KR102012527B1 - 세포외 기질 단백질 합성을 활성화시키는 신규 펩타이드 및 이를 포함하는 화장품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부에서 세포외 기질 단백질 합성을 활성화시키는 신규 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 활성제로서 상기 펩타이드를 포함하는 화장품 조성물, 및 세포외 기질 단백질 발현을 증가시키고, 주름, 피부 부피의 늘어짐 및 손실, 및 피부의 건조의 출현을 지연시키거나 또는 감소시키기 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
마지막으로 본 발명은 노화 및 광노화의 피부 징후를 지연 또는 치료하기 위한 미용 관리 방법에 관한 것이다.

Description

세포외 기질 단백질 합성을 활성화시키는 신규 펩타이드 및 이를 포함하는 화장품 조성물{NOVEL ACTIVATOR PEPTIDES FOR SYNTHESIZING EXTRACELLULAR MATRIX PROTEINS, AND COSMETIC COMPOSITIONS INCLUDING SAME}

본 발명은 화장품용 활성제 및 피부 약학적 활성제, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 세포외 기질 단백질 발현을 활성화시키는 신규 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 생리학적으로 적합한 매질 중에, 활성제로서 상기 펩타이드를 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포외 기질 단백질 발현을 증가시키고, 노화의 피부 징후, 특히 주름, 피부 부피의 늘어짐 및/또는 손실, 및 피부 건조화를 지연시키고/또는, 이들을 차단하기 위한 상기 조성물의 용도, 및 최종적으로는 노화 및 광노화의 피부 징후의 출현을 지연시키고/또는 노화 및 광노화의 피부 징후를 치료하는 미용 관리 방법에 관한 것이다.

피부는 복수의 층(진피, 진피표피 접합부, 표피)으로 이루어지는 피복 기관이다. 진피는 피부를 지지하는 조직이며, 프로테오글리칸의 기질 사이에 싸인, 물, 엘라스틴 섬유 및 콜라겐 섬유(진피 섬유의 70%)로 이루어진다. 섬유아세포는 진피의 주요한 세포 성분이며, 콜라겐 섬유 및 엘라스틴 섬유 합성의 공급원이다.

글리코사미노글리칸은 이들의 특출한 가습 능력으로 콜라겐 및 엘라스틴 섬유의 구조화 및 물의 저장을 확실하게 책임진다. 히알루론산은 피부 중 가장 많은 글리코사미노글리칸이며, 진피의 주요한 구성성분이지만, 또한 표피 중의 각질형성세포 주위에도 존재한다. 글리코사미노글리칸 및 콜라겐 복합체는 피부 유연성 및 견고성에 주요한 역할을 한다.

다른 모든 기관처럼 피부도 복합 생리학적 노화 과정을 거친다. 내재성 또는 연령 노화 및 외재성 노화로 구분된다. 내재성 노화는 내부 요인에 의한 유전적으로 프로그램된 노쇠 및 생화학적 변화의 결과이다. 피부에서, 세포 및 세포외 기질의 재생이 느려져 진피 및 표피 위축, 건조, 탄력성 감소 및 잔주름과 주름의 출현이 나타나는 것이 특징이다.

외재성 노화는 환경적 스트레스, 예컨대 오염, 태양, 질병, 생활습관 등에 의한 것이다. 이러한 영향은 이러한 침공에 만성적으로 노출된 영역(이것은 광노화(photoaging)라고 함)에서 내재성 노화의 원인들과 결합한다. 광노화와 관련된 주요한 변화에는 색소 반점의 출현뿐만 아니라 주름을 유도하는 콜라겐 섬유의 감소 및 파괴가 포함된다.

피부 노화를 없앨 수 있는 활성제를 규명하는 연구로 다수의 다소 효과적인 활성제가 시장에서 판매되고 있다. 그러나, 피부 징후 노화의 출현을 지연시키거나 또는 보다 효과적으로 없앨 수 있는 신규 화합물을 규명하는 것이 중요하다. 본 발명에서 특히 목적으로 하는 것은 세포외 기질에 위치하는 노화의 주요 피부 징후를 없앨 수 있는 신규의 활성제를 규명하는 것이다.

본 발명자들은 하기 일반식 (Ⅰ)로 나타내는 펩타이드가 양호한 세포외 기질 단백질 합성 활성제라는 것을 입증하였다:

R₁-(AA)_n-X₁-Pro-X₂-Gly-Pro-X₃-X₄-(AA)_p-R₂

본 발명에 따른 펩타이드는 하기와 같은 특징을 갖는다:

- I-형 및 III-형 콜라겐의 발현을 증가시킨다.

- 피브로넥틴의 발현을 증가시킨다.

- 히알루론산의 발현을 증가시킨다.

- 섬유아세포의 노쇠 징후를 감소시킨다.

"세포외 기질 단백질을 활성화시키는 펩타이드 또는 활성제"는 세포에 존재하는 콜라겐, 피브로넥틴 및 히알루론산의 양을 증가시킬 수 있는, 상기 일반식 (Ⅰ)의 임의의 펩타이드, 또는 유전자 발현의 직접 또는 간접적인 조절에 의해 단백질 합성을 증가시키거나 또는 메신저 RNA 전사의 안정화 또는 단백질 안정화와 같은 기타 생물학적 과정에 의해서 분비되는 임의의 펩타이드를 의미한다.

