CN111150834A - 一种载脂蛋白e与盐霉素复合纳米粒及制备方法和应用 - Google Patents

一种载脂蛋白e与盐霉素复合纳米粒及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒及制备方法和应用，是利用胆酸钠法制备的复合纳米粒，复合纳米粒包括有卵磷脂、胆酸钠、盐霉素和载脂蛋白E，其中卵磷脂与胆酸钠质量比为0.5‑2，盐霉素与载脂蛋白E质量比为0.067‑0.2，盐霉素与PBS总体积的质量体积比为0.083‑0.2，单位为：g/L。其制备方法为：步骤一、将卵磷脂和盐霉素溶于无水乙醇；步骤二、将胆酸钠和载脂蛋白E溶于PBS；步骤三、将步骤二制得的液体进行聚合；步骤四、将步骤三中聚合后的物质透析去除胆酸钠。载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒在治疗癌症和在生产用于治疗癌症药物中的应用，有益效果：载脂蛋白E和盐霉素具有良好的协同作用，从而降低盐霉素使用剂量，提高其临床应用的安全性。

Description

一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种复合纳米粒及制备方法和应用，特别涉及一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒及制备方法和应用。
背景技术
目前，卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一。该病起病隐匿，极易发生浸润、转移，其死亡率高居妇科恶性肿瘤之首，超过70％的病人确诊时已属晚期，患者五年生存率仅25％-30％，目前，治疗卵巢癌的方法主要为手术及铂类药物为主的基础化疗。大部分患者术后化疗早期敏感性较好，但是80％患者仍会在术后2-3年复发，并最终衍变为化疗耐药而死亡。因此，迫切需要寻找新的药物及治疗方法来提高卵巢癌患者的生存率及生活质量。
肿瘤异质性直接导致病人治疗效果及预后的差异，肿瘤组织由表型和功能不同的细胞组成，在肿瘤的生长、分化、耐药等生物特征上发挥不同的作用。肿瘤中存在极小部分细胞，极少数量即可致瘤，并且拥有类似干细胞的无限增殖能力，这类细胞被称之为肿瘤干细胞。传统肿瘤治疗主要是针对普通肿瘤细胞，结果是杀伤了普通肿瘤细胞，而肿瘤干细胞由于处于G0期，且高表达耐药蛋白，可在常规治疗中存活下来，经过一段时间的增殖、分化会再次形成新的肿瘤，导致肿瘤复发，特殊情况下，尤其当肿瘤组织内己存在的肿瘤干细胞被清除时，普通肿瘤细胞可去分化形成新的肿瘤干细胞，最终形成异质且可相互转化的肿瘤病灶。因此，采用可同时杀灭肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞的技术，或联合应用针对肿瘤干细胞和针对普通肿瘤细胞的药物，能够在肿瘤治疗中达到预期效果。
盐霉素是一种聚醚类离子载体型抗生素，因其可特异性杀伤乳腺癌、肺癌、胰腺癌等多种肿瘤干细胞而受到广泛关注。但是其高剂量下显著的毒性以及水不溶性，一直是盐霉素难以进入临床应用的主要障碍。
纳米药物递送系统可凭借增强的通透与滞留效应，增加药物在病变部位的蓄积，即被动靶向作用，降低化疗药物的副作用，因而在肿瘤治疗领域的应用越来越广泛。但是，目前采用的大多数纳米载体均为人工合成，作为外源性物质具有免疫原性，可能引起毒、副反应。
载脂蛋白E是一个含有299个氨基酸，结合有磷脂的糖蛋白。载脂蛋白E主要在肝脏中合成，分泌入血后可结合到脂蛋白中，具有结合胆固醇的能力，并同它们一起代谢。不同类型载脂蛋白E异构体对血浆脂质水平的影响有很大差异，这主要是由于它们在介导脂蛋白通过多种途径进行代谢的能力上存在着差异。同时，载脂蛋白E还具有抑制内皮细胞迁移并抑制血管再生的功能，从而发挥抗肿瘤作用。
利用载脂蛋白E作为药物载体，合成一种包载盐霉素的靶向纳米粒——载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒，载脂蛋白E为人体内天然蛋白，作为仿生载体，载脂蛋白E具有良好的生物相容性。载脂蛋白E的亲脂基团结合盐霉素，亲水基因暴露在表面突入周围水相，从而使载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒颗粒能稳定地分散在水相中，提高盐霉素的水溶性；同时，体外实验说明载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒可以特异性的杀伤卵巢癌细胞，而对正常人上皮细胞(IOSE80)、人成纤维细胞(BJ)无明显毒性，说明载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒具有主动靶向性，可特异性的杀伤卵巢癌细胞，从而降低盐霉素对正常组织的毒性作用。
利用载脂蛋白E作为药物载体的另一个优势在于，载脂蛋白E本身也具有抗肿瘤作用。在载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒的药效学实验中，我们发现载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒中载脂蛋白E和盐霉素具有良好的协同作用，当载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒剂量(以载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒中盐霉素含量计算)为游离盐霉素的1/4时，即可起到与游离盐霉素相似的抗卵巢癌作用，从而降低盐霉素使用剂量，提高安全性。因此，本申请合成一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒，达到降低盐霉素毒性及增强其杀伤卵巢癌细胞能力的目的。
