JP2023129421A - Rnaポリメラーゼバリアント - Google Patents
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Abstract
【課題】本開示のいくつかの態様は、野生型RNAポリメラーゼと比較して、RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、RNAポリメラーゼバリアントを提供する。
【解決手段】本開示は、いくつかの態様では、バリアントRNAポリメラーゼであって、その使用により、インビトロ転写反応において生成される二本鎖RNA混入物及びランオン転写物の数を減少させながら転写効率を増加させる、該バリアントRNAポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアント)は、高ヘリックス性向を有する残基(例えば、アラニン)か、または骨格柔軟性を伸長複合体の骨格柔軟性に特異的に一致させる残基に対する変異を含む。S43A及びG47Aを含むCヘリックス及びT7 RNAポリメラーゼのCリンカー領域内のアミノ酸置換、ならびにC末端グリシン残基の付加についても記載する。キャップ類似体を使用した共転写法についても記載する。
【選択図】なし
【解決手段】本開示は、いくつかの態様では、バリアントRNAポリメラーゼであって、その使用により、インビトロ転写反応において生成される二本鎖RNA混入物及びランオン転写物の数を減少させながら転写効率を増加させる、該バリアントRNAポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアント)は、高ヘリックス性向を有する残基(例えば、アラニン)か、または骨格柔軟性を伸長複合体の骨格柔軟性に特異的に一致させる残基に対する変異を含む。S43A及びG47Aを含むCヘリックス及びT7 RNAポリメラーゼのCリンカー領域内のアミノ酸置換、ならびにC末端グリシン残基の付加についても記載する。キャップ類似体を使用した共転写法についても記載する。
【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、2017年8月18日に出願された米国仮出願第62/547,677号、2018年2月9日に出願された米国仮出願第62/628,484号、及び2018年3月5日に出願された米国仮出願第62/638,684号、2018年5月29日に出願された米国仮出願第62/677,527号の35U.S.C.§119(e)下の利益を主張し、それらの各出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2017年8月18日に出願された米国仮出願第62/547,677号、2018年2月9日に出願された米国仮出願第62/628,484号、及び2018年3月5日に出願された米国仮出願第62/638,684号、2018年5月29日に出願された米国仮出願第62/677,527号の35U.S.C.§119(e)下の利益を主張し、それらの各出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
インビトロ転写(IVT)は、バクテリオファージDNA依存性リボ核酸(RNA)ポリメラーゼ(例えば、SP6、T3、及びT7)を使用して、鋳型に対するmRNA転写物を合成する。IVT反応における問題により、完全な失敗(例えば、転写物が生成しない)またはサイズが正しくない(例えば、予想よりも短いまたは長い)転写物となり得る。IVT反応に関連する特定の問題には、例えば、アボーティブ(abortive)(切断型)転写物、ランオン(run-on)転写物、ポリAテールバリアント/3´不均一性(heterogeneity)、変異転写物、及び/または反応中に生成される二本鎖混入物が含まれる。
RNAポリメラーゼは、転写の3つの段階-開始、伸長、及び終了を示す。開始段階では、RNAポリメラーゼは、特定のプロモーターDNA配列に結合し、DNA二重鎖を開かせ、鋳型鎖を活性部位へと供給する。例えば、T7 RNAポリメラーゼは、プロモーターと相互作用してDNA二重鎖融解を開始する6つのヘリックス束のサブドメイン(プロモーター結合ドメイン)を含む開始複合体と呼ばれる構造を形成する。ポリメラーゼは、プロモーターに結合している間、2~12ヌクレオチド(nt)の長さの短い多くの(切断型)転写物を生成し、プロセスはしばしばアボーティブ合成/開始と呼ばれる。切断型RNA転写物は、RNAポリメラーゼによって完全長の転写物に変換され得ず、転写中に蓄積する副産物となる。伸長段階への移行及びプロモーターのリリース後、ポリメラーゼは、DNA鋳型へと働きかけ、完全長RNA転写物を生成する。
伸長段階の間、RNAポリメラーゼはしばしば、終了が開始されるべき位置を超えてDNAを転写し続け、予想よりも長いRNA転写物(「ランオン転写物」)を生成する。T7 RNAポリメラーゼは、例えば、鋳型から「フォーリングオフする(falling off)」前に、ヌクレオチドを転写物の末端に追加する。研究では、T7 RNAポリメラーゼによってインビトロで生成された転写物の70%超がランオン転写物であり得ることが示唆されている。いくつか場合では、これらの異常なRNA産物は、コードされた配列の2倍の長さである。ランオン転写は推計学的であるため、所与のIVT反応における生成物中に多くの3´不均一性がしばしば存在する。この3´不均一性は、規定の長さ及び/またはヌクレオチド組成のRNA転写物に依存するライゲーション反応などの下流での用途において問題になる。
転写開始の際、RNAポリメラーゼは2つの相反する段階の平衡を保つ。ポリメラーゼはまず、2つのDNA鎖(そのうちの1つは鋳型鎖である)の解離を可能にするのに十分にしっかりとプロモーターと結合し、転写を開始する必要がある。次いで、ポリメラーゼはプロモーターをリリースし、高度にプロセッシブな(processive)伸長段階に入る必要がある。これらの2つの段階の間の競合により、アボーティブな転写物が生成する。ポリメラーゼは繰り返しプロモーターを除こうとするが、移行障壁を克服することができず、短い(アボーティブな)RNA産物を放出する。逆に、ポリメラーゼはしばしばDNA鋳型を「ランオフ」せず、3´不均一性を有するRNA転写物の集団を生成する。例えば、インビトロ転写(IVT)反応において生成される転写効率及び3´均一性を増加させるバリアントRNAポリメラーゼ、ランオン転写物、二本鎖混入物、またはそれらの任意の組み合わせが本明細書で提供される。
開始から伸長への移行中に、RNAポリメラーゼは、アミノ末端ドメイン(N末端ドメイン)の大きな再配列を必要とするコンフォメーション変化を受ける(例えば、Bandwar,RP et al.Journal of Biological Chemistry 282,22879-22886(2009);Guillerez,J.et al.Proc National Acad Sci 102,5958-5963(2005);Durniak,K.et al.Science(New York,N.Y.)322,553(2008);及びTahirov,T.H.et al.Nature 420,43-50(2002)を参照のこと、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)。このN末端ドメイン内には、「Cヘリックス」(例えば、T7 RNAポリメラーゼのアミノ酸28~71)及び「Cリンカー」(例えば、T7 RNAポリメラーゼのアミノ酸258~266)があり、その各々が、RNAポリメラーゼが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて、プロモーター結合部位が廃棄され、活性部位が拡張され、RNA転写物の出口トンネルが作出される、ループ構造からヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けるサブ領域(それぞれ、アミノ酸42~47及び257~262)を含む(例えば、図10を参照のこと)。Cヘリックス構造のサブ領域及び/またはCリンカーのリンカー領域に対する変異は、開始複合体と比較して伸長複合体の熱力学的安定性を高めることにより、伸長複合体に対するコンフォメーション平衡を推進し得る。理論に縛られることなく、Cヘリックス構造及び/またはCリンカーのリンカー領域などの選択領域の変異は、伸長中にポリメラーゼの出口トンネルが転写物と相互作用する方法を変化させることができ、転写エラー(例えば、ランオン転写物)を大幅に減少させると考えられている。したがって、本開示のバリアントポリメラーゼは、Cヘリックス及び/またはCリンカーにおいて、伸長複合体に対するコンフォメーション平衡を推進するための(少なくとも1つの)変異を含む。
本明細書で提供されるように、ポリメラーゼが開始から伸長に進むにつれてヘリックス構造に移行するループ構造を含むN末端ドメインの他の領域は、変異され得る(置換と呼ばれる、点変異)。そのようなループ-ヘリックス(loop-to-helix)領域の非限定的な例には、T7 RNAポリメラーゼ(例えば、配列番号1)のアミノ酸55~73、164~169、もしくは176~187に及ぶ領域、または前述の領域と相同である(例えば、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一である)他の単一サブユニットRNAポリメラーゼの領域(例えば、Cermakian,N.et al.J Mol Evol 45,671-681(1997)を参照のこと)を含む。他の単一サブユニットRNAポリメラーゼの非限定的な例には、T3 RNAポリメラーゼ、K11 RNAポリメラーゼ、及びSP6 RNAポリメラーゼが含まれる。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアント)は、高ヘリックス性向を有する残基(例えば、アラニン)か、または骨格柔軟性を伸長複合体の骨格柔軟性に特異的に一致させる残基に対する変異を含む。
ポリメラーゼのC末端に少なくとも1つの追加のアミノ酸を含むRNAポリメラーゼバリアントが本明細書でさらに提供される。例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、ポリメラーゼのC末端に、追加のグリシン(G)などの少なくとも1つの追加のアミノ酸を含み得る。驚くべきことに、C末端「足(foot)」領域(例えば、野生型T7 RNAPの880~883位に「FAFA」(配列番号172)アミノ酸を含む領域)に追加のGを含むように修飾されたT7 RNAポリメラーゼを使用して生成されたRNA転写物の集団は、より少ない3´不均一性を示す。例えば、図23に示すように、C末端グリシン(すなわち、…FAFAG(配列番号329))を含むT7 RNAポリメラーゼバリアントは、転写物の少なくとも85%が3´末端において均一であるRNA転写物集団を生成する。これまでの研究では、C末端の付加/挿入によりT7ポリメラーゼの機能が失われることが示されていることを考慮すると、このデータは特に予想外である(Gardner LP,et al.Biochemistry 36,2908-2918(1997)及びGross L,et al.Journal of Molecular Biology 228,488-505(1992))。
本明細書に記載されているT7 RNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアントG47AまたはG47A* C末端バリアント)を使用したインビトロ転写アッセイにおいて、ssRNA(例えば、mRNA)をキャップ類似体(例えば、トリヌクレオチド)で共転写で(co-transcriptionally)キャッピングする方法(共転写キャッピング方法)もまた、本明細書で提供される。効率的な共転写キャッピングには、通常、5′ATPならびに等モル濃度のNTP及びトリヌクレオチドを用いて転写を開始する二本鎖DNA(dsDNA)鋳型が含まれる。これらの条件下で、T7RNAポリメラーゼは、5′ATPを用いると開始活性が著しく低下する。予想外に、本明細書で提供されるデータは、GAGトリヌクレオチド(例えば、m7GpppA2′OMepG)の存在下において、例えば、5′ATPを用いたT7 RNAポリメラーゼの限定された開始活性は、5′ATPではなくトリヌクレオチドで開始が推進され、キャップされたRNAを共転写で生成する。驚くべきことに、いくつかの実施形態では、生成されたRNAの90%超が一本鎖完全長転写物を含み、生成されたRNAの少なくとも90%が機能性キャップを含み、生成されたRNAがIVT後に精製なしでも実質的なサイトカイン応答を示さない。
したがって、本開示のいくつかの態様は、野生型RNAポリメラーゼと比較して、RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、RNAポリメラーゼバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、開始複合体よりも伸長複合体においてフォールディング自由エネルギーの負の変化が大きいと推定される。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、野生型アミノ酸と比較して、高いヘリックス性向を有する。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、C末端に(少なくとも1つの)追加のアミノ酸残基を含む。例えば、RNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアント)は、C末端にグリシン(G)を含み得る。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、T3 RNAポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、SP6 RNAポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、K11 RNAポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つのループ構造が、Cヘリックス構造中にある。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのループ構造が、Cリンカー構造中にある。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのループ構造が、T7 RNAポリメラーゼのアミノ酸55~73、164~169、もしくは176~187、またはT7 RNAポリメラーゼに相同なRNAポリメラーゼ内の領域に存在する。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換である。例えば、少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸から選択され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、アラニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、イソロイシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、ロイシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、アルギニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、メチオニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高ヘリックス性向のアミノ酸置換は、リジンである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高ヘリックス性向のアミノ酸置換は、グルタミンである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、グルタミン酸である。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、E42(例えば、E42R)、S43(例えば、S43A)、Y44(例えば、Y44A)、E45(例えば、E45R/L)、M46(例えば、M46A)、G47(例えば、G47A)、A255(例えば、A255K/Q/Y/I)、R257(例えば、R257A)、A258(例えば、A258R/E/L)、G259(例えば、G259A)、A260(例えば、A260R/E/L)、L261(例えば、L261A)及びA262(例えば、A262R/E/L)から選択される少なくとも1つの位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸置換を含むように修飾される。T7 RNAポリメラーゼは、いくつかの実施形態では、(少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換に加えて)1つ以上の追加のアミノ酸置換をさらに含み得る。したがって、本開示は、本明細書で提供される1つ以上の高ヘリックス性向アミノ酸置換を有する既存の(例えば、現在入手できる及び/または市販の)T7 RNAポリメラーゼバリアントのさらなる修飾を包含する。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、E42(例えば、E42R)、S43(例えば、S43A)、Y44(例えば、Y44A)、E45(例えば、E45R/L)、M46(例えば、M46A)及びG47(例えば、G47A)から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、S43Aを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、G47Aを含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、E42(例えば、E42R)、S43(例えば、S43A)、Y44(例えば、Y44A)、E45(例えば、E45R/L)、M46(例えば、M46A)及びG47(例えば、G47A)から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号99、配列番号100、配列番号294、配列番号295、または配列番号296のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、S43Aを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、G47Aを含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、A255(例えば、A255K/Q/Y/I)、R257(例えば、R257A)、A258(例えば、A258R/E/L)、G259(例えば、G259A)、A260(例えば、A260R/E/L)、L261(例えば、L261A)及びA262(例えば、A262R/E/L)から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、R257Aを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、G259Aを含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、A255(例えば、A255K/Q/Y/I)、R257(例えば、R257A)、A258(例えば、A258R/E/L)、G259(例えば、G259A)、A260(例えば、A260R/E/L)、L261(例えば、L261A)及びA262(例えば、A262R/E/L)から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号99、配列番号100、配列番号294、配列番号295、または配列番号296のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、R257Aを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、G259Aを含む。
いくつかの態様では、位置G47、S43、R257、またはG259に高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1のアミノ酸配列を含むT7 RNAポリメラーゼもまた、本明細書で提供される。いくつかの態様では、位置G47、S43、R257、またはG259に高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号99、配列番号100、配列番号294、配列番号295、または配列番号296のアミノ配列を含むT7 RNAポリメラーゼがさらに提供される。
いくつかの実施形態では、本開示のT7 RNAポリメラーゼは、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のT7 RNAポリメラーゼは、配列番号107もしくは108、配列番号109もしくは110、配列番号111もしくは112、または配列番号113もしくは114のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、少なくとも1つの追加のC末端アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、少なくとも2つの追加のC末端アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも2つの追加のC末端アミノ酸は、同じ種類のアミノ酸(例えば、すべてGly、すべてAla)を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも2つの追加のC末端アミノ酸は、少なくとも2つの異なる種類のアミノ酸(例えば、GlyAla、AlaGly)を含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、少なくとも3つの追加のC末端アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも3つの追加のC末端アミノ酸は、少なくとも2つもしくは少なくとも3つの同じ種類または異なる種類のアミノ酸(例えば、GlyGlyGly、AlaAlaAla)を含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、1~10個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個)の追加のC末端アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、1~5つの追加のC末端アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼはFAFAXn
(配列番号171)モチーフを含むC末端を含み、Xは任意のアミノ酸であり、nはゼロより大きい任意の整数である。いくつかの実施形態では、Xはグリシン(G)である。いくつかの実施形態では、nは1、2、3、4、または5である。nが1より大きく、したがって、C末端モチーフは、例えばFAFXX、FAFAXXX(配列番号319)、FAFAXXXX(配列番号320)、またはFAFAXXXXX(配列番号321)である実施形態では、例えば、X´が同じアミノ酸であり得、または異なるアミノ酸であり得ると理解されるべきである。例えば、C末端モチーフは、FAFAGG(配列番号322)もしくはFAFAGGG(配列番号323)であってもよく、またはC末端モチーフは、FAFAGA(配列番号324)、FAFAGC(配列番号325)、FAFAGAA(配列番号326)、FAFAGAG(配列番号327)、FAFAGAC(配列番号328)などであり得る。他のC末端アミノ酸の組み合わせを使用し得る。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、FAFAG(配列番号329)モチーフを含むC末端を含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼは、XAFAXnモチーフ、FXFAXnモチーフ、FAXAXnモチーフ、またはFAFXXnモチーフを含み、各Xは任意のアミノ酸であり、nはゼロより大きい任意の整数である。したがって、本開示は、様々なC末端、F880A881F882A883
(配列番号172)モチーフを含み、880位、881位、882位、または883位のうちの1つ以上のアミノ酸(例えば、野生型T7 RNAPと比較して、例えば、配列番号1)が、追加のC末端アミノ酸(Xn)の有無にかかわらず、少なくとも1つのアミノ酸置換を含むように修飾されている。
いくつかの態様では、本開示は、対応する野生型RNAポリメラーゼと比較して少なくとも1つの追加のC末端アミノ酸を含む、RNAポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、及びSP6 RNAポリメラーゼから選択される。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、少なくとも1つの追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、G47A、S43A、R257A、及びG259Aから選択される配列番号1のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、43±1(例えば、42、43、または44)位、47±1(例えば、46、47、または48)位、257±1(例えば、256位、257位、または258)位,及び/または259±1(例えば、258位、259位、または260)位にアミノ酸を含むように修飾された、配列番号1と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含むT7 RNAポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン(A)である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、野生型T7 RNAポリメラーゼの43±1位、47±1位、257±1位,及び/または259±1位(配列または構造アライメントに基づく)に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号6と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含むT3 RNAポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン(A)である。いくつかの実施形態では、野生型T7 RNAポリメラーゼの43±1位、47±1位、257±1位,及び/または259±1位(配列または構造アライメントに基づく)に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号7と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含むSP6 RNAポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン(A)である。
本開示のいくつかの態様は、43位、47位、257位,及び/または259位にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号1と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含むT7 RNAポリメラーゼを提供し、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン(A)である。
本開示の他の態様は、野生型T7 RNAポリメラーゼの43位、47位、257位、及び/または259位に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号6と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含むT3 RNAポリメラーゼを提供し、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン(A)である。したがって、いくつかの実施形態では、T3 RNAポリメラーゼは、44位、48位、258位,及び/または260位にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号6と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン(A)である。
本開示のさらに他の態様は、野生型T7 RNAポリメラーゼの43位、47位、257位、及び/または259位に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号7と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含むSP6 RNAポリメラーゼを提供し、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン(A)である。したがって、いくつかの実施形態では、SP6 TNAポリメラーゼは、15位、19位、230位,及び/または232位にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号7と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン(A)である。
本開示はまた、RNA転写物の生成をもたらす条件下で(例えばIVT条件下で)、DNA鋳型を本明細書に記載のRNAポリメラーゼバリアントと接触させることを含む、RNAの生成方法を提供する。
本開示は、ヌクレオシド三リン酸(NTP)及び緩衝液の存在下において、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を本明細書で提供されるRNAポリメラーゼバリアントと接触させることを含む、IVT反応を行う方法をさらに提供する。
いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物は、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、同じIVT条件下で野生型RNAポリメラーゼを使用して生成されたRNAと比較して、少なくとも50%(例えば、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも95%、または少なくとも98%)低いサイトカイン応答を刺激する。
いくつかの実施形態では、IVTにより生成されたdsRNA転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたdsRNA転写物と比較して、少なくとも50%(例えば、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも95%、または少なくとも98%)低い。
いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の20%未満(例えば、15%未満、10%未満、5%未満)が3´不均一性を示す。
いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の50%未満(例えば、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満)が切断型RNA転写物である。
いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の50%未満(例えば、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満)がランオンRNA転写物である。
いくつかの態様では、生成された全長RNA転写物の量が、DNA鋳型の量よりも少なくとも15倍大きい。
いくつかの実施形態では、切断型RNA転写物:生成された完全長RNA転写物の比率が、1:1未満である。
いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物は、DNA鋳型と比較して100ヌクレオチドあたり1未満の変異を有する。
本開示は、いくつかの態様では、RNAポリメラーゼバリアントをコードする核酸を提供し、いくつかの実施形態では、該核酸を含むベクター(例えばプラスミド)及び/または宿主細胞(例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞)を提供する。
本開示の方法により生成されたRNA転写物も提供される。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA)は、脂質ナノ粒子中に製剤化される。脂質ナノ粒子は、例えば、20~60%のイオン化可能なアミノ脂質、5~25%の非カチオン性脂質、25~55%のステロール、及び0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含み得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、2017年4月27日に公開されたWO2017/070624を参照のこと。
RNAポリメラーゼバリアントを含む他の組成物及びキットが本明細書で包含される。
リボ核酸(RNA)合成のための共転写キャッピング方法であって、RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をT7 RNAポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む方法も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の80%超、85%超、または90%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の95%超が機能性キャップを含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸は、非修飾もしくは修飾ATP、修飾もしくは非修飾UTP、修飾もしくは非修飾GTP、及び/または修飾もしくは非修飾CTPを含む。
いくつかの実施形態では、T7ポリメラーゼバリアントは、E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257、及びG259から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号1のアミノ酸配列(または配列番号1と90%~99%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。いくつかの実施形態では、T7ポリメラーゼバリアントは、G47Aのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号1のアミノ酸配列(または配列番号1と90%~99%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。いくつかの実施形態では、T7ポリメラーゼバリアントは、S43Aのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号1のアミノ酸配列(または配列番号1と90%~99%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。
いくつかの実施形態では、T7ポリメラーゼバリアントは、E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257、及びG259から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも99つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号99のアミノ酸配列(または配列番号99と90%~99%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。いくつかの実施形態では、T7ポリメラーゼバリアントは、G47Aのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号99のアミノ酸配列(または配列番号99と90%~99%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。いくつかの実施形態では、T7ポリメラーゼバリアントは、S43Aのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号99のアミノ酸配列(または配列番号99と90%~99%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。
