KR20110122548A - 항염증 활성을 갖는 합성 펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항염증 활성을 갖는 합성 펩티드에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 항염증 활성을 나타내는, PTD(Protein Transduction Domain) 펩티드 및 서열번호 1 내지 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 이루어진 합성 펩티드에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 본 발명의 합성 펩티드는 IREM-1의 특정 아미노산 서열 및 PTD를 포함하고 대식세포 또는 암세포에서의 염증 활성을 저해할 수 있다. 따라서 본 발명의 합성 펩티드의 이러한 염증 활성 저해작용을 이용하여 염증관련 질환의 치료에 사용할 수 있다.

Description

항염증 활성을 갖는 합성 펩티드 {Synthetic peptides having anti-inflammation activities}

본 발명은 항염증 활성을 갖는 합성 펩티드에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 항염증 활성을 나타내는, PTD(Protein Transduction Domain) 펩티드 및 서열번호 1 내지 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 이루어진 합성 펩티드에 관한 것이다.

염증은 외상, 감염, 허혈(post-ischemic), 독성 또는 자가면역 반응에 의한 손상에 반응하는, 조직에서 발생하는 염증관련 요소와 세포들 사이의 매우 복잡한 현상이다 (Nathan, C., Nature 420:846-852(2002)). 보통 이 과정은 감염후의 회복 및 치료를 유도하지만, 만약 이런 과정들이 과도하게 일어나거나 적절한 조절을 받지 못한다면 염증반응으로 인한 조직 손상 및 만성염증성 질환을 야기할 수도 있다.

1. 동맥경화에서의 염증반응과 그 치료방법

동맥경화는 최근 들어 염증성 질환의 하나로 인식되면서 동맥경화의 염증반응이 어떻게 질병의 초기발병과 진행, 그리고 급성심근경색증(myocardial infarction)으로의 악화에 관여하는지에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 대식세포(거품세포, foam cell)는 동맥경화의 가장 초기 현상인 지방선(fatty streak)의 형성에서부터 동맥경화반으로의 진행 및 동맥경화반의 파열로 인한 혈전 형성에 이르기까지 전반적으로 관여하는 세포이다. 동맥경화에서의 염증반응에 대한 연구는 아직 시작단계이며 여기에 관여하는 염증활성화 물질 및 면역제어 물질을 될 수 있는 한 많이 밝혀 이들의 작용기전 및 상호작용을 확인하여야만 효과적인 치료방법의 개발이 가능하다. 동맥경화, 특히 관상동맥질환에 의한 협심증(angina) 및 급성 심근경색증(acute myocardial infarction)은 지난 20-30년 동안 우리나라의 사회, 경제적인 급격한 발전과 한국인의 생활패턴이 서구화 등의 요인으로 인해 현저히 증가하여 왔으며, 현재는 순환기질환 중 고혈압 다음으로 가장 많이 보는 질환으로, 국민보건상 가장 중요한 질환중의 하나로 자리잡고 있다. 따라서 동맥경화의 병인기전 및 치료에 관한 연구의 중요성이 점차 증대되고 있다. 최근의 연구결과들은 동맥경화가 염증성 면역질환의 일종임을 밝혔으나 이에 관한 연구는 아직 시작단계이다. 동맥경화의 발생기전은 최근 혈관생물학 및 분자생물학의 발전, 인체부검 소견 등을 통해서 이해가 많이 넓혀져 가고 있다. 초기 병변은 혈중의 단핵구세포가 혈관내피 세포 내로 유입되고, 대식세포로 변하여, 지질을 탐식하여, 거품세포(foam cell)가 되어 나타나는 지방선(fatty streak)으로부터 시작된다. 이 병변이 진행되면 동맥경화반이 생기고, 점차 지질을 더 탐식하여 융기되고, 지질 및 괴사된 세포를 죽상으로 포함하는 지방핵(lipid core)과 이를 싸고 있는 캡(cap)의 상태로 되고, 동맥경화상태가 활성화되고 더욱 진행되면 핵(core)의 압력이 증가되고 캡이 약해져서 종국에는 캡의 약한 부분이 파열되고, 핵 내부에 있는 죽상의 혈전형성력이 강한 물질이 혈관 내로 분출되어 혈관 내에 혈전을 형성하여 혈관을 막게 된다. 이러한 현상이 심장혈관에 일어날 경우 심근에 괴사를 일으키며 경우에 따라서는 급성 심근경색증(acute myocardial infarction)으로 발전하여 사망하게 된다. 동맥경화반의 형성에는 대식세포와 T-세포가 전반적으로 관여하고 있으며 이들에 의해 발현되는 세포접합분자, 염증성 사이토카인, MMP(matrix metalloproteinase), TF(tissue factor), 키모카인(chemokine) 등이 염증반응을 증가시켜 동맥경화반의 형성 및 파열에 직접적인 영향을 미친다 (Ross, N Engl J Med 1999;340:115-26; Libby, Nature. 2002;420(6917):868-74). 이러한 결과들을 바탕으로 동맥경화의 치료를 위해 면역 세포들의 침윤을 억제하거나 활성을 조절함으로서 초기 병변의 진행을 막거나 후기 병변의 파괴를 막는 연구가 진행 중이다.

