CN106794220A - 具有成骨分化促进能力及牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明的由序列表中序列1或序列表中序列2形成的肽呈现造骨细胞的增殖、分化促进及牙周韧带成纤维细胞的增殖和活性促进功效。本发明的肽通过使如smad1/5/8磷酸化等骨形态发生蛋白(BMP)信号转导增加，来使造骨细胞的生长及如COL1A1、骨唾液酸蛋白、碱性磷酸酶等分化标记的表达增加，从而最终呈现造骨活性。本发明的肽通过磷脂酰肌醇3‑激酶及蛋白激酶B磷酸化，来促进牙周韧带成纤维细胞的生长，并且增加如COL1A1及牙本质涎磷蛋白等活性标记的表达，从而最终呈现牙周组织再生活性。本发明提供包含上述的肽的骨疾病的预防或治疗用组合物及牙周疾病的预防或治疗用组合物。

Description

具有成骨分化促进能力及牙周韧带成纤维细胞活性促进能力 的肽及其用途
技术领域
本申请对2014年7月28日提出于韩国专利局的韩国专利申请第10-2014-0095893号主张优先权，上述申请的公开内容作为参照插入于本说明书。
本发明涉及具有成骨分化促进能力及牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽及其用途。
背景技术
骨头作为我们身体中石灰化的代表性的组织，通过再形成过程，来起到支撑我们的身体的作用。在骨头中产生的疾病的原因大致分为3种，第一、在生长发育过程中产生大小的异常的情况；第二、在骨头的重构过程中，在破坏基于造骨细胞的骨头的形成和基于破骨细胞的吸收的平衡的情况；第三、在骨头的石灰化或矿物化(mineralization)中产生异常的情况。
转化生长因子-β(TGF-β，Transforming growth factor-beta)超级家族由如转化生长因子-β、节部(Nodal)、活化素(Activin)、骨形成蛋白(BMPs，bone morphogeneticproteins)等40个以上的种类构成。
转化生长因子-β信号转导由特定的类型I和类型II丝氨酸/苏氨酸激酶受体形成复合体，来通过异型复合体(heteromeric complex)的形态横穿原生质膜，从而第一次传递信号。众所周知，转化生长因子-β/骨形成蛋白在身体中参与多种功能和哺乳类发育过程的骨质形成。若转化生长因子-β/骨形态发生蛋白信号转导受到妨碍，则如肿瘤转移、短指症、关节炎等由与多发性与骨相关的疾病受到影响。
人体的骨头每天被分解一点儿，并且以新的骨头填满与被分解的量相应的量，从而是保持平衡性的非常动态的器官。若用于分解骨头的破骨细胞和用于再生骨头的造骨细胞中的一种细胞的活性增加或减少，则可产生由平衡性破坏导致的多种疾病。若用于吸收骨头的破骨细胞的活性增加，则促进骨头的分解，并发生如骨头变薄且易破碎的骨质疏松症等疾病，若造骨细胞的活性增加，则由骨密度的增加发生骨头的畸形或骨钙化症。因此破骨细胞和造骨细胞的均衡重要。
作为目前为止众所周知的药品，最近，作为生物仿制药医药品专门化企业的“韩国央行”从食品医药品安全厅针对于骨形成蛋白质“”“Rafugen”得到临床试验授权来进入的临床试验。除此之外，在大雄制药中上市将骨形态发生蛋白2“BMP2”和人工骨头接枝的作为新概念生物融合医疗器械的NOVOSIS，据报告预计上述NOVOSIS在包括种植牙的与骨移植相关的治疗中多样地利用，与自体移植相比骨头更容易结合，并且减少手术时间和出血，从而可期待快的恢复。除此之外同和药品公司的被称为“DW1350”的药品作为不仅抑制破骨细胞而且造骨细胞的促进能力优秀的药品上市，但是到目前为止一直进行临床试验，并处于在韩国内未上市的状况。
本说明书全文中，参照多篇论文及专利文献，并标示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容，作为参照全部插入到本说明书中，从而更加明确地说明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。
发明内容
要解决的问题
本发明人努力开发在生物学上具有有效的活性的优秀的肽，其结果，查明由序列1或序列号2的氨基酸序列形成的肽具有促进造骨细胞的生长及分化，促进牙周韧带成纤维细胞的活性等优秀的生理活性，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供具有成骨分化促进活性及牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽。
本发明的再一目的在于，提供骨疾病的预防或治疗用组合物。
本发明的另一目的在于，提供牙周疾病的预防或治疗用组合物。
