KR101355385B1 - 피부재생용 펩타이드, 이를 포함하는 화장품 조성물 및 이를 이용한 피부재생 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상처 등에 의해 소실되거나 노화에 의해 세포사한 피부조직을 효과적으로 재생할 수 있는 것으로 특정한 아미노산 구조를 갖는 펩타이드 또는 그의 상동체와 상기 합성 펩타이드를 주성분으로 포함하는 피부재생용 화장품 조성물 및 이를 이용한 피부재생 방법에 관한 것으로, 상기한 본 발명의 피부재생용 펩타이드는 다음의 서열을 가지는 OP10, OP13, OP15에서 선택된 것임을 특징으로 한다:
OP10: DWYGFGDW-NH₂
OP13: DWYFGDW-NH₂
OP15: DWGSGD-NH₂
상기와 같이 구성되는 본 발명의 피부재생용 펩타이드, 이를 포함하는 화장품 조성물 및 이를 이용한 피부재생 방법은 인간 생체 단백질인 BMP에서 유래하는 아미노산 서열로 구성되어 상처치료, 피부재생 효과 및 피부주름개선 효과가 뛰어나고, 또한 이러한 우수한 기능을 갖는 펩타이드를 경제적인 비용으로 효과적으로 제공할 수 있어 피부재생용 기능성 화장품 조성물을 보다 효과적이고 간단하게 제공할 수 있다.

Description

피부재생용 펩타이드, 이를 포함하는 화장품 조성물 및 이를 이용한 피부재생 방법{Peptide for renewing skin and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 피부재생용 펩타이드, 이를 포함하는 화장품 조성물 및 이를 이용한 피부재생 방법에 대한 것으로, 보다 자세하게는, 상처 등에 의해 소실되거나 노화에 의해 세포사한 피부조직을 효과적으로 재생할 수 있는 것으로 특정한 아미노산 구조를 갖는 펩타이드 또는 그의 상동체와 상기 합성 펩타이드를 주성분으로 포함하는 피부재생용 화장품 조성물 및 이를 이용한 피부재생 방법에 관한 것이다.

인간을 포함하는 동물의 피부의 가장 중요한 역할은 외부의 손상 및 세균의 침입으로부터 신체를 보호하는 방어장벽(defense barrier)의 역할을 함과 동시에 내부로부터의 열과 수분의 손실을 방지하는 것이다. 이러한 기능을 하는 피부는 여러 개의 층으로 구성되어 있으며, 이 가운데 가장 바깥에 위치하는 것을 표피(epidermis)라고 하는데, 이들 표피에서 재생능력을 보이는 것으로 알려진 것은 기저층에 존재하는 피부의 각질 줄기세포(Keratinocyte stem cells, KSC)이다.

이러한 피부는 세포의 변이, 활성산소 라디칼, 독성물질의 축적 및 피부간극 구성 단백질 변형 등에 의해 노화가 발생하는 것으로 알려져 있고 그 정확한 원인에 대한 수많은 연구에도 불구하고 각각의 주요인이 어떠한 메커니즘으로 피부에 주름을 형성하는 지에 대해서는 충분히 밝혀져 있지 않았으며, 그 노화결과는 피부의 주름형성, 탄력저하 및 반점형성 등으로 나타난다. 또한, 보통 어릴 때는 피부 손상이 일어나더라도 흉터가 남지 않는 반면, 나이가 들어 피부 손상이 일어나게 되면 흉터가 남는 이유도 피부 재생에 필요한 피부각질 줄기세포와 전이-증폭 세포의 증식의 수준 정도가 나이 정도에 따라 현저하게 낮아지기 때문인 것으로 보인다. 즉, 노화가 진행하게 되면, 상기한 세포들의 증식 정도가 낮아지게 되며, 이는 피부 재생 능력이 감퇴하는 것으로, 상처 등의 회복이 지연되거나, 피부 탄력 감소가 심화되어 주름이 발생할 수 있다.

