JP2014510052A - 細胞外基質タンパク質合成を活性化する新規ペプチドおよびそれを含有する化粧料組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、肌での細胞外基質タンパク質合成を活性化させる新規ペプチドに関する。
本発明はまた、本ペプチドを作用剤として含有する化粧料組成物、ならびに本組成物の細胞外基質タンパク質発現を増加させるための使用に関し、使用することで、シワ、皮膚のたるみおよびしぼみ、ならびに肌の乾燥の出現を遅らせるか、または減少させる。
最後に本発明は、皮膚の加齢サインおよび光加齢サインの出現を遅らせることまたはそれを手当することを意図した美容目的の手入れ法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、化粧料用および皮膚医薬用の作用剤ならびにそれらを含有する組成物の分野に関する。

本発明の目的は、細胞外基質タンパク質発現を活性化する新規ペプチドを提供することである。

本発明は、生理学的に適切な媒体中にそのようなペプチドを作用剤として含有する化粧料組成物にも関する。

本発明は、細胞外基質タンパク質発現を増加させるための、皮膚の加齢サイン（特にシワ、皮膚のたるみおよびしぼみ、ならびに肌の乾燥）の出現を遅らせるための、および／またはそれに立ち向かうためのそのような組成物の使用、ならびに最終的には、皮膚の加齢サインおよび光加齢サインの出現を遅らせることおよび／またはそれを手当することを意図した美容目的の手入れ法にも関する。

肌は、複数の層（真皮、真皮表皮接合部、表皮）からなる被覆器官である。真皮は、肌を支える組織であって、水、エラスチン繊維、およびコラーゲン繊維（真皮の繊維の７０％）からなり、プロテオグリカンの間質基質に包まれている。線維芽細胞が真皮の主要構成細胞であり、コラーゲン繊維およびエラスチン繊維合成の源である。

グリコサミノグリカンは、その並外れた吸湿性により、コラーゲン繊維およびエラスチン繊維の構築および水の貯蔵を確実にしている。ヒアルロン酸は、肌で最も豊富に存在するグリコサミノグリカンであり、真皮の主要な構成要素であるが、表皮のケラチン生成細胞周囲にも存在する。グリコサミノグリカンとコラーゲンの複合体が、肌の柔軟性および張りに大きな役割を果たしている。

肌は、その他の器官全てと同様に、加齢の複雑な生理プロセスを受ける。内因性すなわち経時的加齢と、外因性加齢は区別される。内因性加齢は、遺伝的にプログラムされた老化の結果であり、内生要因による生化学的変化である。肌においては、内因性加齢は、細胞および細胞外基質の再生が遅くなり、その結果、真皮および表皮の萎縮、乾燥、弾力性減少、ならびに細かいスジおよびシワが現れることを特徴とする。

外因性加齢は、環境ストレス（汚染、日光、疾病、生活習慣など）によるものである。これらの攻撃に慢性的に曝されている領域では、外因性加齢の影響は内因性加齢の影響と相まったものになる。これを光加齢と称する。光加齢に関連した主な変化として、以下が挙げられる：色素斑の出現、ならびにコラーゲン繊維の減少および破壊によるシワの出現。

皮膚加齢に立ち向かうことができる作用剤を特定する研究の結果、効果の大小に関わらず多数の作用剤が市場に送り出されてきた。しかしながら、皮膚の加齢サインの出現を遅らせることができる、またはそれにより効果的に立ち向かうことができる新規化合物を特定することの重要性は変わらない。本発明が取り上げるより具体的な課題は、細胞外基質での皮膚の加齢サインの主要なものに立ち向かうことができる新規作用剤を特定することである。

本発明者らは、以下の一般式（Ｉ）：
Ｒ_１−（ＡＡ）_ｎ−Ｘ_１−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_３−Ｘ_４−（ＡＡ）_ｐ−Ｒ_２
を有するペプチドが優れた細胞外基質タンパク質合成活性化剤であることを実証した。したがって、このペプチドは、肌の加齢および光加齢に立ち向かうのに適している。

本発明によるペプチドは、以下の特徴を有する：
・Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの発現を増加させる
・フィブロネクチンの発現を増加させる、
・ヒアルロン酸の発現を増加させる、
・線維芽細胞の老化のサインを減少させる