解决问题的方案
根据本发明的一实施方式，提供由选自由序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的具有造成骨分化促进活性的肽。
根据本发明的的再一实施方式，本发明提供由选自由序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的具有牙周韧带成纤维细胞分化促进活性的肽。
本发明人努力开发在生物学上具有有效的活性的优秀的肽，其结果，查明了具有序列表中序列1或序列表中序列号2的氨基酸序列的肽具有促进造骨细胞的生长及分化，促进牙周韧带成纤维细胞的活性等优秀的生理活性。
本发明的肽包含序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列。具体地，本发明的肽需要由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列构成。
根据本发明的一实例，本发明的肽促进造骨细胞的增殖，并且诱导Smad1、Smad5及Smad8的磷酸化，来对骨形态发生蛋白信号进行活性化，通过使作为骨质形成标记众所周知的碱性磷酸酶(ALP，Alkaline phosphatase)、COL1A1(I型胶原α1)及骨唾液酸蛋白(BSP，Bone sialoprotein)的表达增加，来最终促进成骨分化。
根据本发明的再一实例，本发明的肽通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及蛋白激酶B(Akt)磷酸化，来促进牙周韧带成纤维细胞的生长，并且通过使磷脂酰肌醇3-激酶及蛋白激酶B的磷酸化增加，如COL1A1(I型胶原α1)及牙本质涎磷蛋白(DSPP，Dentinsialophosphoprotein)等活性标记的表达增加来促进牙周韧带成纤维细胞的活性，最终呈现牙周组织再生活性。
在本说明书中，术语“肽”是指通过肽键来由多个氨基酸残基互相结合而成的线性分子。本发明的肽可通过本领域中公知的化学合成方法，尤其，固相合成技术(solid-phasesynthesis techniques：Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85：2149-54(1963)；Stewart,etal.,So]id Phase Peptide Synthesis,2nd.ed.,Pierce Chem.Co.：Rockford,111(1984))或液相合成技术(美国授权专利第5516891号)来制备而成。
根据本发明的一实例，上述肽的N-或C-末端可与选自由乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈基、肉豆蔻基、十八烷基及聚乙二醇(PEG)组成的组中的保护基。
上述的氨基酸的变形起到大大地改善本发明的肽的稳定性的作用。
在本说明书中所提及的术语“稳定性”是不仅指“体内”稳定性，而且还指储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。
上述保护基起到从生物体内的蛋白质切割酶的攻击保护本发明的肽的作用。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供骨疾病的预防或治疗用组合物，上述骨疾病的预防或治疗用组合物包含选自由上述的序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽作为有效成分。
由于本发明的组合物包含由本发明的上述的序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列组成的肽作为有效成分，因此为了避免本说明书过于复杂，省略共同的记载内容。
如在以下实施例中得到证明，由本发明的序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽促进造骨细胞的增殖及分化，因此在骨疾病的预防或治疗中非常有效。
本发明的骨疾病的预防或治疗用组合物可适用于在因造骨功能不顺畅导致降低骨密度或因关节的炎症等导致破骨作用过渡的情况下发生的全部疾病，例如适用于骨质疏松症、青少年骨质疏松症、成骨不全症、骨软化症、骨坏死症、佝偻病、骨髓炎、牙槽骨质流失、佩吉特氏病(Paget’s disease)、高钙血症、原发性甲状旁腺功能亢进症、转移性(metastatic)骨疾病、骨髓瘤、风湿性关节炎中的骨质流失、转移性骨疾病、由癌症引起的骨质流失、纤维异常增殖症、无力型骨病、代谢性骨疾病及随年龄的骨量损失等。