최근에 상처 치료(wound healing)에 관한 연구에서 피부각질 줄기세포와 그의 딸세포인 전이 증폭 세포의 중요성에 대해 활발하게 연구되어 그 관계가 밝혀지고 있다(Roh C et al., Pediatr. Res. 100-103, 2006 ; Elaine Fuchs et al., Proc. Natl. Aca. Sci. 11830-11835, 2003). 연구 결과는 피부각질 줄기세포가 지속적으로 분열하여 크게 두 가지 세포를 생성하는데, 하나는 자기 복제(self-renewal)를 하여 만드는 똑같은 줄기세포이고, 다른 하나는 전이-증폭 세포(Transit Amplifying Cells, TA cells)이라는 것이다. 상기 전이-증폭 세포들은 더욱 증폭하고, 초기 분화하여 각질 세포(Keratinocyte cells)가 되고, 계속 분화가 진행되어 이들은 피부 표면으로 밀려 올라간다. 이러한 과정에서 각질 세포는 분화와 각화를 일으키면서 각질층을 이루게 되며, 3 내지 4주 후에는 각질층에서 떨어져 나간다.

상기한 피부각질 줄기세포는 보통 피부 각질 세포들의 약 4 내지 7% 정도로 극히 낮은 수로 분포되는 것으로 파악되며, 피부각질 줄기세포의 수를 증가시키는 것은 전이-증폭 세포의 수를 증가시키는 것보다 쉽지 않으며, 상대적으로 더 넓은 지역에 분포되어 있지 않아 연구에 많은 어려움이 따른다. 피부각질 줄기세포 표지 마커로 알파6 인테그린(α6 integrin)이 밝혀졌는데, 알파6 인테그린은 세포의 상호 전달(cellular communication)을 매개하며, 세포 이동, 증식, 분화 같은 다양한 영역의 세포 기능에 영향을 주는 것으로 보고되었다.

위에서 언급한 바와 같이 피부를 재생시키는 초기 단계(early stage)라고 할 수 있는 피부각질 줄기세포는 인접 세포와의 신호 전달과 전이 증폭 세포의 형성을 필요로 하는 것으로 인식되어, 이러한 메카니즘을 이용한 피부재생용 기능성 화장품 또는 상처치료용 조성물에 대해 다양한 제안이 되어 왔는데, 예를 들어, 대한민국 특허공개공보 제2010-0104703호는 5-아미노레불린산 에스터 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 피부재생용 기능성화장료 조성물 및 피부재생용 기능성 화장료 조성물의 사용방법에 관한 것으로, 상기 피부재생용 기능성 화장료 조성물은 피부에 도포시 경피흡수가 용이하고 세포독성이 적을 뿐만 아니라 피부재생 효과가 우수하여 노화 방지 및 피부관리에 유용한 우수한 효과를 갖는다고 기술하고 있으며, 또 다른 발명으로는 대한민국 특허공개공보 제2011-0119062호에서는 인간 지방유래 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양한 후 여과를 하여 얻은 줄기세포 배양 농축액을 유효성분으로 함유하는 피부재생 또는 주름개선용 조성물과, 상기 조성물을 상처부위에 국소적으로 도포 또는 피내주사하는 것을 특징으로 하는 피부재생 방법과, 상기 조성물을 주름살 제거를 필요로 하는 부위에 국소적으로 도포 또는 피내주사하는 것을 특징으로 하는 주름개선 방법과, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 피부재생 또는 주름개선 치료제, 및 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 피부재생 또는 주름개선 화장품에 대해 개시하고 있다.

또한, 대한민국 특허공개공보 제2010-0114729호는 제대혈 줄기세포 유래 혈관전구세포 배양액 또는 분비물을 이용한 피부재생용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 제대혈 줄기세포 유래 혈관전구세포 자체가 아닌 배양 분비물을 치료제로 이용하므로 세포 이식으로 인한 면역거부반응의 위험성이 없고, 신생혈관 생성능력을 촉진시켜 창상치료에 효과적이며, 이를 화장품 원료로 이용하는 경우 콜라겐 생성을 증대시켜 피부노화를 방지하는 효과를 제공하고, 상기 배양 분비물을 고농도로 농축시킨 조성물은 높은 창상치료 효과를 제공한다는 것을 개시하고 있다.

한편, 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein: BMP)은 형질전환성장인자(transforming growth factor: TGF) β-상과(superfamily)의 일원으로 조골세포 전구세포로부터 조골세포로의 분화를 촉진하고 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro) 모두에서 뼈 형성을 증가시키는 효과를 나타내는 것이 보고되어 있으며, 특히 BMP-2 단백질은 골형성유도 단백질로 골형성을 촉진하는데 탁월한 효과가 있으나, 짧은 반감기를 갖는다는 단점이 있는 물질로 알려져 있다.

