CN114010526A - 一种抗衰多肽组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗衰多肽组合物及其应用，属于美容多肽技术领域，该组合物包含减少细胞外基质蛋白分解的多肽与减少早衰蛋白合成的多肽，两者的浓度比为(3～5):(5～7)。所述减少细胞外基质蛋白分解的多肽，包括但不限于：六肽‑11。所述减少早衰蛋白合成的多肽，包括但不限于：三氟乙酰三肽‑2。本发明的多肽组合物采用不同靶点的多肽，通过特定比例组合发挥协同作用，具有优异的抗氧化及抗光老化能力，可以减缓衰老，从而可用于抗衰的产品当中。
Description
技术领域
本发明属于美容多肽技术领域，提供了一种抗衰多肽组合物及其应用。
背景技术
随着科学技术的发展，抗衰产品也越来越受到人们的关注。皮肤是一个很容易呈现老化的器官。紫外线照射、氧化应激、化学物质和机械应激等外源性干扰会加速皮肤老化，源自内源性代谢活动的氧化应激也会刺激衰老。皮肤衰老的特征也随之出现：皱纹增多，皮肤松弛、变黄，光泽、光滑度降低，皮肤纹理变粗，色素沉着色斑增多等。
长时间的紫外线照射介导的皮肤老化被表征为光老化，自然老化和光老化都会进一步导致皮肤老化。由于基质金属蛋白酶的产生和/或活性增加，导致前胶原、胶原蛋白和弹性蛋白的产生减少，导致老化的皮肤由于细胞外基质结构和成分的变化而表现出弹性丧失。
此外，细胞的衰老与早衰蛋白有密不可分的关系，作为lamin A突变体的Progerin是多种衰老过程的生理生物标志物之一，早衰蛋白的激增会加速细胞衰老进程。随着年龄的增长，早衰蛋白越积越多，导致细胞核老化，从而产生一系列衰老现象。
针对上述问题及衰老机理，有必要寻找新的抗衰老策略，通过去除刺激/导致衰老的物质来减少衰老进程，促进皮肤再生、增加细胞活力、减缓衰老。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗衰多肽组合物。所述组合物通过不同作用靶点的多肽以特定比例复配得到，能够发挥协同作用，可用于抗氧化，治疗、预防或修复皮肤老化或光老化的迹象。
为实现上述目的，本发明提供一种抗衰多肽组合物，包含：
(1)减少细胞外基质蛋白分解的多肽，所述多肽包括但不限于：六肽-11；
(2)减少早衰蛋白合成的多肽，所述多肽包括但不限于：三氟乙酰三肽-2；
所述多肽组合物中，减少细胞外基质蛋白分解的多肽与减少早衰蛋白合成的多肽的浓度比为(3～5):(5～7)。
本发明所述六肽-11(Hexapeptide-11，FVAPFP)，作用于真皮成纤维细胞，促进胶原蛋白、弹性蛋白和细胞外基质成分的合成，可延缓细胞自然衰老或应激诱导的细胞衰老。
本发明所述三氟乙酰三肽-2，是从elafin(弹性蛋白酶抑制因子)衍生得到的仿生肽，可减少progerin(早衰蛋白)合成，抑制基质金属蛋白酶和弹性蛋白酶，增加蛋白聚糖的产生并收缩胶原蛋白，因此可以减少皱纹并增加组织的硬度，具有抗衰功效。
优选地，本发明所述减少细胞外基质蛋白分解的多肽与减少早衰蛋白合成的多肽的浓度比为3:7或5:5。
优选地，所述浓度比为六肽-11与三氟乙酰三肽-2的浓度比3:7或5:5。
进一步优选地，所述减少细胞外基质蛋白分解的多肽与减少早衰蛋白合成的多肽的浓度比为3:7。
进一步优选地，所述浓度比为六肽-11与三氟乙酰三肽-2的浓度比3:7。
本发明所述的抗衰多肽组合物，其制剂选自：精华液、粉剂、片剂、胶囊、乳剂、软膏、霜剂或凝胶。
本发明的另一方面，提供一种抗衰多肽组合物在制备抗氧化的美容组合物或药物组合物中的用途。
本发明的另一方面，提供一种抗衰多肽组合物在制备用于治疗、预防或修复皮肤老化或光老化的美容组合物或药物组合物中的用途。
皮肤老化或光老化的治疗、预防或修复是促进成纤维细胞增殖，减少、预防或治疗面部皱纹。
本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：
UVB照射穿过表皮并到达真皮上部，导致真皮成纤维细胞产生氧化应激，导致细胞衰老和光老化。本发明针对不同的衰老机理，采用减少细胞外基质蛋白分解的多肽与减少早衰蛋白合成的多肽进行复配，两者浓度比为(3～5):(5～7)，由此得到的组合物，具有协同作用，特别是六肽-11与三氟乙酰三肽-2的浓度比为3:7或5:5时，ROS染色分析显示，组合物具有优异的抗氧化能力；β-半乳糖苷酶染色分析显示，紫外线照射后人真皮成纤维细胞中β-半乳糖苷酶阳性细胞升高，而用本发明组合物孵育的细胞中紫外线照射诱导的衰老细胞比例显著降低，表明本发明的组合物具有优异的抗光老化能力，可以减缓衰老，从而可用于抗衰的产品当中。
附图说明
图1是测试样品对HSF细胞活性影响结果图。
图2是本发明的组合物对HSF细胞ROS的影响结果图。
图3是β-半乳糖苷酶染色形态图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例对发明作详细的说明，然而，应当理解的是，这些实施例仅用作说明目的，并且不旨在限制本发明的范围。
