CN115252591A - Dmdd在制备抗乳腺癌药物方面的应用以及一种用dmdd制备的癌症靶向药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物制备技术领域，具体是DMDD在制备抗乳腺癌药物方面的应用以及一种用DMDD制备的癌症靶向药物。本申请将DMDD与主动靶向配体制备成靶向药物，成功制备得到了DMDD癌症靶向药物。并且本申请使用HA和TN制备脂质体来改善药物的溶解度，提高药物的稳定性，促进细胞摄取，改善炎症反应，提高药物的生物利用度，并增强靶向肿瘤的潜力，最终得到的DMDD癌症靶向药物具有良好的稳定性，并且无明显毒副作用，与此同时，DMDD癌症靶向药物对乳腺癌的形成具有明显的抑制作用，使用DMDD癌症靶向药物时具有比DMDD单药治疗更显著的抗肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，具体是DMDD在制备抗乳腺癌药物方面的应用以及一种用DMDD制备的癌症靶向药物。
背景技术
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。治疗乳腺癌的方法有很多，如手术、内分泌治疗、化疗、放疗等，但没有一种方法能达到完美的治疗效果。当前，临床上化疗药物治疗是治疗乳腺癌的主要手段之一，而化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有严重的损害作用，因此，制备一个具有靶向能力的药物显得尤为重要，它能在目标部位蓄积或释放有效成分，形成相对较高的浓度，从而在提高药效的同时降低毒副作用，减少对正常组织、细胞的伤害。
主动靶向脂质体的出现或许可以解决这个难题。主动靶向脂质体通常由抗癌药物和主动靶向配体组成脂质体，可以特异性结合在癌细胞中大量表达的肿瘤标志物。理想的主动靶向治疗肿瘤标志物应该是在癌细胞表面过表达，而在正常组织中表达相对较低的膜蛋白，因而可以使脂质体借助靶向配体将抗癌药物定向转运至靶组织，选择性的杀灭癌细胞，而对正常组织细胞无损伤。
但是目前并没有将DMDD用于制备抗乳腺癌靶向药物方面的内容，其是由于将药物用于制备抗乳腺癌靶向药物时，需要考虑药物本身的性质，比如溶解性，稳定性，PH等等，还需要根据药物本身的性质选择合适的靶向制剂，还需要考虑诸多因素，并针对性进行大量的研究试验。
因此，在现有DMDD抗癌作用研究的基础上，进行进一步的靶向药物研究，将DMDD用于制备抗乳腺癌靶向药物方面，并得到一种用 DMDD制备的癌症靶向药物，是目前的主要研究方向。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供DMDD 在制备抗乳腺癌药物方面的应用以及一种用DMDD制备的癌症靶向药物。具体是通过以下技术方案得以实现的：
DMDD在制备抗乳腺癌药物方面的应用，所述DMDD，是2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮。
进一步的，所述抗乳腺癌药物，是抗乳腺癌靶向药物。
一种用DMDD制备的癌症靶向药物，是将DMDD与主动靶向配体制备成靶向药物；所述DMDD，是2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1， 4-环己二酮。
进一步的，所述癌症靶向药物，是乳腺癌靶向药物。
进一步的，所述主动靶向配体，是透明质酸及TAT-NBD复合肽 (TN)。
进一步的，所述TAT-NBD复合肽(TN)，是用TAT多肽和NBD 多肽制备成的。进一步的，所述TAT多肽，是人类免疫缺陷病毒反式激活因子(human immunodeficiency virustransactivator,TAT)细胞穿透肽。进一步的，所述NBD多肽，是NEMO结合结构域(NBD)多肽。