根据本发明的一实例，本发明的组合物可制备成药剂学组合物，上述药剂学组合物包含：(a)上述的本发明的肽的药剂学有效量；以及(b)药剂学上接受的载体。
在本说明书中术语“药剂学有效量”是指达成上述的肽的功效或活性的充分量。
包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为制剂时通常所使用的物质，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不局限于此。
本发明的药剂学组合物除了上述成分之外还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保鲜剂等。适合的药剂学上接受的载体及制剂详细地记载于Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)。
本发明的药剂学组合物能够进行口服给药或非口服给药，优选地，能够以非口服给药的方式给药，而在进行非口服给药的情况下，能够通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部给药、经皮给药等方式给药。
本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量会根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏度等因素，能够下多种处方。本发明的药剂学组合物的有些给药剂量为每日0.0001～200μg。
本发明的药剂学组合物根据本发明所属领域普通技术人员能够容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂进行制剂化，从而以单位容量形态制备或装在大容量容器内进行制备。此时，剂型可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂或凝胶(例如，水凝胶)的形态，且还能包含分散剂或稳定剂。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供牙周疾病的预防或治疗用组合物，上述牙周疾病的预防或治疗用组合物包含选自由上述的序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽作为有效成分。
由于本发明的组合物包含由本发明的上述的肽作为有效成分，因此为了避免本说明书过于复杂，省略共同的记载内容。
治疗牙周疾病的最终目标在于牙槽骨、牙周韧带、牙骨质等被破坏的组织的再生。人的牙周韧带成纤维细胞可分化、增值为牙周韧带成纤维细胞、成骨细胞及伯牙母细胞，来起到牙周组织再生的中枢作用，因此当应用用于牙周组织再生的牙周组织工程学时，是需要利用的代表性的细胞。为了牙周组织的再生，重要的是通过促进具有多种分化能力的牙周韧带细胞的增殖，来诱导组织再生。
如在以下实施例中得到证明，本发明的肽通过促进牙周韧带成纤维细胞的增殖和活性，来呈现参与牙周组织的保持和再生的细胞外基质构成成分的强化效果。因此，本发明的组合物在多种牙周疾病的预防或治疗中非常有效。
牙周疾病作为很多口腔感染疾病中的之一，使在30岁以上的人类中发生的牙齿流失的主要原因。
在本说明书中的术语“牙周疾病(peridontal disease)”是包含实际上对牙周组织(periodontium)产生影响的很多疾病。牙周组织由牙齿的通水组织及支撑组织构成，并包含牙槽骨(alveolar bone)、牙周韧带(periodontal ligament)、牙骨质(cementum)及牙龈(gingiva)。很多疾病对牙齿-支撑组织(tooth-supporting structures)产生影响，另一方面，诱导菌斑的炎症性部分占有牙周疾病的大部分，传统地，被分类为牙龈炎(gingivitis)或牙周炎(periodontitis)。
在本发明中，牙周疾病选自牙周炎(periodontitis)、牙龈炎(gingivitis)、冠周炎(pericoronitis)、牙周脓肿(Parodontal abscess)、牙周病(Periodontosis)、其他牙周疾病(other periodontal diseases)或它们的组合中。
在本说明书中的术语“牙龈炎(gingivitis)”作为牙龈组织的炎症，是牙周疾病发病的第一个死因。
在本说明书中的术语“牙周炎(periodontitis)”是不仅指牙龈单位(gingivalunit)，而且还指在牙槽骨、牙龈韧带及牙骨质中发生的炎症。通常，牙周炎通过牙龈的慢性附着(attachment)的流失(loss)及骨的放射性流失得到特征。
