CN115005449B - 一种肿瘤术后复合天然植物蛋白营养餐食及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种肿瘤术后复合天然植物蛋白营养餐食及其制作方法，用于促进肿瘤切除手术后患者的免疫力提高和伤口愈合。本申请所述营养餐食，以大豆分离蛋白为主要氨基酸来源，添加山药低聚肽和功能型三肽Ser‑Asn‑Ala，以及其他营养成分，与普通食品相比可以显著提高肿瘤手术后病人的免疫力，并促进伤口愈合。本申请所述营养餐食，原料易得，制备工艺简单。

Description

一种肿瘤术后复合天然植物蛋白营养餐食及其制作方法
技术领域
本发明属于特殊医学配方食品技术领域，具体涉及一种肿瘤术后复合天然植物蛋白营养餐食及其制作方法。
背景技术
到目前为止，外科手术是治疗肿瘤的最古老方法，也是最主要、效果最好的方法。尽管治疗肿瘤的手段越来越多，但仍有60％以上的肿瘤以手术为主要治疗手段；并且有90％的肿瘤应用手术作为诊断及分期的手段。
肿瘤外科医生通过手术可治愈大部分尚未扩散的肿瘤，也可以通过手术对肿瘤进行精准诊断和分期，制订规范化、个体化的治疗方案，能使患者获得最佳疗效并减轻痛苦，提高生活质量。
实体肿瘤，例如乳腺癌、肝癌、肺癌等一般首选手术治疗，而血液系统肿瘤像淋巴瘤、白血病等则不能行手术治疗。一般肿瘤处于早期可手术治疗，但当肿瘤晚期出现远处或者广泛转移时则不能用手术治疗。患者的一般情况、身体状况能不能耐受手术治疗，也是需要考虑的因素。
肿瘤手术治疗的优点包括：
·去除大量的肿瘤，可以减轻质量效应，可以立即减轻症状
·去除产生刺激身体其他部位癌细胞生长的血液因子的癌细胞
·在不能用辐射治疗的部位(如果患者已经接受了辐射)或系统治疗(例如在某些化学治疗不能达到的大脑)的肿瘤的去除
·潜在的去除小面积内所有癌细胞的能力(患者可以单独手术治愈)
·肿瘤组织(病理)取样观察
o可以检查组织样本以确定该患者的最佳治疗选择。
o如果患者已经接受治疗，可以使用这些样本来查看肿瘤如何对之前的治疗作出反应，以查看是否应该给予更多的治疗或者治疗方式是否需要改变。
·方便患者(因为在患者睡着(全身麻醉)的同时在一天内进行一次手术)
恶性肿瘤手术治疗，作为一种创伤，其应激会不同程度的影响机体免疫功能，主要是引起免疫功能的下降，因此肿瘤手术后的支持治疗中，提高免疫功能具有重要意义，与促进伤口愈合，避免感染同样重要。
肠内营养作为肿瘤患者以及其它手术后患者的营养支持，对于保证治疗效果，改善预后具有非常重要的临床意义。在此特殊时期特殊人群，往往需要高热量、高维生素以及高蛋白的饮食以满足因治疗而产生的身体消耗和组织修复所需要的营养，而这样的饮食结构需求难以通过天然或传统的饮食方式获取。
因此，给予癌症患者有效的肠内营养补充，能维持其肠粘膜屏障和内脏的免疫功能，减少感染并发症和败血症，并促进伤口进口愈合。与肠外营养剂相比(静脉注射脂肪乳等)，肠内营养剂价格低廉，更合乎生理要求，更易于维持，同时还能避免静脉营养引起的肠粘膜破坏，是癌症患者首选的营养途径。
植物蛋白是蛋白质的一种，来源于植物，营养全面，与动物蛋白相仿，易被人体消化吸收，具有多种生理保健功能。
植物蛋白是人类膳食蛋白质的重要来源。谷类一般含蛋白质6％-10％，不过其中所含必需氨基酸种类不完全。薯类含蛋白质2％-3％。某些坚果类如花生、核桃、杏仁和莲子等则含有较高的蛋白质(15％-30％)。豆科植物如某些干豆类的蛋白质含量可高达40％左右。特别是大豆在豆类中更为突出。它不仅蛋白质含量高，而且质量亦高，是人类食物蛋白质的良好来源。
植物蛋白主要来源于米面类、豆类，但是米面类和豆类的蛋白质营养价值不同。米面类来源的蛋白质中缺少赖氨酸(一种必需氨基酸)，因此其氨基酸评分较低，仅为0.3～0.5，这类蛋白质被人体吸收和利用的程度也会差些。
从营养学上说，植物蛋白大致分为两类：一是完全蛋白质，凡是含有各种必需氨基酸且比例适宜的蛋白质，称为完全蛋白质，如大豆分离蛋白质，卵白蛋白，白蛋白，乳白蛋白，酪蛋白；二是不完全蛋白质，缺乏任何一种必需氨基酸的蛋白质，称为不完全蛋白质，绝大多数的植物蛋白质属于此类，例如胶原蛋白、豆球蛋白等。单独使用不完全蛋白质时，不能维持机体的氮平衡和生长发育需求。
随着对肿瘤认识的发展，肿瘤外科治疗已经从最初的单纯手术治疗到现在的综合治疗。现在，肿瘤外科治疗并不是简单地将身体里面的肿瘤切除，而是会根据肿瘤的性质、生长情况、病情严重程度，患者临床情况，确定合适的外科治疗策略，并在肿瘤切除手术后给予适当的营养支持，以促进免疫力的恢复和提高以及伤口的愈合，以利于下一步的肿瘤治疗。