기존 혈관질환 치료제와 문제점: 심혈관의 동맥경화증으로 발생하는 관상동맥질환(coronary artery disease)의 경우 HMG-CoA 환원효소를 저해하는 스타틴(statin) 약물이 가장 일반적으로 쓰인다. 스타틴은 콜레스테롤 저하, 지질대사 개선효과를 위해 쓰여졌으나 부수적으로 항염증작용이 있어 관상동맥질환을 치료하고 급성관상증후군(acute coronary syndrome)의 발생을 저하시키는데 기여함이 밝혀졌다. 그러나 항염증작용을 중심으로 한 동맥경화 치료용 약제는 아직 없다. 이외에도 동맥경화치료를 위해 고혈압의 치료에도 쓰이는 혈전용해제, 항응고제인 헤파린(heparin), 혈소판저해제인 아스피린, 베타-차단제, 칼슘길항제, 질산염(nitrate), ACE 저해제 등이 사용되고 있다. 그러나, 혈전용해제는 출혈을 일으킬 수 있으며 뇌수술력이 있거나 고혈압 및 당뇨병 환자에게는 사용이 제한되는 등 부작용 및 합병증으로 인하여 심근경색 환자의 30-40% 밖에 사용될 수 없다. 또한 수술요법으로는 경피적 관동맥 성형술 (PCI: percutaneous coronary intervention)과 관동맥 우회술(CABG) 등이 있으나 풍성확장치료나, 기존의 약물이 코팅안된 스텐트 삽입 후 약 17-40%의 환자에서 6개월 이내에 재협착이 발생되며, 항암제 등의 약물이 코팅된 스텐트 삽입 후에는 재협착율은 10% 미만으로 낮게 보고되고 있으나, 스텐트 위로 혈관내피세포 및 신생내피가 잘 덮이지 않아서, 메탈이 혈관에 그대로 노출된 상태로 남아있을 수 있고, 6개월이 지난 후에도 갑자기 혈전이 발생하면서 환자가 급사하는 등의 문제가 발생할 수 있어서 아직 완전하다고 할 수 없다. 관동맥 우회술을 사용하는 경우에도 동맥경화가 지속되어 혈관이 좁아져 증상이 재발하는 경우가 많다. 이러한 문제들을 해결하기 위하여 수없이 많은 연구가 지난 10년간 진행되었으며, 혈액내의 줄기세포인 혈관내피 전구세포(endothelial progenitor cells, EPCs)를 잡을 수 있도록 CD34Ab을 코팅한 스텐트가 개발되어 인체에 사용되고 있으며, 스텐트 위로 혈관내피세포가 빨리 덮이고, 혈전이 있는 혈관에 삽입되어도 혈전이 잘 발생하지 않는 장점이 있다. 동맥경화 및 이로 인한 심장질환의 새로운 치료법의 개발은 여전히 현대의학의 가장 큰 과제 중의 하나이다.

2. 류마티스 관절염에서의 염증반응과 그 치료 방법

류마티스 관절염은 비교적 흔한 만성 염증성 질환으로 항류마티스제제, 면역억제제 및 부신피질호르몬 등을 이용한 치료에도 불구하고 관절파괴가 진행될 수 있어 관절변형으로 인한 장애를 유발한다 (Cunnane, G., K. M., Arch Immunol Ther Exp 46:1-7(1998)). 기존 치료제의 한계를 극복하기 위해서는 류마티스 관절염의 병인기전을 좀 더 정확히 이해하고 새로운 치료법 개발이 필요하다. 최근에는 류마티스 관절염의 병인기전에 중요한 것으로 밝혀진 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 인터루킨-1β(IL-1β)을 차단하는 생물학적 제재를 개발하여 치료에 이용한 결과 매우 효과적인 것으로 보고되었다 (Cutolo, M., S., Ann Rheum Dis 65:728-35 (2006)). 하지만 이런 생물학적 제재에 반응하지 않는 환자들이 아직 많고 반응이 불완전한 경우도 많아 좀 더 효과적이거나 보완작용이 있는 약제의 개발이 필요하다. 류마티스 관절염은 자가면역 질환으로서 유전적 요인과 외부 인자에 의해 자가반응성 T 세포 및 류마티스 인자와 같은 자가항체가 발생하고 이들이 활막조직에 염증을 유발하면서 시작된다. 자가반응성 T세포는 활막조직의 염증에 있어 핵심적인 역할을 담당하며 활막조직에 있는 대식세포, 활막세포, 수지상세포 및 B세포 등과 상호작용을 통하여 염증과정을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Sweeney, S. E., Int J Biochem Cell Biol 36:372-8(2004)). 이들 세포간의 상호작용에는 여러 가지 세포표면 분자들이나 분비단백들이 관여하는데 그 중에서 특히 TNF 리간드 슈퍼패밀리와 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 TRANCE/RANK, CD40/CD40L, GITR/GITRL, 및 LTβ/LTβR의 상호작용은 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다 (Cuzzocrea, S., E., Faseb J 19:1253-65(2005); Eissner, G., W., Cytokine Growth Factor Rev 15:353-66(2004)). T세포에 의해 활성화된 활막세포 및 대식세포는 여러 가지 염증 촉진 사이토카인과 세포외 기질을 분해하는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)들을 분비하여 활막염 및 골-연골파괴를 일으키는데 이 과정은 만성 관절염의 의한 관절 파괴기전으로 매우 중요하다 (Yanni, G., A., Ann Rheum Dis 53:39-44(1994)).

