BRPI1006861B1 - métodos para isolar bactérias - Google Patents

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Stéphanie Texier
Jean-Paul Leonetti
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Deinove
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Abstract

MÉTODOS PARA ISOLAR BACTÉRIAS. A presente invenção se refere a composições e métodos para identificar novas bactérias e metabolites derivados das mesmas. Mais especificamente, a invenção descreve um novo método para isolar bactérias produtoras de metabolites de interesse a partir de amostras ambientais. Particularmente, a invenção rebela um método para selecionar bactérias produtoras de antibiótico raras. A invenção pode ser usada a partir de qualquer amostra e permite o isolamento de bactérias que têm, por exemplo, interesse farmacêutico ou agroquímico.

Description

DESCRIÇÃO
A presente invenção se refere a composições e métodos para identificar novas bactérias e metabólitos derivados das mesmas. Mais especificamente, a invenção descreve um novo método para isolar bactérias produtoras de metabólitos de interesse a partir de amostras ambientais. Particularmente, a invenção revela um método para selecionar novas bactérias que produzem antibiótico. A invenção pode ser usada a partir de qualquer amostra e permite o isolamento de bactérias que têm, por exemplo, interesse farmacêutico ou agroquímico.
ANTECEDENTES
Desde tempos imemoriais, a raça humana tem considerado a fonte de organismos circundantes para propósitos terapêuticos, e a maior parte dos antibióticos comerciais ainda tem uma origem natural. Durante os últimos 10 anos, em um esforço para racionalizar e acelerar os processos de descoberta de antibacterianos, a indústria mudou de produtos naturais e uma estratégia de descoberta orientada à molécula a moléculas sintéticas e uma estratégia orientada ao alvo.
Após anos de uniformização do processo de P&D de antibióticos, com uma alta taxa de atrito sem precedentes, é necessário retornar aos recursos naturais. De fato, a seleção de bibliotecas de produtos naturais usualmente rende uma porcentagem mais alta de antibióticos hits que essa de bibliotecas químicas, e conseqüentemente proporciona uma probabilidade mais alta para obter um agente terapêutico. A primeira razão provavelmente está no papel ecológico dos antibióticos, que foram otimizados ao longo do curso da evolução, para defender plantas, animais e micro-organismos contra outros organismos vivos. Além disso, produtos naturais são geralmente tanto lipofílicos como compostos combinatórios, mas têm uma diversidade estrutural incomparável e dispersão no espaço químico. Isto ajuda a encontrar descobertas hidrofílicas raras que podem ser otimizadas para aplicações in vivo.
Geralmente é assumido que de 20 a 30 por cento das bactérias isoladas de fontes ambientais tais como solo ou água são produtoras de antibióticos (Berdy, 2005). Por razões óbvias, as bactérias mais adequadas e representadas são as mais freqüentemente isoladas. Isto explica porque muitos antibióticos produzidos por Bacillus ou Pseudomonas já forma documentados, e porque é cada vez mais difícil encontrar novas entidades moleculares produzidas por estes gêneros. Outras famílias de bactérias sub-representadas, mais adaptadas à produção de antibiótico, devido a um genoma maior, podem ser facilmente isoladas com técnicas adaptadas. Este é o caso de actinomicetos, de longe os melhores produtores de antibiótico (Berdy, 2005). Foram estudados extensivamente pela indústria farmacêutica entre 1950 e 1980, e é agora difícil identificar cepas que produzem moléculas nâo redundantes.
Na última década, foram realizados esforços para isolar bactérias raras a fim de encontrar novas entidades químicas de interesse farmacêutico. Myxobacteria, por exemplo, são conhecidas desde a década de 40, mas devido a dificuldades encontradas para isolar as mesmas, foram sub-representadas nas coleções. Graças a uma extensiva campanha de coleta levada a cabo por Reichenbach H e colaboradores, até o momento aproximadamente 80 compostos e 450 variantes estruturais diferentes produzidos por Myxobacteria foram caracterizados (Reichenbach, 2001). Muitos daqueles compostos eram novos. Entre os quais está o fármaco antineoplásico, epotilonas, atualmente sendo avaliada em ensaios clínicos.
É geralmente reconhecido, no entanto, que os microbiologistas são incapazes de cultivar a maioria dos microorganismos de solo (Schoenborn et al, 2005). O número de células que podem ser cultivadas em solo é com freqüência somente aproximadamente 1 % do número total de células presentes. A maioria destas bactérias são difíceis de detectar e isolar usando técnicas de isolamento padrão, porque são raras no ambiente, ou porque são menos adaptadas a condições ambientais que outras bactérias como Pseudomonas spp. ou Bacillus spp. e rapidamente crescem demais. Diversas técnicas de isolamento com o objetivo de aumentar a diversidade dos isolados foram publicadas. Por exemplo, a cultura de diluição líquida em série tem sido usada com sucesso para melhorar a cultivabilidade (Schoenborn et al, 2005) e para facilitar o isolamento de bactérias de diversos ambientes. Yang et al, 2008, também descreveram o uso de tratamento com microondas para isolar actinomicetos raros. O documento W002/059351 se refere a um método para enriquecer uma população microbiana de um ambiente natural usando, por exemplo, água de fonte termal.
No entanto, microorganismos ambientais ainda representam uma fonte rica e não explorada de novos compostos e atividades, e existe uma necessidade na técnica de métodos alternativos ou melhorados para identificar bactérias de interesse.
SUMÁRIO DA INVENCÁQ
O presente pedido de patente proporciona uma nova abordagem para identificar ou isolar bactérias a partir de amostras ambientais. Mais particularmente, a invenção revela um método rápido e eficiente de identificar ou isolar bactérias raras a partir de amostras ambientais usando um tratamento de danificação de DNA.
Um objeto da presente invenção, portanto, reside em um método para identificar ou isolar uma bactéria que produz metabólito (secundário), o método que compreende submeter uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas a um tratamento de danificação de DNA que destrói células e identificar ou isolar de dita amostra tratada uma bactéria que produz o metabólito (secundário). Em uma modalidade preferida, o tratamento é um tratamento de irradiação repetido.
Com respeito a isso, um objeto particular desta invenção é um método para identificar ou isolar uma bactéria que produz metabólitos, o método que compreende: a) proporcionar uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas; b) submeter a amostra a um tratamento de irradiação repetido; c) identificar ou isolar uma bactéria viva ou em crescimento de dita amostra tratada; e d) selecionar uma bactéria da etapa c) que produz o metabólito.
Em uma modalidade particular, o tratamento compreende um tratamento de UV seqüencial, por exemplo, uma repetição de pelo menos 2, preferivelmente 3 ou mais irradiações em intervalos essencialmente regulares.
Em uma modalidade particular, o tratamento compreende uma irradiação de UV repetida.
