CN115399447B - 一种鳖血晶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鳖血晶及其制备方法和应用，将新鲜鳖血进行抗凝处理，之后置于冷冻干燥机中进行预冻和干燥，获取鳖血冻干品，将鳖血冻干品研磨均质，得到所述鳖血晶。本发明的鳖血晶制备方法能提供完美保留鳖血功效、极大提高鳖血生物利用度并延长鳖血保存时间的鳖血晶产品，鳖血经过抗凝处理后能最大程度的延长保存时间，制成的成品中基本无血腥味，采用本发明所述冻干曲线制得的鳖血晶溶解度极高，使得鳖血中的活性蛋白质大分子以及一些肽类得到广泛应用而且易于吸收，适合于普通人和各类血虚或术后康复人群及病患者作为保健和医疗辅助品，尤其对肿瘤患者增强抵抗力有效。且制备工艺简单，生产效率高，方便进行工业化生产，具有较高的经济价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鳖血晶及其制备方法和应用。
背景技术
鳖血来源于鳖科动物中华鳖Trionyx sinensis Wiegmann的新鲜血液，具有滋阴清热、活血通络之功效。其药用始于唐代，临床内服用于治疗虚劳潮热、口眼斜；外用可治面神经诸症、脱肛及外伤出血。《本草纲目》记载：鳖“头血”，治风中血脉，口眼症僻，小儿疳劳潮热。《现代实用中药》记载鳖血生饮，用于结核潮热有效。化学成分及药理作用研究表明其含有蛋白质、氨基酸、矿物元素、酶类等多种活性物质：多种蛋白质及氨基酸可为人体补充营养并提高机体的免疫力；鳖血中含有丰富的矿物元素，除了钾、钠、钙、镁、磷等常量元素含量丰富外，还含有人体必需的铁、锌、铜、锰、铬等微量元素，这些微量元素作为激素辅助成分可促进激素合成，影响机体的生长发育甚至降低疾病的发生；鳖血中的乳酸脱氢酶、肌酸激酶分别为人的24.8倍和31.0倍，这与其长期水底栖息的生活环境有关，其碱性磷酸酶的含量约为人的11倍，显示出鳖血在促进骨骼成长及骨的再生方面具有潜在能力，临床亦有采用鳖血治疗骨关节结核病的相关案例；鳖血也可“以血补血”，对贫血患者能够达到很好的补血效果。现代药理研究证明，鳖血口服液对有丝分裂原ConA引起的小鼠T淋巴细胞增殖具有明显的增强作用；鳖血提取物对免疫功能低下小鼠的各项免疫指标均具有正向调节作用，主要表现为CD4+亚型T细胞在外周血中的比例增多，NK细胞的杀伤活性增高及促进淋巴细胞的增殖功能增强，并呈剂量依赖性；鳖血清可强烈地抑制癌细胞生长，并且对S180、P388腹水型肿瘤细胞和艾氏腹水肿瘤细胞均具有显著抑制作用，但不同温度对鳖血清抑癌活性有显著影响，温度升高其抑癌活性明显降低，提示鳖血作为生物制品存在热敏性生物活性物质。
鳖以其长寿而为人熟知，自西周以来便作为上等佳肴被达官显贵、宫廷皇族视作滋补保健的珍品，在我国具有悠久的养殖和食用历史。随着我国养鳖业的快速发展，养殖规模的不断扩大，将其单一作为名菜简单烹饪食用，既严重制约了鳖产业的发展，又未能充分利用其全身肌肉、裙边、卵、油、壳、骨、血等所含的营养药用价值。现代仅有鳖甲作为中药材被《中国药典》收录。我国向来有食用牲畜血制品的饮食习惯，一些地区将猪血、牛血或羊血等制成血肠、血糕、血豆腐等食品，独具特色。但鳖血之性急缩走血，凝血极快，稳定性差，极易变质，因而很难得到有效利用。目前鳖血应用多以生饮鳖血、制成鳖血酒、干燥鳖血块/粉为主。鳖血生饮或兑酒饮用尽管可以不经过高温处理工艺，保留了鳖血中多种活性成分，但保存期短，适口性差、大众接受度低，并存在安全卫生隐患，在服用上受到了很大的限制。而经过加热凝固、晒干、烘干等干燥工艺制备而成的鳖血干血，由于受到高温的影响，其活性成分大大减少，无法使鳖血得到真正的高效利用。目前还没有能够将鳖血制成鳖血制品的成熟工艺，因此需要提出一种具有确切功效的鳖血制品及其生产方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鳖血晶及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鳖血晶的制备方法，将新鲜鳖血进行抗凝处理得到抗凝鳖血，将抗凝鳖血置于冷冻干燥机中进行预冻和干燥，包括如下步骤：