상기한 바와 같이 종래의 상처 치료 또는 피부 재생용 조성물들은 주로 특정한 화합물이나 세포배양액을 이용하는 것으로, 이러한 종래에 개시된 물질에 비하여 보다 효과적인 피부재생 또는 상처치료용 조성물을 유도하고 또한 저렴한 비용으로 제공할 수 있는 물질에 대한 연구가 필요한 실정이며, 따라서 본 발명자 등은 이러한 필요성에 부응하기 위해 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

특허문헌 1: 대한민국 특허공개공보 제2010-0104703호 특허문헌 2: 대한민국 특허공개공보 제2010-0114729호 특허문헌 3: 대한민국 특허공개공보 제2011-0119062호

Roh C et al., Pediatr. Res. 100-103, 2006. Elaine Fuchs et al., Proc. Natl. Aca. Sci. 11830-11835, 2003.

따라서, 본 발명은 상기한 종래의 실정을 감안하여 된 것으로, 본 발명의 제일 목적은 인간 생체 단백질에서 유래하는 아미노산 서열로 구성되며 상처치료, 피부재생 효과 및 피부주름개선 효과가 뛰어난 특정한 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 주성분으로 포함하는 기능성 화장품 조성물을 보다 효과적이고 간단하게 제공기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인간 생체 단백질로 BMP를 사용하여 여기서 유래하는 아미노산 서열로 이루어진 것으로 상처치료 및 피부재생에 효과적이며 경제성을 가지는 새로운 합성 펩타이드로 된 기능성 화장품 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 또한 상기한 명확한 목적 이외에 이러한 목적 및 본 명세서의 전반적인 기술로부터 이 분야의 통상인에 의해 용이하게 도출될 수 있는 다른 목적을 달성함을 그 목적으로 할 수 있다.

상기한 본 발명의 목적들은, 종래의 BMP-2의 골형성 특징이 보고되어져 있지만 BMP-2의 결정적인 수용체-결합 시퀀스 뿐만 아니라 이들의 다른 기능에 대해서는 여전히 완전히 밝혀지지 않고 있는 상태에서, 하기 본 발명에 따른 특정한 아미노산 시퀀스를 갖는 합성 펩타이드가 상처치료 및 피부재생에 현저한 효과가 있음을 밝혀내고 상기 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 화장품 조성물이 피부재생과 주름살형성 방지에 우수한 효과가 있음을 밝혀냄에 의해 달성되었다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 피부재생용 펩타이드는;

다음의 서열을 가지는 OP10, OP13, OP15에서 선택된 것임을 특징으로 한다:

OP10: DWYGFGDW-NH₂

OP13: DWYFGDW-NH₂

OP15: DWGSGD-NH₂

여기서, G는 Gly, V는 Val, I는 Ile, F는 Phe, Y는 Tyr, W는 Trp, S는 Ser, D는 Asp을 나타냄.

본 발명의 다른 구성에 따르면, 상기 펩타이드는 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein: BMP)로부터 유래된 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구성에 따르면, 상기 펩타이드는 OP10의 펩타이드임을 특징으로 한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 피부재생용 화장품 조성물은;

다음의 서열을 가지는 OP10, OP13, OP15에서 선택된 하나 이상의 펩타이드를 주성분으로 포함하여 구성됨을 특징으로 한다:

OP10: DWYGFGDW-NH₂

OP13: DWYFGDW-NH₂

OP15: DWGSGD-NH₂

여기서, G는 Gly, V는 Val, I는 Ile, F는 Phe, Y는 Tyr, W는 Trp, S는 Ser, D는 Asp을 나타냄.

본 발명의 다른 구성에 따르면, 상기 펩타이드는 OP10의 펩타이드임을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구성에 따르면, 상기 조성물은 일반 피부 화장품에 배합되는 성분들인 물, 유분, 계면활성제, 보습제,점증제, 저급알콜, 색소, 방부제, 향료와 같은 성분을 추가로 포함함을 특징으로 한다

본 발명의 또 다른 구성에 따르면, 상기 조성물은 피부재생, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 여드름 치료 또는 상처 제거의 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

