KR101888756B1 - 빅밸리 해마 가수분해물과 홍삼 추출물의 혼합물을 함유하는 피로개선용 건강 기능성 식품 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 Hippocampus abdominalis 건조시료에 Alcalase 단백질 가수분해 효소로 처리하여 가수분해물을 얻고, 상기 가수분해물과 홍삼 추출물은 1:11.5-4 중량비로 배합하고 혼합물의 농도는 200 내지 500㎍/ml 인 해마 가수분해물과 홍삼 추출물의 혼합물을 함유하는 피로개선용 건강 기능성 식품 조성물 및 피로개선용 건강식품을 제공함으로써, 피로의 축적을 감소시키고 개선시키는 효과가 있다.
Description
본 발명은 가수분해물을 이용하여 제조한 빅밸리 해마 가수분해물과 홍삼 추출물을 배합한 혼합물을 함유하는 건강 기능성 식품 조성물로 보다 상세하게는, Alcalase 가수분해 효소를 이용하여 해마 가수분해물을 제조하고, 해마 사용을 식품에서 50% 이하로 사용해야 하는 국내 실정에 맞추어 해마 가수분해물과 홍삼 추출물을 배합함으로써 피로개선의 효과가 있는 빅밸리 해마 가수분해물과 홍삼 추출물의 혼합물을 함유하는 피로개선용 건강 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
해마는 실고기과에 속하는 경골어류로서 52속 215종 중에 해마속 어류 32종이 분류되며 우리나라에는 해마, 가시해마, 복해마, 산호해마, 그리고 점해마 등의 5종이 서식하고 있다.
유럽과 북미에서는 관상용과 건조시켜 기념품이나 골동품 등으로 상품화한 데 반해, 해마는 천식, 간 기능 장애, 성기능 향상 그리고 일반적인 통증에 효능이 있는 것으로 알려져, 중국을 비롯한 동남아시아에서는 약제로서 사용되어져 왔다.
해마의 주요 구성 성분들은 스테로이드, 미네랄, 아미노산 펩타이드 지방산으로 알려져 있고, 해마의 약제로서의 효능에 주력하여 종래의 연구들에서는 항암, 항노화, 항혈전, 항관절염, 항산화, 발기부전 완화, 신경 보호 작용과 같은 효과가 밝혀졌다.
빅벨리해마(Hippocampus abdominalis)는 큰가시고기목(Syngnathifromes), 실고기과(Syngnathidae) 에 속하며 온대와 열대해역에 서식하고 해마들 중에서도 크기가 가장 크고 아름다운 체색과 체형을 지니고 있어 관상가치가 높아 국제 해수 관상생물 시장에서도 인기가 많다.
이미 뉴질랜드, 호주, 중국에서 해마양식이 시도되었고, 최근 제주에서는 식용으로 지정된 빅벨리해마의 완전 양식이 성공하였다. 하지만 이전에 많은 생리활성 연구가 진행된 북해마 (Hippocampus kuda Bleeker), 갈귀해마(Hippocampus guttu- latus), Short-snouted seahorse (Hippocampus hippocampus) 종 등에 비해 빅벨리해마는 생리활성 연구가 많이 부족한 상황이다.
본 발명의 출원인에 의해 빅벨리해마의 소화효소 2종(trypsin, pepsin)과 식품용 가수분해 효소 5종(neutrase, protamex, alcalase, koji- zyme, flavourzyme)을 이용한 빅벨리해마 가수분해물들의 제조와 가수분해물 유래의 각 분자량별 분획물을 이용해 염증을 유발하고 세포 내 조직을 손상시키며, 노화와 암, 당뇨, 뇌졸증, 동맥경화, 심혈관 질환, 빈혈, 위궤양, 치매 등의 질병을 야기하는 원인으로 알려져 있는 자유 라디칼에 대한 소거능을 확인함으로써 해마의 항산화 활성에 관한 연구는 진행된 바가 있으나, 후술할 본 발명의 빅벨리해마 가수분해물의 항피로 효능에 대한 연구는 진행되어진 적이 없다.
