CN117683790A

CN117683790A - 一种嗜肺军团菌相关抗原的mRNA疫苗及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN117683790A
Application number: CN202311697136.8A
Authority: CN
Inventors: 詹晓勇; 夏恒; 何韵茹; 邱皓炜; 查高峰
Original assignee: Seventh Affiliated Hospital Of Sun Yat Sen University Shenzhen
Current assignee: Seventh Affiliated Hospital Of Sun Yat Sen University Shenzhen
Priority date: 2023-12-12
Filing date: 2023-12-12
Publication date: 2024-03-12

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种嗜肺军团菌相关抗原的mRNA疫苗及其制备方法与用途。为了应对军团菌感染，本发明公开了一种能有效预防嗜肺军团菌感染的核酸分子及其脂质纳米颗粒，该核酸分子可编码表达嗜肺军团菌相关抗原Pal、和/或PilE、和/或FlaA、和/或MompS。同时，该核酸分子及其脂质纳米颗粒具有良好的免疫原性，可以有效诱导机体产生免疫反应，激活体液免疫和细胞免疫，使机体产生特异性抗体中和嗜肺军团菌。而且，该核酸分子及其脂质纳米颗粒只需要较低剂量即可激活机体的体液免疫，产生军团菌特异IgG抗体，对防治军团菌病具有良好效果。

Description

一种嗜肺军团菌相关抗原的mRNA疫苗及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种嗜肺军团菌相关抗原的mRNA疫苗及其制备方法与用途。

背景技术

军团菌病(Legionnaires'diseases LD)是由军团菌(Legionella)属细菌引起的感染，病死率高达10％。军团菌病是一种被低估的疾病，自1977年初首次发现以来，一直保持着较高的发病率。而军团菌广泛存在于自然界，可通过空气中含军团菌的气溶胶进行传播。其中，常见的传染源包括水源和土壤。当前，军团菌主要经由空调系统播散，由于空调的广泛应用，军团菌病已然成为全世界的一个公共卫生问题。

根据2007年世界卫生组织指南，军团菌感染导致的疾病可分成三种亚型：肺炎性军团菌病、肺外综合征、庞蒂亚克热。目前世界上共发现了71种军团菌，其中至少有19种是人类肺炎的病原体，而引起疾病的主要是嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,LP)(占病例的91.5％)。研究表明，具有较强免疫原性的LP蛋白，以及能够产生一定浓度体液和细胞免疫反应的DNA/蛋白疫苗靶点均有可能成为治疗军团菌的候选靶点。这些靶点主要包括外膜蛋白(MompS)、鞭毛蛋白(FlaA)、IV型菌毛蛋白(PilE)、肽聚糖相关脂蛋白(Pal)等。

目前，军团菌病的治疗主要以敏感抗生素抗感染治疗为主，支持治疗为辅，并根据患者的临床状况进行一些对症处理。治疗的难点在于严重病例可能延误治疗时机，因此早发现，及早抗感染治疗是关键。尽管抗感染治疗对大多数人有效，但是具有基础疾病的老年嗜肺军团菌感染者约有30％将进入重症监护室，约15-20％死亡。而且，截至目前，尚无可以预防军团菌病的疫苗。因此，军团菌疫苗的研发迫在眉睫。而相对传统疫苗，mRNA疫苗因具有快捷高效安全的优势而成为新兴传染病预防性疫苗开发的首选策略。综上可见，开发军团菌mRNA疫苗在军团菌病的防治方面具有重要的应用前景。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明基于嗜肺军团菌特异有效抗原，制备了用于嗜肺军团菌相关疾病的核酸分子及其LNP(脂质体纳米颗粒)，该mRNA或LNP可以编码具有较强免疫原性的Pal，和/或PilE，和/或FlaA、和/或MompS，只需要低剂量即可有效激活机体的体液免疫，起到预防或杀伤嗜肺军团菌的效果。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明第一方面提供了一种编码嗜肺军团菌抗原的核酸分子，所述核酸分子包括编码嗜肺军团菌相关抗原肽聚糖相关脂蛋白Pal(编码基因pal)，和/或IV型菌毛蛋白PilE(编码基因pilE)，和/或鞭毛蛋白FlaA(编码基因flaA)，和/或主要外膜蛋白MompS(编码基因mompS)的核苷酸。