현재 관절염의 치료는 근본적인 치료보다는 증상을 약화시키는데 주력하고 있다. 이러한 치료의 대부분은 발병에 관련된 면역현상과 감염에 대항하는 면역현상을 구분하지 못하는 비특이적(nonspecific) 면역제어로 류마티스 관절염의 치료와 함께 면역기능의 저하라는 부작용(side-effect)을 동반할 가능성이 크다고 할 수 있다. 현재 국내 및 외국에서 사용되어지고 있거나 개발 중에 있는 류마티스 관절염의 치료 방법으로는 1) 비스테로이드성 항염증약물(NSAIDs) 또는 스테로이드를 이용한 소염제, 2) 항 류마티스 약물(antirheumatic drugs or disease modifying antirheumatic drugs: DMARD), 3) 생물학적 매체(Biologic agents): 사이토카인의 하나인 TNF-α의 기능을 저해하는 항체 또는 가용성 수용체 (ENBREL 등), 4) 유전자 치료: IL-1 및 TNF-α의 길항제(antagonist) 또는 IL-10, TGF-β1과 같은 항염증성 사이토카인을 발현하는 유전자 치료, 및 5) 경구용 타입 II 콜라켄 면역치료 등을 들 수 있다 (Sweeney, S. E., Int J Biochem Cell Biol 36:372-8(2004), Sweeney, S. E., Curr Opin Rheumatol 16:231-7(2004)). 그러나 이들 방법은 류마티스 관절염의 증상을 완화하는데 머물 뿐 근본적인 치료가 되지 않기 때문에 류마티스 관절염의 근원적인 치료를 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.

3. 암의 발생에서 염증반응과 그 치료 방법

암과 염증작용의 상관관계는 최근 4-5년 사이에 많은 증거들이 제시되면서 암의 발생에 있어 염증작용이 중요한 역할을 하는 것으로 확인되고 있다. 1) 염증반응과 암의 상관관계는 역학적인 연구와 임상연구에 의해 밝혀졌는데, 예를 들어 염증성 장염이 있는 사람의 경우 대장암의 발병 확률이 10배로 증가하며 장염환자에 대한 항염증치료가 대장암의 발병률을 감소시켰다 (Itzkowitz and Yio, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2004;287:G7-17; Seril et al., Carcinogenesis. 2003;24:353-62; Moody et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1996 Dec;8(12):1179-83; Eaden et al., Aliment Pharmacol Ther. 2000;14:145-53). 감염에 의한 염증작용과 이로 인한 암 발생과의 연관성이 밝혀진 경우도 많은데 위에서 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)에 의한 감염이 위암의 원인이 될 수 있음은 잘 알려져 있다 (Macarthur et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004;286:G515-20). 또한 HVB 및 HVC의 감염에 의해 발생하는 만성 간염이 간암의 대표적인 원인이 된다 (Block et al., Oncogene. 2003;22:5093-107). 감염에 의한 염증뿐만 아니라 만성 염증의 경우도 암 발생에 영향을 미치는데, 예를 들면 만성 천식과 폐암, 사르코이도시스(sarcoidosis)와 폐/피부/간암, 자궁염증과 자궁암, 만성 전립선염과 전립선암, 석면에 대한 염증반응과 중배엽 상피종(中胚葉上皮腫/mesothelioma), 실리카 및 흡연에 의한 염증반응과 기관지암 등이 서로 연관되어 있다 (Vesterinen et al., Int J Epidemiol. 1993;22:976-82; Askling et al., Am J Respir Crit Care Med. 1999;160:1668-72; Persky, Recent Results Cancer Res. 1977;(60):97-109; Risch and Howe, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1995;4:447-51; Palapattu et al., Carcinogenesis. 2005;26:1170-81). 이들 뿐만 아니라 만성 염증과 암 발생의 상관관계를 증명할 수 있는 예는 점점 늘어나고 있다. 암과 염증작용의 상관관계는 이상 언급한 염증작용에 의한 암 발생 빈도의 증가 뿐만 아니라 그 역으로도 작용하는데 암세포 자체도 국소적/전신적 만성염증반응을 조장하여 암의 증식과 전이에 필요한 환경을 조성한다. 그 예로 암세포는 경우에 따라 다양한 사이토카인 및 키모카인, MMPs, COX-2, iNOS와 같은 염증매개인자들을 발현하고 VEGF와 같은 혈관신생촉진인자를 발현하는데 이들은 암의 발생 및 전이과정에 전반적으로 관여한다 (Greten et al., Cell. 2004;118(3):285-96; Rakoff-Nahoum et al., Cell. 2004; 118(2):229-41). 국내에서는 암과 염증반응을 연관지으려는 시도는 많이 행해지고 있지 않다. 암의 발병과 연관된 염증반응매개인자들 중 사이클로옥시게나제(Cyclooxygenase, COX-2)가 대부분 국내 연구자들의 연구의 대상이었으며 각종 암 조직 및 암세포에서 COX-2의 발현이 보고되었다 (Joo et al., Int J Gastrointest Cancer. 2002;31(1-3):147-54; Chang et al., Korean J Gastroenterol. 2004;43(5):291-8. Seo et al., Ann N Y Acad Sci. 2002;973:477-80). 현재, 암과 염증의 연관성에 기초하여 그 연결고리를 끊음으로써 암의 발생과 진행을 저해하는 치료제에 대한 연구가 진행중에 있다.

