CN110251464B

CN110251464B - 一种多西紫杉醇的复方脂质体及其制备方法和应用

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Publication number: CN110251464B
Application number: CN201910618275.4A
Authority: CN
Inventors: 陈西敬; 方敏; 李家明; 李宁
Original assignee: Nanjing Philip Kang Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Philip Kang Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-07-10
Filing date: 2019-07-10
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2039-07-10
Also published as: CN110251464A

Abstract

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种多西紫杉醇的复方脂质体及其制备方法和应用。所述多西紫杉醇的复方脂质体含有多西紫杉醇、五环三萜类化合物、磷脂和胆固醇，其中多西紫杉醇和五环三萜类化合物的重量比为1∶（1~200），五环三萜类化合物优选熊果酸。所述多西紫杉醇的复方脂质体的制备方法优选乙醇注入法。本发明的多西紫杉醇复方脂质体，不仅克服了其疏水缺陷，还可以通过协同效应增强抗癌效果，减轻了多西紫杉醇的毒副作用。

Description

一种多西紫杉醇的复方脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种多西紫杉醇的复方脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

多西紫杉醇（DTX）是紫杉醇类抗微管化疗药物，广泛用于治疗非小细胞肺癌、乳腺癌和前列腺癌。但是，多西紫杉醇水溶性差，此缺点极大地限制了其广泛应用。市售的注射剂使用吐温-80作为增溶剂，并以乙醇溶解，会引起严重的不良反应，包括过敏、溶血、神经毒性等。在过去几年中，大量研究用于开发多西紫杉醇的新型纳米制剂，以克服其难溶性、改善其抗肿瘤效果并降低毒性。

熊果酸（ursolic acid, UA）是一种来自各种药用植物和水果中的五环三萜类化合物（如式一所示）。近年来，各项研究表明，熊果酸可以作为抗氧化剂、抗炎剂、抗菌剂、肝脏保护剂，还能抑制白血病细胞增殖并诱导细胞凋亡。此外，研究表明，熊果酸与吉西他滨、顺铂、卡培他滨和紫杉醇合用，都可以增强这些药物的药效。然而，熊果酸的水溶性差显著限制了其进一步的临床应用。

式一熊果酸的结构式

Xu等（Cyclooxygenase-2 mediated synergistic effect of ursolic acid incombination with paclitaxel against human gastric carcinoma）通过实验证明熊果酸和紫杉醇在体外具有协同抗肿瘤活性，熊果酸能够增强紫杉醇对胃癌细胞的抗增殖作用。

但是，对于多西紫杉醇这一传统化疗药物，为更好地克服其水溶性差、改善其疗效、并减少其毒副作用的影响，如何开发出适合其给药的制剂是研究的重点。

发明内容

本发明提供了一种多西紫杉醇复方脂质体及其制备方法和应用，所述复方脂质体显著改善了多西紫杉醇的药动学特性，延长了其体内驻留时间，降低了其体内清除率，继而明显增加了多西紫杉醇的体内暴露量，显著增强在荷瘤小鼠的抑瘤率，然而系统暴露量的变化并未增加多西紫杉醇的毒副作用。因此，所述复方脂质体不仅克服了其疏水缺陷，还可以通过协同效应增强抗癌效果，减轻了多西紫杉醇的毒副作用。

一种多西紫杉醇的复方脂质体，其特征在于，所述复方脂质体含有多西紫杉醇、五环三萜类化合物、磷脂和胆固醇。

进一步地，所述复方脂质体中多西紫杉醇和五环三萜类化合物的重量比为1∶（1~200）；优选，所述复方脂质体中多西紫杉醇和五环三萜类化合物的重量比为1∶（5~100）；再优选，所述复方脂质体中多西紫杉醇和五环三萜类化合物的重量比为1∶（20~50）；最优选，所述复方脂质体中多西紫杉醇和五环三萜类化合物的重量比为1∶20。

进一步地，所述复方脂质体中多西紫杉醇、五环三萜类化合物、磷脂和胆固醇的重量比为1∶（1~200）∶（1~1000）∶（1~200）；优选，所述复方脂质体中多西紫杉醇、五环三萜类化合物、磷脂和胆固醇的重量比为1∶（5~100）∶（25~500）∶（5~100）；再优选，所述复方脂质体中多西紫杉醇、五环三萜类化合物、磷脂和胆固醇的重量比为1∶（20~50）∶（100~250）∶（20~50）；最优选，所述复方脂质体中多西紫杉醇、五环三萜类化合物、磷脂和胆固醇的重量比为1∶20∶150∶20。

进一步地，所述复方脂质体中五环三萜类化合物选自熊果酸、齐墩果酸、甘草酸、甘草次酸、β-乳香酸、雷公藤酮、山楂酸、科罗索酸、白桦脂醇、白桦脂酸、羽扇醇、高根二醇及其药学上可接受的盐或酯或衍生物中的一种或几种。优选，所述复方脂质体中五环三萜类化合物选自熊果酸、齐墩果酸及其药学上可接受的盐或酯或衍生物中的一种或几种。再优选，所述复方脂质体中五环三萜类化合物选自熊果酸及其药学上可接受的盐或酯或衍生物中的一种或几种。最优选，所述复方脂质体中五环三萜类化合物选自熊果酸。

进一步地，所述复方脂质体中磷脂选自卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂以及其他合成磷脂（如合成二棕榈酰-DL-α-磷脂酰胆碱、合成磷脂酰丝氨酸）中的一种或几种。优选，所述复方脂质体中磷脂选自卵磷脂、大豆磷脂中的一种或几种。再优选，所述复方脂质体中磷脂选自卵磷脂。

本发明还提供了上述多西紫杉醇的复方脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法选自薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、pH梯度法、注入法或超声波分散法。优选，所述制备方法选自乙醇注入法或乙醚注入法。再优选，所述制备方法选自乙醇注入法。