「細胞外基質タンパク質を活性化させるペプチドすなわち作用剤」は、直接または間接的に遺伝子発現を調節することによりタンパク質合成を増加させるか、または他の生体プロセス（タンパク質安定化もしくはメッセンジャーＲＮＡ転写の安定化など）によるかのいずれかで、細胞に存在する、あるいは分泌されるコラーゲン、フィブロネクチン、およびヒアルロン酸の量を増加させることができる一般式（Ｉ）の任意のペプチドを意味する。

「線維芽細胞の老化サイン」は、細胞の老化表現形質に関連した生化学マーカーの発現プロファイルを意味する。

肌は、肌、粘膜、および肌付属物（髪、まつげ、および眉毛を含む）で構成される被覆器官全てを示す。

すなわち、第一に、本発明は、一般式（Ｉ）のペプチドに関する：
Ｒ_１−（ＡＡ）_ｎ−Ｘ_１−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_３−Ｘ_４−（ＡＡ）_ｐ−Ｒ_２
式中
Ｘ_１は、グリシンまたはアラニンまたはバリンを表し、
Ｘ_２は、グリシンまたはアラニンまたはバリンを表し、
Ｘ_３は、アスパラギンまたはリシンまたはグルタミンを表すか、またはアミノ酸がないことを表し、
Ｘ_４は、フェニルアラニンまたはチロシンを表すか、またはアミノ酸がないことを表し、
ＡＡは、任意のアミノ酸を表し、ならびにｎおよびｐは０〜２の整数であり、
Ｒ_１は、Ｎ末端アミノ酸の第一級アミン官能基−ＮＨ２を表し、式中２つの水素原子のうち１つは、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０アルキル鎖、またはアシル基（Ｒ−ＣＯ−）（式中、Ｒ基は、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０アルキル鎖、好ましくはメチルであり）、またはベンゾイル型、トシル型、もしくはベンジルオキシカルボニル型の芳香族基のいずれかで置換可能であり、
Ｒ_２は、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基のヒドロキシル基−ＯＨを表し、式中、水素原子は、Ｃ_１〜Ｃ_３０アルキル鎖で置換可能であるか、またはＮＨ_２、ＮＨＹ、もしくはＮＹＹ基（式中、Ｙは、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル鎖を表し）を表し、
一般式（Ｉ）の上記配列は、５〜１１個のアミノ酸残基からなり、塩の形を取ることができる。

本発明の特別に好適な実施形態によれば、ペプチドは以下の配列のものである：
（配列番号１）：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ_２
（配列番号２）：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
（配列番号３）：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ_２
（配列番号４）：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
（配列番号５）：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ_２
（配列番号６）：Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＧＬｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２

特に有用な実施形態によれば、ペプチドは配列番号４の配列に相当する。

別の特に有用な実施形態によれば、ペプチドは配列番号５の配列に相当する。

本発明によるペプチドを構成し、用語「ＡＡ」で示されるアミノ酸は、Ｌ配置およびＤ配置の異性体が可能である。好ましくは、アミノ酸はＬ型である。

「ペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸がペプチド結合により互いに結合している鎖を示す。

「ペプチド」はまた、上記の通りの本発明の天然または合成ペプチド、あるいはそれらペプチドの断片の少なくとも１つ（これは、タンパク質分解によるものでも合成によるものでも構わない）、あるいは上記のペプチドの配列の全てまたは一部をその配列に含む任意の天然または合成ペプチドを示す。

分解されにくくするために、本発明によるペプチドは、保護した形で用いる必要があるかもしれない。Ｎ末端アミノ酸の第一級アミン官能基は、アシル型（Ｒ−ＣＯ−、式中、Ｒ基は、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０アルキル鎖、好ましくはメチル基である）のＲ_１基で置換するか、またはベンゾイル型、トシル型、もしくはベンジルオキシカルボニル型の芳香族基で置換するかのいずれかにより、保護することが可能である。

好ましくは、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基は、Ｃ_１〜Ｃ_３０アルキル鎖型のＲ_２基、あるいはＮＨ_２、ＮＨＹ、またはＮＹＹ基（式中、Ｙは、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル鎖を表す）で置換することにより、保護される。

配列番号１〜配列番号６の配列を有する本発明によるペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端の片方または両末端で保護することができる。