피로는 육체적 피로와 정신적 피로로 나눌 수 있고, 증상은 무기력한 상태에서부터 졸림, 근육통, 오한을 동반하는 몸살 등 다양하게 나타나며, 피로가 거듭 되풀이되면 만성피로 증후군을 일으킬 수 있다. 바쁜 생활 속의 현대인들은 활동량의 부족, 정신적인 스트레스, 게으른 습관 및 비만 등으로 인해 피로가 쉽게 나타나, 질병 없이 건강을 유지하고자 하는 관심과 욕구는 점점 높아지고 있다.
일반적으로 피로는 운동 시 세포들의 적절한 에너지 공급을 위하여 산소요구량이 급격히 증가하게 되는데 이때 세포들의 대사가 산소요구량을 충족시키지 못하면 세포는 일시적인 무산소 대사에 의한 에너지 공급 상태가 되어 lactate의 생성과 축적으로 인하여 피로를 유발하게 된다. 따라서 많은 사람들이 피로회복과 건강증진 및 질병예방을 위한 영양물질을 보충하고자 건강 기능성 식품의 섭취를 선호하고 있는 실정이다.
본 발명은 국내에서 해마의 식품용 사용을 50% 미만으로 제한한 조건을 만족하기 위하여 이미 항피로 효능으로 건강기능성 인정을 받은 홍삼과 배합하여 상승효과가 나타나는 가장 우수한 해마 가수분해물의 배합비율을 확인함으로서, 빅벨리해마 가수분해물과 홍삼 추출물을 포함하는 피로개선용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 식품에 있어 해마사용을 50% 이하로 한정해야 하는 국내 실정에 맞추어 Alcalase 가수분해 효소를 이용하여 제조한 가수분해물과 종래의 피로개선의 효과가 알려져 있는 홍삼 추출물을 배합시킴으로써, 50% 이하의 포함량을 만족시키면서 최대의 피로개선의 효과가 있는 해마 가수분해물과 홍삼 추출물의 혼합물을 함유하는 피로개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공하고자 한다.
상기 문제를 해결하기 위한 수단으로서 본 발명은 해마 가수분해물과 홍삼 추출물의 혼합물을 함유하는 피로개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다. 상기 해마는 Hippocampus abdominalis로, 해마 가수분해물은 해마 건조시료에 Alcalase 단백질 가수분해 효소로 처리하여 얻어지며, 해마 가수분해물과 홍삼 추출물은 1:1.5-4 중량비로 배합되며, 혼합물의 농도는 200 내지 500 ㎍/ml이다.
또한, 상기 조성물을 함유하는 해마 가수분해물과 홍삼 추출물의 혼합물을 함유하는 피로개선용 건강식품을 제공한다.
후술된 실시예에 기재된 바와 같이, 해마 가수분해물과 홍삼 추출물의 혼합물을 함유하는 피로개선용 건강 기능성 식품 조성물을 마우스 유래 근아세포인 C2C12 세포주에 처리하여, 그 결과로서 세포증식 효능을 확인하였고, 해마 가수분해물과 홍삼 추출물이 1:1.5-4 중량비로 배합되었을 때 홍삼 100% 추출물보다 피로개선 활성효과가 있었음을 확인하였다.
In vivo 모델로 Zebrafish를 사용하여 근육내 glycogen 및 ATP 함량과 lactate 함량을 측정한 결과, 해마 가수분해물과 홍삼 추출물이 1:1.5-4 중량비로 배합되었을 때 glycogen 함량이 많았고, 피로 유발 물질인 L-Lactate 함량이 현저히 적게 생성되었으며, ATP 함량이 높아 피로개선에 효능이 있음을 확인하였다.
상기 실시예들의 결과를 통해서 본 발명의 해마 가수분해물과 홍삼 추출물은 1:1.5-4 중량비로 배합되고 200 내지 500 ㎍/ml 농도의 혼합물을 함유하는 본 발명의 조성물은 피로개선의 효과가 있는 것으로 사료된다.
도 1은 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율 농도별 세포독성 평가 결과를 나타낸다.
도 2는 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율 농도별 세포증식 효능 결과를 나타낸다.
도 3은 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율 농도별 피로개선 효능 결과를 나타낸다.
도 4는 In vivo 모델에서의 피로개선 활성측정을 위한 운동 수조를 나타낸다.