进一步地，所述制备方法包括如下步骤：将磷脂、胆固醇、多西紫杉醇和五环三萜类化合物溶于有机溶剂中，缓慢滴入搅拌下的磷酸盐缓冲液（PBS）中，待有机溶剂挥发完全，获得脂质体混悬液；任选地，将脂质体混悬液通过高压乳匀机进行分散。

进一步地，所述有机溶剂选自乙醇或乙醚；优选，所述有机溶剂选自乙醇。

进一步地，所述磷酸盐缓冲液的搅拌速度为200~1000 r/min；优选，所述磷酸盐缓冲液的搅拌速度为400~800 r/min；再优选，所述磷酸盐缓冲液的搅拌速度为600 r/min。

进一步地，所述脂质体混悬液通过高压乳匀机进行分散1~4次；再优选，所述脂质体混悬液通过高压乳匀机进行分散2次。

本发明还提供了上述多西紫杉醇的复方脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、肌肉组织癌或软组织癌、头颈癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌或皮肤癌。

本发明的有益效果：

1、本发明的多西紫杉醇的复方脂质体为多层脂质的球形结构，克服了多西紫杉醇的疏水缺陷，粒径符合纳米制剂的特征，易于通过EPR效应富集于肿瘤部位；多分散系数低，带负电荷，有利于脂质体保持稳定；并且多西紫杉醇和熊果酸的包封率高，熊果酸的载药量也高。

2、本发明的多西紫杉醇的复方脂质体，五环三萜类化合物通过协同效应增强了多西紫杉醇的抗癌效果，还减轻了多西紫杉醇的毒副作用，包括复方脂质体的多西紫杉醇血药浓度峰值和在大鼠体内的系统暴露量显著增加、多西紫杉醇的半衰期延长、清除率显著降低、抑瘤率明显变优、具有高安全性。

附图说明

图1是多西紫杉醇PBS样品标准曲线。

图2是熊果酸PBS样品标准曲线图。

图3是(A)对比例2和(B)实施例2的脂质体的形态。

图4是实施例2的脂质体在PBS（pH 7.4）、DMEM和10％血浆中48 h内的PDI值（A）和粒径值（B）（n=3）。

图5是对比例1-2和实施例2的脂质体4 ℃储存30天的粒径变化值（n=3）。

图6是对比例2和实施例2的脂质体在pH为5.0和7.4的PBS中体外释放过程（n=3，与DTX-LPs相比，**p < 0.01，***p < 0.001）。

图7是MCF-7细胞（A、B）、A549细胞（C、D）和4T1细胞（E、F）在药物作用后的存活率（n=6）。

图8是在与C6溶液，C6-LP和C6₁/UA_20-LP孵育30分钟（A）或2小时（B）后，MCF-7细胞摄取DTX的共聚焦图像（n=3）。

图9是多西紫杉醇细胞样品标准曲线图。

图10是DTX浓度为618.90 pmol/ mL时，在不同时间点MCF-7细胞的DTX摄取量（n=3，与DTX₁/UA₂₀-LPs相比，**p <0.01）。

图11是在不同DTX浓度下MCF-7细胞培养1 h后DTX摄取量（n=3，与DTX₁/UA₂₀-LPs相比，**p <0.01，*** p <0.001）。

图12是多西紫杉醇血浆样品标准曲线图。

图13是按DTX 3 mg/kg给予不同药物后大鼠的血浆中DTX药时曲线（n=3）。

图14是（A）试验期间不同药物治疗组的相对肿瘤体积的变化和（B）试验结束后4T1肿瘤细胞荷瘤小鼠的肿瘤重量（n=8，与生理盐水处理组相比，*** p <0.001；与DTXsolution处理组相比，^### p <0.001；与DTX-LPs处理组相比， ⁺⁺ p <0.01）。

图15是（A）肿瘤组织的照片（B）试验期间不同药物治疗组4T1肿瘤细胞荷瘤小鼠的体重变化（n=8）。

图16是实验结束后4T1肿瘤细胞荷瘤小鼠肿瘤中的DTX浓度（n=8，与DTX solution处理组相比，* p <0.05，** p <0.01；与DTX-LPs处理组相比，^# p <0.05）。

图17是肿瘤，心脏，肝脏和肾脏的H＆E染色图像。

图18是肿瘤组织的Ki-67免疫组化图像。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1-4

称量卵磷脂150 mg、胆固醇30 mg、熊果酸30 mg，根据制备脂质体的类型分别称量多西紫杉醇6 mg（实施例1，DTX与UA质量比为1:5的复方脂质体DTX₁/UA₅-LPs）、1.5 mg（实施例2，DTX与UA质量比为1:20的复方脂质体DTX₁/UA₂₀-LPs）、0.6 mg（实施例3，DTX与UA质量比为1:50的复方脂质体DTX₁/UA₅₀-LPs）、0.3 mg（实施例4，DTX与UA质量比为1:100的复方脂质体DTX₁/UA₁₀₀-LPs）。将脂质（卵磷脂和胆固醇）和药物（多西紫杉醇和熊果酸）溶于乙醇中，涡旋使其完全溶解；将其逐滴缓慢滴入快速搅拌的PBS中（600 r/min），待乙醇挥发完全，会得到均匀的淡蓝色脂质体混悬液，将其置于4℃过夜。

对比例1-2

称量卵磷脂150 mg、胆固醇30 mg、熊果酸30 mg（对比例1，熊果酸单方脂质体UA-LPs）。称量卵磷脂150 mg、胆固醇30 mg、多西紫杉醇1.5 mg（对比例2，多西紫杉醇单方脂质体DTX-LPs）。将脂质（卵磷脂和胆固醇）和药物（多西紫杉醇或熊果酸）溶于乙醇中，涡旋使其完全溶解；将其逐滴缓慢滴入快速搅拌的PBS中（600 r/min），待乙醇挥发完全，会得到均匀的脂质体混悬液，将其置于4℃过夜。