"섬유아세포의 노쇠 징후"는 세포 노쇠 표현형과 관련이 있는 생화학적 마커의 발현 프로파일을 의미한다.

피부는 피부, 점막, 및 머리카락, 속눈썹 및 눈썹을 포함하는 피부부속물을 구성하는 피복 조직(covering tissue) 모두를 의미한다.

따라서, 본 발명은 첫째로 하기 일반식 (Ⅰ)의 펩타이드에 관한 것이며,

R₁-(AA)_n-X₁-Pro-X₂-Gly-Pro-X₃-X₄-(AA)_p-R₂

여기서,

X₁은 글리신 또는 알라닌 또는 발린을 나타내며,

X₂는 글리신 또는 알라닌 또는 발린을 나타내고,

X₃은 아스파라긴 또는 리신 또는 글루타민, 또는 아미노산이 아닌 것을 나타내며,

X₄는 페닐알라닌 또는 티로신, 또는 아미노산이 아닌 것을 나타내고,

AA는 임의의 아미노산을 나타내며, n 및 p는 0 내지 2의 정수이고,

R₁은 N-말단 아미노산의 일차 아민 작용기 -NH₂를 나타내며, 상기 -NH₂에서, 두 개 수소 원자 중 하나는 포화 또는 불포화 C₁ 내지 C₃₀ 알킬 사슬 또는 아실-타입 기(R-CO-), 또는 벤조일, 토실 또는 벤질옥시카르보닐 타입의 방향족 기에 의해 치환될 수 있고, 상기 R-CO-에서, 라디칼 R은 포화 또는 불포화 C₁ 내지 C₃₀ 알킬 사슬이고, 바람직하게는 메틸이며,

R₂는 C-말단 아미노산의 카르복실 작용기의 히드록실기 -OH를 나타내며, 상기 -OH에서, 수소 원자는 C₁ 내지 C₃₀ 알킬 사슬, 또는 NH₂, NHY 또는 NYY 기에 의해 치환될 수 있고, 상기 NHY 및 NYY에서, Y는 C₁ 내지 C₄ 알킬 사슬이며,

상기 일반식 (Ⅰ)의 서열은 5개 내지 11개의 아미노산 잔기로 구성되며, 염 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 매우 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 펩타이드는 하기 서열로 이루어진다:

(서열 번호 1): Ala-Pro-Ala-Gly-Pro-NH₂

(서열 번호 2): Val-Pro-Ala-Gly-Pro

(서열 번호 3): Val-Pro-Gly-Gly-Pro-NH₂

(서열 번호 4): Gly-Pro-Ala-Gly-Pro

(서열 번호 5): Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-NH₂

(서열 번호 6): Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-GLy-Pro-Asn-Tyr-NH₂

특히 유리한 실시형태에 따르면, 상기 펩타이드는 서열 번호 4의 서열에 상응한다.

또 다른 특히 유리한 실시형태에 따르면, 상기 펩타이드는 서열 번호 5의 서열에 상응한다.

본 발명에 따른 펩타이드를 구성하고, AA라는 용어로 지정한 아미노산은 L- 및 D-이성질체 구조일 수 있다. 바람직하게, 상기 아미노산은 L 형태이다.

용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해서 다른 것과 결합된 2개 이상의 아미노산의 사슬을 나타낸다.

"펩타이드"는 또한 상기에서 기재한 본 발명의 천연 또는 합성 펩타이드, 또는 단백질 분해 또는 합성적으로 수득되는 이의 단편 중 적어도 하나를 나타내며, 또는 상기에서 기재한 펩타이드의 서열 중 전부 또는 부분을 구성하는 서열의 임의의 천연 또는 합성 펩타이드를 나타낸다.

분해에 대한 저항성을 개선시키기 위해서, 본 발명에 따른 펩타이드의 보호 형태를 사용할 필요가 있을 수 있다. 아실 타입(R-CO-, 여기서 라디칼 R은 포화 또는 불포화 C₁ 내지 C₃₀ 알킬 사슬), 바람직하게는 메틸 타입의 R₁ 기에 의한 치환, 또는 벤조일, 토실 또는 벤질옥시카르보닐 타입의 방향족 기에 의한 치환에 의해서 N-말단 아미노산의 일차 아민 작용기를 보호할 수 있다.

바람직하게, C-말단 아미노산의 카르복실 작용기는 C₁ 내지 C₃₀ 알킬 사슬 타입의 R₂ 기 또는 NH₂, NHY 또는 NYY 기(여기서, Y는 C₁ 내지 C₄ 알킬 사슬을 나타냄)에 의한 치환에 의해 보호된다.

서열 번호 1 내지 서열 번호 6의 서열의 본 발명에 따른 펩타이드는 N-말단 또는 C-말단 또는 둘 다의 말단에서 보호될 수 있다.