4. IREM-1과 ITIM

IREM-1(immune receptor expressed on myeloid cells-1)은 CD300F, IgSF13, CMRF-35A5 등의 다른 이름으로도 불리는 세포막 단백질로서 대식세포 및 수지상세포 등의 골수계 세포(myeloid lineage)에 주로 발현된다. 항체로 IREM-1을 자극하면 세포의 활성화에 저해작용을 하는 것으로 알려져 있으며 이러한 저해작용은 IREM-1의 세포내 부위에 존재하는 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif)을 통해 전달된다는 것이 알려져 있다 (Alvarez-Errico et al., Eur J Imm 2004;34(12):3690-701; Alvarez-Errico et al., J Immunol 2007; 178(2):808-16).

이에, 본 발명자들은 IREM-1의 세포내 부위에 존재하는 ITIM의 일부를 포함하는 합성 펩티드가 대식세포 및 암세포에 의한 염증반응을 억제할 수 있음을 확인하였고, 이 효과를 이용하여 암, 동맥경화, 류마티스 관절염과 같은 질환에 적용가능한 항염증제로서 사용될 수 있음을 증명하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 PTD 펩티드 및 서열번호 1 내지 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 이루어진 합성 펩티드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 합성 펩티드를 유효성분으로 하는 항염증 활성을 갖는 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 항염증 활성을 나타내는, PTD(Protein Transduction Domain) 펩티드 및 서열번호 1 내지 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 이루어진 합성 펩티드를 제공한다.

본 발명에서, 상기 PTD(Protein Transduction Domain, 단백질 운반 도메인)는 숙주세포내로 생리활성분자를 침투시키는데 이용되는 저분자량의 펩티드를 일컫는 것으로서, 세포막 수용체의 도움 없이 세포막을 투과할 수 있게 해준다. 현재 가장 많은 연구가 진행된 PTD는 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)의 전사 인자인 Tat 단백질이다. 이 단백질이 세포막을 통과하는데 있어서 86개의 아미노산으로 구성된 완전한 형태일 때 보다 양 전하를 갖는 아미노산들이 집중적으로 분포되어 있는 47번째부터 57번째 아미노산(YGRKKRRQRRR)의 일부분으로 구성된 형태일 때 더욱 효과적임이 밝혀졌다 (Fawell S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668(1994)).

본 발명의 합성 펩티드에서, 상기 PTD는 5 내지 30개의 아미노산으로 구성되고 아미노산 중 적어도 30％ 이상이 아르기닌(arginine)을 포함하는 PTD를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열과 70％ 이상 상동인 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 더욱 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열이다.

본 발명에서는 상기 PTD로 TAT(GRKKRRQRRR: 서열번호 6)를 사용하였으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 초파리 유래 Antp 펩티드, VP22 펩티드(Gene Therapy, 8:1, Blackbirch Press, 2001), mph-1-btm (미국특허 2005/0147971) 등과 같은 PTD를 사용할 수도 있다. 또한 전기적으로 양성인 아미노산들을 나열한 인위적인 펩티드도 사용될 수 있다 (Laus R. et al. Nature Biotechnol. 18, 1269-1272(2000)).

본 발명의 합성 펩티드에서, 상기 PTD와 결합된 각 펩티드들은 IREM-1 단백질의 세포내 부위에서 유래된 10개의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 서열번호 1 내지 5에 기재된 아미노산 서열은 IREM-1의 세포내 부위에 존재하는 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif)의 일부로서, 이들 합성 펩티드들을 처리할 경우 대식세포 및 암세포의 활성화를 억제하여 항염증 활성을 나타내는 것이 본 발명자에 의해 처음으로 밝혀졌다.