いくつかの実施形態では、T7ポリメラーゼバリアントは、E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257、及びG259から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも100つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号100のアミノ酸配列(または配列番号100と90%~99%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。いくつかの実施形態では、T7ポリメラーゼバリアントは、G47Aのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号100のアミノ酸配列(または配列番号100と90%~99%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。いくつかの実施形態では、T7ポリメラーゼバリアントは、S43Aのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号100のアミノ酸配列(または配列番号100と90%~99%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体は、反応において等モル濃度で存在する。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、1:1より大きい。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、1:1未満である。
いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、トリヌクレオチドキャップである。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列:GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG、及びGUUから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列:m7GpppApA、m7GpppApC、m7GpppApG、m7GpppApU、m7GpppCpA、m7GpppCpC、m7GpppCpG、m7GpppCpU、m7GpppGpA、m7GpppGpC、m7GpppGpG、m7GpppGpU、m7GpppUpA、m7GpppUpC、m7GpppUpG、及びm7GpppUpUから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列:m7G3′OMepppApA、m7G3′OMepppApC、m7G3′OMepppApG、m7G3′OMepppApU、m7G3′OMepppCpA、m7G3′OMepppCpC、m7G3′OMepppCpG、m7G3′OMepppCpU、m7G3′OMepppGpA、m7G3′OMepppGpC、m7G3′OMepppGpG、m7G3′OMepppGpU、m7G3′OMepppUpA、m7G3′OMepppUpC、m7G3′OMepppUpG、及びm7G3′OMepppUpUから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列:m7G3′OMepppA2′OMepA、m7G3′OMepppA2′OMepC、m7G3′OMepppA2′OMepG、m7G3′OMepppA2′OMepU、m7G3′OMepppC2′OMepA、m7G3′OMepppC2′OMepC、m7G3′OMepppC2′OMepG、m7G3′OMepppC2′OMepU、m7G3′OMepppG2′OMepA、m7G3′OMepppG2′OMepC、m7G3′OMepppG2′OMepG、m7G3′OMepppG2′OMepU、m7G3′OMepppU2′OMepA、m7G3′OMepppU2′OMepC、m7G3′OMepppU2′OMepG、及びm7G3′OMepppU2′OMepUから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列:m7GpppA2′OMepA、m7GpppA2′OMepC、m7GpppA2′OMepG、m7GpppA2′OMepU、m7GpppC2′OMepA、m7GpppC2′OMepC、m7GpppC2′OMepG、m7GpppC2′OMepU、m7GpppG2′OMepA、m7GpppG2′OMepC、m7GpppG2′OMepG、m7GpppG2′OMepU、m7GpppU2′OMepA、m7GpppU2′OMepC、m7GpppU2′OMepG、及びm7GpppU2′OMepUから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列:GAG、GCG、GUG、及びGGGから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、配列GAGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppA2′OmepGを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置+1に2´-デオキシシチジン残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置+1に2´-デオキシアデノシン残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置+1に2´-デオキシグアノシン残基を含む。
RNA合成のための共転写キャッピング方法であって、RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を(a)T7 RNAポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、該RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、該T7 RNAポリメラーゼバリアント、(b)ヌクレオシド三リン酸、及び(c)配列GpppA2′OmepGを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む、該方法も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物は、任意選択により未精製の形態で細胞に送達されたときに、検出可能なサイトカイン応答を刺激しない。
インビトロ転写(IVT)RNA及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、IVT後の精製なしでサイトカイン誘導RNA混入物を実質的に含まない組成物が、本明細書でさらに提供される。
組成物は、いくつかの実施形態では、IVT RNA及び薬学的に許容される賦形剤を含み、該組成物は5%未満のキャップされていないRNA種を有する。
いくつかの実施形態では、IVT RNAの80%超、85%超、または90%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、IVT RNAの95%超が機能性キャップを含む。
いくつかの実施形態では、IVT RNAは化学修飾されていない。他の実施形態では、IVT RNAは化学的に修飾されている。
いくつかの実施形態では、IVT RNAの95%超が一本鎖完全長転写物を含む。
いくつかの実施形態では、RNAは、RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を(a)T7 RNAポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、該RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、該T7 RNAポリメラーゼバリアント、(b)ヌクレオシド三リン酸、及び(c)配列GpppA2′OmepGを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含むプロセスによって生成され、ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号294~313のアミノ酸配列を含むT7 RNAPバリアントを提供し、xは任意のアミノ酸であり、nは任意の整数、例えば1~5(例えば、1、2、3、4、または5)である。
いくつかの態様では、本開示は、ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を本開示のRNAポリメラーゼバリアントと接触させることを含む、IVT反応を行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、生成されたRNAは、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、野生型を使用して生成されたdsRNA転写物と比較して少なくとも50%低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、IVT反応により生成されたRNA転写物の30%未満が3´不均一性を示す。
本開示は、例えば、インビトロ転写(IVT)反応中に生成されたランオン転写物及び/または二本鎖混入物を減少させながら、転写効率及び3´均一性を増加させる、RNAポリメラーゼ(RNAP)バリアントを提供する。いくつかの実施形態では、単一のアミノ酸置換を含むこれらのRNAPバリアントは、開始複合体から伸長複合体へのRNAPコンフォメーション転移を促進し、それにより転写開始段階に関連する問題の多くを軽減する。
DNA依存性RNAポリメラーゼ(例えば、T7 RNAポリメラーゼ)のN末端Cヘリックス及び/またはCリンカー構造(複数可)の修飾(複数可)が、伸長複合体へのポリメラーゼのコンフォメーション平衡を推進し、DNA鋳型プロモーターの放出及び高度に進行性の伸長段階の開始を促進することを示す予測しなかった実験結果が本明細書で提供される。驚くべきことに、IVT反応における本明細書で提供されるポリメラーゼバリアントの使用は、生成された転写物間の3´不均一性を低減し、二本鎖混入物の生成も低減(または排除)する。さらに、結果は、ポリメラーゼバリアントを使用して生成された転写物の純度及び発現レベルが、野生型ポリメラーゼを使用して生成された転写物のものに匹敵することを示している。
したがって、本開示のRNAポリメラーゼバリアントの使用は、IVT反応生成物に関連する問題の多くを減らす。野生型T7 RNAポリメラーゼ(RNAP)は、産業界及び学界の両方で一般的に使用されており、その活性のうちのいくつかは、得られるRNA転写物の純度を著しく損なう。特に、この野生型T7 RNAP酵素を使用すると、RNA転写物の3´末端への、ヌクレオチドの鋳型のない(non-templated)付加がもたらされる。例えば、野生型T7 RNAPは、核酸塩基の同一性にとってほとんど好ましくないと思われる、少なくとも1つ、しばしば2つ以上の鋳型なしのヌクレオチドを3´末端に挿入する。驚くべきことに、本明細書で提供されるT7 RNAPバリアントは3´不均一性の発生を低減させる。いくつかの実施形態では、本開示のRNAポリメラーゼバリアントを使用してIVTによって生成されたRNA転写物の30%未満が3´不均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のRNAポリメラーゼバリアントを使用してIVTによって生成されたRNA転写物の20%未満(例えば、15%、10%、または5%未満)が3´不均一性を示す。いくつかの実施形態では、IVTによって生成されたRNA転写物の1~20%、1~15%、1~10%、または1~5%が3´不均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のRNAポリメラーゼバリアントを使用してIVTによって生成されたRNA転写物の1%未満が3´不均一性を示す。
したがって、例えばIVT反応における、本開示のRNAポリメラーゼバリアントの使用は、「より均質な」RNA転写物(3´末端における不均一性が低減し/均一性が増大したRNA転写物の集団)の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示のRNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物の少なくとも70%が3´均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のRNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%が3´均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のRNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物の少なくとも90%が3´均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のRNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物の少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%が3´均一性を示す。
また、本明細書において、驚くべきことは、アミノ酸置換(例えば、配列番号1のS43A及び/またはG47A)またはC末端付加(例えば、1つ以上のアミノ酸が付加されたWT、S43A*、及び/またはG47A*)T7 RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物は、任意選択により未精製の形態で(例えば、逆相クロマトグラフィーにより精製されずに)細胞に送達されたときに、野生型RNAポリメラーゼを使用して生成されたRNAに比べて低いサイトカイン応答を刺激する示す結果であった。いくつかの実施形態では、本開示のT7 RNA変異型ポリメラーゼを使用して生成されたRNA転写物を受け取った細胞からの検出可能なサイトカイン応答はない。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAP S43A*バリアント及び/またはT7 RNAP G47A*バリアント)を使用して生成されたRNAは、野生型RNAポリメラーゼを使用して生成されたRNAと比較して、少なくとも50%(例えば、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%)低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAP S43A*バリアント及び/またはT7 RNAP G47A*バリアント)を使用して生成されたRNAは、野生型RNAポリメラーゼを使用して生成されたRNAと比較して、50~60%、50~70%、50~80%、50~90%、50~100%、60~70%、60~80%、60~90%、60~100%、70~80%、70~90%、70~100%、80~90%、80~100%、または90~100%低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAP S43A*バリアント及び/またはT7 RNAP G47A*バリアント)を使用して生成されたRNAは、野生型RNAポリメラーゼを使用して生成されたRNAと比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、または5倍低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、サイトカイン応答を試験するために使用される細胞は、ヒト線維芽細胞(例えば、BJ(ATCC(登録商標)CRL-2522(商標))細胞)である。いくつかの実施形態では、サイトカイン応答を試験するために使用される細胞は、単球由来マクロファージ(MDM)である。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたdsRNA転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたdsRNA転写産物と比較して、少なくとも50%(例えば、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%)低い。いくつかの実施形態では、生成されたdsRNA転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたdsRNA転写物と比較して、50~60%、50~70%、50~80%、50~90%、50~100%、60~70%、60~80%、60~90%、60~100%、70~80%、70~90%、70~100%、80~90%、80~100%、または90~100%低い。いくつかの実施形態では、生成されたdsRNA転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたdsRNA転写物と比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、または5倍低い。
本開示のRNAポリメラーゼバリアントの使用により、二本鎖混入物の生成及びより少ないランオン転写物の生成が予想外にもたらされた。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントを使用して例えばIVTによって生成されたRNA転写物の50%未満(例えば、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、または1%未満)は、二本鎖混入物である。いくつかの実施形態において、生成されたRNA転写産物の1~50%、1~40%、1~30%、1~20%、1~10%、1~5%、5~50%、5~40%、5~30%、5~20%、5~10%、10~50%、10~40%、10~30%、または10~20%は、二本鎖混入物である。
いくつかの実施形態において、RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写産物の50%未満(例えば、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、または1%未満)は、ランオンRNA転写産物である。いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の1~50%、1~40%、1~30%、1~20%、1~10%、1~5%、5~50%、5~40%、5~30%、5~20%、5~10%、10~50%、10~40%、10~30%、または10~20%は、ランオンRNA転写物である。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成された全長RNA転写物の量は、DNA鋳型の量よりも少なくとも15倍大きい。例えば、生成された全長RNA転写物の量は、DNA鋳型の量よりも少なくとも20倍、30倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、または100倍大きいものであり得る。いくつかの実施形態では、生成された全長RNA転写物の量は、DNA鋳型の量よりも15~100倍、15~90倍、15~80倍、15~70倍、15~60倍、15~50倍、15~40倍、15~30、15~20倍、20~100倍、20~90倍、20~80倍、20~70倍、20~60倍、20~50倍、20~40倍、または20~30倍大きいものであり得る。いくつかの実施形態において、生成された全長RNA転写物の量は、DNA鋳型の量よりも2倍、3倍、4倍、または5倍大きい。
いくつかの実施形態では、二本鎖混入物:RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成された完全長RNA転写物の比は、1:1未満である。たとえば、二本鎖混入物:生成された完全長RNA転写物の比率は、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1、または0.1:1である。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物は、DNA鋳型と比較して、100ヌクレオチドあたり1未満の変異を有する。例えば、生成されたRNA転写物は、DNA鋳型と比較して、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000ヌクレオチドあたり1未満の変異を有し得る。
RNAポリメラーゼ
RNAポリメラーゼ(DNA依存性RNAポリメラーゼ)は、成長中のRNA鎖の3´末端へのリボヌクレオチドの連続的な付加を触媒する酵素であり(5´→3´方向のRNAの転写)、ヌクレオシド三リン酸(NTP)を酵素の基質として作用し、ヌクレオチドの配列はDNA鋳型によって特定される。転写は、塩基の相補的対合に依存する。二重ヘリックスの2本の鎖は局所的に分離し、分離した鎖の1つは鋳型(DNA鋳型)として機能する。次いで、RNAポリメラーゼは、鋳型中の相補的な塩基によって、DNA鋳型上の遊離ヌクレオチドのアライメントを触媒する。したがって、ポリメラーゼが成長中のRNA鎖の3´末端へのリボヌクレオチドの連続的な追加を触媒する場合、RNAポリメラーゼはRNAポリメラーゼ活性を有するとみなす。
RNAポリメラーゼ(DNA依存性RNAポリメラーゼ)は、成長中のRNA鎖の3´末端へのリボヌクレオチドの連続的な付加を触媒する酵素であり(5´→3´方向のRNAの転写)、ヌクレオシド三リン酸(NTP)を酵素の基質として作用し、ヌクレオチドの配列はDNA鋳型によって特定される。転写は、塩基の相補的対合に依存する。二重ヘリックスの2本の鎖は局所的に分離し、分離した鎖の1つは鋳型(DNA鋳型)として機能する。次いで、RNAポリメラーゼは、鋳型中の相補的な塩基によって、DNA鋳型上の遊離ヌクレオチドのアライメントを触媒する。したがって、ポリメラーゼが成長中のRNA鎖の3´末端へのリボヌクレオチドの連続的な追加を触媒する場合、RNAポリメラーゼはRNAポリメラーゼ活性を有するとみなす。
T7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)は、バクテリオファージT7のゲノムによりコードされる99kDaのDNA依存性RNAポリメラーゼであり、T7ファージプロモーターに非常に特異的である。T7 RNAPの構造研究により、N末端ドメインのコンフォメーションが転写の開始段階と伸長段階との間で大きく変化することが示されている。N末端ドメインは、Cヘリックスサブドメイン及びプロモーター結合ドメイン(サブドメインHで分離された2つのセグメントを含む)を含む。プロモーター結合ドメイン及び結合したプロモーターは、8ntRNA転写物の合成の際に約45度回転し、活性部位が拡張して成長中のヘテロ二本鎖を収容しながら、プロモーターの接触の維持が可能となる。Cヘリックスサブドメインは、その伸長コンフォメーションに向かって緩やかに移動するのに対し、サブドメインHは、伸長段階の位置でなく、開始段階の位置のままであり、70オングストローム超離れる。T7 RNAP開始及び伸長複合体の構造の比較により、N末端267残基(N末端ドメイン)内の大きなコンフォメーション変化及びRNAPの残部のわずかな変化が明らかになった。プロモーター結合ドメインの剛体回転ならびに末端Cヘリックス(残基28~71)及びH(残基151~190)サブドメインのリフォールディングは、プロモーター結合部位の廃棄、活性部位の拡張、及びRNA転写物の出口トンネルの作出に関与している。N末端ドメイン内の構造変化は、伸長複合体の安定性の増加及び加工性の主な要因である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Durniak,K.J.et al.,Science 322(5901): 553-557,2008,を参照のこと)。
いくつかの態様では、RNAP開始複合体からRNAP伸長複合体へのコンフォメーション変化を促進するRNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAPバリアント)が本明細書で提供される。RNAポリメラーゼバリアントは、RNAポリメラーゼ活性及び対応する野生型RNAポリメラーゼと比較して少なくとも1つの置換を有する酵素である。上に示したように、RNAポリメラーゼは、該ポリメラーゼが成長中のRNA鎖の3´末端へのリボヌクレオチドの連続的な付加を触媒する場合、RNAポリメラーゼ活性を有しているとみなされる。例えば、位置S43(例えば、S43A)またはG47(例えば、G47A)にアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含み、RNAポリメラーゼ活性を維持する酵素は、野生型T7 RNAP(配列番号1)のT7 RNAPバリアントとみなされる。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、野生型RNAポリメラーゼと比較して、RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて、RNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つの三次元ループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸修飾は、野生型アミノ酸と比較して高ヘリックス性向を有する。
ループ構造の例には、T7 RNAポリメラーゼ開始複合体(IC)コンフォメーションのCヘリックス構造中のアミノ酸(aa)42~47(例えば、配列番号1のaa28~71)及びCリンカー構造中のアミノ酸257~262(例えば、配列番号1のアミノ酸258~266)が含まれるが、これらに限定されない。
C末端に少なくとも1つの追加のアミノ酸を含むRNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAPバリアント)も本明細書で提供される。少なくとも1つの追加のアミノ酸は、いくつかの実施形態では、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの追加のアミノ酸は、極性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの追加のアミノ酸は、非極性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの追加のアミノ酸は、グリシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの追加のアミノ酸は、アラニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの追加のアミノ酸は、セリンである。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAXn(配列番号171)を含み、xは任意のアミノ酸であり、nは任意の整数、例えば1~5(例えば、1、2、3、4、または5)である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAGn(配列番号330)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAAn(配列番号331)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFARn(配列番号332)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFANn(配列番号333)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFADn(配列番号334)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFACn(配列番号335)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAEn(配列番号336)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAQn(配列番号302)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAHn(配列番号303)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAIn(配列番号304)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFALn(配列番号305)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAKn(配列番号306)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAMn(配列番号307)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAFn(配列番号308)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAPn(配列番号309)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFASn(配列番号310)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFATn(配列番号311)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAWn(配列番号312)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAYn(配列番号313)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼのC末端は、以下のコンセンサス配列:FAFAVn(配列番号314)を含み、nは任意の整数、例えば1~5である。
いくつかの実施形態では、C末端モチーフ(FAFA(配列番号172)またはFAFAXn
(配列番号171))は、野生型T7 RNAP(例えば、配列番号1)と比較して、880位、881位、882位、または883位のうちの1つ以上にアミノ酸置換を含む。したがって、本開示は、様々なC末端F880A881F882A883
(配列番号172)モチーフを含み、880位、881位、882位、または883位のうちの1つ以上のアミノ酸が、野生型T7 RNAP(例えば、配列番号1)と比較して、追加のC末端アミノ酸(Xn)の有無にかかわらず、少なくとも1つのアミノ酸置換が含まれるように修飾されている。
アミノ酸置換
本開示のRNAポリメラーゼバリアントは、WT RNAポリメラーゼと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有するWT T7 RNAポリメラーゼに関して、43位のセリンは「野生型アミノ酸」とみなされ、43位のセリンのアラニンへの置換は高いヘリックス性向を有する「アミノ酸置換」とみなされる。
本開示のRNAポリメラーゼバリアントは、WT RNAポリメラーゼと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有するWT T7 RNAポリメラーゼに関して、43位のセリンは「野生型アミノ酸」とみなされ、43位のセリンのアラニンへの置換は高いヘリックス性向を有する「アミノ酸置換」とみなされる。
平均的な球状タンパク質は、30%の、最も一般的な種類の二次構造であるαヘリックスを含む。いくつかのアミノ酸は、他のアミノ酸よりもαヘリックスにおいてより頻繁に存在し、この傾向はヘリックス性向として知られている。例えば、Pace,N.C. and Scholtz,J.M.Biophysical Journal,75:422-427(1998)を参照のこと。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、野生型アミノ酸と比較して高いヘリックス性向を有する。一般に、高ヘリックス性向のアミノ酸置換は、ポリメラーゼ配座異性体の集団を伸長複合体へと熱力学的に偏らせるように選択される。相対ΔΔGs(自由エネルギー)は、公に利用可能なソフトウェア(例えば、ワシントン大学のRosetta とシュレディンガーのMaestro)を使用して、IC及び伸長複合体(EC)構造の置換について計算される。次いで、置換は、計算ならびに例えばアミノ酸ヘリックス性向及び/またはポリペプチド骨格phi-psi適合性を含む追加の知識に基づいて選択される。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、WT T7 RNAポリメラーゼ(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有するWT T7 RNAポリメラーゼ)と比較して少なくとも1つ(1つ以上)のアミノ酸置換を含むT7 RNAポリメラーゼバリアントである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、高ヘリックス性向アミノ酸置換である。高ヘリックス性向アミノ酸の例には、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸が含まれる。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、C末端に少なくとも1つの追加のアミノ酸を含むT7 RNAポリメラーゼバリアント(例えば、配列番号99、配列番号100、配列番号294、配列番号295、もしくは配列番号296、または配列番号99、配列番号100、配列番号294、配列番号295、もしくは配列番号296と90%~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列)である。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、WT T7 RNAポリメラーゼと比較して、C末端に少なくとも1つの追加のアミノ酸及びアミノ酸置換を含むT7 RNAポリメラーゼバリアントである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
本明細書では、コンフォメーション平衡を熱力学的にECへと偏らせる/支持する高いまたはより高いヘリックス性向のアミノ酸置換を特定するために使用し得る2つのアプローチが提供される。どちらのアプローチでも、(構造のレビュー、文献検索に基づいて)プロモーターの結合または触媒に直接関与する任意の位置へのアミノ酸置換を避けるように注意が払われる。方法Aでは、専用のソフトウェアを使用して、EC及びICの変異(ΔΔGmut)によるタンパク質折りたたみの自由エネルギーの変化を算定する。望ましい配列位置でのすべての可能なアミノ酸置換は、この方法によって評価される。望ましいアミノ酸置換(すなわち、ICよりもECを好む置換)は、ΔΔGmutの差