De acordo com outra modalidade particular, a invenção se refere a um método para identificar ou isolar uma bactéria que produz metabólitos, o método que compreende: a) proporcionar uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas; b) adicionar à amostra um antibiótico da família da bleomicina; c) identificar ou isolar uma bactéria viva ou em crescimento de dita amostra tratada; e d) selecionar uma bactéria da etapa c) que produz o metabólito.
O antibiótico da família da bleomicina preferido é bleocina.
O metabólito pode ser qualquer produto farmacêutico, tal como antibióticos, compostos bacteriostáticos, agentes antimetabólito, compostos quimioterápicos, agentes antifúngicos, compostos antivirais, compostos de atividade de citocina ou fatores de crescimento de células.
Outro objeto desta invenção é um método para identificar ou isolar uma bactéria que produz um antibiótico ou um composto bacteriostático, o método que compreende: a) proporcionar uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas; b) submeter a amostra a um tratamento de irradiação repetido, preferivelmente um tratamento de UV repetido c) identificar ou isolar bactérias vivas ou em crescimento de dita amostra tratada; e d) expor as bactérias identificadas ou isoladas da etapa c), ou um extrato das mesmas, a uma cepa bacteriana de referência e identificar ou isolar uma bactéria que exibe uma atividade antibiótica ou bacteriostática.
Em uma modalidade preferida, os métodos da presente invenção compreendem uma etapa adicional de isolar ou purificar o metabólito produzido pela dita bactéria.
Além disso, os métodos da invenção opcionalmente compreendem uma etapa adicional de modificar, geneticamente, biologicamente ou quimicamente, as bactérias identificadas ou isoladas ou seu DNA por qualquer processo técnico conhecido per se por um técnico no assunto, dita modificação tendo por objetivo melhorar, por exemplo, a viabilidade, crescimento ou função da dita bactérias, por exemplo, a fim de melhorar a atividade ou produção de antibiótico. Isto inclui, sem limitação, fusão celular, evolução acelerada, tecnologias de embaralhamento de DNA, inserção de ácido nucleico eucariota, procariota ou sintético (por exemplo, DNA) de outra cepa, ou qualquer tecnologia de engenharia genética. Dita etapa de modificação pode ser levada a cabo nas bactérias isoladas, ou em qualquer estágio anterior do processo, por exemplo, na amostra da etapa a), por exemplo.
Outro objeto desta invenção reside em uma bactéria do tipo selvagem ou modificada obtida por um método como descrito acima, ou um extrato da mesma.
Um objeto adicional desta invenção é um método de produção de um metabólito, particularmente um composto farmacêutico, o método que compreende (i) identificar ou isolar uma bactéria que produz o dito metabólito usando o método como definido acima e (ii) produzir o dito antibiótico.
Um objeto adicional desta invenção é um método de identificação, isolamento ou produção de um composto farmacêutico (tal como um antibiótico), usando uma cepa bacteriana de Deinococcus do tipo selvagem ou modificada.
Um objeto adicional desta invenção reside no uso de uma bactéria do tipo selvagem ou modificada Deinococcus para produzir um composto farmacêutico (tal como um antibiótico).
Um objeto adicional desta invenção é um antibiótico derivado de uma bactéria do tipo selvagem ou modificada Deinococcus.
Um objeto adicional desta invenção é um método de produção de uma célula hospedeira recombinante, o método que compreende identificar ou isolar uma bactéria de acordo com o método como definido acima e clonar um ou diversos genes (ou ácidos nucleicos sintéticos ou recombinantes correspondentes) da dita bactéria em outra célula hospedeira, deste modo produzindo uma célula hospedeira recombinante.
Os métodos da presente invenção podem ser usados com várias amostras, tais como amostras ambientais, e tem sido usado com sucesso para isolar novas bactérias que têm propriedades farmacêuticas e/ou agroquímicas vantajosas.
LEGENDA DAS FIGURAS
Figura 1: Capa bacteriana obtida após a) 1 exposição a UV: 0, 4 e 17 mJ/cm2 e b) exposições repetidas a tratamento de UV de 4 mJ/cm2. Colônias escuras são D. radiopugnans. As outras bactérias pertencem a comunidade do solo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O presente pedido de patente descreve um novo método para identificar ou isolar bactérias a partir de amostras. Mais particularmente, a invenção revela um método rápido e eficiente de identificar ou isolar bactérias raras a partir de amostras ambientais usando um tratamento de danificação de DNA que destrói células.
A resistência de bactérias a UV ou radiação tem sido estudada extensivamente f
para entender como bactérias podem sobreviver em tal ambiente agressivo (Makarova et al, 2001). Rainey et al, 2005, mostraram que Geodermatophilus spp. e Deinococcus spp. estão entre as bactérias mais resistentes à radiação coletadas dos solos do deserto de Sonoran. Outras bactérias foram também isoladas a saber, Deinococcus, Hymenobacter, Kineococcus, Kocuria, e Methylobacterium.
A presente invenção agora propõe o uso de um tratamento de dano de DNA que destrói células para isolar novas (sub-representadas) bactérias produtoras de metabólitos. A presente invenção de fato mostra que tal tratamento, que causaria normalmente substancial morte celular, inesperadamente permite a seleção de bactérias sub-representadas que têm notáveis propriedades de produção de metabólitos valiosos.
A invenção agora mostra pela primeira vez que, após um tratamento de dano de DNA que destrói células, é possível isolar um alto número de bactérias capazes de produzir metabólitos secundários valiosos.
Um objeto da presente invenção, portanto reside em um método para identificar ou isolar uma bactéria que produz metabólito, o método que compreende submeter uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas a um tratamento de dano de DNA que destrói células e identificar ou isolar de dita amostra tratada uma bactéria que produz o metabólito.
Em uma modalidade particular, o método compreende: a) proporcionar uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas; b) submeter a amostra a um tratamento de dano de DNA que destrói células; c) identificar ou isolar uma bactéria viva ou em crescimento de dita amostra tratada; e d) selecionar uma bactéria da etapa c) que produz metabólito.
O método pode ser implementado com várias amostras que compreendem bactérias não caracterizadas, particularmente com amostras que são ou derivam de uma amostra ambiental. Dentro do contexto desta invenção, amostras ambientais incluem qualquer amostra que contém (uma pluralidade de) (micro)organismos não caracterizados, particularmente microorganismos não cultivados (por exemplo, microorganismos que não foram intencionadamente cultivados e expandidos em forma isolada). A amostra pode ser .obtida ou derivada de ambientes naturais ou de ambientes artificiais ou especificamente criados.