본 발명에 따른 일반식 (Ⅰ)의 펩타이드는 치환체 아미노산으로부터 전통적인 화학적 합성(고체상 또는 액체 균질 상) 또는 효소적 합성(Kullman et al. J. Biol. Chem., 1980, vol. 225, p. 8234)에 의해서 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드는 천연 또는 합성적 기원일 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따르면, 펩타이드는 화학적 합성에 의해 수득된 합성 기원이다.

본 발명에 따르면, 상기 활성제는 단일 펩타이드 또는 펩타이드들의 혼합물일 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드는 물, 글리세롤, 에탄올, 프로판디올, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 에톡시화 또는 프로폭시화 디글리콜, 사이클릭 폴리올 또는 이들 용매의 임의의 혼합물과 같은 하나 이상의 생리학적으로 적합한 용매에 용해하는 것이 유리하다.

"생리학적으로 적합한"이라는 것은 유독성, 과민증, 불안정, 알레르기 반응 또는 기타 역효과의 위험이 없고, 인간 피부 또는 피부 부속물과 접촉하여 사용하기에 적합한 용매 또는 매질을 의미한다.

다음으로, 희석된 펩타이드는 무균 여과에 의해서 멸균된다.

이러한 희석 단계 이후에, 펩타이드는 화장품 분야에 사용되는 리포좀 또는 임의의 다른 마이크로캡슐과 같은 화장품 벡터 중에 캡슐화되거나 또는 포함될 수 있거나, 또는 분말형 유기 폴리머, 탈크 및 벤토나이트와 같은 미네랄 담체에 흡착되고, 보다 일반적으로 임의의 생리학적으로 적합한 벡터 중에 용해되거나 또는 이러한 벡터에 결합될 수 있다.

두 번째로, 본 발명은 생리학적으로 적합한 매질 중에, 피부에서의 세포외 기질 단백질 합성을 활성화시키는 활성제로서 일반식 (Ⅰ)의 펩타이드를 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 유리한 실시형태에 따르면, 상기 활성제는 최종 조성물의 총 중량에 대해서 0.0005 내지 500 mg/kg, 바람직하게는 0.01 내지 5 mg/kg의 농도로 조성물 중에 존재한다.

상기 농도 범위는 목적하는 분자 효과를 수득하기 위해, 즉 I-형 및 III-형 콜라겐, 피브로넥틴 및 히알루론산의 발현을 활성화시키기 위해 필요한 활성제의 양을 나타낸다.

바람직하게, 본 발명에 따른 조성물은 피부에 생리학적으로 적합한 매질을 포함하는 국소 적용에 적합한 형태이다.

"국소 적용"은 본 발명에 따른 활성제 또는 이를 포함하는 조성물의 피부 표면 상으로의 적용 또는 살포(spreading)를 나타낸다.

이러한 조성물은 특히 수성, 수성-알콜 또는 오일 용액의 형태; 수중유형 또는 유중수형 에멀젼 또는 복합 에멀젼, 수성 또는 무수 겔, 콜로이드 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 또한 피부, 점막, 입술 및/또는 피부 부속물 상에 적용하기 적합한 크림, 현탁액 또는 분말의 형태일 수도 있다. 이러한 조성물은 약간의 유체일 수 있으며, 크림, 로션, 밀크, 혈청, 포마드, 크림, 페이스트 또는 폼의 외관을 가질 수 있다. 이들은 또한 고형 형태, 예컨대 스틱일 수 있으며, 또는 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수 있다. 이들은 피부 케어 제품 및/또는 피부에 있어서의 메이크업 제품으로서 사용될 수 있다.

이러한 조성물 모두는 또한 보조-용매(에탄올, 글리세롤, 벤질 알콜, 습윤제 등), 점증제, 희석제, 유화제, 항산화제, 착색제, 선스크린, 색소, 필러, 보존제, 향, 냄새흡수제, 정유, 미량원소, 필수 지방산, 계면활성제, 막형성 폴리머, 화학적 또는 미네랄 필터, 수화 작용제 또는 온천수 등과 같은 이들 제형에 필수적인 보조제뿐만 아니라 예상되는 용도 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 첨가제를 포함한다. 예를 들면, 천연 타입의 수용성 폴리머, 예컨대 폴리사카라이드 또는 폴리펩타이드, 메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필 셀룰로스 타입의 셀룰로스 유도체, 또는 합성 폴리머, 폴록사머, 카보머, 실록산, PVA 또는 PVP가 있으며, 특히 ISP 회사에서 판매하는 폴리머가 있다.

임의의 경우에, 당업자는 이러한 보조제뿐만 아니라 이들의 비율도 본 발명에 따른 조성물 중의 유리한 특성을 없애지 않도록 선택할 수 있다. 이러한 보조제는, 예를 들면 조성물의 총 중량의 0.01 내지 20% 범위의 농도로 존재할 수 있다. 본 발명의 조성물이 에멀젼인 경우에, 지방 상은 조성물의 총 중량에 대해서 5 내지 80 중량%, 바람직하게는 5 내지 50 중량%를 나타낼 수 있다. 조성물에 사용되는 유화제 및 보조-유화제는 관련 분야에서 종래에 사용되는 것들로부터 선택될 것이다. 예를 들면, 이들은 조성물의 총 중량에 대해서 0.3 내지 30 중량% 범위의 농도로 사용될 수 있다.

