KR101391134B1

KR101391134B1 - 줄기세포의 골분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 골분화 증가방법

Info

Publication number: KR101391134B1
Application number: KR1020130046148A
Authority: KR
Inventors: 정용준; 김세희; 권보선; 심혜은
Original assignee: 우리들생명과학 주식회사
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2013-04-25
Publication date: 2014-05-02
Also published as: KR20130049793A

Abstract

본 발명은 줄기세포의 골세포 분화 유도시 분화 유도효과를 증가시키는 것으로 골 형성 단백질에서 유래하는 아미노산 서열로 이루어진 골분화 및 골형성 촉진용 합성 펩타이드 또는 그의 상동체, 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골분화 유도용 조성물 또는 약학적 조성물, 이들을 포함하는 배지 조성물, 그리고 이를 이용한 골분화 증가방법에 관한 것으로, 상기한 본 발명의 줄기세포의 골분화 유도용 합성 펩타이드는 서열번호 1 내지 13의 아미노산 서열을 가지는 OP5, OP7, OP8, OP9, OP10, OP11, OP12, OP13, OP14, OP15, OP16, OP17, OP18에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체로 구성됨을 특징으로 한다.
상기와 같이 구성되는 본 발명의 줄기세포의 골분화 유도용 조성물은 특정한 서열을 가지는 골형성 촉진용 합성 펩타이드를 제공하고 이들 합성 펩타이드는 줄기세포(MSC)의 골아 세포로 분화를 촉진하는데 현저한 효과가 있어 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학조성물은 골다공증, 골결손질환 및/또는 골관절염의 치료에 우수한 효과가 있어, 종래 고가의 BMP를 대체할 수 있게 할 뿐 아니라, 이를 이용한 골분화 증가방법은 보다 용이하고 저렴하게 골분화를 유도할 수 있게 한다.

Description

줄기세포의 골분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 골분화 증가방법{Composition for inducing a bone differentiation and method for enhancing a bone differentiation using the same}

본 발명은 줄기세포의 골분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 골분화 증가방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 줄기세포의 골세포 분화 유도시 분화 유도효과를 증가시키는 것으로 골 형성 단백질에서 유래하는 아미노산 서열로 이루어진 골분화 및 골형성 촉진용 합성 펩타이드 또는 그의 상동체, 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골분화 유도용 조성물 또는 약학적 조성물, 이들을 포함하는 배지 조성물, 그리고 이를 이용한 골분화 증가방법에 관한 것이다.

뼈를 구성하는 세포는 뼈의 항상성을 유지하는 골세포(osteocyte), 뼈를 형성하는 골모세포(osteoblast), 뼈를 흡수하는 파골세포(osteoclast), 그리고 뼈의 말단의 관절기능을 담당하는 연골세포(chondrocyte) 등이 있으며, 성장이 완료된 골(骨)에서도 해면골은 파골세포에 의해서 흡수되면 다른 표면에서는 골모세포에 의해서 새로운 골이 형성되면서 재형성되게 된다. 이러한 골형성과 골흡수의 균형이 깨어지면 골질환으로 진행되는데, 이러한 골질환으로 난치성 골질환에는 골다공증(osteoporosis), 불유합(non-union) 골절, 골괴사증(osteonecrosis), 골연화증(osteomalacia), 골결손 등이 있다. 또한, 무혈성대퇴골괴사(Avascular necrosis of the Femoral Head)는 외상, 음주, 스테로이드제 복용 등의 원인으로 고관절을 이루는 대퇴골 골두에 혈액 공급이 중단되어 뼈가 파괴되는 난치성 골질환으로, 이 질환은 미국에서는 연간 20,000명, 한국에서는 연간 4,000명~5,000명의 발병률을 보이며, 대부분 20-50세 발생하며 평균 30대 후반에서 발생률 높은 것으로 알려져 있다. 그러나, 인공 관절 치환술의 수술적 방법 이외에는 특별한 치료 방법이 개발되어 있지 않다.