Como indicado, a amostra pode ser qualquer amostra ambiental, tal como aquelas obtidas ou derivadas de solo, água, extrato vegetal, material biológico, sedimentos, turfas, efluentes industriais ou sítios, extratos minerais, areia, e similares. A amostra pode ser coletada de várias regiões ou condições, tais como, mas não limitadas a regiões tropicais, regiões vulcânicas, florestas, fazendas, áreas industriais, etc. A amostra usualmente contém várias espécies de microorganismos (não caracterizados, não cultivados), tais como microorganismos terrestres, microorganismos marinhos, microorganismos de água doce, microorganismos simbióticos, etc. As espécies de tais microorganismos ambientais incluem bactérias, algas, fungos, leveduras, mofos, vírus, etc. Os microorganismos podem incluir organismos extremófilos, tais como, por exemplo, termófilos. A amostra tipicamente compreende várias espécies de tais microorganismos (não cultivados), bem como várias quantidades das mesmas. Além disso, a amostra pode conter, além disso, microorganismos conhecidos e/ou cultiváveis (por exemplo, procarióticos ou eucarióticos).
Deve ser entendido que a presente invenção não é limitada a qualquer tipo específico de amostra ou microorganismo ambiental, mas pode ser implementada usando qualquer amostra que compreende microorganismos não cultivados.
Em uma modalidade preferida, a amostra é ou deriva de solo, água, fontes termais, ambiente marinho, lama, madeira, pedra, musgo, extrato vegetal, líquen, material biológico, sedimento, biofilme, efluentes industriais, gás, areia, óleo, água de esgoto, ou dejetos humanos ou animais.
Para uso na presente invenção, a amostra pode ser úmida, solúvel, seca, na forma de uma suspensão, pasta, etc. Além disso, antes da etapa b) do método, a amostra pode ser tratada para melhorar o processo, por exemplo, para enriquecer os microorganismos, por exemplo, tais como através de filtração, lavagens, concentração, diluição, condução, secagem, etc.
Em uma modalidade particular, a amostra é na forma de uma suspensão filtrada. Mais particularmente, a amostra pode ser esterilizada por filtração e /ou colocada em água estéril, antes da etapa de tratamento b).
A etapa b) do processo compreende submeter a amostra (isto é, microorganismos contidos na amostra) a um tratamento de dano de DNA que destrói células.
O tratamento de dano de DNA que destrói células designa um tratamento que causa a substancial morte celular na amostra, em oposição a meros tratamentos mutagênicos que introduzem modificações no DNA. Em particular, o tratamento de dano de DNA que destrói células é um tratamento que é suficiente para causar 90% da morte celular, ou mais, em uma cultura de bactérias E. coli. Ainda mais preferivelmente, o tratamento de dano de DNA que destrói células é um tratamento que é suficiente para reduzir em pelo menos 2 log a titulação bacteriana em uma cultura de E. co/i. Surpreendentemente, a invenção mostra que tal tratamento, que seria normalmente letal à maioria das populações de células, permite o eficiente e rápido isolamento de novos microorganismos de vários tipos de amostras, cujos microorganismos produzem metabólitos (secundários) valiosos. Este resultado é particularmente surpreendente uma vez que submeter microorganismos a tal tratamento de dano de DNA que destrói células seria esperado que prevenisse o isolamento de microorganismos vivos. Surpreendentemente, a invenção permite a seleção de microorganismos raros da amostra, especialmente microorganismos que têm a capacidade de remontar seu genoma ou resistir ao dano de DNA.
A invenção assim revela, pela primeira vez, o uso de um tratamento de dano de DNA que destrói células para selecionar, com uma alta eficácia, bactérias sub- representadas que produzem metabólitos (secundários) valiosos. Como ilustrado nos exemplos, a invenção permitiu o isolamento de novas cepas bacterianas de Deinococcus sp, Bacillus sp, Methylobacterium sp. Sphingobacterium sp. Cellulosimicrobium sp. Tepidimonas sp. Truepera sp., Porphyrobacter sp., Novosphingobium sp., Exiguobacterium sp., Nocardia sp Arthrobacter sp., Rhodococcus sp., Microbacterium sp., Kineococcus sp., e Williamsia sp.
O tratamento de dano de DNA pode compreender submeter a amostra a irradiação(ões) e/ou a um ou diversos agentes genotóxicos. O tratamento é conduzido sob condições e/ou durante um período de tempo suficiente para induzir a substancial morte celular nos microorganismos presentes na amostra.
Em uma modalidade preferida, o tratamento de dano de DNA compreende submeter a amostra a uma ou diversas irradiações. Um tratamento preferido compreende submeter a amostra (isto é, microorganismos na amostra) a um tratamento de irradiação repetido (por exemplo, sequencial).
A irradiação pode ser selecionada de irradiação de UV, gama e/ou raios-X, em separado ou em combinações, o mais preferível irradiação(ões) de UV. O tratamento de irradiação tipicamente compreende submeter os microorganismos a uma ou diversas irradiações sequenciais (por exemplo, desde 1 até 5), que pode ser da mesma natureza ou natureza diferente, preferivelmente da mesma natureza. Os tratamentos de irradiação repetido são tipicamente levados a cabo em um intervalo de entre 1 e 8 horas, preferivelmente 3 a 5 horas, e mais preferivelmente de aproximadamente 4 horas.
Um tratamento particularmente preferido compreende submeter a amostra a uma irradiação de UV que destrói células. A invenção de fato mostra que tal tratamento permite isolar com alta eficácia a partir de amostras ambientais (por exemplo, solo ou água), espécies de bactérias sub-representadas que produzem metabólitos (secundários) (tais como antibióticos). Tratamentos de UV que destroem células são tipicamente de entre 0,5 e 400 mJ/cm2, mais preferivelmente de entre 1 e 200 mJ/cm2, tipicamente entre 1 e 100 mJ/cm2, aplicados durante um período de tempo de aproximadamente 5" a 5'. Um tratamento preferido de UV é 4 mJ/cm2 durante 30 segundos.
Em uma modalidade específica, o tratamento de dano de DNA que destrói células compreende submeter a amostra a pelo menos 2, preferivelmente pelo menos 3 tratamentos de UV de entre 0,5 e 400 mJ/cm2 cada, preferivelmente de aproximadamente 4 mJ/cm2 cada, levado a cabo em um intervalo de entre 1 e 8 horas, preferivelmente 3 a 5 horas, e mais preferivelmente de aproximadamente 4 horas.
Em um método alternativo, o tratamento de dano de DNA que destrói células compreende contatar a amostra com um agente genotóxico, tal como um solvente, mitomicina, um antibiótico bleomicina, ou H2O2. Deve ser entendido que agentes genotóxicos podem também ser usados em combinação com irradiação. Em uma modalidade particular, o etapa de tratamento b) compreende adicionar à amostra uma quantidade eficaz de bleocina, um antibiótico da família da bleomicina. Como ilustrado nos exemplos, a adição de bleocina causa substancial morte celular bacteriana ao mesmo tempo em que permite que bactérias raras que produzem metabólito cresçam.