물론, 본 발명에 따른 활성제는 단독으로 사용할 수 있으며, 다른 활성제와 함께 사용할 수도 있다.

유리하게, 본 발명에 따라 사용할 수 있는 조성물은 또한 노화의 피부 징후를 예방하고 개선시키는 분야에서 본 발명에 따른 활성제의 활성을 강화시키는 적어도 하나의 다른 활성제 또는 관련된 조성물의 특성 범위를 확장시킬 수 있는 또 다른 활성제를 함유한다.

이에 제한하지는 않지만, 하기 부류의 성분들을 들 수 있다: 재생, 항노화, 주름 방지, 진정, 항자유라디칼, 당화 방지, 수화, 항균성, 항진균성, 각질 용해, 근육 이완, 각질 제거 및 탄력 제제, 진피 거대분자의 합성 또는 에너지 대사 또는 미소 순환 또는 손톱 또는 머리카락 성장을 자극하는 제제, 표피의 분화 또는 색소 침착을 조절하는 제제, 금속단백분해효소-억제 제제 또는 선스크린 및 선 필터제.

본 발명의 특별한 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 펩타이드 이외에 하기를 포함할 것이다:

- 적어도 하나의 시토크롬 c-활성화 화합물, 및/또는

- 적어도 하나의 수화 화합물, 예컨대 아쿠아포린-활성화 화합물, 및/또는

- 적어도 하나의 시르투인-활성화 화합물, 및/또는

- 적어도 하나의 세포 부착-증가 화합물, 및/또는

- 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸과 같은 기질 단백질의 생성을 증가시키는 적어도 하나의 화합물, 및/또는

- 적어도 하나의 프로테아좀 활성-조절 화합물, 및/또는

- 적어도 하나의 일주기성(circadian) 리듬-조절 화합물, 및/또는

- 적어도 하나의 HSP 단백질-조절 화합물, 및/또는

- 적어도 하나의 세포 에너지-증가 화합물, 및/또는

- 적어도 하나의 피부 색소침착-조절 화합물, 및/또는

- 적어도 하나의 코엔자임 Q10-활성화 화합물, 및/또는

- 트랜스글루타미나제 또는 HMG-CoA 환원효소-활성화 화합물과 같은 장벽 기능을 개선시키는 적어도 하나의 화합물, 및/또는

- 적어도 하나의 미토콘드리아-보호 화합물.

상기 화합물들은 천연 기원, 예컨대 식물의 펩타이드 가수분해산물일 수 있거나 또는 합성 기원, 예컨대 펩타이드일 수 있다.

이들의 기능과 관계없이, 조성물 중의 본 발명에 따른 활성제와 관련된 기타 활성제는 매우 다양한 화학적 구조를 가질 수 있다. 이에 제한하지 않지만, 펩타이드, 비타민 C 및 이들의 유도체, B-군 비타민, DHEA(디히드로에피안드로스테론), 피토스테롤, 살리실산 및 이들의 유도체, 레티노이드, 플라보노이드, 당 아민, 아졸, 금속 염, 식물 기원의 펩타이드 추출물 또는 폴리머를 들 수 있다.

세 번째로, 본 발명은 피부 세포에 의한 세포외 기질 단백질 합성을 증가시키기 위한 활성제로서 일반식 (Ⅰ)의 펩타이드를 포함하는 화장품 조성물의 용도에 관한 것이다.

보다 특히, 본 발명에 따른 펩타이드는 인간 피부의 섬유아세포에 의한 피브로넥틴 및 콜라겐 I 및 III의 합성을 증가시키기 위해 사용한다.

본 발명의 이러한 특정 실시형태에 따르면, 일반식 (Ⅰ)의 펩타이드는 진피의 밀도 및 이에 의한 피부의 견고성을 증가시키기 위해 사용하며, 페이셜 선의 늘어짐, 진피 부피의 손실, 피부의 시닝(thinning), 무긴장, 잔주름, 깊은 주름 및 진피 위축을 지연 또는 감소시키기 위해 사용한다.

네 번째로, 본 발명은 섬유아세포 및 각질형성세포 둘 다에 의해 히알루론산의 발현을 증가시키기 위한 활성제로서 일반식 (Ⅰ)의 펩파이드를 포함하는 화장품 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 일반식 (Ⅰ)의 펩타이드는 수분을 보유하고, 노화와 관련된 피부 건조를 지연 또는 감소시키기 위한, 모든 피부층들의 능력을 증가시키기 위해 사용한다.

다섯 번째로, 본 발명은 피부 세포의 노쇠의 출현을 지연시키거나 또는 피부 세포의 노쇠를 감소시키기 위한 활성제로서 일반식 (Ⅰ)의 펩타이드를 포함하는 화장품 조성물의 용도에 관한 것이다.