상기와 같이 구성되는 본 발명의 피부재생용 펩타이드, 이를 포함하는 화장품 조성물 및 이를 이용한 피부재생 방법은 인간 생체 단백질인 BMP에서 유래하는 아미노산 서열로 구성되어 상처치료, 피부재생 효과 및 피부주름개선 효과가 뛰어나고, 또한 이러한 우수한 기능을 갖는 펩타이드를 경제적인 비용으로 효과적으로 제공할 수 있어 피부재생용 기능성 화장품 조성물을 보다 효과적이고 간단하게 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 펩타이드와 대조군에 의한 인간 피부 섬유아세포의 이동성 평가를 시험한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이고,
도 2는 본 발명에 따른 펩타이드와 대조군에 의한 콜라겐1과 MMP1의 발현 양을 조사하여 그 값을 그래프로 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 펩타이드와 대조군에 의한 섬유아세포의 특정 단백질 발현 양을 조사하기 위한 전기영동의 결과를 나타내는 사진이고,
도 4는 도 3에 따라 조사된 발현 양을 그래프로 나타낸 것이고,
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드와 대조군의 유효성 평가하기 위한 동물 적출 상처 모델을 나타낸 사진이고,
도 6은 도 5에 따른 모델에서 본 발명에 따른 펩타이드와 대조군에 의해 6일 후 상처치유의 효능 정도를 나타낸 사진이고,
도 7은 각각 본 발명에 따른 펩타이드와 대조군에 의한 상처 치유의 조직학적 분석을 결과를 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명을 첨부도면을 참고로 바람직한 실시형태에 의해 보다 자세하게 설명한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 본 발명에 따른 피부재생용 펩타이드 및 이를 포함하는 화장품 조성물을 제공하기 위해, 동물 피부의 피부재생 유도시 사용되는 조건을 확립하고, 그런 다음 상기 조건에서 OP10, OP13, OP15에서 선택된 하나를 첨가하여 효율적인 피부재생 효과를 얻었다. 구체적으로는, 본 발명자 등은 천연의 골형성 단백질(Bone morphogenetic protein: BMP)과 동일한 또는 유사한 기능 또는 작용을 할 수 있으면서도 천연 인간 골형성 단백질보다 안정성이 우수하여 반감기가 긴 펩타이드를 제조하여 스크리닝하였으며, 그 결과 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성, 예컨대, 콜라겐, 파이브로넥틴 또는 히알루론산 생성 촉진이 우수할 뿐만 아니라 안정성 및 피부 투과율이 우수한 상기한 OP10. OP13 및 OP15의 펩타이드를 선별하였다.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 OP10. OP13 및 OP15로 나타내어 지는 올리고펩타이드는 이 기술분야에서 당업자들에게 알려진 방법에 따라 쉽게 합성이 가능한 것으로, 예를 들어 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있으며, 본 발명의 하기 실시예에서 사용된 올리고 펩타이드는 고체상 합성기를 이용하여 합성된 것을 사용하였다.

상기한 바와 같이 본 발명에 따른 피부재생용 펩타이드는 다음의 서열을 가지는 OP10, OP13, OP15에서 선택된다:

OP10: DWYGFGDW-NH₂

OP13: DWYFGDW-NH₂

OP15: DWGSGD-NH₂

여기서, G는 Gly, V는 Val, I는 Ile, F는 Phe, Y는 Tyr, W는 Trp, S는 Ser, D는 Asp을 나타냄.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 펩타이드의 C-말단 및 N-말단은 공지된 치환기에 의해 치환되어 질 수 있으며, 예를 들어 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-[0019] NH2), 아자이드(-NHNH2) 등으로, 그리고 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 질 수 있다.

상기 본 발명의 다른 실시형태에 따른, 피부재생용 화장품 조성물은 상기의 서열을 가지는 OP10, OP13, OP15에서 선택된 하나 이상의 펩타이드를 주성분으로 포함하여 구성되어 진다.

상기와 같이 본 발명의 화장품 조성물을 구성하는 본 발명에 따른 펩타이드는 천연 인간 골형성 단백질에서 유래한 것으로 이들보다 분자량이 작기 때문에, 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 화장품 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 피부상태를 효과적으로 개선할 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명의 화장품 조성물은 일반 피부 화장품에 배합되는 성분들인 물, 유분, 계면활성제, 보습제,점증제, 저급알콜, 색소, 방부제, 향료와 같은 성분을 추가로 포함할 수 있음은 물론이다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명의 화장품 조성물에 의한 피부재생은 피부재생뿐만 아니라, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 검버섯 제거, 여드름 치료 및 상처제거 효과를 나타내는 것이며, 보다 바람직하게는 피부재생, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지 및 상처제거 효과이고, 가장 바람직하게는 피부재생을 지칭하는 것이다.