试验例1 脂质体的粒径、PDI和Zeta电位

在室温下，将制备的脂质体过0.22 μm滤膜后，分别取2 mL装入样品池中，利用Litesizer 500粒径仪测定其粒径、PDI和Zeta电位值。结果显示（见表1）：多西紫杉醇和熊果酸单方脂质体及共包载复方脂质体的粒径大小为70-120 nm，这有助于脂质体通过EPR效应靶向进入肿瘤部位；并且脂质体多分散系数较低（PDI <0.25），表明制备的脂质体质量分布均匀，均一性好；Zeta电位均为负电荷，表现出较高的稳定性和相比正电荷较低的细胞毒性。

试验例2 脂质体包封率和载药量的测定

一、多西紫杉醇和熊果酸HPLC-MS/MS定量方法的确定

多西紫杉醇：HPLC-MS/MS进行测定，离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为3500V，加热毛细管温度为350 ℃，鞘气（N₂）压力为40 Arb，辅助气（N₂）压力为40 Arb。碰撞能量（CE）分别为23 eV（多西紫杉醇）和30 eV（紫杉醇，内标），扫描方式为多级反应监测（MRM），在正离子模式下，质荷比（m/z）分别为830.3→549.0（多西紫杉醇），876.0→307.8（紫杉醇）。C18反向色谱柱（1.8 μm，4.6×30 mm，Agilent），柱温为30 ℃。流动性A为0.3 mM乙酸钠水溶液，流动相B为乙腈。测样时等度洗脱，流速为0.8 mL/min，有机相与水相的比例为55:45，洗脱时间为1.8 min。多西紫杉醇PBS样品标准曲线见图1。

熊果酸：HPLC-MS/MS进行测定，离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为3500V，加热毛细管温度为350 ℃，鞘气（N₂）压力为40 Arb，辅助气（N₂）压力为40 Arb。碰撞能量（CE）分别为-30 eV（熊果酸）和-20 eV（氯唑沙宗，内标），扫描方式为多级反应监测（MRM），在负离子模式下，质荷比分别为455.1 →455.1（熊果酸），168.0→132.0（氯唑沙宗）。C18反向色谱柱（1.8 μm，4.6×30 mm，Agilent），柱温为30 ℃。流动性A为0.3 mM乙酸钠水溶液，流动相B为乙腈。测样时等度洗脱，流速为0.8 mL/min，有机相与水相的比例为90∶10，洗脱时间为2 min。熊果酸PBS样品标准曲线见图2。

二、包封率和载药量的测定

脂质体包封率的测定采用过膜法。在室温下，将所有制备好的脂质体分为两份，一份在乙腈中破乳并稀释，取10 μL进样；另一份先通过0.22 μm滤膜，再将过膜后的脂质体同上破乳稀释，取10 μL进样，此样品的测得量记为已成功包载的样品量。后续研究中所用的脂质体均为过膜后的脂质体。

包封率（EE）和载药量（DL）的计算公式如下：

结果显示（见表1）：脂质体的包封率均高于95%；脂质体对于熊果酸的载药量较高，都在14%左右，能够有效发挥药物效果。

表1 脂质体的粒径、PDI、Zeta电位、包封率和载药量（n=3，Mean±SD）

Formation

对比例1

对比例2

实施例4

实施例3

实施例2

实施例1

Size (nm)

79.0±0.8

110.49±1.6

83.0±0.8

73.9±1.0

98.4±0.6

102.7±1.0

PDI

0.175±0.029

0.240±0.009

0.172±0.018

0.179±0.008

0.173±0.013

0.199±0.014

Zeta potential (mV)

-5.84±0.27

-2.89±0.46

-1.87±0.10

-2.19±0.24

-2.53±0.29

-2.69±0.21

EE of UA (%)

98.74±0.31

/

99.85±0.39

99.75±0.11

99.78±0.15

95.47±0.14

EE of DTX (%)

/

99.52±0.06%

99.28±0.01

98.45±0.01

97.30±0.06

95.97±0.08

LD of UA

14.29%

/

14.27%

14.25%

14.18%

13.89%

LD of DTX

/

0.71%

0.14%

0.28%

0.71%

2.78%

试验例3 脂质体形态的观测

通过透射电镜观测脂质体的形态。将对比例2和实施例2的脂质体滴在300目的铜网上，3 min后，吸去脂质体，加入一滴2%（w/v）的磷钨酸染色，染色3 min后，吸去染色剂，红外灯下干燥5 min。将干燥后的铜网放入透射电镜中观测脂质体的形态。如图3所示，对比例1脂质体的形态如图3A所见，其形态和图3B所示的复方脂质体类似，都是脂质双分子层结构，且呈球形。

试验例4 脂质体稳定性

将实施例2的复方脂质体，分别用PBS（pH 7.4）、DMEM和10％血浆等体积稀释，在37℃下测定其放置48小时的粒径、PDI，评估其稳定性，结果见图4：PDI和粒径变化不大，表明脂质体在48 h的实验期间是稳定的。

将对比例1-2和实施例2的脂质体储存在4℃冰箱中，每隔6天测定一次脂质体粒径，评估脂质体的储存稳定性。结果见图5：粒径在一个月内没有明显变化，表明制备的脂质体在4℃时保持稳定。

试验例5 脂质体体外释放

一、体外释放

通过透析法研究脂质体的体外释放过程。取1 mL含药物的脂质体置于透析袋（MWCO：3500Da）中，准备50 mL含有吐温-80（0.5%，w/v）的PBS（pH = 5.0或7.4）溶液作为释放介质。将透析袋浸入释放介质中，并在37℃的恒温振荡器中以100 rpm的频率温孵振荡。在设计好的时间点吸取1 mL释放介质并加入1 mL新鲜的释放介质，吸取的释放介质通过HPLC-MS/MS测定其多西紫杉醇含量。