本发明实施例的组合物中各多肽的复配比例如下：
| 原料名称 | 组合物1 | 组合物2 | 组合物3 |
| 六肽-11(下称肽A) | 3 | 5 | 7 |
| 三氟乙酰三肽-2(下称肽B) | 7 | 5 | 3 |
注：在组合物为10ppm时，如肽A：肽B＝3：7，表示肽A为3ppm，肽B为7ppm。
实施例1细胞活性实验
1.1试剂与材料
噻唑蓝(MTT)(Sigma)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)、高糖培养基(DMEM)(Gibco)、胎牛血清(Gibco)。
1.2仪器
酶标仪(美国MD)、CO2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)。
1.3细胞株
HSF人皮肤成纤维细胞。
1.4待测样品
给药组：
肽A，测试浓度分别为5ppm、10ppm；
肽B，测试浓度分别为5ppm、10ppm；
组合物1，测试浓度分别为5ppm、10ppm；
组合物2，测试浓度分别为5ppm、10ppm；
组合物3，测试浓度分别为5ppm、10ppm；
给药组采用0.5％DMSO溶液溶解。
control组：0.5％DMSO。
阳性对照组：2％DMSO。
1.5实验方法
取冻存的HSF细胞培养，按照1：2传代至5代左右，选择长势较好的细胞作为实验对象。将细胞2000个/孔接种在96孔板中，待细胞贴壁后，按照倍比稀释法，分别加入给药组、control组和阳性对照组样品，补充培养基至200μL，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育72h。
之后每孔加入22μL 5mg/mL MTT，继续于37℃、5％CO2培养箱中孵育4h。弃去原溶液，加入150μL/孔的DMSO。5min后使用酶标仪读取490nm和630nm波长下的参比OD值。
1.6结果
MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，以control组为参照比值，在HSF细胞上开展细胞活性检测实验，测得的OD值与细胞活性成正比。
图1为测试样品对HSF细胞活性影响结果图。结果显示，与control组相比，肽A、肽B、组合物1、组合物2、组合物3在10ppm以内对HSF细胞均没有毒性。
将肽A与肽B按照不同的复配比例分别得到组合物1(肽A：肽B＝3:7)、组合物2(肽A：肽B＝5:5)、组合物3(肽A：肽B＝7:3)。其中，组合物1和组合物2能够显著地促进细胞增殖，与单一肽A、肽B相比，具有更优的技术效果；而组合物3与肽A、肽B相比，在同一浓度下，对于细胞增殖的促进作用没有显著差异。
由上可知，肽A与肽B通过不同比例组合之后，在两者的比例为3:7或5：5时，在10ppm范围内对HSF细胞的增殖促进作用呈剂量依赖性，且具有比单肽及组合物3(肽A：肽B＝7:3)更优的技术效果，说明通过特定比例组合之后，肽A与肽B可以发挥协同增效作用。
实施例2抗氧化应激评价
2.1试剂与材料
胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素、ROS探针。
2.2仪器
荧光显微镜、CO2培养箱。
2.3细胞株
HSF人皮肤成纤维细胞。
2.4待测样品
给药组：
5ppm肽A；5ppm肽B；5ppm组合物1；5ppm组合物2；
给药组采用0.5％DMSO溶液溶解。
control组：0.5％DMSO。
2.5实验方法
取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数1～4×105个/mL，制成细胞悬液。适当稀释取10000个/孔细胞悬液接种于96孔板上，待细胞长满至80％左右时，建立UV光老化模型。control组不进行UV照射；UV组和给药组加入适量PBS反复洗至无色后加入50μL PBS，以80J/cm3 UV灯下照射，灯源和培养瓶间距15cm。经照射后，弃去PBS，UV组不加药，给药组加入培养液和倍比稀释药物至200μL。control组、UV组、给药组继续于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。
ROS染色：弃去培养基，按照ROS探针说明进行染色，染色时间为20min，并置于荧光显微镜下观察。
2.6结果
衰老的指征之一是细胞内氧化应激水平提高，即ROS增加，而通过降低氧化应激可以减缓衰老。为评价测试样品的抗氧化能力，建立UV光老化模型，使用活性氧荧光探针进行标记，结果见图2。