"진피 세포의 노쇠의 출연을 지연시키거나 또는 진피 세포의 노쇠를 감소키기는 것"이라는 표현은, 본 발명의 유리한 측면에 따르면 본 발명의 펩타이드가 인간 섬유아세포에서 노쇠 마커의 발현을 감소시키는 것을 의미하며, 노쇠는 FOXO3a 유전자의 소멸에 의해서 유도되었다.

여섯 번째로, 본 발명은 노화 및 광노화의 피부 징후를 지연시키거나/시키고, 이를 치료하는 미용 관리 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물은 치료할 피부에 국소적으로 적용된다.

"노화의 피부 징후"는 노화에 의한 피부 및 피부부속물의 외적 출현에서의 모든 변화, 예컨대 피부의 시닝, 늘어짐, 수화 손실 및 무긴장, 깊은 주름 및 잔주름, 견고성 및 색조의 손실, 진피 위축 또는 UV 선에의 노출로부터 얻어지는 피부의 임의의 다른 내부 분해에 의한 피부 및 피부 부속물의 외적 출현을 나타낸다.

본 발명의 다른 이점 및 특성은 예시적이고, 비-제한적인 목적으로 제공하는 하기 실시예에 의해 명확해질 것이다.

실시예 1: 인간 섬유아세포에서 콜라겐 I, 콜라겐 III , 프로-콜라겐, 피브로 넥틴 및 히알루론산의 발현에 미치는 서열 번호 4 및 서열 번호 5 펩타이드의 활성화 효과의 입증

본 연구의 목적은 하기 세포외 기질 단백질의 발현에 미치는 서열 번호 5 펩타이드의 영향 및 서열 번호 4 펩타이드의 영향을 결정하기 위한 것이다: 인간 섬유아세포 중의 콜라겐 I, 콜라겐 III, 프로-콜라겐, 피브로넥틴 및 히알루론산. 이를 위해 진피로부터 수득되는 정상적인 인간 섬유아세포 배양물 상에 특이적 라벨링을 실시하였다.

특이적 라벨링 프로토콜: 배양물 중의 인간 섬유아세포는 24, 48 및/또는 72 시간 동안 최종 농도 0.5%, 1% 및/또는 3%(40 mg/kg의 모액을 기준으로)에서 서열 번호 5의 펩타이드 또는 서열 번호 4의 펩타이드로 처리한다. 다음에 세포를 세척하고, 4℃에서 4분 동안 차가운 메탄올(콜라겐 I, 콜라겐 III 및 히알루론산 라벨링용) 또는 상온에서 10분 동안 3.7%에서의 포름알데하이드(프로-콜라겐 및 피브로넥틴 라벨링용)로 고정한다. 세포는 특이적 레빗(rabbit) 콜라겐 I 다클론성 항체(Rockland, Ref: 600-401-103-0.5), 특이적 레빗 콜라겐 III 다클론성 항체(Rockland, Ref: 600-401-105-0.5), 특이적 렛(rat) 프로-콜라겐 다클론성 항체(Millipore, Ref: MAB1912), 특이적 레빗 피브로넥틴 다클론성 항체(Sigma, Ref: F-3648), 다음에 플루오로크롬과 결합된 항-레빗 이차 항체(Invitrogen, Ref: A21206) 또는 플루오로크롬과 결합된 항-렛(Invitrogen, A11006)의 존재하에 배양한다. 히알루론산의 라벨링을 위해서 세포는 특이적 바이오티닐화 단백질(Coger, Ref: 4007631A)의 존재, 다음에는 플루오로크롬과 결합한 스트렙타비딘(Invitrogen, Ref: S32354)의 존재하에 배양한다. 다음에 세포는 에피플루오로센스 현미경(Nikon Eclipse E600 microscope)하에 시험한다.

결과: 모든 시험 조건하에서, 보다 강한 형광성이, 대조군 조건하에서 보다 서열 번호 5의 펩타이드 또는 서열 번호 4의 펩타이드로 처리된 섬유아세포에서 관찰되었다.

결론: 서열 번호 5 및 서열 번호 4의 펩타이드가 인간 진피 섬유아세포에 의해 콜라겐 I, 콜라겐 III, 프로-콜라겐, 피브로넥틴 및 히알루론산의 발현을 자극한다.

실시예 2: 피부 생체 검사에서 콜라겐 I, 콜라겐 III , 프로-콜라겐 및 히알루론산의 발현에 미치는 서열 번호 5 펩타이드의 활성화 효과의 입증

본 연구의 목적은 인간 피부에서의 하기 세포외 기질 단백질의 발현에 미치는 서열 번호 5 펩타이드의 영향을 확인하기 위한 것이다: 콜라겐 I, 콜라겐 III, 프로-콜라겐, 피브로넥틴 및 히알루론산. 이를 위해서, 특이적 라벨링을 생체외에서 배양된 인간 피부 샘플 상에서 실행했다.