(1)将抗凝鳖血预冻3～5h，预冻温度低于抗凝鳖血共晶点温度5～10℃；
(2)斜率升温，使干燥温度在11～15h期间升温至0间；
(3)在干燥温度升至0℃后，调整升温速率为1～1.2h/5℃，到终点温度后维持直至干燥时间结束，其中终点温度为15～25℃，该步骤干燥时间为6～8h；
获取鳖血冻干品，将鳖血冻干品研磨均质，得到所述鳖血晶。
作为一种优选的实施方式，所述将新鲜鳖血进行抗凝处理的方式为，将新鲜鳖血与抗凝剂混合，获得经抗凝处理的鳖血。
作为一种优选的实施方式，所述抗凝剂选用CPDA-1血液保存液。
作为一种优选的实施方式，将所述新鲜鳖血与抗凝剂按100：14～20的体积比混合，获得经抗凝处理的鳖血。
作为一种优选的实施方式，预冻后在真空环境下干燥。
作为一种优选的实施方式，将抗凝处理后的鳖血装入金属平底样品盘中，放入冷冻干燥机的物料盘中，再把物料盘放到冻干机的隔板上，进行预冻和干燥；所述鳖血在样品盘底部厚度均匀，样品体积不超过样品瓶体积的1/3，优选厚度为5mm，可以使鳖血更快整体冻结，避免冻结不完全导致抽真空时鳖血喷射，或冻结时间过长导致鳖血晶出现质量问题。
作为一种优选的实施方式，所述研磨均质的方式为：使用灭菌处理过的研钵将鳖血冻干品研磨均匀，使其能全部通过2号筛。
作为一种优选的实施方式，所述预冻和干燥均在冷冻干燥机的冷阱中进行。避免了传统冻干形式中预冻要在其他设备进行后再转移至干燥机过程中使半成品出现融化或接触空气受到污染等情况。
本发明的另一目的在于提供使用上述方法制备的鳖血晶。
本发明的又一目的在于提供上述鳖血晶在制备免疫调节制剂或抗失血性血虚制剂中的应用。所述制剂可为食品、药品、营养保健品等。
本发明具有如下有益效果：
1.鳖血的现代用法有生饮或兑酒饮用，对结核潮热有效并具有滋阴潜阳、补气补血的保健功效，在餐饮市场十分常见。但其适口性差，群众接受度低，存在安全卫生隐患；且鳖血极易凝固变质，这种应用方式使得鳖血无法长时间保存也不方便运输。本发明可以有效解决上述传统鳖血用法的弊端，制备的鳖血晶外观、口感相较于生饮血液，更易于接受；提高服用安全性；保质期延长且颗粒规整，易于包装储存和运输。
2.鳖血不同于牛血、猪血、鹿血等哺乳动物血液，牛血、猪血、鹿血在添加抗凝剂后即可长久保存，而鳖血极易变质凝固，即便添加抗凝剂也不能保存很久，液体状态下添加抗凝剂也只能保存一周左右。现代技术对于鳖血干血的制备方式有加热凝固后晒干、烘干、阴干、喷雾干燥等，这些方法会使血液中的生物活性成分失活、易导致血液变质甚至滋生细菌病毒，复水性差且不易被人体吸收。本发明运用新型冷冻干燥工艺，通过低温预冻结晶在真空环境下直接升华成气体除去水分，能够很好的保持鳖血中活性蛋白质大分子以及一些肽类的空间结构及稳定性。可有效保存鳖血中的营养成分，不产生化学反应，不变色，具有复水性。见水后崩解时间短，崩解效果好，口感优良且有利于人体充分吸收。
3.本发明提供的鳖血晶制备方法操作简单，生产效率高，便于工业化生产与推广；能够最大限度保留鳖血中的活性成分，与普通鳖血冻干粉相比，蛋白质、氨基酸、矿物元素等含量更高。能够充分利用鳖血，解决鳖血资源浪费问题，并可应用于制备具有调节免疫、抗肿瘤、滋阴补血作用的食品、保健品、药品及医疗辅助用品，可产生较高的经济效益。