が負であるアミノ酸置換である。方法Bでは、IC及びEC二次構造アノテーション(例えば、DSSPソフトウェアを使用したIC及びEC三次構造の3Dモデルから決定される(Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features.Kabsch W,Sander C,Biopolymers.1983 22 2577-2637))は、IC中にループを有し、かつEC中にヘリックスを有する領域を同定するために検査される。次いで、低ヘリックス性向を有する残基(例えばGly)を有する配列位置を高ヘリックス性向のアミノ酸(例えばAla)で置換する。T7 RNAPの場合、例えば、方法A及びBの変異(例えば、置換)オーバーラップ及び方法Bのトップ(top)バリアントを同定した。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸42~47位(E42、S43、Y44、E45、M46、及び/またはG47)のいずれか1つにおける高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位(E42、S43、Y44、E45、M46、及び/またはG47)のいずれか1つにおける高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸42位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸43位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸44位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸45位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸46位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸47位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸42~47位(E42、S43、Y44、E45、M46、及び/またはG47)のいずれか1つにおける高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換である。アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位(E42、S43、Y44、E45、M46、及び/またはG47)のいずれか1つにおける高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸置42位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸43位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸44位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸45位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸46位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸47位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の42位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の43位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の44位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の45位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の46位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の47位におけるアラニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の42位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の43位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の44位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の45位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の46位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の47位におけるアラニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の42位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の43位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の44位のイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の45位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の46位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の47位におけるイソロイシンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の42位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の43位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の44位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の45位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の46位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の47位におけるイソロイシンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の42位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の43位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の44位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の45位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の46位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の47位におけるロイシンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の42位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の43位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の44位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の45位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の46位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の47位におけるロイシンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の42位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の43位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の44位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の45位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の46位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の47位におけるアルギニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の42位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の43位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の44位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の45位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の46位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の47位におけるアルギニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の42位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の43位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の44位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の45位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の46位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の47位におけるメチオニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の42位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の43位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の44位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の45位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の46位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の47位におけるメチオニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の42位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の43位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の44位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の45位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の46位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の47位におけるリジンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の42位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の43位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の44位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の45位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の46位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の47位におけるリジンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の42位におけるグルタミンであるいくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の43位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の44位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の45位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の46位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の47位におけるグルタミンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の42位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の43位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の44位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の45位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の46位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の47位におけるグルタミン酸である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の42位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の43位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の44位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の45位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の46位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の47位におけるグルタミン酸である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位のいずれか1つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の42位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の43位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の44位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の45位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の46位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の47位におけるグルタミン酸である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸257~262位(R257、A258、G259、A260、L261、及び/またはA262)のいずれか1つにおける高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位(R257、A258、G259、A260、L261、及び/またはA262)のいずれか1つにおける高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸257位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸258位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸259位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸260位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸261位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸262位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸257~262位(R257、A258、G259、A260、L261、及び/またはA262)のいずれか1つにおける高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位(R257、A258、G259、A260、L261、及び/またはA262)のいずれか1つにおける高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸257位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸258位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸259位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸260位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸261位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸262位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の257位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の258位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の259位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の260位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の261位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の262位におけるアラニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の257位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の258位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の259位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の260位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の261位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の262位におけるアラニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の257位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の258位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の259位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の260位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の261位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の262位におけるイソロイシンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の257位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の258位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の259位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の260位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の261位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の262位におけるイソロイシンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるロイシンであるアミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の257位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の258位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の259位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の260位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の261位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の262位におけるロイシンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の257位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の258位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の259位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の260位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の261位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の262位におけるロイシンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸257~262位のいずれか1つのアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の257位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の258位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の259位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の260位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の261位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の262位におけるアルギニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸257~262位のいずれか1つのアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の257位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の258位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の259位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の260位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の261位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の262位におけるアルギニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の257位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の258位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の259位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の260位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の261位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の262位におけるメチオニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸257~262位のいずれか1つのメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の257位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の258位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の259位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の260位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の261位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の262位におけるメチオニンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸257~262位のいずれか1つのリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の257位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の258位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の259位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の260位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の261位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の262位におけるリジンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸257~262位のいずれか1つのリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の257位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の258位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の259位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の260位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の261位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の262位におけるリジンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の257位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の258位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の259位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の260位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の261位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の262位におけるグルタミンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の257位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の258位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の259位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の260位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の261位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の262位におけるグルタミンである。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の257位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の258位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の259位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の260位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の261位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号1の262位におけるグルタミン酸である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸257~262位のいずれか1つのグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸257~262位のいずれか1つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の257位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の258位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の259位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の260位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の261位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号99、100、294、295、または296の262位におけるグルタミン酸である。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、位置G47、S43、R257、及び/またはG259において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、位置G47、S43、R257、及び/またはG259において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、位置G47、S43、R257、及び/またはG259において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号99、100、294、295、または296のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、位置G47、S43、R257、及び/またはG259において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号2のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号3のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号4のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号5のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号107または108のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号109または110のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号111または112のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、T7 RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号113または114のアミノ酸配列を含む。
少なくとも2つ(2つ以上)の置換を有するRNAポリメラーゼバリアントも本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位(E42、S43、Y44、E45、M46、及び/またはG47)及び/またはアミノ酸257~262位(R257、A258、G259、A260、L261、及び/またはA262)のいずれか1つにおける少なくとも2つの高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換を含む。
例えば、RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のE42及びS43、E42及びY44、E42及びE45、E42及びM46、E42及びG47、S43及びY44、S43及びE45、S43及びM46、S43及びG47、Y44及びE45、Y44及びM46、Y44及びG47、E45及びM46、E45及びG47、またはM46及びG47におけるアミノ酸置換(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)を含み得る。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のR257及びA258、R257及びG259、R257及びA260、R257及びL261、R257及びA262、A258及びG259、A258及びA260、A258及びL261、A258及びA262、G259及びA260、G259及びL261、G259及びA262、A260及びL261、A260及びA262、またはL261及びA262におけるアミノ酸置換(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)を含み得る。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のE42及びR257、E42及びA258、E42及びG259、E42及びA260、E42及びL261、E42及びA262、S43及びR257、S43及びA258、S43及びG259、S43及びA260、S43及びL261、S43及びA262、Y44及びR257、Y44及びA258、Y44及びG259、Y44及びA260、Y44及びL261、Y44及びA262、E45及びR257、E45及びA258、E45及びG259、E45及びA260、E45及びL261、E45及びA262、M46及びR257、M46及びA258、M46及びG259、M46及びA260、M46及びL261、M46及びA262、G47及びR257、G47及びA258、G47及びG259、G47及びA260、G47及びL261、またはG47及びA262におけるアミノ酸置換(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)を含み得る。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のS43A及びG47Aにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のS43A及びR257Aにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のS43A及びG259Aにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のG47A及びR257Aにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のG47A及びR257Aにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のR257A及びG259Aにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のG47A及びG259Aにおけるアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位(E42、S43、Y44、E45、M46、及び/またはG47)及び/またはアミノ酸257~262位(R257、A258、G259、A260、L261、及び/またはA262)のいずれか1つにおける少なくとも3つ(もしくは少なくとも4つ、または少なくとも5つ)の高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換を含む。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、E42R、S43A、S43E、S43L、S43R、E45R、E45L、M46A、G47A、G47E、G47L、G47R、N165W、E167M、E167N、E168I、E168T、E168V、A181F、A181W、G184M、E187F、A255Q、A255K、A255I、A255Y、R257A、R257E、R257L、R257W、G259A、G259E、G259L、G259R、A260W、及びA260Rから選択される、配列番号1または配列番号1と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列における少なくとも1つ(もしくは少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つ、もしくは少なくとも4つ、または少なくとも5つ)のアミノ酸置換(複数可)を含む。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位(E42、S43、Y44、E45、M46、及び/またはG47)及び/またはアミノ酸257~262位(R257、A258、G259、A260、L261、及び/またはA262)のいずれか1つにおける少なくとも2つの高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換を含む。
