CN116966278B - 一种装载乳酸氧化酶的缓释材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种装载乳酸氧化酶的缓释材料及其制备方法与应用。该缓释材料将LOX包裹在中空二氧化锰(MnO2)中,以聚丙交酯乙交酯(PLGA)三嵌段共聚物包裹MnO2。在用药时MnO2在肿瘤微环境中可产生一定的氧气(O2),提供给消耗乳酸需要O2的LOX,使其能显著降低肿瘤微环境中乳酸的含量,达到显著抗肿瘤的效果。并且,本发明制备得到的缓释材料具有缓慢释放LOX的效果,有效消耗乳酸且降低了LOX的毒性,安全性高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地,涉及一种装载乳酸氧化酶的缓释材料及其制备方法与应用。
背景技术
在氧气充足时,肿瘤细胞会增加葡萄糖的摄取并将大量丙酮转化为乳酸,而产物乳酸作为癌细胞改造微环境的重要工具,促进肿瘤的侵袭与转移,并通过诱导和招募免疫抑制相关细胞和分子,促进肿瘤的发生发展。如乳酸通过单羧酸转运蛋白从癌细胞流出并防止胞内酸化,可抑制T淋巴细胞和NK(natural killer)细胞的细胞毒活性,并促进树突细胞向分泌白介素10的耐受性DCs分化;通过组蛋白赖氨酸残基的乳酸化修饰,乳酸可促进巨噬细胞向M2样表型极化,从而抑制肿瘤微环境内的免疫反应(葛威祥,严时佳,万国辉.乳酸在肿瘤微环境中的免疫调节作用[J].药学学报,2022,57(9):10.)。
为了减少肿瘤微环境中的乳酸,抑制肿瘤发展,可以消耗肿瘤微环境中的乳酸。其中,乳酸氧化酶(LOX)是乳酸消耗的一种有效手段,但是目前却未见在临床上应用,主要原因系由于其毒性较大,全身给药不现实。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有乳酸氧化酶毒性较大,全身给药不现实的缺陷和不足,提供一种装载乳酸氧化酶的缓释材料。
本发明的目的是提供所述装载乳酸氧化酶的缓释材料的制备方法。
本发明另一目的是提供所述装载乳酸氧化酶的缓释材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种装载乳酸氧化酶的缓释材料,所述缓释材料将乳酸氧化酶包裹在中空二氧化锰中,再以聚丙交酯乙交酯三嵌段共聚物包裹负载了乳酸氧化酶的中空二氧化锰。
本发明缓释材料将LOX包裹在中空二氧化锰(MnO2)中,以聚丙交酯乙交酯(PLGA)三嵌段共聚物包裹MnO2。在用药时可以采取局部注射的方法,其中的MnO2在肿瘤微环境中可产生一定的氧气(O2),提供给消耗乳酸需要O2的LOX,使其能显著降低肿瘤微环境中乳酸的含量,达到显著抗肿瘤的效果。并且,本发明制备得到的缓释材料具有缓慢释放LOX的效果,有效消耗乳酸且降低了LOX的毒性,安全性高。
进一步地,所述聚丙交酯乙交酯三嵌段共聚物为聚(丙交酯-共乙交酯)-聚乙二醇-聚(丙交酯-共乙交酯)。其中,聚(丙交酯-共乙交酯)-聚乙二醇-聚(丙交酯-共乙交酯)(PLGA-PEG-PLGA)是美国FDA批准的可用于药物辅料的具有高安全性的温敏型水凝胶。
更进一步地,所述乳酸氧化酶、中空二氧化锰、聚丙交酯乙交酯三嵌段共聚物的质量比为400~600μg:10mg:25~115μg。
另外的,本发明还提供了所述装载乳酸氧化酶的缓释材料的制备方法,具体包括以下步骤:
S1、将二氧化硅与高锰酸钾反应,去除SiO2模版,使二氧化硅表面形成均匀的MnO2涂层,得到SiO2@MnO2纳米颗粒;
S2、将步骤S1所得SiO2@MnO2纳米颗粒分散在水中,加入阳离子聚合物或戊二醛对纳米颗粒进行包裹,得到阳离子聚合物或戊二醛包覆的MnO2纳米粒;
S3、将乳酸氧化酶与步骤S2所得阳离子聚合物或戊二醛包覆的MnO2纳米粒混合均匀,加入透明质酸溶液得到稳定的纳米颗粒,离心,沉淀洗涤后加入聚丙交酯乙交酯三嵌段共聚物水凝胶中,混匀,即得。
进一步地,步骤S1中,所述去除SiO2模版的方法为加入Na2CO3 58~63℃加热反应。
优选地,步骤S1中,采用经典法制备固体二氧化硅(sSiO2)纳米粒子作为硬模板。
更进一步地,步骤S2中,所述阳离子聚合物选自聚烯丙胺盐酸盐(PAH)、聚氨基酯(PBAE)、聚丙烯胺(PAM)中的一种或多种。
进一步地,步骤S3中,所述透明质酸溶液的浓度为8~12mg/ml。
另外的,本发明还要求保护所述装载乳酸氧化酶的缓释材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地,所述肿瘤为肝癌。
更进一步地,所述药物还可以包括药学上可接受的辅料,制备成为口服剂、吸入剂、注射剂或外用剂。
本发明具有以下有益效果:
本发明缓释材料将LOX包裹在中空二氧化锰(MnO2)中,以聚丙交酯乙交酯(PLGA)三嵌段共聚物包裹MnO2。在用药时MnO2在肿瘤微环境中可产生一定的氧气(O2),提供给消耗乳酸需要O2的LOX,使其能显著降低肿瘤微环境中乳酸的含量,达到显著抗肿瘤的效果。并且,本发明制备得到的缓释材料具有缓慢释放LOX的效果,有效消耗乳酸且降低了LOX的毒性,安全性高。