现有营养食品并不能完全满足肿瘤手术后病人的营养及恢复需求，亟需一种可以快速提高手术后病人免疫力以适应进一步化疗需要，并可以有效促进手术伤口愈合的营养餐食。
发明内容
本发明提供一种适用于肿瘤术后的营养餐食，以复合天然植物蛋白(大豆分离蛋白和山药低聚肽)为主要成分，以维生素A，维生素C，维生素D3，维生素E，维生素K1，食用盐为必需营养来源，以麦芽糊精和大豆油为热量来源，以小分子三肽L-丝氨酸-L-天冬酰胺基-L-丙氨酸(Ser-Asn-Ala)为营养添加剂。
所述营养餐食对于肿瘤术后病人的伤口愈合具有显著的促进作用，同时可以提升病人的免疫力，利于肿瘤的全病程治疗。
所述肿瘤术后复合天然植物蛋白营养餐食由以下成分组成：
本申请进一步提供所述营养餐食的制备工艺，如下：
步骤1)取处方量大豆油，依次加入维生素A，D3，E，K1搅拌溶解，得复合维生素大豆油溶液；
步骤2)取处方量70％纯化水，依次加入维生素C，大豆分离蛋白，Ser-Asn-Ala，食用盐，山梨酸钾，搅拌，得乳白色悬浊液；
步骤3)取步骤2)所得悬浊液，加入到步骤1)所得复合维生素大豆油溶液，高压均质，得乳白色或淡黄色乳状液；
步骤4)取步骤3)所得乳状液，加入甘露醇，山药低聚肽，麦芽糊精，搅拌得混悬液，喷雾干燥，得白色至淡黄色粉末，即为本申请所述复合天然植物蛋白营养餐食。
本申请所述复合天然植物蛋白营养餐食在服用时需以温水混悬送服，建议服用量(按体重70kg计算)为每次10-20g，以150-250ml温水送服，每日3次。并注意正餐需为清淡食物，以易消化的食物为主。
本申请所述营养餐食中的成分简述如下：
山药低聚肽：为白色粉末，蛋白质(以干基计)/(g/100g)≥90，低聚肽(以干基计)/(g/100g)≥75，总谷氨酸/(g/100g)≥25，相对分子量质量小于1000的蛋白质水解物所占比例(％)≥85。
山药低聚肽可以通过如下工艺制备：
将山药洗净，去皮，风干，粉碎，取500g混悬于蒸馏水中，质量浓度为10％(W/W)，调节pH为8.5，温度为50℃，加入碱性蛋白酶4.5g，酶解2h。然后用0.1mol/L的HCl溶液调节pH为7.0，加入中性蛋白酶4.0g，酶解3h。酶解结束后，升温至95℃，灭酶10min，再利用离心机8000rpm离心10min，取上清液，用截留分子质量为2×106道尔顿的陶瓷膜过滤，取中间清液，然后利用截留分子质量为1000道尔顿的超滤膜超滤，取滤过液，最后将溶液浓缩并冷冻干燥，得到山药低聚肽干粉。
山药低聚肽也直接购买获得。
大豆分离蛋白是由一系列氨基酸通过肽键结合而成的高分子有机聚合物，它主要由清蛋白和球蛋白组成，其中清蛋白约占5％，球蛋白约占90％。大豆分离蛋白是表面活性剂，它既能降低水和油的表面张力，又能降低水和空气的表面张力。易于形成稳定的乳状液。在烤制食品、冷冻食品及汤类食品的制作中，加入大豆分离蛋白作乳化剂可使制品状态稳定。
大豆分离蛋白可以直接购买获得。
维生素A，C，D3，E，K1用于提供人体必需维生素，可直接购买获得。
Ser-Asn-Ala，为从中国韭菜种子中提取到的小分子三肽化合物，由福州大学生物科学与工程学院洪晶教授等首次提取，并在其学术文章《A novel antibacterialtripeptide from Chinese leek seeds》中首次报道，洪晶教授在此篇文章中报道了此三肽化合物的氨基酸序列，提取方式和抗菌的用途，对于革兰氏阳性菌和阴性菌具有中度抗菌活性，并且申明，体外细胞试验结果显示，此三肽化合物仅具有微弱的溶血活性。
在此篇文章中给出了Ser-Asn-Ala三肽的提取工艺，简述如下：
在室温下，将韭菜籽粉(5.0g)在10％(v/v)乙酸溶液(30mL)中搅拌10小时。提取液4℃，14300g离心15分钟，收集上清液冻干作为韭菜籽肽的来源，命名为CLP。
将冻干的CLP溶解在去离子水中，并加载到用去离子水预平衡的Sephadex G-50凝胶过滤柱(1.6×100cm)上。用去离子水以0.3mL/min的流速洗脱柱子，用分光光度计在214nm处测量所有洗脱组分。使用琼脂盘扩散法测量洗脱部分的抗菌活性，将抗菌活性较高的部分合并并冻干。