예를 들어, 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 피부 섬유아세포의 이동성을 촉진하고, 이들 세포로부터 콜라겐1의 합성 증가를 유도하는 특정한 유전자 및 단백질 발현을 촉진하여, 피부의 상피층 및 진피층의 재생 또는 성장시켜, 피부재생, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처제거 등의 효능을 발휘하는 것으로 판단된다.

상기한 본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장품 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장품 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장품 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장품 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범주가 이들 실시예에 한정되는 것이 아님은 물론이다.

실시예 1. 합성펩타이드 물질의 유효성 평가: 인간 피부섬유아세포의 이동성 평가

본 실시예에서는 피부 재생단계에서 리모델링에 중요한 요소인 세포의 이동성을 평가하기 위하여, 인간 피부섬유아세포(Human dermal fibroblast)를 이용하여 다음과 같은 실험을 진행하였다.

8.0μm의 포어 사이즈를 가진 6.5mm의 트렌스웰 인서트에 2×10⁴/웰의 농도로 세포를 분주하고 OP계열 합성 펩타이드와 양성대조군인 FGF를 각각 1μM과 20ng/ml의 농도로 주입한다. 20시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에 배양 후, 8μm의 구멍을 통과한 세포를 H&E(hematoxylin and eosin) 염색과 MTT법을 이용하여 세포의 이동성을 확인하였으며, 그 결과를 도 1에 나타냈다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 음성 대조군과 비교하여 8μm의 구멍을 통과한 세포의 수가 많은 양성 대조군에서 염색 양이 많고, MTT 값이 높은 것을 확인할 수 있다. 이와 함께 본 발명에 따른 합성 펩타이드 OP10, OP13, OP15에서 양성대조군과 비교하여 더 높거나 비슷한 수의 세포가 이동했음을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 인간 피부세포의 이동성을 향상함을 확인함으로써 피부재생에 긍정적인 영향을 주는 것으로 판단할 수 있다.

실시예 2. 합성펩타이드 물질의 유효성 평가: 인간 피부 섬유아세포의 특정 유전자 발현 확인

본 연구에서는 본 발명에 따른 OP 계열의 합성 펩타이드의 우수한 피부 재생 효과를 확인하고 비교하기 위해, 같은 실험 조건에서 인간 피부섬유아세포(Human dermal fibroblast)를 이용하여 특정 유전자 발현을 확인함으로써 그 효능을 입증하였다.

본 발명에 따른 합성 펩타이드의 특정 유전자 발현 양을 비교하기 위하여, HDF를 6 웰 플레이트에 3×10⁴/웰 세포씩 분주하여 1일간 배양한 후 합성 펩타이드 OP10, OP13 및 OP15, 양성대조군인 FGF, EGF를 각각 처리하여 37℃, CO₂ 배양기에 배양하였다. 8시간 배양 후 RNA를 추출하고, 1μg의 RNA를 정량하여cDNA를 합성 한 후 특정 유전자를 증폭시켜 그 발현 양을 확인하였으며 그 결과를 도 2에 나타냈다.

피부재생에 있어 중요한 요소인 콜라겐1의 발현 양이 음성 대조군 보다 크게 증가하였고, 양성 대조군으로 쓰인 FGF 또는 EGF보다 높거나 비슷한 값을 보인다. 콜라겐 분해효소로 알려진 MMP1의 값 또한 음성 대조군 보다 크게 억제됨을 확인할 수 있다.

이로부터 본 발명에 따른 합성 펩타이드들이 우수한 피부재생 효과를 가진다는 실험 결과를 충분히 뒷받침해 주고 있다.

실시예 3. 합성펩타이드 물질의 유효성 평가: 인간 피부 섬유아세포의 특정 단백질 발현 확인

본 실시예에서는 본 발명에 따른 합성 펩타이드의 피부재생 효과를 알아보기 위하여 웨스턴 블랏법을 이용하여 단백질 발현 양을 알아보았다.