所述核酸分子包含5’-帽结构、5’-UTR、3’-聚核苷酸序列以及3’-UTR中的至少一种。其中，5’-UTR为10-200个核苷酸，优选的50-100个核苷酸；3’-UTR为50-120个核苷酸；3’-聚核苷酸序列为超过28+80个“A”，进一步优选为30+85个“A”。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO：1所示的mRNA、SEQ ID NO：2所示的mRNA、SEQ ID NO：3所示的mRNA、SEQ ID NO：4所示的mRNA中的至少一种。

其中，编码FlaA的核苷酸的具体序列为在flaA(28-205aa)关键抗原结构序列的N端额外加入来自pal基因的分泌信号肽序列“MKAGSFYKLGLLVASAVLVAA”或其它能够增强flaA表达的序列，以显著提高flaA的抗原表达水平。

本发明第二方面提供了一种核酸-脂质体复合物，所述核酸-脂质体复合物包括第一方面所述的核酸分子，以及将核酸分子包封在脂质壳中的阳离子脂质纳米颗粒，所述阳离子脂质纳米颗粒包括可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。

优选地，所述阳离子脂质纳米颗粒与核酸分子的摩尔比为1：1-10：1。

优选地，按摩尔百分比计，所述阳离子脂质纳米颗粒包括20-49％可质子化的阳离子脂质、35-50％结构脂质、5-15％辅助脂质和1-5％聚乙二醇化脂质。

优选地，所述结构脂质包括胆固醇及其衍生物，所述辅助脂质包括DSPC、DOPE、DOPG、DOPS，所述聚乙二醇化脂质包括PEG-DMG、PEG-DSPE。所述可质子化的阳离子脂质选自来源于专利CN202111017566.1中的阳离子脂质。

更优选地，所述结构脂质为胆固醇，所述辅助脂质为DSPC，所述聚乙二醇化脂质为PEG-DMG。

本发明第三方面提供了第二方面所述核酸-脂质体复合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质溶于有机溶剂中，得到有机相；

S2、将核酸分子溶于无机盐缓冲液中，得到水相；

S3、将有机相和水相充分混匀后得到混合液，替换混合液中的缓冲体系及有机相中的溶剂后得到核酸-脂质体复合物。

优选地，所述有机相中可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质的总浓度为10-30mg/mL，所述水相中核酸分子的浓度为0.1-1.0mg/mL，所述有机相和水相的体积比为1：2-6。

更优选地，所述有机相中可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质的总浓度为15-20mg/mL，所述水相中核酸分子的浓度为0.25-0.5mg/mL，有机相和水相的体积比为1：3。

优选地，所述有机溶剂包括(但不限于)乙醇，所述水相的缓冲液包括(但不限于)柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐溶液、甘氨酸溶液。

优选地，替换混合液中的溶媒缓冲液及有机相中的溶剂的方法为：采用缓冲液将混合液稀释10-200倍，优选总稀释倍数不低于100倍，再浓缩至所需浓度。

本发明第四方面提供了第一方面所述的核酸分子，和/或第二方面所述的核酸-脂质体复合物在制备防治军团菌感染的药物中的应用。

本发明提供的mRNA或LNP(脂质体纳米颗粒)具有良好的免疫原性，可以有效诱导机体产生免疫反应，激活体液免疫和细胞免疫，使机体产生特异性抗体中和嗜肺军团菌。而且，该核酸分子及其脂质纳米颗粒只需要较低剂量即可激活机体的体液免疫，产生军团菌特异IgG抗体，对防治军团菌病具有良好效果。

优选地，所述防治军团菌感染的药物包括(但不限于)预防肺炎性军团菌病、肺外综合征、庞蒂亚克热的疫苗。

本发明利用mRNA和新型LNP(脂质体纳米颗粒)技术联合开发的一种疫苗，以mRNA作为疫苗的主要成分，制备工艺简单，无需使用细胞增殖病毒或生产重组蛋白；以mRNA作为疫苗的主要成分，具有研发快速、易产业化等优点；使用小剂量的多价疫苗即能达到足够的保护效果，具有良好的安全性、有效性。

更优选地，疫苗给药途径包括(但不限于)雾化给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、眼部给药。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种能有效预防军团菌感染的核酸分子及其脂质纳米颗粒。其中，该核酸分子可编码表达嗜肺军团菌相关抗原Pal、和/或PilE、和/或FlaA、和/或MompS。而且，该核酸分子及其脂质纳米颗粒具有良好的免疫原性，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应，将该核酸分子及其脂质纳米颗粒递送至体内后能够在机体内表达Pal、和/或PilE、和/或FlaA、和/或MompS蛋白，触发机体的免疫反应，能够使机体产生抗体中和军团菌。同时，该核酸分子及其脂质纳米颗粒只需要低剂量即可有效激活机体的体液免疫，分泌大量军团菌相关抗原特异的IgG，可以较好地达到预防军团菌感染的效果。此外，该核酸分子或其脂质纳米颗粒制备快速简便，可在短期内实现大规模生产，有利于快速应对预防嗜肺军团菌引起的相关感染性疾病。特别是以该核酸分子(mRNA)及其脂质体纳米颗粒)作为主要成分用于开发疫苗，无需使用细胞增殖病毒或生产重组蛋白，具有研发快速、易产业化等优点；使用小剂量的多价疫苗即能达到足够的保护效果，具有良好的安全性、有效性。