载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒的抗肿瘤活性成分为盐霉素和载脂蛋白E，盐霉素可特异性杀伤乳腺癌、肺癌、胰腺癌等多种肿瘤干细胞，因此，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒也具有治疗乳腺癌、肺癌、胰腺癌等多种癌症的功能。
发明内容
本发明的主要目的是为了改善盐霉素的水溶性及在水溶液中的稳定性；
本发明的另一个目的是使载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒靶向作用于卵巢癌局部组织，降低盐霉素对正常组织的毒性；
本发明的再一个目的是载脂蛋白E和盐霉素释放于卵巢癌组织局部，同时杀伤普通卵巢癌细胞和卵巢癌干细胞，载脂蛋白E和盐霉素具有良好的协同作用，从而降低盐霉素使用剂量，提高其临床应用的安全性。
本发明的又一个目的是提供一种新的药物载体——载脂蛋白E，该载体可包载脂溶性药物，并具有靶向卵巢癌细胞的功能。
本发明为了达到上述目的并解决上述问题而提供的一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒及制备方法和应用。
本发明提供的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒是利用胆酸钠法制备的复合纳米粒，复合纳米粒包括有卵磷脂、胆酸钠、盐霉素和载脂蛋白E，其中卵磷脂与胆酸钠质量比为0.5-2，盐霉素与载脂蛋白E质量比为0.067-0.2，盐霉素与PBS总体积的质量体积比为0.083-0.2，单位为：g/L。
载脂蛋白E是使用甲基营养酵母生产的，是以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母,甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的：
(1)、甲基可诱导的转录启动子；
(2)、编码载脂蛋白E的DNA片段；
(3)、转录终止子；
(4)、可选择标志，从而重组表达人载脂蛋白E；
甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。
载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒中的药物载体为载脂蛋白E，该载体可包载脂溶性药物，并具有靶向卵巢癌细胞的功能。
本发明提供的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒的制备方法，其方法如下所述：
步骤一、将卵磷脂和盐霉素溶于无水乙醇，至卵磷脂终浓度为2g/L-10g/L，盐霉素终浓度为0.5g/L-2g/L，之后快速注入5-10倍体积PBS中，充入氮气条件下搅拌15min；
步骤二、将胆酸钠和载脂蛋白E溶于PBS，至胆酸钠终浓度为2g/L-10g/L，载脂蛋白E终浓度为5g/L-20g/L，在搅拌下加入上述液体中；
步骤三、将步骤二制得的液体室温放置30min；移至4℃孵育12h，使各组分进行聚合；
步骤四、将步骤三中聚合后的物质透析去除胆酸钠，使载脂蛋白E与盐霉素形成复合纳米颗粒，载脂蛋白E的亲脂基团结合盐霉素，亲水基因暴露在表面突入周围水相，从而使载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒颗粒能稳定地分散在水相中，从而提高盐霉素的水溶性。
本发明提供的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒在治疗癌症和在生产用于治疗癌症药物中的应用，癌症包括卵巢癌或乳腺癌或肺癌或胰腺癌。
载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒具有靶向杀伤卵巢癌细胞的功能，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒中载脂蛋白E和盐霉素具有良好的协同作用，当载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒浓度为游离盐霉素的1/4时，即可起到与其相似的抗卵巢癌作用，从而降低盐霉素使用剂量，提高安全性。载脂蛋白E可包载脂溶性药物，并具有靶向卵巢癌细胞的功能。
本发明的有益效果：
本发明利用前期工作中获得的重组人载脂蛋白E包载盐霉素，以制备载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒，实现以下目的：(1)改善盐霉素的水溶性及在水溶液中的稳定性；(2)使载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒靶向作用于卵巢癌局部组织，降低盐霉素对正常组织的毒性；(3)载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒活性成分——载脂蛋白E和盐霉素释放于卵巢癌组织局部，同时杀伤普通卵巢癌细胞和卵巢癌干细胞，载脂蛋白E和盐霉素具有良好的协同作用，从而降低盐霉素使用剂量，提高其临床应用的安全性。
本发明提供的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒用于治疗卵巢癌具有“靶向”和“双重功效”的优势，即载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒可特异性作用于肿瘤细胞，同时杀伤普通卵巢癌细胞和卵巢癌干细胞，从而治疗卵巢癌，改善患者预后。
附图说明