도 5는 In vivo 모델인 Zebrafish의 EthoVision®system을 이용한 유영분석 결과를 나타낸다.
도 6은 In vivo 모델인 zebrafish 근육 내 glycogen 함량을 나타낸다.
도 7은 In vivo 모델인 zebrafish 근육내 L-Lactate 함량을 나타낸다.
도 8은 In vivo 모델인 zebrafish 근육내 ATP 함량을 나타낸다.
도 2는 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율 농도별 세포증식 효능 결과를 나타낸다.
도 3은 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율 농도별 피로개선 효능 결과를 나타낸다.
도 4는 In vivo 모델에서의 피로개선 활성측정을 위한 운동 수조를 나타낸다.
도 5는 In vivo 모델인 Zebrafish의 EthoVision®system을 이용한 유영분석 결과를 나타낸다.
도 6은 In vivo 모델인 zebrafish 근육 내 glycogen 함량을 나타낸다.
도 7은 In vivo 모델인 zebrafish 근육내 L-Lactate 함량을 나타낸다.
도 8은 In vivo 모델인 zebrafish 근육내 ATP 함량을 나타낸다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 자세히 설명하면 다음과 같다.
1.
빅벨리
해마
가수분해물과
홍삼추출물이 혼합된 조성물 제조
1.1
빅벨리
해마
가수분해물
제조
본 발명 실시예에서 사용한 실험어는 제주 한국해수관상어센터에서 양식 생산되는 빅벨리 해마(Hippocampus abdominalis)를 동결건조 후 분쇄하여 -70℃에 보관하며 사용하였다.
Alcalase 가수분해효소를 사용하여 기질 대 효소비를 100:1로 하였으며, 24 시간동안 가수분해를 실시하였고, 효소반응 정지를 위해 100℃에서 10분간 효소를 불활성화 시킨 후 pH를 7.0으로 조정하였다. 이후 20분간 원심분리를 한 뒤 잔사를 제외한 상층액을 여과지를 사용하여 여과하여 동결건조 후 분말화하여 실험에 사용하였다.
또한 본 발명에서 사용되는 홍삼추출물은 시판되는 농축액으로 (주)일화 홍삼농축액을 구입하여 사용하였다. 상기 해마 가수분해물과 홍삼 추출물은 1:1.5-4 중량비로 배합하여 실험을 진행하였다.
1.2 세포독성 평가 실험
마우스 유래 근아세포인 C2C12 세포주를 10% 소혈청(bovine serum)과 L-글루타민을 포함하는 DMEM (Dulbeccos’modified Eagle’medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
48 well plate에 5×104 cells/ml로 분주한 후, 16 시간이 지난 후 10% 말 혈청이 들어간 DMEM 배지로 바꿔주었다. 샘플은 상기 제조한 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율(홍삼배합비율 기준으로 20%~80%)과 농도별로 (50, 100, 200, 250, 500 ㎍/ml처리하였고 24시간 동안 배양하였다.여기서 홍삼 배합비율기준이란 예를 들어 홍삼 추출물이 20%이면 해마가수분해 추출물은 80%로 이루어지는 것을 의미한다.
세포독성 평가를 측정하기 위하여 MTT assay를 실시하였고, 원리는 생존하면서 대사가 왕성한 세포 내 mitochondria의 탈수소효소 작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT [3-(4,5-dimethylthiaxol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]를 환원시켜 자주색을 띠는 비 수용성의 formazan을 측정하는 것이다.
24시간이 지난 후, MTT 용액 50 μl (2 mg/ml)을 첨가하여 2시간 동안 반응시킨다. 상층액을 완전히 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 1은 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율 농도별 세포독성 평가 결과를 나타낸다. 상기 실험 결과 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율 농도별 처리 시 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.
2. 해마
Alcalase
가수분해물과
홍삼 추출물로 이루어진 조성물의 피로개선
2.1 세포증식 효능
마우스 유래 근아세포인 C2C12 세포주를 10% 소혈청(bovine serum)과 L-글루타민을 포함하는 DMEM (Dulbeccos’modified Eagle’medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
48 well plate에 5×104 cells/ml로 분주한 후, 16 시간이 지난 후 10% 말 혈청이 들어간 DMEM 배지로 바꿔주었다. 샘플은 상기 제조한 해마 Alcalase와 홍삼 추출물 배합비율(홍삼배합비율 기준으로 0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%) 농도별로 (200, 250, 300, 400, 500 ㎍/ml처리하였고 총 4일간 배양하였다.