通过Sephadex G-50凝胶过滤色谱法将CLP样品分成两个部分(a和b)。将显示对大肠杆菌的抗菌潜力的组分b，注射到带有C18柱的RP-HPLC(反向高效液相色谱法)中进行进一步纯化。纯化后，组分b被分解为11个以上的峰，并且有3个组分(组分7、10和11)对大肠杆菌具有更高的抗菌活性。使用分析型C18柱RP-HPLC测定三个组分的纯度。组分7不是后来通过LC-MS/MS鉴定的肽，组分11与我们之前研究中发现的抗氧化肽完全一致。来自分析C18柱RP-HPLC的组分10为一个单峰表明获得了纯化的抗菌肽，并命名为CLP-1。全波长扫描显示CLP-1在207和222nm处有明显的吸光度，与肽的共同吸收光谱一致。CLP-1的分子量测定为290.08Da，序列被鉴定为Ser-Asn-Ala(SNA)。
根据此序列绘制三肽化学结构如下：
在本申请中，发明人惊奇的发现，将上述三肽化合物添加到营养食品中，尤其是添加到含有山药低聚肽的营养餐食中，口服给予，可以有效提高手术后肿瘤病人的免疫力，并有促进伤口愈合的功效。
麦芽糊精，是由淀粉经低度水解、净化、喷雾干燥制成，不含游离淀粉的淀粉衍生物。具有粘性大、增稠性强、溶解性好、速溶性佳、载体性好、发酵小、吸潮性低、无异味、甜度低，人体易于消化吸收、低热、低脂肪等特点，是食品工业中最理想的基础原料之一，在本申请的营养餐食中用作热量来源，食用后，迅速分解为小分子糖类，易于消化吸收，可以快速补充热量。
大豆油，为常用食用油，在本申请的营养餐食用用作脂肪酸的来源，同时用作脂溶性维生素A，D3，E和K1的溶剂和乳剂的油相。
山梨酸钾，为常用食品防腐剂。
纯化水，用做溶剂，在制备过程中去除。
本申请所述复合天然植物蛋白营养餐食可以显著提高手术后肿瘤病人的免疫力，并促进伤口愈合。
根据《保健食品功能评价方法(2020年版)(征求意见稿)》通过如下试验进一步说明本申请的有益效果：
荷瘤小鼠肿瘤手术切除模型的制备：取近交系615系小鼠，5周龄，雌性，平均体重(20.06±2.15)g，适应性饲养2天后。于一侧背部接种近交系615系小鼠的同源肝癌细胞株HcaF，每只1.0×106/0.2ml，活细胞率99.2％(台盼蓝染色法)。当小鼠肿物达到约1.0cm时(8-9天)，将肿物局部切除，并缝合伤口，对于与皮肤、肌肉、腹膜、骨等黏连或浸润者不予切除。即得肿瘤切除术后小鼠模型。
试验1ConA(刀豆球蛋白A)诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法,检测细胞免疫功能)
试剂配制：
完全培养液：RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨酰胺(200mmol/L)，青霉素(100U/mL)，链霉素(100μg/L)及5×10-5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。
ConA液：用双蒸水配制成100μg/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(-20℃)保存。
无菌Hank's液：用前以3.5％的无菌NaHCO3调pH至7.2-7.4。
MTT液：将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。
酸性异丙醇溶液：96mL异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，临用前配制。
动物分组和样品给予：取手术切除肿瘤模型近交系615系小鼠，130只小鼠，分为13组，每组10只。第一组作为空白对照组，给予常规小鼠饲料，第2-4组为阴性对照组,按分组顺序依次给予对比例处方1-3。第5-13组为样品组，依次摄入实施例3处方1-9，摄入剂量为拟人用剂量的10倍。即0.03g-0.06g每次，每日3次。如小鼠仍有饮食需求，则给予常规小鼠饲料。
受试样品给予时间45天，第46天处死试验动物，进行下一步试验。
脾细胞悬液制备：
在无菌条件下取出处死小鼠的脾，并按样品分组顺序编号。置于盛有适量无菌Hank's液的平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000rpm)。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台盼蓝染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3×106个/mL。