二、脂质体在PBS中的标准曲线绘制及样品处理

PBS中标曲的制备采用叔甲醚提取法。简言之，取50 μL标液加入50 μL内标，挥干后加入50 μL PBS复溶。再加入300 μL叔甲醚，涡旋5 min，15000 rpm离心10 min，取上清挥干后，加入50 μL乙腈复溶进样。体外释放样品的处理同上，最后复溶后取10 μL进质谱测定，其测定方法同上。

三、数据统计

所有结果均表示为平均值±标准偏差（Mean ± SD），并使用SPSS 19.0 student-t检验（IBM Corporation，USA）对数据进行统计学分析。* p <0.05视为具有统计学显著性差异，而** p <0.01和*** p <0.001视为具有统计学高显著性差异。

结果如图6，对比例2和实施例2的脂质体在模拟的正常生理环境，即pH 7.4的PBS中DTX的释放分别为60.10％和46.59％。然而，在模拟微酸性的肿瘤环境，即pH 5.0的PBS中，该释放量分别为72.86％和96.66％。

试验例6 脂质体体外药效评价

细胞系：人乳腺癌MCF-7细胞、非小细胞肺癌A549细胞和鼠乳腺癌4T1细胞均购自中国科学院上海生命科学细胞库。

一、细胞的培养

1、培养基的配制

细胞培养基为89%的培养液（MCF-7和4T1细胞用DMEM，A549细胞用RPMI 1640）+10%胎牛血清 +1%青霉素-链霉素混合溶液，配制的培养基供实验使用。所有操作过程，包括后续相关的细胞操作实验，均在生物安全柜中进行。

2、冻存细胞的复苏

将冻存的细胞取出后，37℃水浴使其快速融化。融化的冻存细胞加入含8倍量培养基的离心管中，密封后，低速离心机1000 rpm离心5 min。弃去上层培养基，加入2 mL新的培养基，轻轻吹打使其重悬。将其加入含4 mL培养基的培养瓶中，静置贴壁，放入二氧化碳培养箱（简称：孵箱）中（37℃，含5% CO₂）培养。

3、细胞的传代

当细胞培养2-3天，长满培养瓶的70-80%时，可以对细胞进行传代培养。培养细胞均为贴壁细胞，先倒掉培养基，然后加入PBS清洗，吸出PBS后加入消化液以覆盖住细胞为准，37℃孵箱中消化（三种细胞消化时间均为40s左右）。显微镜下观察，发现细胞变圆，细胞间隙增大后立即加入2 ml含血清的培养基终止消化，弃去。重新加入2 mL新的培养基，用移液枪反复吹打瓶壁细胞，确保瓶壁上细胞均被吹打下来。吹打均匀后，细胞转移至离心管中，同上操作离心重悬。重悬后的细胞显微镜下计数，然后吸取适量的细胞悬液至新培养瓶中，补足培养基。培养瓶上填写相关信息后放入孵箱，即可完成细胞传代过程。

二、脂质体细胞毒性实验

1、脂质体药液和MTT溶液的配制

脂质体药液：所有脂质体样品在实验前利用上述的定量方法进行定量。确定脂质体初始浓度后，按一定比例用DMEM或者RPMI 1640进行梯度稀释，多西紫杉醇溶液和熊果酸溶液同法稀释；

MTT溶液：配制MTT溶液时，应注意避光。用PBS溶至5 mg/mL，超声至完全溶解，实验时用DMEM或者RPMI 1640稀释至0.5 mg/mL。

2、细胞MTT实验

取96孔板，最外围一圈加200 μLPBS防止边缘效应。细胞按上述步骤计数后，留一组不加细胞（空白组），其余以每孔5000个细胞的密度铺板。细胞在孵箱中培养24 h后，弃去培养基，其中一组（n=6）加入200 μL空白DMEM或RPMI 1640（对照组），其余组依次加入200 μL稀释好的药液，完成给药并将96孔板放回孵箱。药物作用于细胞48 h后取出，将药液吸出，换成200 μL MTT溶液。孵箱中孵育4 h后，吸出MTT溶液并加入150 μL DMSO，通过多功能酶标仪在490nm处检测每组的吸光度。细胞存活率（%）的计算公式如下：

公式中，A_blank表示空白组的吸光度，A_control表示对照组吸光度，A_sample表示药物处理组吸光度。数据测定后，计算出对应的细胞存活率，通过GraphPad Prism 5.0（SanDiego，CA，USA）计算半数细胞致死对应的药物浓度（IC 50）。

协同系数（CI）可用于评估两种药物的协同效应，计算公式如下：

D_x1和D_y1表示使用x和y共包载药物，即药物联用时，细胞IC50对应的药物x和药物y的剂量，而Dx，Dy表示药物单独使用时IC50对应的剂量。根据结果，两种药物之间的作用一般描述为拮抗作用（CI> 1），无作用（CI = 1）和协同作用（CI <1）。

3、数据统计

4、脂质体细胞毒性分析

将所有溶液（DTX solution、UA solution）和脂质体通过MTT实验分别评估其细胞毒性。如图7所示，脂质体的细胞毒性比溶液高，复方脂质体的毒性基本都比单方脂质体高。由此可见，复方脂质体对癌症细胞如MCF-7、A549和4T1细胞的抑制效果比单方脂质体及溶液的效果好，这是因为多西紫杉醇和熊果酸的协同效应。