附图说明

图1为pilE核酸序列优化前后的比对结果；

图2为pal核酸序列优化前后的比对结果；

图3为palSP-flaA(28-205aa)核酸序列优化前后的比对结果；

图4为mompS核酸序列优化前后的比对结果；

图5为用于合成军团菌4个候选抗原的mRNA模板质粒图谱；

图6为军团菌4个候选抗原的mRNA结构示意图；

图7为军团菌4个候选抗原的mRNA的琼脂糖凝胶电泳图(显示大小正确，条带均一)；

图8为候选抗原mRNA的毛细管电泳结果(峰图和条带显示mRNA完整性高)；

图9为合成的军团菌4个候选抗原mRNA在HEK293T细胞中表达的Western-blot检测结果；

图10为Expi293细胞真核表达纯化军团菌4个候选抗原蛋白的SDS-PAGE电泳结果(纯化的候选抗原蛋白用于检测mRNA疫苗注射小鼠后诱发的血清中特异性抗体滴度)；

图11为LNP-mRNA的制备示意图；

图12为分别包裹了军团菌4个候选抗原mRNA的LNP脂质纳米颗粒的粒径分布峰图(粒径主要集中在80nm-90nm之间，是比较理想的粒径范围)，以及LNP-mRNA脂质体纳米颗粒的包封率测定结果(纳米颗粒包封率在95％左右，包封率良好)；

图13为小鼠免疫军团菌mRNA疫苗分组、接种方式(肌注)及采血时间轴图；

图14为嗜肺军团菌mRNA疫苗免疫小鼠后，ELISA检测小鼠机体产生的抗军团菌候选抗原的特异性抗体水平(滴度)；

图15为通过生存率数据评估mRNA-LNP对通过鼻饲法感染2×10⁸嗜肺军团菌ATCC33152的AJ小鼠的保护作用。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1mRNA疫苗的制备

(1)军团菌候选抗原mRNA模板质粒构建：

将包含T7启动子，5’/3’-UTR(来源于morderna的新冠mRNA疫苗的UTR序列)，HA标签(用于Westen blot检测)，终止密码子和polyA结构的序列(30A+GCATATGACT+85A)连接到pUC57载体质粒(BsaI free)的EcoRI与HindIII之间(此步骤交由金斯瑞公司完成)，构建得到能高效翻译表达mRNA的通用型框架载体质粒，记为pIVT-polyA-BsaI。

T7启动子(SEQ ID NO：5)：TAATACGACTCACTATA；

5’-UTR(SEQ ID NO：6)：GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACC；

HA标签(SEQ ID NO：7)：TACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCGCA；

终止密码子：TGATGA；

3’-UTR(SEQ ID NO：8)：

GCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCT CCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC；

30A+GCATATGACT+85A+BsaI(SEQ ID NO：9)：

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAATGAGACC(BsaI酶切位点)；

pIVT-polyA-BsaI载体质粒的序列(SEQ ID NO：10)：

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCG

GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGT

TGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCT

TAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAG

ACCCCGGCGCCGCCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTGAGCTGGAGC

CTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCA

CCCGTACCCCCGTGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGA

GACCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACA

ATTCCACACGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGC

GGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCA

GGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGC

GTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCT

CAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGG

AAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTT

TCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGG

TGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGC

TGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCC

ACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACA

GAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCT

GCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAA

ACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGA

AAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGA

ACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTA

GATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTT

GGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTT

CGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTT

ACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGTGAACCACGCTCACCGGCTCCAGAT

TTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTT

TATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCA

GTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTC

GTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCC

CCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAG

TTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCAT

GCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAAT

AGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCC

ACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTC

TCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTG

ATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAA

ATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCT

TTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTG

AATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCC

ACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC。

在pIVT的基础上，对嗜肺军团菌病毒候选抗原基因pal(NCBI GenBank accessionno.CP015928.1:2296241to 2296771)、pilE(NCBI GenBank accession no.CP015928.1:2147445to2147873)、flaA(NCBI GenBank accession no.CP015928.1:1488494to1489921)、mompS(NCBI GenBank accession no.CP015928.1:3360757to 3361623)进行序列优化，优化的基本原则包括：在保证真核表达密码子偏好的基础上，提高CDS区的GC含量到60％-65％之间，以规避CDS区内类似T7启动子的序列(减少可能存在的非特异性转录起始)，避免含有与核糖体结合位点和/或翻译起始位点互补的序列，以及规避I类和II类转录终止子的序列(避免非必要的转录中断产物)和规避BsaI酶切位点(本实施例使用的是BsaI来线性化模板质粒，所以要规避CDS区里可能含有的BsaI酶切位点)，优化后的序列与原序列进行序列比对后发现各抗原核酸优化后序列与原始核苷酸序列差异明显(见图1-图4)

此外，为了促使FlaA表达后分泌至胞外，提高FlaA-LNP-mRNA的免疫原性，特异地将来自嗜肺军团菌pal基因的信号肽编码基因(1-63nt，序列为：ATGAAGGCCGGCAGCTTCTACAAGCTGGGCCTGCTGGTGGCCAGCGCCGTGCTGGTGG CCGCC，SEQ ID NO：11；氨基酸序列为：MKAGSFYKLGLLVASAVLVAA，SEQ ID NO：12)融合至flaA基因片段(编码28-205aa)的5’端，构建优化后的flaA序列。

用于IVT的mRNA抗原模板质粒构建方法如下：

通过无缝克隆技术将4个基因(优化后的pilE，pal，flaA，mompS基因序列由金斯瑞公司合成)分别克隆到步骤(1)构建的pIVT-polyA-BsaI通用型框架载体质粒中，首先通过引物pIVT-F和pIVT-R(表1)将含T7启动子，UTR和polyA序列的pIVT空载体(pIVT-polyA-BsaI)通过PCR扩增出来并纯化，然后分别用各抗原基因特异性引物(表1)扩增出对应的CDS序列，再通过无缝克隆技术(方法参见碧云天无缝克隆试剂盒D7010M说明书)将对应的抗原基因重组到pIVT-polyA-BsaI空载体(SEQ ID NO：10)中，转化DH5α感受态后挑取单克隆交由擎科生物技术有限公司测序，并筛选polyA的“A”尾长度超过28+80个“A”的正确单克隆保种。构建好的mRNA模板质粒分别记为pIVT-T7p-pilE-polyA-BsaI；pIVT-T7p-pal-polyA-BsaI；pIVT-T7p-flaA(28-205Aa)-polyA-BsaI；pIVT-T7p-mompS-polyA-BsaI(图5)。

表1构建mRNA模板质粒所用的引物(5’-3’)

IVT合成pilE，pal，flaA(28-205aa)和mompS mRNA过程：

1)将上一步构建好的pIVT-T7p-pilE-polyA-BsaI；pIVT-T7p-pal-polyA-BsaI；pIVT-T7p-flaA(28-205aa)-polyA-BsaI；pIVT-T7p-mompS-polyA-BsaI质粒用Axygen的质粒中抽试剂盒(MD-P-25，参见试剂盒使用说明书)进行质粒提取，再通过BsaI限制性内切酶(近岸蛋白)过夜酶切，最后通过DNA纯化磁珠(诺唯赞，RNase Free)进行线性化质粒的纯化，并溶解于无酶水中测浓度后置于-20℃备用。

2)体外转录合成RNA(1mL IVT体系)：

10×transcription buffer	100μL
		NTP(A、G、C、m1ψ)	各70μL
DNA模板(线性化的模板质粒)	终浓度：50ng/μL左右
		Pyrophosphatase Inorganic(yeast)	50μL
RNase inhibitor	30μL
		T7 RNA聚合酶	70μL
补充无酶H₂O	至总体积1mL

轻弹混匀后置于37℃反应2小时，加入100μL的Dnase I在37℃消除DNA 20分钟，中间取出混匀一次，然后加入2倍体积的无酶水混匀，再加入等体积的RNA纯化磁珠(诺唯赞)对合成好的RNA进行纯化。