또한, 골다공증은 골소공증 또는 골 조송증이라고도 하며, 정상인에 비해 골량이 현저히 감소된 상태로 골의 구성성분의 양적 감소를 주 병변으로 하는 대사성 골 질환을 의미한다. 일반적으로 골다공증의 병태 자체는 무증상 또는 경미한 증상인 경우가 많지만, 일단 골절이 생기면 일반적으로 치료가 곤란하고, 골접합술을 시술해도 충분하게 회복되기가 어렵다.

이제까지 골다공증, 골절을 비롯한 골질환의 예방제 및/또는 치료제로서, 칼슘 제제, 에스트로겐 제제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절약(SERM), 활성형 비타민 D3 제제, 비타민 K 제제, 이프리플라본 제제, 칼시토닌 제제, 비스포스포네이트 제제, 부갑상선 호르몬 제제, 단백 동화 호르몬 제제, 골형태 유도 인자(BMP), 또는 섬유아세포 증식 인자(FGF) 등이 임상적으로 사용되거나, 또는 임상 응용이 시도되어 왔으나, 이와 같이 다수의 약제가 사용되고 있음에도 불구하고, 골질환의 환자수는 해마다 증가되고 있는 실정이며, 따라서 이런 난치성 골 질환을 효율적으로 치료하기 위한 새로운 개념의 치료제 개발이 절실히 요구되고 있다.

골 질환에 대한 전통적인 치료법으로는 자가골 이식(autografting)과 동종골 이식(allografting) 그리고 인조골 이식(artificial bone grafting) 등이 있지만, 골 채취 부위의 감염, 혈종 등과 같은 합병증 유발(자가골이식), 공여자로부터의 질병 전염 가능성(동종골 이식), 근본적인 골 생성이 되지 않는(인조골 이식) 문제점을 가지고 있다. 따라서, 이런 단점을 해결하여 난치성 골질환을 치료하기 위한 조직공학적인 골형성 연구가 활발히 진행되고 있다. 조직공학에 의한 골조직의 형성을 위해서는 골생성을 유도하는 골아전구세포와 이런 세포들을 적당한 위치에서 증식 분화시킬 수 있는 지지체, 그리고 골조직 형성의 유도분화를 촉진하는 골유도 성장인자들이 필요하다.

이들 중 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein: BMP)은 형질전환성장인자(transforming growth factor: TGF) β-상과(superfamily)의 일원으로 조골세포 전구세포로부터 조골세포로의 분화를 촉진하고 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro) 모두에서 뼈 형성을 증가시키는 효과를 나타내는 것이 보고(Mol Biol Cell. 1999; 10: 3801-13, Bone. 2001; 28: 491-8 참고)되어 있으며, 특히 BMP-2 단백질은 골형성유도 단백질로 골형성을 촉진하는데 탁월한 효과가 있으나, 이러한 우수한 효과를 가지는 BMP는 만족할만한 효과를 나타내기 위해서는 짧은 반감기로 인해 다량이 필요하고 이로 인해 투여시 고가의 비용으로 인하여 많은 환자에게 쓰이지 못하고 있다는 단점이 있다.

따라서, 이러한 단점을 해결하기 위해 다양한 연구가 시도되어 왔는데, 특히 공지된 BMP의 특정 부분 펩타이드 서열을 이용하므로 BMP와 같은 효과 또는 그 이상의 효과를 얻을 수 있는지에 대해 연구되어 왔으며 지속적으로 연구되어 지고 있는 실정이다. 이러한 골형성 촉진에 대한 연구로, 예를 들어, 대한민국 특허출원 제2007-0055211호는 "골형성 촉진 펩타이드를 함유하는 주입형 골재생재"라는 명칭으로, 골형성 촉진 펩타이드가 함유된 주입형 골재생재를 개시하고 있는데, 이 발명은 키토산, 알긴산, 실크피브로인, 프로필렌글리콜, 프로필렌글리콜 알긴산, 폴록사머, 황산 콘드로이틴 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 젤형성 기제에 서열번호 1 내지 서열번호 7 중 하나 이상의 아미노산 서열을 필수적으로 함유하는 골 형성 촉진 펩타이드가 결합 또는 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는 주입형 골재생재에 대해 개시하고 있다. 여기서 사용한 골형성 촉진 펩타이드는 세포외 기질을 구성하는 단백질에서 활성부위의 아미노산 배열을 분리추출한 것으로, 상기 펩타이드는 가토의 bone sialoprotein1 (BSP1) 85-105위치의 아미노산 서열 YRLKRSKS(서열번호1), KMFHVSNAQYPGA(서열번호2), YRLKRSKSKMFHVSNAQYPGA(서열번호3), 사람의 bone sialoprotein I149-169 위치의 아미노산 서열 YGLRSKS (서열번호4), KKFRRPDIQYPDAT (서열번호5), YGLRSKSKKFRRPDIQYPDAT (서열번호6) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 필수적으로 함유하고, 사람의 bone sialoprotein I (Osteopontin) 150-177 위치의 아미노산 서열 GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM (서열번호 7)을 함유하는 것을 개시하고 있다.