在本发明中为了牙周疾病的有效预防及治疗能够以口腔用组合物的形态提供，并不特别限制上述口腔用组合物的剂型，可具有通常的剂型。具体地，可具有牙膏、口腔清洁剂或漱口液等的剂型。在本发明中提供的口腔用组合物根据其剂型还可含有所需要的各种的气剂和添加物，它们成分的种类和量可根据本发明所属技术领域的普通技术人员容易选择。例如，在口腔用组合物的剂型为牙膏类的情况下，可添加助磨剂、润湿剂、气泡剂、结合剂、调味剂、pH调节剂、防腐剂、药效成分、香料、增白剂、色素、溶剂等来制备。
本发明的牙周疾病的预防或治疗用组合物可制备成药剂学组合物。
发明的效果
归纳本发明的特征及优点如下。
(i)由本发明的序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽呈现造骨细胞的增殖、分化促进及牙周韧带成纤维细胞的增殖和活性促进功效。
(ii)本发明的肽通过使如smad1/5/8磷酸化等骨形态发生蛋白信号转导增加，来使造骨细胞的生长及如COL1A1、骨唾液酸蛋白、碱性磷酸酶等分化标记的表达增加，从而最终呈现造骨活性。
(iii)本发明的肽通过磷脂酰肌醇3-激酶及蛋白激酶B磷酸化，来促进牙周韧带成纤维细胞的生长，并且使如COL1A1及牙本质涎磷蛋白等活性标记的表达增加，从而最终呈现牙周组织再生活性。
(iv)本发明提供包含上述的肽的骨疾病的预防或治疗用组合物及牙周疾病的预防或治疗用组合物。
附图说明
图1a为表示对根据本发明的合成例制备的序列表中序列1的肽进行处理的成骨细胞的细胞生长促进效果的图表。
图1b为表示对根据本发明的合成例制备的序列表中序列2的肽进行处理的成骨细胞的细胞生长促进效果的图表。
图2a为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列1的肽进行处理时，通过细胞染色确认所表达的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)的程度的结果。
图2b为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列2的肽进行处理时，通过细胞染色确认所表达的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)的程度的结果。
图3a为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列1的肽进行处理时，确认成骨分化标记的信使核糖核酸(mRNA)的表达程度的结果。
图3b为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列2的肽进行处理时，确认成骨分化标记的信使核糖核酸的表达程度的结果。
图4a为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列1的肽进行处理时，确认作为与成骨分化相关的信号的Smad1/5/8的磷酸化程度的结果。
图4b为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列2的肽进行处理时，确认作为与成骨分化相关的信号的Smad1/5/8的磷酸化程度的结果。
图5为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列1的肽进行处理时，苏木精—伊红(H&E)染色确认向胶原海绵内渗透的骨细胞的形态的结果。
图6a为表示对根据本发明的合成例制备的序列表中序列1的肽进行处理时，牙周韧带成纤维细胞的细胞生长促进效果的图表。
图6b为表示对根据本发明的合成例制备的序列表中序列2的肽进行处理时，牙周韧带成纤维细胞的细胞生长促进效果的图表。
图7a为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列1的肽进行处理时，确认作为与牙周韧带成纤维细胞的细胞生长促进相关的蛋白质的磷脂酰肌醇3-激酶及蛋白激酶B的磷酸化程度增加的结果。
图7b为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列2的肽进行处理时，确认作为与牙周韧带成纤维细胞的细胞生长促进相关的蛋白质的磷脂酰肌醇3-激酶及蛋白激酶B的磷酸化程度增加的结果。
图8a为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列1的肽进行处理时，确认作为与牙周韧带成纤维细胞的活性化程度相关的基因的COL1A1及牙本质涎磷蛋白的信使核糖核酸的表达增加的结果。