Durante a fase de tratamento, a amostra é preferivelmente colocada em um meio de cultura adequado tal como, sem limitação, PGY (10 g/L de Bacto-peptona, 5 g/L de extrato de leveduras, 20 g/L de glicose) ou LB (10 g/L de bacto-triptona, 2,5 g/L de extrato de leveduras, 10 g/L de cloreto de sódio). Deve ser entendido que outros meios de cultura adequados são conhecidos ao técnico no assunto (Buchanan et al, 1974, Difco, 1995)) ou podem ser preparados pelo técnico no assunto a partir de tais meios conhecidos.
A etapa de tratamento b) é tipicamente realizada em um meio de cultura sólido ou semi-sólido, tal como na presença de um gel (por exemplo, ágar). Um meio de tratamento mais preferido compreende um meio de cultura de ágar, tal como um meio de cultura de ágar mole. Em uma modalidade particular, um meio de ágar TGY é usado para crescer as bactérias. No entanto, diferentes meios sólidos que contêm uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais minerais podem ser usados também. Técnicas de diluição em série podem também ser usadas de acordo com Schoenborn et al 2004.
Na etapa c), bactérias vivas ou em crescimento são identificadas ou isoladas da amostra tratada. As bactérias vivas ou em crescimento podem ser identificadas por meios diferentes conhecidos per se na técnica. Em uma modalidade particular, as colônias que se formam nos meios de cultura são identificadas. As bactérias vivas ou em crescimento podem ser isoladas e colocadas em meio fresco para posterior cultura ou expansão.
Como mencionado acima, o método desta invenção preferivelmente compreende uma etapa d) de selecionar uma ou diversas bactérias, das bactérias vivas ou em crescimento identificadas ou isoladas, que produzem um particular metabólito. Com relação a isso, deve ser notado que as etapas c) e d) podem ser realizadas seqüencialmente, em qualquer ordem, ou simultaneamente. Por exemplo, as bactérias na amostra podem ser colocadas sob condições adequadas para selecionar a atividade desejada na etapa b) ou c), de modo que bactérias vivas ou em crescimento identificadas ou isoladas na etapa c) exibem a atividade desejada. Alternativamente, as bactérias identificadas ou isoladas na etapa c) podem ser colocadas sob condições adequadas para selecionar a atividade desejada na etapa d) somente, de modo que bactérias vivas ou em crescimento sejam primeiro identificadas ou isoladas na etapa c) e então selecionadas para a atividade desejada.
O metabólito pode ser qualquer composto que tem interesse farmacêutico e/ou agroquímico. Em uma modalidade particular, o metabólito é um composto farmacêutico (para uso em seres humanos ou medicina veterinária), preferivelmente selecionado de antibióticos, compostos bacteriostáticos, antimetabólito, compostos quimioterápicos, agentes anti-parasíticos, agentes antifúngicos, compostos antivirais, compostos de atividade de citocina ou fatores de crescimento de células.
O metabólito pode também ter utilidade, por exemplo, em cosméticos ou agricultura, tais como pigmentos, inseticidas, pesticidas, compostos que degradam produtos químicos, etc.
A seleção ou identificação ou bactérias que produzem o metabólito selecionado pode ser feita de acordo com técnicas conhecidas per se na área. Em uma modalidade particular, a etapa d) compreende expor as bactérias identificadas ou isoladas da etapa c), ou um extrato das mesmas, a uma ou diversas células indicadoras e selecionar uma bactéria que afeta a viabilidade, crescimento, metabolismo, mobilidade, expressão de RNA, expressão de proteína, secreção de proteína ou produção de vírus de pelo menos uma das ditas células indicadoras.
No caso de agentes antibiótico ou antiobioestáticos, as células indicadoras são tipicamente cepas bacterianas de referência e bactérias de teste que inibem o crescimento ou matam as ditas cepas de referência são selecionadas.
No caso de, por exemplo, compostos antivirais, as células indicadoras são tipicamente células produtoras de vírus e bactérias que afetam a produção de vírus ou viabilidade de células infectadas por vírus são selecionadas.
Com relação a isso, em uma modalidade particular, o método da invenção compreende ainda uma etapa de isolamento ou purificação do metabólito produzido pelas ditas bactérias.
Em uma modalidade preferida, a atividade selecionada é a produção de uma atividade antibiótica ou bacteriostática. A presente invenção mostra que bactérias produtoras de antibióticos podem ser isoladas com alta eficiência a partir de amostras ambientais tratadas de acordo com o presente método. Mais particularmente, como ilustrado nos exemplos, bactérias produtoras de antibióticos do gênero Bacillus, Methylobacteríum, Sphingobacterium, Cellulosimicrobium, Tepidimonas, Nocardia, Deinococcus, Truepera, Porphyrobacter sp., Novosphingobium sp., Exiguobacterium sp., Chromobacterium sp, Arthrobacter sp, Rhodococcus sp, Microbacterium sp, Kineococcus sp, ou Williamsia sp foram isoladas de diferentes amostras ambientais, incluindo água, solo, animal dejecção, madeira, etc.
A seleção de bactérias que produzem antibióticos pode ser realizada usando diferentes técnicas conhecidas per se na área (Singh, 2008, Janssen, 2002, Hamaki, 2005, Schoenborn L et al 2005). Em uma modalidade particular, as bactérias testadas (ou um extrato das mesmas) são colocadas em contato com uma ou diversas cepas bacterianas de referência, e a capacidade das bactérias de teste para inibir o crescimento de ou matar as cepas de referência é medida, como uma indicação da atividade antibiótica. Os exemplos de cepas de referência incluem, sem limitação, E. coli, Staphilococcus aureus, ou Candida tropicalis (Lorian, 1996).
Com relação a isso, a invenção se refere a um método para identificar ou isolar bactérias que produzem um agente antibiótico ou bacteriostático, o método que compreende: a) proporcionar uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas; b) submeter a amostra a um tratamento de dano de DNA que destrói células, preferivelmente um tratamento de irradiação repetido, por exemplo, um tratamento de UV; c) identificar ou isolar bactérias vivas ou em crescimento de dita amostra tratada; e d) expor as bactérias identificadas ou isoladas da etapa c), ou um extrato das mesmas, a uma cepa bacteriana de referência e identificar ou isolar bactérias que exibem uma atividade antibiótica ou bacteriostática.
O método pode compreender ainda uma etapa de isolamento ou purificação do antibiótico produzido pelas ditas bactérias.
