JP6643314B2

JP6643314B2 - 骨分化促進能及び歯周靭帯線維母細胞活性促進能を有するペプチド及びその用途

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Publication number: JP6643314B2
Application number: JP2017504365A
Authority: JP
Inventors: ヨンジ・チョン; ウンミ・キム; ウンジ・リ; アルム・ハン; ヒョナ・チョン
Original assignee: Caregen Co Ltd
Current assignee: Caregen Co Ltd
Priority date: 2014-07-28
Filing date: 2014-08-05
Publication date: 2020-02-12
Anticipated expiration: 2034-08-05
Also published as: EP3181145A1; CN106794220A; JP2017526653A; KR101610861B1; CN106794220B; EP3181145A4; US10000534B2; KR20160014184A; EP3181145B1; WO2016017845A1; US20170247411A1; ES2797736T3

Description

本特許出願は、２０１４年７月２８日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−００９５８９３号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。

本発明は、骨分化促進能及び歯周靭帯線維母細胞活性促進能を有するペプチド及びその用途に関する。

骨は、我が体において、石灰化された代表的な組織であって、再形成過程を通じて体を支える役割をしている。骨に生じる疾患の原因は、大きく３つに分類されるが、その１、成長発育過程で大きさの異常が生じる場合、その２、骨のリモデリング過程で造骨細胞による骨形成と破骨細胞による吸収のバランスが崩れる場合、その３、骨の石灰化あるいは鉱物化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）に異常が生じる場合がある。

ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）スーパーファミリーは、ＴＧＦ−β、Ｎｏｄａｌ、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）、ＢＭＰｓ（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ）のような４０個以上の種類から構成されている。ＴＧＦ−βシグナリングは、特定なタイプＩとタイプＩＩセリン／トレオニンキナーゼ受容体が複合体を形成し、異型複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃｃｏｍｐｌｅｘ）の形態で原形質膜を横切って最初に信号を伝達する。ＴＧＦ−β／ＢＭＰｓは、身体で多様な機能と哺乳類発達過程の骨形成に関与すると知られている。ＴＧＦ−β／ＢＭＰシグナリングが邪魔されると、腫瘍転移、短指症、関節炎のような多発性骨関連疾患に影響を受けるようになる。

人体の骨は、毎日少しずつ分解されて、分解された量だけ新しい骨で満たされて恒常性を維持する、非常に力動的な器官である。骨を分解する破骨細胞と、骨を再生する造骨細胞のうち、一方の細胞の活性が増加するか減少すると、恒常性破壊による様々な疾病が起こるようになる。骨を吸収する破骨細胞の活性が増加すると、骨を分解が促進され、骨がもろくなって骨折しやすくなる骨粗しょう症のような疾患が起こり、造骨細胞の活性が増加すると、骨密度の増加により骨の奇形や骨石灰症が起こるようになる。そのため、破骨細胞と造骨細胞のバランスが重要である。

今まで知られた薬品としては、バイオシミラー医薬品専門企業のコリアボーンバンクが最近骨形成タンパク質‘Ｒａｆｕｇｅｎ’に対して食品医薬品安全庁から臨床試験の承認をもらって、臨床試験に入った。その他にも、大熊製薬株式会社が、骨形成促進タンパク質‘ＢＭＰ２’と人工骨をグラフトした新概念バイオ融合医療機器としてノボシス（ＮＯＶＯＳＩＳ）を発売したが、このノボシスは、インプラントを始めとした骨移植関連治療に多様に活用される予定であって、自家移植より骨がさらによく接合されて、手術時間と出血は減少され、速い回復が期待できると報告した。その他にも、同和薬品株式会社の‘ＤＷ１３５０’という薬品が、破骨細胞の抑制だけではなく、造骨細胞の促進機能に優れている薬品として発売されたが、今まで臨床試験を続けており、国内に発売されていない状況である。