피부 섬유아세포를 6 웰 플레이트에 3×10⁴/웰 세포씩 분주하여 1일간 배양한 후 1μM 농도의 합성 펩타이드 OP10, OP13 및 OP15와 양성대조군인 FGF를 20ng/ml로 각각 처리하여 37℃, CO₂ 배양기에 배양하였다. 배양 1일 후의 세포를 용해시켜 단백질 20μg을 전기영동을 통하여 크기별로 분리하고, 단백질을 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막으로 이동시킨 후, 특정 항체와 반응시켜 단백질의 발현을 확인였으며 그 결과를 도 3 내지 4에 나타냈다.

피부재생에 있어 중요하게 작용하는 콜라겐의 전구 물질인 프로콜라겐(procollagen 1a2)의 합성이 음성 대조군 및 양성 대조군과 비교하여 본 발명에 따른 OP계열 합성 펩타이드에서 크게 증가함을 확인하였고, 콜라겐 분해효소로 알려져 있는 MMP1의 발현 양 또한 음성 대조군에 비하여 크게 억제됨을 확인하였다.

또한, 세포 증식에 영향을 미치는 신호인 phospho-ERK 1/2의 발현 또한 음성 대조군에 비하여 증가했음을 확인하였고, MMPs의 억제제 역할을 하는 TIMP2의 발현 양은 음성 대조군 및 양성대조군 보다 증가된 발현을 보여주고 있다.

이 결과로부터 본 발명에 따른 OP계열 합성 펩타이드가 피부재생 및 피부의 주름 형성 억제에 유효성을 갖는 것을 입증할 수 있다.

실시예 4. 합성 펩타이드 물질의 유효성 평가: 동물 적출 상처 모델(Animal Excisional Wound Model)

본 실시예에서는 본 발명에 따른 펩타이드의 유효성을 평가하기 위해 다음과 같이 실험을 실시하였다.

먼저, 도 5에 나타난 바와 같이, 각 누드 마우스를 마취제(avertin)를 이용하여 마취한 뒤 피부에 지름 5mm의 상처를 유도한다. 그런 다음 각 상처부위에 DMEM 배지(media)로 희석한 OP-10, OP-13, OP-15 펩타이드, 대조군을 주입하고 6일 후 상처부위의 회복 정도를 파악한다. 이때, 대조군으로 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor; FGF) 단백질(0.5ug/wound site)을 사용하였고, 각 펩타이드의 용량은 10ug/wound site로 지정하여 사용하였다.

상처부위의 회복 정도는 6일 후 상처치유의 효능 정도를 도 6의 사진과 같이 육안상으로 확인이 가능하다.

도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드를 주입한 마우스의 상처 수복이 대조군인 FGF 주입 마우스와 유사한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 조직학적 분석을 위하여 상처 부위를 절개하고, 파라핀 블록으로 제작한 뒤 5um로 조직 절편을 획득하여 염색하여 피부 재생을 확인하였다.

조직 절편을 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색과 MTC(Masson Trichrome) 염색결과, 본 발명에 따른 펩타이드를 처리한 마우스의 상처 부위에서 표피(Epidermis) 재생이 확인되었으며, 또한 OP-10 펩타이드를 처리한 마우스에서는 진피(dermis) 조직까지 재생되는 것으로 확인되며, 이는 대조군인 FGF를 주입한 마우스와 유사한 결과를 나타낸다(도 7 참고).

이상에서 본 발명은 기재된 특정한 실시형태 및 실시예에 대해서만 상세히 기술되었지만, 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

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4. 다음의 서열을 가지는 OP10, OP13, OP15에서 선택된 하나 이상의 펩타이드를 주성분으로 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 피부재생용 화장품 조성물:
   OP10: DWYGFGDW-NH₂
   OP13: DWYFGDW-NH₂
   OP15: DWGSGD-NH₂
   여기서, G는 Gly, V는 Val, I는 Ile, F는 Phe, Y는 Tyr, W는 Trp, S는 Ser, D는 Asp을 나타냄.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 펩타이드는 OP10의 펩타이드임을 특징으로 하는 피부재생용 화장품 조성물
   
6. 제 4항에 있어서, 상기 조성물은 일반 피부 화장품에 배합되는 성분들인 물, 유분, 계면활성제, 보습제, 점증제, 알콜, 색소, 방부제, 향료에서 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함함을 특징으로 하는 피부재생용 화장품 조성물.
   
7. 제 4항에 있어서, 상기 조성물은 피부재생, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지 또는 상처 제거의 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 피부재생용 화장품 조성물.

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