5、脂质体细胞内协同效应分析

从表2-4可以看出所有溶液（DTX solution、UA solution）和脂质体在MCF-7、A549和4T1细胞中的IC50值和协同系数CI值。CI < 1时表示多西紫杉醇和熊果酸具有协同效应，CI值越小，表示协同效应越强。本研究以CI值作为标准，筛选最优处方。如表所示，当脂质体中多西紫杉醇和熊果酸的比例为1:20时，制得的脂质体在MCF-7、A549和4T1细胞中的CI值最小，分别为0.02、0.14和0.20。统筹考虑药物剂量和协同效应，选定该处方（DTX：UA=1：20）作为最终处方。

表2 溶液及脂质体在MCF-7细胞中的IC50和CI值（n = 6）

	DTX(IC50)(nM)	UA(IC50)(μM)	CI
				UA solution	/	19.34±2.12	--
DTX solution	183.50±62.76	/	--
				DTX<sub>1</sub>/UA<sub>20</sub> solution	7.91±0.56<sup>***</sup>	0.285±0.02<sup>***</sup>	--
UA-LPs	/	2.25±0.50<sup>***</sup>	--
				DTX-LPs	9.16±0.74<sup>***</sup>	/	--
DTX<sub>1</sub>/UA<sub>100</sub>- LPs	5.56±0.28<sup>***###+++</sup>	0.99±0.04<sup>***###+++</sup>	0.08
				DTX<sub>1</sub>/UA<sub>50</sub>- LPs	10.37±3.89<sup>**</sup>	0.92±0.35<sup>***#++</sup>	0.10
DTX<sub>1</sub>/UA<sub>20</sub>- LPs	3.18±0.26<sup>***###+++</sup>	0.11±0.02<sup>***###+++</sup>	0.02
				DTX<sub>1</sub>/UA<sub>5</sub>- LPs	11.08±1.73<sup>**++</sup>	0.09±0.02<sup>***###+++</sup>	0.07

^** p < 0.01 and ^*** p < 0.001 versus DTX solution or UA solution, ^# p <0.05 and ^### p < 0.001 versus DTX-LPs or UA-LPs, ⁺⁺ p < 0.01 and ⁺⁺⁺ p < 0.001versus DTX₁/UA₂₀ solution, --not indicated

表3 溶液及脂质体在A549细胞中的IC50和CI值（n = 6）

	DTX(IC50)(nM)	UA(IC50)(μM)	CI
				UA solution	/	13.86±1.16	--
DTX solution	255.43±84.89	/	--
				DTX<sub>1</sub>/UA<sub>20</sub> solution	44.34±3.58<sup>***</sup>	1.53±0.13<sup>***</sup>	--
UA- LPs	/	3.83±0.74<sup>***</sup>	--
				DTX- LPs	131.33±0.66<sup>*</sup>	/	--
DTX<sub>1</sub>/UA<sub>100</sub>- LPs	71.16±3.94<sup>*###+++</sup>	12.59±0.7<sup>***###+++</sup>	1.24
				DTX<sub>1</sub>/UA<sub>50</sub>- LPs	15.55±3.5<sup>***###+++</sup>	1.38±0.31<sup>***###</sup>	0.17
DTX<sub>1</sub>/UA<sub>20</sub>- LPs	26.19±8.68<sup>***###+++</sup>	0.77±0.18<sup>***###+++</sup>	0.14
				DTX<sub>1</sub>/UA<sub>5</sub>- LPs	36.27±8.33<sup>**###</sup>	0.33±0.07<sup>***###+++</sup>	0.17

^* p < 0.05, ^** p < 0.01 and ^*** p < 0.001 versus DTX solution or UAsolution, ^### p < 0.001 versus DTX-LPs or UA-LPs, ⁺⁺⁺ p < 0.001 versus DTX₁/UA₂₀solution, --not indicated

表4 溶液及脂质体在4T1细胞中的IC50和CI值（n = 6）

	DTX(IC50)(nM)	UA(IC50)(μM)	CI
				UA solution	/	78.22±7.09	--
DTX solution	147.05±24.85	/	--
				DTX<sub>1</sub>/UA<sub>20</sub> solution	45.29±9.61<sup>*</sup>	9.92±1.45<sup>***###</sup>	--
UA- LPs	/	1.84±0.55<sup>***</sup>	--
				DTX- LPs	43.01±7.13<sup>**</sup>	/	--
DTX<sub>1</sub>/UA<sub>20</sub>- LPs	19.93±5.89<sup>**##+</sup>	0.7±0.22<sup>***###+</sup>	0.20

^* p < 0.05, ^** p < 0.01 and ^*** p < 0.001 versus DTX solution or UAsolution, ^## p < 0.01 and ^### p < 0.001 versus DTX-LPs or UA-LPs, ⁺ p < 0.05versus DTX₁/UA₂₀ solution, -- not indicated

试验例7 细胞摄取实验

一、脂质体细胞摄取定性实验

1、药液的配制

准备香豆素溶液（C6 solution），终浓度为2 μg/mL。制备香豆素脂质体（C6-LPs），即称量卵磷脂150 mg、胆固醇30 mg、香豆素1.5 mg，乙醇注入法制备C6-LPs。香豆素和熊果酸复方脂质体（C6₁/UA₂₀-LPs），即称量卵磷脂150 mg、胆固醇30 mg、熊果酸30 mg、香豆素1.5 mg，乙醇注入法制备C6₁/UA₂₀-LPs。准备DAPI染液，浓度0.1 μg/mL。

2、细胞摄取定性实验

脂质体的摄取实验均以MCF-7细胞为实验细胞。细胞按上述步骤计数后，取Φ20mm培养皿（n=3），每个皿铺板1×10⁵个细胞。孵箱中培养中24 h后，弃去培养基，加入2 mL配置好的药液。孵箱中分别孵育30 min和2 h，取出后用PBS洗涤细胞三次，然后在室温下加入DAPI染色30 min。染色结束后用PBS洗涤，避免游离染色剂的干扰。小皿加入500 μL PBS，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观测细胞摄取情况。根据对CLSM的参数设置，香豆素-6显绿色荧光，DAPI显蓝色荧光。