本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために鋭意研究した結果、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが、造骨細胞の成長及び分化を促進し、歯周靭帯線維母細胞の活性を促進するなど、優れた生理活性を有することを見出し、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、骨分化促進活性及び歯周靭帯線維母細胞活性促進能を有するペプチドを提供することにある。

本発明の他の目的は、骨疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、歯周疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。

本発明の一様態によると、本発明は、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列から構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる、造骨分化促進活性を有するペプチドを提供する。

本発明の他の一様態によると、本発明は、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列から構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる、歯周靭帯線維母細胞活性促進活性を有するペプチドを提供する。

本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために鋭意研究した結果、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが、造骨細胞の成長及び分化を促進し、歯周靭帯線維母細胞の活性を促進するなど、優れた生理活性を有することを見出した。

本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
（ｉ）本発明の配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドは、造骨細胞の増殖と分化促進、及び歯周靭帯線維母細胞の増殖と活性促進効能を示す。
（ｉｉ）本発明のペプチドは、ｓｍａｄ１／５／８リン酸化のようなＢＭＰシグナリングを増加させ、造骨細胞の成長及びＣＯＬ１Ａ１、ＢＳＰ、ＡＬＰのような分化マーカーの発現を増加させることにより、究極的に造骨活性を示す。
（ｉｉｉ）本発明のペプチドは、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔリン酸化を通じて、歯周靭帯線維母細胞の成長を促進し、ＣＯＬ１Ａ１及びＤＳＰＰのような活性マーカーの発現を増加させることにより、究極的に歯周組織再生活性を示す。
（ｉｖ）本発明は、上述のペプチドを含む骨疾患の予防または治療用組成物及び歯周疾患の予防または治療用組成物を提供する。

図１ａは、本発明の合成例により製造された配列番号１のペプチドを処理した骨母細胞の細胞成長促進効果を示したグラフである。図１ｂは、本発明の合成例により製造された配列番号２のペプチドを処理した骨母細胞の細胞成長促進効果を示したグラフである。図２ａは、本発明の合成例により製造された配列番号１のペプチドを処理した場合に発現されるＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の程度を、細胞染色を通じて確認した結果である。図２ｂは、本発明の合成例により製造された配列番号２のペプチドを処理した場合に発現されるＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の程度を、細胞染色を通じて確認した結果である。図３ａは、本発明の合成例により製造された配列番号１のペプチドを処理した場合の骨分化マーカーのｍＲＮＡ発現程度を確認した結果である。図３ｂは、本発明の合成例により製造された配列番号２のペプチドを処理した場合の骨分化マーカーのｍＲＮＡ発現程度を確認した結果である。図４ａは、本発明の合成例により製造された配列番号１のペプチドを処理した場合の、骨分化関連シグナルであるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化程度を確認した結果である。図４ｂは、本発明の合成例により製造された配列番号２のペプチドを処理した場合の、骨分化関連シグナルであるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化程度を確認した結果である。本発明の合成例により製造された配列番号１のペプチドを処理した場合の、コラーゲンスポンジ内に浸透した骨細胞の様相をＨ＆Ｅ染色で確認した結果である。図６ａは、本発明の合成例により製造された配列番号１のペプチドを処理した場合の、歯周靭帯線維母細胞の細胞成長促進効果を示したグラフである。図６ｂは、本発明の合成例により製造された配列番号２のペプチドを処理した場合の、歯周靭帯線維母細胞の細胞成長促進効果を示したグラフである。図７ａは、本発明の合成例により製造された配列番号１のペプチドを処理した場合の、歯周靭帯線維母細胞の細胞成長促進関連タンパク質であるＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのリン酸化程度が増加することを確認した結果である。図７ｂは、本発明の合成例により製造された配列番号２のペプチドを処理した場合の、歯周靭帯線維母細胞の細胞成長促進関連タンパク質であるＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのリン酸化程度が増加することを確認した結果である。図８ａは、本発明の合成例により製造された配列番号１のペプチドを処理した場合の歯周靭帯線維母細胞の活性化程度を、関連遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１及びＤＳＰＰのｍＲＮＡ発現増加により確認した結果である。図８ｂは、本発明の合成例により製造された配列番号２のペプチドを処理した場合の歯周靭帯線維母細胞の活性化程度を、関連遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１及びＤＳＰＰのｍＲＮＡ発現増加により確認した結果である。