프로토콜: 인간 피부 샘플을 배양물의 공기/액체 인터페이스에 놓는다. 서열 번호 5의 펩타이드를 최종 농도 0.5%, 1% 또는 3%(40 mg/kg의 모액 사용)로 샘플 상에 국소적으로 적용한 다음에 샘플을 37℃에서 24, 48 및/또는 72 시간 동안 배양한다.

다음에 이러한 피부 샘플을 포름알데하이드로 고정하고, 파라핀에 포매(embedded)하거나, 또는 OCT에 고정 및 포매하고, -20℃로 냉동한다. 다음에 4 ㎛ 두께의 섹션을 제조한다(냉동 섹션용으로는 6 ㎛).

특이적 부위를 언마스킹(unmasking)한 후에 파라핀에 포매된 샘플 상에 콜라겐 I 및 콜라겐 III의 라벨링을 실시한다. 면역라벨링은 특이적 레빗 콜라겐 I 다클론성 항체(Rockland, Ref: 600-401-103-0.5), 특이적 레빗 콜라겐 III 다클론성 항체(Rockland, Ref: 600-401-105-0.5), 다음에는 플루오로크롬과 결합한 항-레빗 이차 항체(Invitrogen, Ref: A21206)를 사용해서 실행한다. 히알루론산의 라벨링에 있어서는, 세포를 특이적 바이오티닐화 단백질(Coger, Ref: 4007631A)의 존재하에, 다음에는 플루오로크롬과 결합한 스트렙타비딘(Invitrogen, Ref: S32354)의 존재하에 배양한다.

OCT에 포매된 샘플 상에 프로-콜라겐의 면역라벨링을 차가운 아세톤으로 10분 간 고정한 후에 실시한다. 면역라벨링은 특이적 렛 프로-콜라겐 다클론성 항체(Millipore, Ref: MAB1912), 다음에는 형광성 마커와 결합한 항-렛 이차 항체(Invitrogen, A11006)를 사용해서 실시한다.

다음에 세포는 에피플루오로센스 현미경(Nikon Eclipse E600 microscope)하에서 평가한다.

결과: 현미경 관찰로 서열 번호 5의 펩타이드로 처리한 피부 샘플의 진피에서 보다 강한 형광성을 확인하였다. 히알루론산의 면역라벨링의 경우에 형광성의 증가가 서열 번호 5의 펩타이드로 처리한 피부 샘플의 표피에서도 또한 관찰되었다.

결론: 서열 번호 5의 펩타이드는 진피에서 콜라겐 I, 콜라겐 III, 프로-콜라겐의 발현을 자극하며, 인간 진피 및 표피에서 히알루론산의 발현을 자극한다.

실시예 3: 실시간 PCR 에 의해 콜라겐 I 메신저 RNAs 의 발현에 미치는 서열 번호 5 펩타이드의 활성화 효과의 입증

본 연구의 목적은 인간 섬유아세포에서 콜라겐 I 메신저 RNAs의 발현에 미치는 서열 번호 5 펩타이드의 영향을 확인하기 위한 것이다. 이를 위해서, 콜라겐 I의 발현을 실시간 PCR로 연구했다.

프로토콜: 배양물 중의 인간 섬유아세포를 24, 48 및 72 시간 동안 최종 농도 0.5% 및 1%(40 mg/kg의 모액 사용)로 서열 번호 5의 펩타이드로 처리한다. 총 RNAs를 추출 키트(QIAGEN)를 사용해서 추출한 다음에, RNase 억제제(Applied Biosystems)를 함유하는 특이적 키트로 역 전사시킨다. 실시간 PCR은 특이적 콜라겐 I TaqMan 유전자 발현 분석(Applied Biosystem, Hs99999901_s1) 및 내생 대조군으로서 특이적 18S TaqMan 유전자 발현 분석(Applied Biosystem, Hs00164004_m1)을 사용해서 유전자증폭기에서 실행한다. 콜라겐 I 메신저 RNAs의 발현의 상대적 정량은 비교 Ct 방법(Ct, 즉 한계 사이클은 증폭 곡선과 한계 선 사이의 교차지점임)에 의해 실시한다.

결과/결론: 서열 번호 5의 펩타이드는 인간 섬유아세포에서 콜라겐 I 메신저 RNAs의 발현을 자극한다.

실시예 4: 서열 번호 5 펩타이드의 존재하에서 노쇠 마커 P16 의 발현 연구

본 연구의 목적은 피부에서의 발현이 나이에 따라 증가하는 단백질인 P16의 발현에 미치는 서열 번호 5 펩타이드의 영향을 확인하기 위한 것이다. P16은 세포 노쇠의 확실한 마커로서 알려져 있는, 세포 사이클의 음성조절과 관련된 단백질이다(Brookes S. et al. Experimental Cell Research 298, 2004).

프로토콜: 배양물 중의 인간 섬유아세포를 48 시간 동안 최종 농도 0.5% 및 1%(40 mg/kg의 모액 사용)로 서열 번호 5 펩타이드로 처리한다. 세포는 Shandon Cytoblock® 세포 제조 시스템 키트(Thermo Scientific, Ref: 7401150)에 따라 준비한다.