例えば、RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸位置E42及びS43、E42及びY44、E42及びE45、E42及びM46、E42及びG47、S43及びY44、S43及びE45、S43及びM46、S43及びG47、Y44及びE45、Y44及びM46、Y44及びG47、E45及びM46、E45及びG47、またはM46及びG47におけるアミノ酸置換(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)を含み得る。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸位置R257及びA258、R257及びG259、R257及びA260、R257及びL261、R257及びA262、A258及びG259、A258及びA260、A258及びL261、A258及びA262、G259及びA260、G259及びL261、G259及びA262、A260及びL261、A260及びA262、またはL261及びA262におけるアミノ酸置換(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)を含む。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸位置E42及びR257、E42及びA258、E42及びG259、E42及びA260、E42及びL261、E42及びA262、S43及びR257、S43及びA258、S43及びG259、S43及びA260、S43及びL261、S43及びA262、Y44及びR257、Y44及びA258、Y44及びG259、Y44及びA260、Y44及びL261、Y44及びA262、E45及びR257、E45及びA258、E45及びG259、E45及びA260、E45及びL261、E45及びA262、M46及びR257、M46及びA258、M46及びG259、M46及びA260、M46及びL261、M46及びA262、G47及びR257、G47及びA258、G47及びG259、G47及びA260、G47及びL261、またはG47及びA262におけるアミノ酸置換(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)を含む。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換S43A及びG47Aを含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換S43A及びR257Aを含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換S43A及びG259Aを含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換G47A及びR257Aを含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換G47A及びR257Aを含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換R257A及びG259Aを含む。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換G47A及びG259Aを含む。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、配列番号99、100、294、295、または296または配列番号99、100、294、295、または296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸42~47位(E42、S43、Y44、E45、M46、及び/またはG47)及び/またはアミノ酸257~262位(R257、A258、G259、A260、L261、及び/またはA262)のいずれか1つにおける少なくとも3つ(もしくは少なくとも4つ、または少なくとも5つ)の高ヘリックス性向アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸)置換を含む。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、E42R、S43A、S43E、S43L、S43R、E45R、E45L、M46A、G47A、G47E、G47L、G47R、N165W、E167M、E167N、E168I、E168T、E168V、A181F、A181W、G184M、E187F、R257A、R257E、R257L、R257W、G259A、G259E、G259L、G259R、A260W、及びA260Rから選択される、配列番号99、100、294、295、もしくは296または配列番号99、100、294、295、もしくは296と90~99%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列における少なくとも1つ(もしくは少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つ、もしくは少なくとも4つ、または少なくとも5つ)のアミノ酸置換(複数可)を含む。
いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼバリアントは、E42R、S43A、S43E、S43L、S43R、E45R、E45L、M46A、G47A、G47E、G47L、G47R、N165W、E167M、E167N、E168I、E168T、E168V、A181F、A181W、G184M、E187F、R257A、R257E、R257L、R257W、G259A、G259E、G259L、G259R、A260W、及びA260Rから選択される、少なくとも1つ(もしくは少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つ、もしくは少なくとも4つ、または少なくとも5つ)のアミノ酸置換(複数可)を含み、少なくとも1つ(もしくは少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つ、もしくは少なくとも4つ、または少なくとも5つ)の他のアミノ酸置換(例えば、本明細書に提供されていないアミノ酸置換)をさらに含む。
したがって、本開示は、E42R、S43A、S43E、S43L、S43R、E45R、E45L、M46A、G47A、G47E、G47L、G47R、N165W、E167M、E167N、E168I、E168T、E168V、A181F、A181W、G184M、E187F、A255K、A255Q、A255Y、A255I、R257A、R257E、R257L、R257W、G259A、G259E、G259L、G259R、A260W、及びA260Rから選択される少なくとも1つ(もしくは少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つ、もしくは少なくとも4つ、または少なくとも5つ)のアミノ酸置換(複数可)を含み、配列番号1と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する、RNAポリメラーゼバリアントを包含する。
「同一性」という用語は、配列を比較することにより決定される2つ以上のポリペプチド(例えば酵素)またはポリヌクレオチド(核酸)の配列間の関係を指す。同一性はまた、2つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリング間の一致数によって決定される配列間または配列の間での配列関連性の程度も指す。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム(例えば、「アルゴリズム」)によって指定されたギャップアライメント(存在する場合)を有する2つ以上の配列間の同一性一致のパーセントを測定する。関連するタンパク質または核酸の同一性は、既知の方法で容易に計算することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント(%)(percent(%)identity)」は、配列をアラインさせ、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセントの同一性を達成した後の第2の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸または核酸配列中の残基(アミノ酸残基または核酸残基)のパーセントとして定義される。アライメントのための方法及びコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依るが、計算に導入されるギャップ及びペナルティにより値が異なる場合があることが理解される。一般的に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド(例えば、抗原)のバリアントは、本明細書に記載され、当業者に既知である配列アライメントプログラム及びパラメーターによって決定される特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものに対して、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%であるが、100%未満の配列同一性を有する。そのようなアライメント用ツールには、BLASTスイートのツールが含まれる(Stephen F. Altschul,et al(1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。別の一般的なローカルアライメント手法は、Smith-Watermanアルゴリズムに基づく(Smith,T.F.& Waterman,M.S.(1981)「Identification of common molecular subsequences.」J.Mol.Biol.147:195-197)。ダイナミック(dynamic)プログラミングに基づく一般的なグローバルアライメント手法は、Needleman-Wunschアルゴリズムである(Needleman,S.B.& Wunsch,C.D.(1970)「A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.」J.Mol.Biol.48:443-453)。最近では、Needleman-Wunschアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアライメント手法よりも高速にヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアライメントを生成するといわれる、Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm(FOGSAA)が開発された。
トリヌクレオチドキャップ
リボ核酸(RNA)合成のための共転写キャッピング方法も本明細書で提供される。すなわち、RNAは「ワンポット(one-pot)」反応で生成され、別々のキャッピング反応を必要としない。したがって、本方法は、いくつかの実施形態では、RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をT7 RNAポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む。
リボ核酸(RNA)合成のための共転写キャッピング方法も本明細書で提供される。すなわち、RNAは「ワンポット(one-pot)」反応で生成され、別々のキャッピング反応を必要としない。したがって、本方法は、いくつかの実施形態では、RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をT7 RNAポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む。
キャップ類似体は、例えば、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップであり得る。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、ジヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、トリヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、テトラヌクレオチドキャップである。
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、式(I)の化合物
またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を含み、式中、
環B1は、修飾または未修飾グアニンであり、
環B2及び環B3はそれぞれ独立して、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
X2はO、S(O)p、NR24、またはCR25R26であり、pは0、1、または2であり、
Y0は、OまたはCR6R7であり、
Y1は、O、S(O)n、CR6R7、またはNR8であり、nは0、1、または2であり、
各---は、単結合または不存在であり、各---が単結合の場合、YiはO、S(O)n、CR6R7、またはNR8であり、各---が不存在である場合、Y1は空(void)であり、
Y2は、(OP(O)R4)m(mは0、1、または2である)または-O-(CR40R41)u-Q0-(CR42R43)v-であり、ここで、Q0は結合、O、S(O)r、NR44、またはCR45R46であり、rは0、1、または2であり、u及びvの各々は、独立して、1、2、3または4であり、
各R2及びR2´は、独立して、ハロ、LNA、またはOR3であり、
各R3は、独立して、H、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、またはC2-C6アルキニルであり、R3は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、またはC2-C6アルキニルである場合、ハロ、OH、または1つ以上のOHもしくはOC(O)-C1-C6アルキルで任意選択により置換されたC1-C6アルコキシルのうちの1つ以上で任意選択により置換され、
各R4及びR4´は、独立して、H、ハロ、C1-C6アルキル、OH、SH、SeH、またはBH3 -であり、
R6、R7、及びR8の各々は、独立して、-Q1-T1であり、ここで、Q1は、結合、またはハロ、シアノ、OH、及びC1-C6アルコキシのうちの1つ以上で任意選択により置換されたC1-C3アルキルリンカーであり、T1は、H、ハロ、OH、COOH、シアノ、またはRs1であり、ここで、Rs1は、C1-C3アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、C1-C6アルコキシル、C(O)O-C1-C6アルキル、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、NR31R32、(NR31R32R33)+、4~12員のヘテロシクロアルキル、または5もしくは6員のヘテロアリールであり、Rs1は、ハロ、OH、オキソ、C1-C6アルキル、COOH、C(O)O-C1-C6アルキル、シアノ、C1-C6アルコキシル、NR31R32、(NR31R32R33)+、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、4~12員のヘテロシクロアルキル、及び5または6員のヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意選択により置換され、
R10、R11、R12、R13R14、及びR15の各々は、独立して、-Q2-T2であり、ここで、Q2は、結合、またはハロ、シアノ、OH、及びC1-C6アルコキシのうちの1つ以上で任意選択により置換されたC1-C3アルキルリンカーであり、T2は、H、ハロ、OH、NH2、シアノ、NO2、N3、Rs2、またはORs2であり、ここで、Rs2は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、NHC(O)-C1-C6アルキル、NR31R32、(NR31R32R33)+、4~12員のヘテロシクロアルキル、または5もしくは6員のヘテロアリールあり、Rs2は、ハロ、OH、オキソ、C1-C6アルキル、COOH、C(O)O-C1-C6アルキル、シアノ、C1-C6アルコキシル、NR31R32、(NR31R32R33)+、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール,4~12員のヘテロシクロアルキル、及び5または6員のヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意選択により置換され、あるいはR12はR14と一緒にオキソであり、またはR13はR15と一緒にオキソであり、
R20、R21、R22、及びR23の各々は、独立して、-Q3-T3であり、ここで、Q3は、結合、またはハロ、シアノ、OH、及びC1-C6アルコキシのうちの1つ以上で任意選択により置換されたC1-C3アルキルリンカーであり、T3は、H、ハロ、OH、NH2、シアノ、NO2、N3、RS3、またはORS3であり、ここで、RS3は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、NHC(O)-C1-C6アルキル、モノ-C1-C6アルキルアミノ、ジ-C1-C6アルキルアミノ、4~12員のヘテロシクロアルキル、または5もしくは6員のヘテロアリールあり、Rs3は、ハロ、OH、オキソ、C1-C6アルキル、COOH、C(O)O-C1-C6アルキル、シアノ、C1-C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1-C6アルキルアミノ、ジ-C1-C6アルキルアミノ、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、4~12員のヘテロシクロアルキル、及び5または6員のヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意選択により置換され、
R24、R25、及びR26の各々は、独立して、HまたはC1-C6アルキルであり、
R27及びR28の各々は、独立して、HまたはOR29であり、あるいはR27及びR28は一緒になって、O-R30-Oを形成し、各R29は、独立して、H、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、またはC2-C6アルキニルであり、R29、は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、またはC2-C6アルキニルである場合、ハロ、OH、または1つ以上のOHもしくはOC(O)-C1-C6アルキルで任意選択により置換されたC1-C6アルコキシルのうちの1つ以上で任意選択により置換され、
R30は、ハロ、OH、及びC1-C6アルコキシルのうちの1つ以上で任意選択により置換されたC1-C6アルキレンであり、
R31、R32、及びR33の各々は、独立して、H、C1-C6アルキル、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、4~12員のヘテロシクロアルキル、または5または6員のヘテロアリールであり、
R40、R41、R42、及びR43の各々は、独立して、H、ハロ、OH、シアノ、N3、OP(O)R47R48、または1つ以上のOP(O)R47R48で任意選択により置換されたC1-C6アルキルであり、あるいは1つのR41及び1つのR43は、それらが結合している炭素原子及びQ0と一緒になって、C4-C10シクロアルキル、4~14員のヘテロシクロアルキル、C6-C10アリール、または5~14員のヘテロアリールを形成し、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または5~6員のヘテロアリールの各々は、OH、ハロ、シアノ、N3、オキソ、OP(O)R47R48、C1-C6アルキル、C1-C6ハロアルキル、COOH、C(O)O-C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシル、C1-C6ハロアルコキシル、アミノ、モノ-C1-C6アルキルアミノ、及びジ-C1-C6アルキルアミノのうちの1つ以上で任意選択により置換され、
R44は、H、C1-C6アルキル、またはアミン保護基であり、
R45及びR46の各々は、独立して、H、OP(O)R47R48、または1つ以上のOP(O)R47R48で任意選択により置換されたC1-C6アルキルであり、
R47及びR48の各々は、独立して、H、ハロ、C1-C6アルキル、OH、SH、SeH、またはBH3 -である。
環B2及び環B3はそれぞれ独立して、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
X2はO、S(O)p、NR24、またはCR25R26であり、pは0、1、または2であり、
Y0は、OまたはCR6R7であり、
Y1は、O、S(O)n、CR6R7、またはNR8であり、nは0、1、または2であり、
各---は、単結合または不存在であり、各---が単結合の場合、YiはO、S(O)n、CR6R7、またはNR8であり、各---が不存在である場合、Y1は空(void)であり、
Y2は、(OP(O)R4)m(mは0、1、または2である)または-O-(CR40R41)u-Q0-(CR42R43)v-であり、ここで、Q0は結合、O、S(O)r、NR44、またはCR45R46であり、rは0、1、または2であり、u及びvの各々は、独立して、1、2、3または4であり、
各R2及びR2´は、独立して、ハロ、LNA、またはOR3であり、
各R3は、独立して、H、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、またはC2-C6アルキニルであり、R3は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、またはC2-C6アルキニルである場合、ハロ、OH、または1つ以上のOHもしくはOC(O)-C1-C6アルキルで任意選択により置換されたC1-C6アルコキシルのうちの1つ以上で任意選択により置換され、
各R4及びR4´は、独立して、H、ハロ、C1-C6アルキル、OH、SH、SeH、またはBH3 -であり、
R6、R7、及びR8の各々は、独立して、-Q1-T1であり、ここで、Q1は、結合、またはハロ、シアノ、OH、及びC1-C6アルコキシのうちの1つ以上で任意選択により置換されたC1-C3アルキルリンカーであり、T1は、H、ハロ、OH、COOH、シアノ、またはRs1であり、ここで、Rs1は、C1-C3アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、C1-C6アルコキシル、C(O)O-C1-C6アルキル、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、NR31R32、(NR31R32R33)+、4~12員のヘテロシクロアルキル、または5もしくは6員のヘテロアリールであり、Rs1は、ハロ、OH、オキソ、C1-C6アルキル、COOH、C(O)O-C1-C6アルキル、シアノ、C1-C6アルコキシル、NR31R32、(NR31R32R33)+、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、4~12員のヘテロシクロアルキル、及び5または6員のヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意選択により置換され、
R10、R11、R12、R13R14、及びR15の各々は、独立して、-Q2-T2であり、ここで、Q2は、結合、またはハロ、シアノ、OH、及びC1-C6アルコキシのうちの1つ以上で任意選択により置換されたC1-C3アルキルリンカーであり、T2は、H、ハロ、OH、NH2、シアノ、NO2、N3、Rs2、またはORs2であり、ここで、Rs2は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、NHC(O)-C1-C6アルキル、NR31R32、(NR31R32R33)+、4~12員のヘテロシクロアルキル、または5もしくは6員のヘテロアリールあり、Rs2は、ハロ、OH、オキソ、C1-C6アルキル、COOH、C(O)O-C1-C6アルキル、シアノ、C1-C6アルコキシル、NR31R32、(NR31R32R33)+、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール,4~12員のヘテロシクロアルキル、及び5または6員のヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意選択により置換され、あるいはR12はR14と一緒にオキソであり、またはR13はR15と一緒にオキソであり、
R20、R21、R22、及びR23の各々は、独立して、-Q3-T3であり、ここで、Q3は、結合、またはハロ、シアノ、OH、及びC1-C6アルコキシのうちの1つ以上で任意選択により置換されたC1-C3アルキルリンカーであり、T3は、H、ハロ、OH、NH2、シアノ、NO2、N3、RS3、またはORS3であり、ここで、RS3は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、NHC(O)-C1-C6アルキル、モノ-C1-C6アルキルアミノ、ジ-C1-C6アルキルアミノ、4~12員のヘテロシクロアルキル、または5もしくは6員のヘテロアリールあり、Rs3は、ハロ、OH、オキソ、C1-C6アルキル、COOH、C(O)O-C1-C6アルキル、シアノ、C1-C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1-C6アルキルアミノ、ジ-C1-C6アルキルアミノ、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、4~12員のヘテロシクロアルキル、及び5または6員のヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意選択により置換され、
R24、R25、及びR26の各々は、独立して、HまたはC1-C6アルキルであり、
R27及びR28の各々は、独立して、HまたはOR29であり、あるいはR27及びR28は一緒になって、O-R30-Oを形成し、各R29は、独立して、H、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、またはC2-C6アルキニルであり、R29、は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、またはC2-C6アルキニルである場合、ハロ、OH、または1つ以上のOHもしくはOC(O)-C1-C6アルキルで任意選択により置換されたC1-C6アルコキシルのうちの1つ以上で任意選択により置換され、
R30は、ハロ、OH、及びC1-C6アルコキシルのうちの1つ以上で任意選択により置換されたC1-C6アルキレンであり、
R31、R32、及びR33の各々は、独立して、H、C1-C6アルキル、C3-C8シクロアルキル、C6-C10アリール、4~12員のヘテロシクロアルキル、または5または6員のヘテロアリールであり、
R40、R41、R42、及びR43の各々は、独立して、H、ハロ、OH、シアノ、N3、OP(O)R47R48、または1つ以上のOP(O)R47R48で任意選択により置換されたC1-C6アルキルであり、あるいは1つのR41及び1つのR43は、それらが結合している炭素原子及びQ0と一緒になって、C4-C10シクロアルキル、4~14員のヘテロシクロアルキル、C6-C10アリール、または5~14員のヘテロアリールを形成し、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または5~6員のヘテロアリールの各々は、OH、ハロ、シアノ、N3、オキソ、OP(O)R47R48、C1-C6アルキル、C1-C6ハロアルキル、COOH、C(O)O-C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシル、C1-C6ハロアルコキシル、アミノ、モノ-C1-C6アルキルアミノ、及びジ-C1-C6アルキルアミノのうちの1つ以上で任意選択により置換され、
R44は、H、C1-C6アルキル、またはアミン保護基であり、
R45及びR46の各々は、独立して、H、OP(O)R47R48、または1つ以上のOP(O)R47R48で任意選択により置換されたC1-C6アルキルであり、
R47及びR48の各々は、独立して、H、ハロ、C1-C6アルキル、OH、SH、SeH、またはBH3 -である。
本明細書で提供されるキャップ類似体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2017年4月20日に公開された国際公開WO2017/066797に記載のキャップ類似体のいずれかを含み得ることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、B2中間位置は、アラビノースなどの非リボース分子であり得る。
いくつかの実施形態では、R2はエチル系である。
したがって、いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む:
他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む:
さらに他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む:
さらに他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む:
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列:GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG、及びGUUから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GAAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GACを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GAGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GAUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GCAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GCCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GCGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GCUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GGAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GGCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GGGを含むいくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GGUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GUAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GUCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GUGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GUUを含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列:m7GpppApA、m7GpppApC、m7GpppApG、m7GpppApU、m7GpppCpA、m7GpppCpC、m7GpppCpG、m7GpppCpU、m7GpppGpA、m7GpppGpC、m7GpppGpG、m7GpppGpU、m7GpppUpA、m7GpppUpC、m7GpppUpG、及びm7GpppUpUから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppApAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppApCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppApGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppApUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppCpAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppCpCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppCpGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppCpUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppGpAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppGpCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppGpGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppGpUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppUpAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppUpCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppUpGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppUpUを含む。
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列:m7G3′OMepppApA、m7G3′OMepppApC、m7G3′OMepppApG、m7G3′OMepppApU、m7G3′OMepppCpA、m7G3′OMepppCpC、m7G3′OMepppCpG、m7G3′OMepppCpU、m7G3′OMepppGpA、m7G3′OMepppGpC、m7G3′OMepppGpG、m7G3′OMepppGpU、m7G3′OMepppUpA、m7G3′OMepppUpC、m7G3′OMepppUpG、及びm7G3′OMepppUpUから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppApAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppApCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppApGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppApUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppCpAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppCpCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppCpGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppCpUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppGpAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppGpCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppGpGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppGpUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppUpAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppUpCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppUpGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppUpUを含む。