4.本发明提供的鳖血晶制备方法采用单因素试验和Box-Behnken响应面法设计分析，以鳖血晶的水分、溶解度及蛋白质含量为评价指标，考察预冻时间、干燥时间和干燥温度等多个因素，对鳖血晶真空冷冻干燥的冻干工艺进行优选，得到鳖血晶最优冻干曲线。同时对最优冻干曲线的鳖血晶滋阴补血、抗炎等药效进行验证。鳖血晶的溶解度越高可应证其生物利用度越高，本发明优选的冻干曲线所得的鳖血晶溶解度最高，且质量稳定，可用于鳖血晶大规模生产。
附图说明
图1为三因素分别对鳖血晶水分含量的影响。
图2是三因素分别对鳖血晶溶解度的影响。
图3是三因素分别对鳖血晶含氮量的影响。
图4是三因素交互作用对冻干鳖血晶溶解度影响的响应曲面图。
图5为鳖血晶最优冻干曲线。
图6为鳖血晶图。
图7为非抗凝鳖血晶图。
图8为鳖血普通冻干粉。
图9为鳖血晶对LPS诱导的RAW264.7细胞NO分泌量的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，不是对本技术方案的限制。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明中的生物材料来源如下：中华鳖Trionyx sinensis Wiegmann购买自江苏省扬州市宝应众盛生态龟鳖产销合作社，批号：BY2111231。实施例中所用仪器、试剂信息如下：
SCIENTZ-20F/A冷冻干燥机，宁波新芝冻干设备股份有限公司；
FD-1A-50冷冻干燥机，上海利闻科学仪器有限公司；
KDN-1000半自动凯氏定氮仪，上海昕瑞仪器仪表有限公司；
KDT-08C消化炉，苏州市天威仪器有限公司；
无水葡萄糖；碳酸二氢钠；枸橼酸钠；枸橼酸；
生理盐水；肝素钠；乙二胺四乙酸(EDTA)；草酸钾；
腺嘌呤，高纯98％，LOT：Y02A11C120174；
MJ-54A高压灭菌锅，施都凯仪器设备(上海)有限公司。
实施例1鳖血晶最佳冻干工艺考察
鳖血晶溶解度的高低与其冻干程度密切相关，不同冻干条件对其冻干程度的影响深浅不一，并且不同冻干条件存在交互作用。因而采用单因素及响应面实验，以鳖血晶水分、溶解度和含氮量为指标考察其冻干工艺。
实施例1中实验用血液均为抗凝鳖血，即实施例2中所述的将CPDA-1血液保存液与新鲜鳖血混合得到的抗凝鳖血。
解析干燥温度指设置的终点温度。
(1)预冻时间单因素实验
预冻阶段：预冻温度-50℃，考察预冻时间为2，3，4，6，12h对鳖血冻干的影响。干燥阶段：真空度20Pa；以5℃为一个升温阶梯，升温方式为斜率升温。以0℃为界，0℃前干燥时间16h，0℃后干燥时间为7h，解析干燥温度10℃。
(2)干燥时间单因素实验
预冻阶段：预冻温度-50℃，预冻时间4h。干燥阶段：真空度20Pa；以5℃为一个升温阶梯，升温方式为斜率升温。以0℃为界，考察0℃前干燥时间为4.5h，9h，13.5h，18h，27h(对应升温速率分别为0.5h/5℃，1h/5℃，1.5h/5℃，2h/5℃，3h/5℃)对鳖血冻干的影响；干燥温度达到0℃后干燥时间为7h，解析干燥温度30℃。
(3)解析干燥温度单因素实验
预冻阶段：预冻温度-50℃，预冻时间4h。干燥阶段：真空度20Pa；以5℃为一个升温阶梯，升温方式为斜率升温。以0℃为界，0℃前干燥时间13.5h，0℃后干燥时间为7h，考察解析干燥温度为5，10，15，20，30℃对鳖血冻干的影响。
单因素实验结果如图1～3所示：
由图1可知，鳖血晶水分含量随着预冻时间延长而降低，而干燥时间与解析干燥温度的变化对鳖血晶水分含量的影响不具有规律性，原因为冻干品为多孔海绵状结构，质地松散、复水性强的同时也导致其极易吸水，水分含量受到实验当天的温湿度及人员操作等影响较大。得出结论：仅预冻时间的延长会对鳖血晶水分含量存在明显的规律性影响，其余冻干条件对鳖血晶水分含量的改变受到实验环境的影响而无法体现出规律性。