图1为本发明所述载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒的形态放大10000倍的电镜观察示意图。
图2显示不同浓度载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒、载脂蛋白E、游离盐霉素作用不同时间对卵巢癌干细胞生长的抑制率示意图。
图3显示不同浓度载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒、载脂蛋白E、游离盐霉素作用不同时间对卵巢癌细胞生长的抑制率示意图。
图4显示载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌细胞、人成纤维细胞和人上皮细胞生长的影响示意图。
图5显示不同浓度载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒、游离盐霉素对卵巢癌细胞迁移的抑制作用示意图，其中：A为空白对照组；B为载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒10μg/ml组；C为载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒20μg/ml组；D为载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒40μg/ml组；E游离盐霉素40μg/ml组。
图6显示不同浓度载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒、游离盐霉素对卵巢癌细胞侵袭的抑制作用示意图，其中：A为空白对照组；B为载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒10μg/ml组；C为载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒20μg/ml组；D为载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒40μg/ml组；E游离盐霉素40μg/ml组。
图7显示不同浓度载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒、游离盐霉素对卵巢癌细胞凋亡的促进作用示意图，其中：A为空白对照组；B为载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒10μg/ml组；C为载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒20μg/ml组；D为载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒40μg/ml组；E游离盐霉素40μg/ml组。
具体实施方式
请参阅图1至图7所示：
本发明提供的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒是利用胆酸钠法制备的复合纳米粒，复合纳米粒包括有卵磷脂、胆酸钠、盐霉素和载脂蛋白E，其中卵磷脂与胆酸钠质量比为0.5-2，盐霉素与载脂蛋白E质量比为0.067-0.2，盐霉素与PBS总体积的质量体积比为0.083-0.2，单位为：g/L。
载脂蛋白E是使用甲基营养酵母生产的，是以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母,甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的：
(1)、甲基可诱导的转录启动子；
(2)、编码载脂蛋白E的DNA片段；
(3)、转录终止子；
(4)、可选择标志，从而重组表达人载脂蛋白E；
甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。
载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒中的药物载体为载脂蛋白E，该载体可包载脂溶性药物，并具有靶向卵巢癌细胞的功能。
本发明提供的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒的制备方法，其方法如下所述：
步骤一、将卵磷脂和盐霉素溶于无水乙醇，至卵磷脂终浓度为2g/L-10g/L，盐霉素终浓度为0.5g/L-2g/L，之后快速注入5-10倍体积PBS中，充入氮气条件下搅拌15min；
步骤二、将胆酸钠和载脂蛋白E溶于PBS，至胆酸钠终浓度为2g/L-10g/L，载脂蛋白E终浓度为5g/L-20g/L，在搅拌下加入上述液体中；
步骤三、将步骤二制得的液体室温放置30min；移至4℃孵育12h，使各组分进行聚合；
步骤四、将步骤三中聚合后的物质透析去除胆酸钠，使载脂蛋白E与盐霉素形成复合纳米颗粒，载脂蛋白E的亲脂基团结合盐霉素，亲水基因暴露在表面突入周围水相，从而使载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒颗粒能稳定地分散在水相中，从而提高盐霉素的水溶性。
本发明提供的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒在治疗癌症和在生产用于治疗癌症药物中的应用，癌症包括卵巢癌或乳腺癌或肺癌或胰腺癌。
载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒具有靶向杀伤卵巢癌细胞的功能，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒中载脂蛋白E和盐霉素具有良好的协同作用，当载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒浓度为游离盐霉素的1/4时，即可起到与其相似的抗卵巢癌作用，从而降低盐霉素使用剂量，提高安全性。载脂蛋白E可包载脂溶性药物，并具有靶向卵巢癌细胞的功能。