本発明のペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む。具体的に、本発明のペプチドは、必須的に配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列から構成されている。

本発明の一具現例によると、本発明のペプチドは、造骨細胞の増殖を促進して、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５及びＳｍａｄ８のリン酸化を誘導し、ＢＭＰシグナルを活性化させて、骨形成マーカーと知られたＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＣＯＬ１Ａ１（ＣｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅＩａｌｐｈａ１）及びＢＳＰ（Ｂｏｎｅｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を増加させることにより、結果的に骨分化を促進させる。

本発明の他の具現例によると、本発明のペプチドは、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔリン酸化を通じて、歯周靭帯線維母細胞の成長を促進し、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのリン酸化を増加させて、ＣＯＬ１Ａ１（ＣｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅＩａｌｐｈａ１）及びＤＳＰＰ（Ｄｅｎｔｉｎｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）のような活性マーカーの発現を増加させ、歯周靭帯線維母細胞の活性を促進させることにより、究極的に歯周組織再生活性を示す。

本明細書で使用される用語‘ペプチド’は、ペプチド結合により、アミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔａｌ．，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）によって製造できる。

本発明の一具現例によると、前記ペプチドのＮ−またはＣ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される保護基が結合される。

上述のアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用をする。

上述の保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。

本明細書で言及される用語‘安定性’は、‘イン・ビボ’安定性だけではなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。

本発明の他の様態によると、本発明は、上述の配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列から構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、骨疾患の予防または治療用組成物を提供する。

本発明の組成物は、上述の本発明の配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。

下記の実施例で立証されたように、本発明の配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドは、造骨細胞の増殖及び分化を促進するため、骨疾患の予防または治療に非常に有効である。

本発明の骨疾患予防または治療用組成物は、造骨機能が円滑ではなくて骨密度が低下するか、あるいは関節の炎症などにより破骨作用が過度なる場合に発生するあらゆる疾患に使用でき、例えば、骨粗しょう症、少年期骨粗しょう症、骨形成不全症、骨軟化症、骨壊死症、くる病、骨髄炎、歯槽骨消失、骨のパジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、高カルシウム血症、原発性副甲状腺機能亢進症、転移性（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）骨疾患、骨髄腫、リウマチ関節炎における骨消失、癌による骨消失、線維性骨異形性症、無形性骨疾患、代謝性骨疾患及び年による骨質量の消失などに使用できる。

本発明の一具現例によると、本発明の組成物は、（ａ）上述の本発明のペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物で製造できる。

本明細書で用語‘薬剤学的有効量’は、上述のペプチドの効能または活性を達成するに十分な量を意味する。

前記薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口、好ましくは、非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などにより投与できる。

本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方できる。一方、本発明の薬剤学的組成物のある投与量は、１日当たり０．０００１〜２００μｇである。

本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造するか、または多用量容器内に入れて製造できる。ここで剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤またはゲル（例えば、ハイドロゲル）の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。

本発明の他の様態によると、本発明は、上述の配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列から構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、歯周疾患の予防または治療用組成物を提供する。

本発明の組成物は、上述の本発明のペプチドを有効成分として含むため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。

歯周疾患治療の究極的な目標は、歯槽骨、歯周靭帯、セメント質など、破壊された組織の再生にある。ヒト歯周靭帯線維母細胞は、歯周靭帯線維母細胞と骨母細胞、セメント芽細胞に分化、増殖が可能であって、歯周組織再生の中枢的役割を担当するため、歯周組織再生のための歯周組織工学の応用時、活用すべき代表的な細胞である。歯周組織の再生のためには、多様な分化能力のある歯周靭帯細胞の増殖を促進させ、組織再生を誘導することが重要である。

