，通过酯化促进了其溶解，获得的酪蛋白磷酸肽二十八烷醇酯-磷酸钙常温下呈固态的浅黄色粉末，无味，可溶于水。
3、本发明采用胞苷三磷酸作为转酯反应的中介分子，并提供能量，使磷酯化反应能够顺利进行。酪蛋白中的丝氨酸羟基能够和磷酸钙结合，磷酸钙中的磷酸基能作为桥梁连接二十八烷醇和丝氨酸残基。
4、本发明方法操作简单、方便，适应工业化生产。
附图说明
图1是本发明实施例得到钙营养强化剂与各类市售钙营养强化剂的动物钙吸收实验股骨重量柱状对比图；
图2是本发明实施例得到钙营养强化剂与各类市售钙营养强化剂的动物钙吸收实验股骨长度柱状对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
步骤1：取250g脱脂奶粉溶于去离子水中，定容至1000mL，用0.5mol/L的盐酸溶液将脱脂奶pH值调至4.6，在3500r/min条件下离心8min，弃去上清液，再加2倍体积的去离子水洗涤，3500r/min条件下离心8min，弃去上清液，得酪蛋白沉淀物；
步骤2：取酪蛋白沉淀物20g，用去离子水定容至100mL，得到酪蛋白溶液，再加入0.05g活力单位为250000U/g的胰蛋白酶，放置于58℃水浴锅中，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.4，58℃保温酶解2.5h，即用沸水浴处理15min灭酶，得酶解液；
步骤3：用0.5mol/L的盐酸溶液将酶解液pH值调至4.6，在5000r/min条件下离心15min，取上清液，得到酪蛋白酶解液；
步骤4：准确称取0.0310g磷酸钙、0.0527g胞苷三磷酸二钠、0.1g活力单位为1000U/g的酸性磷酸酯酶和0.0500g二十八烷醇，投入到1000mL去离子水中，加入用0.001mol/L的盐酸溶液调pH值至4.0得到磷酸钙溶液，取磷酸钙溶液100mL，再加入步骤三所得的酪蛋白酶解液5mL，置于37℃水浴锅中磷酯化反应，反应120min后取出，50℃条件下干燥得钙营养强化剂酪蛋白磷酸肽二十八烷醇酯-磷酸钙(CPP-OOL-ACP)。
实施例2：
步骤1：取200g脱脂奶粉溶于去离子水中，定容至1000mL，用0.5mol/L的盐酸溶液将脱脂奶pH值调至4.6，在3500r/min条件下离心8min，弃去上清液，再加2倍体积的去离子水洗涤，3500r/min条件下离心8min，弃去上清液，得酪蛋白沉淀物；
步骤2：取酪蛋白沉淀物19g，用去离子水定容至100mL，得到酪蛋白溶液，再加入0.05g活力单位为250000U/g的胰蛋白酶，放置于58℃水浴锅中，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.4，58℃保温酶解2.5h，即用沸水浴处理15min灭酶，得酶解液；
步骤3：用0.5mol/L的盐酸溶液将酶解液pH值调至4.6，在5000r/min条件下离心15min，取上清液，得到酪蛋白酶解液；
步骤4：准确称取0.0310g磷酸钙、0.0527g胞苷三磷酸二钠、0.1g活力单位为1000U/g的酸性磷酸酯酶和0.0500g二十八烷醇，投入到1000mL去离子水中，加入用0.001mol/L的盐酸溶液调pH值至3.0得到磷酸钙溶液，取磷酸钙溶液100mL，再加入步骤三所得的酪蛋白酶解液5mL，置于30℃水浴锅中磷酯化反应，反应40min后取出，50℃条件下干燥得钙营养强化剂酪蛋白磷酸肽二十八烷醇酯-磷酸钙(CPP-OOL-ACP)。
实施例3：
步骤1：取250g脱脂奶粉溶于去离子水中，定容至1000mL，用0.5mol/L的盐酸溶液将脱脂奶pH值调至4.6，在3500r/min条件下离心8min，弃去上清液，再加2倍体积的去离子水洗涤，3500r/min条件下离心8min，弃去上清液，得酪蛋白沉淀物；
步骤2：取酪蛋白沉淀物21g，用去离子水定容至100mL，得到酪蛋白溶液，再加入0.05g活力单位为250000U/g的胰蛋白酶，放置于60℃水浴锅中，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.4，60℃保温酶解2.5h，即用沸水浴处理15min灭酶，得酶解液；
步骤3：用0.5mol/L的盐酸溶液将酶解液pH值调至4.6，在5000r/min条件下离心15min，取上清液，得到酪蛋白酶解液；
步骤4：准确称取0.0310g磷酸钙、0.0527g胞苷三磷酸二钠、0.1g活力单位为1000U/g的酸性磷酸酯酶和0.0500g二十八烷醇，投入到1000mL去离子水中，加入用0.001mol/L的盐酸溶液调pH值至5.0得到磷酸钙溶液，取磷酸钙溶液100mL，再加入步骤三所得的酪蛋白酶解液5mL，置于40℃水浴锅中磷酯化反应，反应180min后取出，50℃条件下干燥得钙营养强化剂酪蛋白磷酸肽二十八烷醇酯-磷酸钙(CPP-OOL-ACP)。