由图2可知，不同冻干条件对鳖血晶溶解度的影响均具有规律性。溶解度随着预冻时间和干燥时间的延长而增高，当预冻时间超过3h、干燥时间超过9h时，溶解度上升趋势逐渐趋于平缓。解析干燥温度在20℃左右时，溶解度最高。
由图3可知，随着预冻时间、干燥时间及解析干燥温度的改变，鳖血晶的水分、溶解度均受到不同程度的影响，而含氮量均在14.0％左右浮动(无显著性差异)。随着冻干时间的延长，鳖血晶水分含量降低、溶解度增高；干燥时间为4.5h时，此时隔板升温速率为0.5h/5℃，溶解度仅为75.43％，当干燥时间在9h以上时，溶解度基本可维持在90％以上，时间延长溶解度提升无显著性差异，此时隔板升温速率为1～3h/5℃；解析干燥阶段是真空冷冻干燥最后一个阶段，此过程是物料中剩余结晶水脱除过程，一般来说解析干燥温度越高，剩余结晶水脱除越彻底，但解析干燥温度高于15℃后含氮量均为下降趋势，随着解析干燥温度上升到15～20℃时，溶解度上升过程越来越趋于平缓，解析干燥温度至30℃时，溶解度也开始下降，考虑到鳖血作为生物制品存在热敏性生物活性物质，实验设定解析干燥温度不超过30℃。
综合以上因素并结合冻干效果及机器能耗等多方面考虑，预冻时间选择3、4、5h，干燥时间选择11、13、15h，解析干燥温度选择15、20、25℃进行下一步实验。
(4)鳖血共晶点测定
采用电阻法，将共晶点测定电极置于样品中，根据阻抗突变显示共晶点。上述单因素实验过程共计运行18条冻干曲线，每条冻干曲线的预冻阶段均检测了鳖血的共晶点。鳖血共晶点温度测定结果为-16.5±1.7℃(n＝18)。
(5)响应面优化实验及结果
依据单因素实验结果，根据Box-Behnken实验设计原理，考察预冻时间、干燥时间、解析干燥温度三因素对鳖血冻干效果影响。以溶解度为响应值，设计三因素三水平实验见表1。
表1响应面实验因素水平表
依据鳖血共晶点测定结果确定预冻温度，预冻温度应低于物料共晶点温度5～10℃最佳，即预冻阶段将样品温度降至-16.5℃以下5～10℃，即-21.5～-26.5℃进行预冻即可，为方便实际操作，预冻温度确定为-25℃。
为确定鳖血晶真空冷冻干燥最佳工艺条件，选择预冻时间、干燥时间和解析干燥温度3个因素，以溶解度(％)为评价指标进行响应面回归分析，Box-Behnken实验设计及结果如表2所示。
表2响应面实验设计及结果
| 实验号 | A预冻时间(h) | B干燥时间(h) | C解析干燥温度(℃) | Y溶解度(％) |
| 1 | 3 | 13 | 15 | 82.27 |
| 2 | 5 | 13 | 15 | 84.80 |
| 3 | 5 | 11 | 20 | 78.17 |
| 4 | 4 | 13 | 20 | 97.12 |
| 5 | 4 | 13 | 20 | 95.12 |
| 6 | 4 | 15 | 25 | 89.93 |
| 7 | 4 | 11 | 25 | 87.88 |
| 8 | 3 | 13 | 25 | 82.91 |
| 9 | 3 | 11 | 20 | 77.56 |
| 10 | 4 | 13 | 20 | 94.89 |
| 11 | 4 | 13 | 20 | 95.58 |
| 12 | 4 | 13 | 20 | 96.06 |
| 13 | 3 | 15 | 20 | 75.13 |
| 14 | 5 | 15 | 20 | 78.40 |
| 15 | 4 | 11 | 15 | 85.57 |
| 16 | 4 | 15 | 15 | 82.00 |