下記の実施例で立証されたように、本発明のペプチドは、歯周靭帯線維母細胞の増殖と活性を促進し、歯周組織の維持と再生に関与する細胞外基質構成成分の強化効果を示す。したがって、本発明の組成物は、多様な歯周疾患の予防または治療に非常に有効である。

歯周疾患は、数多い口腔感染疾患の一つであって、３０歳以上の人間から発生する歯牙消失の主要原因である。

本明細書の用語‘歯周疾患（ｐｅｒｉｄｏｎｔａｌｄｉｓｅａｓｅ）’は、実質的に歯周組織（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｕｍ）に影響を及ぼす数多い疾患を含む。歯周組織は、歯牙の被覆組織及び支持組織から構成されており、歯槽骨（ａｌｖｅｏｌａｒｂｏｎｅ）、歯周靭帯（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔ）、セメント質（ｃｅｍｅｎｔｕｍ）及び歯齦（ｇｉｎｇｉｖａ）を含む。他のたくさんの疾患が歯牙−支持組織（ｔｏｏｔｈ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）に影響を及ぼす反面、プラーク−誘導された炎症性疾患が歯周疾患の大部分を占めて、伝統的に歯齦炎（ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ）または歯周炎（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）に分類される。

本発明において歯周疾患は、歯周炎（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）、歯齦炎（ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ）、歯冠周囲炎（ｐｅｒｉｃｏｒｏｎｉｔｉｓ）、歯周膿瘍（Ｐａｒｏｄｏｎｔａｌａｂｓｃｅｓｓ）、歯周症（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｓｉｓ）、その他の歯周疾患（ｏｔｈｅｒｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｄｉｓｅａｓｅｓ）またはこれらの組み合わせから選択される。

本明細書の用語‘歯齦炎（ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ）’は、歯齦組織の炎症であって、歯周疾患発病の第一のサインである。

本明細書の用語‘歯周炎（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）’は、歯齦ユニット（ｇｉｎｇｉｖａｌｕｎｉｔ）だけではなく、歯槽骨、歯周靭帯及びセメント質で発生する炎症を意味する。一般に、歯周炎は、歯齦の慢性付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）の消失（ｌｏｓｓ）及び骨の放射性消失により特徴付けられる。

本発明は、歯周疾患の効果的な予防及び治療のために、口腔用組成物形態として提供できて、前記口腔用組成物の剤形は、特に限定されず、通常の剤形であればよい。具体的には、歯磨き、口腔洗浄剤または口腔清潔剤などの剤形である。本発明で提供する口腔用組成物は、その剤形によって、製剤化に必要な各種の基剤と添加物を含有することができて、これらの成分の種類と量は、当業者によって容易に選定できる。例えば、口腔用組成物の剤形が歯磨き類である場合、研磨剤、湿潤剤、気泡剤、結合剤、甘味剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、薬効成分、香料、増白剤、色素、溶剤などを添加して製造できる。

本発明の歯周疾患の予防または治療用組成物は、薬剤学的組成物に製造できる。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。

合成例１：ペプチド合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅｒｅｓｉｎ；ＣＴＬｒｅｓｉｎ，ＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍＣａｔＮｏ．０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去してジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶かし、１時間攪拌しながら反応した。反応後、洗浄して、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭに溶かして１０分間反応して、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去して、ＤＭＦを１０ｍｌ入れて、３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピぺリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、それぞれ３分間ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄し、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＣＴＬＲｅｓｉｎを製造した。

新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌して、よく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を分画で２回にかけて入れた後、全ての固体が溶けるまで少なくとも５分間攪拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンの入った反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応した。反応液を除去して、ＤＭＦ溶液で３回５分間ずつ攪拌した後、除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎｔｅｓｔ）を利用して反応程度を点検した。上記と同様に脱保護溶液で２回脱保護反応し、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＣＴＬＲｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。