实施例4：酪蛋白磷酸肽与钙的螯合率测定
称取2.00g样品，于250ml烧杯中，加入80ml水，搅拌至完全溶解，定容至100ml，测定此时的钙含量c1(mg/ml)。再加入10ml 20g/L碳酸钠溶液，滴加1mol/L氢氧化钠溶液将溶液pH值调为11，加水至150ml。10000r/min离心，弃去清液，用水洗涤3遍，加入5ml 5mol/L盐酸溶液，振荡至完全溶解，测定钙含量c2(mg/ml)。溶液中的钙含量采用火焰原子吸收法测定。酪蛋白磷酸肽与钙的螯合率按下式计算：
各实施例螯合率测定结果如下表所示：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 钙含量 | 0.7％ | 0.65％ | 0.6％ |
| 螯合率 | 96％ | 94％ | 92％ |
实施例5：动物钙吸收利用实验
选出生20d的小白鼠60只，随机分成A、B、C、D、E、F六组，10只为一组，雌雄各半，A、B、C三组分别以基础饲料喂养，同时补喂0.2g/d相应实施例中的钙营养强化剂CPP-OOL-ACP(A：实施例1；B：实施例2；C：实施例3)。D、E、F三组除以基础饲料喂养外，同时分别补喂0.2g/d葡萄糖酸钙、0.2g/d氧化钙和0.2g/d骨粉。自由进食和饮水。4周后将鼠处死。测定股骨的重量、长度。数据处理用t检验进行统计分析，股骨的重量分析结果如图1所示，股骨的长度分析结果如图2所示。
图1为A、B、C、D、E、F六组实验的股骨重量柱状图，根据图1可以发现A、B、C三组的股骨重量显著高于其他组。图2为A、B、C、D、E、F六组实验的股骨长度柱状图，根据图2可以发现A、B、C三组的股骨长度显著高于其他组。因此，可以认为本发明所制备的钙营养强化剂CPP-OOL-ACP有明显促进钙吸收和骨沉积的作用。
以上所述仅仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种钙营养强化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将脱脂奶粉溶解于去离子水中，用盐酸溶液调节pH值至4.6，离心去上清液，得酪蛋白沉淀物；
步骤2：将所述酪蛋白沉淀物溶于去离子水中，得酪蛋白溶液，向所述酪蛋白溶液中加入胰蛋白酶后放置于58℃~60℃水浴锅中，用氢氧化钠溶液调pH值至7.4后保温酶解2.5h，然后用沸水浴处理15min灭酶，得酶解液；
步骤3：用盐酸溶液将所述酶解液pH值调至4.6，离心取上清液，得到酪蛋白酶解液；
步骤4：将磷酸钙、胞苷三磷酸二钠、酸性磷酸酯酶和二十八烷醇加入去离子水后用盐酸溶液调pH值至3.0~5.0，得到磷酸钙溶液；所述磷酸钙、所述胞苷三磷酸二钠、所述酸性磷酸酯酶、所述二十八烷醇和所述去离子水的质量比为（0.03~0.10）:（0.05~0.10）:（0.1~0.5）:（0.05~0.10）:1000；
步骤5：向所述磷酸钙溶液中加入所述酪蛋白酶解液，置于30℃~40℃水浴锅中进行磷酯化反应，反应40min~180min后取出，50℃条件下干燥得酪蛋白磷酸肽二十八烷醇酯-磷酸钙，即所述钙营养强化剂。
2.根据权利要求1所述的一种钙营养强化剂的制备方法，其特征在于，步骤1中所述脱脂奶粉与所述去离子水的质量比为（200~250）:1000。
3.根据权利要求1所述的一种钙营养强化剂的制备方法，其特征在于，步骤1中所述离心去上清液具体为：在3500r/min条件下离心8min，弃去上清液。
4.根据权利要求1所述的一种钙营养强化剂的制备方法，其特征在于，步骤2中所述酪蛋白沉淀物、所述胰蛋白酶和所述去离子水的质量比为（19~21）:（0.05~2）:100。
5.根据权利要求1所述的一种钙营养强化剂的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的活力单位为250000U/g。
6.根据权利要求1所述的一种钙营养强化剂的制备方法，其特征在于，所述酸性磷酸酯酶的活力单位为1000U/g。
7.根据权利要求1所述的一种钙营养强化剂的制备方法，其特征在于，步骤3中所述离心取上清液具体为在5000r/min条件下离心15min，取上清液。
8.根据权利要求1所述的一种钙营养强化剂的制备方法，其特征在于，所述盐酸溶液的浓度为0.5mol/L。
9.根据权利要求1所述的一种钙营养强化剂的制备方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/L。
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