| 17 | 5 | 13 | 25 | 88.39 |
注：响应面法中的干燥时间均为0℃前的干燥时间。
利用Design-Expert12软件对表中数据进行二次多元回归拟合,得到各因素对鳖血晶溶解度的二次回归方程如下：
Y＝-379.86981+74.97975*A+49.85862*B-0.34955*C+0.3325*A*B+0.1475*A*C+0.1405*B*C-10.09575*A2-2.08581*B2-0.04263*C2
表3回归方程方差分析
由表3可得，对于鳖血晶溶解度(Y)来说，模型F值为66.18(P＜0.0001)，表明模型极显著，失拟项P值0.1689(P＞0.0500)不显著，软件分析得出的复相关系数R2为0.9884，校正后R2 Adj为0.9735，表明该模型成立且拟合度较好，误差小，较为精确，可以预测鳖血晶溶解度随各因素变化的规律。根据表4中F值的大小，可以判断三因素对溶解度影响的主次因素为C＞A＞B，从P值可知，A2、B2对溶解度影响极显著(P＜0.0001)，A、C对溶解度影响高度显著(P＜0.01)，BC对溶解度影响显著(P＜0.05)，其余因子均不显著(P＞0.05)。
三因素交互作用对鳖血晶溶解度的影响：
根据图4(a)可知，在以解析干燥温度为中心水平值时，图中等高线呈近圆形，表明预冻时间与干燥时间交互作用显著。由图4(b)可以看出，随解析干燥温度增加，溶解度呈缓慢上升趋势，与图4(c)趋势一致，干燥时间与解析干燥温度均是处于中间水平时，溶解度最高，提示鳖血冻干工艺中干燥时间不宜过长，解析干燥温度也不宜过高，这与单因素实验结果也具有一致性。
(6)验证实验
为保证鳖血晶的生物利用度，溶解度越高越好。根据Design-Expert 12软件预测的真空冷冻干燥最佳工艺条件为：预冻时间4.109h，干燥时间13.108h(0℃前)，解析干燥温度24.603℃，在此条件下，鳖血晶溶解度理论值可达96.656％。考虑到工厂化生产实际操作，将最优工艺条件调整为：预冻时间4.1h，干燥时间13.1h(0℃前)，解析干燥温度24.6℃，在此条件下进行三次重复实验后计算得到溶解度为(94.71±0.61)％，与理论值接近，说明回归模型的拟合度较高，具有一定的利用价值。
(7)鳖血晶最优冻干曲线
由图5可知，通过响应面优化，在最佳条件下，整个冷冻干燥过程真空度维持在30±5Pa。在升华干燥阶段，随着隔板温度(即图中导热油温度)上升，物料温度也随之呈现上升趋势，整个升华干燥阶段，隔板温度由-25℃开始斜率升温，升温速率为3～3.3h/5℃，物料温度与隔板温度趋于一致时，表示升华干燥阶段结束，此时物料温度约为-10℃，解析干燥开始，保持升温速率将温度升至0℃，0℃后升温速率变为1～1.2h/5℃，至24.5℃，隔板温度与物料温度趋于一致，整个真空冷冻干燥过程基本结束。
实施例2
一种鳖血晶的生产方法，具体包括以下步骤：
S1、鳖血抗凝处理：采集新鲜鳖血，进行抗凝处理；具体包括以下步骤：
S11、将健康活体中华鳖清洗表面后，倒挂半小时，采用断颈法切断其脖颈，收集新鲜血液；
S12、制备CPDA-1血液保存液，称取枸橼酸钠2.63g、枸橼酸0.327g、无水葡萄糖3.19g、磷酸二氢钠0.222g、腺嘌呤0.0275g制备100mL CPDA-1血液保存液，置于高压灭菌锅中灭菌2h；
S13、将S12步骤所得CPDA-1血液保存液与S11步骤采集的新鲜血液混合，每100mL鳖血使用14mL CPDA-1血液保存液。轻微震荡使混合均匀，得到抗凝鳖血。
S2、样品盘无菌处理，并将抗凝鳖血置于无菌样品盘中，所述抗凝鳖血在无菌样品盘底部厚度均匀，厚度不超过5mm；