结果见图8，通过CLSM观测和ZEN成像软件处理得到的荧光图像对脂质体的细胞摄取进行定性评估。孵箱中培养30 min后，与C6 solution药液处理过的MCF-7细胞相比，用C6-LPs和C6₁/UA₂₀-LPs处理过的细胞其胞质和核内区域观察到更高的香豆素和DAPI荧光信号（图8A），表明脂质体比溶液更易进入细胞。孵箱中培养2 h后，C6-LPs和C6₁/UA₂₀-LPs处理过的细胞也是显示更强的荧光信号（图8B）。而且，与培养30 min相比，荧光信号更强，表明培养2 h比培养30 min细胞摄取更多药物。

二、脂质体细胞摄取定量实验

1、脂质体在细胞中的标准曲线绘制及样品处理

细胞标准曲线的制备采用叔甲醚提取法。简言之，取50 μL标液加入50 μL内标，挥干后加入50 μL空白细胞液复溶。再加入300 μL叔甲醚，涡旋5 min，15000 rpm离心10 min，取上清挥干后，加入50 μL乙腈复溶进样。细胞样品的处理同上，最后复溶后取10 μL进质谱测定，其测定方法与上述的HPLC-MS/MS定量方法相同。标准曲线见图9。

2、脂质体细胞摄取时间依赖性实验

通过测定MCF-7细胞中DTX的浓度评估细胞的摄取量。时间依赖性实验中，取24孔板，将MCF-7细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度铺板。孵箱中培养48 h后，弃去培养基，加入1mL 618.90 pmol/ mL的药液（DTX solution、DTX-LPs、DTX₁/UA₂₀ solution和DTX₁/UA₂₀-LPs，n=3）并在培养不同时间（0.25、0.5、1、2、4、6 h）后终止作用。终止时，加入冰HBSS洗涤细胞两次，然后每个孔加入300 μL去离子水。24孔板储存在-70℃，并反复冻融，确保细胞完全裂解。通过HPLC-MS/MS测定24孔板每个孔细胞中DTX含量，以ng/mL表示其浓度。通过BCA试剂盒，按照其操作要求加入试剂和细胞，测定24孔板每个孔的蛋白质含量，以ngprotein/mL表示其浓度。根据测定的结果，利用公式C_DTX/C_protein计算细胞摄取量。公式中，C_DTX表示测定的每个孔DTX的浓度，C_protein表示测定的对应孔蛋白质的浓度，计算出的细胞摄取量以pmol/ng protein表示，分析细胞摄取时间依赖性。

结果见图10，1 h内，细胞内DTX浓度随着药物作用时间增加而增加，其中DTX₁/UA₂₀-LPs脂质体进入细胞的有效药物更多。

3、脂质体细胞摄取浓度依赖性实验

细胞铺板培养48 h后分别加入不同浓度（0.06、0.12、0.25、0.62、1.23、2.48nmol/mL）的药液（DTX solution、DTX-LPs、DTX₁/UA₂₀ solution和DTX₁/UA₂₀-LPs）一起培养1h，计算其细胞摄取量，分析细胞摄取浓度依赖性。

结果见图11，细胞内DTX浓度随着药物浓度的增加而增加，其中DTX₁/UA₂₀-LPs脂质体进入细胞的有效药物更多。

试验例8 体内药动学实验

药动学实验用Sprague-Dawley (SD)大鼠（雌性，200±20 g）购自上海杰思捷实验动物有限公司（中国），生产许可证号：SCXK（沪）2016-0010。

一、脂质体在血浆中标准曲线绘制及样品处理

血浆标曲的制备采用叔甲醚提取法。简言之，取50 μL标液加入50 μL内标，挥干后加入50 μL空白大鼠血浆复溶。再加入300 μL叔甲醚，涡旋5 min，15000 rpm离心10 min，取上清挥干后，加入50 μL乙腈即可复溶进样。血浆样品的处理用上，最后复溶后取10 μL进质谱测定，其测定方法与上述的HPLC-MS/MS定量方法相同。血浆中多西紫杉醇标准曲线见图12。

二、体内药动学实验

大鼠喂水喂食一周以适应环境。实验开始前，将大鼠随机分成三组（n=3），分别称重，然后以相当于DTX 3 mg/kg的剂量静脉内给予DTX solution、DTX-LPs和DTX₁/UA₂₀-LPs。在给药前0.25 h和给药后0.033、0.083、0.167、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24 h取血，离心后，转移上层血浆样品，并置于-70 ℃下储存待测。

三、数据统计

根据测定出的血浆中DTX的药物浓度，使用软件WinNonlin 8.1（Certara USA,Inc.）计算药物的药代动力学参数。所有结果均表示为平均值±标准偏差（Mean ± SD），并使用SPSS 19.0 student-t检验（IBM Corporation，USA）对数据进行统计学分析。* p <0.05视为具有统计学显著性差异，而** p <0.01和*** p <0.001视为具有统计学高显著性差异。

以相当于DTX 3 mg/kg的剂量分别静脉注射给予DTX solution、DTX-LPs和DTX₁/UA₂₀-LPs后血浆内的DTX浓度如表5所示，药时曲线图如图13，由血药浓度计算出的参数如表6所示。DTX₁/UA₂₀-LPs的曲线下面积（AUC_0-t）为3665.75±617.67 h*ng/mL，比DTX solution高5倍以上（p < 0.01），比DTX-LPs高3.7倍（p < 0.01）。此外，DTX₁/UA₂₀-LPs的清除率（Cl）为0.83±0.14 L/h/kg，与DTX solution和DTX-LPs相比，分别降低了80％（p < 0.001）和73％（p < 0.01）。