本発明による一般式（Ｉ）のペプチドは、古典的な化学合成（固相中または均一液相中）によるか、酵素を利用した合成（Ｋｕｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８０， ｖｏｌ． ２２５， ｐ．８２３４）によるかのいずれかで、構成アミノ酸から得ることができる。

本発明によるペプチドは、天然物由来でも合成由来でもよい。好ましくは、本発明によれば、ペプチドは、化学合成により得られた合成由来のものである。

本発明によれば、作用剤は、単一のペプチドであってもペプチド混合物であってもよい。

有利なことに、本発明によるペプチドは、１種以上の生理学的に適切な溶媒（水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシ化またはプロポキシ化ジグリコール、環状ポリオール、およびこれらの溶媒の任意の混合物など）に対して可溶性である。

「生理学的に適切な」は、毒性、不耐性、不安定性、アレルギー反応、および他の副作用の危険性がなく、ヒトの肌または肌付属物と接触させて使用するのに適した溶媒または媒体を意味する。

ついで、希釈されたペプチドを、滅菌濾過により滅菌する。

この希釈工程後、ペプチドを、化粧料用ベクター（リポソームまたは化粧料分野で使用される任意の他のマイクロカプセルなど）に封入または含有させるか、あるいは粉末有機ポリマーまたは鉱物キャリア（タルクおよびベントナイトなど）に吸着させるか、より一般的には、任意の生理学的に適切なベクターに溶解させるか、これに結合させることができる。

第二に、本発明は、生理学的に適切な媒体中に、一般式（Ｉ）のペプチドを、肌の細胞外基質タンパク質合成を活性化する作用剤として含有する化粧料組成物に関する。

本発明の有利な実施形態によれば、作用剤は、最終組成物の全重量に対して、０．０００５〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの濃度で組成物中に存在する。

この濃度範囲は、所望の分子作用、すなわち、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、およびヒアルロン酸の発現を活性化させるのに必要な作用剤の量を表す。

好ましくは、本発明による組成物は、肌にとって生理学的に適切な媒体を含む、局所使用に適した形状をしている。

「局所使用」は、本発明による作用剤、またはそれを含有する組成物を、肌表面に塗布または塗り広げることを示す。

本発明の組成物は、具体的には、水溶液、水／アルコール溶液、または油性溶液；水中油または油中水乳濁液あるいは多重乳濁液、水性または無水ゲル、コロイドの形状をとることができる。本発明の組成物はまたは、肌、粘膜、唇、および／または肌付属物への使用に適したクリーム、懸濁液、または粉末の形状をとることができる。本発明の組成物は、流動性が高くても低くてもよく、クリーム、ローション、乳液、セラム、ポマード、クリーム、ペースト、またはフォームの外観を有することができる。本発明の組成物はまた、棒状などの固形でもよいし、エーロゾルの形で肌に使用してもよい。本発明の組成物は、肌用の手入れ用品および／または化粧用品として使用することができる。

本発明の組成物は全て、さらに、想定される用途の分野で通常用いられる任意の添加物、ならびに組成物を配合するのに必要なアジュバント、例えば共溶媒（エタノール、グリセロール、ベンジルアルコール、湿潤剤、など）、増粘剤、希釈剤、乳化剤、抗酸化剤、着色剤、日焼け止め剤、顔料、増量剤、保存料、香料、異臭吸着剤、精油、微量元素、必須脂肪酸、界面活性剤、膜形成重合体、フィルター化合物もしくは鉱物、水和剤、および温泉水などを含有する。例えば、天然型水溶性重合体として、多糖類、ポリペプチド、メチルセルロースもしくはヒドロキシプロピルセルロース型のセルロース誘導体など、また合成重合体として、ポロキサマー、カルボマー、シロキサン、ＰＶＡまたはＰＶＰ、および具体的にはＩＳＰ社が販売する重合体を挙げることができる。

いずれにしろ、当業者は必ず、こうしたアジュバントの種類および割合を、本発明による組成物に求められる有利な性質をそがないように選択するだろう。こうしたアジュバントは、例えば、組成物の全重量の０．０１〜２０％の濃度で存在させることができる。本発明の組成物が乳濁液の場合、油相は組成物の全重量の５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％を占める。組成物に使用される乳化剤および共乳化剤は、想定される分野で従来から用いられているものから選択されるだろう。例えば、乳化剤および共乳化剤は、組成物の全重量に対して、０．３〜３０重量％の割合で用いることができる。

