CN114948959A - 一种调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物及其制备方法和应用。该药物用PEG、卵磷脂等脂质材料制备成脂质体包裹住氯尼达明和乙酯利血平，在脂质体屏蔽层的保护下，可以减少抗肿瘤活性成分的泄漏，提高药物的细胞亲和性和组织相容性，靶向聚集在肿瘤部位，细胞内释放抗肿瘤活性成分，联合作用干扰肿瘤细胞代谢的同时控制细胞内外乳酸生成，有效促进肿瘤细胞凋亡，改善TME中乳酸大量堆积的现象，增加CD8+、NK细胞的活性，将M2型巨噬细胞转变为M1型，逆转免疫抑制微环境，显著抑制肿瘤生长。

Description

一种调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
大部分肿瘤微环境(TME)中存在着大量的免疫抑制细胞，肿瘤细胞的异常代谢是促成免疫抑制性TME形成的重要因素。例如癌细胞中高水平的有氧糖酵解会在肿瘤细胞质和TME中分泌大量浓度达到40mM的乳酸，乳酸的浓度与肿瘤细胞增殖转移呈正相关，高浓度的乳酸通过影响多种免疫细胞来抑制肿瘤免疫功能，例如高浓度的乳酸会直接抑制自然杀伤(NK)细胞的浸润、募集调节性T细胞(Treg)、促进精氨酸酶(Arg1)活性、增强缺氧诱导因子(HIF-1α)稳定性以及诱导巨噬细胞(TAM)的M2极化等，从而降低机体免疫对肿瘤细胞的抵抗作用，造成肿瘤细胞日益增长、转移。因此，TME中乳酸的调控在癌症进展和治疗中起着至关重要的作用，降低肿瘤微环境中的乳酸含量有利于抗肿瘤免疫细胞发挥作用，杀死肿瘤细胞。
现有技术表明，3-羧基吲哚的衍生物氯尼达明(LND)可以抑制己糖激酶(HK)，从而干扰癌细胞的糖酵解，最终抑制乳酸生成，达到抗肿瘤效果。但是由于细胞中代谢途径的灵活性，旁路代谢可以逆转单一途径抑制的作用，例如HK抑制剂虽然可以抑制癌细胞中乳酸的产生，但癌细胞的内在和适应性抗氧化能力会削弱氯尼达明维持氧化还原稳态的抗肿瘤能力，极大地限制了氯尼达明的抗肿瘤效果。为了解决这个问题，现有技术常将氯尼达明与其他抗肿瘤药物联用，如中国专利申请公开了一种鬼臼毒素-氯尼达明缀合物，将同样具有抗肿瘤效果的鬼臼毒素与氯尼达明缀合在一起，达到了显著抗肿瘤增殖的效果，肿瘤抑制作用明显。但是该缀合物需进行化学合成，制备方法复杂；另一方面，该缀合物在体循环中无法靶向肿瘤部位，治疗效果有限，为了提高抗肿瘤效果需增加用药量，容易产生副作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有氯尼达明单独使用时抗肿瘤效果有限的缺陷和不足，提供一种氯尼达明和乙酯利血平联合使用在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的是提供一种调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物。
本发明另一目的是提供所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物的制备方法。
本发明另一目的是提供所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
发明人通过实验研究发现，氯尼达明(lonidamine，LND)和乙酯利血平(syrosingopine，Sy)联合使用可以协同达到显著抗肿瘤的效果。在肿瘤组织处，LND可以将己糖激酶与线粒体解耦连，在引发阶段抑制糖酵解，从细胞内部阻止乳酸的生成，并且减少肿瘤细胞ATP的产生；与此同时，Sy沉默乳酸关键外排蛋白MCT-4的表达，减少乳酸外排，防止其它代偿路径产生的乳酸外流；共同协同作用减少肿瘤微环境中的乳酸堆积，有利于活化NK细胞、抑制Treg细胞、诱导巨噬细胞M2极化等，改善微环境中的免疫抑制，从而达到显著抗肿瘤效果。
因此，本发明要求保护氯尼达明和乙酯利血平联合使用在制备抗肿瘤药物中的应用。