淋巴细胞增殖反应：
将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μL ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃二氧化碳培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值(OD值)。所得OD值以均值±SD形式表示，数据总结如下表所示：
组别 OD值 P1 P2 P3 P4
分组1 0.080±0.059 / / / /
分组2 0.111±0.019 0.131 / / /
分组3 0.130±0.102 0.197 / / /
分组4 0.132±0.074 0.103 / / /
分组5 0.200±0.078 0.001 0.003 0.103 0.061
分组6 0.208±0.135 0.014 0.038 0.166 0.138
分组7 0.211±0.128 0.009 0.026 0.138 0.110
分组8 0.261±0.087 0.000 0.000 0.007 0.002
分组9 0.328±0.134 0.000 0.000 0.002 0.001
分组10 0.334±0.073 0.000 0.000 0.000 0.000
分组11 0.393±0.116 0.000 0.000 0.000 0.000
分组12 0.418±0.191 0.000 0.000 0.001 0.000
分组13 0.422±0.121 0.000 0.000 0.000 0.000
说明：
P1为各个样品组数据与分组1数据的比较所得；
P2为各个样品组数据与分组2数据的比较所得；
P3为各个样品组数据与分组3数据的比较所得；
P4为各个样品组数据与分组4数据的比较所得；
由上述P1数据可以看出，与分组1相比，分组2-4均增加了淋巴细胞增殖能力，但是不显著。即单独加入山药低聚肽或Ser-Asn-Ala或二者均不加入的样品，与常规饲料相比，虽然可以增加淋巴细胞增殖能力，但是并不显著(P>0.05)。
由上述P1，P2，P3及均值数据可以看出，与分组1-3分别相比，分组5-13均显著(P<0.05)增加了淋巴细胞增殖能力，其中分组8-13十分显著(P<0.01)增加了淋巴细胞增殖能力。即同时加入山药低聚肽和Ser-Asn-Ala的样品，显著增加了淋巴细胞增殖能力，其中,如实施例3所示，Ser-Asn-Ala的加入量由1％增加至2％，可以十分显著地增加淋巴细胞增殖能力。
即本申请所述的营养餐食可以显著增加肿瘤术后小鼠的细胞免疫功能，尤其以分组8-13最为显著。
试验2抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法，检测体液免疫)
绵羊红细胞SRBC制备：绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
补体制备：采集豚鼠血，分离出血清(5只豚鼠的混合血清)，将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，震荡，离心取上清，分装，－70℃保存。用时以SA缓冲液按1：10稀释。
玻片涂膜：在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖(0.5g琼脂糖加双蒸水至100mL，加热溶解)，干后长期保存备用。
动物分组和样品给予(同试验1)：取手术切除肿瘤模型近交系615系小鼠，130只小鼠，分为13组，每组10只。第一组作为空白对照组，给予常规小鼠饲料，第2-4组为阴性对照组，按分组顺序依次给予对比例处方1-3。第5-13组为样品组，依次摄入实施例3处方1-9，摄入剂量为拟人用剂量(按70kg计算)的10倍。即0.03g-0.06g每次，每日3次。并给予常规小鼠饲料。
受试样品给予时间45天，之后进行下一步试验。
SRBC免疫动物：取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000rpm)10min，计数细胞，将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL。