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列:m7G3′OMepppA2′OMepA、m7G3′OMepppA2′OMepC、m7G3′OMepppA2′OMepG、m7G3′OMepppA2′OMepU、m7G3′OMepppC2′OMepA、m7G3′OMepppC2′OMepC、m7G3′OMepppC2′OMepG、m7G3′OMepppC2′OMepU、m7G3′OMepppG2′OMepA、m7G3′OMepppG2′OMepC、m7G3′OMepppG2′OMepG、m7G3′OMepppG2′OMepU、m7G3′OMepppU2′OMepA、m7G3′OMepppU2′OMepC、m7G3′OMepppU2′OMepG、及びm7G3′OMepppU2′OMepUから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppA2′OMepAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppA2′OMepCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppA2′OMepGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppA2′OMepUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppC2′OMepAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppC2′OMepCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppC2′OMepGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppC2′OMepUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppG2′OMepAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppG2′OMepCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppG2′OMepGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppG2′OMepUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppU2′OMepAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppU2′OMepCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppU2′OMepGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7G3′OMepppU2′OMepUを含む。
トリヌクレオチドキャップは、さらにいくつかの実施形態では、以下の配列:m7GpppA2′OMepA、m7GpppA2′OMepC、m7GpppA2′OMepG、m7GpppA2′OMepU、m7GpppC2′OMepA、m7GpppC2′OMepC、m7GpppC2′OMepG、m7GpppC2′OMepU、m7GpppG2′OMepA、m7GpppG2′OMepC、m7GpppG2′OMepG、m7GpppG2′OMepU、m7GpppU2′OMepA、m7GpppU2′OMepC、m7GpppU2′OMepG、及びm7GpppU2′OMepUから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppA2′OMepAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppA2′OMepCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppA2′OMepGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppA2′OMepUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppC2′OMepAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppC2′OMepCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppC2′OMepGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppC2′OMepUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppG2′OMepAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppG2′OMepCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppG2′OMepGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppG2′OMepUを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppU2′OMepAを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppU2′OMepCを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppU2′OMepGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppU2′OMepUを含む。
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GAGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GCGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GUGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、GGGを含む。
インビトロ転写方法
本開示のいくつかの態様は、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型をRNAポリメラーゼ(例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアントなどのT7 RNAポリメラーゼ)と接触させることを含む、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)を生成(合成)する方法を提供する。
本開示のいくつかの態様は、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型をRNAポリメラーゼ(例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアントなどのT7 RNAポリメラーゼ)と接触させることを含む、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)を生成(合成)する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法は、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を、S43A置換を有するT7 RNAポリメラーゼ(例えば、配列番号1、99、または100)バリアント(例えば、S43A T7 RNAPバリアントまたはS43A* T7 RNAPバリアント)と接触させることを含む。他の実施形態では、本方法は、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を、G47A置換を有するT7 RNAポリメラーゼ(例えば、配列番号1、99、または100)バリアント(例えば、G47A T7 RNAPバリアントまたはG47A* T7 RNAPバリアント)と接触させることを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を、R257A置換を有するT7 RNAポリメラーゼ(例えば、配列番号1、99、または100)バリアント(例えば、R257A T7 RNAPバリアントまたはR257A* T7 RNAPバリアント)と接触させることを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を、G259A置換を有するT7 RNAポリメラーゼ(例えば、配列番号1、99、または100)バリアント(例えば、G259A T7 RNAPバリアントまたはG259A* T7 RNAPバリアント)と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、DNA鋳型を(少なくとも1つの)追加のC末端アミノ酸(例えば、Gly、Ala、GlyGly、AlaAla、GlyAla、またはAlaGly)を含むT7 RNAポリメラーゼバリアントと接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、DNA鋳型を、E42R、S43A、S43E、S43L、S43R、E45R、E45L、M46A、G47A、G47E、G47L、G47R、N165W、E167M、E167N、E168I、E168T、E168V、A181F、A181W、G184M、E187F、A255Q、A255K、A255I、A255Y、R257A、R257E、R257L、R257W、G259A、G259E、G259L、G259R、A260W、またはA260R置換、または前述の置換のうちの2つ以上及び任意選択による追加のC末端アミノ酸(例えば、Gly、Ala、GlyGly、AlaAla、GlyAla、またはAlaGly)の任意の組み合わせを含むT7 RNAポリメラーゼバリアントと接触させることを含む。
いくつかの態様では、本開示は、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、DNA鋳型をRNAポリメラーゼ(例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアントなどのT7 RNAポリメラーゼ)と接触させることを含む、IVT反応を行う方法を提供する。
本開示の他の態様は、インビトロ転写物を生成するための条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をT7 RNAポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させてRNA転写物を生成することを含む、共転写キャッピング方法を提供する。
いくつかの実施形態では、RNA合成のための共転写キャッピング方法は、RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を(a)T7 RNAポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、該RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、該T7 RNAポリメラーゼバリアント、(b)ヌクレオシド三リン酸、及び(c)配列GpppA2′OmepGを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む。
IVT条件は、典型的には、プロモーター、ヌクレオシド三リン酸、ジチオトレイトール(DTT)及びマグネシウムイオンを含む緩衝系、ならびにRNAポリメラーゼを含む精製した線形DNA鋳型を必要とする。転写反応で使用される正確な条件は、特定の用途に必要なRNAの量に依拠する。典型的なIVT反応は、転写緩衝液中でDNA鋳型をRNAポリメラーゼ及びGTP、ATP、CTP、UTP(またはヌクレオチド類似体)を含むヌクレオシド三リン酸とともにインキュベートすることにより行われる。5´末端グアノシン三リン酸を有するRNA転写物は、この反応から生成される。
デオキシリボ核酸(DNA)は、単にRNAポリメラーゼの核酸鋳型である。DNA鋳型は、目的のポリペプチド(例えば、抗原性ポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドを含み得る。DNA鋳型は、いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから5´に位置し、該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたRNAポリメラーゼプロモーター(例えば、T7 RNAポリメラーゼプロモーター)を含む。DNA鋳型は、目的の遺伝子の3´末端に位置するポリアデニル化(ポリA)テールをコードするヌクレオチド配列も含み得る。
目的のポリペプチドには、生物製剤、抗体、抗原(ワクチン)、及び治療用タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。「タンパク質」という用語には、ペプチドが包含される。
RNA転写物は、いくつかの実施形態では、IVT反応の産物である。RNA転写物は、いくつかの実施形態では、ポリA尾部に連結された目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むメッセンジャーRNA(mRNA)である。いくつかの実施形態では、mRNAは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む修飾されたmRNA(mmRNA)である。
ヌクレオチドは、窒素塩基、五炭糖(リボースまたはデオキシリボース)、及び少なくとも1つのリン酸基を含む。ヌクレオチドには、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸が含まれる。ヌクレオシド一リン酸(NMP)には、リボースに結合した核酸塩基及び1つのリン酸が含まれる。ヌクレオシド二リン酸(NDP)には、リボースに結合した核酸塩基及び2つのリン酸が含まれる。ヌクレオシド三リン酸(NTP)には、リボースに結合した核酸塩基及び3つのリン酸が含まれる。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの一般構造を有するか、またはヌクレオチドに構造的に類似した化合物である。ヌクレオチド類似体には、例えば、核酸塩基の類似体、糖の類似体、及び/またはヌクレオチドのリン酸基(複数可)の類似体が含まれる。
ヌクレオシドは、窒素塩基及び五炭糖を含む。したがって、ヌクレオシドとリン酸基とにより、ヌクレオチドとなる。ヌクレオシド類似体は、ヌクレオシドの一般構造を有するか、またはヌクレオシドに構造的に類似した化合物である。例えば、ヌクレオシド類似体には、核酸塩基の類似体及び/またはヌクレオシドの糖の類似体が含まれる。
「ヌクレオチド」という用語には、別段で明記しない限り、天然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド、及び修飾ヌクレオチドが含まれることを理解されたい。本明細書で提供される、例えばIVT反応においてRNAの生成に使用される天然に存在するヌクレオチドの例には、アデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、ウリジン三リン酸(UTP)、及び5-メチルウリジン三リン酸(m5UTP)が含まれる。いくつかの実施形態では、アデノシン二リン酸(ADP)、グアノシン二リン酸(GDP)、シチジン二リン酸(CDP)、及び/またはウリジン二リン酸(UDP)が使用される。
ヌクレオチド類似体の例には、抗ウイルスヌクレオチド類似体、リン酸類似体(可溶性または固定化(immobilized)、加水分解性または非加水分解性)、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、例えば、キャップ類似体、または酵素キャッピングの前駆体/基質(ワクシニアまたはリガーゼ)、キャップもしくは5´部分(IRES)のライゲーション/コンジュゲーションを促進するための官能基で標識されたヌクレオチド、キャップもしくは5´部分のライゲーションを促進するための5′PO4で標識されたヌクレオチド、または化学的もしくは酵素的に切断することができる官能基/保護基で標識されたヌクレオチが含まれるが、これらに限定されない。抗ウイルスヌクレオチド/ヌクレオシド類似体の例には、ガンシクロビル、エンテカビル、テルビブジン、ビダラビン、及びシドフォビルが含まれるが、これらに限定されない。
修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。例えば、本開示のRNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、シュードウリジン(ψ)、1-メチルシュードウリジン(m1ψ)、1-エチルシュードウリジン、2-チオウリジン、4´-チオウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-シュードウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン(mo5U)、及び2´-O-メチルウリジンから選択される修飾核酸塩基を含み得る。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)には、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも2つ(例えば、2、3、4つまたはそれ以上)の組み合わせが含まれる。
本明細書で提供されるヌクレオシド三リン酸(NTP)は、非修飾もしくは修飾ATP、修飾もしくは非修飾UTP、修飾もしくは非修飾GTP、及び/または修飾もしくは非修飾CTPを含み得る。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、非修飾ATPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、修飾ATPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、非修飾UTPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、修飾UTPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、非修飾GTPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、修飾GTPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、非修飾CTPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、修飾CTPを含む。
IVT反応において存在するヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体の濃度は変動し得る。いくつかの実施形態では、NTP及びキャップ類似体は、反応において等モル濃度で存在する。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体(例えば、トリヌクレオチドキャップ)とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、1:1より大きい。例えば、反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、または100:1であり得る。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体(例えば、トリヌクレオチドキャップ)とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、1:1未満である。例えば、反応におけるキャップ類似体(例えば、トリヌクレオチドキャップ)とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、または1:100であり得る。
IVT反応におけるNTPの組成も変化し得る。例えば、ATPは、GTP、CTP、及びUTPより超過して使用され得る。非限定的な例として、IVT反応には、7.5ミリモルのGTP、7.5ミリモルのCTP、7.5ミリモルのUTP、及び3.75ミリモルのATPが含まれ得る。同じIVT反応には、3.75ミリモルのキャップ類似体(例えば、トリヌクレオチドキャップ)が含まれ得る。いくつかの実施形態では、G:C:U:A:キャップのモル比は、1:1:1:0.5:0.5である。いくつかの実施形態では、G:C:U:A:キャップのモル比は、1:1:0.5:1:0.5である。いくつかの実施形態では、G:C:U:A:キャップのモル比は、1:0.5:1:1:0.5である。いくつかの実施形態では、G:C:U:A:キャップのモル比は、0.5:1:1:1:0.5である。
いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)には、シュードウリジン(ψ)、1-メチルシュードウリジン(m1ψ)、5-メトキシウリジン(mo5U)、5-メチルシチジン(m5C)、α-チオグアノシン、及びα-チオアデノシンから選択される修飾核酸塩基が含まれる。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)には、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも2つ(例えば、2、3、4つまたはそれ以上)の組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えばmRNA転写物)には、シュードウリジン(ψ)が含まれる。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)には、1-メチルシュードウリジン(m1ψ)が含まれる。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)には、5-メトキシウリジン(mo5U)が含まれる。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)には、5-メチルシチジン(m5C)が含まれる。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)には、α-チオ-グアノシンが含まれる。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)には、α-チオ-アデノシンが含まれる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、特定の修飾のために均一に修飾される(例えば、完全に修飾される、配列全体にわたって修飾される)。例えば、ポリヌクレオチドを1-メチルシュードウリジン(m1ψ)で均一に修飾することができ、このことは、mRNA配列中のすべてのウリジン残基が1-メチルシュードウリジン(m1ψ)で置換されることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記のもののうちのいずれかなどの修飾残基での置換により、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について均一に修飾することができる。あるいは、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、均一に修飾されていなくてもよい(例えば、部分的に修飾され、配列の一部が修飾されている)。各々の選択肢は、本発明の別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリス(tris)を含む。例えば、IVT反応で使用されるトリスの濃度は、少なくとも10mM、少なくとも20mM、少なくとも30mM、少なくとも40mM、少なくとも50mM、少なくとも60mM、少なくとも70mM、少なくとも80mM、少なくとも90mM、少なくとも100mM、または少なくとも110mMのリン酸塩である。いくつかの実施形態では、リン酸塩の濃度は、20~60mMまたは10~100mMである。
いくつかの実施形態では、緩衝系は、ジチオトレイトール(DTT)を含む。IVT反応で使用されるDTTの濃度は、例えば、少なくとも1mM、少なくとも5mM、または少なくとも50mMであり得る。いくつかの実施形態では、IVT反応で使用されるDTTの濃度は、1~50mMまたは5~50mMである。いくつかの実施形態では、IVT反応で使用されるDTTの濃度は、5mMである。
いくつかの実施形態では、緩衝系は、マグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応において存在するNTPとマグネシウムイオン(Mg2+;例えばMgCl2)とのモル比は、1:1~1:5である。例えば、NTPとマグネシウムイオンとのモル比は、1:1、1:2、1:3、1:4、または1:5であり得る。
いくつかの実施形態では、IVT反応において存在するNTP及びキャップ類似体(例えば、GAGなどのトリヌクレオチドキャップ)とマグネシウムイオン(Mg2+;例えばMgCl2)とのモル比は、1:1~1:5である。例えば、NTP+トリヌクレオチドキャップ(例えば、GAG)とマグネシウムイオンとのモル比は、1:1、1:2、1:3、1:4、または1:5であり得る。
いくつかの実施形態では、緩衝系は、Tris-HCl、スペルミジン(例えば、1~30mMの濃度)、TRITON(登録商標)X-100(ポリエチレングリコールp-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェニルエーテル)、及び/またはポリエチレングリコール(PEG)を含む。
成長中のRNA鎖の3´末端へのヌクレオシド三リン酸(NTP)の付加は、T7 RNAポリメラーゼなどのポリメラーゼ、例えば、本開示のT7 RNAポリメラーゼバリアントのいずれか1つ以上(例えば、S43A及び/またはG47A)によって触媒される。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼ(例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアント)は、0.01mg/ml~1mg/mlの濃度で反応(例えば、IVT反応)において存在する。例えば、RNAポリメラーゼは、0.01mg/mL、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、または1.0mg/mlの濃度で反応において存在し得る。
驚くべきことに、例えば、インビトロ転写反応において、本明細書で提供されるT7 RNAPバリアント(例えば、E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257、またはG259、例えばS43AまたはG47A)とキャップ類似体(例えば、GpppA2′OmepG)とを組み合わせて使用すると、RNA転写物が生成され、生成されたRNA転写物の80%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の85%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の90%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の95%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の96%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の97%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の98%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたRNA転写物の99%超が機能性キャップを含む。
また、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基または2´-デオキシシチジン残基を含むポリヌクレオチド鋳型を使用すると、RNA転写物が生成され、生成されたRNA転写物の80%超(例えば、85%超、90%超、または95%超)が機能性キャップを含むことが見出されたことは驚くべきことであった。したがって、いくつかの実施形態では、例えばIVT反応で使用されるポリヌクレオチド(例えばDNA)鋳型は、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む。他の実施形態では、例えばIVT反応で使用されるポリヌクレオチド(例えばDNA)鋳型は、鋳型位置+1に2´-デオキシシチジン残基を含む。
用途
本開示に従って生成されたRNA転写物には、mRNA(修飾mRNA及び/または非修飾RNAを含む)、lncRNA、自己複製RNA、環状RNA、CRISPRガイドRNAなどが含まれる。実施形態では、RNAは、ポリペプチド(例えば、治療用ポリペプチド)をコードするRNA(例えばmRNAまたは自己複製RNA)である。したがって、本開示のRNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物は、非常に多くの用途で使用され得る。
本開示に従って生成されたRNA転写物には、mRNA(修飾mRNA及び/または非修飾RNAを含む)、lncRNA、自己複製RNA、環状RNA、CRISPRガイドRNAなどが含まれる。実施形態では、RNAは、ポリペプチド(例えば、治療用ポリペプチド)をコードするRNA(例えばmRNAまたは自己複製RNA)である。したがって、本開示のRNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物は、非常に多くの用途で使用され得る。
例えば、RNA転写物は、目的のポリペプチド、例えば治療用タンパク質、ワクチン抗原などを生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、RNA転写物は、治療用RNAである。治療用mRNAは、治療用タンパク質をコードするmRNAである(「タンパク質」という用語には、ペプチドが包含される)。治療用タンパク質は、宿主細胞または対象における様々な効果を媒介して、疾患を治療し、または疾患の徴候及び症状を改善する。例えば、治療用タンパク質は、欠損または異常なタンパク質を置換し、内因性タンパク質の機能を増強し、細胞に新規機能を提供する(例えば、内因性細胞活性を阻害もしくは活性化し、または別の治療用化合物(例えば、抗体-抗体コンジュゲートなど)のための送達剤として作用する)。治療用mRNAは、以下の疾患及び状態:細菌感染症、ウイルス感染症、寄生虫感染症、細胞増殖障害、遺伝障害、及び自己免疫障害の治療に有用であり得る。他の疾患及び状態が本明細書において包含される。
本明細書で提供されるmRNAによってコードされる目的のタンパク質は、本質的に任意のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、サイトカイン、成長因子、抗体、または融合タンパク質である。治療用タンパク質の非限定的な例には、血液因子(VIII因子及びVII因子など)、補体因子、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)、及びMUT1が含まれる。サイトカインの非限定的な例には、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、リンホカインなどが含まれる。成長因子の非限定的な例には、エリスロポエチン、EGF、PDGF、FGF、TGF、IGF、TNF、CSF、MCSF、GMCSFなどが含まれる。抗体の非限定的な例には、アダリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、イピリムマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、イトリズマブ、トラロキヌマブが含まれる。融合タンパク質の非限定的な例には、例えば、エタネルセプト、アバタセプト、及びベラタセプトが含まれる。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ヒトエリスロポエチン、LDLR(コレステロールの阻害に使用)、またはMUT1(メチルマロン酸血症(MMA)の治療に使用)である。他の実施形態では、mRNAによってコードされる目的のタンパク質は、治療抗体であり、上記抗体を含むがこれらに限定されない。
本明細書に開示されるRNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物は、1つ以上の生物製剤をコードし得る。生物製剤は、重篤なもしくは生命を脅かす疾患または状態の治療、治癒、緩和、予防、または診断に使用され得るポリペプチドベースの分子である。生物学には、特に、アレルゲン抽出物(例えば、アレルギー注射(shot)及び検査用)、血液成分、遺伝子治療製品、移植に使用されるヒト組織または細胞製品、ワクチン、モノクローナル抗体、サイトカイン、成長因子、酵素、血栓溶解剤、及び免疫調整剤が含まれるが、これらに限定されない。
現在市販されているまたは開発中の1つ以上の生物製剤は、本発明のRNAによってコードされ得る。理論に拘束されることを望まないが、既知の生物製剤のコード化ポリヌクレオチドを本開示のRNAに組み込むと、構築設計物の特異性、純度、及び/または選択性に少なくとも部分的に起因して、治療効果の改善がもたらされると考えられる。
本明細書に開示されるRNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物は、1つ以上の抗体をコードし得る。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有する全長抗体を含む)、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び単鎖分子)、及び抗体断片が含まれる。「免疫グロブリン」(Ig)という用語は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体である。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る起こり得る天然に存在する変異及び/または翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。
モノクローナル抗体には、具体的には、重鎖及び/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖(複数可)の残りが、別の抗体に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、キメラ抗体(免疫グロブリン)、及び所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる。キメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、旧世界猿、類人猿など)及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化(primatized)」抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本開示のRNAにコードされる抗体は、血液、心臓血管、CNS、中毒(抗毒素を含む)、皮膚病学、内分泌学、胃腸、医用画像、筋骨格、腫瘍学、免疫学、呼吸器、感覚、及び抗感染症などの多くの治療分野における状態または疾患を治療するために利用され得る。
本明細書に開示されるRNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物は、1つ以上のワクチン抗原をコードし得る。ワクチン抗原は、特定の疾患または感染因子に対する免疫を改善する生物学的製剤である。現在市販されているまたは開発中の1つ以上のワクチン抗原は、本開示のRNAによってコードされ得る。RNAにコードされたワクチン抗原は、がん、アレルギー、感染症などの多くの治療分野における状態または疾患を治療するために利用され得る。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、コンカテマーまたはペプチドエピトープをコードする個々のRNAまたはそれらの組み合わせの形態の個別化されたがんワクチンであり得る。
本明細書に開示されるRNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたRNA転写物は、1つ以上の抗菌ペプチド(AMP)または抗ウイルスペプチド(AVP)をコードするように設計され得る。AMP及びAVPは、限定するものではないが、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚類、及び哺乳類などの広範囲の動物から単離及び記述されている。抗菌ポリペプチドは、細胞融合及び/または1つ以上のエンベロプウイルス(例えば、HIV、HCV)によるウイルス侵入を遮断し得る。例えば、抗菌ポリペプチドは、領域、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、例えばHIV-1 gpl20またはgp41の膜貫通サブユニットの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含むか、またはそれからなることができる。HIV-1 gp120またはgp41のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、例えば、Kuiken et al.,(2008).「HIV Sequence Compendium」,Los Alamos National Laboratoryに記載されている。