3)RNA加帽反应(10mL加帽反应体系)：

轻弹混匀后置于37℃反应30分钟，中间每隔10分钟取出颠倒混匀一次，反应结束后加入0.6倍体积的RNA纯化磁珠(诺唯赞)进行RNA纯化。

4)Oligo(dT)²⁵亲和填料(Thermo)纯化去除转录中断和降解的RNA产物

具体纯化的步骤如下：

A、使用5倍柱体积的缓冲液(10mm Tris-HCl，0.5M NaCl,1mm EDTA,pH 7.4)平衡色谱柱。

B、将通过RNA亲和磁珠(诺维赞)纯化的RNA样品溶解于缓冲液(10mM Tris-HCl,0.5M NaCl,1mM EDTA,pH 7.4)中。

C、将样品以50-150cm/h的速度加载到色谱柱上，色谱柱温控制在65℃。

D、用额外的5倍柱体积的缓冲液(10mM Tris-HCl,0.5M NaCl,1mM EDTA,pH 7.4)洗涤色谱柱，然后用不同盐离子缓冲液(NaCl的浓度从500mM线性降低至100mM)洗涤与填料结合不稳的杂质，直到导电率稳定。

E、使用无酶无菌水洗脱色谱柱，即为带有polyA结构序列的mRNA，再将收集的mRNA样品通过RNA亲和磁珠纯化，也可通过超滤管或等效放大后采用切向流等设备浓缩纯化获得pilE，pal，flaA和mompS mRNA(图6)。pilE，pal，flaA和mompS mRNA的序列(为了统一碱基序列的格式，这里采用T来代表U)，如下所示：

pilE mRNA(SEQ ID NO：1)：

GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACCATGCCCGGCGATGTGATGAGAATGAAGGGCTTCACCCTGATCGAGCTGATGATCGTGGCCGCCATCCTCGGCATCCTGGTGGCCATCGCCATCCCCGCCTACCAGGACTACACCATCAGAGCCAGAGTGGTGGAGGGCCTGGAGATGGCCTCCGCCGCTAAGCTGGCCGTGGTGGAGACATCCCTGATCGACAACACCCTGCCTGCCAACCAGGCCGACACCGGCTACACATCCCCTGCCCCCACAATCAATGTGGCCAGCATCGCCATCGGAAACCAGGGCATCATCACAATCACATACACAGCCAATGCCGGCAACGGCACAATCACAATGGTGCCTACCATCGATGCCACCAATAGAATCCTGACATGGGACTGCACAGGCGGCACCCTGATCAGCAAGTACAGACCCGCCTACTGTAGGCCTTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTGATGAGCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

pal mRNA(SEQ ID NO：2)：

GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACCATGAAGGCCGGCAGCTTCTACAAGCTGGGCCTGCTGGTGGCCAGCGCCGTGCTGGTGGCCGCCTGCAGCAAGACCCCCGGCAGCGCCGACGGCGGCGCCGCCGTGGGCGACGGCGACGCCACCGCCCAGGGCCTGGGCCAGATGACCCACTTCGCCGGCCAGGAGCCCGGCGAGAGCTACACCACCCAGGCCCCCCACAACCAGCTGTACCTGTTCGCCTACGACGACAGCACCCTGGCCAGCAAGTACCTGCCCAGCGTGAACGCCCAGGCCGAGTACCTGAAGACCCACCCCGGCGCCAGAGTGATGATCGCCGGCCACACCGACGAGAGAGGCAGCAGAGAGTACAACGTGGCCCTGGGCGAGAGAAGAGCCGACACCGTGGCCGAGATCCTGAGAATGGCCGGCGTGAGCAGACAGCAGATCAGAGTGGTGAGCTACGGCAAGGAGAGGCCCGCCAACTACGGCCACGACGAGGCCAGCCACGCCCAGAACAGAAGAGTGGAGTTCATCTACGAGGCCACCAGATACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTGATGAGCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

flaA[palSP+flaA(28-205aa)]mRNA(SEQ ID NO：3)：

GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACCATGAAGGCCGGCAGCTTCTACAAGCTGGGCCTGCTGGTGGCCAGCGCCGTGCTGGTGGCCGCCAGCATCCAGAGACTGAGCTCCGGCCTGAGGATCAACTCCGCCAAGGATGACGCCGCCGGCCTGGCTATCAGCCAGAGAATGACAGCCCAGATCAGGGGCATGAACCAGGCCGTGAGGAACGCCAACGACGGCATCAGCCTGGCCCAGGTGGCCGAGGGAGCCATGCAGGAGACAACCAACATCCTGCAGAGAATGAGGGAGCTGTCCGTGCAGGCCGCCAATTCCACCAATAACAGCTCCGATAGATCCAGCATCCAGAGCGAGATCAGCCAGCTGAAGTCCGAGCTGGAGAGAATCGCCCAGAATACAGAGTTTAATGGCCAGAGAATCCTGGATGGCAGCTTTAGCGGCGCCTCCTTCCAGGTGGGCGCCAACAGCAATCAGACAATCAACTTCAGCATCGGCAGCACCAAGGCCTCCAGCCTGGGCGGAATCGCCACAGCCACAGGCACCGAGGTGGCCGGAGCCGCTGCTGCTGACATCACCATCGCCATCGGCGGCGGCGCCGCTACATCCATCAACAGCAGCGCCAATTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTGATGAGCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