選定されたアミノ酸配列に基づき、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）順に連鎖反応を行った。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分間ずつ２回反応した後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔ（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を入れて一時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、五酸化リン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｐｅｎｔｏｘｉｄｅ，Ｐ２Ｏ５）下で真空で減圧し、完全に乾燥した後、脱漏溶液［ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量の溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒペプチド１（配列番号１）を０．８５ｇ合成した（収率：８９．９％）。分子量測定器を利用して測定時、分子量１３０３（理論値：１３０３．４４０）が得られた。上記のような方法で、Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓペプチド２（配列番号２）も合成した（収率：９２．１％）。分子量測定器を利用して測定時、分子量１１３３（理論値：１１３３．２７５）の値が得られた。

実施例１：合成ペプチドを活用した骨細胞成長効果の確認
合成例１で合成された配列ペプチドに対するＢＭＰ２類似効能を分析するために、筋芽細胞株（ｍｙｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅ）のＣ２Ｃ１２細胞を利用したＭＴＴアッセイを進行し、増殖促進効能があるかどうかを確認した。

Ｃ２Ｃ１２細胞を、５００ｍｌ容量の組織培養用フラスコを利用して、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）で培養した。培養された細胞株を１％トリプシン溶液で培養容器の底から剥がし、遠心分離して、細胞沈殿物だけを集めた。これを、ＦＢＳが含有されていないＤＭＥＭ培養液に再び懸濁した後、９６−ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり１×１０^３細胞になるように入れて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。２４時間後、血清を完全に除いた同一な培養液で培地を入れ替えた後、標準を定めるための空試料と合成ペプチドを蒸留水に滅菌状態で溶かした後、１０μｇ／ｍｌの濃度で７２時間上記と同一条件で培養した。培養完了したウェルにＭＴＴ試料を入れて、４時間後形成されたホルマザンをＤＭＳＯに溶かして、５６０ｎｍ吸光度を測定し、細胞増殖を測定した。

図１は、配列番号１及び配列番号２のペプチド処理後の造骨細胞の成長に対する結果である。図１ａ及び１ｂに示したように、本発明のペプチドは、造骨細胞の成長を大きく増進させた。

本発明のペプチドは、ＢＭＰＩｂ型受容体に結合して発掘されたものであって、本ペプチドは、骨形成に重要なタンパク質であるＢＭＰと同一な機能をすることが確認された。本発明のＢＭＰ受容体Ｉｂ型結合ペプチドは、天然のＢＭＰと類似した機能を行う。

実施例２：合成ペプチドの骨分化促進効果確認
合成例１で合成された配列ペプチドに対するＢＭＰ２類似効能を分析するために、前駆−骨芽細胞株（ｐｒｅ−ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅ）のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を利用して、ＡＬＰ（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色を通じて、造骨細胞分化促進効能を示すかどうか確認した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２４−ウェルプレートに３×１０^４細胞になるように入れて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。２４時間後、１０％ＦＢＳ，５０ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸＋１００ｍＭｂ−グリセロホスフェートが含有されたアルファ−ＭＥＭ培地に、合成したペプチドを１０ｕｇ／ｍｌ，５０ｕｇ／ｍｌ濃度で処理して、培地を３日に１回ずつ入れ替えながら１３日間培養した。培養完了されたプレートウェルをＰＢＳで２回洗浄後、アセトン、３７％ホルムアルデヒド、クエン酸溶液を含む固定バッファーで３０秒間細胞固定した。白血球アルカリホスファターゼ染色キット（ＳＩＧＭＡ）を利用して、下記の染色を進行した。

ＦＢＢ−アルカリ溶液、亜硝酸ナトリウム溶液を１：１で混ぜて、２分間処理した後、蒸留水とナフトールＡＳ−ＢＩアルカリ溶液とからなるバッファーを処理して、３７℃培養器で１時間発色した。