另外的，本发明还要求保护一种调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物，所述纳米药物以氯尼达明和乙酯利血平作为抗肿瘤活性成分，且抗肿瘤活性成分被包裹于脂质体中；其中，所述脂质体包括以下组分：卵磷脂(PC)、胆固醇(Chol)、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、磷脂酰乙醇胺(PE)。
本发明用PEG、卵磷脂等脂质材料制备成脂质体包裹住氯尼达明和乙酯利血平，在脂质体屏蔽层的保护下，可以减少抗肿瘤活性成分的泄漏，提高药物的细胞亲和性和组织相容性，通过高通透性和滞留(EPR)效应，该纳米药物可以靶向聚集在肿瘤部位，在肿瘤细胞内释放抗肿瘤活性成分，直接作用于肿瘤细胞，联合作用干扰肿瘤细胞代谢的同时控制细胞内外乳酸生成，有效促进肿瘤细胞凋亡，改善TME中乳酸大量堆积的现象，增加CD8+、NK细胞的活性，将M2型巨噬细胞转变为M1型，逆转免疫抑制微环境，显著抑制肿瘤生长。
进一步地，所述脂质体包括以下组分及其重量份数：卵磷脂50～100份、胆固醇25～50份、DSPE-PEG20001～2份、磷脂酰乙醇胺25～50份。优选地，所述脂质体包括以下组分及其重量份数：卵磷脂50～70份、胆固醇25～35份、DSPE-PEG20001～2份、磷脂酰乙醇胺25～35份；更优选地，所述脂质体包括以下组分及其重量份数：卵磷脂50份、胆固醇25份、DSPE-PEG20001份、磷脂酰乙醇胺25份。
更进一步地，所述氯尼达明与脂质体的质量比为1:(5～10)；优选地，所述氯尼达明与脂质体的质量比为1:(5～8)；更优选地，所述氯尼达明与脂质体的质量比为1:6。
进一步地，所述乙酯利血平与脂质体的质量比为1:(10～30)；优选地，所述乙酯利血平与脂质体的质量比为1:(10～20)；更优选地，所述乙酯利血平与脂质体的质量比为1:15。
更进一步地，所述纳米药物的粒径为90～190nm。
另外的，本发明还提供了所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
将脂质体组分溶解于有机溶剂中，加入抗肿瘤活性成分，去除有机溶剂，得到脂质膜；所得脂质膜置于水中，破碎，水透析后过滤，即得。
进一步地，所述有机溶剂选自三氯甲烷、四氢呋喃、丙酮中的一种或多种。
优选地，所述去除有机溶剂的方法为30～50℃、100～200rpm旋转蒸发20～50min。
优选地，所述破碎为10～30W、10～30kHz超声20～50min。
优选地，所述过滤的滤膜孔径为220～450nm。
另外的，本发明还提供了所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤包括乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤等免疫抑制性“冷”肿瘤。
本发明具有以下有益效果：
本发明调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物用PEG、卵磷脂等脂质材料制备成脂质体包裹住氯尼达明和乙酯利血平，在脂质体屏蔽层的保护下，可以减少抗肿瘤活性成分的泄漏，提高药物的细胞亲和性和组织相容性，靶向聚集在肿瘤部位，细胞内释放抗肿瘤活性成分，联合作用干扰肿瘤细胞代谢的同时控制细胞内外乳酸生成，有效促进肿瘤细胞凋亡，改善TME中乳酸大量堆积的现象，增加CD8+、NK细胞的活性，将M2型巨噬细胞转变为M1型，逆转免疫抑制微环境，显著抑制肿瘤生长。并且，本发明调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物制备方法简单，无需进行复杂的化学合成反应，通过简单的脂质体包覆即可制备得到，适于大规模产业化生产。
附图说明
图1为试验例1中纳米脂质体的粒径电位图及数据统计图，其中，图1A-水合粒径表征图，图1B-透射电镜形貌表征图(比例尺：100nm)，图1C-不同组别的纳米脂质体粒径表征图，图1D-不同组别的纳米脂质体的电位表征图。