mompS mRNA(SEQ ID NO：4)：

GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACCATGCTGAACCTGAAGAAGACCGCCGTGGCCGTGCTGGCCCTGGGATCTAGCGCCGTGTTCGCCGGCACAATGGGCCCCGTGTGTACCCCCGGCAACGTGACCGTGCCCTGCGAGAGAACAGCCTGGGATATCGGCATCACCGCCCTGTACCTGCAGCCTATCTACGACGCCGATTGGGGCTACAATGGCTTCACCCAGGTGGGCGGCTGGAGACACTGGCACGATGTGGATCACGAGTGGGACTGGGGCTTCAAGCTGGAGGGCTCCTACCACTTCAACACAGGCAATGATATCAACGTGAACTGGTACCACTTCGATAATGATTCCGATCACTGGTTCGACTTCGCCAACTGGCACAATTACAATAACAAGTGGGACGCCGTGAACGCCGAGCTGGGCCAGTTTGTGGACTTTTCCGCCAATAAGAAGATGAGGTTCCACGGCGGCGTGCAGTACGCCAGGATCGAGGCCGATGTGAATAGGTACTTCAACAATTTCGCCTTCAATGGCTTTAACAGCAAGTTTAACGGCTTCGGCCCCAGGACAGGCCTGGATATGAACTACGTGTTCGGCAATGGCTTCGGCATCTACGCCAAGGGCGCCGCCGCCATCCTGGTGGGAACCTCTGATTTTTACGATGGCATCGGCTTCGTGACCGGCTCCAAGAACGCCATCGTGCCCGAGCTGGAGGCCAAGCTGGGCGCTGACTACACATACGCCATGGCCCAGGGCGACCTGACCCTGGACGTGGGATACATGTGGTTCAACTACTTTAATGCCATGCACAACACAGCCACAAACGGCCTGGAAACCGACTTTGCCGCCAGCGGCCCTTACATCGGCCTGAAGTACGTGGGCAACGTGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTGATGAGCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

(3)RNA质量检测：

首先，通过琼脂糖凝胶电泳对合成的pilE，pal，flaA和mompS mRNA进行初步的质量检测，具体过程为：将0.5μg mRNA样品用5μl无酶水稀释后加入等体积的2×RNA loadingbuffer混匀，85℃加热变性2分钟后立刻置于冰上2分钟，然后在浓度为1.5％的琼脂糖凝胶中通过100V电泳30min，使用RNA marker(Thermo，SM1821)来指示样品RNA大小，结果见图7所示。同时，还使用毛细管电泳仪(安捷伦5200)对制备的pilE，pal，flaA和mompS mRNA进行完整性检测，检测结果说明合成的mRNA完整性良好(图8)。

此外，通过Western-blot检测嗜肺军团菌疫苗mRNA在细胞水平的表达情况。转染前24小时，将Hek293T细胞(中国科学院昆明细胞库，KCB 200744YJ)分别铺于12孔板中，然后按照每孔1μg mRNA+2.5μL lip2000转染试剂(Thermo Scientific，货号：11668019)的比例进行细胞转染，24小时后收集细胞裂解液上清，加入5×SDS loading在100℃变性5分钟后进行Western-blot实验，一抗为HA标签单克隆抗体(CST，#2367s)，ECL化学发光检测结果见图9，根据蛋白marker指示，各目的蛋白条带位置与预测的抗原蛋白大小一致，同时位于抗原蛋白C端的HA标签能被HA单克隆抗体特异性识别，说明整个抗原蛋白获得了完整的翻译，这为下一步将mRNA通过LNP包裹后进行免疫动物提供了关键的参考和基础。实施例2候选抗原蛋白的真核表达纯化

将Pal、pilE、flaA、momps经优化后的基因序列构建到pCDNA3.1载体中，带有His标签以便通过镍柱纯化(委托通用生物完成)，将测序正确的质粒通过PEI转染到200mLExpi293 cells中，第5天收集培养基，通过Ni NTA Beads 6FF柱(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：C600793)纯化，纯化的具体步骤如下：