具体实施例如下：
实施例1：载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒的制备：
胆酸钠法制备载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒，以高效液相法测定载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒中盐霉素含量。通过调节卵磷脂与胆酸钠比例、盐霉素与载脂蛋白E比例，盐霉素质量与PBS体积比等因素，优化载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒的合成条件。最终确定，按照如下方法合成载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒：
a.取卵磷脂5.4mg，盐霉素1mg，溶于1ml无水乙醇。用皮试注射器吸入后快速注入5ml PBS中，充入氮气条件下搅拌15min；
b.5.4mg胆酸钠，7.5mg载脂蛋白E溶于0.75ml PBS中。在搅拌下加入上述液体中；
c.室温放置30min；移至4℃孵育12h，各组分聚合形成载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒；
d.将液体加入孔径为10kD的蛋白透析袋中，4℃对透析液(PBS)充分透析，去除胆酸钠。
e.载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒的透射电镜观察。
透射电镜结果显示，通过胆酸钠法处理，盐霉素、载脂蛋白E、卵磷脂、胆固醇等成功聚合为盘状的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒。该复合物在透射电镜下较为均匀圆整，粒径为50nm-80nm(见附图1)。载脂蛋白E可结合脂溶性药物，因此有望成为新的药物载体，包载脂溶性药物。
实施例2：载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌干细胞的生长抑制作用
磁珠法收集人卵巢癌细胞A2780中表面标志物CD133阳性的细胞，经鉴定为卵巢癌干细胞。分别加入终浓度为10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒(浓度以载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒中盐霉素剂量表示)，同时设置空白对照组(无药物处理)、载脂蛋白E对照组(加入终浓度为1mg/ml的载脂蛋白E)和盐霉素对照组(分别加入终浓度为20μg/ml、40μg/ml的游离盐霉素)。放入37℃，5％CO2培养箱中培养，分别于24h、36h、48h、72h、96h,以CCK-8法检测细胞增殖情况。
结果显示(见附图2)，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌干细胞生长的抑制作用具有时间和浓度依赖性。相同浓度下，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒抑制卵巢癌干细胞生长作用显著优于游离盐霉素和载脂蛋白E两者之和，说明盐霉素和载脂蛋白E具有良好的协同作用。药物作用48h后，20μg/ml载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对卵巢癌干细胞抑制作用优于40μg/ml游离盐霉素；药物作用72～96h，10μg/ml载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒具有与40μg/ml游离盐霉素相似的抑制作用。说明使用载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒可降低盐霉素的使用剂量，提高盐霉素应用的安全性。
实施例3：载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌细胞生长的抑制作用
取生长对数期的卵巢癌细胞A2780，调整细胞密度为2.5×104/ml，接种。分别加入终浓度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒(浓度以载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒中盐霉素剂量表示)，同时设置空白对照组(无药物处理)、载脂蛋白E对照组(加入终浓度为1mg/ml的载脂蛋白E)和盐霉素对照组(加入终浓度为40μg/ml的游离盐霉素)。放入37℃，5％CO2培养箱中培养，分别于12h、24h、36h、48h、72h、96h，以CCK-8法检测细胞增殖情况。
结果显示(见附图3)，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌A2780细胞生长的抑制作用具有时间和浓度依赖性。相同浓度下，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒抑制卵巢癌细胞生长作用显著优于游离盐霉素和载脂蛋白E两者之和，说明盐霉素和载脂蛋白E具有良好的协同作用。药物作用48h后，20μg/ml载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对卵巢癌细胞抑制作用优于40μg/ml游离盐霉素；药物作用72～96h，10μg/ml载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒具有与40μg/ml游离盐霉素相似的抑制作用。说明使用载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒可降低盐霉素的使用剂量，提高盐霉素应用的安全性。