图2为试验例2中4T1细胞摄取纳米脂质体的共聚焦表征图(比例尺：5μm)。
图3为试验例2中4T1细胞摄取纳米粒子的流式表征图。
图4为试验例3中细胞蛋白免疫印迹图。
图5为试验例4中脂质体在细胞内外对乳酸的影响；其中，图5A-细胞外乳酸含量图，图5B-细胞内乳酸含量图。
图6为试验例4中脂质体在体外对促进巨噬细胞分化的影响图；其中，图6A-共培养前后巨噬细胞各表型占比图，图6B-共培养前后对于M1表型巨噬细胞的统计图，图6C-共培养前后对于M2表型巨噬细胞的统计图。
图7为试验例5中纳米脂质体在体内24h的聚集效果图。
图8为试验例6中纳米脂质体在体内对肿瘤的免疫效果图；其中，图8A-纳米脂质体对巨噬细胞M1极化的影响图，图8B-纳米脂质体对巨噬细胞M1极化的统计图，图8C-纳米脂质体对巨噬细胞M2极化的影响图，图8D-纳米脂质体对巨噬细胞M2极化的统计图，图8E-纳米脂质体对Treg细胞的抑制图，图8F-纳米脂质体对Treg细胞的影响统计图，图8G-纳米脂质体对NK细胞的活化图，图8H-纳米脂质体对NK细胞的活化统计图。
图9为试验例7中纳米脂质体在体内的抗肿瘤效果图；其中，图9A-纳米脂质体对小鼠肿瘤的抑制统计图，图9B-纳米脂质体对小鼠体重的统计图，图9C-纳米脂质体对小鼠的肿瘤抑制效果图，图9D-纳米脂质体对荷瘤小鼠的生存时间影响图。
图10为试验例7中纳米脂质体对肿瘤组织的影响对比图(比例尺：100μm)。
图11为试验例7中纳米脂质体对小鼠器官(心肝脾肺肾)的影响对比图(比例尺：100μm)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种调控肿瘤乳酸代谢的纳米脂质体药物的制备
所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米脂质体药物的制备包括以下步骤：
采用电子天平分别称取8.3mg的PC，9.48mg的PE，4.95mg的Chol，7.35mg的DSPE-PEG2000，每种膜材分别使用2mL CHCl3溶解，混合到一起；称取5mg氯尼达明(LND)和2mg乙酯利血平(Sy)，每种药物分别用200μL DMSO溶解，以上溶液逐次加入250mL茄形瓶后，通过旋转蒸发仪去除溶剂使脂质成膜，加入5mL去离子水在超声中剥离脂质膜，转移水化后的脂质体通过超声破碎探头(功率20W，20kHz，30min)获得合适粒径的纳米脂质体；用去离子水透析24h后通过220nm无菌滤头，得到粒径均一稳定的纳米脂质体药物(L@S/L)。
实施例2一种调控肿瘤乳酸代谢的纳米脂质体药物的制备
所述调控乳酸代谢的纳米脂质体药物的制备包括以下步骤：
采用电子天平分别称取16.6mg的PC，18.96mg的PE，9.9mg的Chol，14.7mg的DSPE-PEG2000，每种膜材分别使用4mL CHCl3溶解，混合到一起；称取10mg氯尼达明(LND)和4mg乙酯利血平(Sy)，每种药物分别用200μL DMSO溶解，以上溶液逐次加入250mL茄形瓶后，通过旋转蒸发仪去除溶剂使脂质成膜，加入5mL去离子水在超声中剥离脂质膜，转移水化后的脂质体通过超声破碎探头(功率10W，30kHz，30min)获得合适粒径的纳米脂质体；用去离子水透析24h后通过220nm无菌滤头，得到粒径均一稳定的纳米脂质体药物(L@S/L)。
实施例3一种调控肿瘤乳酸代谢的纳米脂质体药物的制备
所述调控乳酸代谢的纳米脂质体药物的制备包括以下步骤：
采用电子天平分别称取8.3mg的PC，9.48mg的PE，4.95mg的Chol，7.35mg的DSPE-PEG 2000，每种膜材分别使用2mL CHCl3溶解，混合到一起；称取3mg氯尼达明(LND)和1mg乙酯利血平(Sy)，每种药物分别用100μL DMSO溶解，以上溶液逐次加入250mL茄形瓶后，通过旋转蒸发仪去除溶剂使脂质成膜，加入5mL去离子水在超声中剥离脂质膜，转移水化后的脂质体通过超声破碎探头(功率30W，10kHz，50min)获得合适粒径的纳米脂质体；用去离子水透析24h后通过220nm无菌滤头，得到粒径均一稳定的纳米脂质体药物(L@S/L)。