DTX主要在粪便或胆汁中排泄，并且血浆蛋白结合率高。复方脂质体可以避免DTX竞争性蛋白质结合，减少药物清除。药物相互作用的另一种可能性是由于共同给药，CYP3A1/2的酶活性发生变化，使复方脂质体对DTX的清除率降低。而且，静注DTX₁/UA₂₀-LPs的大鼠C_max显著增加，与给予DTX solution和DTX-LPs的大鼠相比，C_max分别增加了8倍（p <0.01）和3倍（p < 0.01）。更重要的是，DTX₁/UA₂₀-LPs延长了DTX在血浆中的半衰期（t_1/2）。这些结果表明UA在DTX的体内药代动力学中起重要作用，而共包载制剂显著影响DTX的PK过程。

表5 按DTX 3 mg/kg给予不同药物后大鼠的血浆中DTX药物浓度（ng/mL，Mean ± SD，n=3）

Time(h)	DTX solution	DTX-LPs	DTX<sub>1</sub>/UA<sub>20</sub>-LPs
				0.033	2191.74±624.29	5426.00±2478.00	17596.10±3395.6
0.083	467.42±25.77	508.00±193.30	6770.46±880.60
				0.167	223.25±32.55	189.70±78.42	3767.54±794.39
0.5	107.38±27.94	72.46±6.20	822.28±167.44
				0.75	103.04±33.52	64.86±9.23	533.99±82.36
1	86.89±18.07	42.29±15.66	331.16±53.24
				2	53.18±6.96	28.71±14.83	108.22±13.33
4	27.01±2.99	19.7±14.82	54.25±12.74
				8	13.72±2.68	10.48±5.45	28.18±6.27
12	7.17±1.49	6.32±0.69	13.36±0.37
				24	1.89±1.35	2.24±0.85	4.03±0.81
48	ND	ND	ND

ND：not detected，表示已低于定量下限

表6 按DTX 3 mg/kg给予不同药物后大鼠血药浓度参数（n=3）

parameters		DTX solution	DTX-LPs	DTX<sub>1</sub>/UA<sub>20</sub>-LPs
					t<sub>1/2</sub>	h	5.40±0.42	5.37±0.49	5.99±0.57
Cmax	ng/ml	2191.74±624.28	5426.27±2477.62	17596.10±3395.55<sup>**##</sup>
					AUC(0-t)	h*ng/ml	688.99±115.70	991.05±228.95	3665.75±617.67<sup>**##</sup>
Vz	L/kg	33.09±5.73	23.67±4.41	7.20±1.78<sup>**##</sup>
					Cl	L/h/kg	4.24±0.57	3.09±0.78	0.83±0.14<sup>***##</sup>

^* p < 0.05, ^** p < 0.01 and ^*** p < 0.001 versus DTX solution, ^## p < 0.01versus DTX-LPs.

试验例9 体内药效学实验

药效学实验用4T1肿瘤细胞的荷瘤BALB/c小鼠（雌性，20±2 g）来自上海灵畅生物科技有限公司。生产许可证号：SCXK（沪）2016-0018。

一、组织标准曲线及样品处理方法

组织标准曲线的制备采用叔甲醚提取法。简言之，将组织匀浆后，标曲取50 μL标液加入50 μL内标，挥干后加入50 μL空白组织匀浆复溶。再加入300 μL叔甲醚，涡旋5 min，15000 rpm离心10 min，取上清挥干后，加入50 μL乙腈即可复溶进样。组织样品的处理用上，最后复溶后取10 μL进质谱测定，其测定方法与上述的HPLC-MS/MS定量方法相同。

二、体内药效学实验

将鼠乳腺癌4T1细胞悬浮液接种于小鼠右侧腋窝皮下，使用4T1肿瘤模型评估药物的体内抗肿瘤作用。当肿瘤体积达到100 mm³时，将小鼠随机分成四组（n=8），分别称重，然后以相当于DTX 10 mg/kg的剂量静脉内给予生理盐水（空白对照组）、DTX solution（阳性对照组）、DTX-LPs和DTX₁/UA₂₀-LPs。第一次给药记为第0天，每3天给药一次，共7次。在实验期间每次给药前测定肿瘤的长宽值，计算其体积大小并称量小鼠体重。相对肿瘤体积（RV）和肿瘤生长抑制率（IR）的计算公式如下：

其中，V₀表示准备给药时肿瘤的体积大小。

结果见图14A和表7，与注射saline的荷瘤小鼠组相比，注射DTX solution、DTX-LPs和DTX₁/UA₂₀-LPs治疗的荷瘤小鼠组的相对肿瘤体积分别从给药后第9天、第6天和第3天差异显著，与注射DTX solution组相比，注射DTX-LPs和DTX₁/UA₂₀-LPs治疗的荷瘤小鼠组的相对肿瘤体积分别从给药后第21天和第6天显著减小。从第15天开始，注射DTX₁/UA₂₀-LPs治疗的荷瘤小鼠组的相对肿瘤体积与注射DTX-LPs组相比，差异显著。试验表明，DTX₁/UA₂₀-LPs对肿瘤的抑制作用比DTX solution和DTX-LPs更有效。实验结束后，测定的肿瘤重量如图14B所示，DTX solution、DTX-LPs和DTX₁/UA₂₀-LPs的肿瘤抑制率（IR）分别为53.8％，60.8％和68.4％，由此可见DTX₁/UA₂₀-LPs的抗肿瘤效果相比较其他药物更有作用。肿瘤大小如图15A所示，显然，DTX₁/UA₂₀-LPs治疗组的肿瘤最轻最小，此外，所有组的荷瘤小鼠体重均增加（图15B），这表明脂质体的毒性较小，对小鼠体重影响不大。