또 다른 발명으로는, 대한민국 특허출원 제2010-0018148호에서 "조골세포 분화능을 증진시키는 올리고펩타이드"라는 명칭으로, BMP-특이적 수용체에 대한 반응 특이성이 매우 높은 올리고펩타이드를 개발함으로써 조골세포 분화도 및 석회화도가 증가되어 개선된 골유착 및 골형성능을 가능하게 하기 위해, 조골세포 분화능을 증진시키는 올리고펩타이드로서 PEP7(서열번호 1), PEP71(서열번호 2), PEP72(서열번호 3), PEP73(서열번호 4), PEP74(서열번호 5), PEP75(서열번호 6) 및 PEP76(서열번호 7)로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 임플란트에 적용가능한 올리고펩타이드를 개시하고 있다.

또한, 상기한 특허출원된 발명들 외에, "Biomaterials 26 (2005) 5648-5657"에서는 P-15 펩타이드가 배아세포 부착의 고양에 의해 그리고 어팝토시스의 조절을 통해 세포 수 및 조직 구조를 조절할 수 있는 것과, 최근의 연구 결과가 비유기성 골 기질(ABM)/P-15 복합체가 골 재생을 촉진하기 위한 주입형 생체유사 기질로서 사용될 수 있다는 것을 제시한다( Hanks T, Atkinson BL . Comparison of cell viability on anorganic bone matrix with or without P-15 cell binding peptide . Biomaterials 2004;25(19):4831-6.) ( Nguyen H, Qian JJ , Bhatnagar RS , Li S. Enhanced cell attachment and osteoblastic activity by P-15 peptide - coated matrix in hydrogels . Biochem Biophys Res Commun 2003;311(1):179-86)고 개시하고 있으며, "Regulatory Peptides 142 (2007) 16-23"에서는 OGP 및 OGP(10-14)는 정상 및 골조소증 실험 동물에 투여될 때 골형성 및 해면골밀도를 증가하고 그리고 골절 치료를 고무하고, 그리고 골아세포 및 다른 골수의 기조직 세포의 배양에 있어서, OGP는 증식, 알카린 포스파타제 활성 및 매트릭스 무기질화를 조절한다( Bab I, Gazit D, Chorev M, Muhlrad A, Shteyer A, Greenberg Z, Namdar M, Kahn A. Histone H4 - related osteogenic growth peptide ( OGP ): a novelcirculating stimulator of osteoblastic activity . EMBO J 1992;11:1867-73.)는 것을 개시하고 있다.