다음에 세포를 포름알데하이드로 고정하고, 파라핀에 포매한다. 다음에 4 ㎛의 섹션을 제조한다. 파라핀에 포매된 세포 상의 p16의 라벨링은 특이적 부위를 언마스킹한 후에 실시한다. 면역라벨링은 특이적 마우스 p16 다클론성 항체(Santa-Cruz, Ref: sc-81157), 다음에는 플루오로크롬과 결합한 항-마우스 이차 항체(Invitrogen, Ref: A21202)를 사용해서 실시한다. 다음에 세포는 에피플루오로센스 현미경(Nikon Eclipse E600 microscope)하에서 평가한다.

결과: 현미경 관찰로 서열 번호 5의 펩타이드로 처리한 세포에서 덜 강한 핵 형광성이 확인되었다.

결론: 서열 번호 5의 펩타이드는 인간 섬유아세포에서 p16 노쇠 마커의 발현을 감소시킨다.

실시예 5: 서열 번호 5 펩타이드에 의한 섬유아세포에서 유도되는 세포 노쇠의 전환 입증

본 연구의 목적은 FOXO3a 유전자의 소멸로 노쇠가 유도되는 노쇠 섬유아세포 에 미치는 서열 번호 5의 펩타이드의 영향을 확인하기 위한 것이다. 이러한 세포는 이들의 노쇠 상태와 관련해서 베타-갈락토시다아제를 과발현시킨다.

FOXO3a는 세포의 장수와 관련되는 전사 조절 인자(Forkhead transcription factor)이다. 피부에서, FOXO3a의 음성조절로 정상적인 인간 섬유아세포의 노쇠가 촉진된다(Hyun Kyoung K. et al. J. of Gerontol., 2005, vol. 60A n°1, pages 4-9). 이러한 특성은 특이적 간섭 RNA(siRNA)에 의해 FOXO3a 발현을 차단함으로써 인간 섬유아세포에서의 노쇠를 유도하는데 유리하게 사용되었다.

프로토콜: 배양물 중의 인간 섬유아세포는 Lipofectamine^TM RNAiMAX(Invitrogen, Ref: 13778-075) 트랜스펙션 기술을 사용해서 25 nM의 최종 농도에서 FOXO3a의 특이적인 siRNA 처리에 의해 노화시킨다. 비처리 대조군도 제조한다. 섬유아세포에는 48 시간 동안 최종 농도 1%(40 mg/kg의 모액 사용)의 서열 번호 5의 펩타이드를 동시에 처리한다.

세포를 헹구고, 고정 완충액(0.2% 글루타르알데하이드, 2% 포름알데하이드)으로 고정한다. 다음에 세포는 40 mM의 시트르산/포스페이트(pH 6), 5 mM의 K₃FeCN₆, 5 mM의 K₄FeCN₆, 150 mM의 NaCl 및 2 mM의 MgCl₂ 중 1 mg/mL X-Gal 용액으로 24 시간 동안 CO₂ 없이 37℃에서 배양한다. 다음에 세포는 백색광 현미경(Nikon Eclipse E600 microscope)으로 시험한다.

결과: 특이적 β-갈락토시다아제 활성을 갖는 노쇠 세포는 청색으로 염색된다. FOXO3a의 특이적 siRNA로 처리한 세포에서는 청색으로 염색된 세포의 수의 증가와 관련되는 노쇠 유도 관련 β-갈락토시다아제 활성의 증가를 보여준다. 1%에서 서열 번호 5의 펩타이드 및 FOXO3a의 특이적 siRNAs로 처리한 세포에서는 청색으로 염색된 세포의 수의 감소와 관련하여 β-갈락토시다아제 활성의 감소를 보여준다.

결론: 서열 번호 5의 펩타이드는 인간 섬유아세포에서 유도되는 노쇠 표현형을 감소시킬 수 있다.

실시예 6: 조성물의 제조

1 - 항-노화 페이셜 크림:

65℃ 내지 70℃에서 상 A를 준비하고 용융한다. 상 C는 65 내지 70℃에서 가열한다. 상 B는 상 C 중에 상 A를 유화하기 직전에 상 A에 첨가한다. 약 45℃에서, 카보머를 상 D에 첨가하여 중화시킨다. 다음에 약 30℃에서, 상 E를 가볍게 교반하면서 첨가하고, 25℃에 도달할 때까지 냉각을 지속한다. 다음으로, 필요하다면 상 F를 첨가한다.