对比例1一种空白纳米脂质体(BL)
所述空白纳米脂质体(BL)的制备：
采用电子天平分别称取8.3mg的PC，9.48mg的PE，4.95mg的Chol，7.35mg的DSPE-PEG2000，每种膜材分别使用2mL CHCl3溶解，以上溶液逐次加入250mL茄形瓶后，通过旋转蒸发仪去除溶剂使脂质成膜，加入5mL去离子水在超声中剥离脂质膜，转移水化后的脂质体通过超声破碎探头(功率20W，20kHz，30min)获得合适粒径的纳米脂质体；用去离子水透析24h后通过220nm无菌滤头，得到空白纳米脂质体(BL)。
与实施例1不同之处在于，本对比例不添加氯尼达明和乙酯利血平，其余参数及操作参考实施例1。
对比例2一种氯尼达明纳米脂质体(L@L)
所述氯尼达明纳米脂质体(L@L)的制备：
采用电子天平分别称取8.3mg的PC，9.48mg的PE，4.95mg的Chol，7.35mg的DSPE-PEG 2000，每种膜材分别用2mL CHCl3溶解，称取5mg氯尼达明(LND)，用200μL DMSO溶解，以上溶液逐次加入250mL茄形瓶后，通过旋转蒸发仪去除溶剂使脂质成膜，加入5mL去离子水在超声中剥离脂质膜，转移水化后的脂质体通过超声破碎探头(功率20W，20kHz，30min)获得合适粒径的纳米脂质体；用去离子水透析24h后通过220nm无菌滤头，得到氯尼达明纳米脂质体(L@L)。
与实施例1不同之处在于，本对比例不添加乙酯利血平，其余参数及操作参考实施例1。
对比例3一种乙酯利血平纳米脂质体(L@S)
所述乙酯利血平纳米脂质体(L@S)的制备：
采用电子天平分别称取8.3mg的PC，9.48mg的PE，4.95mg的Chol，7.35mg的DSPE-PEG 2000，每组膜材分别使用2mL CHCl3溶解，称取2mg乙酯利血平(Sy)，用200μL DMSO溶解，以上溶液逐次加入250mL茄形瓶后，通过旋转蒸发仪去除溶剂使脂质成膜，加入5mL去离子水在超声中剥离脂质膜，转移水化后的脂质体通过超声破碎探头(功率20W，20kHz，30min)获得合适粒径的纳米脂质体；用去离子水透析24h后通过220nm无菌滤头，得到乙酯利血平纳米脂质体(L@S)。
与实施例1不同之处在于，本对比例不添加氯尼达明，其余参数及操作参考实施例1。
对比例4一种荧光可见纳米脂质体药物的制备
所述荧光可见纳米脂质体药物的制备包括以下步骤：
采用电子天平分别称取8.3mg的PC，9.48mg的PE，4.95mg的Chol，7.35mg的DSPE-PEG 2000，每种膜材分别使用2mL CHCl3溶解，混合到一起；称取2mg香豆素6(C6)，使用200μL CHCl3溶解，以上溶液逐次加入250mL茄形瓶后，通过旋转蒸发仪去除溶剂使脂质成膜，加入10mL去离子水在超声中剥离脂质膜，转移水化后的脂质体通过超声破碎探头(功率30W，30kHz，40min)获得合适粒径的纳米脂质体；通过220nm无菌滤头，得到粒径均一稳定的纳米脂质体(L@C6)。
对比例5一种荧光可见纳米脂质体药物的制备
所述荧光可见纳米脂质体药物的制备包括以下步骤：
采用电子天平分别称取16.6mg的PC，18.96mg的PE，9.9mg的Chol，14.7mg的DSPE-PEG 2000，每种膜材分别使用4mL CHCl3溶解，混合到一起；称取3mg荧光染料1，1-dioctadecyl-3，3，3，3-tetramethylindotricarbocyanine iodide(DIR)，使用200μLCHCl3溶解，以上溶液逐次加入250mL茄形瓶后，通过旋转蒸发仪去除溶剂使脂质成膜，加入20mL去离子水在超声中剥离脂质膜，转移水化后的脂质体通过超声破碎探头(功率20W，30kHz，50min)获得合适粒径的纳米脂质体；通过220nm无菌滤头，得到粒径均一稳定的纳米脂质体(L@DiR)。