图8b为对根据本发明的合成例制备的序列表中序列2的肽进行处理时，确认作为与牙周韧带成纤维细胞的活性化程度相关的基因的COL1A1及牙本质涎磷蛋白的信使核糖核酸的表达增加的结果。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅仅是为了对本发进行更加具体的说明的，而根据本发明的要点，本发明的范围不会因这些实施例而受到限制是本发明所属技术领域的普通技术人员显而易见的。
实施例
合成例1：肽合成
将700mg的氯三苯甲基氯树脂(Chloro trityl chloride resin；CTL resin，Novabiochem Cat No.01-64-0021)放入反应容器中，并加入10ml的二氯甲烷(MC)来搅拌了3分钟。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(DMF)来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的二氯甲烷(DCM)溶液放入反应器中，并放入200mmole的Fmoc-Ser(tBu)-OH(瑞士巴亨公司(Bachem，Swiss))及400mmole的二异丙基乙胺(DIEA)后，搅拌并均匀溶解，搅拌1小时并进行反应。反应后清洗，将甲醇和二异丙基乙胺(2：1)溶解于二氯甲烷中，反应10分钟，并用过量的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1：1)进行清洗。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的脱保护溶液(20％的哌啶(Piperidine)/二甲基甲酰胺)放入反应容器中，并在常温条件下搅拌10分钟后，去除了溶液。放入同量的脱保护溶液，并重新维持10分钟反应后，去除溶液，并分别以3分钟的方式用二甲基甲酰胺清洗2次、用二氯甲烷清洗1次、用二甲基甲酰胺清洗1次，来制备了Ser(tBu)-CTL树脂。
在新的反应器中放入10ml的二甲基甲酰胺溶液，并加入200mmole的Fmoc-Lys(Boc)-OH(Bachem，Swiss)、200mmole的羟基苯并三唑(HoBt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(Bop)后，搅拌来均匀溶解。在反应器中，经过2次以分馏的方式放入400mmole的N，N-二异丙基乙胺(DIEA，N，N-Diisopropylethylamine)后，搅拌至所有固体溶解为止至少5分钟。将溶解的氨基酸混合溶液放入具有脱保护的树脂的反应容器中，在常温条件下搅拌1小时并进行反应。去除反应液，并用二甲基甲酰胺溶液每次搅拌5分钟，并搅拌3次后去除。取少量的反应树脂，并利用茚三酮测试(Nihydrin test)检查了反应程度。使用脱保护溶液，以与上述方法相同的方法进行2次脱保护反应，来制备了Lys(Boc)-Ser(tBu)-CTL树脂。使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分清洗，并重新执行一次茚三酮测试，接着以与上述方法相同的方法执行了以下氨基酸附着实验。
根据选定的氨基酸序列，按Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Leu、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Leu、Fmoc-Ser(tBu)及Fmoc-Arg(Pbf)的顺序进行连锁反应。利用脱保护溶液使Fmoc-保护基以10分钟的方式反应2次后，清洗干净并去除。利用二甲基甲酰胺、二氯甲烷及甲醇，分别将放入乙酸酐、N，N-二异丙基乙胺、羟基苯并三唑(HoBt，Hydroxybenzotriazole)乙酰化1小时后制备的肽基树脂清洗3次，使氮气慢慢流入来干燥后，在五氧化二磷(Phosphorus pentoxide，P2O5)条件下，减压成真空状态，来完全干燥后，放入30ml的泄漏溶液[95％的三氟乙酸(TFA，Trifluroacetic acid)、2.5％的蒸馏水、2.5％的苯甲硫醚(Thioanisole)]，接着，在常温条件下微动一下，并保持2小时反应。通过过滤对树脂进行过滤，并利用少量的溶液清洗树脂后，与母液进行混合。利用减压蒸馏至剩有总容积的一半左右的容积，并加入50ml的凉的醚诱导沉淀后，进行离心分离来收集沉淀，并利用更凉的醚清洗2次。去除母液，并在氮条件下充分干燥，来合成了0.85g的纯化前Arg-Ser-Leu-Asn-Leu-Arg-Asp-Ser-Gln-Lys-Ser肽1(序列1)(收率：89.9％)。当利用分子量测定仪测定时，可得到的分子量为1303(理论值：1303.440)。以如上所述的方法还合成了序列2的肽(Phe-Asp-Met-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Ser-Lys)(序列表中序列2)(收率：92.1％)。当利用分子量测定仪测定时，可得到的分子量为1133(理论值：1133.275)。