SEQUENCE LISTING <110> ISP Investments INC. <120> NOUVEAUX PEPTIDES ACTIVATEURS DE LA SYNTHESE DES PROTEINES DE LA MATRICE EXTRACELLULAIRE ET COMPOSITIONS COSMETIQUES LES COMPRENANT <130> Bv PCT 11-150 <150> FR1100497 <151> 2011-02-18 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> AMIDATION <400> 1 Ala Pro Ala Gly Pro 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Synthetic peptide <400> 2 Val Pro Ala Gly Pro 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> AMIDATION <400> 3 Val Pro Gly Gly Pro 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Synthetic peptide <400> 4 Gly Pro Ala Gly Pro 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> AMIDATION <400> 5 Gly Pro Ala Gly Pro 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 6 Lys Gly Ala Pro Gly Gly Pro Asn Tyr 1 5

Claims (15)

1. 하기 일반식 (Ⅰ)의 펩타이드로서,
   R₁-(AA)_n-X₁-Pro-X₂-Gly-Pro-X₃-X₄-(AA)_p-R₂
   식 중,
   X₁은 글리신 또는 알라닌 또는 발린을 나타내며,
   X₂는 글리신 또는 알라닌 또는 발린을 나타내고,
   X₃은 아스파라긴 또는 리신 또는 글루타민을 나타내고, 또는 X₃은 존재하지 않으며,
   X₄는 페닐알라닌 또는 티로신을 나타내고, 또는 X₄는 존재하지 않으며,
   AA는 임의의 아미노산을 나타내며, n 및 p는 0 내지 2의 정수이고,
   R₁은 N-말단 아미노산의 일차 아민 작용기 -NH₂를 나타내며, 상기 -NH₂에서, 두 개 수소 원자 중 하나는 포화 또는 불포화 C₁ 내지 C₃₀ 알킬 사슬, 또는 아실-타입 기(R-CO-)(여기서, 라디칼 R은 포화 또는 불포화 C₁ 내지 C₃₀ 알킬 사슬), 또는 벤조일, 토실 또는 벤질옥시카르보닐 타입의 방향족 기에 의해 치환될 수 있으며,
   R₂는 C-말단 아미노산의 카르복실 작용기의 히드록실기 -OH를 나타내며, 상기 -OH에서, 수소 원자는 C₁ 내지 C₃₀ 알킬 사슬, 또는 NH₂, NHY 또는 NYY 기에 의해서 치환될 수 있으며, 상기 NHY 및 NYY에서, Y는 C₁ 내지 C₄ 알킬 사슬을 나타내고,
   상기 일반식 (Ⅰ)의 서열은 5 내지 11개의 아미노산 잔기로 이루어지며, 염의 형태로 존재할 수 있는, 펩타이드에 있어서,
   상기 일반식 (Ⅰ)의 서열은 하기 서열 중의 하나로 구성되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   (서열 번호 4): Gly-Pro-Ala-Gly-Pro
   (서열 번호 5): Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-NH₂
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 물, 글리세롤, 에탄올, 프로판디올, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 에톡시화 또는 프로폭시화 디글리콜, 사이클릭 폴리올, 또는 이들 용매들의 임의의 혼합물과 같은 하나 이상의 생리학적으로 적합한 용매 중에 용해되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
3. 피부에서 세포외 기질 단백질 합성을 활성화시키는 활성제로서 제1항에 따른 적어도 하나의 펩타이드를 생리학적으로 적합한 매질 중에 포함하는 화장품 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 펩타이드는 최종 조성물의 총 중량에 대해서 0.0005 내지 500 mg/kg의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 펩타이드는 최종 조성물의 총 중량에 대해서 0.01 내지 5 mg/kg의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
   
6. 제3항 또는 제5항에 있어서,
   상기 조성물은 국소 투여용인 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
   
7. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 적어도 하나의 다른 활성제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 다른 활성제는 재생, 항노화, 주름 방지, 진정, 항자유라디칼, 당화 방지, 수화, 항균성, 항진균성, 각질 용해, 근육 이완, 각질 제거 및 탄력 제제, 진피 거대분자의 합성 또는 에너지 대사 또는 미소 순환 또는 손톱 또는 머리카락 성장을 자극하는 제제, 표피의 분화 또는 색소 침착을 조절하는 제제, 금속단백분해효소-억제 제제 또는 선스크린 및 선 필터제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
   
9. 생리학적으로 적합한 매질 중에, 피부 세포에 의한 세포외 기질 단백질 합성을 증가시키기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 펩타이드를 포함하는 화장품 조성물.
   
10. 생리학적으로 적합한 매질 중에, 섬유아세포에 의한 I-타입 및 III-타입 콜라겐 및 피브로넥틴의 합성을 증가시키기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 펩타이드를 포함하는 화장품 조성물.
    
11. 진피의 밀도 및 피부의 탄력성을 증가시키고, 페이셜 선의 늘어짐, 진피 부피의 감소, 피부 시닝(thinning), 무긴장, 잔주름 및 깊은 주름을 지연 또는 감소시키기 위한 제10항에 따른 화장품 조성물.
    
12. 생리학적으로 적합한 매질 중에, 피부 섬유아세포 및 각질형성세포에 의한 히알루론산의 발현을 증가시키기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 펩타이드를 포함하는 화장품 조성물.
    
13. 수분을 보유하고, 노화와 관련된 피부 건조를 지연 또는 감소시키기 위한 모든 피부층들의 능력을 증가시키기 위한 제12항에 따른 화장품 조성물.
    
14. 생리학적으로 적합한 매질 중에, 피부 세포 노쇠의 출현을 지연시키거나 또는 피부 세포의 노쇠를 감소시키기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 펩타이드를 포함하는 화장품 조성물.
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