表7 试验期间肿瘤相对体积大小（n=8）

	saline	DTX solution	DTX-LPs	DTX<sub>1</sub>/UA<sub>20</sub>-LPs
					0	1	1	1	1
3	1.70±0.19	1.55±0.13	1.55±0.15	1.52±0.14<sup>*</sup>
					6	3.02±0.58	2.51±0.38	2.22±0.28<sup>**</sup>	2.11±0.33<sup>***#</sup>
9	5.21±1.01	3.73±0.68<sup>**</sup>	3.35±0.36<sup>***</sup>	3.12±0.42<sup>***#</sup>
					12	7.44±1.67	4.80±0.79<sup>**</sup>	4.34±0.60<sup>***</sup>	3.92±0.58<sup>***#</sup>
15	10.56±2.50	5.94±0.62<sup>**</sup>	5.47±0.65<sup>***</sup>	4.73±0.53<sup>***###+</sup>
					18	14.20±2.97	7.00±0.70<sup>***</sup>	6.28±0.73<sup>***</sup>	5.44±0.59<sup>***###+</sup>
21	17.87±3.87	7.95±0.69<sup>***</sup>	6.91±0.50<sup>***##</sup>	5.97±0.63<sup>***###++</sup>

^* p < 0.05, ^** p < 0.01 and ^*** p < 0.001 versus saline, ^# p < 0.05, ^## p <0.01 and ^### p < 0.001 versus DTX solution, and ⁺ p < 0.05 and ⁺⁺ p < 0.01 versusDTX-LPs.

三、体内组织分布实验

在给药全部结束时，处死所有荷瘤小鼠，取出肿瘤，拍照并称量重量。取血及心、肝、脾、肺、肾这些主要器官，处理后用HPLC-MS/MS测定血浆及各组织中DTX的药物浓度。

结果见图16，DTX₁/UA₂₀-LPs治疗组的荷瘤小鼠肿瘤中DTX浓度最高，这也解释了共包载复方脂质体DTX₁/UA₂₀-LPs比阳性药或者单方脂质体更强的抗肿瘤活性

可知，肿瘤中DTX₁/UA₂₀-LPs治疗组的DTX浓度比DTX solution治疗组高 2.5倍，比DTX-LPs治疗组高1.6倍，证明共包载复方脂质体更易在肿瘤部位释放。而且，DTX₁/UA₂₀-LPs治疗组的其他组织，包括脾、肺中DTX浓度均较低，可见DTX₁/UA₂₀-LPs具有靶向性，可以减少DTX的毒副作用。

四、H＆E染色和免疫组化实验

将荷瘤小鼠的肿瘤、心、肝、肾这些重要器官用4％多聚甲醛固定，再用石蜡包埋并切片。然后，通过苏木精和伊红（H＆E）染色观察组织学切片，并且用Ki-67对肿瘤组织切片进行染色以进行免疫组织化学测定。

结果见图17和图18，H＆E染色表明DTX₁/UA₂₀-LPs比DTX solution和DTX-LPs在肿瘤组织中引发更高程度的坏死，而对正常组织的损伤很小。DTX₁/UA₂₀-LPs治疗组的肿瘤组织图片显示出更多模糊、致密的坏死细胞，这进一步证明了DTX和UA具有优异的协同抗肿瘤作用增殖标志物Ki-67在G0期（静息期）较少表达，可以通过免疫组化检测肿瘤组织的增殖效应。如图18所示，与saline、DTX solution和DTX-LPs组相比，Ki-67在DTX₁/UA₂₀-LPs治疗组中的表达降低，表明其荷瘤小鼠肿瘤细胞增殖减少，可见共包载复方脂质体可以有效抑制4T1肿瘤细胞增殖。这些结果证明DTX₁/UA₂₀-LPs比DTX阳性对照药（DTX solution）和单方脂质体（DTX-LPs）具有更强的抗肿瘤活性，也具有更高的安全性。

Claims

1.一种多西紫杉醇的复方脂质体，其特征在于，所述复方脂质体含有多西紫杉醇、五环三萜类化合物、磷脂和胆固醇；

所述复方脂质体中多西紫杉醇和五环三萜类化合物的重量比为1∶20；

所述五环三萜类化合物为熊果酸；

所述磷脂为卵磷脂。

2.根据权利要求1所述的复方脂质体，其特征在于，所述复方脂质体的组成为卵磷脂150mg、胆固醇30mg、熊果酸30mg、多西紫杉醇1.5mg。

3.根据权利要求1-2任意一项所述的多西紫杉醇的复方脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法选自薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、pH梯度法、注入法或超声波分散法。

4.根据权利要求3所述的复方脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法选自乙醇注入法或乙醚注入法。

5.根据权利要求3所述的复方脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将磷脂、胆固醇、多西紫杉醇和熊果酸溶于有机溶剂中，缓慢滴入搅拌下的磷酸盐缓冲液(PBS)中，待有机溶剂挥发完全，获得脂质体混悬液；将脂质体混悬液通过高压乳匀机进行分散。

6.根据权利要求5所述的复方脂质体的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的搅拌速度为200～1000r/min。

7.根据权利要求6所述的复方脂质体的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的搅拌速度为400～800r/min。

8.根据权利要求6所述的复方脂质体的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的搅拌速度为600r/min。

9.根据权利要求3所述的复方脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：称量卵磷脂150mg、胆固醇30mg、熊果酸30mg，多西紫杉醇1.5mg；将卵磷脂、胆固醇、多西紫杉醇和熊果酸溶于乙醇中，涡旋使其完全溶解；将其逐滴缓慢滴入快速搅拌的PBS中，搅拌速度为600r/min，待乙醇挥发完全，会得到均匀的淡蓝色脂质体混悬液，将其置于4℃过夜。

10.根据权利要求1-2任意一项所述的多西紫杉醇的复方脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、肌肉组织癌或软组织癌、头颈癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌或皮肤癌。