表1
实施例1：利用合成肽的骨细胞生长效果的确认
为了分析在合成例1中合成的与序列肽相关的骨形态发生蛋白2类似功效，进行利用作为成肌细胞(myoblast cell line)的C2C12细胞的MTT分析，来确认了是否具有增殖促进功效。
在包含10％的胎牛血清(FBS，fetal bovine serum，希格玛(Sigma)公司)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’medium，吉毕科公司(Gibco，U.S.A.))中，利用容量为500ml的组织培养用烧瓶，对C2C12细胞株(ATCC)进行培养。针对培养的多个细胞株，使用1％的胰蛋白酶溶液小心地从培养容器底部摘除后，进行离心分离，并只收集了细胞沉淀物。使上述细胞沉淀物再次在达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基培养液中悬浮后，放入96-孔组织培养用平板中，使得每个孔有1×103细胞，并在37℃温度且5％的CO2条件下培养24小时。24小时后，在蒸馏水中以灭菌状态溶解用完全去除血清的相同的培养液交换培养基，将用于制定标准的空试样和合成肽后，以10μg/ml的浓度与上述相同的条件培养了72小时。在完成培养的空中，放入分析试样，并在二甲基亚砜(DMSO)中溶解过4小时后形成的甲腊，然后通过测定吸光度来测定了细胞增殖。
图1为对序列表中序列1及序列表中序列2的肽进行处理后的与造骨细胞的生长相关的结果。如图1a及图1b所示，本发明的肽大大增进了造骨细胞的生长。
本发明的肽通过与骨形态发生蛋白Ib型受体相结合来发掘，来确认了本肽与作为对骨质形成起到重要作用的骨形态发生蛋白(BMP)起到相同的作用。本发明的骨形态发生蛋白受体Ib型结合肽执行与天然的骨形态发生蛋白类似的功能。
实施例2：合成肽的成骨分化促进效果确认
为了分析在合成例1中合成的与序列肽相关的骨形态发生蛋白2类似功效，利用作为前-成骨细胞细胞株(pre-osteoblast cell line)的MC3T3-E1细胞，来通过碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)染色确认了是否呈现造骨细胞分化促进功效。将MC3T3-E1细胞放入24-孔板中，使得成为3×104细胞，并在37℃温度且5％的CO2条件下培养24小时。24小时后，在含有50μg/ml的抗坏血酸+100mm的b-磷酸甘油的α-MEM培养基中以10μg/ml、50μg/ml的浓度处理合成的肽，并每三天交换一次培养基培养了13天。对培养结束的板孔利用磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer saline)清洗2次后，利用混合有丙酮、37％的甲醛及柠檬酸溶液的固定缓冲液进行30秒钟的细胞固定。利用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(leukocytealkaline phosphatase kit，希格玛(Sigma)公司，美国)进行了以下的染色。
以1：1混合FBB-碱性溶液、亚硝酸钠溶液来处理2分钟后，处理由蒸馏水和萘酚AS-BI碱性溶液形成的缓冲液来在37℃的培养器中发色1小时。
实验结果，在前-成骨细胞MC3T3-E1中，按浓度处理序列表中序列1及序列2的肽时，确认了根据分化促进的碱性磷酸酶的表达的增加(图2a、图2b)。
实施例3：确认基于合成肽的与成骨分化相关的基因的表达增加
为了确认基于在合成例1中合成的成骨分化相关基因骨唾液酸蛋白(bonesialoprotin)及COL1A1(I型胶原α1)的信使核糖核酸的表达程度，将MC3T3-E1细胞放入6-孔板中，使得成为3×105细胞，并在37℃温度且5％的CO2条件下培养24小时。24小时后，在含有10％的胎牛血清的培养基中分别以10μg/ml、50μg/ml的浓度处理肽，并以100ng/ml处理作为阳性对照组所使用的骨形态发生蛋白2。2天后利用磷酸盐缓冲液进行清洗，并利用Easy blue(内含子)分离了核糖核酸(RNA)。利用1μg的核糖核酸和RT预混合物(premixture)(内含子)合成了互补脱氧核糖核酸(cDNA)，利用聚合酶链式反应预混合物(PCR premixture)(试剂盒(Bioneer))进行聚合酶链式反应后，在琼脂糖凝胶中确认了信使核糖核酸的表达程度。