본 발명의 합성 펩티드에서, 상기 항염증 활성은 대식세포 또는 암세포에서의 염증 활성을 저해하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실험결과 1에서, 본 발명의 합성 펩티드들이 LPS에 의한 대식세포의 염증반응을 저해할 수 있는지 확인한 결과, 대식세포의 염증반응을 일으킬 때 발현되는 IL-8의 발현을 저해하는 것으로 나타났으며 (도 1 및 2 참조), 실험결과 2에서 본 발명의 합성 펩티드들이 TNF-α에 의한 대식세포의 염증반응을 저해할 수 있는지 확인한 결과, 대식세포의 염증반응을 일으킬 때 발현되는 MMP-9의 발현을 저해하는 것으로 나타났다 (도 3 참조). 또한 대식세포를 자극하는 것으로 알려진 BAFF(B세포활성화인자)로 자극하였을 때 발현되는 IL-8의 발현 또한 저해할 수 있었다 (도 4).

뿐만 아니라, 본 발명의 합성 펩티드들이 암세포에서 일어나는 염증반응 또한 저해할 수 있는지를 확인한 결과, 섬유육종암 세포인 HT1080 세포에서 TNF에 의한 IL-8의 발현 및 MMP-9의 발현을 저해하는 것으로 나타났으며 (도 5 참조), HT1080 세포의 침투능을 약화시키는 것으로 나타났다 (도 6 참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 합성 펩티드를 유효성분으로 하는 항염증 활성을 갖는 약학 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 실험결과 1 내지 3에서는 본 발명의 합성 펩티드들이 암세포뿐만 아니라 대식세포와 같은 여러 면역세포에서 이들의 염증 활성화를 저해할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 합성 펩티드들은 항염증 활성을 갖는 약학 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 암, 동맥경화, 류마티스 관절염으로 구성된 군에서 선택된 질환에 사용되는 항염증제인 것을 특징으로 한다.

최근 연구에서, 동맥경화는 최근 들어 염증성 질환의 하나로 인식되고 있고 대식세포는 동맥경화의 가장 초기 현상인 지방선(fatty streak)의 형성에서부터 동맥경화반으로의 진행 및 동맥경화반의 파열로 인한 혈전 형성에 이르기까지 전반적으로 관여하는 세포로 알려져 있다. 이러한 동맥경화반의 형성에는 대식세포와 T-세포가 전반적으로 관여하고 있으며 이들에 의해 발현되는 세포접합분자, 염증성 사이토카인, MMP(matrix metalloproteinase), TF(tissue factor), 키모카인(chemokine) 등이 염증반응을 증가시켜 동맥경화반의 형성 및 파열에 직접적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Ross, N Engl J Med 1999;340:115-26; Libby, Nature. 2002;420(6917):868-74). 따라서 동맥경화는 염증반응을 억제함으로써 병의 진행을 막을 수 있고 치료에 도움이 될 수 있다.

다른 연구에서, 류마티스 관절염은 비교적 흔한 만성 염증성 질환으로 알려져 있으며 자가면역 질환으로서 유전적 요인과 외부 인자에 의해 자가반응성 T 세포 및 류마티스 인자와 같은 자가항체가 발생하고 이들이 활막조직에 염증을 유발하면서 시작된다. T세포에 의해 활성화된 대식세포는 여러 가지 염증 촉진 사이토카인과 세포외 기질을 분해하는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)들을 분비하여 활막염 및 골-연골파괴를 일으키는 것으로 알려져 있다 (Yanni, G., A., Ann Rheum Dis 53:39-44(1994)). 따라서 류마티스 관절염은 대식세포의 염증반응을 억제함으로써 병의 진행을 막을 수 있고 치료에 도움이 될 수 있다.

또 다른 연구에서, 암과 염증작용의 상관관계가 연구되어 있다. 예를 들어 염증성 장염이 있는 사람의 경우 대장암의 발병 확률이 10배로 증가하며 장염환자에 대한 항염증치료가 대장암의 발병률을 감소시켰다 (Itzkowitz and Yio, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2004;287:G7-17). 또한 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)에 의한 감염이 위암의 원인이 될 수 있고 (Macarthur et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004;286:G515-20), HVB 및 HVC의 감염에 의해 발생하는 만성 간염이 간암의 대표적인 원인이 될 수 있다 (Block et al., Oncogene. 2003;22:5093-107). 따라서 암환자의 경우 항염증 치료가 병행될 경우 암의 치료에 도움이 될 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 합성 펩티드들을 암, 동맥경화, 류마티스 관절염 등과 같은 만성염증질환 환자에게 투여하면 염증반응을 저해하여 이들 질병의 진행을 막을 수 있는 치료제로 이용이 가능하다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 본 발명의 합성 펩티드는 IREM-1의 특정 아미노산 서열 및 PTD를 포함하고 대식세포 또는 암세포에서의 염증 활성을 저해할 수 있다. 따라서 본 발명의 합성 펩티드의 이러한 염증 활성 저해작용을 이용하여 염증관련 질환의 치료에 사용할 수 있다.