附图说明
图1为实验例1中不同材料表征和功能验证结果汇总图,其中,A-透射电子显微镜图;B-平均粒径分布;C-zeta电位;D-LOX负载量测定凝胶电泳图;E-常氧条件下乳酸含量;F-O2消耗量;G-乳酸消耗量;H-O2生成速率比;I-Mn2+的释放量。
图2为实验例2中PLGA-PEG-PLGA溶液的溶胶-凝胶相变图,precipitate phase:析出物状态;Sol phase:溶液状态;Gel phase:凝胶状态。
图3为实验例2中纳米粒子-水凝胶复合体系的性能检测汇总图,其中,A-小瓶翻转方法在37℃下表现出的快速且可逆的溶胶-凝胶相变;B-PLGA-PEG-PLGA凝胶的冻干样品SEM成像图;C-PLGA-PEG-PLGA凝胶不同时间外观;D-PLGA-PEG-PLGA凝胶在小鼠体内的水凝胶结节降解图示;E-含有ICG的PLGA-PEG-PLGA凝胶的在小鼠体内的荧光信号;F-周围皮肤组织的苏木精和伊红染色图;G-MnO2@Gel在37℃下的溶胶-凝胶相变行为;H-PLGA-PEG-PLGA凝胶和LOX-MnO2@Gel的储能模量(G')和损耗模量(G")随时间的变化;I-PLGA-PEG-PLGA凝胶中LOX-MnO2的释放曲线;J-LOX-MnO2@Gel在体内Mn2+的释放动力学;K-肿瘤组织中的乳酸含量。
图4为实验例3中纳米粒子-水凝胶复合体系的治疗效果汇总图,其中,A-实验流程图;B-代表性皮下Hepa1-6荷瘤小鼠的体内生物发光图;C-肿瘤体积大小检测;D-小鼠生存时间;E-瘤内乳酸含量;F-小鼠的体重数据;G-主要器官组织病理学切片。
图5为实验例3中各组荷瘤小鼠的血清生化参数数据统计图。
图6为实验例4中肿瘤进行免疫细胞学分析汇总图,其中,A-小鼠肿瘤RNA测序汇总;B-小鼠肿瘤RNA测序基因的基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析;C-小鼠肿瘤RNA测序基因热图;D-小鼠肿瘤微环境中杀伤T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)(CD45CD3 CD8)的占比;E-小鼠肿瘤微环境中GzmB CTL(CD45 CD3 CD8 GzmB)的占比;F-小鼠肿瘤微环境中调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)(CD45 CD3 CD4 CD25 Foxp3)的占比;G-小鼠肿瘤微环境中M1(CD45+CD11b+F4/80+CD80+)的占比;H-小鼠肿瘤微环境中M2(CD45+CD11b+F4/80+CD163+)的占比;I-M1/M2型巨噬细胞的比率;J-小鼠肿瘤、M1/M2巨噬细胞和细胞核的染色图。
图7为实验例4中小鼠肿瘤的CTL(CD45 CD3 CD8)(A)、GzmB CTL(CD45 CD3 CD8GzmB)(B)和Tregs(CD45 CD3 CD4 CD25 Foxp3)(B)的代表性流式细胞术图。
图8为实验例4中小鼠肿瘤的M1(CD45+CD11b+F4/80+CD80+)(A)和M2(CD45+CD11b+F4/80+CD163+)(B)的巨噬细胞的代表性流式细胞术图。
图9为实验例5中LOX与PAH-MnO2@Gel的不同比例配比对肝细胞的毒性影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种装载乳酸氧化酶的缓释材料
S1、纳米粒的制备:
(1)将3mL原硅酸四乙酯(TEOS)滴加到含有EtOH(7mL)、去离子(DI)H2O(10mL)和NH3·H2O(25%,2mL)的混合溶液中,室温下搅拌24小时,所得产物离心,形成的纳米颗粒用EtOH和水分别洗涤3次,得到固体二氧化硅(sSiO2)纳米粒子;
(2)在超声处理下将KMnO4水溶液(300mg)滴加到含有40mg sSiO2纳米粒子的水悬浮液中,搅拌12小时后,洗涤得到二氧化硅/二氧化锰结合体(SiO2-MnO2)纳米颗粒,并重新分散在水中,将SiO2-MnO2纳米颗粒(20mg)分散液添加到60℃的Na2CO3(2M)水溶液中,去除SiO2模板,得到中孔MnO2(HMnO2)纳米颗粒;
(3)将HMnO2纳米颗粒(10mg)均匀分散在超纯水中,加入阳离子聚合物聚烯丙胺盐酸盐(PAH)溶液(10mg/mL,2mL)并搅拌30分钟,用去离子水洗涤后得到带正电荷的纳米颗粒——阳离子聚合物包覆聚烯丙胺盐酸盐包裹MnO2纳米粒(PAH-MnO2)。
S2、装载乳酸氧化酶的缓释材料制备:
将500μg乳酸氧化酶(LOX)与PAH改性的纳米颗粒PAH-MnO2(2mg/mL,5mL)混合,在4℃下振荡15分钟;加入透明质酸(HA)溶液(10mg/mL,2mL),并继续摇匀15分钟以稳定纳米颗粒;离心(6000rmp,15分钟)收集获得的纳米颗粒LOX-MnO2,用超纯水洗涤,所得粒子加入聚(丙交酯-共乙交酯)-聚乙二醇-聚(丙交酯-共乙交酯)(PLGA-PEG-PLGA)(15wt%)温敏水凝胶中,4℃下匀速搅拌30min,得到均质稳定的装载乳酸氧化酶的缓释材料LOX-MnO2@Gel。