脾细胞悬液制备：将SRBC免疫5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank's液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000rpm)10min，用Hank's液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL。
空斑的测定：将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后，放45～50℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hank's液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL 10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配制)，20μL脾细胞悬液(5×106个/mL)，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1：8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。所得溶血空斑数数据以均值(个/105)±SD形式表示，如下表所示：
说明：
P1为各个样品组数据与分组1数据的比较所得；
P2为各个样品组数据与分组2数据的比较所得；
P3为各个样品组数据与分组3数据的比较所得；
P4为各个样品组数据与分组4数据的比较所得；
由上述P1数据可以看出，与分组1相比，分组2-4均增加了抗体生成水平，但是不显著。即单独加入山药低聚肽或Ser-Asn-Ala或二者均不加入的样品，与常规饲料相比，虽然可以增加抗体生成水平，但是并不显著(P>0.05)。
由上述P1，P2，P3，P4及均值数据可以看出，与分组1-4分别相比，分组5-13均显著(P<0.05)增加了抗体生成水平，其中分组8-13十分显著(P<0.01)增加了抗体生成水平。即同时加入山药低聚肽和Ser-Asn-Ala的样品，显著增加了抗体生成水平，其中Ser-Asn-Ala的加入量由1％增加至2％，可以十分显著地增加抗体生成水平。
即本申请所述的营养餐食可以显著增加肿瘤术后小鼠的体液免疫，尤其以分组8-13最为显著。
试验3、NK细胞活性的测定(乳酸脱氢酶测定法)
靶细胞的传代(YAC-1细胞)：实验前24h将靶细胞进行传代培养。用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。
动物分组和样品给予(同试验1)：取手术切除肿瘤模型近交系615系小鼠，130只小鼠，分为13组，每组10只。第一组作为空白对照组，给予常规小鼠饲料，第2-4组为阴性对照组,按分组顺序依次给予对比例处方1-3。第5-13组为样品组，依次摄入实施例3处方1-9，摄入剂量为拟人用剂量的10倍。即0.03g-0.06g每次，每日3次。并给予常规小鼠饲料。
受试样品给予时间45天，之后进行下一步试验。
脾细胞悬液的制备(效应细胞)：在第46天杀死试验小鼠(离断颈椎)，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤。弃上清，将细胞浆弹起，采用NH4Cl-Tris红细胞裂解液裂解红细胞，离心10min(1000rpm)，弃红色上清。用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台盼蓝染色计数活细胞数(在95％以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
NK细胞活性检测：取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500rpm离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，室温反应5min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。
所得NK细胞活性数据以均值±SD的形式表示如下：
说明：
P1为各个样品组数据与分组1数据的比较所得；
P2为各个样品组数据与分组2数据的比较所得；
P3为各个样品组数据与分组3数据的比较所得；