또한, "Biomaterials 30 (2009) 3532-3541"에서는, OPD 펩타이드는 BMP-2로부터 동정되어 지고, 그리고 BMP 수용체에 친화성을 가지며, 이에 의해 골아세포 안으로 인간의 골수의 기조직 세포의 분화를 유도한다는 것을 개시하고 있으며, "J Korean Med Sci 2005; 20: 438-44"에서 Mundy 등은 먼저 스타틴류(statins)가 뼈에 동화작용의 효과를 가질 수 있는 것을 보여주는 증거를 보고하였고, 여기서 스타틴류는 설치류에서 유의성 있게 신생 골 형성을 자극하였다는 것을 개시하고 있으며, 또한 스타틴은 골아세포에서 지질합성 경로에 작용하고 그리고 골형성 단백질-2(BMP-2)의 발현을 증진한다는 것이 보고되어 있다 ( Mundy , G. R., Regulation of bone formation by bone morphogenetic proteins and other growth factors . Clin Orthop Relat Res (324), 24 (1996)). BMP-2 상향조절은 스타틴류의 골 형성 효과를 조정하는 것으로 여겨진다. 부가적으로, 스타틴류는 감소된 단백질 프레닐화를 이끄는, 정상의 골아세포 기능에 필수적인 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-코엔자임 A (HMG-CoA)의 저해를 통해 골아세포에서 비스포스포네이트의 동일한 업스트림 경로에 작용한다는 것을 보고되어 있다( Chen , P. Y. et al ., Simvastatin promotes osteoblast viability and differentiation via Ras / Smad / Erk / BMP -2 signaling pathway. Nutr Res 30 (3), 191.).

상기한 바와 같이 종래의 골형성 메카니즘 및 이들 메카니즘에 작용하여 골형성에 효과적으로 기여하는 물질들에 대해 지속적으로 연구되어 왔으며 이들 연구 성과가 어느 정도 얻어지고 있으나, 상기한 특허발명 및 연구 보고서를 포함하는 종래의 기술은 아직까지 보다 효과적으로 골분화를 유도하고 그리고 저렴한 비용으로 제공할 수 있는 물질에 대한 연구가 필요한 실정이며, 따라서 본 발명자 등은 이러한 필요성에 부응하기 위해 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

특허문헌 1: 대한민국 특허출원 제2007-0055211호. 특허문헌 2: 대한민국 특허출원 제2010-0018148호.

비특허문헌 1: Biomaterials 26 (2005) 5648-5657. 비특허문헌 2: Regulatory Peptides 142 (2007) 16-23. 비특허문헌 3: Biomaterials 30 (2009) 3532-3541. 비특허문헌 4: J Korean Med Sci 2005; 20: 438-44.

따라서, 본 발명은 상기한 종래의 실정을 감안하여 된 것으로, 본 발명의 제일 목적은 줄기세포의 골세포 분화 유도시 분화 유도효과를 증가시키는 새로운 펩타이드를 보다 효과적이고 간단하게 제공할 수 있게 하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 BMP에서 유래하는 아미노산 서열로 이루어진 것으로 골형성 촉진에 효과적이며 경제성을 가지는 새로운 골형성 촉진용 합성 펩타이드를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 새로운 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물로 특히는 줄기세포의 골분화 유도에 효과적인 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포의 골분화 유도용 약학적 조성물 및 배지 조성물을 제공하고 그리고 이를 이용한 골분화 증가방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 또한 상기한 명확한 목적 이외에 이러한 목적 및 본 명세서의 전반적인 기술로부터 이 분야의 통상인에 의해 용이하게 도출될 수 있는 다른 목적을 달성함을 그 목적으로 할 수 있다.

상기한 본 발명의 목적들은, 비록 BMP-2의 골형성 특징이 보고되어져 있지만 BMP-2의 결정적인 수용체-결합 시퀀스 뿐만 아니라 이들의 골형성 영역은 여전히 완전히 밝혀지지 않고 있는 상태에서, 하기 본 발명에 따른 특정한 아미노산 시퀀스를 갖는 골형성촉진용 합성 펩타이드가 줄기세포(MSC)의 골아 세포로 분화를 촉진하는데 현저한 효과가 있음을 밝혀내고 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학조성물이 골다공증, 골결손질환 및/또는 골관절염의 치료에 우수한 효과가 있음을 밝혀냄에 의해 달성되었다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 줄기세포의 골분화 유도용 합성 펩타이드는:

다음의 서열을 가지는 OP5, OP7, OP8, OP9, OP10, OP11, OP12, OP13, OP14, OP15, OP16, OP17, OP18에서 선택된 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 상동체로 구성되어 질 수 있음을 특징으로 한다:

OP5: DWIVAGSGDWIVA-NH₂

OP7: DWIVGSGDWIV-NH₂

OP8: DWIGSGDWIV-NH₂

OP9: DWIGSGDWI-NH₂

OP10: DWYGFGDW-NH₂

OP11: DWGSGDW-NH₂

OP12: DWYGFDW-NH₂

OP13: DWYFGDW-NH₂

OP14: DWYFDW-NH₂

OP15: DWGSGD-NH₂

OP16: DWGSGW-NH₂

OP17: DWYGFD-NH₂

OP18: DWYGFW-NH₂

여기서, G는 Gly, V는 Val, I는 Ile, F는 Phe, Y는 Tyr, W는 Trp, S는 Ser, D는 Asp을 나타냄.