4일간 배양하는 동안 2일에 한 번씩 배지를 새로 바꿔주고, 샘플도 다시 처리하였다. 총 4일간 배양 후에 세포증식 효능을 측정하기 위하여 MTT assay를 이용하여 실험하였다.
도 2는 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율 농도별 세포증식 효능 결과를 나타낸다. 상기 실험 결과, 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율이 0%, 20% 일 때 200, 250 ㎍/ml에서 세포증식 효능이 가장 우수하였고, 이와 같은 결과를 통해 해마 Alcalase 가수분해물 자체가 세포증식 효능이 있는 것으로 사료된다.
그러나 상기에 기재한 바와 같이, 국내에서는 해마를 식품으로 사용하기 위해서는 해마추출물의 함유량을 50% 미만으로 사용해야 하기 때문에 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물 배합 비율 60%(홍삼추출물 60%, 해마가수분해추출물 40%), 80%(홍삼추출물 80%, 해마가수분해추출물 20%) 일 때의 결과를 살펴보면, 배합 비율이 60%, 80% 일 때 농도 의존적으로 세포 증식 효능이 증가함을 확인할 수 있었다.
마우스 유래 근아세포의 세포증식 효능은 즉 근세포의 증식이 많아지면 그만큼 근육량이 많아지기 때문에 상기의 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물 배합 비율 60%, 80%이 피로를 덜 받을 수 있다는 것을 간접적으로 보여주는 것으로 사료된다.
2.2 피로개선 활성
마우스 유래 근아세포인 C2C12 세포주를 10% 소혈청(bovine serum)과 L-글루타민을 포함하는 DMEM (Dulbeccos’modified Eagle’medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 48 well plate에 5×104 cells/ml로 분주한 후, 16 시간이 지난 후 10% 말 혈청이 들어간 DMEM 배지로 바꿔주었다.
샘플은 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물 배합비율(홍삼배합비율 기준으로 0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%) 농도별로 (200, 250, 300, 400, 500 ㎍/ml처리하였고 총 4일간 배양하였다.
4일간 배양하는 동안 2일에 한 번씩 배지를 새로 바꿔주고, 샘플도 다시 처리하였다. 4일간 배양 후 배지와 샘플을 바꿔준 후 1시간 후에 피로유도 물질로 100μM H2O2를 세포에 처리 후 24시간 후에 피로개선 활성을 측정하기 위하여 MTT assay를 이용하여 실험하였다.
도 3은 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율 농도별 피로개선 효능 결과를 나타낸다. 상기 실험 결과 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율이 60%, 80% 일때 농도 의존적으로 홍삼 100% 보다 피로개선 효능이 더 우수함을 확인할 수 있었고 특히 500 ㎍/ml의 농도일 때 홍삼 100% 샘플과의 확연한 활성차이가 있음을 확인하였다. 이와 같은 결과로 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합으로 인해 피로개선 활성에 있어 상승효과가 있음으로 사료된다.
2.3
In
vivo
모델에서의 피로개선 활성 평가
In vivo 모델로 Zebrafish를 사용하였으며, zebrafish는 인간과 유전적 상동성이 유사한 척추동물로서 손쉽게 이용하기가 쉬워 실험에 사용하였다. 도 4는 In vivo 모델에서의 피로개선 활성측정을 위한 운동 수조를 나타낸다. 상기 운동수조에 Zebrafish 50마리를 각각 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율별 (Control, 0%, 60%, 80%, 100%)로 그룹을 나누어 2일에 한번 운동, 3일에 한번 샘플 (500 ㎍/ml)을 투여하여 실험하였다.