当然ながら、本発明の作用剤は、単独で用いることも他の作用剤と併用することもできる。

有利なことに、本発明に従って使用可能な組成物は、さらに、肌の加齢サインを防ぎ改善する分野での、本発明による作用剤の作用を増強することを意図した少なくとも１種の他の作用剤、または想定される組成物の性質の範囲を拡張することを可能にする別の作用剤を含有する。

制限ではなく例として、以下のクラスの成分を挙げることができる：再生剤、抗加齢剤、抗シワ剤、鎮静剤、抗フリーラジカル剤、抗糖化剤、水和剤、抗細菌剤、抗真菌剤、角質溶解剤、筋肉弛緩剤、角質除去剤、引き締め剤、真皮の巨大分子の合成またはエネルギー代謝または微小循環または爪成長または髪成長の刺激剤、表皮の分化または色素沈着の調節剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、ならびに日焼け止めおよび太陽光フィルター。

本発明の特定の実施形態において、本発明による組成物は、本発明によるペプチドの他に、以下も含有できる、
・少なくとも１種のシトクロムｃ活性化化合物、および／または
・少なくとも１種の水和化化合物（アクアポリン活性化化合物など）および／または
・少なくとも１種のサーチュイン活性化化合物、および／または
・少なくとも１種の細胞接着増加化合物、および／または
・基質タンパク質（コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカンなど）の産生を増加させる少なくとも１種の化合物、および／または
・少なくとも１種のプロテアソーム活性調節化合物、および／または
・少なくとも１種の概日リズム調節化合物、および／または
・少なくとも１種のＨＳＰタンパク質調節化合物、および／または
・少なくとも１種の細胞エネルギー増加化合物、および／または
・少なくとも１種の肌色素沈着調節化合物、および／または
・少なくとも１種の補酵素Ｑ１０活性化化合物、および／または
・バリア機能を改善する少なくとも１種の化合物（トランスグルタミナーゼまたはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性化化合物など）、および／または
・少なくとも１種のミトコンドリア保護化合物。

上記化合物は、天然物由来（植物のペプチド加水分解物など）のものでも、合成由来（ペプチドなど）のものでもよい。

組成物において本発明による作用剤と併用されるその他の作用剤は、その機能によらず、多様な化学構造を有することができる。制限ではなく例として、ペプチド、ビタミンＣおよびその誘導体、ビタミンＢ群、ＤＨＥＡ（ジヒドロエピアンドロステロン）、植物ステロール、サリチル酸およびその誘導体、レチノイド、フラボノイド、糖アミン、アゾール、金属塩、植物由来のペプチド抽出物、および重合体を挙げることができる。

第三に、本発明は、肌細胞による細胞外基質タンパク質合成を増加させるための、一般式（Ｉ）のペプチドを作用剤として含有する化粧料組成物の使用に関する。

より詳細には、本発明によるペプチドを用いて、ヒトの肌の線維芽細胞によるコラーゲンＩおよびＩＩＩならびにフィブロネクチンの合成を増加させる。

本発明のこの特定の実施形態によれば、一般式（Ｉ）のペプチドを用いて、真皮密度、ひいては肌の張りを向上させることで、顔の輪郭のたるみ、真皮のしぼみ、肌が薄くなること、アトニー、細かいスジ、深いシワ、および皮膚萎縮を遅らせるか減少させる。

第四に、本発明は、線維芽細胞およびケラチン生成細胞の両方でのヒアルロン酸発現を増加させるための、一般式（Ｉ）のペプチドを作用剤として含有する化粧料組成物の使用に関する。

本発明のこの特定の実施形態によれば、一般式（Ｉ）のペプチドを用いて、肌の全ての層の能力を増加させることで、保水力を高め、加齢による肌の乾燥を遅らせるか減少させる。

第五に、本発明は、肌細胞の老化の現れを遅らせるか老化を減少させるための、一般式（Ｉ）のペプチドを作用剤として含有する化粧料組成物の使用に関する。

「真皮細胞の老化の現れを遅らせるか老化を減少させる」という語句は、本発明のこの有利な態様によれば、本発明のペプチドが、ＦＯＸＯ３ａ遺伝子の消衰により老化が誘導されたヒト線維芽細胞における老化マーカーの発現を減少させることを意味する。