以下以实施例1纳米脂质体药物(L@S/L)为例进行试验，其他纳米脂质体药物效果与实施例1纳米脂质体药物(L@S/L)效果类似。
试验例1纳米脂质体的表征
通过动态光散射法采用Zeta粒径电位测试仪测定实施例1与对比例1～3纳米脂质体的粒径以及电位，结果参见图1。
由图可见，实施例1制备的纳米脂质体药物均一且稳定，各脂质体粒径大小无明显差别，均保持在130nm左右；经透射电镜(比例尺：100nm)观察发现，实施例1纳米脂质体药物的粒径与经动态光散射法测得的大小保持一致；通过动态光散射法测得各纳米脂质体的电位基本维持在-12.5mV左右，有利于其在体内的长循环。
试验例2细胞对纳米脂质体的摄取情况
1、实验方法：
用对比例4制备所得脂质体为例，考察小鼠乳腺癌细胞4T1对纳米脂质体的摄取情况，具体步骤如下：
将4T1细胞以1×104个/孔接种于到35mm共聚焦小皿中，待细胞贴壁后，按0、0.5、1、2、4h的时间点分别加入L@C6孵育；使用PBS洗两遍后，加入4％多聚甲醛固定细胞15min，再加入4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核5min，在激光共聚焦显微镜下观察细胞摄取情况，结果参见图2。
将4T1细胞以每孔1×106个细胞密度接种于12孔板，培养24h，加入L@C6分别孵育0、0.5、1、2、4h；收集4T1细胞并重新悬浮在PBS中，用流式细胞仪进行分析，使用FlowJo10.0对数据进行分析，结果数据统计参见图3。
2、实验结果：
由图2可见，随着时间的延长，L@C6实验组的荧光越来越强，表明细胞孵育显著增强了纳米粒子在4T1细胞中的内化；孵育4h后，激光共聚焦显示强烈的C6荧光。其中，DAPI组为仅对细胞核染色的对照组，Merge组为对后两组(DAPI和L@C6)的叠加。
由图3可见，孵育4h后4T1细胞摄取率达83.3％，与激光共聚焦的结果一致。
上述细胞摄取的结果表明，该本发明纳米脂质体可以有效快速递送药物进入细胞。
试验例3细胞蛋白免疫印迹
1、实验方法：
4T1细胞以每孔1×106个细胞密度接种于6孔板中，分别用等量的PBS、BL、L@L、L@S和L@S/L处理24h。4T1细胞的总蛋白通过使用蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法提取，使用SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，PVDF膜用5％脱脂牛奶封闭1小时，然后与一抗MCT-4和GAPDH在4℃下孵育过夜；将膜用含有Tween 20的Tris-Buffer生理盐水(TBST)洗涤5次，与二抗IgG-辣根过氧化物酶(HRP)孵育1h，用TBST洗涤；，在化学发光检测系统(Imagequant LAS 500)上观察到免疫反应蛋白条带，结果参见图4。
2、实验结果：
由图可见，Western blotting分子蛋白分析结果表明L@S和L@S/L均能显著抑制4T1细胞MCT-4的表达。
试验例4巨噬细胞分化实验
1、实验方法：
4T1细胞分别用PBS、L@L、L@S和L@S/L处理24h后，使用乳酸试剂盒测定收集的上清液中的乳酸含量(细胞外乳酸)和4T1细胞裂解液中的乳酸水平(细胞内乳酸)，细胞外/细胞内乳酸的终值按照试剂盒说明书计算。此外，分别取上清液与M0巨噬细胞共培养48小时后，收集细胞并通过流式细胞仪测量巨噬细胞极化。结果参见图5～6。
2、实验结果：
如图5A所示，L@S/L组显示出了最低的细胞外乳酸水平；如图5B所示，在细胞内乳酸水平上，显示L@S组可以有效抑制细胞内乳酸外排，结合L@S/L组实验结果表明该实验方案可以有效改善肿瘤微环境中的乳酸堆积状况。