实施例2一种装载乳酸氧化酶的缓释材料
S1、纳米粒的制备:
(1)将3mL原硅酸四乙酯(TEOS)滴加到含有EtOH(7mL)、去离子(DI)H2O(10mL)和NH3·H2O(25%,2mL)的混合溶液中,室温下搅拌24小时,所得产物离心,形成的纳米颗粒用EtOH和水分别洗涤3次,得到固体二氧化硅(sSiO2)纳米粒子;
(2)在超声处理下将KMnO4水溶液(300mg)滴加到含有40mg sSiO2纳米粒子的水悬浮液中,搅拌12小时后,洗涤得到二氧化硅/二氧化锰结合体(SiO2-MnO2)纳米颗粒,并重新分散在水中,将SiO2-MnO2纳米颗粒(20mg)分散液添加到60℃的Na2CO3(2M)水溶液中,去除SiO2模板,得到中孔MnO2(HMnO2)纳米颗粒;
(3)将HMnO2纳米颗粒(10mg)均匀分散在超纯水中,加入阳离子聚合物聚烯丙胺盐酸盐(PAH)溶液(10mg/mL,2mL)并搅拌30分钟,用去离子水洗涤后得到带正电荷的纳米颗粒——阳离子聚合物包覆聚烯丙胺盐酸盐包裹MnO2纳米粒(PAH-MnO2)。
S2、装载乳酸氧化酶的缓释材料制备:
将400μg乳酸氧化酶(LOX)与PAH改性的纳米颗粒PAH-MnO2(2mg/mL,5mL)混合,在4℃下振荡15分钟;加入透明质酸(HA)溶液(8mg/mL,2mL),并继续摇匀15分钟以稳定纳米颗粒;离心(6000rmp,15分钟)收集获得的纳米颗粒LOX-MnO2,用超纯水洗涤,所得粒子加入聚(丙交酯-共乙交酯)-聚乙二醇-聚(丙交酯-共乙交酯)(PLGA-PEG-PLGA)(10wt%)温敏水凝胶中,4℃下匀速搅拌30min,得到均质稳定的装载乳酸氧化酶的缓释材料LOX-MnO2@Gel。
实施例3一种装载乳酸氧化酶的缓释材料
S1、纳米粒的制备:
(1)将3mL原硅酸四乙酯(TEOS)滴加到含有EtOH(7mL)、去离子(DI)H2O(10mL)和NH3·H2O(25%,2mL)的混合溶液中,室温下搅拌24小时,所得产物离心,形成的纳米颗粒用EtOH和水分别洗涤3次,得到固体二氧化硅(sSiO2)纳米粒子;
(2)在超声处理下将KMnO4水溶液(300mg)滴加到含有40mg sSiO2纳米粒子的水悬浮液中,搅拌12小时后,洗涤得到二氧化硅/二氧化锰结合体(SiO2-MnO2)纳米颗粒,并重新分散在水中,将SiO2-MnO2纳米颗粒(20mg)分散液添加到60℃的Na2CO3(2M)水溶液中,去除SiO2模板,得到中孔MnO2(HMnO2)纳米颗粒;
(3)将HMnO2纳米颗粒(10mg)均匀分散在超纯水中,加入阳离子聚合物聚烯丙胺盐酸盐(PAH)溶液(10mg/mL,2mL)并搅拌30分钟,用去离子水洗涤后得到带正电荷的纳米颗粒——阳离子聚合物包覆聚烯丙胺盐酸盐包裹MnO2纳米粒(PAH-MnO2)。
S2、装载乳酸氧化酶的缓释材料制备:
将550μg乳酸氧化酶(LOX)与PAH改性的纳米颗粒PAH-MnO2(2mg/mL,5mL)混合,在4℃下振荡15分钟;加入透明质酸(HA)溶液(8mg/mL,2mL),并继续摇匀15分钟以稳定纳米颗粒;离心(6000rmp,15分钟)收集获得的纳米颗粒LOX-MnO2,用超纯水洗涤,所得粒子加入聚(丙交酯-共乙交酯)-聚乙二醇-聚(丙交酯-共乙交酯)(PLGA-PEG-PLGA)(20wt%)温敏水凝胶中,4℃下匀速搅拌30min,得到均质稳定的装载乳酸氧化酶的缓释材料LOX-MnO2@Gel。
实施例4一种装载乳酸氧化酶的缓释材料
S1、纳米粒的制备:
(1)将3mL原硅酸四乙酯(TEOS)滴加到含有EtOH(7mL)、去离子(DI)H2O(10mL)和NH3·H2O(25%,2mL)的混合溶液中,室温下搅拌24小时,所得产物离心,形成的纳米颗粒用EtOH和水分别洗涤3次,得到固体二氧化硅(sSiO2)纳米粒子;
(2)在超声处理下将KMnO4水溶液(300mg)滴加到含有40mg sSiO2纳米粒子的水悬浮液中,搅拌12小时后,洗涤得到二氧化硅/二氧化锰结合体(SiO2-MnO2)纳米颗粒,并重新分散在水中,将SiO2-MnO2纳米颗粒(20mg)分散液添加到60℃的Na2CO3(2M)水溶液中,去除SiO2模板,得到中孔MnO2(HMnO2)纳米颗粒。;
(3)将HMnO2纳米颗粒(10mg)均匀分散在超纯水中,加入阳离子聚合物戊二醛(10mg/mL,2mL)并搅拌30分钟,用去离子水洗涤后得到带正电荷的纳米颗粒——阳离子聚合物包覆戊二醛包裹MnO2纳米粒(戊二醛-MnO2)。
S2、装载乳酸氧化酶的缓释材料制备:
将600μg乳酸氧化酶(LOX)与戊二醛改性的纳米颗粒(2mg/mL,5mL)混合,在4℃下振荡15分钟;加入透明质酸(HA)溶液(8mg/mL,2mL),并继续摇匀15分钟以稳定纳米颗粒;离心(6000rmp,15分钟)收集获得的纳米颗粒LOX-MnO2,用超纯水洗涤,所得粒子加入聚(丙交酯-共乙交酯)-聚乙二醇-聚(丙交酯-共乙交酯)(PLGA-PEG-PLGA)(15wt%)温敏水凝胶中,4℃下匀速搅拌30min,得到均质稳定的装载乳酸氧化酶的缓释材料LOX-MnO2@Gel。