第六に、本発明は、本発明による組成物を、手当すべき肌に局所的に使用することを特徴とする、皮膚の加齢サインおよび光加齢サインを遅らせるおよび／または手当することを意図した美容目的の手当法に関する。

「皮膚の加齢サイン」は、加齢による肌および肌付属物の外見における全ての変化、例えば、肌が薄くなること、たるみ、保水力の低下およびアトニー、深いシワおよび細かいスジ、張りおよび調子が失われること、皮膚萎縮、および紫外線を浴びることによる肌のあらゆる内部破壊などを示す。

本発明の他の利点および特徴は、以下の実施例に照らしてより明らかとなるだろう。実施例は例示のために提供されるもので、制限することを目的としない。

ヒト線維芽細胞での、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、プロコラーゲン、フィブロネクチン、およびヒアルロン酸の発現における、配列番号４および５のペプチドの活性化効果の実証

この研究の目的は、ヒト線維芽細胞での以下の細胞外基質タンパク質の発現における、配列番号４および５のペプチドならびに配列番号４のペプチドの影響を明らかにすることである：コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、プロコラーゲン、フィブロネクチン、およびヒアルロン酸。このため、真皮由来の正常ヒト線維芽細胞培養物に特異的標識を導入した。

特異的標識化プロトコル：配列番号５のペプチドまたは配列番号４のペプチドを最終濃度０．５％、１％、および／または３％（４０ｍｇ／ｋｇの原液を基準として）で用いて、培養液に入ったヒト線維芽細胞を２４時間、４８時間、および／または７２時間処理する。次いで、細胞を洗浄し、冷メタノールを用いて４℃で４分間（コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、およびヒアルロン酸標識化の場合）、またはホルムアルデヒドを３．７％で用いて室温で１０分間（プロコラーゲンおよびフィブロネクチン標識化の場合）固定する。ウサギコラーゲンＩ特異的ポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｒｅｆ：６００−４０１−１０３−０．５）、ウサギコラーゲンＩＩＩ特異的ポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｒｅｆ：６００−４０１−１０５−０．５）、ラットプロコラーゲン特異的ポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｒｅｆ：ＭＡＢ１９１２）、ウサギフィブロネクチン特異的ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ：Ｆ−３６４８）、次いで、蛍光色素が結合した抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｅｆ：Ａ２１２０６）または蛍光色素が結合した抗ラット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１００６）の存在下で、細胞を培養する。ヒアルロン酸の標識化については、細胞を、特異的ビオチン化タンパク質（Ｃｏｇｅｒ、Ｒｅｆ：４００７６３１Ａ）、次いで、蛍光色素が結合したストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｅｆ：Ｓ３２３５４）の存在下で培養する。次いで、細胞を落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００顕微鏡）で検査する。

結果：試験したどの条件下でも、配列番号５のペプチドまたは配列番号４のペプチドで処理された線維芽細胞では、対照条件下よりも強い蛍光が観測される。

結論：配列番号５のペプチドおよび配列番号４のペプチドは、ヒト皮膚線維芽細胞によるコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、プロコラーゲン、フィブロネクチン、およびヒアルロン酸の発現を刺激する。

肌細胞診での、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、プロコラーゲン、およびヒアルロン酸の発現における、配列番号５のペプチドの活性化効果の実証

この研究の目的は、ヒトの肌での以下の細胞外基質タンパク質の発現における、配列番号５のペプチドの影響を明らかにすることである：コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、プロコラーゲン、フィブロネクチン、およびヒアルロン酸。このため、生体外で培養したヒト肌試料に特異的標識を導入した。

プロトコル：ヒト肌試料を培養液の気液界面に置く。配列番号５のペプチドを、最終濃度０．５％、１％、または３％（４０ｍｇ／ｋｇの原液を用いて）で、試料に局所的に塗布し、次いで、試料を３７℃で２４時間、４８時間、および／または７２時間培養する。

次いで、肌試料を、ホルムアルデヒドで固定してパラフィンに封入するか、ＯＣＴを用いて固定および封入を行い、次いで−２０℃で凍結させる。次いで、厚さ４μｍの切片を切り出す（凍結時は６μｍ）。

コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩの標識化は、パラフィン封入試料で、特定部位のマスキングを外してから行う。ウサギコラーゲンＩ特異的ポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｒｅｆ：６００−４０１−１０３−０．５）、ウサギコラーゲンＩＩＩ特異的ポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｒｅｆ：６００−４０１−１０５−０．５）、次いで蛍光色素が結合した抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｅｆ：Ａ２１２０６）を用いて免疫標識化を行う。ヒアルロン酸の標識化については、特異的ビオチン化タンパク質（Ｃｏｇｅｒ、Ｒｅｆ：４００７６３１Ａ）の存在下、次いで蛍光色素が結合したストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｅｆ：Ｓ３２３５４）の存在下で細胞を培養する。

プロコラーゲンの免疫標識化は、ＯＣＴ封入試料で、冷アセトンで１０分間固定してから行う。ラットプロコラーゲン特異的ポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｒｅｆ：ＭＡＢ１９１２）、次いで蛍光マーカーが結合した抗ラット二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１００６）を用いて、免疫標識化を行う。

次いで、細胞を落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００顕微鏡）で検査する。

結果：顕微鏡観察では、配列番号５のペプチドで処理した肌試料の真皮で、より強い蛍光が観察される。ヒアルロン酸の免疫標識化の場合、配列番号５のペプチドで処理した肌試料の表皮でも、強くなった蛍光が観測される。

結論：配列番号５のペプチドは、真皮でのコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、プロコラーゲンの発現を刺激し、ヒト真皮および表皮でのヒアルロン酸発現を刺激する。

コラーゲンＩメッセンジャーＲＮＡの発現における、配列番号５のペプチドの活性化効果の、リアルタイムＰＣＲによる実証

この研究の目的は、ヒト線維芽細胞でのコラーゲンＩメッセンジャーＲＮＡの発現における、配列番号５のペプチドの影響を明らかにすることである。このため、コラーゲンＩの発現をリアルタイムＰＣＲで研究した。

プロトコル：培養液に入ったヒト線維芽細胞を、配列番号５のペプチドを用いて、最終濃度０．５％および１％（４０ｍｇ／ｋｇの原液を用いて）で、２４時間、４８時間、および７２時間処理する。抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、次いで、ＲＮアーゼ阻害剤を含む専用キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写させる。リアルタイムＰＣＲは、コラーゲンＩ特異的ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１）および内在対照として用いられる１８Ｓ特異的ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｈｓ００１６４００４＿ｍ１）を用いて、サーモサイクラーで行う。コラーゲンＩメッセンジャーＲＮＡの発現の相対的定量化は、Ｃｔ比較法（Ｃｔ、すなわち閾値到達サイクル数は、増幅曲線と閾値の交点である）により行う。

結果／結論：配列番号５のペプチドは、ヒト線維芽細胞でのコラーゲンＩメッセンジャーＲＮＡの発現を刺激する。

配列番号５のペプチドの存在下における老化マーカーＰ１６の発現についての研究

この研究の目的は、年齢とともに肌での発現が増加するタンパク質Ｐ１６の発現における、配列番号５のペプチドの影響を明らかにすることである。Ｐ１６は、細胞周期の負の調節に関与するタンパク質であり、細胞老化の信頼できるマーカーとして報告されている（Ｂｒｏｏｋｅｓ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９８， ２００４）。

プロトコル：培養液に入ったヒト線維芽細胞を、配列番号５のペプチドを用いて、最終濃度０．５％、および１％（４０ｍｇ／ｋｇの原液を用いて）で、４８時間処理する。細胞は、Ｓｈａｎｄｏｎ Ｃｙｔｏｂｌｏｃｋ（登録商標）細胞調製システムキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｅｆ：７４０１１５０）に従って調製する。

次いで、細胞をホルムアルデヒドで固定してパラフィンに封入する。次いで、厚さ４μｍの切片を切り出す。パラフィン封入細胞でのｐ１６標識化は、特定部位のマスキングを外してから行う。免疫標識化は、マウスｐ１６特異的ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、Ｒｅｆ：ｓｃ−８１１５７）、次いで蛍光色素が結合した抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｅｆ：Ａ２１２０２）を用いて行う。次いで、細胞を落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００顕微鏡）で検査する。