实施例4：载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对卵巢癌细胞的特异性杀伤作用
取生长对数期的人卵巢癌细胞、正常人成纤维细胞、正常人上皮细胞、分别调整细胞密度为2.5×104/ml，接种。分别加入终浓度为40μg/ml的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒(浓度以载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒中盐霉素量表示)，同时设置空白对照组(无药物处理)，放入37℃，5％CO2培养箱中培养，分别于12h、24h、36h、48h以CCK-8法检测细胞增殖情况。
如附图4所示，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌细胞生长具有显著的抑制作用，培养24h后载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌细胞生长抑制率可达(57.45±2.34)％，而24小时内载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人成纤维细胞和人上皮细胞的生长均没有明显的抑制作用。培养48h后载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌细胞生长抑制率可达(87.81±3.33)％，而培养48小时后，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人成纤维细胞和人上皮细胞的生长的抑制率分别为(14.17±1.75)％、(20.42±2.62)，与载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌细胞生长的抑制率相比具有显著性差异，说明载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对卵巢癌细胞具有特异性杀伤作用，而对正常组织影响极小。
实施例5：载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响
(1)载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌细胞迁移的抑制作用
取对数生长期的A2780细胞接种于六孔板中，每孔5×105个细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。用200μl的枪头于孔板底部划线，洗去脱落掉的细胞。空白对照组加入新的培养基，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒组加入不同终浓度(10、20、40μg/ml)的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒，盐霉素对照组加入40μg/ml游离盐霉素，37℃，5％CO2培养箱中培养，分别于0h、12h、24h、48h和72h在400倍显微镜下拍照。
利用细胞划痕实验检测不同浓度载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒处理A2780细胞不同时间(0h、12h、24h、48h)对细胞迁移的影响，如附图5所示，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒能显著抑制A2780细胞的迁移，具有时间和剂量的依赖性，且同等浓度下载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对卵巢癌细胞A2780细胞迁移的抑制作用高于游离盐霉素对A2780细胞迁移的抑制作用。说明使用载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒可降低盐霉素的使用剂量，提高盐霉素应用的安全性。
(2)载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对人卵巢癌细胞侵袭能力的抑制作用
取对数生长期的A2780细胞接种于六孔板中，每孔5×105个/孔，培养24h。加入不同终浓度(10、20、40μg/ml)的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒，同时设定空白对照组(无药物处理)和盐霉素对照组(加入终浓度为40μg/ml的游离盐霉素)，放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养24h。Transwell法检测载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对卵巢癌细胞A2780迁移能力的影响