Um objeto adicional desta invenção é um método para identificar ou isolar bactérias que produzem fator de crescimento de células ou atividade antimetabólica ou quimioterapêutica ou anti-fúngica ou de citocina, o método que compreende: a) proporcionar uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas; b) submeter a amostra a um tratamento de dano d,e DNA que destrói células, preferivelmente um tratamento de irradiação repetido, por exemplo, um tratamento de UV; c) identificar ou isolar bactérias vivas ou em crescimento de dita amostra tratada; e d) expor as bactérias identificadas ou isoladas da etapa c), ou um extrato das mesmas, a um ou diversos tipos de células eucarióticas de referência e identificar bactérias selecionadas que afetam a viabilidade, crescimento, metabolismo, mobilidade, expressão de RNA, expressão de proteína, ou secreção de proteína de alguns dos tipos de células eucarióticas.
O método pode compreender ainda uma etapa de isolamento ou purificação da atividade antimetabólica ou quimioterapêutica ou anti-fúngica ou de citocina ou fator de crescimento de células produzido pelas ditas bactérias.
Um objeto adicional da invenção reside em um método para identificar ou isolar bactérias que produzem composto antiviral, o método que compreende: a) proporcionar uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas; b) submeter a amostra a um tratamento de dano de DNA que destrói células, preferivelmente um tratamento de irradiação repetido, por exemplo, um tratamento de UV; c) identificar ou isolar bactérias vivas ou em crescimento de dita amostra tratada; e d) expor as bactérias identificadas ou isoladas da etapa c), ou um extrato das mesmas, a um ou diversos tipos de células produtoras de vírus para selecionar bactérias que afetam a produção de vírus ou viabilidade de células infectadas por vírus.
O método pode compreender ainda uma etapa de isolamento ou purificação do agente antiviral produzido pelas ditas bactérias.
Os métodos da presente invenção podem também incluir uma etapa de determinação do gênero/espécie das bactérias identificadas ou isoladas. Com respeito a isso, a invenção é particularmente adequada para identificar ou isolar bactérias Deinocoçcus que produzem um metabólito selecionado.
Consequentemente, em uma modalidade particular, a invenção se refere a um método para identificar ou isolar uma bactéria que exibe uma atividade selecionada (por exemplo, que produz um metabólito de interesse), o método que compreende: a) proporcionar uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas; b) submeter a amostra a um tratamento de dano de DNA que destrói células, preferivelmente um tratamento de irradiação repetido; c) identificar oü isolar bactérias Deinococcus vivas ou em crescimento de dita amostra tratada e d) selecionar bactérias Deinococcus da etapa c) que exibem a atividade selecionada.
As bactérias podem ser caracterizadas e classificadas, por exemplo, de acordo com Hirsch, 2004 e Kampfer, 2008. A caracterização fisiológica inclui, por exemplo a determinação do padrões de ácido graxo, quinonas respiratórias, lipídios polares e poliaminas, um perfil metabólico de diferentes fontes de carbono e/ou a determinação das sequências de gene de 16S rDNA.
Além disso, os métodos desta invenção podem compreender uma ou diversas etapas adicionais de selecionar bactérias que têm propriedades particulares. Mais particularmente, em uma modalidade preferida, o método compreende ainda uma ou diversas etapas de selecionar bactérias que são viáveis ou crescem sob condições de cultura selecionadas, tais como meios, temperatura, pH, salinidade, nutrientes, oxigenação ou fonte de carbono. Para este propósito, a amostra ou bactérias podem ser colocadas sob condições de seleção apropriadas durante qualquer uma das etapas b), c) ou d), ou durante uma etapa anterior ou subseqüente, e a propriedade resultante é selecionada durante qualquer destas etapas.
Em um aspecto particular da presente invenção, as bactérias são cultivadas sob condições de temperatura particulares a fim de identificar ou isolar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas em um intervalo de temperatura desde aproximadamente 4 até 70°C. Mais particularmente, as bactérias são mantidas na temperatura selecionada durante a etapa b), c) e/ou d); e/ou durante uma etapa adicional e), a fim de identificar ou isolar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas na temperatura desejada.
Em outro aspecto particular da presente invenção, as bactérias são cultivadas sob condições salinas particulares a fim de identificar ou isolar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas sob condições de concentração de NaCI ou sais equivalentes possivelmente alcançando cerca de 5 % peso/volume. Mais particularmente, as bactérias são mantidas na salinidade selecionada durante a etapa b), c) e/ou d), e/ou durante uma etapa adicional e), a fim de identificar ou isolar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas na salinidade desejada.
Em uma modalidade particular adicional e preferida da presente invenção, as bactérias são cultivadas sob condições de pH particulares a fim de identificar ou isolar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas em um intervalo de pH entre aproximadamente 3 e 9,5, preferivelmente entre 4 e 8. Mais particularmente, as bactérias são mantidas no pH selecionado durante a etapa b), c) e/ou d); e/ou durante uma etapa adicional e), a fim de identificar ou isolar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas no pH desejado.
Em uma modalidade particular adicional da presente invenção, as bactérias são cultivadas sob condições de oxigenação particulares a fim de identificar ou isolar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas em condições aeróbicas e/ou anaeróbicas. Mais particularmente, as bactérias são mantidas sob as condições de oxigenação selecionadas durante a etapa b), c) e/ou d); e/ou durante uma etapa adicional e), a fim de identificar ou isolar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas nas condições desejadas.
Em uma modalidade particular adicional da presente invenção, as bactérias são cultivadas em um meio de cultura particular a fim de identificar ou isolar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas na presença de uma fonte de carbono selecionada. Mais particularmente, as bactérias são mantidas sob o meio durante a etapa b), c) e/ou d); e/ou durante uma etapa adicional e), a fim de identificar ou isolar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas usando a fonte de carbono desejada.
Deve ser entendido que as características podem ser selecionadas individualmente ou em quaisquer combinações. Por exemplo, o método pode ser usado para identificar bactérias que são viáveis ou podem ser crescidas em uma temperatura e salinidade desejadas, ou em uma temperatura e pH desejadas, ou em uma condição de temperatura, pH e oxigenação desejadas.
Além disso, os métodos desta invenção podem compreender uma etapa adicional de modificar, por exemplo, biologicamente, geneticamente e/ou quimicamente, as bactérias identificadas ou isoladas, ou seu DNA, por meio de qualquer processo conhecido per se na técnica, dita modificação tem por objetivo, por exemplo, melhorar a viabilidade, crescimento ou funções da dita bactéria, por exemplo, a fim de melhorar a atividade antibiótica. Tal etapa de modificação inclui, sem limitação, fusão celular, evolução acelerada, embaralhamento de DNA, mutagênese, inserção de ácido nucleico eucariota, procariota ou sintético (por exemplo, DNA) de outra cepa, ou qualquer tecnologia de engenharia genética. A modificação pode também incluir uma etapa de introduzir um gene marcador (por exemplo, resistência a canamicina) na bactéria.