結果：顕微鏡観察では、配列番号５のペプチドで処理した細胞の核蛍光が弱まって観察される。

結論：配列番号５のペプチドは、ヒト線維芽細胞でのｐ１６老化マーカーの発現を減少させる。

ペプチド配列番号５のペプチドによる、線維芽細胞で誘導される細胞老化の逆転の実証

この研究の目的は、ＦＯＸＯ３ａ遺伝子の消衰により老化が誘導された老化線維芽細胞への、配列番号５のペプチドの影響を明らかにすることである。こうした細胞は、その老化段階との関連で、ｂｅｔａ−ガラクトシダーゼを過剰発現する。

ＦＯＸＯ３ａは、細胞寿命に関与するＦｏｒｋｈｅａｄ転写因子である。肌においては、ＦＯＸＯ３ａの負の調節が、正常なヒト線維芽細胞の老化を加速させる（Ｈｙｕｎ Ｋｙｏｕｎｇ Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． ｏｆ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．， ２００５， ｖｏｌ．６０Ａ ｎ１，ｐａｇｅｓ４−９）。この性質を利用して、特異的干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によりＦＯＸＯ３ａ発現を遮断することで、ヒト線維芽細胞の老化を誘導した。

プロトコル：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｅｆ：１３７７８−０７５）遺伝子導入法を利用して、ＦＯＸＯ３ａの特異的ｓｉＲＮＡを用いて、最終濃度２５ｎＭで処理することにより、培養液に入ったヒト線維芽細胞を老化させる。未処理の対照も作製する。これらの線維芽細胞を、平行して、最終濃度１％（４０ｍｇ／ｋｇの原液を用いて）の配列番号５のペプチドにより４８時間処理する。

細胞をすすぎ、固定緩衝液（０．２％グルタルアルデヒド、２％ホルムアルデヒド）で固定する。次いで、細胞を、Ｘ−Ｇａ１溶液（濃度１ｍｇ／ｍＬ、４０ｍＭのクエン酸／ホスフェート（ｐＨ６）、５ｍＭのＫ３ＦｅＣＮ６、５ｍＭのＫ４ＦｅＣＮ６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む）を用いて、無ＣＯ２条件下、３７℃で２４時間培養する。次いで、細胞を白色光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００顕微鏡）で検査する。

結果：特定のβ−ガラクトシダーゼ活性を有する老化細胞は青色に染色される。ＦＯＸＯ３ａの特異的ｓｉＲＮＡで処理した細胞は、老化の誘導に関連したβ−ガラクトシダーゼ活性の向上を示し、青色に染色された細胞数の増加に関与する。ＦＯＸＯ３ａの特異的ｓｉＲＮＡおよび１％の配列番号５のペプチドで処理した細胞は、β−ガラクトシダーゼ活性の低下を示し、青色に染色された細胞数の減少に関与する。

結論：配列番号５のペプチドは、ヒト線維芽細胞で誘導される老化表現形質を減少させることができる。

組成物の調製

１−抗加齢フェイシャルクリーム：

Ａ相を調製し６５〜７０℃で溶融させる。Ｃ相を６５〜７０℃に加熱する。相Ｂを相Ａに加え、直ちにＡをＣに加え乳化させる。４５℃前後で、Ｄ相を加えてカルボマーを中和する。次いで、３０℃前後で、軽く撹拌しながらＥ相を加え、２５℃になるまで冷却する。次いで、必要があれば相Ｆを加える。

Claims (15)