实施例5一种装载乳酸氧化酶的缓释材料
S1、纳米粒的制备:
(1)将3mL原硅酸四乙酯(TEOS)滴加到含有EtOH(7mL)、去离子(DI)H2O(10mL)和NH3·H2O(25%,2mL)的混合溶液中,室温下搅拌24小时,所得产物离心,形成的纳米颗粒用EtOH和水分别洗涤3次,得到固体二氧化硅(sSiO2)纳米粒子;
(2)在超声处理下将KMnO4水溶液(300mg)滴加到含有40mg sSiO2纳米粒子的水悬浮液中,搅拌12小时后,洗涤得到二氧化硅/二氧化锰结合体(SiO2-MnO2)纳米颗粒,并重新分散在水中,将SiO2-MnO2纳米颗粒(20mg)分散液添加到60℃的Na2CO3(2M)水溶液中,去除SiO2模板,得到中孔MnO2(HMnO2)纳米颗粒;
(3)将HMnO2纳米颗粒(10mg)均匀分散在超纯水中,加入阳离子聚合物聚氨基酯(PBAE)(10mg/mL,2mL)并搅拌30分钟,用去离子水洗涤后得到带正电荷的纳米颗粒——阳离子聚合物包覆聚氨基酯包裹MnO2纳米粒(PBAE-MnO2)。
S2、装载乳酸氧化酶的缓释材料制备:
将500μg乳酸氧化酶(LOX)与PBAE改性的纳米颗粒(2mg/mL,5mL)混合,在4℃下振荡15分钟;加入透明质酸(HA)溶液(8mg/mL,2mL),并继续摇匀15分钟以稳定纳米颗粒;离心(6000rmp,15分钟)收集获得的纳米颗粒LOX-MnO2,用超纯水洗涤,所得粒子加入聚(丙交酯-共乙交酯)-聚乙二醇-聚(丙交酯-共乙交酯)(PLGA-PEG-PLGA)(15wt%)温敏水凝胶中,4℃下匀速搅拌30min,得到均质稳定的装载乳酸氧化酶的缓释材料LOX-MnO2@Gel。
实验例1材料表征和功能验证
1、采用透射电子显微镜(TEM)可视化观察实施例1中二氧化硅/二氧化锰结合体纳米颗粒(sSiO2-MnO2)、中孔MnO2(H-MnO2)纳米颗粒、携带LOX的MnO2(LOX-MnO2)材料的形貌。结果参见图1中的A,TEM图像清楚地显示了外层和内核之间的对比度差异,表明sSiO2-MnO2的二氧化硅与蚀刻剂溶解后形成了中空结构的H-MnO2纳米壳;测量H-MnO2纳米壳的厚度约为15.5nm;负载LOX和HA后形成的LOX-MnO2的厚度略微增加至约18.6nm,而形貌基本不受影响。
2、分别检测实施例1中sSiO2-MnO2、H-MnO2、PAH修饰后的MnO2(PAH-MnO2)和LOX-MnO2的平均粒径分布和zeta电位。检测方法:利用Zetasizer Nano ZS system(MalvernInstruments Ltd,Malvern,UK),采用动态光散射法,结合“NIBS”光学器件,测定池温度设定为26℃,每份样品平行操作3次。
结果参见图1中的B、C,可见sSiO2-MnO2的平均纳米粒径约为147.52nm,H-MnO2纳米粒的平均粒径约为145.5nm,PAH-MnO2的平均粒径约为154.2nm,LOX-MnO2的平均粒径约为172.1nm,各产物的粒径大小均匀性佳。sSiO2-MnO2的电位值约为-48.5mV,H-MnO2纳米粒的电位值约为-46.28mV,PAH-MnO2的电位值约为35.92mV,LOX-MnO2的平均电位值约为-13.51mV。
3、利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析测定LOX、H-MnO2、LOX-MnO2中LOX的负载量。检测方法:在SDS-PAGE胶按LOX、H-MnO2、LOX-MnO2的顺序上样,上样量同样为30μl,使用二辛可宁酸(BCA)蛋白测定法测定LOX-MnO2中LOX的负载量。结果参见图1中的D,结合LOX浓度与吸光度值关系的标准曲线(y=-50.179x2+714.39x,R2=0.9981),计算可得,LOX-MnO2中LOX的负载能力约为51.40μg/mg。
4、使用乳酸侦察分析仪(EKF Diagnostics GmbH,德国巴勒本)检测常氧条件下LOX-MnO2对乳酸氧化的催化能力。检测方法:在常氧条件下,LOX(5μg/mL)、H-MnO2(100μg/mL)和LOX-MnO2(100μg/mL)在含有5mM乳酸的PBS中的乳酸消耗效应。由于LOX通过消耗O2催化乳酸生成丙酮酸和H2O2,使用溶解氧仪(JBPJ-609L,雷思传感器技术有限公司,中国上海)测定上述混合系统在用液体石蜡密封的环境中的O2浓度,含有LOX(5μg/mL)、H-MnO2纳米粒(100μg/mL)或LOX-MnO2(100μg/mL)的5mM乳酸溶液的O2消耗曲线。
结果参见图1中的E、F,可见,除H-MnO2外,LOX和LOX-MnO2均能随着时间的推移有效降低乳酸水平,表明LOX-MnO2可以很好地保持LOX的催化能力;在LOX基团溶液中检测到溶解O2的明显减少。总言之,LOX-MnO2在消耗氧气的情况下能够促进LOX与乳酸反应,MnO2的存在能够更好维持O2的产生,使上述反应持续发生达到更好的乳酸消耗的效果。