Muitos fármacos antibacterianos (comercializados) são análogos semi-sintéticos de produtos naturais, e são obtidos de modificações de produtos de fermentação iniciais. Este é o caso dos cetólidos, o grupo P-lactama de antibióticos. Semi-síntese ou mesmo a manipulação das enzimas envolvidas na biossíntese de antibiótico pode, portanto, ser usada para melhorar ataque inicial (Von Nusssbaum, 2006, Marsden, 1998).
Conseqüentemente, em uma modalidade particular, a invenção reside em um método de produção de uma bactéria que têm uma atividade selecionada, o método que compreende isolar uma bactéria de acordo com qualquer dos métodos descritos acima e modificar a dita bactéria, por exemplo, por meio de tratamento químico, biológico ou químico para melhorar a dita atividade.
Como é ilustrado nos exemplos, o método da presente invenção permitiu o eficiente e rápido isolamento de bactérias resistentes a UV que produzem metabólitos secundários (por exemplo, antibióticos). Estas bactérias eram desconhecidas antes de e podem estendr a diversidade e o espectro de atividade antibiótica (ou outros metabólitos secundários) para propósitos terapêuticos ou outros propósitos industriais.
Um aspecto adicional desta invenção, portanto, também reside em uma bactéria obtenível por um método como descrito acima, ou um extrato das mesmas. O extrato pode ser qualquer preparação derivada de uma cultura de células, tal como um sobrenadante, um lisado, um membrana celular, ou preparações enriquecidas/purificadas derivadas das mesmas, preferivelmente que contém um metabólito secundário.
A bactéria pode pertencer a diferentes gêneros, tais como, por exemplo, Bacillus, Methylobacterium, Sphingobactéria, Cellulosimicrobium, Tepidimonas, Nocardia, Deinococcus, Truepera, Porphyrobacter sp., Novosphingobium sp., Exiguobactéria sp., Chromobactéria sp, Arthrobacter sp, Rhodococcus sp, Microbactéria sp, Kineococcus sp, ou Williamsia sp.
A invenção também se refere a um método de produção de uma célula hospedeira recombinante, o método que compreende identificar ou isolar ou produzir uma bactéria de acordo com qualquer um dos métodos como definido acima e clonar genes (ou agrupamentos ou operons de gene, ou ácidos nucleicos sintéticos ou recombinantes correspondentes) da dita bactéria em outra célula hospedeira, deste modo produzindo uma célula hospedeira recombinante. A bactéria hospedeira pode ser uma bactéria hospedeira procariótica ou euocariótica, preferivelmente uma bactéria hospedeira procariótica. A clonagem pode ser feita de acordo com técnicas conhecida per se na técnica, tal como \ usando vetores de clonagem (por exemplo, plasmídeos, fagos, cromossomos bacterianos, etc.). Em uma modalidade preferida, genes ou agrupamentos de genes que codificam toda ou parte de uma via biossintética (por exemplo, genes que codificam enzimas envolvidas em tal vias) são isoladas da bactéria identificada, clonados em vetores apropriados, e inseridos na bactéria hospedeira selecionada, para construir nas vias biossintéticas.
A invenção também se refere a um método de produção de um agente farmacêutico (tal como um antibiótico), o método que compreende identificar ou isolar ou produzir bactéria de acordo com qualquer um dos métodos acima, em que a dita bactéria produz o agente farmacêutico, e produzir o dito antibiótico. A produção do agente farmacêutico pode compreender cultivar a bactéria (ou progénie ou derivados das mesmas) sob condições adequadas são coletar ou purificar o agente. A produção do agente farmacêutico pode também compreender a síntese artificial (por exemplo, química, recombinante, enzimática, etc.).
Um objeto adicional desta invenção é um método de identificação, isolamento ou produção de um agente farmacêutico (tal como um antibiótico), usando uma cepa bacteriana de tipo selvagem de Deinococcus.
Um objeto adicional desta invenção é um método de identificação, isolamento ou produção de um agente farmacêutico (tal como um antibiótico), usando uma cepa bacteriana modificada de Deinococcus.
Um objeto adicional desta invenção reside no uso de uma bactéria Deinococcus para produzir um agente farmacêutico (tal como um antibiótico).
Um objeto adicional desta invenção é um antibiótico derivado de uma bactéria Deinococcus.
Também, a presente invenção pode ser usada para selecionar bactérias e para gerar bibliotecas metagenômicas. Tipicamente DNA genômico de tais bactérias é extraídos e grandes fragmentos DNA são (diretamente) clonados em um vetor lançadeira para fazer uma biblioteca metagenômica representativa de ditas bactérias. Esta biblioteca metagenômica pode ser transferida em diferentes bactérias hospedeiras para identificar cepas que produzem metabólito secundário. Como um exemplo, enzimas responsáveis pela produção de policétido podem ser selecionadas de acordo com Ginolhac, 2007.
Além disso, a invenção também se refere a métodos industriais melhorados de usar microorganismos. De fato, a invenção também propõe incluir um ou diversos tratamentos de dano de DNA que destrói células em processos industriais a fim de eliminar bactérias potencialmente contaminantes. De fato, uma vez que as bactérias da presente invenção são capazes de crescer e sobreviver a tais tratamentos que destrói células, o último pode ser usado, por exemplo, em qualquer fermentação industrial ou dispositivo de cultura ou instalação, para evitar contaminação. Com respeito a isso, um objeto particular desta invenção também reside em um processo de usando uma bactéria obtenível por um método como descrito anteriormente em uma fermentação ou cultura contínua, em que o processo compreende uma etapa de irradiação da bactéria antes de ou após o início da fermentação ou da cultura contínua, para limitar a contaminação por outras bactérias ou células. Um objeto adicional desta invenção é um processo de usar uma bactéria Deinococcus em uma fermentação ou cultura contínua, em que o processo compreende uma etapa de irradiação da bactéria antes de ou após o início da fermentação ou da cultura contínua, para limitar a contaminação por outras bactérias ou células. A irradiação pode ser realizada repetidamente, tipicamente sob as condições descritas anteriormente.
Aspectos adicionais e vantagens da presente invenção serão revelados nos seguintes exemplos, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitantes. Todas as referências (pedidos de patente, patentes, publicações científicas) citadas neste pedido de patente são incorporadas no presnete documento por referência.
EXEMPLOS Exemplo 1 Determinação de condições melhoradas para selecionar bactéria que produz metabólitos
Em uma etapa preliminar, 5 cepas foram testadas para sua resistência a UV. Estas cepas foram E. coli, Deinococcus radiopugnans, Deinococcus radiodurans, Deinococcus sp. e Deinococcus geothermalis.