いくつかの実施形態では、RNA転写物は、放射標識RNAプローブとして使用される。いくつかの実施形態では、RNA転写物は、非同位体RNA標識のために使用される。いくつかの実施形態では、RNA転写物は、遺伝子ターゲティングのためのガイドRNA(gRNA)として使用される。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA)は、インビトロ翻訳及び微量注入に使用される。いくつかの実施形態では、RNA転写物は、RNA構造、プロセシング、及び触媒研究に使用される。いくつかの実施形態では、RNA転写物は、RNA増幅に使用される。いくつかの実施形態では、RNA転写物は、遺伝子発現実験のためのアンチセンスRNAとして使用される。他の用途が本開示に包含される。
組成物
本開示のT7 RNAPバリアントは、いくつかの実施形態では、IVT反応においてトリヌクレオチドキャップなどのキャップ類似体と組み合わせて使用されるとき、IVT後の精製がなくても、検出可能なサイトカイン応答を誘導しないRNAを生成する。したがって、いくつかの実施形態では、IVT RNA及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、IVT後の精製なしで、サイトカイン誘導RNA混入物を実質的に含まない(例えば、含まないか、または10%未満、1%未満、0.1%未満、または0.01%未満含む)、該組成物が本明細書で提供される。
本開示のT7 RNAPバリアントは、いくつかの実施形態では、IVT反応においてトリヌクレオチドキャップなどのキャップ類似体と組み合わせて使用されるとき、IVT後の精製がなくても、検出可能なサイトカイン応答を誘導しないRNAを生成する。したがって、いくつかの実施形態では、IVT RNA及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、IVT後の精製なしで、サイトカイン誘導RNA混入物を実質的に含まない(例えば、含まないか、または10%未満、1%未満、0.1%未満、または0.01%未満含む)、該組成物が本明細書で提供される。
本明細書の他の箇所で説明するように、本開示のT7 RNAPバリアント及び本開示の方法はRNA転写物を生成し、該転写物の少なくとも80%(例えば、80%~90%、80~95%、90~95%、80~99%、90~99%、または90~100%)は機能的なキャップを含む。したがって、IVT RNA及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物も本明細書で提供され、組成物は、20%(例えば、5~15%、5~10%、1~15%、または1~10%)未満のキャップされていないRNA種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、15%(例えば、5~10%、1~10%、または1~5%)未満のキャップされていないRNA種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、10%未満のキャップされていないRNA種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、5%未満のキャップされていないRNA種を含む。
いくつかの実施形態では、IVT RNAの80%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、IVT RNAの85%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、IVT RNAの90%超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、IVT RNAの95%超が機能性キャップを含む。
いくつかの実施形態では、IVT RNAは化学修飾されていないが、他の実施形態では、IVT RNAは化学修飾されている。
いくつかの実施形態では、予想外に、IVT RNAの80%超が一本鎖完全長転写物を含む。例えば、IVT RNAの85%超が一本鎖完全長転写物を含み得る。いくつかの実施形態では、IVT RNAの90%超が一本鎖完全長転写物を含み、IVT RNAの95%超が一本鎖完全長転写物を含む。
いくつかの実施形態では、RNAは、RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を(a)T7 RNAポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、該RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、該T7 RNAポリメラーゼバリアント、(b)ヌクレオシド三リン酸、及び(c)配列GpppA2′OmepGを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含む方法によって生成され、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む。
キット
本開示のRNAポリメラーゼバリアントを含むインビトロ転写キットなどのキットも本明細書で提供される。キットは、本明細書に記載の任意の1つ以上(少なくとも1つ)のIVT成分及び任意の1つ以上(少なくとも1つ)のRNAポリメラーゼバリアントを含み得る。例えば、キットは、緩衝系、NTP、及び位置E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257、A258、G259、A260、L261及び/またはA262における少なくとも1つ(もしくは少なくとも2つ、または少なくとも3つ)のアミノ酸置換ならびに任意選択によりC末端において少なくとも1つのアミノ酸付加を有する配列番号1、99、または100のアミノ酸配列を有するT7 RNAポリメラーゼバリアントを含み得る。
本開示のRNAポリメラーゼバリアントを含むインビトロ転写キットなどのキットも本明細書で提供される。キットは、本明細書に記載の任意の1つ以上(少なくとも1つ)のIVT成分及び任意の1つ以上(少なくとも1つ)のRNAポリメラーゼバリアントを含み得る。例えば、キットは、緩衝系、NTP、及び位置E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257、A258、G259、A260、L261及び/またはA262における少なくとも1つ(もしくは少なくとも2つ、または少なくとも3つ)のアミノ酸置換ならびに任意選択によりC末端において少なくとも1つのアミノ酸付加を有する配列番号1、99、または100のアミノ酸配列を有するT7 RNAポリメラーゼバリアントを含み得る。
追加の実施形態
本開示の追加の実施形態には、以下の番号の段落のものが包含される:
段落1.リボ核酸(RNA)ポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、前記RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて前記RNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、前記リボ核酸(RNA)ポリメラーゼバリアント。
本開示の追加の実施形態には、以下の番号の段落のものが包含される:
段落1.リボ核酸(RNA)ポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、前記RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて前記RNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、前記リボ核酸(RNA)ポリメラーゼバリアント。
段落2.前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、野生型アミノ酸と比較して高いヘリックス性向を有する、段落1に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落3.前記RNAポリメラーゼが、T7 RNAポリメラーゼである、段落1または2に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落4.前記少なくとも1つのループ構造が、Cヘリックス構造中にある、段落1~3のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落5.前記少なくとも1つのループ構造が、Cリンカー構造中にある、段落1~4のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落6.前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換である、段落1~4のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落7.前記少なくとも1つの高ヘリックス性向酸置換が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸から選択される、段落6に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落8.前記少なくとも1つの高ヘリックス性向アミノ酸置換が、アラニンである、段落7に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落9.前記T7 RNAポリメラーゼが、E42、S43、Y44、E45、M46、G47、R257、及びG259から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号1、配列番号99、または配列番号100によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落4~8のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落10.前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、S43Aを含む、段落9に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落11.前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、G47Aを含む、段落9に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落12.前記T7 RNAポリメラーゼが、R257、A258、G259、A260、L261及びA262から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号1、配列番号99、または配列番号100によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落5~8のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落13.前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、R257Aを含む、段落12に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落14.前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、G259Aを含む、段落12に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
段落15.G47、S43、R257、またはG259の位置における高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号1、配列番号99、または配列番号100によって特定されるアミノ酸配列を含む、T7リボ核酸(RNA)ポリメラーゼ。
段落16.前記高ヘリックス性向アミノ酸が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び/またはグルタミン酸から選択される、段落15に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
17.前記高ヘリックス性向アミノ酸が、アラニンである、段落16に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
段落18.配列番号2、配列番号107、または配列番号108によって特定されるアミノ酸配列を含む、T7 RNAポリメラーゼ。
段落19.配列番号3、配列番号109、または配列番号110によって特定されるアミノ酸配列を含む、T7 RNAポリメラーゼ。
段落20.配列番号4、配列番号111、または配列番号112によって特定されるアミノ酸配列を含む、T7 RNAポリメラーゼ。
段落21.配列番号5、配列番号113、または配列番号114によって特定されるアミノ酸配列を含む、T7 RNAポリメラーゼ。
段落22.RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を段落1~21のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼと接触させることを含む、リボ核酸(RNA)を生成する方法。
段落23.ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を段落1~21のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロ転写(IVT)反応を行う方法。
段落24.前記生成されたRNA転写物が、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、野生型RNAポリメラーゼを使用して生成されたRNAと比較して少なくとも50%低いサイトカイン応答を刺激する、段落23に記載の方法。
段落25.IVTにより生成された前記二本鎖RNA転写物の濃度が、野生型ポリメラーゼを用いて生成されたdsRNA転写物と比較して少なくとも50%低い、段落23~24のいずれか1つに記載の方法。
段落26.前記生成されたRNA転写物の20%未満が、3´不均一性を示す、段落23~25のいずれか1つに記載の方法。
段落27.前記生成されたRNA転写物の50%未満が、切断型RNA転写物である、段落23~26のいずれか1つに記載の方法。
段落28.前記生成されたRNA転写物の50%未満が、ランオンRNA転写物である、段落23~28のいずれか1つに記載の方法。
段落29.前記生成された完全長RNA転写物の量が、前記DNA鋳型の量よりも少なくとも15倍多い、段落23~28のいずれか1つに記載の方法。
段落30.切断型RNA転写物:生成された完全長RNA転写物の比が、1:1未満である、段落23~29のいずれか1つに記載の方法。
段落31.前記生成されたRNA転写物が、前記DNA鋳型と比較して100ヌクレオチドあたり1未満の変異を有する、段落23~30のいずれか1つに記載の方法。
段落32.段落1~21のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼをコードする核酸。
段落33.段落33の核酸を含むベクター。
段落34.段落33に記載の核酸または段落34に記載のベクターを含む宿主細胞。
段落35.段落1~21のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼを含むキット。
段落36.段落1~21のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼを含む組成物。
段落37.段落22~31のいずれか1つに記載の方法で生成されたリボ核酸(RNA)。
段落38.脂質ナノ粒子中に製剤化された段落37に記載のRNA。
段落39.前記脂質ナノ粒子が、20~60%のイオン化可能なアミノ脂質、5~25%の非カチオン性脂質、25~55%のステロール、及び0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む、段落38に記載のRNA。
段落40.RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をT7 RNAポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む、リボ核酸(RNA)合成のための共転写キャッピング方法。
段落41.前記生成されたRNA転写物の80%超、85%超、または90%超が、機能性キャップを含む、段落40に記載の方法。
段落42.前記生成されたRNA転写物の95%超が、機能性キャップを含む、段落41に記載の方法。
段落43.前記ヌクレオシド三リン酸が、非修飾もしくは修飾ATP、修飾もしくは非修飾UTP、修飾もしくは非修飾GTP、及び/または修飾もしくは非修飾CTPを含む、段落40~42のいずれか1つに記載の方法。
段落44.前記T7 RNAポリメラーゼバリアントが、段落1~21のいずれか1つに記載のT7ポリメラーゼバリアントである、段落40~43のいずれか1つに記載の方法。
段落45.前記T7ポリメラーゼバリアントが、E42、S43、Y44、E45、M46、G47、R257、及びG259から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1、配列番号99、または配列番号100によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落44に記載の方法。
段落46.前記T7ポリメラーゼバリアントが、G47Aの位置にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1、配列番号99、または配列番号100によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落40~45のいずれか1つに記載の方法。
段落47.前記T7ポリメラーゼバリアントが、S43Aのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1、配列番号99、または配列番号100によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落40~45のいずれか1つに記載の方法。
段落48.前記ヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体が、前記反応において等モル濃度で存在する、段落40~47のいずれか1つに記載の方法。
段落49.前記反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比が1:1より大きい、段落40~47のいずれか1つに記載の方法。
50.前記反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸のモル比が1:1未満である、段落40~47のいずれか1つに記載の方法。
段落51.前記キャップ類似体が、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップである、段落40~50のいずれか1つに記載の方法。
段落52.キ前記ャップ類似体が、トリヌクレオチドキャップである、段落40~50のいずれか1つに記載の方法。
段落53.前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列:GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG、及びGUUから選択される配列を含む、段落51に記載の方法。
段落54.前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列:m7GpppApA、m7GpppApC、m7GpppApG、m7GpppApU、m7GpppCpA、m7GpppCpC、m7GpppCpG、m7GpppCpU、m7GpppGpA、m7GpppGpC、m7GpppGpG、m7GpppGpU、m7GpppUpA、m7GpppUpC、m7GpppUpG、及びm7GpppUpUから選択される配列を含む、段落53に記載の方法。
段落55.前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列:m7G3′OMepppApA、m7G3′OMepppApC、m7G3′OMepppApG、m7G3′OMepppApU、m7G3′OMepppCpA、m7G3′OMepppCpC、m7G3′OMepppCpG、m7G3′OMepppCpU、m7G3′OMepppGpA、m7G3′OMepppGpC、m7G3′OMepppGpG、m7G3′OMepppGpU、m7G3′OMepppUpA、m7G3′OMepppUpC、m7G3′OMepppUpG、及びm7G3′OMepppUpUから選択される配列を含む、段落53に記載の方法。
段落56.前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列:m7G3′OMepppA2′OMepA、m7G3′OMepppA2′OMepC、m7G3′OMepppA2′OMepG、m7G3′OMepppA2′OMepU、m7G3′OMepppC2′OMepA、m7G3′OMepppC2′OMepC、m7G3′OMepppC2′OMepG、m7G3′OMepppC2′OMepU、m7G3′OMepppG2′OMepA、m7G3′OMepppG2′OMepC、m7G3′OMepppG2′OMepG、m7G3′OMepppG2′OMepU、m7G3′OMepppU2′OMepA、m7G3′OMepppU2′OMepC、m7G3′OMepppU2′OMepG、及びm7G3′OMepppU2′OMepUから選択される配列を含む、段落53に記載の方法。
段落57.前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列:m7GpppA2′OMepA、m7GpppA2′OMepC、m7GpppA2′OMepG、m7GpppA2′OMepU、m7GpppC2′OMepA、m7GpppC2′OMepC、m7GpppC2′OMepG、m7GpppC2′OMepU、m7GpppG2′OMepA、m7GpppG2′OMepC、m7GpppG2′OMepG、m7GpppG2′OMepU、m7GpppU2′OMepA、m7GpppU2′OMepC、m7GpppU2′OMepG、及びm7GpppU2′OMepUから選択される配列を含む、段落53に記載の方法。
段落58.前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列:GAG、GCG、GUG、及びGGGから選択される配列を含む、段落53~57のいずれか1つに記載の方法。
段落59.前記トリヌクレオチドキャップが、配列GAGを含む、段落58に記載の方法。
段落60.前記トリヌクレオチドキャップが、GpppA2′OmepGを含む、段落59に記載の方法。
段落61.前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む、段落40~60のいずれか1つに記載の方法。
段落62.前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシシチジン残基を含む、段落40~60のいずれか1つに記載の方法。
段落63.RNA合成のための共転写キャッピング方法であって、RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を(a)T7 RNAポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、前記RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、前記T7 RNAポリメラーゼバリアント、(b)ヌクレオシド三リン酸、及び(c)配列GpppA2′OmepGを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む、前記方法。
段落64.前記生成されたRNA転写物が、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、検出可能なサイトカイン応答を刺激しない、段落40~63のいずれか1つに記載の方法。
段落65.インビトロ転写(IVT)RNA及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、IVT後の精製なしでサイトカイン誘導性RNA混入物を実質的に含まない、前記組成物。
段落66.インビトロ転写(IVT)RNA及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、5%未満のキャップされていないRNA種を有する、前記組成物。
段落67.前記IVT RNAの80%、85%、または90%超が機能性キャップを含む、段落65または66に記載の組成物。
段落68.前記IVT RNAの95%超が機能性キャップを含む、段落67に記載の組成物。
段落69.前記IVT RNAが化学修飾されていない、段落65~68のいずれか1つに記載の組成物。
段落70.前記IVT RNAが化学修飾されている、項65~68のいずれか1項に記載の組成物。
段落71.前記IVT RNAの95%超が一本鎖完全長転写物を含む、段落65~70のいずれか1つに記載の組成物。
段落72.前記RNAが、
RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を(a)T7 RNAポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、前記RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、前記T7 RNAポリメラーゼバリアント、(b)ヌクレオシド三リン酸、及び(c)配列GpppA2′OmepGを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含むプロセスによって生成され、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む、請求項65~71のいずれか1項に記載の組成物。
RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を(a)T7 RNAポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、前記RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、前記T7 RNAポリメラーゼバリアント、(b)ヌクレオシド三リン酸、及び(c)配列GpppA2′OmepGを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含むプロセスによって生成され、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む、請求項65~71のいずれか1項に記載の組成物。
段落73.野生型T7 RNAポリメラーゼと比較して少なくとも1つの追加のC末端アミノ酸を含む、T7 RNAポリメラーゼ。
段落74.少なくとも2つの追加のC末端アミノ酸を含む、段落73に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
段落75.前記少なくとも2つの追加のC末端アミノ酸が、同じ種類のアミノ酸または少なくとも2つの異なる種類のアミノ酸を含む、段落74に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
段落76.1~10個の追加のC末端アミノ酸を含む、段落73~75のいずれか1つに記載のT7 RNAポリメラーゼ。
段落77.1~5個の追加のC末端アミノ酸を含む、段落76に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
段落78.前記T7 RNAポリメラーゼがFAFAXn
(配列番号171)モチーフを含むC末端を含み、Xが任意のアミノ酸であり、nがゼロより大きい任意の整数である、段落73~77のいずれか1つに記載のT7 RNAポリメラーゼ。
段落79.XがGまたはAであり、任意選択により、XnがGGまたはAAである、段落78に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
段落80.nが1、2、3、4、または5である、段落78または79に記載のT7 RNAポリメラーゼ
段落81.FAFAG(配列番号329)モチーフを含むC末端を含む、T7 RNAポリメラーゼ。
段落82. XAFAXnモチーフ、FAXAXnモチーフ、FAXAXnモチーフ、またはFAFXXnモチーフを含むC末端を含み、各Xが任意のアミノ酸であり、nがゼロより大きい任意の整数である、T7 RNAポリメラーゼ。
段落83.前記T7 RNAポリメラーゼが、野生型T7 RNAポリメラーゼの位置S43、G47、R257、またはG259に対応する位置に少なくとも1つの置換及び任意選択により少なくとも1つの追加の置換を含む、段落73~82のいずれか1つに記載のT7 RNAポリメラーゼ。
段落84.前記野生型T7 RNAポリメラーゼが、配列番号1により特定されるアミノ酸配列を含む、段落83に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
段落85.G47、S43、R257、及びG259から選択される少なくとも1つの置換、及び任意選択により少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号99のアミノ酸配列を含む、T7 RNAポリメラーゼ。
段落86.G47、S43、R257、及びG259から選択される少なくとも1つの置換、及び任意選択により少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号100、294、296、または296のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、T7 RNAポリメラーゼ。
段落87.S43A、G47A、R257A、及びG259Aから選択される少なくとも1つの置換を含む、段落83~86のいずれか1つに記載のT7 RNAポリメラーゼ。
段落88.配列番号294~313のいずれか1つのアミノ酸配列を含むT7 RNAポリメラーゼであって、xは任意のアミノ酸であり、nは任意の整数、例えば1~5(例えば、1、2、3、4、または5)であり、任意選択により、T7 RNAポリメラーゼが少なくとも1つの追加のアミノ酸置換をさらに含む、前記T7 RNAポリメラーゼ。
段落89.ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を段落73~88のいずれかのRNAポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロ転写(IVT)反応を行う方法。
段落90.前記生成されたRNAが、細胞に送達されたときに、WT T7 RNAPを用いて生成されたdsRNA転写物と比較して少なくとも50%低いサイトカイン応答を刺激する、段落89に記載の方法。
91.前記RNAが未精製の形態で細胞に送達される、段落90に記載の方法。
段落92.前記生成されたRNA転写物の30%未満が3´不均一性を示す、段落89~92のいずれか1つに記載の方法。
段落93.段落73~92のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼをコードする核酸。
段落94.段落93の核酸を含むベクター。
段落95.段落93の核酸または段落94のベクターを含む宿主細胞。
段落96.段落73~92のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼを含むキット。
段落97.段落73~92のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼを含む組成物。
段落98.段落89~92のいずれか1つに記載の方法によって生成されたリボ核酸(RNA)。
段落99.脂質ナノ粒子中に製剤化された段落98に記載のRNA。
段落100.前記脂質ナノ粒子が、20~60%のイオン化可能なアミノ脂質、5~25%の非カチオン性脂質、25~55%のステロール、及び0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む、段落98に記載のRNA。
段落101.対応する野生型RNAポリメラーゼと比較して少なくとも1つの追加のC末端アミノ酸を含むRNAポリメラーゼであって、任意選択により、少なくとも1つの追加のC末端アミノ酸が、グリシン(G)及び/またはアラニン(A)を含む、前記RNAポリメラーゼ。
段落102.前記RNAポリメラーゼが、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、及びSP6 RNAポリメラーゼから選択される、段落101に記載のRNAポリメラーゼ。
段落103.前記RNAポリメラーゼが、少なくとも1つの追加のアミノ酸置換をさらに含み、任意選択により、S43A、G47A、R257A、及びG259Aから選択される配列番号1のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む、段落101または102に記載のRNAポリメラーゼ。
段落104.前記RNAポリメラーゼが、43位、47位、257位、及び/または259位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含むT7 RNAポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン(A)である、段落101~104のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼ。
段落105.前記RNAポリメラーゼが、44位、48位、258位、及び/または 260位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号6と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含むT3 RNAポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン(A)である、段落101~104のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼ。
段落106. 前記RNAポリメラーゼが、15位、19位、230位、及び/または 232位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号7と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含むSP6 RNAポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン(A)である、段落101~104のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼ。
段落107.43位、47位、257位、及び/または259位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン(A)である、T7 RNAポリメラーゼ。
段落108.44位、48位、258位、及び/または260位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号6と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン(A)である、T3 RNAポリメラーゼ。
段落109.15位、19位、230位、及び/または232位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号7と少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン(A)である、SP6 RNAポリメラーゼ。
実施例1.バリアントT7 RNAポリメラーゼの生成
Cヘリックス及びCリンカーT7 RNAポリメラーゼバリアントを、表3及び表4に示される置換を用いて生成した。
Cヘリックス及びCリンカーT7 RNAポリメラーゼバリアントを、表3及び表4に示される置換を用いて生成した。
実施例2.T7 RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたhEPO mRNAの純度は、野生型T7 RNAポリメラーゼを使用して生成されたhEPO mRNAの純度に匹敵する。
hEPO DNA鋳型、ならびに(1)野生型(WT)T7 RNAポリメラーゼ(WT #1及びWT #2)、(2)G47A C末端G T7 RNAポリメラーゼバリアント(「G47A*」)(配列番号110)、及び(3)S43A C末端G T7 RNAポリメラーゼバリアント(「S43A*」)(配列番号108)を使用して、インビトロ転写反応を行った。DBAA(ジブチルアンモニウムアセテート)HPLC分析は、すべてのhEPO転写物の純度がほぼ同じであったことを示した(図1)。