5、由于H-MnO2纳米壳分解为Mn2+,在H2O2存在下Mn2+将H2O2催化为O2,这是有益的用于在缺氧微环境中维持乳酸氧化反应。为了进一步证明这一点,本发明利用乳酸侦察分析仪(EKF Diagnostics GmbH,德国巴勒本)评估了LOX-MnO2在缺氧条件下对乳酸氧化的催化能力。具体方法为:在常氧或缺氧条件下37℃,将乳酸(5mM)和LOX(5μg/mL)或H-MnO2(100μg/mL)或LOX-MnO2(100μg/mL)混合置于试管中,利用液体石蜡将试管密封。
结果参见图1中的G(数据表示为平均值±s.d.,n=3,***=P<0.001),可见LOX和LOX-MnO2的乳酸消耗效果受到缺氧的严重限制;当添加外源性H2O2后,LOX-MnO2的乳酸消耗效果显著增加;体现了LOX(5μg/mL)和LOX-MnO2(100μg/mL)在含有不同浓度H2O2的5mM乳酸溶液中的乳酸消耗作用。
6、利用溶解氧仪(JBPJ-609L,雷思传感器技术有限公司,中国上海)检测反应体系的O2含量。具体方法为:在常氧或缺氧条件下37℃,将乳酸(5mM)和LOX(5μg/mL)或H-MnO2(100μg/mL)或LOX-MnO2(100μg/mL)混合置于试管中,利用液体石蜡将试管密封,使用乳酸侦察分析仪(EKF Diagnostics GmbH,Barleben,德国)检测乳酸含量。结果见图1中的H,可见,在100μMH2O2存在下,LOX-MnO2在酸性条件(pH 6.5)下的O2生成速率比在中性条件(pH7.4)下更快,也证实了LOX-MnO2纳米颗粒的H2O2依赖性产氧能力。
7、将LOX-MnO2分散到含有或不含100μM H2O2的磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.4或6.5)中,并在不同时间点收集反应溶液并离心。使用Agilent ICP-MS 7700(AgilentTechnologies,CA,USA)对上清液进行电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析,以检测Mn2+的释放,同时将沉淀物重悬于PBS中并进行透射电子显微镜操作(TEM)分析记录LOX-MnO2的形态变化。
结果参见图1中的I,可见在100μM H2O2存在的情况下,LOX-MnO2中Mn2+的释放量显着增加;相反,在没有H2O2的情况下,LOX-MnO2在pH 7.4下24小时内似乎保持稳定,在pH 6.5下仅观察到适度的Mn2+释放。
总结:上述这些结果表明LOX-MnO2利用MnO2与H2O2的催化产氧能力,给LOX消耗乳酸提供O2,凸显了LOX-MnO2的高效乳酸消耗能力,具有良好的级联催化性能。
实验例2纳米粒子-水凝胶复合体系的性能检测
1、纳米粒子-水凝胶复合体系的制备与表征
将适量的PLGA-PEG-PLGA溶解于PBS(pH7.4)中,4℃搅拌过夜,得到一系列不同浓度的PLGA-PEG-PLGA前驱体溶液(5、10、15、20、25wt%)。PLGA-PEG-PLGA凝胶的相图是通过小瓶翻转方法,从30℃加热到50℃以及每步1℃的恒定加热速率来确定的。将装有400μL不同浓度PLGA-PEG-PLGA的小瓶浸入水浴中,并在每个温度下平衡5分钟。如果将小瓶倒置30秒时未观察到可见流动,则判断样品处于凝胶状态。使用FEIQuanta FEG 450ESEM(FEICompany,俄勒冈州,美国)在高真空模式下对冻干水凝胶的横截面图像进行表征。
相变图参见图2,可见温度和PLGA-PEG-PLGA前驱体溶液浓度对溶胶-凝胶相变的影响。PLGA-PEG-PLGA溶液凝胶化的临界浓度约为10wt%,随着PLGA-PEG-PLGA溶液的浓度从15wt%增加到25wt%,凝胶化的临界温度逐渐降低。然而,如果在凝胶化后温度继续升高,由于PEG壳的过度脱水和胶束的显着收缩,可能会形成沉淀物。
因此,选择15wt%的PLGA-PEG-PLGA溶液进行后续实验,通过小瓶翻转方法呈现其在37℃下表现出快速且可逆的溶胶-凝胶相变(图3中的A)。冷冻扫描电子显微镜(SEM)成像证实,PLGA-PEG-PLGA凝胶的冻干样品表现出结构良好的支架,具有多孔和松散的微观结构(图3中的B)。
2、垂直放置PLGA-PEG-PLGA凝胶(15wt%)于37℃恒温箱内,每1、3、6、12、18天进行拍摄,记录其完整外观。结果参见图3中的C,可见PLGA-PEG-PLGA凝胶的完整性在37℃下可以保持至少6天,之后逐渐降解直到第18天。这些发现表明,PLGA-PEG-PLGA凝胶在体外的降解速度缓慢,可实现缓释给药的作用。
3、为了可视化PLGA-PEG-PLGA凝胶在体内的降解,将150μL的PLGA-PEG-PLGA溶液(15wt%)注射到健康C57/BL6小鼠的皮下腹部组织中;原位形成的PLGA-PEG-PLGA凝胶的整体尺寸随着时间的推移而逐渐降解,并且在注射后第18天在小鼠的注射部位没有观察到可见的水凝胶结节(图3中的D)。