実験結果、前駆−骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に配列番号１及び２のペプチドを濃度別に処理した時、分化促進によるＡＬＰ発現増加を確認した（図２ａ、ｂ）。

実施例３：合成ペプチドによる骨分化関連遺伝子の発現増加の確認
合成例１で合成された配列ペプチドによる骨分化関連遺伝子ＢＳＰ（ｂｏｎｅｓｉａｌｏｐｒｏｔｉｎ）及びＣＯＬ１Ａ１（ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅＩａｌｐｈａ１）のｍＲＮＡ発現程度を確認するために、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を６−ウェルプレートに２×１０^５細胞になるように入れて、２４時間３７℃，５％ＣＯ_２条件下で培養した。２４時間後、ＦＢＳ１０％含まれた培地に、それぞれのペプチドを１０ｕｇ／ｍｌ、５０ｕｇ／ｍｌ濃度で処理し、陽性対照群として使用されたＢＭＰ２は、１００ｎｇ／ｍｌ濃度で処理した。２日後、ＰＢＳで洗浄し、Ｅａｓｙｂｌｕｅ（Ｉｎｔｒｏｎ）を利用してＲＮＡを分離した。１ｕｇのＲＮＡとＲＴｐｒｅｍｉｘｔｕｒｅ（Ｉｎｔｒｏｎ）を利用してｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲｐｒｅｍｉｘｔｕｒｅ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用してＰＣＲを進行した後、アガロースゲルにかけて各遺伝子のｍＲＮＡ発現程度を確認した。

実験結果、前駆−骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に配列番号１及び２のペプチドを濃度別に処理した時、骨分化遺伝子のｍＲＮＡ発現が増加されることを確認した（図３ａ、ｂ）。

実施例４：合成ペプチドによる骨分化のシグナル促進効果の確認
骨分化促進に係るシグナルのｐＳｍａｄ１／５／８を、本ペプチドが活性化させるかどうか確認するために、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を６−ウェルプレートに２×１０^５細胞になるように入れて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。２４時間後、血清の含まれていない培地に入れ替え、２４時間培養した後、ペプチドを１０μｇ／ｍｌ濃度で処理して、陽性対照群として使用されたＢＭＰ２は、５０ｎｇ／ｍｌ濃度で処理して１５分間、３０分間後にＰＢＳで洗浄し、溶解バッファーを入れて溶解させた後、タンパク質を得てウェスタンブロッティングを進行した。

実験結果、前駆−骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に配列番号１及び２のペプチドを濃度別に処理した時、骨分化シグナル活性化を示すＳｍａｄ１／５／８のリン酸化が促進されることを確認した（図４ａ、ｂ）。

実施例５：合成ペプチドによる骨細胞浸透及び増殖効果の確認
配列番号１のペプチド１００μｇに０．５ｍｍ×０．５ｍｍのコラーゲンスポンジを浸して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの背中に移植して、２週間放置した。その後、コラーゲンスポンジを摘出し、パラフィンブロックに制作して、Ｈ＆Ｅ染色を通じてコラーゲンスポンジ内の骨細胞浸透及び増殖程度を測定した（図５）。

これを通じて、イン・ビトロ上で見られた配列番号１のペプチドの骨細胞増殖及び分化のような骨形成促進効能を、イン・ビボ上でも再確認することができた。

実施例６：合成ペプチドによる歯周靭帯線維母細胞の成長促進効果の確認
配列番号１及び２のペプチドの歯周組織に対する効果を確認するために、歯周靭帯線維母細胞（Ｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に対する成長促進効果を分析した。歯周靭帯線維母細胞を４８−ウェルプレートに１×１０^３細胞になるように入れて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。２４時間後、血清の含まれていない培地に入れ替え、６時間培養した後、ペプチドを０．０５〜１０μｇ／ｍｌ濃度で処理して、陽性対照群として使用されたＢＭＰ２及びＩＧＦ−１は、０．２μｇ／ｍｌ濃度で処理して、７２時間培養した。培養が完了した後、培養上澄み液を除去し、エタノールを利用して細胞を固定化した後、細胞固定が終わった後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色ＳＲＢ溶液で処理して、１％アセト酸で十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察して生存細胞の状態を観察して、２０ｍＭトリスで脱染色された溶液に対して紫外線５６０ｎｍで吸光度を測定し、細胞の生存状態を測定した。