P4为各个样品组数据与分组4数据的比较所得；
由上述P1数据可以看出，与分组1相比，分组2-4均增加了NK细胞活性，但是不显著。即单独加入山药低聚肽或Ser-Asn-Ala或二者均不加入的样品，与常规饲料相比，虽然可以增加NK细胞活性，但是并不显著(P>0.05)。
由上述P1，P2，P3，P4及均值数据可以看出，与分组1-4分别相比，分组5-13均十分显著增加了NK细胞活性(P<0.01)。即同时加入山药低聚肽和Ser-Asn-Ala的样品，显著增加了NK细胞活性。
即本申请所述的营养餐食可以显著增加肿瘤术后小鼠的NK细胞活性。
根据《保健食品功能评价方法(2020年版)(征求意见稿)》，本发明在增强免疫力功能判定中，与常规小鼠饲料组相比，细胞免疫、体液免疫和NK细胞活性结果均为阳性,免疫力均显著增加(P<0.05)，判定本发明具有增强免疫力的作用。
试验4本申请所述营养餐食对伤口愈合的影响：参照CN 107921034 A施行
本研究的目的是评估对比例和实施例3各个处方样品对肿瘤术后模型小鼠切割伤重构的影响。
试验动物及分组：
动物分组和样品给予(同试验1)：取手术切除肿瘤模型近交系615系小鼠，130只小鼠，分为13组，每组10只。背部皮肤脱毛后，用0.5mg/ml戊巴比妥钠麻醉，用打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取直径为10.0mm的全层皮肤，止血后以无菌纱布包扎。第一组作为空白对照组，给予常规小鼠饲料，第2-4组为阴性对照组，按分组顺序依次给予对比例处方1-3。第5-13组为样品组，依次摄入实施例3处方1-9，摄入剂量为拟人用剂量的10倍。即0.03g-0.06g每次，每日3次。如小鼠仍有饮食需求，则给予常规小鼠饲料。
受试样品给予时间21天，在创伤后7天、14天、21天称量体重，并进行伤口拍照，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析和计算小鼠皮肤伤口的面积，并对小鼠伤口愈合率进行计算。
愈合率＝[(原始创面面积-未愈合创面面积)÷原始创面面积]×100％。
所得体重变化数据(以均值(单位：g)±SD的形式表示)如下表所示：
分组 0天 7天 14天 21天
分组1 20.30±0.57 18.84±0.33 19.50±0.58 20.17±0.29
分组2 20.64±0.54 19.39±0.26 19.15±0.21 21.27±0.22
分组3 19.77±0.24 19.83±0.58 20.39±0.34 21.65±0.57
分组4 19.34±0.56 19.43±0.25 19.43±0.36 21.41±0.57
分组5 20.82±0.21 20.36±0.23 21.94±0.41 23.37±0.24
分组6 19.62±0.35 20.17±0.43 20.69±0.28 23.54±0.24
分组7 19.56±0.45 20.53±0.54 20.39±0.52 23.88±0.4
分组8 19.04±0.55 19.83±0.25 21.08±0.51 22.06±0.34
分组9 19.76±0.57 19.82±0.51 21.78±0.33 23.38±0.27
分组10 20.93±0.57 20.63±0.52 21.18±0.27 22.59±0.49
分组11 19.23±0.21 20.35±0.48 21.81±0.56 23.91±0.52
分组12 20.11±0.24 20.32±0.38 21.37±0.43 22.42±0.39
分组13 20.44±0.37 20.95±0.31 21.14±0.24 22.36±0.4
。
由以上数据可以看出：
第7天空白对照组(第一组)小鼠平均体重为18.84g，较0天略有降低。阴性对照组(第2-4组)小鼠平均体重与0天相比基本无变化。样品组(第5-13组)小鼠平均体重与0天相比基本无变化，有些组还略有升高。
第14天空白对照组(第一组)小鼠平均体重为19.50g，较第7天略有升高，但是仍低于0天体重。阴性对照组(第2-4组)小鼠平均体重与0天相比基本无变化。样品组(第5-13组)小鼠平均体重与0天相比均略有升高。
第21天空白对照组(第一组)小鼠平均体重为20.17g，与0天基本相同。阴性对照组(第2-4组)小鼠平均体重与0天相比有所升高。样品组(第5-13组)小鼠平均体重与0天，7天，14天相比均有所升高。