结果显示，经UV辐射后，细胞密度降低，相同单位内细胞ROS表达增加(如图2中浅色部分所示)。肽A、肽B在5ppm时，对单位细胞ROS水平的影响较小。相比之下，5ppm的组合物1、组合物2均可以抑制光老化细胞的氧化应激水平，显著降低单位细胞ROS的表达，具有优异的抗氧化能力，其中组合物1的技术效果更优。
由此说明，肽A与肽B通过不同比例组合之后，在两者的比例为3:7或5：5时，能够发挥协同作用，肽A与肽B经特定比例组合后，相较于同一浓度下肽A、肽B单独存在时，组合物具有更加优异的抗氧化能力，因此本发明的组合物可以减缓衰老，从而用于抗衰的产品当中。
实施例3抗光老化评价
3.1试剂与材料
胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素、β-半乳糖苷酶试剂盒。
3.2仪器
倒置显微镜、CO2培养箱。
3.3细胞株
HSF人皮肤成纤维细胞。
3.4待测样品
给药组：
肽A，测试浓度分别为5ppm、10ppm；
肽B，测试浓度分别为5ppm、10ppm；
组合物1，测试浓度分别为5ppm、10ppm；
给药组采用0.5％DMSO溶液溶解。
control组：0.5％DMSO。
3.5实验方法
取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数1～4×105个/mL，制成细胞悬液。适当稀释取10000个/孔细胞悬液接种于96孔板上，待细胞长满至80％左右时，建立UV光老化模型。control组不进行UV照射；UV组和给药组加入适量PBS反复洗至无色后加入50μL PBS，以80J/cm3 UV灯下照射，灯源和培养瓶间距15cm。经照射后，弃去PBS，UV组不加药，给药组加入培养液和倍比稀释药物至200μL。control组、UV组、给药组继续于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。
β-半乳糖苷酶染色：弃去培养基，每孔加入100μL 4％多聚甲醛室温固定15min，PBS洗涤3次，加入β-半乳糖苷酶染色试剂(X-gal 0.01％，铁氰化钾0.16％，亚铁氰化钾0.02％)50μL/孔，保鲜膜封闭，37℃恒温箱避光染色12h。弃去染色液，PBS洗涤3次，置于显微镜下拍照。
3.6结果
UV照射能够引起细胞衰老，衰老的细胞胞浆会被β-半乳糖苷酶试剂染成蓝绿色(黑白图中以深色部分表示)。本实验通过染色形态图评价本发明组合物的抗光老化能力。
图3是β-半乳糖苷酶染色形态图。结果显示，经UV辐照后，衰老细胞明显增加(如图3中深色部分所示)。给药后，5ppm的肽A、肽B没有表现出明显的改善细胞光老化的能力，而5ppm的组合物1可以降低衰老细胞比例，抑制细胞光老化。在10ppm时，肽A、肽B可以在一定程度上降低衰老细胞比例，相比之下，10ppm的组合物1可以显著促进细胞增殖并降低单位细胞着色面积，具有更优的抗光老化修复能力。
由此说明，肽A与肽B在复配比例为3:7时，能够发挥协同作用，肽A与肽B经特定比例组合后，相较于同一浓度下肽A、肽B单独存在时，组合物具有更加优异的抗光老化能力，因此本发明的组合物可以减缓衰老，从而用于抗衰的产品当中。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种抗衰多肽组合物，其特征在于，包含：
(1)减少细胞外基质蛋白分解的多肽，所述多肽包括但不限于：六肽-11；
(2)减少早衰蛋白合成的多肽，所述多肽包括但不限于：三氟乙酰三肽-2；
所述多肽组合物中，减少细胞外基质蛋白分解的多肽与减少早衰蛋白合成的多肽的浓度比为(3～5):(5～7)。
2.根据权利要求1所述的抗衰多肽组合物，其特征在于，所述减少细胞外基质蛋白分解的多肽与减少早衰蛋白合成的多肽的浓度比为3:7或5:5。
3.根据权利要求2所述的抗衰多肽组合物，其特征在于，所述浓度比为六肽-11与三氟乙酰三肽-2的浓度比3:7或5:5。
4.根据权利要求2所述的抗衰多肽组合物，其特征在于，所述减少细胞外基质蛋白分解的多肽与减少早衰蛋白合成的多肽的浓度比为3:7。
5.根据权利要求3所述的抗衰多肽组合物，其特征在于，所述浓度比为六肽-11与三氟乙酰三肽-2的浓度比3:7。
6.根据权利要求1所述的抗衰多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物的制剂选自：精华液、粉剂、片剂、胶囊、乳剂、软膏、霜剂或凝胶。
7.权利要求1所述的抗衰多肽组合物在制备抗氧化的美容组合物或药物组合物中的用途。
8.权利要求1所述的抗衰多肽组合物在制备用于治疗、预防或修复皮肤老化或光老化的美容组合物或药物组合物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，皮肤老化或光老化的治疗、预防或修复是促进成纤维细胞增殖，减少、预防或治疗面部皱纹。
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