본 발명의 다른 구성에 따르면, 상기 OP5의 상동체는 DWIVAGSGDWIVA, DWIVAGSGDWIVA-NH_2,N-Ac-DWIVAGSGDWIVA-NH₂ _,N-Ac-DWIVAGSGDWIVA, N-formyl-DWIVAGSGDWIVA와 같이 N-, C-말단이 치환된 것을 포함한다.

본 발명의 다른 구성에 따르면, 상기 OP7, OP8, OP9, OP10, OP11, OP12, OP13, OP14, OP15, OP16, OP17, OP18의 상동체 또한 모든 펩타이드의 N-, C- 말단이 OP5의 경우와 같이 치환된 것을 포함한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골분화 유도용 조성물은:

유효성분으로 상기의 서열을 가지는 OP5의 펩타이드와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은:

상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골결손질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은:

상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 저인산효소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은:

상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 베제트병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은:

상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대퇴골두무혈성 괴사증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은:

상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은:

상기와 같이 구성되는 본 발명의 줄기세포의 골분화 유도용 조성물은 특정한 서열을 가지는 골형성촉진용 합성 펩타이드를 제공하고 이들 합성 펩타이드는 줄기세포(MSC)의 골아 세포로 분화를 촉진하는데 현저한 효과가 있어 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학조성물은 골다공증, 골결손질환 및/또는 골관절염의 치료에 우수한 효과가 있어, 종래 고가의 BMP를 대체할 수 있게 할 뿐 아니라, 이를 이용한 골분화 증가방법은 보다 용이하고 저렴하게 골분화를 유도할 수 있는 유용한 발명이다.

도 1은 골 형성 세포의 분화 초기 마커인 ALP(alkaline phosphatase)와 석회화능 마커인 Vonkossa 염색법을 이용하여 본 발명에 따라 얻어진 합성 펩타이드 OP5의 줄기세포 골분화 효과를 염색 시험한 사진으로, 여기서 10% FBS는 줄기세포 배양 배지(음성대조군)이고, ODM은 골분화 배지(양성대조군)이고, ODM + OP5는 OP5 펩타이드가 첨가된 골분화 배지(시험군)이다.
도 2는 본 발명에 따른 합성 펩타이드의 줄기세포 골분화 효과를 비교하기 위하여 조골세포의 초기 분화 마커인 ALP 활성을 비교하여 나타내는 그래프로, 여기서, "control"은 음성 대조군이고, BOPD, OGP 및 BMP-2는 골재생이 알려져 있는 물질로서, 상기 BOPD는 DWIVA의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이다.
도 3은 본 발명에 따른 합성 펩타이드의 줄기세포 골분화 효과를 확인하기 위해서 세포외 기질의 석회화 정도를 평가하기 위한 ARS(Alizarin Red S) 염색법의 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, "control"은 음성 대조군이고, BOPD, OGP 및 BMP-2는 골재생이 알려져 있는 물질이다.
도 4 및 5는 본 발명에 따른 OP 계열의 합성 펩타이드의 지방줄기세포 골분화 효과를 확인하고 비교한 그래프이다.
도 6 및 7은 본 발명에 따른 합성 펩타이드 물질의 유효성을 평가하기 위해 동물 두개골을 이용하여 파라핀 블록을 5um 두께로 잘라 조직 표본을 얻은 후 신생골 형성 정도를 파악하기 위해 각각 H&E(hematoxylin and eosin) 염색과 MT(masson trichrome) 염색을 한 사진으로, 여기서 화살표 부분은 두개골을 시상봉합(sagittal suture) 방향으로 절개한 부분을 가르키고, 왼쪽 사진의 사각형 부분을 확대한 사진이 오른쪽 사진이다.
도 8은 새로 형성된 신생골의 면적을 각각 측정한 후 음성대조군(10% DMEM)을 기준으로 백분율로 계산한 결과를 나타낸 큰 막대그래프이다.