如附图6，表1所示，与空白对照组相比，随着载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒浓度的增高，A2780细胞穿过小室膜的数量逐渐减少(P<0.001)。相同药物浓度下，载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒处理过的卵巢癌细胞穿过小室膜的细胞数要远远少于游离盐霉素处理过的细胞。10μg/ml的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒即具有与40μg/ml游离盐霉素相似的抑制卵巢癌细胞侵袭的作用。说明使用载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒可降低盐霉素的使用剂量，提高盐霉素应用的安全性。
表1不同浓度载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒对A2780侵袭能力的影响(n＝5,
Figure BDA0002356191360000121
)
Figure BDA0002356191360000122
与空白对照组比较，***P<0.001
实施例6：载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒促进人卵巢癌细胞凋亡的作用
取对数生长期的A2780接种于六孔板中，每孔5×105个细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。加入不同终浓度(10、20、40μg/ml)的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒，同时设定空白对照组和盐霉素对照组(加入终浓度40μg/ml的游离盐霉素)，放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h。Annexin V-FITC/PI法检测卵巢癌细胞凋亡情况。
如附图7所示，不同浓度的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒和游离盐霉素分别处理48小时，可诱导卵巢癌细胞凋亡。随着载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒浓度升高，凋亡率递增。40μg/ml的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒诱导卵巢癌细胞凋亡率73.75％，为10μg/ml的载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒诱导卵巢癌细胞凋亡率(45.51％)优于40μg/ml的游离盐霉素(14.25％)，说明使用载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒可降低盐霉素的使用剂量，提高盐霉素应用的安全性。

Claims (6)

1.一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒，其特征在于：是利用胆酸钠法制备的复合纳米粒，复合纳米粒包括有卵磷脂、胆酸钠、盐霉素和载脂蛋白E，其中卵磷脂与胆酸钠质量比为0.5-2，盐霉素与载脂蛋白E质量比为0.067-0.2，盐霉素与PBS总体积质量体积比为0.083-0.2，单位为：g/L。
2.根据权利要求1所述的一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒，其特征在于：所述的载脂蛋白E是使用甲基营养酵母生产的，是以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母,甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的：
(1)、甲基可诱导的转录启动子；
(2)、编码载脂蛋白E的DNA片段；
(3)、转录终止子；
(4)、可选择标志，从而重组表达人载脂蛋白E；
甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。
3.根据权利要求1所述的一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒，其特征在于：其药物载体为载脂蛋白E，该载体可包载脂溶性药物，并具有靶向卵巢癌细胞的功能。
4.一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒的制备方法，其特征在于：其方法如下所述：
步骤一、将卵磷脂和盐霉素溶于无水乙醇，至卵磷脂终浓度为2g/L-10g/L，盐霉素终浓度为0.5g/L-2g/L，之后快速注入5-10倍体积PBS中，充入氮气条件下搅拌15min；
步骤二、将胆酸钠和载脂蛋白E溶于PBS，至胆酸钠终浓度为2g/L-10g/L，载脂蛋白E终浓度为5g/L-20g/L，在搅拌下加入上述液体中；
步骤三、将步骤二制得的液体室温放置30min；移至4℃孵育12h，使各组分进行聚合；
步骤四、将步骤三中聚合后的物质透析去除胆酸钠，使载脂蛋白E与盐霉素形成复合纳米颗粒，载脂蛋白E的亲脂基团结合盐霉素，亲水基因暴露在表面突入周围水相，从而使载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒颗粒能稳定地分散在水相中，从而提高盐霉素的水溶性。
5.一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒在治疗癌症和在生产用于治疗癌症药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的一种载脂蛋白E与盐霉素复合纳米粒的应用，其特征在于：所述的癌症包括卵巢癌或乳腺癌或肺癌或胰腺癌。
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