实验结果，在前-成骨细胞MC3T3-E1中，按浓度处理序列表中序列1及序列2的肽时，确认了使根据成骨分化基因的信使核糖核酸的表达增加(图3a、图3b)。
实施例4：确认基于合成肽的成骨分化的信号促进效果
为了确认对作为与成骨分化促进相关的信号的pSmad1/5/8本肽是否进行活性化，将MC3T3-E1细胞放入6-孔板中，使得成为2×105细胞，并在37℃温度且5％的CO2条件下培养24小时。24小时后，更换为不包含血清的培养基来培养24小时后，并以10ng/ml的浓度进行处理，以50ng/ml处理作为阳性对照组所使用的骨形态发生蛋白2，来15分钟、30分钟后，利用磷酸盐缓冲液清洗，放入溶解缓冲液，然后进行溶解后取得蛋白质来进行了蛋白质印迹法。
实验结果，在前-成骨细胞MC3T3-E1中，按浓度处理序列表中序列1及序列2的肽时，确认了促进表示成骨分化的信号活性化的Smad1/5/8的磷酸化(图4a、图4b)。
实施例5：基于合成肽的骨细胞渗透及增殖效果
在0.5mm*0.5mm大小的胶原海绵中使100μg的序列表中序列1的肽润湿，来移植于Balb/c小鼠的背后，并放置了两个星期。之后，提取胶原海绵来制作石蜡块，并通过苏木精—伊红染色，来测定了胶原海绵内的骨细胞渗透及增殖程度(图5)。
通过上述还可在体内再次确认在体外呈现的如序列表中序列1的肽的骨细胞增殖及分化等骨质形成促进功效。
实施例6：确认基于合成肽的牙周韧带成纤维细胞的生长促进效果
为了确认与序列表中序列1及序列2的肽的牙周组织相关的效果，分析了对牙周韧带成纤维细胞(人牙周膜成纤维细胞(Human periodontal ligament fibroblast))的生长促进效果。将牙周韧带成纤维细胞放入48-孔板中，使得成为1×103细胞，并在37℃温度且5％的CO2条件下培养24小时。24小时后，更换为不包含血清的培养基来培养6小时后，并以0.05～10μg/ml的浓度进行处理，以0.2μg/ml的浓度处理作为阳性对照组所使用的骨形态发生蛋白2及胰岛素样生长因子(IGF-1)，来培养了72小时。培养结束后去除培养上层液，并利用乙醇来固定细胞后，细胞固定结束后利用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline)清洗了3次。去除清洗溶液后利用比色SRB溶液进行处理，并用1％的乙酸充分地进行清洗后，通过利用显微镜观察细胞，来观察生存细胞的状态，针对于利用20mM的三羟甲基氨基甲烷进行脱染色的溶液，通过在560nm下测定吸光度来测定了细胞的生存状态。
实验结果，当按浓度处理序列表中序列1及序列2的肽时，确认了细胞的生长以依赖于处理浓度的方式增加(图6a、图6b)。
实施例7：确认基于合成肽的牙周韧带成纤维细胞的生长促进机制
为了确认与序列表中序列1及序列2的肽的牙周韧带成纤维细胞(人牙周膜成纤维细胞)相关的生长促进效果，利用蛋白质印迹法确认了相关信号转导分子的磷酸化程度。将牙周韧带成纤维细胞放入6-孔板中，使得成为5×105细胞，并在37℃温度且5％的CO2条件下培养24小时后以10μg/ml的浓度处理肽。以0.2μg/ml的浓度处理作为阳性对照组所使用的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)后，按5-15分钟的培养时间回收细胞来分离总蛋白质，并进行了与磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)相关的蛋白质印迹法。
实验结果，当在牙周韧带成纤维细胞中处理序列表中序列1及序列2的肽时，确认了使磷脂酰肌醇3-激酶及蛋白激酶B的磷酸化程度增加(图7a、图7b)。
实施例8：确认基于合成肽的牙周韧带成纤维细胞的活性促进
为了确认与序列表中序列1及序列2的肽的牙周韧带成纤维细胞活性促进效果，利用反义聚合酶链式反应(RT-PCR)确认了相关基因的的信使核糖核酸的表达。将牙周韧带成纤维细胞放入24-孔板中，使得成为1.5×104细胞，并在37℃温度且5％的CO2条件下培养了24小时。24小时后，更换为不包含血清的培养基来培养24小时后，以1μg/ml、10μg/ml的浓度进行处理，以0.2μg/ml的浓度处理作为阳性对照组所使用的骨形态发生蛋白2及胰岛素样生长因子(IGF-1)，并培养了72小时。培养结束后利用磷酸盐缓冲液进行清洗，并利用Easyblue(内含子)分离了核糖核酸。利用1μg的核糖核酸和RT预混合物(内含子)合成了互补脱氧核糖核酸，利用聚合酶链式反应预混合物(试剂盒)进行聚合酶链式反应后，在琼脂糖凝胶中确认了信使核糖核酸的表达水平。