为了进一步表征PLGA-PEG-PLGA凝胶的体内降解行为,将吲哚菁绿(ICG)作为指示剂添加到PLGA-PEG-PLGA溶液中,并注射到小鼠的皮下腹部组织中,使用IVIS光谱成像系统(美国马萨诸塞州珀金埃尔默)监测和量化ICG的荧光强度。结果参见图3中的E,体内成像显示,来自含有ICG的PLGA-PEG-PLGA凝胶的荧光信号至少可检测到18天。这些发现表明,PLGA-PEG-PLGA凝胶在体内的降解速度缓慢,可实现缓释给药的作用。
对上述小鼠麻醉后处死、取材,进行周围皮肤组织的苏木精和伊红(H&;E)染色,结果参见图3中的F,均未显示任何显著的炎症反应,表明PLGA-PEG-PLGA凝胶具有理想的生物降解性和生物兼容性。
4、为了研究负载LOX-MnO2对PLGA-PEG-PLGA的溶胶-凝胶相变的影响,进行了流变学分析,将负载LOX-MnO2的PLGA-PEG-PLGA凝胶(LOX-MnO2@Gel)放置在在37℃环境里,结果参见图3中的G,可见溶胶转变成凝胶的行为没有明显改变。
使用配备温度控制器的HAAKE Rotovisco1旋转流变仪(Thermo ScientificHAAKE GmbH,卡尔斯鲁厄,德国)监测纳米粒子-水凝胶复合系统的动态流变行为。结果参见图3中的H,可见在37℃的受控温度下,以振荡时间扫描模式测量PLGA-PEG-PLGA凝胶和LOX-MnO2@Gel的储能模量(G')和损耗模量(G")随时间的变化,结果显示负载LOX-MnO2对PLGA-PEG-PLGA的溶胶-凝胶相变未见明显影响。实验条件为剪切应变:1%;剪切频率:1.59赫兹;温度:37℃。所有测试样品在37℃下60s内形成物理水凝胶。
这些发现表明,LOX-MnO2加载于PLGA-PEG-PLGA并不影响凝胶本身的相变特征,保持良好的缓释效应。
5、利用旋转流变仪评估LOX-MnO2@Gel中LOX-MnO2的释放曲线,结果参见图3中的I,表明24小时内的初始爆发释放量约为47.5%,随后持续缓慢释放,到第18天,LOX-MnO2的累积释放率达到约90.9%。这些发现表明,LOX-MnO2@Gel在体外具有良好的缓释作用。
6、研究LOX-MnO2@Gel在体内的缓释动力学,在肿瘤内注射游离LOX-MnO2或LOX-MnO2@Gel后的不同时间点,测定C57/BL6小鼠皮下Hepa1-6肿瘤中的Mn元素含量。结果参见图3中的J,可见游离LOX-MnO2组的瘤内Mn保留量在注射后第1天仅为25.9%;相比之下,LOX-MnO2@Gel组在第1天至第12天每个时间点的瘤内Mn保留量显着高于游离LOX-MnO2组,即使在注射后第18天,LOX-MnO2@Gel组中仍有8.1%的瘤内Mn2+潴留。这些发现表明,LOX-MnO2@Gel具有良好的缓释作用,能够持续发挥作用。
在肿瘤内注射LOX-MnO2@Gel后第1天,麻醉小鼠并处死取材,快速研磨肿瘤组织,并利用乳酸侦察分析仪(EKF Diagnostics GmbH,德国巴勒本)检测对肿瘤裂解液的乳酸含量。结果参见图3中的L,可见肿瘤组织中的乳酸含量与注射后第0天相比降至55.9%,并且由LOX-MnO2@Gel介导的肿瘤内乳酸含量的显着降低持续到注射后第18天;相比之下,肿瘤内直接注射游离LOX-MnO2在18天内没有显着降低乳酸水平。这些发现表明,纳米粒子-水凝胶复合体系可以维持肿瘤组织中LOX-MnO2的持续释放,从而实现乳酸的持续消耗。
总结:PLGA-PEG-PLGA具有良好的相变性能和生物安全性,其与MnO2的结合不改变各自原有特性,LOX-MnO2@Gel在体内外实验中表现出极佳的生物安全性、极佳的装药率及释药效能,同时在生物体内具备长达18天的缓释功能。
实验例3纳米粒子-水凝胶复合体系的治疗效果
1、C57/BL6小鼠皮下接种Hepa1-6Luc细胞,肿瘤细胞接种后7天进行不全消融(incomplete Microwave Ablation,iMWA);iMWA操作如下:暴露肿瘤后,用超细微波消融针插入肿瘤内,以5W的消融功率维持1分钟的消融治疗,达到不全MWA的效果。随后,立即通过瘤内注射(即在肿瘤周边进行20ul小体积注射)空白水凝胶(Gel,Group1)、H-MnO2@Gel(H-MnO2,5mg/kg,Group2)、LOX@Gel(LOX,250μg/kg,Group3)或LOX-MnO2@Gel(LOX-MnO2,5mg/kg,Group4),流程参见图4中的A。
2、利用使用IVIS光谱成像系统(美国马萨诸塞州珀金埃尔默)监测和量化接受不同干预后残留肿瘤的生长。代表性皮下Hepa1-6荷瘤小鼠的体内生物发光图像参见图4中的B,结果显示,经LOX-MnO2@Gel治疗的肿瘤发光明显减弱。
3、使用游标卡尺测量来监测肿瘤生长。测量结果参见图4中的C,可见LOX-MnO2@Gel处理的小鼠的肿瘤体积最小,而其他三组之间没有观察到肿瘤体积的显着差异,这表明在所有水凝胶制剂中,只有LOX-MnO2@Gel对iMWA后残留肿瘤生长表现出抑制功效。
4、记录各组小鼠的生存时间,利用Kaplan-Meier生存曲线分析,结果参见图4中的D,可见与其他三组相比,LOX-MnO2@Gel治疗的小鼠术后生存时间明显延长。