Culturas de fase estacionária das 5 cepas testadas foram sucessivamente diluídas desde 10° até 10’8. Toda as diluições foram manchadas (5 pl) sobre meio rico em agar TGY (Triptona 10 g/1, Glicose 2,5 g/L e Extrato de levedura 5 g/L) e diferentes tratamentos de UV foram aplicados: 0 mJ/cm2, 4 mJ/cm2, 17 mJ/cm2, 42 mJ/cm2 e 167 mJ/cm2 com um reticulador BioLink (Vilbert Lourmat). A Tabela 1 abaixo apresenta z densidade bacteriana após diferentes tratamentos de UV. Tabela 1:
Figure img0001
Como pode ser visto, um ■ tratamento de 4 mJ/cm2 reduz em 3 log a titulação bacteriana em uma cultura de E. coli. Um tratamento de 17 mJ/cm2 também discrimina entre
E coli e bactérias Deinococcus.
Em uma segunda etapa, uma suspensão de solo foi submetida a diferente tratamentos de irradiação com base nos resultados de tabela 1. A suspensão de solo foi preparada como segue: 5 g de solo úmido forma diluídos em 20 ml_ água destilada. Após vórtex e sonicação (1 minuto), sobrenadante de solo foi coletado e misturado com uma cultura de 350 pl_ de D. radiopugnans em fase de crescimento estacionária. Um alíquota (50 pL) foi espalhada sobre TGY agar que contém um agente antifúngico (cicloheximida 100 pg/mL), e diferentes tratamentos de irradiação seqüenciais repetidos foram testados: 1 tratamento, 2 tratamentos e 3 tratamentos. Intervalos de 4 h foram respeitados entre cada tratamento de UV.
A Figura 1a mostra os resultados obtidos após um exposição a 0 mJ/cm2, 4 mJ/cm2 e 17 mJ/cm2. Figura 1 b mostra os resultados obtidos após 1, 2 e 3 exposições a 4 mJ/cm2.
Como pode ser visto, as melhores condições testadas são 3 exposições a irradiações de UV de 4 mJ/cm2 cada. Tais condições proporcionam uma maior quantidade de bactérias Deinococcus que crescem que a partir da amostra de solo tratada. Uma quantidade substancial de bactérias Deinococcus é também obtida após um exposição da amostra a irradiação UV de 17 mJ/cm2.
Exemplo 2. Isolamento de bactérias resistentes a UV a partir de amostras de água.
Amostras de água foram concentradas por meio de filtração sobre um filtro de nitrocelulose de 0,22 pm (Millipore, França), então colocadas em suspensão em 10 ml de água estéril. A solução filtrada é então sonicada por aproximadamente 60 segundos para ressuspender as bactérias.
Em seguida a sonicação, entre 150 pl e 2 ml das suspensões são espalhadas sobre um meio de cultura sólido enriquecido com PGY-agar esterilizado por autoclave (20 minutos a 120°C) que contém glicose (Sigma-Aldrich, França) 1 g/l, peptona (Fluka, França) 10 g/l, e extrato de levedura (Fluka, França) 5 g/l. A cultura semeada então foi submetida a 3 tratamentos de UV de 4 mJ/cm2 cada um usando um bioreticulador BLX-E254 (Vilber- Lourmat, França), levados a cabo em um intervalo de 4 horas. Após incubação a de 30 a 50°C por 3 a 4 dias, as colônias viáveis de interessè foram visíveis.
Exemplos de colônias identificadas são listadas na Tabela 2 a seguir.
Exemplo 3. Isolamento de bactérias resistentes a UV a partir de amostras de seixo e madeira.
Amostras de seixo e madeira foram imersas em água estéril então submetidas a vórtex e sonicadas por aproximadamente 60 segundos.
Em seguida a sonicação, entre 150 pl e 2 ml das suspensões são espalhadas sobre um meio de cultura sólido enriquecido com PGY-agar esterilizado por autoclave (20 minutos a 120°C) que contém glicose (Sigma-Aldrich, França) 1 g/l, peptona (Fluka, França) 10 g/l, e extrato de levedura (Fluka, França) 5 g/l. A cultura semeada media então foi submetida a 3 tratamentos de UV usando um bioreticulador BLX-E254 (Vilber-Lourmat, França) de 4 mJ/cm2 cada um, levados a cabo em um intervalo de 4 horas. Após incubação a de 30 a 50°C por 3 a 4 dias, as colônias viáveis de interesse foram visíveis.
Exemplos de colônias identificadas são listadas na Tabela 2 a seguir.
Exemplo 4. Isolamento de bactérias resistentes a UV a partir de pedras, musgo, líquen, lama, sedimento, biofilme, solo e dejetos de animal.
Amostras de musgo, líquen, lama, solo e dejetos de animal foram colocadas em suspensão em água estéril (V/V) então submetidas a vórtex. As amostras foram então sonicadas por aproximadamente 60 segundos.
Em seguida a sonicação, entre 150 pl e 2 ml das suspensões são espalhadas sobre um meio de cultura sólido enriquecido com PGY-agar esterilizado por autoclave (20 minutos a 120°C) que contém glicose (Sigma-Aldrich, França) 1 g/l, peptona (Fluka, França) 10 g/l, e extrato de levedura (Fluka, França) 5 g/l A cultura semeada media então foi submetida a 3 tratamentos de UV usando um bioreticulador BLX-E254 (Vilber-Lourmat, França) de 4 mJ/cm2 cada um, levados a cabo em um intervalo de 4 horas. Após incubação a de 30 a 50°C por 3 a 4 dias, as colônias viáveis de interesse são visíveis.
Exemplos de colônias identificadas são listadas na Tabela 2. Tabela 2
Figure img0002
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Exemplo 5. Isolamento de bactérias a partir de amostras tratadas com bleocinaa.
Amostras de solo contendo Deinococcus radiopugnans cepa DRH40 foram colocadas em suspensão sob condições similares a aquelas do exemplo 2. Em lugar de irradiação, as suspensões foram mantidas na ausência (controle) ou presença de 50 pg/ml ou 100 pg/ml de bleocina.
Na ausência de bleocina, nenhum crescimento de colônias rosa {Deinococcus) são observados, mas somente microflora selvagem. Na presença de 50 pg/ml de bleocina, microflora selvagem diminui drasticamente, e colônias rosa são presente. O mesmo fenômeno é observado a 100 pg/ml de bleocina.