도 1은 IREM-1의 5가지 ITIM 도메인을 모방하는 TAT-YADL, TAT-YVTM, TAT-YASL, TAT-YCNM, TAT-YSTI를 인간 대식세포인 THP-1 세포에 5 μM의 농도로 30분 동안 전처리 한 후 LPS(1 μg/ml)를 처리하여 활성화하였다. 24시간 배양 후에 세포배양액을 분리하여 IL-8의 농도를 ELISA를 이용하여 측정한 결과이다.
도 2는 TAT, TAT-YADL, TAT-FADL을 THP-1 세포에 5 μM의 농도로 30분 동안 전처리 후 LPS(1 μg/ml)를 처리하여 활성화하였다. 24시간 배양 후에 세포배양액을 분리하여 IL-8의 농도를 ELISA를 이용하여 측정한 결과이다.
도 3은 TAT, TAT-YADL, TAT-FADL을 THP-1 세포에 5 μM의 농도로 30분 동안 전처리 후 TNF-α(10 ng/ml)를 처리하여 활성화하였다. 24시간 배양 후에 세포배양액을 분리하여 MMP-9의 활성을 젤라틴 자이모그램으로 측정하고 IL-8의 농도를 ELISA를 이용하여 측정한 결과이다.
도 4는 TAT-YADL, TAT-YVTM, TAT-YASL, TAT-YCNM, TAT-YSTI, TAT을 THP-1 세포에 5 μM의 농도로 30분 동안 전처리 후 항-BAFF 항체(1 μg/ml)를 처리하여 활성화하였다. 24시간 배양 후에 세포배양액을 분리하여 IL-8의 농도를 ELISA를 이용하여 측정한 결과이다.
도 5는 TAT-YADL, TAT-YVTM, TAT-YASL, TAT-YCNM, TAT-YSTI, TAT를 인간 섬유육종세포인 HT10180 세포에 5 μM의 농도로 30분 동안 전처리 후 TNF-α(10 ng/ml)를 처리하여 활성화하였다. 24시간 배양 후에 세포배양액을 분리하여 IL-8의 농도 및 MMP-9의 활성을 측정한 결과이다.
도 6은 TAT-YADL, TAT-YVTM, TAT-YASL, TAT-YCNM, TAT-YSTI, TAT를 인간 섬유육종세포인 HT10180 세포에 5 μM의 농도로 30분 동안 전처리 후 Matrigel이 코팅된 Transwell의 윗 칸에 넣고 24시간 배양한 후 transwell을 통과한 세포의 양을 측정하기 위해 transwell 막을 hematoxylin으로 염색하여 임의로 다섯 부위를 정하여 사진(x100)을 찍고 사진 안에 세포들의 숫자를 카운트한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 합성 펩티드의 제조

하기 표 1에 기재된 합성 펩티드들은 펩트론㈜ (대전, 한국)에 의뢰하여 5 mg 단위로 제작하였으며 합성 후 HPLC를 통하여 99% 이상의 순도를 유지하도록 정제하여 사용하였다.

[표 1]. 실험에 사용된 합성 펩티드의 아미노산 서열

표 1에서, TAT을 제외한 각 합성 펩티드들은 IREM-1 단백질의 세포내 부위에서 유래된 10개의 아미노산 서열을 가지고 있다. TAT 펩티드는 AIDS 바이러스의 HIV 단백질의 48번에서 57번 아미노산에 해당하는 부위를 합성한 것이며 합성 펩티드가 세포내로 원활하게 이동하도록 하기 위해 포함시킨 것이다.

실시예 2. 세포 배양 및 합성 펩티드 처리

사람의 대식세포주인 THP-1과 암세포주인 HT1080 세포는 ATCC(American type culture collection, Rockville, 미국)사를 통해 구입하였다. HT1080 세포는 액상의 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM))에 10% 우태혈청(FBS), 10 ml/L 페니실린-스트렙토마이신 (10,000 unit/ml penicillin and 10,000 mg/ml streptomycin), 1.5 g/L 탄산수소나트륨, 그리고 4.5 g/L 글루코오스를 첨가하여 조성된 배지에 배양하며, 5% 이산화탄소와 섭씨 37도로 조정된 이산화탄소 세포배양기 내에서 습한 상태를 유지하며 배양하였다. THP-1 세포는 액상의 배지(RPMI 1640 배지)에 10% 우태혈청(FBS), 1.0 mM 소듐 파이루베이트, 10 mM N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N'-[4-butanesulonic acid] (HEPES), 4.5 g/L 글루코오스, 1.5 g/L 탄산수소나트륨, 10 ml/L 페니실린-스트렙토마이신 (10,000 unit/ml penicillin and 10,000 mg/ml streptomycin) 그리고 0.05 mM 베타-머르캅토에탄올을 첨가하여 조성된 배지에 배양하며, 5% 이산화탄소와 섭씨 37도로 조정된 이산화탄소 세포배양기 내에서 습한 상태를 유지하며 배양하였다. 이들 세포는 2~4일에 한 번씩 계대배양 하였다. 합성 펩티드를 처리하기 이전에 THP-1 및 HT1080 세포를 0.1% 혈청을 포함하는 배양액에 넣고 24시간 배양한 후 합성 펩티드를 1~10 mM 농도가 되게 처리한 후 30분이 경과한 후 자극을 가하였다. 이때 자극은 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 박테리아의 내독소, TNF와 같은 사이토카인 혹은 TNFSF(tumor necrosis factor superfamily)/TNFRSF(TNF receoptor superfamily)에 대한 항체 등을 배양액에 넣어주어 세포를 자극하도록 하였다.