1. 下記一般式（Ｉ）：
   Ｒ_１−（ＡＡ）_ｎ−Ｘ_１−Ｐｒｏ−Ｘ_２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_３−Ｘ_４−（ＡＡ）_ｐ−Ｒ_２
   式中
   Ｘ_１は、グリシンまたはアラニンまたはバリンを表し、
   Ｘ_２は、グリシンまたはアラニンまたはバリンを表し、
   Ｘ_３は、アスパラギンまたはリシンまたはグルタミンを表すか、またはアミノ酸がないことを表し、
   Ｘ_４は、フェニルアラニンまたはチロシンを表すか、またはアミノ酸がないことを表し、
   ＡＡは、任意のアミノ酸を表し、ならびにｎおよびｐは０〜２の整数であり、
   Ｒ_１は、該Ｎ末端アミノ酸の該第一級アミン官能基−ＮＨ２を表し、式中、該２個の水素原子のうち１個は、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０アルキル鎖、またはアシル基（Ｒ−ＣＯ−）（式中、該Ｒ基は、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０アルキル鎖、好ましくはメチルであり）、またはベンゾイル型、トシル型、もしくはベンジルオキシカルボニル型の芳香族基のいずれかで置換可能であり、
   Ｒ_２は、該Ｃ末端アミノ酸の該カルボキシル官能基の該ヒドロキシル基−ＯＨを表し、式中、該水素原子は、Ｃ_１〜Ｃ_３０アルキル鎖で置換可能であるか、またはＮＨ_２、ＮＨＹ、もしくはＮＹＹ基（式中、Ｙは、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル鎖を表し）を表す、
   のペプチドであって、
   一般式（Ｉ）の該配列は、５〜１１個のアミノ酸残基からなり、塩の形を取ることができ、以下の配列：
   （配列番号１）：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ_２
   （配列番号２）：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
   （配列番号３）：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ_２
   （配列番号４）：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
   （配列番号５）：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ_２
   （配列番号６）：Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２
   のうちの１つに相当することを特徴とするペプチド。
2. 前記配列番号４の配列または前記配列番号５の配列に相当することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
3. １種以上の生理学的に適切な溶媒、例えば、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシ化またはプロポキシ化ジグリコール、環状ポリオール、またはこれらの溶媒の任意の混合物に対して可溶性であることを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド。
4. 生理学的に適切な媒体中に、請求項１から３のうち１項に定義されるとおりのペプチドのうち少なくとも１種を肌の細胞外基質タンパク質合成を活性化させる作用剤として含有する、化粧料用組成物。
5. 前記ペプチドは、前記組成物の最終的な全重量に対して、０．０００５〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの濃度で該組成物中に存在することを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
6. 局所使用を意図したものであることを特徴とする、請求項４または５に記載の組成物。
7. さらに少なくとも１種の他の作用剤を含有することを特徴とする、請求項４から６のいずれか１項に記載の組成物。
8. 前記他の作用剤は、再生剤、抗加齢剤、抗シワ剤、鎮静剤、抗フリーラジカル剤、抗糖化剤、水和剤、抗細菌剤、抗真菌剤、角質溶解剤、筋肉弛緩剤、角質除去剤、引き締め剤、真皮の巨大分子の合成またはエネルギー代謝または微小循環または爪成長または髪成長の刺激剤、表皮の分化または色素沈着の調節剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、日焼け止め、および太陽光フィルターから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
9. 肌細胞による細胞外基質タンパク質合成を増加させるための、請求項１から３のうち１項に定義されるとおりのペプチドを作用剤として生理学的に適切な媒体に含有する組成物の美容目的の使用。
10. 線維芽細胞によるＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、およびフィブロネクチンの合成を増加させるための、請求項１から３のうち１項に定義されるとおりのペプチドを作用剤として生理学的に適切な媒体に含有する組成物の美容目的の使用。
11. 真皮密度および肌の弾力を向上させるための、ならびに顔の造作のたるみ、真皮のしぼみ、肌が薄くなること、アトニー、細かいスジ、および深いシワの発生を遅らせるか減少させるための、請求項４から８のいずれか１項に記載の組成物の美容目的の使用。
12. 肌線維芽細胞およびケラチン生成細胞によるヒアルロン酸発現を増加させるための、請求項１から３のうち１項に定義されるとおりのペプチドを作用剤として生理学的に適切な媒体に含有する組成物の美容目的の使用。
13. 肌の全ての層の能力を増加させることで、保水力を高め、加齢による肌の乾燥を遅らせるか減少させるための、請求項４から８のいずれか１項に記載の組成物の美容目的の使用。
14. 肌細胞の老化の現れを遅らせるか肌細胞の老化を減少させるための、請求項１から３のうち１項に定義されるとおりのペプチドを作用剤として生理学的に適切な媒体に含有する組成物の美容目的の使用。
15. 請求項４から８のうち１項に定義されるとおりの組成物を、手当すべき肌に局所的に使用することを特徴とする、皮膚の加齢サインおよび光加齢サインを遅らせるおよび／または手当することを意図した美容目的の手当法。