上述数据说明，本申请所述营养餐食对于肿瘤术后体重的恢复具有一定的促进作用，尤其是当在餐食中同时加入了山药低聚肽和Ser-Asn-Ala的样品，与单独加入一种成分或两种成分均不加入相比，促进作用更为明显。
所得愈合率数据(以均值(％)±SD的形式表示)如下：
组别 7天 14天 21天
分组1 17.38±3.11 41.78±3.98 70.03±5.96
分组2 17.22±5.91 46.85±4.92 80.72±3.79
分组3 18.28±4.06 47.06±3.09 82.41±5.82
分组4 17.97±4.74 48.27±4.27 81.15±4.07
分组5 19.14±3.11 50.62±4.95 87.86±3.62
分组6 19.91±4.53 51.86±3.71 90.88±5.82
分组7 22.08±4.64 52.85±3.67 88.48±4.27
分组8 23.44±5.03 53.75±5.06 96.71±4.84
分组9 22.26±4.79 55.35±5.74 95.39±4.63
分组10 24.44±5.92 56.27±4.75 96.03±5.56
分组11 25.99±5.51 61.62±5.46 98.19±5.04
分组12 27.22±5.03 63.77±3.29 99.56±3.43
分组13 26.55±3.51 65.87±5.42 99.91±3.74
。
如上数据可以看出：
第7天空白对照组(第一组)平均愈合率最低，仅为17.38％，阴性对照组加入山药低聚肽或Ser-Asn-Ala的营养餐食小鼠愈合率与第一组相似。样品组(第5-13组)小鼠平均愈合率均高于第1-4组，并且随着Ser-Asn-Ala加入量的增加而增加。
第14天空白对照组(第一组)小鼠平均愈合率为41.78％。低于第2-4组愈合率。样品组(第5-13组)小鼠平均愈合率均高于第1-4组，并且随着Ser-Asn-Ala加入量的增加而增加。
第21天空白对照组(第一组)小鼠平均合率达到70.03％。，但是仍然为所有分组中最低的。第2-4组与第一组相比，略高，但是愈合率数据较为接近，说明在营养餐食中单独加入山药低聚肽或Ser-Asn-Ala并无显著的促进伤口愈合的作用。样品组(第5-13组)小鼠平均愈合率均高于第1-4组，并且随着Ser-Asn-Ala加入量的增加而增加。说明在营养餐食中同时加入山药低聚肽和Ser-Asn-Ala具有协同作用，可以显著促进伤口愈合。
上述数据说明，本申请所述营养餐食对于肿瘤术后，伤口愈合具有一定的促进作用，尤其是当在餐食中同时加入了山药低聚肽和Ser-Asn-Ala的样品，与单独加入一种成分或两种成分均不加入相比，促进作用更为明显，证明在营养餐食中同时加入山药低聚肽和Ser-Asn-Ala具有协同作用，可以显著促进伤口愈合。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1Ser-Asn-Ala口服急性毒性试验(参照CN103301178A施行)
试验动物：取昆明种小白鼠80只，体重约为20g，预试验20只，正式试验60只，每组20只雌雄各半，灌胃给药。
预试验：将Ser-Asn-Ala加入蒸馏水，搅拌制备成最大浓度为0.4g/ml混悬液。参照霍恩(Horn)氏方法，取小鼠20只，雌雄各半，随机分成4组，每组5只，分别灌胃给予不同剂量的Ser-Asn-Ala，0.1ml/10g，0.2ml/10g，0.3ml/10g，0.4ml/10g，连续观察72小时，未见明显毒性反应。提示灌胃给药难以测出其LD50。
最大给药试验：取小鼠60只，雌雄各半，随机分成3组，每组20只，分别灌胃给予Ser-Asn-Ala制备成最大浓度为0.4g/ml混悬液，连续观察14天。给药体积每次按0.2ml/10g，0.3ml/10g，0.4ml/10g给药，一日内共三次给药，最大浓度0.4g/ml，最大用量相当于成人最大临床用量(按实施例3处方9计算，Ser-Asn-Ala约占营养餐食干粉重量的20％)的140倍。观察指标给药后立即观察动物活动情况包括(小鼠的呼吸、自主活动与行为活动、眼检指征、唾液分泌、竖毛、肌张力、粪便、尿液等)及死亡情况。每天观察上述指标。