実験結果、歯周靭帯線維母細胞に配列番号１及び２のペプチドを濃度別に処理した時、細胞の成長が処理濃度依存的に増加することを確認した（図６ａ、ｂ）。

実施例７：合成ペプチドによる歯周靭帯線維母細胞の成長促進メカニズムの確認
配列番号１及び２のペプチドの歯周靭帯線維母細胞（Ｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に対する成長促進効果を確認するために、関連シグナリング分子のリン酸化程度をウェスタンブロッティングで確認した。歯周靭帯線維母細胞を６−ウェルプレートに５×１０^５細胞になるように入れて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した後、ペプチドを１０μｇ／ｍｌ濃度で処理して、陽性対照群として使用されたｂＦＧＦは、０．２μｇ／ｍｌ濃度で処理した後、５〜１５分間培養時間別に細胞を回収して、全体タンパク質を分離し、ｐ−ＰＩ３Ｋ、ｐ−Ａｋｔに対するウェスタンブロッティングを進行した。

実験結果、歯周靭帯線維母細胞に配列番号１及び２のペプチドを処理した時、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのリン酸化程度が増加することを確認した（図７ａ、ｂ）。

実施例８：合成ペプチドによる歯周靭帯線維母細胞の活性促進確認
配列番号１及び２のペプチドの歯周靭帯線維母細胞活性促進効果を確認するために、関連遺伝子のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲで確認した。歯周靭帯線維母細胞を２４−ウェルプレートに１．５×１０^４細胞になるように入れて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。２４時間後、血清の含まれていない培地に入れ替え、２４時間培養した後、ペプチドを１、１０μｇ／ｍｌ濃度で処理して、陽性対照群として使用されたＢＭＰ−２及びＩＧＦ−１は、０．２μｇ／ｍｌ濃度で処理して、７２時間培養した。培養完了後、ＰＢＳで洗浄して、Ｅａｓｙｂｌｕｅ（Ｉｎｔｒｏｎ）を利用してＲＮＡを分離した。１μｇのＲＮＡとＲＴｐｒｅｍｉｘｔｕｒｅ（Ｉｎｔｒｏｎ）を利用してｃＤＮＡを合成して、ＰＣＲｐｒｅｍｉｘｔｕｒｅ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用してＰＣＲを進行した後、アガロースゲルにかけて各マーカーのｍＲＮＡレベルを確認した。

実験結果、歯周靭帯線維母細胞に配列番号１及び２のペプチドを濃度別に処理した時、細胞活性関連遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１（ａｌｐｈａ−１ｔｙｐｅＩｃｏｌｌａｇｅｎ）及びＤＳＰＰ（Ｄｅｎｔｉｎｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）のｍＲＮＡ発現程度が増加することを確認した（図８ａ、ｂ）。

以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

Claims

配列番号１で表されるアミノ酸配列及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される１つのアミノ酸配列からなり、
ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＣＯＬ１Ａ１（ＣｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅＩａｌｐｈａ１）、ＢＳＰ（Ｂｏｎｅｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びＤＳＰＰ（Ｄｅｎｔｉｎｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）の少なくとも１つの発現を増加させる、ペプチド。
前記ペプチドは、造骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５及びＳｍａｄ８又は、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのリン酸化を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、歯周靭帯線維母細胞の増殖を促進することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
請求項１から４のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、骨疾患の予防または治療用組成物。
請求項１から４のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、歯周疾患の予防または治療用組成物。