hEPO DNA鋳型、ならびに(1)野生型(WT)T7 RNAポリメラーゼ(WT #1及びWT #2)、(2)G47A C末端G T7 RNAポリメラーゼバリアント(「G47A*」)(配列番号110)、及び(3)S43A C末端G T7 RNAポリメラーゼバリアント(「S43A*」)(配列番号108)を使用して、インビトロ転写反応を行った。DBAA(ジブチルアンモニウムアセテート)HPLC分析は、すべてのhEPO転写物の純度がほぼ同じであったことを示した(図1)。
実施例3. T7 RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたhEPO mRNAは、細胞サイトカイン応答を示さない。
BJ線維芽細胞を、実施例2に記載されるIVT反応により生成されたhEPO mRNAでトランスフェクトした。mRNAを、精製しないか、または逆相(RP)クロマトグラフィーにより精製した。図2(左のグラフ)に示されるように、S43A* T7 RNAポリメラーゼバリアントまたはG47A* T7 RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成された精製されていないmRNAは、WT T7ポリメラーゼを使用して生成された精製されたmRNAと同程度に「コールド(cold)」(サイトカイン応答を示さなかった)であった。ほぼ同等のmRNA発現レベルを、図2(右のグラフ)に示す。これらの実験で使用されたmRNAは、いずれのヌクレオチド修飾も含まなかった。
BJ線維芽細胞を、実施例2に記載されるIVT反応により生成されたhEPO mRNAでトランスフェクトした。mRNAを、精製しないか、または逆相(RP)クロマトグラフィーにより精製した。図2(左のグラフ)に示されるように、S43A* T7 RNAポリメラーゼバリアントまたはG47A* T7 RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成された精製されていないmRNAは、WT T7ポリメラーゼを使用して生成された精製されたmRNAと同程度に「コールド(cold)」(サイトカイン応答を示さなかった)であった。ほぼ同等のmRNA発現レベルを、図2(右のグラフ)に示す。これらの実験で使用されたmRNAは、いずれのヌクレオチド修飾も含まなかった。
m1ψヌクレオチド修飾(図3、上のグラフ)またはmo5Uヌクレオチド修飾(図3、下のグラフ)のいずれかを含むhEPO mRNAを使用して、同様の細胞トランスフェクションアッセイを繰り返した。G47A*及びS43A* T7 RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成された精製されていないm1ψ hEPO mRNAでトランスフェクトされたBJ線維芽細胞は、WT T7 RNAポリメラーゼを使用して生成された精製されていないm1ψ hEPO mRNAでトランスフェクトされた細胞より低いIFNβ応答を示した。ほぼ同等のmRNA発現レベルを、図4に示す。
次いで、単球由来マクロファージ(MDM)を使用して、さらにサイトカイン応答を試験した。IP10対ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)の比を、実施例2に記載される条件下で生成されたhEPO mRNAでトランスフェクトされたMDMで測定した。MDMは、非修飾化学に対して非常に感受性であるため、試料間の強烈な違いは、非修飾hEPO mRNAを使用して見られなかった。しかしながら、G47A*及びS43A* T7 RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成された精製されていないm1ψ hEPO mRNAでトランスフェクトされたMDMは、WT T7 RNAポリメラーゼを使用して生成された精製されたm1ψ hEPO mRNAでトランスフェクトされたMDMより低いIP10応答を示した(図5、上のグラフ)。
実施例4.T7 RNAポリメラーゼバリアントは、WT T7 RNAポリメラーゼよりも少ない混入dsRNAに関連するmRNAを生成する。
標準dsRNA ELISAを使用して、非修飾hEPO mRNA(図7)またはm1ψヌクレオチド修飾(図8、上のグラフ)もしくはmo5Uヌクレオチド修飾(図8、下のグラフ)のいずれかを含むhEPO mRNAを生成するために使用されるIVT反応におけるdsRNA混入物(例えば、40ヌクレオチド塩基対よりも長い)を評価した。dsRNAアッセイは、S43A* T7 RNAポリメラーゼバリアント及びG47A* T7 RNAポリメラーゼバリアントが、WT T7 RNAポリメラーゼよりも少ないdsRNAを生成したことを示した(図7及び図8)。
標準dsRNA ELISAを使用して、非修飾hEPO mRNA(図7)またはm1ψヌクレオチド修飾(図8、上のグラフ)もしくはmo5Uヌクレオチド修飾(図8、下のグラフ)のいずれかを含むhEPO mRNAを生成するために使用されるIVT反応におけるdsRNA混入物(例えば、40ヌクレオチド塩基対よりも長い)を評価した。dsRNAアッセイは、S43A* T7 RNAポリメラーゼバリアント及びG47A* T7 RNAポリメラーゼバリアントが、WT T7 RNAポリメラーゼよりも少ないdsRNAを生成したことを示した(図7及び図8)。
実施例5.T7 RNAポリメラーゼバリアントは、mRNAの3′不均一性を低減する。
転写物の3′不均一性は、RNAse T1消化を使用して測定することができる。RNAse T1は、Gヌクレオチドの後にmRNAを特異的に切断する。エンドヌクレオチド切断は、5′水酸化物(OH)及び3′一リン酸(mP)「瘢痕」をもたらす。したがって、RNAse T1消化は、3′末端で鋳型のない付加を有する及び有さない転写物を区別するために使用され得る。この実施例では、実施例2で生成されたhEPO mRNAは、ポリAテール及びXbaI制限部位(例えば、AnUCUAG)で終了する。WT T7 RNAポリメラーゼを使用して生成されたhEPO mRNA、S43A* T7 RNAポリメラーゼバリアント、またはG47A* T7 RNAポリメラーゼバリアントを、RNAse T1で消化し、LCMSによって分析して、オリゴフィンガープリントを生成した。均質な3′末端(5´OH/3´OH)は、32780Daでピークに達することが見出されたが、一方で、「瘢痕」(5´OH/3´mP)は、32860Daでピークに達した(図9A)。「瘢痕」は、転写物が、カルボキシ末端で鋳型のない付加を有したことを示す。T7 RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたhEPO mRNA、S43A*、またはG47A*は、より高い3′末端集団分布を有し、それらがより均質な3′末端及び改善された3′末端不均一性を有することを示す(図9B)。
転写物の3′不均一性は、RNAse T1消化を使用して測定することができる。RNAse T1は、Gヌクレオチドの後にmRNAを特異的に切断する。エンドヌクレオチド切断は、5′水酸化物(OH)及び3′一リン酸(mP)「瘢痕」をもたらす。したがって、RNAse T1消化は、3′末端で鋳型のない付加を有する及び有さない転写物を区別するために使用され得る。この実施例では、実施例2で生成されたhEPO mRNAは、ポリAテール及びXbaI制限部位(例えば、AnUCUAG)で終了する。WT T7 RNAポリメラーゼを使用して生成されたhEPO mRNA、S43A* T7 RNAポリメラーゼバリアント、またはG47A* T7 RNAポリメラーゼバリアントを、RNAse T1で消化し、LCMSによって分析して、オリゴフィンガープリントを生成した。均質な3′末端(5´OH/3´OH)は、32780Daでピークに達することが見出されたが、一方で、「瘢痕」(5´OH/3´mP)は、32860Daでピークに達した(図9A)。「瘢痕」は、転写物が、カルボキシ末端で鋳型のない付加を有したことを示す。T7 RNAポリメラーゼバリアントを使用して生成されたhEPO mRNA、S43A*、またはG47A*は、より高い3′末端集団分布を有し、それらがより均質な3′末端及び改善された3′末端不均一性を有することを示す(図9B)。
実施例6.「より均質な」3′末端を生成するT7 RNAポリメラーゼバリアント
アッセイを使用して、T7 RNAPバリアント、G47A*、及びS43A*によって生成された鋳型のない付加の程度を調べた。このアッセイでは、酵素ポリメラーゼを使用してライゲーションレフトマーを作製した(例えば、図11Aを参照のこと)。次いで、レフトマーを、5´-モノリン酸化ライトマーRNAにすぐ隣接する完全に相補的なDNAスプリントにアニーリングした。DNAスプリントは、典型的には、40nt長であり、ライトマーは、典型的には、5´末端においてフルオロフォアで修飾される。次いで、DNAリガーゼIを、触媒条件下で添加し、反応がEDTAでクエンチされる前に、所望の反応時間の間、ライゲーションを進めた。次いで、混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル(PAGE-D)に充填される前に、95℃で5分間4Mの尿素中で変性した(図11B)。ゲル中のアクリルアミドのパーセンテージは、予期される構築物の長さによるが、典型的には、>50ntのレフトマー長については6%アクリルアミド、及び典型的なmRNAの長さにアプローチするレフトマーについては20%アクリルアミドである。6%アクリルアミドゲルを、一定の180Vで25分間実行し、20%アクリルアミドゲルを、一定の180Vで120分間実行した。次いで、ゲルを、ライトマー及び新しくライゲーションされた産物に存在するフルオロフォアに適切な励起波長及び発光波長を使用してTyphoonまたは同様のスキャナーで画像化した。ライトマー及びライゲーションされた産物は、サイズに基づくゲル上で異なって移動し、2つのバンドの強度は、ライゲーション反応の効率に正確に対応するであろう。レフトマーの酵素合成の間の鋳型のないヌクレオチド付加の程度がより大きいほど、予期されるライゲーション収量はより低い。
アッセイを使用して、T7 RNAPバリアント、G47A*、及びS43A*によって生成された鋳型のない付加の程度を調べた。このアッセイでは、酵素ポリメラーゼを使用してライゲーションレフトマーを作製した(例えば、図11Aを参照のこと)。次いで、レフトマーを、5´-モノリン酸化ライトマーRNAにすぐ隣接する完全に相補的なDNAスプリントにアニーリングした。DNAスプリントは、典型的には、40nt長であり、ライトマーは、典型的には、5´末端においてフルオロフォアで修飾される。次いで、DNAリガーゼIを、触媒条件下で添加し、反応がEDTAでクエンチされる前に、所望の反応時間の間、ライゲーションを進めた。次いで、混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル(PAGE-D)に充填される前に、95℃で5分間4Mの尿素中で変性した(図11B)。ゲル中のアクリルアミドのパーセンテージは、予期される構築物の長さによるが、典型的には、>50ntのレフトマー長については6%アクリルアミド、及び典型的なmRNAの長さにアプローチするレフトマーについては20%アクリルアミドである。6%アクリルアミドゲルを、一定の180Vで25分間実行し、20%アクリルアミドゲルを、一定の180Vで120分間実行した。次いで、ゲルを、ライトマー及び新しくライゲーションされた産物に存在するフルオロフォアに適切な励起波長及び発光波長を使用してTyphoonまたは同様のスキャナーで画像化した。ライトマー及びライゲーションされた産物は、サイズに基づくゲル上で異なって移動し、2つのバンドの強度は、ライゲーション反応の効率に正確に対応するであろう。レフトマーの酵素合成の間の鋳型のないヌクレオチド付加の程度がより大きいほど、予期されるライゲーション収量はより低い。
ライゲーション収量を、ライゲーションされていないライトマー及びライゲーションされた完全長産物に対応するバンドの比率として計算した。反応を、反応収量の差を誇張するために早く終了した。これらの結果に基づいて、T7 RNAPバリアント G47A*は、レフトマーRNAの3´末端で最も少ない鋳型のないヌクレオチドを組み込んだ。
実施例7.単回インビトロ転写反応におけるキャップされたmRNAの生成
標準インビトロ転写(IVT)アッセイでは、T7 RNAポリメラーゼは、5′GTPで転写を開始することが好ましい。そのような標準IVTアッセイによって生成された一本鎖RNA(ssRNA)分子は、別々の酵素キャッピングステップを必要とする(図13)。例えば、キャップ1 RNA(7mGpppN2′-Om-RNA)は、ワクシニアキャッピング及び2´-O-メチルトランスフェラーゼ(2´OMTase)を使用してキャッピングアッセイにおいて生成され得る。キャップ1は、典型的には、細胞における効率的なタンパク質翻訳及びmRNA安定性のために使用される。しかしながら、いくつかのmRNA配列は、キャッピングすることが難しく、キャッピング/メチル化酵素は、非常に高価である。
標準インビトロ転写(IVT)アッセイでは、T7 RNAポリメラーゼは、5′GTPで転写を開始することが好ましい。そのような標準IVTアッセイによって生成された一本鎖RNA(ssRNA)分子は、別々の酵素キャッピングステップを必要とする(図13)。例えば、キャップ1 RNA(7mGpppN2′-Om-RNA)は、ワクシニアキャッピング及び2´-O-メチルトランスフェラーゼ(2´OMTase)を使用してキャッピングアッセイにおいて生成され得る。キャップ1は、典型的には、細胞における効率的なタンパク質翻訳及びmRNA安定性のために使用される。しかしながら、いくつかのmRNA配列は、キャッピングすることが難しく、キャッピング/メチル化酵素は、非常に高価である。
本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるT7 RNAポリメラーゼバリアント(例えば、T7 RNAポリメラーゼバリアントG47A*)を使用したインビトロ転写アッセイにおいて、ssRNA(例えば、mRNA)を共転写で、トリヌクレオチドでキャッピングする方法を提供する。効率的な共転写キャッピングには、通常、5′ATPならびに等モル濃度のNTP及びトリヌクレオチドを用いて転写を開始する二本鎖DNA(dsDNA)鋳型が含まれる。通常、T7 RNAポリメラーゼは、5′ATPを用いると開始活性が著しく低下した。しかしながら、XAG(Xは任意のヌクレオチド、例えば、5´mGpppである)トリヌクレオチドの存在下で、5′ATPを用いたT7 RNAポリメラーゼの限定された開始活性は、5′ATPではなくトリヌクレオチドで開始が推進され、キャップされたmRNAを共転写で生成する。
例示的な市販のジ-及びトリヌクレオチドキャップを、図14Aに示す。ワクシニアキャップ1は、典型的なジ-ヌクレオチドキャップであり、共転写で添加することができない。共転写で添加され得る別のジ-ヌクレオチドキャップは、抗逆方向キャップ類似体(Anti-Reverse Cap Analog)(ARCA)であり、また市販されている(例えば、Thermo Fisherから、カタログ番号: AM8045)。ARCAは、3´OH基(m7Gに近接する)が-OCH3で置き換えられる修飾されたキャップ類似体である。ARCAを、この研究において記載される共転写キャッピングアッセイのいくつかにおいて対照として使用する。
共転写キャッピングアッセイでは、ヒトEPO(hEPO)DNA鋳型を使用した。5mMのトリヌクレオチドありまたはなしで5mM NTPもまたアッセイ混合物に存在した(mGpppAG、mGmpppAG、及びARCA)。非修飾mRNA産物を、RNase HキャップアッセイまたはLCMSによって分析した。表5に示されるように、野生型(WT)T7 RNAポリメラーゼ及びT7 RNAポリメラーゼバリアントG47A*は、均等に高い効率で完全にキャップされたmRNAを生成することができた。RNA収量は、異なるIVT反応(図14B)の中でも匹敵し、高度の完全性を有するmRNA産物が生成された(図14C)。
mRNA産物の免疫刺激活性を、BJ線維芽細胞におけるサイトカイン(IFNβ)生成を誘発するそれらの能力を評価することによって評価した。興味深いことに、WT T7 RNAポリメラーゼは、高いサイトカイン応答を誘発した非修飾mRNAを生成したが、一方で、T7 RNAポリメラーゼバリアント G47A*は、BJ線維芽細胞においてサイトカイン生成を刺激しなかった非修飾mRNAを生成し(図14D)、IVT/キャッピングアッセイの後にRNAをさらに精製する必要性を最小化した。mRNA産物からのhEPO発現もまた評価した。hEPO発現を、WT T7 RNAポリメラーゼによって生成されたmRNAから観察したが、一方で、T7 RNAポリメラーゼバリアントG47A*によって生成されたmRNAは、ワクシニアキャップ1でキャップされた1-メチル-シュードウリジンで修飾されたmRNAに匹敵するhEPO発現をもたらした(図14E)。LCMS実験はまた、トリヌクレオチド組み込み効率は2つの酵素と同等であるように思われたが、T7 RNAポリメラーゼバリアントG47A*が、WT T7 RNAポリメラーゼより均質なRNAを生成したことを示す(図15)。
異なる実験では、T7 RNAポリメラーゼバリアントG47A*のキャッピング効率を、ワクシニアキャップ1を使用する標準キャッピングアッセイにおいて達成された効率と比較した。この実験では、反応混合物は、鋳型鎖上の+1位でデオキシチミジンを含むhEPO dsDNA鋳型(第1の鋳型のあるヌクレオチドについては「Astart」とも命名される)、T7 RNAポリメラーゼバリアントG47A*、ならびに等モル(7.5mM)NTP及びGAGトリヌクレオチドを含んだ。得られるmRNA産物を、オリゴdTを使用して精製し、キャッピング効率、インビトロサイトカイン応答、及びインビトロ発現について分析した。結果は、T7 RNAポリメラーゼバリアントG47A*が、標準キャッピングプロセスと比較できる程に高い効率でキャップされたmRNAを生成し(表6)、mRNAは、BJ線維芽細胞においてサイトカイン応答を誘発せず(図16A)、mRNAは、BJ線維芽細胞において高いhEPO発現をもたらす(図16B)ことを示す。
要約すると、T7 RNAポリメラーゼバリアントG47A*は、XAGトリヌクレオチド(例えば、GAGまたはGmAG)の存在下で、鋳型鎖の3′dTTPで転写を効率的に開始することができることを本明細書に示された。アッセイにおいてNTPとして等モル濃度を条件として、トリヌクレオチドは、免疫応答を刺激しない完全にキャップされたmRNAを生成するために共転写で添加され、高タンパク質発現をもたらし得る(図17)。
実施例8.5′GTP(Gstart)または5′ATP(Astart)での転写開始の比較
実施例7に記載される共転写キャッピングアッセイを使用して、転写開始が5´-GTP(Gstart)または5´-ATP(Astart)を必要とするモデル構築物へのキャッピング効率を比較した。5′UTR及び47-mer RNAオリゴヌクレオチドをコードするモデル構築物を、IVTの鋳型として使用した。全RNA産物を、質量分析によって評価し、結果は、Astart構築物が、Gstart構築物と比較して GAGまたはGmAGトリヌクレオチドをより効率的に組み込むことを示す(図18A)。データはここでは示されていないが、Cstart及びUstart構築物が少量のキャップされた生成物を生成したこともまた観察された。
実施例7に記載される共転写キャッピングアッセイを使用して、転写開始が5´-GTP(Gstart)または5´-ATP(Astart)を必要とするモデル構築物へのキャッピング効率を比較した。5′UTR及び47-mer RNAオリゴヌクレオチドをコードするモデル構築物を、IVTの鋳型として使用した。全RNA産物を、質量分析によって評価し、結果は、Astart構築物が、Gstart構築物と比較して GAGまたはGmAGトリヌクレオチドをより効率的に組み込むことを示す(図18A)。データはここでは示されていないが、Cstart及びUstart構築物が少量のキャップされた生成物を生成したこともまた観察された。
さらに、RNA産物を、RNase H切断させ、RNA産物の切断された5′末端を、質量分析を使用して分析し、キャップの存在を判定した。同様の結果を全RNA産物のものとして得た(図18B)。
図18A及び図18Bで使用されるモデル構築物を使用して、トリヌクレオチド滴定実験もまた行った。共転写キャッピングアッセイでは、5mMのNTP(A、等モル比で修飾されたU、G、C)を使用したが、一方で、トリヌクレオチド(GAGまたはGmAG)の濃度は、変化し、NTP及びトリヌクレオチドの異なるモル比でキャッピング効率を評価した。次いで、粗RNA産物をLC-MSによって分析した。結果は、NTP及びトリヌクレオチドが、GAG及びGmAGの両方について等モル比であるときに、キャッピング効率が最も高いことを示す(表7)。
実施例9.1-メチル-シュードウリジンで化学修飾されたmRNAのキャッピング
1-メチル-シュードウリジンで化学修飾されたmRNAの共転写キャッピングもまた評価した。3つのモデル構築物を使用した:hEPO、Luc(ルシフェラーゼをコードする)、及びeGFP。すべてのIVT鋳型は、Astart鋳型であった。鋳型は、PCR断片またはプラスミドであり得る。キャッピングアッセイ反応混合物は、鋳型、T7 RNAポリメラーゼバリアントG47A*、7.5mMのNTP、及び7.5mMのトリヌクレオチド(GAGまたはGmAG)を含んだ。NTP中のUTPを、1-メチルシュードウリジンで置き換えて、化学修飾されたmRNAを生成した。ワクシニアキャップ1を、標準キャッピングアッセイにおいて生成対照として使用した。mRNA産物を、RNase Hキャップアッセイ、T1フィンガープリンティング、及びフラグメントアナライザーを使用して分析し、それらの完全性を判定した。サイトカイン応答を誘発すること及びBJ線維芽細胞においてコードされたタンパク質を発現することにおけるmRNA産物の能力もまた試験した。
1-メチル-シュードウリジンで化学修飾されたmRNAの共転写キャッピングもまた評価した。3つのモデル構築物を使用した:hEPO、Luc(ルシフェラーゼをコードする)、及びeGFP。すべてのIVT鋳型は、Astart鋳型であった。鋳型は、PCR断片またはプラスミドであり得る。キャッピングアッセイ反応混合物は、鋳型、T7 RNAポリメラーゼバリアントG47A*、7.5mMのNTP、及び7.5mMのトリヌクレオチド(GAGまたはGmAG)を含んだ。NTP中のUTPを、1-メチルシュードウリジンで置き換えて、化学修飾されたmRNAを生成した。ワクシニアキャップ1を、標準キャッピングアッセイにおいて生成対照として使用した。mRNA産物を、RNase Hキャップアッセイ、T1フィンガープリンティング、及びフラグメントアナライザーを使用して分析し、それらの完全性を判定した。サイトカイン応答を誘発すること及びBJ線維芽細胞においてコードされたタンパク質を発現することにおけるmRNA産物の能力もまた試験した。
表8に示されるように、PCR断片から生成されたすべての3つのモデル構築物の1-メチル-シュードウリジンで化学修飾されたmRNAは、効率的にキャップされ、キャッピング効率は、ワクシニアキャップ1対照に匹敵した。化学Aは、非修飾ウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示し、化学Bは、1-メチル-シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示す。化学Cは、5-メチル-シチジン三リン酸及び1-メチル-シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドを示す。プラスミド鋳型から生成された1-メチル-シュードウリジンで化学修飾されたmRNAについて同様の結果を得た(表9)。さらに、RNase T1フィンガープリンティング分析は、PCR断片鋳型を使用してモデル構築物から生成されたmRNAが、正しい配列のものであったことを示した(図19A)。PCR断片鋳型(図19B)またはプラスミド鋳型(図20C)のいずれかから生成されたmRNAもまた、高度の完全性を有することを示した。PCR断片鋳型ならびにプラスミド鋳型から生成されたキャップされたmRNAは、BJ線維芽細胞においていずれのサイトカイン発現も誘発しなかった(図19C、図20D)。さらに、プラスミド鋳型から生成されたmRNAは、BJ線維芽細胞においてコードされたタンパク質の発現をもたらした(図20E~図20G)。GAGキャップされたmRNAの発現レベルは、わずかにより高いか、ワクシニアキャップ1対照mRNAからの発現レベルに匹敵するか、またはそれよりもわずかに低かった。
共転写キャッピングアッセイにおけるNTP消費もまた、モデル構築物hEPO(図20A)及びeGFP(図20B)についてプラスミド鋳型を使用する反応を評価した。結果は、GAG及びGmAGが、アッセイの期間(2時間)にわたってほとんど消費されなかったことを示す。これは、アッセイにおけるトリヌクレオチドの濃度が極端に超過していたという事実と一貫している。アッセイが完了した後にトリヌクレオチドを回収することが可能であり得る。
実施例10.RNA収量に影響を与えるT7 RNAポリメラーゼC末端での置換
G47A*ポリメラーゼは、翻訳されたタンパク質のC末端で余分なグリシン(「フットグリシン」)を含む。フットグリシンの存在を、トリプシン消化及び精製されたG47A*タンパク質の質量分析によって確認した(データには示されていない)。G47A*のC末端フット領域の役割を、G47A*の活性部位に対するその近接のために、より詳細に試験した。
G47A*ポリメラーゼは、翻訳されたタンパク質のC末端で余分なグリシン(「フットグリシン」)を含む。フットグリシンの存在を、トリプシン消化及び精製されたG47A*タンパク質の質量分析によって確認した(データには示されていない)。G47A*のC末端フット領域の役割を、G47A*の活性部位に対するその近接のために、より詳細に試験した。
インビトロ転写(IVT)反応を、hEPO DNA鋳型、ならびに(1)野生型(WT)T7 RNAポリメラーゼ(WT)、(2)フットグリシンを有するWT T7 RNAポリメラーゼ(WT+G)、(3)2つのフットグリシンを有するWT T7 RNAポリメラーゼ(WT+GG)、(4)2つのフットアラニンを有する野生型RNAポリメラーゼ(WT+AA)、(5)G47A T7 RNAポリメラーゼバリアント、(6)フットグリシンを有するG47A* T7 RNAポリメラーゼバリアント(G47A+G)、(7)2つのフットグリシンを有するG47A T7 RNAポリメラーゼバリアント(G47A+GG)、(7)2つのフットアラニンを有するG47A T7 RNAポリメラーゼバリアント(G47A+AA)、(9)S43A/G47A T7 RNAポリメラーゼバリアント(S43A/G47A)、及び(10)フットグリシンを有するS43A/G47A T7 RNAポリメラーゼバリアント(S43A/G47A+G)を使用して行った。IVT反応混合物は、hEPO DNA鋳型、上に列挙されるT7 RNAポリメラーゼバリアントのうちの1つ、及びNTPを含んだ。非修飾化学を有するIVT反応(図22)を、標準NTP(ATP、CTP、GTP、UTP)で行ったが、一方で、シュードウリジン修飾(m1ψ)化学を有するIVT反応(図23)は、UTPの代わりに1-メチルシュードウリジンを含み、化学修飾されたmRNAを生成した。RNA収量を、UV吸収によって測定した。
hEPO mRNA収量は、WTまたはG47A*バリアントT7 RNAポリメラーゼのいずれかにおいてフットグリシンの存在とともに減少した(図22及図23)。mRNA収量は、WT T7 RNAポリメラーゼよりもG47A*でのより少ない減少があったが、2つのフットグリシンまたは2つのフットアラニン残基のいずれかとともに減少し続けた。
実施例11.3´-mRNA不均一性へのT7 RNAポリメラーゼフットグリシンの影響
実施例5のように、フットグリシンを有するWTまたはG47A* T7 RNAPを使用して生成されたhEPO mRNAを、RNAse T1で消化し、LCMSによって分析して、オリゴフィンガープリントを生成した。WT T7 RNAP IVT反応を、NTPの等モル濃度(WT EQ)またはGTP及びATP(WTアルファ(A))のモル過剰のいずれかで行った。LCMS分析は、均質な3′末端(5´OH/3´OH)は、32780Daでピークに達し、「瘢痕」(5´OH/3´mP)は、32860Daでピークに達することを明らかにした(図24A)。「瘢痕」は、転写物が、3´末端で鋳型のない付加を有したことを示す。WT T7 RNAP及びNTPの等モル濃度(WT EQ)を使用して生成されたhEPO mRNAは、3´末端集団分布を減少し、減少された3´均一性及び鋳型のない付加を有するより多くのランオン生成物を示す(図24B)。しかしながら、フットグリシンを有するG47A* T7 RNAPを使用して生成されたhEPO mRNAは、より高い3′末端集団分布を有し、それらはより均質な3′末端を有し、3′末端の不均一性を改善したことを示す(図24B)。
実施例5のように、フットグリシンを有するWTまたはG47A* T7 RNAPを使用して生成されたhEPO mRNAを、RNAse T1で消化し、LCMSによって分析して、オリゴフィンガープリントを生成した。WT T7 RNAP IVT反応を、NTPの等モル濃度(WT EQ)またはGTP及びATP(WTアルファ(A))のモル過剰のいずれかで行った。LCMS分析は、均質な3′末端(5´OH/3´OH)は、32780Daでピークに達し、「瘢痕」(5´OH/3´mP)は、32860Daでピークに達することを明らかにした(図24A)。「瘢痕」は、転写物が、3´末端で鋳型のない付加を有したことを示す。WT T7 RNAP及びNTPの等モル濃度(WT EQ)を使用して生成されたhEPO mRNAは、3´末端集団分布を減少し、減少された3´均一性及び鋳型のない付加を有するより多くのランオン生成物を示す(図24B)。しかしながら、フットグリシンを有するG47A* T7 RNAPを使用して生成されたhEPO mRNAは、より高い3′末端集団分布を有し、それらはより均質な3′末端を有し、3′末端の不均一性を改善したことを示す(図24B)。
hEPO 3´mRNA均一性へのT7 RNAPフット領域の影響を直接試験するために、IVT反応を、hEPO DNA鋳型、ならびに(1)野生型T7 RNAP(WT)、(2)フットグリシンを有するWT T7 RNAP(WT+G)、(3)2つのフットグリシンを有するWT T7 RNAP(WT+GG)、(4)2つのフットアラニンを有する野生型T7 RNAP(WT+AA)、(5)G47A T7 RNAPバリアント、(6)フットグリシンを有するG47A* T7 RNAPバリアント(G47A+G)、(7)2つのフットグリシンを有するG47A T7 RNAPバリアント(G47A+GG)、(8)2つのフットアラニンを有するG47A T7 RNAPバリアント(G47A+AA)、(9)S43A/G47A T7 RNAPバリアント(S43A/G47A)、及び(10)フットグリシンを有するS43A/G47A T7 RNAPバリアント(S43A/G47A+G)を使用して行った。IVT反応混合物は、hEPO DNA鋳型、上に列挙されるT7 RNAPバリアントのうちの1つ、及び等モルNTPを含んだ。IVT反応を行い、それは、非修飾mRNA(図24C)またはシュードウリジン修飾されたmRNA(図24D)のいずれかを生成した。hEPO mRNAを、実施例5及び上記のようにRNase T1で消化した。フットグリシンの存在は、hEPO mRNA 3´末端の均一性を60%増加させた(図24C~図24D)。T7 RNAPにおける、2つのフットグリシンまたは2つのアラニンもまた、WTまたはG47A T7 RNAPにわたって3´末端の均一性を60~70%改善した(図24C及び図24D)。これらの結果は、T7 RNAP中の単一のフットグリシンの存在が、図24Bに観察される3´末端均一性を増加させることができることを示す。
実施例12.免疫刺激へのT7 RNAPフットグリシンの影響
hEPO mRNA生成物への免疫応答を刺激することにおけるT7 RNAPフットグリシンの役割は、実施例7のように、BJ線維芽細胞におけるサイトカイン(IFNβ)生成を誘発するそれらの能力を評価することによって評価した。興味深いことに、WT T7 RNAP生成された非修飾及びシュードウリジン修飾hEPO mRNAが、高いサイトカイン応答を誘発したが、一方で、フットグリシン生成された非修飾及びシュードウリジン修飾hEPO mRNAを有するWT T7 RNAPは、BJ線維芽細胞においてより少ないサイトカイン生成を刺激した(図25)。フットグリシンを有するG47A*バリアント T7 RNAPによって生成されたhEPO mRNAは、BJ線維芽細胞においてサイトカイン生成を刺激することをしそびれて、免疫応答を誘発しそびれることにおいてフットグリシン及びG47A T7 RNAポリメラーゼバリアントの間の相加的効果を示す(図25)。
hEPO mRNA生成物への免疫応答を刺激することにおけるT7 RNAPフットグリシンの役割は、実施例7のように、BJ線維芽細胞におけるサイトカイン(IFNβ)生成を誘発するそれらの能力を評価することによって評価した。興味深いことに、WT T7 RNAP生成された非修飾及びシュードウリジン修飾hEPO mRNAが、高いサイトカイン応答を誘発したが、一方で、フットグリシン生成された非修飾及びシュードウリジン修飾hEPO mRNAを有するWT T7 RNAPは、BJ線維芽細胞においてより少ないサイトカイン生成を刺激した(図25)。フットグリシンを有するG47A*バリアント T7 RNAPによって生成されたhEPO mRNAは、BJ線維芽細胞においてサイトカイン生成を刺激することをしそびれて、免疫応答を誘発しそびれることにおいてフットグリシン及びG47A T7 RNAポリメラーゼバリアントの間の相加的効果を示す(図25)。
実施例13.mRNA生成へのT7 RNAポリメラーゼフットグリシンの影響
アッセイを開発して、WT及びG47AバリアントT7 RNAPによって生成されたhEPO mRNA種へのフットグリシン残基の効果を調べた。試験されたT7 RNAPは、以下の通りであった。(1)WT+G(フットグリシン)、(2)G47Aバリアント、または(3)G47Aバリアント+G(G47A*バリアント)。IVT反応は、列挙されるT7 RNAPのうちの1つ、shORFan鋳型、NTP(非修飾または修飾されたUTPのいずれか)、及び32P-CTPを含んだ。反応を、所望の長さの時間の後にEDTAで終了した。次いで、反応混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル(20%アクリルアミド)に充填される前に、95℃で5分間4Mの尿素中で変性した(図26A)。ゲルを20ワットで30分間、次いで40ワットで2時間実行した。画像を、Typhoonスキャナーを使用する画像化の前にホスフォイメージャースクリーンに移動した(1時間の露光時間)。32P-CTPの使用は、完全長生成物(shORFan mRNAを示す)、ランオン転写生成物(上の箱)(図26A)、及び逆相補mRNA産物(図26A、下の箱)を標識する。結果はまた、以下の表10に要約される。これらのデータは、フットグリシンを有するT7 RNAPが、WTまたはG47A T7 RNAPのいずれかより少ない混入dsRNAに関連することを示す(図26A(下の箱)及び図26B)。さらに、フットグリシンは、WTまたはG47AバリアントT7 RNAPと比較して、減少されたランオン転写(図26A(上の箱)、図26B)と関連する。
アッセイを開発して、WT及びG47AバリアントT7 RNAPによって生成されたhEPO mRNA種へのフットグリシン残基の効果を調べた。試験されたT7 RNAPは、以下の通りであった。(1)WT+G(フットグリシン)、(2)G47Aバリアント、または(3)G47Aバリアント+G(G47A*バリアント)。IVT反応は、列挙されるT7 RNAPのうちの1つ、shORFan鋳型、NTP(非修飾または修飾されたUTPのいずれか)、及び32P-CTPを含んだ。反応を、所望の長さの時間の後にEDTAで終了した。次いで、反応混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル(20%アクリルアミド)に充填される前に、95℃で5分間4Mの尿素中で変性した(図26A)。ゲルを20ワットで30分間、次いで40ワットで2時間実行した。画像を、Typhoonスキャナーを使用する画像化の前にホスフォイメージャースクリーンに移動した(1時間の露光時間)。32P-CTPの使用は、完全長生成物(shORFan mRNAを示す)、ランオン転写生成物(上の箱)(図26A)、及び逆相補mRNA産物(図26A、下の箱)を標識する。結果はまた、以下の表10に要約される。これらのデータは、フットグリシンを有するT7 RNAPが、WTまたはG47A T7 RNAPのいずれかより少ない混入dsRNAに関連することを示す(図26A(下の箱)及び図26B)。さらに、フットグリシンは、WTまたはG47AバリアントT7 RNAPと比較して、減少されたランオン転写(図26A(上の箱)、図26B)と関連する。
実施例14.ホタルルシフェラーゼをコードするトリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAの繰り返し投与の評価