如图6A、6B、6C所示，根据巨噬细胞共培养分化实验结果，原始M0巨噬细胞中M1表型的巨噬细胞占比仅5.97％，经过与分组处理(PBS、L@L、L@S和L@S/L)的4T1细胞的上清液共培养后的M0巨噬细胞中M1表型的巨噬细胞数分别达到14.6％、29.7％、22.4％和56.7％；而原始M0巨噬细胞中M2表型的巨噬细胞占比为4.01％，经过以上相同的共培养处理后，其中的M2表型占比分别达到58.3％、34.2％、27.1％和11.4％；可以看到L@S/L可以促进M0巨噬细胞向M1型极化，减少M0巨噬细胞向M2的极化。
试验例5体内靶向实验
1、实验方法：
将4T1细胞以1×106个的数目皮下植入6周大雌性Balb/c小鼠中，肿瘤生长一周后达到约100mm3的大小后，将L@DiR通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，DiR剂量为0.75mg/kg(体重)。使用荧光成像系统(In vivo FX)在特定时间点(0、4、8、12、24h)捕获荧光图像。注射后24小时，从同一动物获得主要器官和肿瘤的离体荧光图像。结果参见图7。
2、实验结果：
由图可见，L@DiR可以在体内有效靶向小鼠肿瘤部位，增强药物疗效。说明本发明的纳米脂质体可以在体内有效靶向小鼠肿瘤部位。
试验例6体内抗肿瘤免疫实验
1、实验方法：
将小鼠毛发清洁后，将1×106个4T1细胞按100μL剂量注射到Balb/c小鼠右腿皮下，建立动物肿瘤模型。分别于第1、3、5、7、9、11、13、15、17天注射PBS、L@L、L@S和L@S/L：注射时以Sy和LND计剂量分别为1mg/kg和2.5mg/kg(体重)，PBS注射等体积。每两天用卡尺测量肿瘤体积，计算方法如下：肿瘤体积＝0.5×长×宽2。
治疗结束后，处死小鼠收集其主要脏器及肿瘤，采用研磨法提取肿瘤组织单细胞悬液。为了确定Treg细胞亚群，细胞悬液用抗体(抗小鼠CD3-APC、抗小鼠CD4-FITC、抗小鼠CD25-BV785和抗小鼠FOXP3-PE)染色30分钟。为了鉴定肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，将细胞悬液与抗小鼠CD45-FITC、抗小鼠CD11b-Alexa700、抗小鼠F4/80-PE/Cyanine7、抗小鼠CD86-PE和抗小鼠CD206-APC染色30分钟。为了识别NK细胞，细胞悬液用针对小鼠CD3-APC、抗小鼠CD11b-PE和抗小鼠NK1.1-FITC的抗体进行标记。最后，使用流式细胞仪评估免疫细胞悬浮液的数量。结果参见图8。
2、实验结果：
对于肿瘤组织中的巨噬细胞表型检测(图8A，8C)，经过纳米脂质体L@S/L处理的小鼠中M1型巨噬细胞的比例实现了显著增长。与对照组相比，L@L处理的M2型巨噬细胞略有减少，但L@S/L处理后M2型巨噬细胞剧烈减少，从对照组中的63.1％降至L@S/L组的25.9％。相应的统计分析如图8B，8D所示。这些结果与L@S/L纳米脂质体介导的乳酸代谢调节促进巨噬细胞M1型极化的体外研究一致。
如图8E所示，L@S/L治疗小鼠肿瘤组织中的Treg数量显著减少。L@S/L处理对NK细胞浸润的影响(如图8G所示)：L@S/L处理的小鼠肿瘤组织中NK细胞的密度显着高于其他处理组。统计图也显示了相同的趋势(如图8F，H所示)。NK细胞有效浸润肿瘤是L@S/L抑制肿瘤生长的可能内在机制之一。
以上结果表明，抑制糖酵解和减少乳酸堆积的L@S/L可以调节酸化肿瘤微环境，减少TME中Tregs的数量。此外，抑制乳酸流出有利于TME中的M1巨噬细胞极化。因此，通过干扰乳酸代谢和增强抗肿瘤免疫敏感性来重编程TME的方案是高度可行的。
试验例7体内抗肿瘤实验
1、实验方法：
将小鼠清洁毛发后，将1×106个4T1细胞按100μL剂量注射到Balb/c小鼠右腿皮下，建立动物肿瘤模型。小鼠分组后，平均每组3～6只小鼠，分别于第1、3、5、7、9、11、13、15、17天按照组别分别注射PBS、L@L、L@S、L@S/L纳米脂质体200μL，每两天用卡尺测量肿瘤体积，计算方法如下：肿瘤体积＝0.5×长×宽2。