Control 그룹은 해마 Alcalase 가수분해물 및 홍삼 추출물을 먹이지 않은 그룹이다. 운동수조의 유속은 0.3~0.4 m2/sec 이며, zone 1과 2로 나누어 2일에 한번 운동을 시킬 때마다 30분 동안 EthoVision®system을 이용하여 zebrafish가 어느 zone에 더 많이 머물고 이동하는지 유영분석을 하여 실험 결과값을 얻었으며, 실험 시작 후 8일째 되는 날 zebrafish의 근육조직을 얻어 분석하였다. 분석인자들로는 근육내 glycogen 및 ATP 함량과 lactate 함량을 분석하였다.
도 5는 In vivo 모델인 Zebrafish의 EthoVision®system을 이용한 유영분석 결과를 나타낸다. 상기 실험 결과, (A)의 결과는 Zone 1과 2에 zebrafish가 이동한 횟수를 나타낸 결과로 운동수조를 살펴보면 물 흐름이 Zone 1에서 2로 이동하는 것을 볼 수 있는데, Zone 1에 많이 머무를수록 물살을 거스르는 것이기 때문에 피로개선 효능이 있음을 확인할 수 있다.
해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율이 60%, 80% 일때 0%와 100% 비율보다 zone 1에서 머무는 빈도 수가 증가하고 zone 2에 머무는 빈도 수가 감소함을 확인할 수 있었다. (B)의 결과는 zebrafish가 각각의 zone에 머무는 시간을 분석한 결과로 (A)의 결과와 마찬가지의 패턴을 나타내었다.
도 6은 In vivo 모델인 zebrafish 근육 내 glycogen 함량을 나타낸다. zebrafish 내 근육에 존재하는 glycogen 함량을 분석하였한 결과, 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율이 60%, 80% 일때 0%와 100% 비율보다 glycogen 함량이 더 많음을 알 수 있었다.
이는 glycogen 함량이 높을수록 근육 내 존재하는 에너지가 많음을 알 수 있는 결과로, Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율이 60%, 80% 일때 피로를 덜 느끼는 것으로 사료된다.
도 7은 In vivo 모델인 zebrafish 근육내 L-Lactate 함량을 나타낸다. 상기 실험 결과, zebrafish 내 근육에 존재하는 L-Lactate 함량을 분석하였다. L-Lactate는 세포 내 생성 및 축적하게 되면 피로를 유발하는 물질로 피로개선 활성측정에 있어 아주 중요한 인자 중에 하나이다.
해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율이 80% 일때 0%와 100% 비율보다 L-Lactate 함량이 현저히 적게 생성되어 피로개선 활성이 있는 것으로 사료된다.
도 8은 In vivo 모델인 zebrafish 근육내 ATP 함량을 나타낸다. 상기 실험 결과, zebrafish 내 근육에 존재하는 ATP 함량을 분석한 결과이다. 일반적으로 세포들이 적절한 에너지 공급을 위하여 산소요구량이 급격히 증가하게 되는데 이때 세포들의 대사가 원활히 진행되게 되면 lactate 생성이 없고 ATP 생성이 증가하게 된다.
상기의 결과는 해마 Alcalase 가수분해물과 홍삼 추출물의 배합비율이 80% 일때 0%와 100% 비율보다 ATP 함량이 더 높아 피로누적이 되지 않음을 보여주는 결과이다.
완전 양식이 성공된 빅벨리해마와 피로개선의 효능이 알려진 홍삼 추출물을 함유하는 기능성 식품을 제공함으로써, 수산양식산업 뿐만 아니라 기능성 제품 개발 산업을 발전시키고 소득증대의 효과가 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.
Claims (4)
- 빅밸리 해마(Hippocampus abdominalis)의 Alcalase에 의한 가수분해물과 홍삼 추출물이 1 : 1.5 ~ 4 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 빅밸리 해마 가수분해물과 홍삼 추출물의 혼합물로 이루어진 피로개선용 건강기능성 식품 조성물
- 제1항의 빅밸리 해마 가수분해물과 홍삼 추출물의 혼합물을 함유 농도 200 내지 500㎍/ml로 포함하는 것을 특징으로 하는 빅밸리 해마 가수분해물과 홍삼 추출물의 혼합물로 이루어진 피로개선용 건강기능성 식품 조성물
- 제1항 또는 제2항의 건강기능성 식품 조성물을 포함하는 피로개선용 건강 기능성 식품
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