S3、将S2样品盘置于冷冻干燥机中，进行预冻和干燥，得到抗凝鳖血冻干品；
所述的步骤S3中，所述冷冻干燥机为SCIENTZ-20F/A冷冻干燥机，预冻温度-25℃，预冻时间4h，预冻完毕后抽真空，干燥阶段维持真空度值30±5Pa，预冻、干燥均在冷阱中，冻干容器选择金属平底样品盘。干燥过程升温方式为斜率升温，以0℃为界，0℃前升温速率为3～3.3h/5℃，时间13.1小时，升华干燥在此阶段内可完全结束，且包含有解析干燥开始的小部分阶段；0℃后升温速率为1～1.2h/5℃，干燥时间7小时，均为解析干燥阶段，升温至24.6℃即可停止冻干，维持24.6℃直到达到设置的干燥时间(7小时)。
S4、将得到的鳖血冻干品取出，研磨均质，过2号筛(850±29μm)，得到鳖血晶；
S5、将得到的鳖血晶在无菌条件下放入无菌西林瓶进行密封包装；
S6、将包装后的产品灭菌，2～6℃的温度下冷藏保存，成品如图6。
对比例1
本对比例提供了一种非抗凝鳖血晶，其制备方法与实施例2基本相同，其区别在于，不包括S12～S13的抗凝处理，成品如图7。
对比例2
本对比例提供一种鳖血普通冻干粉，制备方法如下：
S1、鳖血抗凝处理：采集新鲜鳖血，进行抗凝处理；
所述步骤S1具体包括以下步骤：
S11、将健康活体中华鳖清洗表面后，倒挂半小时，采用断颈法切断其脖颈，收集新鲜血液；
S12、制备CPDA-1血液保存液，称取枸橼酸钠2.63g、枸橼酸0.327g、无水葡萄糖3.19g、磷酸二氢钠0.222g、腺嘌呤0.0275g制备100mL CPDA-1血液保存液，置于高压灭菌锅中灭菌2h；
S13、将S12步骤所得CPDA-1血液保存液与S11步骤采集的新鲜血液混合，每100mL鳖血使用14mL CPDA-1血液保存液。轻微震荡使混合均匀，得到抗凝鳖血。
S2、样品盘无菌处理，并将抗凝鳖血置于无菌样品盘中，所述抗凝鳖血在无菌样品盘底部厚度均匀，厚度不超过5mm；
S3、将S2样品盘置于-20℃或-80℃冰箱中预冻8h以上，使其完全凝固；
S4、将完全凝固的鳖血迅速转移至冷冻干燥机中，进行干燥，得到鳖血普通冻干品；
所述的步骤S4中，所述冷冻干燥机为FD-1A-50冷冻干燥机，无冻干曲线，直接在冻干机中干燥10h以上，得到鳖血普通冻干品。
S4、将得到的鳖血普通冻干品取出，研磨均质，得到鳖血冻干粉；
S5、将均质后的鳖血冻干粉在无菌条件下放入无菌西林瓶进行密封包装；
S6、将包装后的产品灭菌，2～6℃的温度下冷藏保存，成品如图8。
实施例3
采用实施例2提供的鳖血晶，以及对比例1～2提供的鳖血制品，对其外观性状、水分、灰分、溶解度以及所含活性成分(以蛋白质为主)含量进行比较。比较结果见表4～5。
表4实施例2及对比例1～2成品外观性状
| 外观性状 | |
| 实施例2 | 暗红色粉末状，粒径分布均匀，气微，味淡，微有血腥气，无腐败变质异味 |
| 对比例1 | 暗红色粉末状，粒径分布均匀，气微，味淡，有血腥气，无腐败变质异味 |
| 对比例2 | 砖红色粉末状，粒径分布均匀，气微，味淡，微有血腥气，无腐败变质异味 |
表5实施例2及对比例1～2水分、灰分、溶解度及活性成分含量
溶解度检测方法：精确称取50mg样品，用3mL25℃蒸馏水充分溶解，置于离心机离心10min(4000r/min)，去上清液，并用棉签擦净管壁，再重复操作一次。然后用少量蒸馏水将沉淀移入干燥至恒重的称量皿中，放入105℃烘箱中干燥至恒重。按公式计算：
式中：W——样品重量(g)；
W1——称量皿重(g)；
W2——称量皿+不溶物重(g)；
B％——样品含水量。
实施例4
采用实施例2提供的鳖血晶，以及对比例1～2提供的鳖血制品，2～6℃冷藏保存35天后，对其外观性状、水分、灰分、溶解度以及所含活性成分(蛋白质、矿物元素)含量进行比较。比较结果见表6～7。