(1)收集的培养基经0.45uM滤膜过滤后由蠕动泵进样到Ni NTA Beads 6FF预装柱中；

(2)使用PBS(含20mM咪唑，pH7.4)洗涤柱子；

(3)用PBS(含50mM咪唑，pH7.4)洗涤柱子；

(4)用PBS(含200mM咪唑，pH7.4)从柱子中洗脱目的蛋白；

(5)将步骤(4)洗脱收集的样品根据蛋白稳定性进行部分浓缩后透析到PBS中封装后冻存(虽然部分蛋白的表达较低，但是通过浓缩后能够满足作为抗体检测抗原使用)，通过SDS-PAGE电泳后进行考马斯亮蓝染色分析，结果见图10，表达得到Pal、pilE、flaA、momps四种纯抗原蛋白。

实施例3LNP-mRNA脂质体纳米颗粒的包裹与鉴定

(1)脂质体纳米颗粒的制备(其简要流程如图11所示)：

3)制备脂质纳米颗粒：利用微流控纳米药物制备系统(迈安纳，INano E)使有机相和水相以1：3的体积比在微流控芯片中混合，混合流速为12mL/min。之后往所得溶液中添加PBS缓冲液至100倍体积进行稀释，并用50mL超滤离心管(Millipore，100K)进行超滤离心(4℃，1500rcf，20min)，实现脂质纳米颗粒的浓缩和PBS溶液置换，最终使可离子化脂质与嗜肺疫苗mRNA的摩尔比约为N/P＝5:1，制备得到LNP-mRNA(pilE mRNA-LNP；pal mRNA-LNP；flaA mRNA-LNP；mompS mRNA-LNP；mix mRNA-LNP)脂质体纳米颗粒溶液。

(2)脂质纳米颗粒的表征检测：

1)粒径、PDI及电位的表征：通过Nano-ZSZEN3600(Malvern)测定所制备的脂质纳米颗粒的粒径和PDI。取5μL LNP-mRNA脂质体纳米颗粒溶液用PBS稀释100倍后进行粒径或电位测量，稳定时间为120s，循环三次，每次循环10次。测试结果表明所制备的脂质纳米颗粒粒径在80-90nm左右，PDI均小于0.1，电位在-2至2mV(图12)。

2)包封率测定：参照Quant-iT RiboGreen RNA试剂盒(Invitrogen,R1149)标准规程对所制备的脂质纳米颗粒的进行包封率测定，测试结果表明所制备的LNP-mRNA样品(pilE mRNA-LNP；pal mRNA-LNP；flaA mRNA-LNP；mompS mRNA-LNP；mix mRNA-LNP)的包封率均在95％左右，比较理想(图12)。

实施例4mRNA疫苗作用效果的动物实验

1、免疫实验

(1)小鼠给药及免疫(如图13所示)：

选取SPF级的4-6周龄A/J小鼠，重约为15g，在第0天和第7天用不同的mRNA疫苗对小鼠进行两次免疫。注射方式：右侧大腿肌肉肌肉注射；注射剂量：每只小鼠注射2μg或10μg军团菌mRNA-LNP(实验组：Pal、PilE、FlaA、MomPs，以及Pal、PilE、FlaA、MomPs四种抗原组合，对照组：PBS)，注射体积：50μL。在第14天，利用异氟烷将小鼠麻醉后进行颌下采血，通过离心(常温，2500rpm，20min)分离收集血清备用。

(2)血清特异抗体滴度检测(Elisa)：

1)抗原包被：用100mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释实施例2真核表达纯化的军团菌相关抗原蛋白(Pal、PilE、FlaA、MomPs)，然后在96孔板进行包被，包被量为100μL，每孔2μg，4℃孵育过夜。

2)封闭与洗涤：PBST洗涤一次后，用含5％BSA的PBS对96孔板进行非特异性封闭，体积为100μL/孔，室温下孵育1小时，再用PBS-Tween 20(PBS-T)缓冲液洗去孔中多余的蛋白，洗涤三次。

3)血清孵育：用PBS分别按5×10²、5×10³、5×10⁴、5×10⁵、5×10⁶的标准对血清进行稀释，然后每孔加入100μL稀释后的血清样品(3个复孔)，在摇床上进行孵育，4℃过夜。

4)二抗孵育：PBST洗涤三次后，再加入含辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(CST,Danvers,USA,Cat#7076)，室温孵育1小时。