실시예 3. ELISA

세포에서 세포배양액으로 분비된 사이토카인(cytokine)의 농도를 측정하기 위해 ELISA를 이용하였다. 우선 농도를 이미 알고 있는 사이토카인 용액을 연속 희석하여 10~1000 ng/ml의 표준용액(standard)을 만들고 영점 표준용액(zero standard) 및 샘플을 ELISA 측정에 이용하였다. 먼저, 50 μl의 표준용액과 샘플들을 각 웰에 넣고 20-25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 세 번 씻어준 후 50 μl의 바이오틴 결합 항체 시약(biotinylated antibody reageant)을 각 웰에 넣어준 후 1시간 동안 같은 온도에서 반응하게 하였다. 다시 플레이트를 세 번 씻어준 후 100 μl의 희석된 스트렙토아비딘-HRP (streptavidin-horseradish peroxidase)와 동온도에서 30분간 반응시킨 후 씻어주었다. TMB(5,5’-Tetramethylbenzidine) 기질 용액을 첨가한 후 효소반응이 일어날 수 있도록 30분간 암실에서 반응시킨 후 스톱(stop) 용액을 넣어 반응을 종결하였다. 최종적으로 이 플레이트를 450-550nm에서 ELISA 측정기로 읽어 그 농도를 계산하였다.

실시예 4. 겔라틴 자이모그램(Gelatin zymogram)을 이용한 기질 메탈로프로테나제 (MMP-9) 측정

기질 메탈로프로테나제의 활성을 측정하기 위하여 겔라틴을 첨가한 겔 전기영동을 실시하였다. 겔은 0.1% 겔라틴을 함유한 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔을 사용하였다. 4% SDS, 20% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀, 0.125 M 트리스-염소의 혼합물과 상층액을 혼합하여 10% 아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 겔은 소듐 도데실 설페이트를 제거하기 위하여 2.5% 트리톤 엑스-100으로 40분간 세척하고 트리톤 엑스-100을 제거하기 위하여 증류수로 40분간 세척하였다. 세척이 끝나면 효소와 기질을 반응시키기 위하여 섭씨 37도에서 반응 완충 용액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.02% NaN₃)에 겔을 담가 14시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 겔은 0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 알250으로 염색시키고, 30% 메탄올, 10% 아세트산, 60% 증류수의 혼합물로 탈색시켰다. 탈색시킨 겔은 건조시킨 뒤 밀도계를 이용하여 결과를 확인하였다.

실시예 5. 세포 침투력(invasion activity)의 측정

세포의 이동성을 알아보기 위해서 마트리겔 침투 분석(Matrigel Invasion assay)을 사용하였다. 트랜스웰 플레이트의 위쪽에 100 μg/cm₂의 마트리겔을 넣어 37℃에서 15분간 두었다가 실온에서 10분간 두어 굳혔다. 트랜스웰 플레이트의 위에는 2×10⁵의 HT1080 세포와 1 ng/ml TNF-α를 넣고 아래에는 세포배양액을 넣어주어 24시간 배양하면서 세포의 침투가 일어나게 하였다. 24시간 이후 트랜스웰 위쪽은 면봉으로 긁어내고 아래쪽에 이동하여 붙어있는 세포들을 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색한 후 각 샘플에 해당하는 부위에서 다섯 장의 사진(100배)을 임의로 찍어 세포를 세었다.

실험결과 1. 대식세포에서 LPS에 의한 세포활성화에 대한 합성 펩티드의 효과

대식세포는 염증반응을 일으킬 때 IL-8을 포함한 사이토카인들과 MMP-9와 같은 세포외 기질분해효소를 발현하게 된다. 이들 사이토카인들은 대식세포 자신뿐만 아니라 여러 염증세포들에 작용하여 염증매개자들의 발현을 증폭하게 되어 염증반응의 확산에 기여한다. 세포외기질 단백질들은 조직의 형태를 유지하고 각 조직의 세포들이 필요한 위치에 고정되어 있도록 환경을 조성해 주는 역할을 하게 되는데, 염증반응이 일어나면 MMP(matrix matelloporteinase)라 불리는 세포외기질분해효소들의 발현이 증가하여 조직재생에 관여하게 된다. 그러나 이들 세포외기질분해효소들이 과도하게 작용하면 흉터가 과도하게 커지거나 조직에서 세포들의 위치를 고정하지 못하게 되어 문제가 발생하게 된다.