表6冷藏保存35天后实施例2及对比例1～2成品外观性状
| 外观性状 | |
| 实施例2 | 暗红色粉末状，粒径分布均匀，气微，味淡，微有血腥气，无腐败变质异味 |
| 对比例1 | 暗红色粉末状，粒径分布均匀，气微，有腐败变质异味 |
| 对比例2 | 砖红色粉末状，粒径分布均匀，气微，味淡，微有血腥气，无腐败变质异味 |
表7冷藏保存35天后实施例2及对比例1～2水分、灰分、溶解度及活性成分含量
可以看出，鳖血经抗凝处理后再通过真空冷冻干燥得到的鳖血晶可以最大限度的保留鳖血的营养价值，且相比非抗凝鳖血晶、鳖血普通冻干粉具有更好的溶解性和保存性能。而不经过真空冷冻干燥只进行抗凝处理的鳖血在冷藏条件下保存两周左右就会出现变质腐坏迹象。除含氮量检测外，后续将采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对鳖血晶进行矿物元素含量检测，可作为数据补充内容。
实施例5
对比了不同抗凝剂的效果。
本实施例对鳖血抗凝处理步骤(步骤S11～S13)进行单因素考察。具体实施步骤如下：
S11步骤同实施例2，区别在于S12步骤抗凝剂采用肝素钠抗凝剂、乙二胺四乙酸(EDTA)和草酸钾抗凝剂。抗凝结果显示，同样保存条件下，使用肝素钠抗凝剂的鳖血样品仅在1天后就出现结块变质现象，且使用此抗凝剂对鳖血的DNA提取和后期PCR扩增有不利影响；乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂可与钙离子形成螯合物，会显著影响鳖血中活性成分之一钙元素的含量，且在一周内变质凝固；而草酸钾抗凝剂不可用于供钾、钙含量测定的血样，影响鳖血中多种矿物元素的含量测定，不适用于本发明的鳖血晶产品。
本实施例证实，由于不同抗凝剂对血液的抗凝原理不同，因此使用不同的抗凝剂进行抗凝处理对鳖血生理指标影响显著，抗凝效果也存在显著差异。选用抗凝剂的原则应尽可能的减少抗凝剂对血液生理指标的影响，采用本发明配制的CPDA-1血液保存液可以最大限度的延长鳖血保存期，并且，国家相关法规对于枸橼酸钠的摄入量无限制，是鳖血抗凝处理选用的最佳抗凝剂。
实施例6
本实施例考察鳖血晶对LPS诱导的RAW264.7细胞NO分泌量的影响。NO是一种由免疫系统产生的重要效应分子，参与宿主免疫防御、组织修复和其他生理活动。
S1、细胞培养：在生物安全柜中，将RAW264.7细胞接种于直径60mm细胞培养皿中，加入3mL含10％FBS、1％双抗的DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，贴壁生长。每1～2d换一次液，细胞数大于1×107mL-1时按1：5或1：6传代一次，使细胞保持圆整、透亮的形态，取对数生长期细胞用于实验。
S2、鳖血晶水溶液的制备：向20mL去离子水中加入1g鳖血晶冻干粉末，充分混匀后于37℃水浴加热至无明显颗粒状物质存在。再次混匀后用200目尼龙滤布过滤掉不溶物，滤液在超净台内用0.22μm孔径的滤器过滤，得到无菌鳖血晶水溶液。
S3、一氧化氮检测和ELISA实验：将RAW264.7细胞接种于96孔细胞培养板中，贴壁生长至汇合度为50％～60％，加入鳖血晶水溶液使其终浓度为12.5、25、50、100、200、400、800μg/mL，培养1h后，加入LPS使终浓度为1μg/mL。培养24h后，收集培养基，7500g离心5min，小心吸取上清到新EP管中，依照试剂盒说明书对培养基上清中的一氧化氮含量进行检测。
S4、收集鳖血晶和LPS共同处理后RAW264.7细胞的培养基上清，通过ELISA实验检测鳖血晶对RAW264.7细胞炎症因子一氧化氮(NO)释放量的影响。结果如图9所示：