5)显色：PBST洗涤三次后，加入TMB显色液，孵育5-10min后加2M硫酸终止显色。在酶标仪上检测样品在450nm的吸光度(OD值)。

(3)结果判断：吸光度大于空白孔4倍的为阳性孔，每组最大稀释组OD值大于空白孔OD值4倍的为最终稀释倍数，以该稀释倍数为最终滴度。

(4)检测结果：结果表明，5μg军团菌mRNA疫苗即可诱导小鼠产生高浓度针对嗜肺军团菌的IgG抗体，说明本发明设计的军团菌mRNA疫苗均能有效激活A/J小鼠体液免疫，且5μg/只的剂量即可使IgG的分泌达到高峰(见图14)。

2、军团菌挑战实验：

选取SPF级雌性6-8周龄小鼠60只，随机分为6组，每组10只。肌注mRNA疫苗(第1天和第14天共两针)，第21天额下取血测特异性抗体滴度，第28天开始细菌挑战实验。分组和剂量如下表所示：

细菌挑战实验的具体步骤如下：

①按100mg/kg的药量，以0.5％氯胺酮腹腔麻醉小鼠。

②挑战前通过滴鼻往小鼠滴入0.25％腔利多卡因50uL，放松气道平滑肌，增强肺部细菌攻毒效果。

③挑战当天准备好预实验，摸索好的适当浓度(2×10⁸/只小鼠)的军团菌(嗜肺军团菌ATCC33152)Lp1悬液，每只小鼠滴鼻100uL军团菌Lp1悬液，将悬液滴于小鼠鼻孔内壁，待液体被吸入后再滴下一滴，分两次进行，每次50uL，中间隔10min。

④细菌挑战后共观察14天，观察小鼠的状况，称体重和测体温，并记录存活数量。

攻毒实验结果表明，单flaA组(5μg/只)和Mix组疫苗(pal，pilE，flaA和mompS各1μg/只)可使小鼠100％免于感染后的死亡，而对照组则在4天内全部死亡(见图15)。

综上可见，本发明设计的核酸分子可以编码具有较强免疫原性的Pal，和/或pilE、和/或flaA、和/或mompS蛋白，用于制备防治军团菌的mRNA核酸疫苗，只需要较低剂量即可有效激活机体的体液免疫，其中单flaA组(5μg/只)和Mix组疫苗(pal，pilE，flaA和mompS各1μg/只)在小鼠体内可达到良好的中和军团菌的效果，使小鼠100％免于感染后的死亡，可以用于预防军团菌病的感染。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种编码嗜肺军团菌抗原的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码嗜肺军团菌相关抗原肽聚糖相关脂蛋白Pal，和/或IV型菌毛蛋白PilE，和/或鞭毛蛋白FlaA，和/或主要外膜蛋白MompS的核苷酸。

2.根据权利要求1所述的一种编码嗜肺军团菌抗原的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括SEQ ID NO：1所示的mRNA、SEQ ID NO：2所示的mRNA、SEQ ID NO：3所示的mRNA、SEQID NO：4所示的mRNA中的至少一种。

3.一种核酸-脂质体复合物，其特征在于，所述核酸-脂质体复合物包括权利要求1或2所述的核酸分子，以及将核酸分子包封在脂质壳中的阳离子脂质纳米颗粒，所述阳离子脂质纳米颗粒包括可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。

4.根据权利要求3所述的一种核酸-脂质体复合物，其特征在于，所述阳离子脂质纳米颗粒与核酸分子的摩尔比为1：1-10：1。

5.根据权利要求3所述的一种核酸-脂质体复合物，其特征在于，按摩尔百分比计，所述阳离子脂质纳米颗粒包括20-49％可质子化的阳离子脂质、35-50％结构脂质、5-15％辅助脂质和1-5％聚乙二醇化脂质。

6.根据权利要求3所述的一种核酸-脂质体复合物，其特征在于，所述结构脂质包括胆固醇及其衍生物，所述辅助脂质包括DSPC、DOPE、DOPG、DOPS，所述聚乙二醇化脂质包括PEG-DMG、PEG-DSPE。

7.权利要求3-6任一项所述核酸-脂质体复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2、将核酸分子溶于无机盐缓冲液中，得到水相；

8.根据权利要求7所述的核酸-脂质体复合物的制备方法，其特征在于，所述有机相中可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质的总浓度为10-30mg/mL，所述水相中核酸分子的浓度为0.1-1.0mg/mL，所述有机相和水相的体积比为1：2-6。

9.权利要求1或2所述的核酸分子，和/或权利要求3-6任一项所述的核酸-脂质体复合物在制备防治军团菌感染的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述防治军团菌感染的药物包括预防肺炎性军团菌病、肺外综合征、庞蒂亚克热的疫苗。