试验结果：Ser-Asn-Ala灌胃给药后，小鼠无明显中毒反应，呼吸正常，自主活动与行为活动无改变，未见眼球分泌物、眼球突出现象，粪便、尿液无异常。观察期间，试验动物摄食正常，体重增加，一般情况良好。试验结束，离断颈椎处死小鼠进行解剖观察，心、肝、脾、肺、肾、睾丸、子宫等脏器未见明显病理改变。本试验测得Ser-Asn-Ala的最大给药量相当于临床人(70kg)最大拟用量0.21g/kg/天的140倍。
实施例2山药低聚肽口服急性毒性试验(参照CN103301178A施行)
按实施例1方法，施行山药低聚肽口服急性毒性试验。试验结果：山药低聚肽灌胃给药后，小鼠无明显中毒反应，呼吸正常，自主活动与行为活动无改变，未见眼球分泌物、眼球突出现象，粪便、尿液无异常。观察期间，试验动物摄食正常，体重增加，一般情况良好。试验结束，处死动物进行解剖观察，心、肝、脾、肺、肾、睾丸、子宫等脏器未见明显病理改变。本试验测得山药低聚肽的最大给药量相当于临床人(70kg)最大拟用量0.21g/kg/天的140倍。
实施例3复合天然植物蛋白营养餐食的制备
处方组成：
。
制备方法：
步骤1)取处方量大豆油，依次加入维生素A，D3，E，K1搅拌溶解，得复合维生素大豆油溶液；
步骤2)取处方量70％纯化水，依次加入维生素C，大豆分离蛋白，Ser-Asn-Ala，食用盐，山梨酸钾，搅拌，得乳白色悬浊液；
步骤3)取步骤2)所得悬浊液，加入到步骤1)所得复合维生素大豆油溶液，高压均质，得乳白色或淡黄色乳状液；
步骤4)取步骤3)所得乳状液，加入甘露醇，山药低聚肽，麦芽糊精，搅拌得混悬液，喷雾干燥，得干燥粉末，即为本申请所述复合天然植物蛋白营养餐食。
对比例空白对照样品的制备
本实验制备山药低聚肽、Ser-Asn-Ala或二者均空白样品，用于说明二者在本申请所述营养食品中的作用，处方组成如下：
组分 处方1 处方2 处方3
山药低聚肽 0 5.0g 0
Ser-Asn-Ala 0 0 5.0g
大豆分离蛋白 5.0g 5.0g 5.0g
维生素A 200μg 200μg 200μg
维生素C 0.5g 0.5g 0.5g
维生素D3 100单位 100单位 100单位
维生素E 0.2g 0.2g 0.2g
维生素K1 5mg 5mg 5mg
麦芽糊精 2.0g 2.0g 2.0g
大豆油 2.0g 2.0g 2.0g
食用盐 1.0g 1.0g 1.0g
甘露醇 5.0g 5.0g 5.0g
山梨酸钾 0.005 0.005 0.005g
纯化水定容至 100ml 100ml 100ml
。
制备方法：
步骤1)取处方量大豆油，依次加入维生素A，D3，E，K1搅拌溶解，得复合维生素大豆油溶液；
步骤2)取处方量70％纯化水，依次加入维生素C，大豆分离蛋白，Ser-Asn-Ala，食用盐，山梨酸钾，搅拌，得乳白色悬浊液；
步骤3)取步骤2)所得悬浊液，加入到步骤1)所得复合维生素大豆油溶液，高压均质，得乳白色或淡黄色乳状液；
步骤4)取步骤3)所得乳状液，加入甘露醇，山药低聚肽，麦芽糊精，搅拌得混悬液，喷雾干燥，即为本申请所述复合天然植物蛋白营养餐食的空白对照样品。

Claims (3)

1.一种肿瘤术后复合植物蛋白营养餐食，其特征在于，组成如下：
成分 用量
Ser-Asn-Ala 1.0-5.0g
山药低聚肽 1.0-5.0g
大豆分离蛋白 5.0g
维生素A 200μg
维生素C 0.5g
维生素D3 100单位
维生素E 0.2g
维生素K1 5mg
麦芽糊精 2.0g
大豆油 2.0g
食用盐 1.0g
甘露醇 5.0g
山梨酸钾 0.005g
纯化水定容至 100ml。
2.如权利要求1所述的肿瘤术后复合植物蛋白营养餐食，其特征在于，制备工艺如下：
步骤1)取处方量大豆油，依次加入维生素A，D3，E，K1搅拌溶解，得复合维生素大豆油溶液；
步骤2)取处方量70％纯化水，依次加入维生素C，大豆分离蛋白，Ser-Asn-Ala，食用盐，山梨酸钾，搅拌，得乳白色悬浊液；
步骤3)取步骤2)所得悬浊液，加入到步骤1)所得复合维生素大豆油溶液，高压均质，得乳白色或淡黄色乳状液；
步骤4)取步骤3)所得乳状液，加入甘露醇，山药低聚肽，麦芽糊精，搅拌得混悬液，喷雾干燥，即为复合天然植物蛋白营养餐食。
3.如权利要求1-2任一所述的肿瘤术后复合植物蛋白营养餐食，用于制备肿瘤患者手术后恢复营养餐食的用途。
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