Exemplo 6. Identificação de bactérias que produzem antibiótico
As cepas resistentes a UV como divulgado na Tabela 2 foram testadas para sua capacidade de inibir o crescimento de diversas cepas de referência de bactérias. Brevemente, a fermentação foi levada a cabo em 10 ml de meio PGY que contém peptona 5g/L, extrato de levedura 2,5 g/L e glicose 0,5 g/L a de 30 a 50°C com aeração e agitação. Após 3 dias a produção de antibiótico das cepas testadas foi controlado e quantificado por teste de difusão em Agar contra diversas cepas de referência cultivadas em meio LB. LB: Bacto-triptona 10 g/L, Extrato de levedura 5g/L, cloreto de sódio 10 g/L PGY peptona 5 g/L, extrato de levedura 2,5 g/L, glicose 0,5 g/L, Cepas de referência: Staphilococcus aureus CIP 76,25 Escherichia coli CIP 76,24; Candida tropicalis CIP 1275. Os resultados são representados na Tabela 3 a seguir. Tabela 3
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0: antibiose não visível + antibiose visível Os resultados mostram que diversas cepas exibindo atividade antibiótica foram isoladas. Estas cepas produzem atividade antibiótica que é ativa contra Staphilococcus aureus, Escherichia coli e/ou Candida tropicalis. As cepas produtoras são resistentes a UV e podem ser crescidas a temperatura elevada, deste modo ilustrando a eficácia do método desta invenção.
Exemplo 7. Ensaio de seleção de produção de antibiótico 7,2. Material e Método Meios de cultura
Diferente meios foram preparados para testar produção de antibiótico. 100 ml_ de solução A é composta por MnCI2, 4H2O 0,1 g, ZnSO4, 7 H2O 0,1 g e FeCI30,1g.
O meio 1 é composto por bacto peptona de caseína 5 g/L, bacto extrato de levedura 3 g/L e ajustado a pH 7,1.
O meio 2 é composto por celobiose 10 g/L, K2HP04 1 g/L, MgSO4, 7H2O I g/L, NaCI 1 g/L, (NH4)2 SO4 2 g/L, CaCO3 2 g/L e ajustado a pH 7,2. Solução A é adicionada a 1 ml/L.
O meio 3 é composto por farinha de aveia 20 g/L e solução A a 1 ml/L.
Preparação da cultura de cepas de teste
As cepas foram inoculadas em 5 mL de meios PGY líquidos. Pré-culturas foram então incubadas a 30°C ou 45°C por 48 horas sob agitação a 150 rpm.
Em tubo de vidro de 15 ml, 100 pL de pré-cultura foram inoculados em 5 mL de meios 1 a 3. Culturas foram então incubadas a 30°C ou 45°C por 48 horas, 96 horas, 168 horas e 336 horas sob agitação a 150 rpm.
Preparação da cultura de cepas alvo
As cepas alvo foram Staphilococcus aureus CIP76,25, Escherichia coli CIP 76,24, Pseudomonas aeruginosa CIP 76,110, Streptococcus pneumonia CIP 104485 e Candida tropicalis DSM 1346.
Foram cultivadas em meio LB a 37°C por 18 horas. Então, 10 mL agar mole (meio Luria Bertani com agar a 7 g/L) foram inoculadas a 2% (v/v) com pré-cultura de cepas alvo em um placa de petri.
Avaliação da produção de antibiótico
Após incubação a 30°C ou 45°C por 48 horas, 96 horas, 168 horas e 336 horas, 1 ml de cultura de teste foi centrifugada a 13000 rpm por 3 minutos. O sobrenadante foi então filtrado em um filtro de 0,22 pm. 10 pL de sobrenadante de cultura filtrada foram inoculados em agar mole que contém cepas alvo. Após incubação a 37°C por 18 horas, placas de lise puderam ser observadas.
7,2. Resultados
A tabela 4 apresenta exemplo de diferentes perfis antibiótico obtidos. Kineococcus cepa M10-5H produziu antibióticos contra cepas Gram positivas de teste e E. coli CIP 76.24. Deinococcus cepa MC5-7F produziu antibióticos contra S. aureus CIP 76,25. Microbactéria cepa MA3-7G produziu antibióticos contra C. tropicalis CIP 1275 e Williamsia cepa MA3-6B produziu antibióticos contra cepas Gram positivas de teste e P. aeruginosa CIP 76,110. Tabela 4: Resultados de testes de produção de antibiótico
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"+" significa que uma antibiose foi observada. significa que não foi observada antibiose.
Referências
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Claims (14)

1. Método para identificar ou isolar uma bactéria que produz um metabólito selecionado de antibióticos e agentes antifúngicos, o método caracterizado por compreender: a) proporcionar uma amostra que compreende bactérias não caracterizadas; b) submeter a amostra a pelo menos 3 tratamentos de UV de entre 0,5 e 400 mJ/cm2, a irradiação sendo realizada em um intervalo de entre 3 e 5 horas; c) identificar ou isolar uma bactéria viva ou em crescimento de dita amostra tratada; e d) selecionar uma bactéria da etapa c) que produz o metabólito.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a amostra ser ou derivar de uma amostra ambiental, preferivelmente obtida ou derivada de solo, água, fontes termais, ambiente marinho, lama, madeira, pedra, musgo, extrato vegetal, líquen, material biológico, sedimento, turfas, biofilme, efluentes industriais, gás, areia, óleo, água de esgoto, dejetos humanos ou animais.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por dito tratamento compreender irradiações repetidas em intervalos de 4 horas.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender ainda uma etapa de selecionar uma bactérias Deinococcus.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a etapa b) ser realizada em um meio de cultura sólido.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por, na etapa c), as colônias serem identificadas ou isoladas.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por as etapas c) e d) serem realizadas sequencialmente, em qualquer ordem, ou simultaneamente.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a etapa d) compreender expor as bactérias identificadas ou isoladas da etapa c), ou um extrato das mesmas, a uma ou diversas células indicadoras e selecionar uma bactéria que afeta a viabilidade, crescimento, metabolismo, mobilidade, expressão de RNA, expressão de proteína, secreção de proteína ou produção de vírus de pelo menos uma das ditas células indicadoras.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o método compreender uma etapa adicional de isolamento ou purificação do dito metabólito.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o metabólito ser um antibiótico.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o metabólito ser um antibiótico e por a etapa d) compreender expor as bactérias identificadas ou isoladas da etapa c), ou um extrato das mesmas, a uma cepa bacteriana de referência e identificar ou isolar uma bactéria que exibe uma atividade antibiótica.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender ainda uma etapa de isolamento ou purificação do composto antibiótico produzido pela dita bactéria.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender ainda uma etapa de selecionar uma bactéria que é viável 10 ou cresce sob condições de cultura selecionadas, tais como meios, nutrientes, temperatura, pH, salinidade, oxigenação, co-cultura, biorreatores ou fonte de carbono.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por compreender ainda uma etapa de modificar, biologicamente, geneticamente e/ou quimicamente, as bactérias identificadas ou isoladas, ou seu DNA, a fim 15 de melhorar a viabilidade, crescimento ou funções da dita bactéria.
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