이하, 본 발명을 첨부도면을 참고로 바람직한 실시형태에 의해 보다 자세하게 설명한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 본 발명에 따른 줄기세포의 골분화 유도용 조성물을 제공하기 위해 본 발명은 먼저, 1) 줄기세포의 골분화 유도시 사용되는 배양 조건을 확립하고, 2) 상기 배양 조건에서 OP5 등을 첨가하여 효율적인 골분화 유도효과를 얻었다.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 OP5 내지 OP18로 나타내어 지는 올리고펩타이드는 이 기술분야에서 당업자들에게 알려진 방법에 따라 쉽게 합성이 가능한 것으로, 본 발명의 하기 실시예에서 사용된 올리고 펩타이드는 고체상 합성기를 이용하여 합성된 것을 사용하였다.

하기 실시예에서는 대조군 대비 본 발명의 OP5의 골분화 효과에 대한 실험을 실시하고 그 결과를 개시하였다.

줄기세포(MSC)의 골분화 유도시 본 발명에 따른 OP5를 첨가한 경유에 대조군에 비해 유의성 있는 결과를 얻을 수 있었다.

상기 본 발명에 따른 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물을 함유하는 식품, 식품첨가제 또는 의약 조성물을 제조할 수 있으며, 그 제조에는 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 또한, 상기 본 발명에 따른 조성물은 단독으로 또는 골다공증 치료제로서의 효능 증진을 위해 다른 약학적 활성성분과 조합하여 투여될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물은 식품, 식품첨가제 또는 의약 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 더 포함할 수 있다.

또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형물로 사용될 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 의약 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 이의 제형은 사용 방법에 따라 달라질 수 있으므로 상기 기술한 바에 한정되는 것은 아니다.

상기 경구형 제형은 경구 투여를 위한 고형제제와 액상제제를 포함하는 의미이며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 포함하여 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범주가 이들 실시예에 한정되는 것이 아님은 물론이다.

실시예 1. 줄기세포의 골분화능 평가: 염색시험 평가

본 연구에서는 골 형성 세포의 분화 초기 마커인 ALP(alkaline phosphatase), ARS(Alizarin Red S) 염색법을 이용하여 본 발명에 따라 얻어진 합성 올리고펩타이드가 골 형성 세포의 분화에 미치는 영향을 관찰하였다.

골 형성 세포의 분화능을 비교하기 위해 양성 대조군으로 아스코빅 산(ascorbic acid), β-글리세로포스페이트(Glycerophosphate), 덱사메타손(Dexamethasone)을 포함한 분화용 배지 ODM(osteogenic differentiation medium)을 사용하였고(Develop . Grewth Differ . 50,553-564, 2008.), 음성 대조군으로는 10% FBS(10% FBS가 포함된 줄기세포 배양용 배지)를 사용하였다. 실험군은 각각의 배지에 본 발명에 따른 합성 펩타이드를 첨가하여 진행하였다. 세포배양용 플레이트(12 well culture plate)에 MSC를 웰(well) 당 4×10³ 세포씩 분주하여 37℃에서, CO₂ 배양기에 배양하였다. 배양 3일마다 신선한 배지로 교체하였으며 배양 14일째 ALP, ARS 및 Vonkossa 염색법으로 골분화능을 비교하였으며, 그 결과를 도 1에 나타냈다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 연구에서 본 발명에 따른 합성 펩타이드 OP5는 양성 대조군인 ODM과 비교시 OP5를 첨가한 실험군에서 ALP, ARS 및 Vonkossa 염색이 월등히 염색되었음을 알 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 합성 펩타이드는 줄기세포의 조골세포로의 분화능을 현저하게 개선함을 확인할 수 있다.