治疗结束后，处死小鼠收集其主要脏器及肿瘤。肿瘤用于制备苏木精/伊红(HE)和TUNEL免疫荧光染色和分析的石蜡包埋切片。主要器官(心、肝、脾、肺、肾)用HE染色试剂盒进行HE染色。使用全自动载玻片扫描系统扫描切片。TUNEL免疫荧光染色按照KeyGENBioTECH试剂盒说明进行，并通过共聚焦显微镜进行分析。
另取20只小鼠，进行相同的实验操作，治疗结束后观察老鼠的生存时间。
2、实验结果：
结果参见图9～11，由图9A，图9C可知，PBS处理组中肿瘤快速生长，而单独使用LND(L@L)或单独使用Sy(L@S)组显示出对肿瘤生长的中度抑制。在相同剂量下，LND和Sy(L@S/L)联合治疗表现出最佳的肿瘤生长抑制作用。由图9B知小鼠体重基本维持不变，表明该纳米脂质体药物的生物安全性。此外，记录的小鼠存活率显示出与肿瘤生长抑制数据一致的趋势(如图9D)。
由图9D可见，PBS组在治疗后第20天没有小鼠存活，而在接受L@S/L治疗时，60％的小鼠在第50天存活。这些结果表明联合LND和Sy在抑制肿瘤生长和延长小鼠存活时间方面显示出协同作用。
由图10可见，L@S/L处理组的肿瘤组织肿瘤细胞凋亡和坏死程度最高，细胞增殖最低，这与抑制肿瘤生长的结果一致。
由图11可见，与PBS组相比，接受纳米药物治疗的小鼠心脏、肝脏、脾脏和肺等主要器官未出现明显的组织学病变或异常，表明脂质体系统的安全性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.氯尼达明和乙酯利血平联合使用在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.一种调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物以氯尼达明和乙酯利血平作为抗肿瘤活性成分，且抗肿瘤活性成分被包裹于脂质体中；其中，所述脂质体包括以下组分：卵磷脂、胆固醇、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、磷脂酰乙醇胺。
3.根据权利要求2所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物，其特征在于，所述脂质体包括以下组分及其重量份数：卵磷脂50～100份、胆固醇25～50份、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20001～2份、磷脂酰乙醇胺25～50份。
4.根据权利要求2所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物，其特征在于，所述氯尼达明与脂质体的质量比为1:(5～10)。
5.根据权利要求2所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物，其特征在于，所述乙酯利血平与脂质体的质量比为1:(10～30)。
6.根据权利要求2～5任一所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物的粒径为90～190nm。
7.权利要求2～6任一所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将脂质体组分溶解于有机溶剂中，加入抗肿瘤活性成分，去除有机溶剂，得到脂质膜；所得脂质膜置于水中，破碎，水透析后过滤，即得。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自三氯甲烷、四氢呋喃、丙酮中的一种或多种。
9.权利要求2～6任一所述调控肿瘤乳酸代谢的纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤。
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