5、利用乳酸检测仪对瘤内乳酸含量进行分析,结果参见图4中的E,可见与LOX-MnO2@Gel相比,LOX@Gel的瘤内乳酸消耗效果不太明显,这可能是由于iMWA后残余肿瘤缺氧水平加剧,限制了治疗效果。这些发现表明,LOX-MnO2@Gel介导的局部乳酸消耗对iMWA后残留的肝癌生长具有抑制作用,并进一步支持LOX与MnO2结合的相辅相成。
6、测定处理后小鼠的体重,结果参见图4中的F,可见Gel、H-MnO2@Gel、LOX@Gel和LOX-MnO2@Gel处理后对小鼠的体重没有显着影响。
治疗后第12天,对荷瘤小鼠进行取材,主要器官(包括心脏,肝脏,脾脏,肺和肾脏)的组织病理学分析,结果参见图4中的G,未发现任何明显的异常,说明LOX-MnO2@Gel在体内的生物安全性较好。
同时,治疗后12天收集皮下Hepa1-6荷瘤C57/BL6小鼠的外周血样本,未经治疗的健康小鼠作为对照,利用自动生化分析仪(Chemray 240,雷托,深圳,中国)检测治疗后小鼠的血清生化参数,如丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST),碱性磷酸酶(ALP),血尿素氮(BUN)和肌酐(CR),数据表示为平均值±s.d.,n=3(使用Tukey事后检验的单因素方差分析)。结果参见图5,可见用药后上述参数与健康对照小鼠相当,表明本研究中使用的各种水凝胶制剂表现出良好的生物安全性。
总结:LOX-MnO2@Gel介导的乳酸消耗可有效抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠的生存时长,同时对荷瘤小鼠的器官无明显的毒副作用。
实验例4对纳米粒子-水凝胶复合体系治疗的肿瘤进行免疫细胞学分析
实验方法:在瘤内注射实施例3所述纳米粒子-水凝胶复合体系的18天后,对各组动物的肿瘤进行免疫细胞相关分析,group 1:空白水凝胶(Gel)组;group2:LOX@Gel组;group 3:LOX-MnO2@Gel组。
1、对Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组的小鼠肿瘤进行RNA测序,以热图显示Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组之间差异表达的基因(n=3,倍数变化≥2,P<0.05)。结果参见图6中的A,蓝色和红色分别代表下调和上调的基因。
2、对Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组的小鼠肿瘤进行RNA测序,利用基因本体(GO)分析,与Gel组对比,将LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组上调基因进行富集分析。结果参见图6中的B,可见,LOX-MnO2@Gel组上调基因与先天免疫及获得性免疫激活高度相关。
3、对Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组的小鼠肿瘤进行RNA测序,以热图展示,结果参见图6中的C,可见LOX-MnO2@Gel组的“T细胞激活的正向调节”和“先天免疫反应的正向调节”相关的基因表达谱明显上调(n=3)。
4、利用流式细胞术对Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组的小鼠肿瘤进行染色及分析,结果参见图6中的D,可见LOX-MnO2@Gel组的杀伤性浸润淋巴细胞(CTL)(染色指标:CD45 CD3 CD8)明显增多,说明LOX-MnO2@Gel可促进肿瘤局部CTL浸润。流式结果参见图7中的A。
5、利用流式细胞术对Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组的小鼠肿瘤进行染色及分析,结果参见图6中的E,可见LOX-MnO2@Gel组的细胞杀伤T淋巴细胞(GzmB CTL)(染色指标:CD45 CD3 CD8 GzmB)明显增多,说明LOX-MnO2@Gel有效促进肿瘤局部T细胞的杀伤能力。流式结果参见图7中的B。
6、利用流式细胞术对Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组的小鼠肿瘤进行染色及分析,结果参见图6中的F,可见LOX-MnO2@Gel组的调节性T淋巴细胞(Tregs)(染色指标:CD45 CD3 CD4 CD25 Foxp3)明显减少,说明LOX-MnO2@Gel有效改善肿瘤局部免疫抑制的状态。流式结果参见图7中的C。
7、利用流式细胞术对Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组的小鼠肿瘤进行染色及分析,结果参见图6中的G,可见LOX-MnO2@Gel组的M1型巨噬细胞(M1)(染色指标:CD45CD11b F4/80 CD80)明显增多,说明LOX-MnO2@Gel增加免疫激活的巨噬细胞比例,有效促进肿瘤相关巨噬细胞的免疫响应。流式结果参见图8中的A。