インビトロ転写mRNAは、典型的には、例えば、逆相クロマトグラフィー(RP)によって精製され、サイトカイン誘発不純物(dsRNA)及びプロセス不純物(例えば、タンパク質/DNA)を除去し、全RNA純度を改善する。しかしながら、この精製プロセスはしばしば、mRNA産物の著しい喪失をもたらす。RPを排除することは、ターンアラウンドタイムを低減し、大規模に動作及び操作複雑性を排除し、費用を節約する。さらに、RP中に使用される高温度が、mRNAの画分を加水分解することができるため、RPを排除することは、mRNA発現レベルを増加させる。したがって、RPの必要性を排除するためにmRNA産物及び精製戦略を開発した。この実施例に提供される方法によって生成されたmRNAは、「トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNA」 と称され、それは、G47A* T7 RNAPバリアント(G47A置換及び追加のC末端Gを有する)を使用するインビトロ転写アッセイにおいてトリヌクレオチドGpppA2′OmepGで共転写でキャップされているmRNAである。
インビトロ転写mRNAは、典型的には、例えば、逆相クロマトグラフィー(RP)によって精製され、サイトカイン誘発不純物(dsRNA)及びプロセス不純物(例えば、タンパク質/DNA)を除去し、全RNA純度を改善する。しかしながら、この精製プロセスはしばしば、mRNA産物の著しい喪失をもたらす。RPを排除することは、ターンアラウンドタイムを低減し、大規模に動作及び操作複雑性を排除し、費用を節約する。さらに、RP中に使用される高温度が、mRNAの画分を加水分解することができるため、RPを排除することは、mRNA発現レベルを増加させる。したがって、RPの必要性を排除するためにmRNA産物及び精製戦略を開発した。この実施例に提供される方法によって生成されたmRNAは、「トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNA」 と称され、それは、G47A* T7 RNAPバリアント(G47A置換及び追加のC末端Gを有する)を使用するインビトロ転写アッセイにおいてトリヌクレオチドGpppA2′OmepGで共転写でキャップされているmRNAである。
この実施例では、ホタルルシフェラーゼ(ffLuc)をコードするmRNAの単回の0.5mpk用量を、MC3脂質ナノ粒子中に配合し、6週間(1日目、8日目、15日目、22日目、29日目、及び36日目に)C57Bl/6マウス(n=5)に毎週投与した。以下のmRNAを投与した。(1)NTPの等モル濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製された非修飾mRNA(化学Aプロセス1 dT)、(2)GTP/ATPの過剰濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス2 RP)、(3)GTP/ATPの過剰濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製されたシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス2 dT)、(4)NTPの等モル濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製されたシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス1 dT)、(5)逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNA(G47A* T7 RNAPバリアントを使用してキャップ及び生成されたトリヌクレオチド)(化学Bプロセス3 RP)、(6)オリゴdT精製によって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップG47A* mRNA(化学Bプロセス3 dT)、ならびに(7)G47A* T7 RNAPバリアントを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製されたキャップされていないシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス4 dT))。各用量後6時間、以下を評価した:血清サイトカインレベル、mRNA発現、及び抗-PEG IgMレベル。B細胞活性化を、36日目の用量後6時間評価した。化学Aは、非修飾ウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示し、化学Bは、1-メチル-シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示す。プロセス1は、IVT及びワクシニアキャップ1における等モルNTPを指し、プロセス2は、4:2:1:1のGTP:ATP:CTP:UTP(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2018年3月22日に公開されたWO2018/053209 A1を参照のこと)及びワクシニアキャップ1を含むIVTを指し、プロセス3は、IVTにおける等モルNTP及びGAGを指し、プロセス4は、IVT及びキャップなしにおける等モルNTPを指す。
1日目及び29日目のマウスにおける血清サイトカイン評価(IP-10)からの結果を、図27A及び図27Bに表し、トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAが、インビボで血清サイトカインレベルを誘発し、アルファmRNA対照と同様であることを示す。結果は、mRNAが、BJヒト線維芽細胞(図28A)及び単球由来マクロファージ(MDM)(図28B)に送達されたインビトロ実験について同様であった。
mRNA発現研究(図29)は、トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAが、6回の隔週用量後にインビボで高い発現を維持したことを示した。
抗-PEG IgM評価(図30)は、N1UトリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAが、6回の隔週用量後に低い抗-PEG IgMレベル生成したことを示した。
B細胞活性化分析(図31)は、トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAでトランスフェクトされた脾臓B細胞の活性化が低く、アルファmRNA対照と同様であったことを示した。
まとめると、これらの結果は、RP精製されていないffLucをコードするトリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAが、ベースラインを超えてサイトカイン応答を誘発せず、インビボで低い抗-PEG IgMレベルを維持し、低いB細胞活性化を呈することを示す。
実施例15.ヒトエリスロポエチンをコードするトリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAの繰り返し投与の評価
この実施例では、ヒトエリスロポエチン(hEPO)をコードするmRNAの単回の0.5mpk用量を、MC3脂質ナノ粒子中に配合し、6週間(1日目、8日目、15日目、22日目、29日目、及び36日目に)C57Bl/6マウス(n=5)に毎週投与した。以下のmRNAを投与した。(1)NTPの等モル濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製された非修飾mRNA(化学Aプロセス1 dT)、(2)GTP/ATPの過剰濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス2 RP)、(3)GTP/ATPの過剰濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製されたシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス2 dT)、(4)NTPの等モル濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製されたシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス1 dT)、(5)逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNA(G47A* T7 RNAPバリアントを使用してキャップ及び生成されたトリヌクレオチド)(化学Bプロセス3 RP)、(6)オリゴdT精製によって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップG47A* mRNA(化学Bプロセス3 dT)、ならびに(7)G47A* T7 RNAPバリアントを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製されたキャップされていないシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス4 dT))。各用量後6時間、以下を評価した:血清サイトカインレベル、mRNA発現、及び抗-PEG IgMレベル。B細胞活性化を、36日目の用量後6時間評価した。化学Aは、非修飾ウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示し、化学Bは、1-メチル-シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示す。プロセス1は、IVT及びワクシニアキャップ1における等モルNTPを指し、プロセス2は、4:2:1:1のGTP:ATP:CTP:UTP及びワクシニアキャップ1を含むIVTを指し、プロセス3は、IVTにおける等モルNTP及びGAGを指し、プロセス4は、IVT及びキャップなしにおける等モルNTPを指す。
この実施例では、ヒトエリスロポエチン(hEPO)をコードするmRNAの単回の0.5mpk用量を、MC3脂質ナノ粒子中に配合し、6週間(1日目、8日目、15日目、22日目、29日目、及び36日目に)C57Bl/6マウス(n=5)に毎週投与した。以下のmRNAを投与した。(1)NTPの等モル濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製された非修飾mRNA(化学Aプロセス1 dT)、(2)GTP/ATPの過剰濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス2 RP)、(3)GTP/ATPの過剰濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製されたシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス2 dT)、(4)NTPの等モル濃度の存在下で野生型T7ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製されたシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス1 dT)、(5)逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNA(G47A* T7 RNAPバリアントを使用してキャップ及び生成されたトリヌクレオチド)(化学Bプロセス3 RP)、(6)オリゴdT精製によって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップG47A* mRNA(化学Bプロセス3 dT)、ならびに(7)G47A* T7 RNAPバリアントを使用して生成され、オリゴdT精製によって精製されたキャップされていないシュードウリジン修飾mRNA(化学Bプロセス4 dT))。各用量後6時間、以下を評価した:血清サイトカインレベル、mRNA発現、及び抗-PEG IgMレベル。B細胞活性化を、36日目の用量後6時間評価した。化学Aは、非修飾ウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示し、化学Bは、1-メチル-シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示す。プロセス1は、IVT及びワクシニアキャップ1における等モルNTPを指し、プロセス2は、4:2:1:1のGTP:ATP:CTP:UTP及びワクシニアキャップ1を含むIVTを指し、プロセス3は、IVTにおける等モルNTP及びGAGを指し、プロセス4は、IVT及びキャップなしにおける等モルNTPを指す。
1日目及び22日目のマウスにおける血清サイトカイン評価(IP-10)からの結果を、図32A及び図32Bに表し、トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAが、インビボで血清サイトカインレベルを誘発し、アルファmRNA対照と同様であることを示す。結果は、mRNAが、BJヒト線維芽細胞(図33A)及び単球由来マクロファージ(MDM)(図33B)に送達されたインビトロ実験について同様であった。
mRNA発現研究(図34)は、トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAが、6回の隔週用量後にインビボで高い発現を維持したことを示した。
抗-PEG IgM評価(図35)は、トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAが、6回の隔週用量後に低い抗-PEG IgMレベル生成したことを示した。
B細胞活性化分析(図36)は、トリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAでトランスフェクトされた脾臓B細胞の活性化が低く、アルファmRNA対照と同様であったことを示した。
まとめると、これらの結果は、RP精製されていないhEPOをコードするトリヌクレオチドキャップされたG47A* mRNAが、ベースラインを超えてサイトカイン応答を誘発せず、インビボで低い抗-PEG IgMレベルを維持し、低いB細胞活性化を呈することを示す。
実施例16.インデル頻度及び点変異頻度の評価
mRNAを、プロセス1(等モルNTP)またはプロセス2(4:2:1:1のGTP:ATP:CTP:UTP)を使用してWTまたはG47A*酵素のいずれかで調製した。次世代シーケンシング(NGS)について、mRNAを、逆転写酵素によってcDNAに変換し、アダプターをライゲーションしてシーケンシングライブラリを準備した。NGSデータを、親配列と比較し、観察された任意のインデルを表にした。インデル頻度は、WT及びG47A*に匹敵した(図37A)。同様に、NGSデータを、任意の点変異について分析した。点変異頻度は、WT及びG47A*に匹敵した(図37B)。
mRNAを、プロセス1(等モルNTP)またはプロセス2(4:2:1:1のGTP:ATP:CTP:UTP)を使用してWTまたはG47A*酵素のいずれかで調製した。次世代シーケンシング(NGS)について、mRNAを、逆転写酵素によってcDNAに変換し、アダプターをライゲーションしてシーケンシングライブラリを準備した。NGSデータを、親配列と比較し、観察された任意のインデルを表にした。インデル頻度は、WT及びG47A*に匹敵した(図37A)。同様に、NGSデータを、任意の点変異について分析した。点変異頻度は、WT及びG47A*に匹敵した(図37B)。
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が示される主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合において、それは書類の全体を包含し得る。
明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用されるように、不定冠詞「a」及び「an」は、明らかに矛盾する記載がない限り、「少なくとも1つ」を意味するものとして理解されるべきである。
明らかに矛盾する記載がない限り、1を超えるステップまたは行為を含む本明細書に請求されるあらゆる方法において、方法のステップまたは行為の順番は、方法のステップまたは行為が言及されているその順番に必ずしも限定されない。
特許請求の範囲、ならびに上の明細書において、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「有する(carrying)」、「有する(having)」、「含む(containing)」、「含む(involving)」、「有する(holding)」、「から構成される(composed of)」などのすべての移行句は、無制限、すなわち、含むが限定されないと意味すると理解されたい。「からなる」及び「から本質的になる」の移行句のみが、the United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures,Section 2111.03に示されるように、それぞれ閉鎖または半閉鎖的移行句であるものとする。
Claims (77)
- リボ核酸(RNA)ポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、前記RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて前記RNAポリメラーゼバリアントのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせるアミノ酸置換を含む、前記リボ核酸(RNA)ポリメラーゼバリアント。
- 前記アミノ酸置換が、野生型アミノ酸と比較して高いヘリックス性向を有する、請求項1に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記RNAポリメラーゼが、T7 RNAポリメラーゼである、請求項1または2に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 、
前記ループ構造が、Cヘリックス構造中にある、請求項1~3のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント。 - 前記ループ構造が、Cリンカー構造中にある、請求項1~4のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記アミノ酸置換が、高ヘリックス性向アミノ酸置換である、請求項1~4のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記高ヘリックス性向酸置換が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、及びグルタミン酸から選択される、請求項6に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記高ヘリックス性向アミノ酸置換が、アラニンである、請求項7に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記T7 RNAポリメラーゼバリアントが、配列番号1と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記T7 RNAポリメラーゼが、E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257、A258、G259、A260、L261、及びA262から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号1と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項9に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記アミノ酸置換が、S43Aを含む、請求項10に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記アミノ酸置換が、G47Aを含む、請求項10に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 追加のC末端アミノ酸をさらに含む、請求項1~12のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記追加のC末端アミノ酸が、グリシン(G)を含む、請求項13に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記RNAポリメラーゼバリアントが、配列番号108のアミノ酸配列を含む、請求項11、13、または14のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記RNAポリメラーゼバリアントが、配列番号110のアミノ酸配列を含む、請求項12~14のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 野生型RNAポリメラーゼと比較して追加のC末端アミノ酸を含む、リボ核酸(RNA)ポリメラーゼバリアント。
- 前記RNAポリメラーゼバリアントが、T7 RNAポリメラーゼバリアントである、請求項17に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記RNAポリメラーゼバリアントが、野生型T7 RNAポリメラーゼと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する、請求項18に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記RNAポリメラーゼバリアントが、野生型T7 RNAポリメラーゼと比較してアミノ酸置換を含む、請求項17または18に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 2つの追加のC末端アミノ酸を含む、請求項17~20のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記2つの追加のC末端アミノ酸が、同じ種類のアミノ酸または2つの異なる種類のアミノ酸を含む、請求項21に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 1~5個または1~10個の追加のC末端アミノ酸を含む、請求項17~22のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- FAFAXn (配列番号171)モチーフを含むC末端を含み、Xが任意のアミノ酸であり、nがゼロより大きい任意の整数である、RNAポリメラーゼバリアント。
- Xが、GまたはAである、請求項24に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- nがゼロより大きい任意の整数であり、任意選択により、nが1、2、3、4、または5である、請求項24または25に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- FAFAG(配列番号329)モチーフを含むC末端を含む、RNAポリメラーゼバリアント、任意選択によりT7 RNAポリメラーゼバリアント。
- XAFAXnモチーフ、FXFAXnモチーフ、FAXAXnモチーフ、またはFAFXXnモチーフを含むC末端を含み、各Xが任意のアミノ酸であり、nはゼロより大きい任意の整数である、RNAポリメラーゼバリアント、任意選択によりT7 RNAポリメラーゼバリアント。
- アミノ酸置換をさらに含む、請求項17~28のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記アミノ酸置換が、野生型RNAポリメラーゼのE42、S43、Y44、E45、M46、G47、R257、A258、G259、A260、L261、及びA262から選択される位置の高ヘリックス性向アミノ酸であり、任意選択により、前記野生型RNAポリメラーゼが、配列番号1のアミノ酸配列または配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項29に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記高ヘリックス性向アミノ酸が、アラニンである、請求項30に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- 前記アミノ酸置換が、S43AまたはG47Aである、請求項31に記載のRNAポリメラーゼバリアント。
- RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を請求項1~32のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼと接触させることを含む、リボ核酸(RNA)を生成する方法。
- ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、RNA転写物の生成をもたらす条件下で、DNA鋳型を請求項1~32のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロ転写(IVT)反応を行う方法。
- 前記生成されたRNA転写物が、任意選択により未精製の形態で細胞に送達されたとき、野生型RNAポリメラーゼを用いて生成されたRNAと比較して少なくとも50%低いサイトカイン応答を刺激する、請求項33または34に記載の方法。
- 生成された二本鎖RNA(dsRNA)転写物の濃度が、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたdsRNA転写物と比較して少なくとも50%低い、請求項33~35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生成されたRNA転写物の20%未満が、3´不均一性を示す、請求項33~36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生成されたRNA転写物の50%未満が、二本鎖混入物である、請求項33~37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生成されたRNA転写物の50%未満が、ランオンRNA転写物である、請求項33~38のいずれか1項に記載の方法。
- 生成された完全長RNA転写物の量が、前記DNA鋳型の量よりも少なくとも15倍大きい、請求項33~39のいずれか1項に記載の方法。
- 二本鎖混入物:生成された完全長RNA転写物の比が、1:1未満である、請求項33~40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生成されたRNA転写物が、前記DNA鋳型と比較して100ヌクレオチドあたり1未満の変異を有する、請求項33~41のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1~32のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアントをコードする核酸。
- 請求項43に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項43に記載の核酸または請求項44に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1~32のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼバリアント及び任意選択によりインビトロ転写(IVT)試薬を含む、組成物またはキット。
- 請求項33~42のいずれか1項に記載の方法により生成される、リボ核酸(RNA)、任意選択によりメッセンジャーRNA(mRNA)。
- 脂質ナノ粒子中に製剤化された請求項47に記載のRNAであって、任意選択により、前記脂質ナノ粒子が、20~60%のイオン化可能なアミノ脂質、5~25%の非カチオン性脂質、25~55%のステロール、及び0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む、前記RNA。
- RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をRNAポリメラーゼバリアント、任意選択によりT7 RNAポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む、リボ核酸(RNA)合成のための共転写キャッピング方法。
- 前記生成されたRNA転写物の80%超、85%超、90%超、または95%超が、機能性キャップを含む、請求項49に記載の方法。
- 前記ヌクレオシド三リン酸が、非修飾もしくは修飾ATP、修飾もしくは非修飾UTP、修飾もしくは非修飾GTP、及び/または修飾もしくは非修飾CTPを含む、請求項49または50に記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼバリアントが、請求項1~32のいずれか1つに記載のRNAポリメラーゼバリアントである、請求項49~51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体が、前記反応において等モル濃度で存在する、請求項49~52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比が、1:1より大きいか、または1:1に等しく、任意選択により、前記ヌクレオシド三リン酸がGTP及び/またはATPを含む、請求項49~53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キャップ類似体が、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップである、請求項49~54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キャップが、以下の配列:GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG、及びGUUから選択される配列を含む、請求項55に記載の方法。
- 前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列:
(a)m7GpppApA、m7GpppApC、m7GpppApG、m7GpppApU、m7GpppCpA、m7GpppCpC、m7GpppCpG、m7GpppCpU、m7GpppGpA、m7GpppGpC、m7GpppGpG、m7GpppGpU、m7GpppUpA、m7GpppUpC、m7GpppUpG、及びm7GpppUpU;
(b)m7G3′OMepppApA、m7G3′OMepppApC、m7G3′OMepppApG、m7G3′OMepppApU、m7G3′OMepppCpA、m7G3′OMepppCpC、m7G3′OMepppCpG、m7G3′OMepppCpU、m7G3′OMepppGpA、m7G3′OMepppGpC、m7G3′OMepppGpG、m7G3′OMepppGpU、m7G3′OMepppUpA、m7G3′OMepppUpC、m7G3′OMepppUpG、及びm7G3′OMepppUpU;
(c)m7G3′OMepppA2′OMepA、m7G3′OMepppA2′OMepC、m7G3′OMepppA2′OMepG、m7G3′OMepppA2′OMepU、m7G3′OMepppC2′OMepA、m7G3′OMepppC2′OMepC、m7G3′OMepppC2′OMepG、m7G3′OMepppC2′OMepU、m7G3′OMepppG2′OMepA、m7G3′OMepppG2′OMepC、m7G3′OMepppG2′OMepG、m7G3′OMepppG2′OMepU、m7G3′OMepppU2′OMepA、m7G3′OMepppU2′OMepC、m7G3′OMepppU2′OMepG、及びm7G3′OMepppU2′OMepU;または
(d)m7GpppA2′OMepA、m7GpppA2′OMepC、m7GpppA2′OMepG、m7GpppA2′OMepU、m7GpppC2′OMepA、m7GpppC2′OMepC、m7GpppC2′OMepG、m7GpppC2′OMepU、m7GpppG2′OMepA、m7GpppG2′OMepC、m7GpppG2′OMepG、m7GpppG2′OMepU、m7GpppU2′OMepA、m7GpppU2′OMepC、m7GpppU2′OMepG、及びm7GpppU2′OMepUから選択される配列を含む、請求項56に記載の方法。 - 前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列:GAG、GCG、GUG、及びGGGから選択される配列を含む、請求項56または57に記載の方法。
- 前記トリヌクレオチドキャップが、配列GAGを含む、請求項58に記載の方法。
- 前記トリヌクレオチドキャップが、GpppA2′OmepGを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む、請求項49~60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシシチジン残基を含む、請求項49~60のいずれか1項に記載の方法。
- RNA合成のための共転写キャッピング方法であって、RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を(a)T7 RNAポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、前記RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、前記T7 RNAポリメラーゼバリアント、(b)ヌクレオシド三リン酸、及び(c)配列GpppA2′OmepGを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む、前記方法。
- 前記生成されたRNA転写物が、任意選択により未精製の形態で、細胞に送達されたときに、検出可能なサイトカイン応答を刺激しないか、またはベースライン対照を上回るサイトカイン応答を刺激しない、請求項49~63のいずれか1項に記載の方法。
- インビトロ転写(IVT)RNA及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、IVT後の精製なしでサイトカイン誘導RNA混入物を実質的に含まない、前記組成物。
- インビトロ転写(IVT)RNA及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、5%未満のキャップされていないRNA種を含む、前記組成物。
- 前記IVT RNAの80%超、85%超、90%超、または95%超が機能性キャップを含む、請求項65または66に記載の組成物。
- 前記IVT RNAが化学修飾されていない、請求項65~67のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記IVT RNAが化学修飾されている、請求項65~67のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記IVT RNAの95%超が、一本鎖完全長転写物を含む、請求項65~69のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記RNAが、
RNA転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を(a)T7 RNAポリメラーゼバリアントであって、野生型RNAポリメラーゼと比較して、前記RNAポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてRNAポリメラーゼバリアントの少なくとも1つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、前記T7 RNAポリメラーゼバリアント、(b)ヌクレオシド三リン酸、及び(c)配列GpppA2′OmepGを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含むプロセスによって生成され、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置+1に2´-デオキシチミジン残基を含む、請求項65~70のいずれか1項に記載の組成物。 - 野生型T7 RNAポリメラーゼと少なくとも90%の同一性を有し、(a)配列番号1のアミノ酸47位に対応するアミノ酸位置のアラニン及び(b)追加のC末端グリシンを含むように修飾されているアミノ酸配列を含む、T7リボ核酸(RNA)ポリメラーゼ。
- トリヌクレオチドキャップをさらに含む、請求項72に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
- 前記トリヌクレオチドキャップが、GpppA2′OmepGである、請求項73に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
- 野生型T7 RNAポリメラーゼと少なくとも90%の同一性を有し、(a)配列番号1のアミノ酸43位に対応するアミノ酸位置のアラニン及び(b)追加のC末端グリシンを含むように修飾されているアミノ酸配列を含む、T7リボ核酸(RNA)ポリメラーゼ。
- トリヌクレオチドキャップをさらに含む、請求項75に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
- 前記トリヌクレオチドキャップが、GpppA2′OmepGである、請求項76に記載のT7 RNAポリメラーゼ。
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