실시예 2. 합성 펩타이드 물질의 유효성 평가: 초기 세포분화능 평가(골수 줄기세포의 골분화능 평가)

본 연구는 조골세포의 초기 분화 마커인 ALP ( alkaline phosphatase ) 활성을 비교하여 본 발명에 따른 합성 올리고펩타이드가 조골세포의 분화에 미치는 영향을 관찰하기 위한 것이다.

본 발명에 따른 합성 펩타이드의 조골세포 분화능을 비교하기 위하여, MSC 를 96 웰 플레이트에 4×10 ³ /웰 세포씩 분주하여 1일간 배양한 후 분화용 배지 ODM 에 본 발명의 합성 펩타이드 OP5 내지 OP18 , 양성대조군인 BMP -2, 심바스타틴( simvastatin ) 및 OP3 를 각각 처리하여 37℃, CO ₂ 배양기에 배양하였다. 배지는 3일마다 교체하였으며 배양 4일째 ALP 활성을 측정하여 그 결과는 도 2에 나타냈다.

이 연구에서 본 발명에 따른 합성 펩타이드는 종래 BMP -2에 비해 약 35% 증가된 ALP 활성을 나타냄으로써, 본 발명에 따른 합성 펩타이드는 조골세포의 분화능을 현저히 개선할 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 3. 합성 펩타이드 물질의 유효성 평가: 석회화능 평가

본 발명에 따른 합성 펩타이드에 의한 조골세포의 골분화가 잘 진행되었는지를 확인하기 위하여 세포외 기질의 석회화 정도를 본 연구에서 관찰하였다.

석회화능 평가를 위한 배양 조건은 상기 실시예 2와 동일하며 배양 14일째 ARS 염색법으로 석회화 정도를 비교 평가하여 그 결과를 도 3에 나타냈다. 실험 결과 배양 14일째에서 본 발명에 따른 합성 펩타이드 OP5의 석회화능은 BMP-2, 심바스타틴(simvastatin) 및 OP3에 비해 약 4배 더 높았으며, OP6 내지 OP18도 유의적으로 높았다. 이들 결과로부터 본 발명에 따른 합성 올리고펩타이드에 의한 골분화가 개선된 양태로 진행될 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 4. 합성펩타이드 물질의 유효성 평가: 지방유래 줄기세포의 골분화능 평가

본 연구에서는 본 발명에 따른 OP 계열의 합성 펩타이드의 우수한 MSC 골분화능을 확인하고 비교하기 위해 같은 실험 조건에서 지방유래 줄기세포(Adipose derived stem cell)를 이용하여 골분화능을 측정하여 그 결과를 도 4 및 5에 나타냈다. 여기서, ADSC의 분화 속도가 느려 ALP 또는 ARS의 값이 MSC의 경우에 비해 낮게 나오지만, OP계열의 합성 펩타이드와 함께 진행되어 진 것에서 전체적으로 대조군에서의 값에 비해 높은 값을 보이고 있어, 이로부터 본 발명에 따른 합성 펩타이드들이 우수한 골분화능 효과를 가진다는 MSC에서의 실험 결과를 충분히 뒷받침해 주고 있다.

실시예 5. 합성 펩타이드 물질의 유효성 평가: 동물 두개골이용 효능 평가

본 실시예에서는 본 발명에 따른 합성 펩타이드의 신생골 형성의 효능을 평가하기 위하여 생후 4일된 마우스의 두개골을 이용한 생체외(in vitro) 골생성 효능 평가 실험을 하였다.

생체외 골생성 효능 평가를 위해, 생후 4일된 마우스의 두개골을 적출한 뒤 시상봉합(sagittal suture)을 기준으로 반으로 분리한다. 2조각으로 분리된 두개골을 10% FBS가 포함된 줄기세포 배양용 배지에서 약 15시간 동안 안정화시켰다. 안정화 완료 후 분화용 배지 ODM(osteogenic differentiation medium)에 OP5(1uM)와 OP10(0.01uM, 1uM)을 각각 첨가한 배지를 두개골에 넣어준다. 음성대조군으로는 10% FBS를 포함한 줄기세포 배양용 배지를 처리한 두개골을 사용하였고, 양성대조군으로는 분화용 배지(ODM)를 처리해준 두개골을 사용하였다. 배양기간 3일마다 신선한 배지로 교체해주었다.