结果表明，与模型组相比，各浓度的鳖血晶溶液处理均能显著降低NO释放量，提示鳖血晶具有调节免疫的作用。
实施例7
本实施例考察鳖血晶对失血性血虚小鼠HB(血红蛋白)的影响。鳖血普通冻干粉溶解度过低，无法喂给小鼠，因此不作考虑。
选小鼠30只，每只小鼠眼静脉丛取血10μL，用试剂盒及紫外可见光分光光度计测定小鼠血液HB含量。并同时每只小鼠眼眶放血约0.5mL，造成失血性血虚模型，失血后24小时再次取血10μL，测定HB。将上述小鼠随机分为3组，每组10只，分别为鳖血组(称取鳖血晶溶于生理盐水使剂量为0.1g/kg)，模型组和阳性药组(3mL原药液/kg)。阳性药组为安神补脑液，购自吉林敖东延边药业股份有限公司；规格：10mL/支，临用前用注射用水配成0.3mL原液/mL。每天各组小鼠灌胃相应药物0.1mL/10g体重，模型组灌胃同体积生理盐水，连续7天。于末次给药后1小时于眼静脉丛取血10μL，测定HB含量，观察给药后HB的恢复情况，与模型组比较并进行统计学计算。
试验结果表明，小鼠因失血造成外周血液中HB含量减少的血虚模型，灌胃鳖血晶7天后，血虚模型小鼠外周血中HB的含量明显增加，结果见表8：
表8各组别小鼠外周血中HB含量
各组增加值与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。
鳖血晶0.1g/kg剂量对失血性血虚模型小鼠引的血红蛋白(HB)含量降低有一定的恢复和提高作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (8)
1.一种鳖血晶的制备方法，其特征在于，将新鲜鳖血进行抗凝处理得到抗凝鳖血，将抗凝鳖血置于冷冻干燥机中进行预冻和干燥，包括如下步骤：
（1）将抗凝鳖血预冻3~5h，预冻温度低于抗凝鳖血共晶点温度5~10℃；
（2）斜率升温，使干燥温度在11~15h期间升温至0℃；
（3）在干燥温度升至0℃后，调整升温速率为1~1.2h/5℃，到终点温度后维持直至干燥时间结束；其中终点温度为15~25℃，该步骤干燥时间为6~8h；获取鳖血冻干品，将鳖血冻干品研磨均质，得到所述鳖血晶；所述将新鲜鳖血进行抗凝处理的方式为：将新鲜鳖血与抗凝剂混合，获得经抗凝处理的鳖血；所述抗凝剂选用CPDA-1血液保存液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述新鲜鳖血与抗凝剂按100：14~20的体积比混合，获得经抗凝处理的鳖血。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，预冻后在真空环境下干燥。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将抗凝处理后的鳖血置于样品盘上，之后置于冷冻干燥机中进行预冻和干燥；所述鳖血在样品盘底部厚度均匀，厚度不超过5mm。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述研磨均质的方式为：使用灭菌处理过的研钵将鳖血冻干品研磨均匀，使其能全部通过2号筛。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预冻和干燥均在冷冻干燥机的冷阱中进行。
7.一种鳖血晶，其特征在于，使用权利要求1~6任一项所述制备方法制得。
8.权利要求7所述鳖血晶在制备免疫调节制剂或抗失血性血虚制剂中的应用。
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