实验结果，当在牙周韧带成纤维细胞中按浓度处理序列表中序列1及序列2的肽时，确认了使作为与细胞活性相关的基因的COL1A1(胶原类型Iα1型)及牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein)的信使核糖核酸的表达程度增加(图8a、图8b)。
以上，对本发明的特定部分进行详细记述，而对于所属领域的普通技术人员而言，这些具体记述仅仅是优选实施例，本发明的范围不会由此受到限制是显而易见的。因此，本发明的实质范围应视为根据发明要求保护范围和其等同技术方案进行定义。
 序列表
<110> CAREGEN Co,.LTD.
<120> 具有成骨分化促进能力及牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽及其用途
<130> PP140076
<150> KR 2014/0095893
<151> 2014-07-28
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽1
<400> 1
Arg Ser Leu Asn Leu Arg Asp Ser Gln Lys Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽2
<400> 2
Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys
1 5 10

Claims (12)

1.一种具有成骨分化促进活性的肽，其特征在于，由选自由序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成。
2.根据权利要求1所述的具有成骨分化促进活性的肽，其特征在于，上述肽促进造骨细胞的增殖。
3.根据权利要求1所述的具有成骨分化促进活性的肽，其特征在于，上述肽使Smad1、Smad5及Smad8的磷酸化增加。
4.根据权利要求1所述的具有成骨分化促进活性的肽，其特征在于，上述肽使碱性磷酸酶、I型胶原α1及骨唾液酸蛋白的表达增加。
5.一种具有牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽，其特征在于，由选自由序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成。
6.根据权利要求5所述的具有牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽，其特征在于，上述肽促进牙周韧带成纤维细胞的增殖。
7.根据权利要求5所述的具有牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽，其特征在于，上述肽使磷脂酰肌醇3-激酶及蛋白激酶B的磷酸化增加。
8.根据权利要求5所述的具有牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽，其特征在于，上述肽使I型胶原α1及牙本质涎磷蛋白的表达增加。
9.一种骨疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，包含权利要求1至4中任一项所述的具有成骨分化促进活性的肽作为有效成分。
10.一种牙周疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，包含权利要求5至8中任一项所述的具有牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽作为有效成分。
11.一种骨疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将包含权利要求1至4中任一项所述的具有成骨分化促进活性的肽的组合物给药到对象中的步骤。
12.一种牙周疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将包含权利要求5至8中任一项所述具有牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽的组合物给药到对象中的步骤。
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