14일 동안 배양 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액에 두개골 조직을 24시간 고정시킨다. 고정이 끝나면 10% EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) pH7.2~7.4 용액을 이용하여 24시간 동안 탈회과정을 거친다. 탈회과정이 끝나면 수돗물에 수세하고 에탄올을 이용한 탈수과정을 거치고, 파라핀 용액에 포매하고 블록을 만든다. 탈수와 포매과정은 조직 염색 처리기(tissue stain processor) 기계를 이용하였다.

파라핀 블록을 5um 두께로 잘라 조직 표본을 얻은 후 신생골 형성정도를 파악하기 위해 H&E(hematoxylin and eosin) 염색과 MT(masson trichrome) 염색을 하였으며, 그 결과를 각각 도 6 및 도 7에 나타냈다. 도 6에 도시된 H&E 염색에서 신생골은 붉은색으로 염색된 부분이며, 도 7에 도시된 MT 염색법에서 파란색으로 염색된 부분으로 신생골의 형성 정도를 파악할 수 있다. 실험 결과 양성대조군인 분화용 배지(ODM)에서 배양한 두개골 조직보다 본 발명에 따른 합성 펩타이드를 함께 처리해준 두개골 조직에서 골형성이 확연히 증가하는 것을 확인할 수 있다. 새로 형성된 신생골의 면적을 각각 측정한 후 그것을 음성대조군(10% DMEM)을 기준으로 백분율로 계산한 결과를 큰 막대그래프로 그리고 양성대조군(ODM)보다 증가한 신생골의 양의 백분율을 작은 파란색 막대 그래프로 하여 도 8에 나타냈다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 양성대조군(ODM)보다 본 발명에 따른 OP5 및 OP10은 신생골의 생성을 크게 증가함을 도 8을 통해 확인할 수 있다.

상기 각 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 합성 올리고펩타이드 OP5 내지 OP18은 골재생을 유도하는 데 가장 많이 쓰이는 용액인 ODM과 비교하여 인산화효소의 활성증가는 OP5의 경우는 30%, OP10의 경우는 25% 증가된 결과를 보였다. 그리고, 종래의 골재생이 알려져 있는 물질인 BOPD, OGP와 비교하여 25% 증가된 결과를 보였다.

골재생에 중요한 실험인 석회화능 평가에서도 활성증가는 OP5의 경우는 30%, OP10의 경우는 25% 증가된 결과를 보였다. 그리고, 종래의 골재생이 알려져 있는 물질인 BOPD, OGP와 비교하여 25% 증가된 결과를 보였다.

그리고, 동물의 두개골을 이용한 생체외 신생골 형성 효능 평가 실험에서도 양성대조군인 줄기세포 분화배지(ODM)에서만 배양한 두개골 조직보다 OP5(1uM)의 경우 7.2%, OP10(1uM)의 경우 17% 신생골의 면적이 증가하는 결과를 보였다.

따라서, 상기 결과로부터 상기 서열을 가지는 본 발명에 따른 합성 펩타이드 OP5 내지 OP18, 특히 OP5 및 OP10은 줄기세포의 골세포 분화 유도에 효과적으로 작용하는 유용한 골분화 유도용 조성물을 형성할 수 있음을 알 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 OP5의 펩타이드로 구성됨을 특징으로 하는 줄기세포의 골분화 유도용 합성 펩타이드.
유효성분으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 OP5의 펩타이드와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 하는 골분화 유도용 조성물.
유효성분으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 OP5의 펩타이드와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
유효성분으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 OP5의 펩타이드와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 하는 골결손질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
유효성분으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 OP5의 펩타이드와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 하는 저인산효소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
유효성분으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 OP5의 펩타이드와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 하는 베제트병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
유효성분으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 OP5의 펩타이드와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 하는 대퇴골두무혈성 괴사증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
유효성분으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 OP5의 펩타이드와 약학적으로 허용될 수 있는 부형제를 포함함을 특징으로 하는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.