8、利用流式细胞术对Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组的小鼠肿瘤进行染色及分析,结果参见图6中的H,可见LOX-MnO2@Gel组的M2型巨噬细胞(M2)(染色指标:CD45CD11b F4/80CD163)明显减少,说明LOX-MnO2@Gel有效减少负性肿瘤相关巨噬细胞的比例。流式结果参见图8中的B。
9、利用流式细胞术对Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组的小鼠肿瘤进行染色及分析,结果参见图6中的I,可见比对M1/M2型巨噬细胞的比率,结果显示iMWA后第9天肿瘤内M1/M2的比率明显增加,这些发现表明LOX-MnO2@Gel有效激活肿瘤相关巨噬细胞的免疫响应,有助于抑制肿瘤生长。
10、利用免疫荧光法对Gel组、LOX@Gel组和LOX-MnO2@Gel组的小鼠肿瘤进行染色及分析,GzmB CTL使用CD8(绿色)和GzmB(红色)染色进行可视化,M1/M2巨噬细胞使用F4/80(白色)、CD80(绿色)和CD163(红色)染色进行可视化,DAPI(蓝色)染色表示细胞核(比例尺:50μm)。结果参见图6中的J,结果显示LOX-MnO2@Gel可显著增加瘤内GzmB CTL浸润和M1/M2巨噬细胞比率。
总体而言,上述数据强烈表明LOX-MnO2@Gel介导的局部乳酸消耗可以有效重塑免疫抑制性iMWA后TME并恢复抗肿瘤免疫反应,从而抑制残留HCC生长。
实验例5LOX与PAH-MnO2@Gel的不同比例配比对肝细胞的毒性
利用肝细胞作为处理对象,用不同比例的LOX@Gel处理24h,分组如下:
LOX:PAH-MnO2@Gel:LOX=0mg:115μg
LOX@Gel(1):PAH-MnO2@Gel:LOX=1mg:115μg
LOX@Gel(2):PAH-MnO2@Gel:LOX=1mg:85μg
LOX@Gel(3):PAH-MnO2@Gel:LOX=1mg:55μg
LOX@Gel(4):PAH-MnO2@Gel:LOX=1mg:25μg
经流式细胞术分析,结果参见图9,可见LOX@Gel(3)及LOX@Gel(4)的毒性显著减少,LOX@Gel(3)作为最佳配比成品用于体内实验。
总结:PAH-MnO2@Gel与LOX的组合而成的纳米反应器所具备的缓释功能,可克服LOX对肝细胞的毒性,使得LOX能够在肝癌荷瘤小鼠体内有效使用的同时不伤害正常肝细胞,显著提高LOX的生物利用度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种装载乳酸氧化酶的缓释材料,其特征在于,所述缓释材料将乳酸氧化酶包裹在中空二氧化锰中,再以聚丙交酯乙交酯三嵌段共聚物包裹负载了乳酸氧化酶的中空二氧化锰;
所述聚丙交酯乙交酯三嵌段共聚物为聚(丙交酯-共乙交酯)-聚乙二醇-聚(丙交酯-共乙交酯);
所述乳酸氧化酶、中空二氧化锰、聚丙交酯乙交酯三嵌段共聚物的质量比为400~600μg:10mg:25~115μg;
所述装载乳酸氧化酶的缓释材料的制备方法具体包括以下步骤:
S1、将二氧化硅与高锰酸钾反应,去除SiO2模版,使二氧化硅表面形成均匀的MnO2涂层,得到SiO2@MnO2纳米颗粒;
S2、将步骤S1所得SiO2@MnO2纳米颗粒分散在水中,加入阳离子聚合物或戊二醛对纳米颗粒进行包裹,得到阳离子聚合物或戊二醛包覆的MnO2纳米粒;
S3、将乳酸氧化酶与步骤S2所得阳离子聚合物或戊二醛包覆的MnO2纳米粒混合均匀,加入透明质酸溶液得到稳定的纳米颗粒,离心,沉淀洗涤后加入聚丙交酯乙交酯三嵌段共聚物水凝胶中,混匀,即得。
2.根据权利要求1所述装载乳酸氧化酶的缓释材料,其特征在于,步骤S1中,所述去除SiO2模版的方法为加入Na2CO3 58~63℃加热反应。
3.根据权利要求1所述装载乳酸氧化酶的缓释材料,其特征在于,步骤S2中,所述阳离子聚合物选自聚烯丙胺盐酸盐、聚氨基酯、聚丙烯胺中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述装载乳酸氧化酶的缓释材料,其特征在于,步骤S3中,所述透明质酸溶液的浓度为8~12mg/ml。
5.权利要求1所述装载乳酸氧化酶的缓释材料在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述肿瘤为肝癌。
6.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述药物为口服剂、吸入剂、注射剂或外用剂。
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- 2023-08-30 CN CN202311112216.2A patent/CN116966278B/zh active Active
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