상기 표 1의 합성 펩티드들이 대식세포의 염증반응을 저해할 수 있는지 확인하였다. 우선, 인간대식 세포인 THP-1 세포에 표 1의 합성 펩티드들을 각각 5 μM 씩 30분 동안 전처리하고 1 μg/ml의 LPS로 자극하였을 때 발현되는 IL-8의 양을 측정하여 보았다. 그 결과 ITIM에 해당하는 부위를 가지는 모든 합성 펩티드들은 IL-8의 발현을 저해하였으나 대조군으로 쓰인 TAT 펩티드는 저해능이 없었다 (도 1). 이러한 저해능이 ITIM 부위를 통한 것인지 확인하기 위해 TAT-YADL 펩티드를 ITIM의 핵심부위에 해당하는 타이로신 아미노산을 페닐알라닌으로 치환한 TAT-FADL 펩티드를 제작하여 TAT-YADL과 그 저해능을 비교해 보았다. 그 결과 TAT-FADL은 LPS에 의한 IL-8의 발현을 저해하지 못하였다 (도 2).

실험결과 2. 대식세포에서 TNF에 대한 세포활성화에 대한 합성 펩티드의 효과

LPS이외의 다른 자극에 의한 대식세포의 활성화를 저해하는지 확인하기 위해 THP-1 세포를 TNF-α로 자극하고 MMP-9과 IL-8의 발현을 확인하여 보았다. 도 2의 결과에서 볼 수 있듯이 TAT-YADL 펩티드는 TNF에 의한 대식세포의 활성화를 저해할 수 있었다 (도 3). TNF 뿐만 아니라 대식세포를 자극하는 것으로 알려진 BAFF를 자극하였을 때 발현되는 IL-8의 발현 또한 ITIM유래의 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩티드들이 저해할 수 있었다 (도 4).

실험결과 3. 암세포에서의 염증반응 및 이동에 대한 합성 펩티드의 효과

암의 발생은 암세포의 무제한적인 증식에 기인한다. 암이 발생할 때 그 주변에서 염증작용의 증가가 필요함은 잘 알려져 있으며 이때 발생하는 염증반응은 암 조직에 침윤한 대식세포뿐만 아니라 암세포 자체에 의해서도 일어난다. 다른 말로 암세포도 사이토카인과 같은 염증매개자들을 활발히 발현하여 염증반응이 더 활발히 일어나도록 한다. 암세포는 염증반응과 함께 세포외기질분해효소들을 발현하는 경우가 많은데 이때 발현되는 세포외기질분해효소들은 암세포가 조직 안에 머물도록 하는 세포외기질을 분해하여 암세포가 주변조직 및 혈액으로 퍼지도록 하는 결과를 낳아 암의 전이에 핵심적인 역할을 하게 된다.

IREM-1의 ITIM을 포함하는 합성 펩티드들이 암세포에서 일어나는 염증반응 또한 저해할 수 있는지를 확인하기 위해 섬유육종암(fibrosarcoma) 세포주인 HT1080 세포를 이용하여 실험을 수행하였다. TAT-YADL 펩티드를 5 μM 농도로 30분 동안 전처리한 경우 TNF에 의한 IL-8의 발현 및 MMP-9의 발현을 저해함을 알 수 있었으며, TAT-FADL 및 TAT 펩티드들은 저해능이 없었다 (도 5). 또한 마트리겔 침투 실험을 수행한 결과, TAT-YADL 펩티드의 전처리는 HT1080 세포의 침투능을 약화시킨다는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).

이러한 결과들을 종합하여 볼 때, IREM-1 단백질 세포내부부위에 존재하는 ITIM을 이용한 합성 펩티드들은 암세포뿐만 아니라 대식세포와 같은 여러 면역세포에서 이들의 염증활성화를 저해할 수 있음을 알 수 있다. 이러한 결과를 바탕으로 생각하면, IREM-1 단백질 세포내부부위에 존재하는 ITIM을 이용한 합성 펩티드들을 암, 동맥경화, 류마티스 관절염 등과 같은 만성염증질환 환자에게 투여하면 염증반응을 저해하여 이들 질병의 진행을 막을 수 있는 치료제로 이용이 가능하다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Synthetic peptides having anti-inflammation activities <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Asp Leu Cys Tyr Ala 1 5 10 15 Asp Leu Thr Leu 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Val Glu Val Glu Tyr Val 1 5 10 15 Thr Met Ala Ser 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Glu Asp Ile Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gln Glu Pro Thr Tyr Cys 1 5 10 15 Asn Met Gly His 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Glu Pro Thr Glu Tyr Ser 1 5 10 15 Thr Ile Ser Arg 20 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide TAT <400> 6 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10

Claims (5)

1. PTD(Protein Transduction Domain) 펩티드 및 서열번호 1 내지 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 이루어진 합성 펩티드.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 PTD는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 항염증 활성은 대식세포 또는 암세포에서의 염증 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
   
4. 제 1항 및 제 3항 중 어느 한 항에 따른 합성 펩티드를 유효성분으로 하는 항염증 약학 조성물.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 약학 조성물은 암, 동맥경화, 류마티스 관절염으로 구성된 군에서 선택된 질환에 사용되는 항염증제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   

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