进一步的，所述用DMDD制备的癌症靶向药物，是通过如下方法制备得到：
(1)将30mg蛋黄卵磷脂、4.3mg胆固醇、0.3mg DSPE-PEG2000-TN、3mg十八胺和4.3mg DMDD于烧杯中并用5mL 无水乙醇溶解作为油相；
(2)在磁力搅拌的作用下，用注射器将油相缓慢匀速的注入到 5mL水相PBS液面下逐渐形成脂质体；
(3)继续加热搅拌以除去无水乙醇，得到脂质体悬浮液；
(4)量取5mL 1mg/mL HA溶液于烧杯中，在持续搅拌下，用注射器将(3)中得到的脂质体悬浮液缓缓注入HA溶液中，滴加完继续搅拌30min；
(5)将所得溶液冰水浴环境下100w探头超声10min，再经过0.45、 0.22μm微孔滤膜各过滤1次，即得到用DMDD制备的癌症靶向药物。
所述水相PBS，是0.01M，pH7.2-7.4的PBS缓冲液。
DSPE-PEG(2000)，是一种磷脂聚乙二醇的胺衍生物，用于合成固体脂质和热敏脂质体纳米颗粒，以递送抗癌剂。将DSPE-PEG(2000) 于TN多肽合成DSPE-PEG2000-TN，DSPE-PEG2000-TN的DSPE端可以与脂质膜结合并将TN修饰在脂质体中。
CD44是一种广泛存在于哺乳动物细胞表面的糖蛋白，在许多生物学功能中发挥着重要作用，特别是在各种实体瘤细胞中表达量显著增高，是许多肿瘤细胞表面重要的表面标志分子，在肿瘤的发生、发展和转移中发挥着重要作用。CD44分子的表达水平与肿瘤的恶性程度及预后密切相关。作为CD44分子的天然配体，透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)与CD44分子具有很强的亲和力。当HA作为纳米材料时，可以与抗肿瘤药物形成靶向制剂，通过受体-配体机制到达肿瘤部位，因此常用于肿瘤靶向给药研究。另外多肽作为机体内重要的生物活性物质，具有分子质量小、制备容易、免疫原性低、毒副作用小等优点，因而可作为配体，通过受体的介导作用，提高脂质体的稳定性，降低药物的毒副作用，是近几年制剂中的研究热点之一。将细胞穿透肽作为药物的运载体，可广泛应用于各种脂质体、小分子药物等，并且可以促进细胞对药物的摄取。
人类免疫缺陷病毒反式激活因子(human immunodeficiency virustransactivator,TAT)细胞穿透肽是HIV-1病毒编码的反式转录激活因子，富含碱性氨基酸序列，能够高效介导多种外源生物大分子通过多种膜性结构，例如细胞质膜和血脑屏障等。它是能够穿过细胞膜进入细胞内的有效载体,它们在肿瘤的治疗以及肿瘤分子成像中发挥着重要的作用。采用TAT多肽与紫杉醇联合应用不仅能够有效克服肿瘤细胞对紫杉醇的耐受，也能减少紫杉醇的毒副作用。
NEMO结合结构域(NBD)多肽是根据IKKα、IKKβ羧基末端同源结构域-NBD区域设计的一种具有细胞渗透性的多肽，是NF-κB 特异性抑制剂，可下调NF-κB通路活性。
将TAT多肽和NBD多肽制备成TAT-NBD复合肽(TN)，并将其渗入到肿瘤分子靶向肽中，不仅可以促进细胞对药物的摄取，还能有效的改善肿瘤炎症反应，在抗炎和抗肿瘤方面发挥显著的作用。
用HA和TN制备脂质体能够改善药物的溶解度，提高药物的稳定性，促进细胞摄取，改善炎症反应，提高药物的生物利用度，并增强靶向肿瘤的潜力。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
本申请成功制备得到了DMDD癌症靶向药物。并且本申请使用 HA和TN制备脂质体来改善药物的溶解度，提高药物的稳定性，促进细胞摄取，改善炎症反应，提高药物的生物利用度，并增强靶向肿瘤的潜力，最终得到的DMDD癌症靶向药物具有良好的稳定性，并且无明显毒副作用，与此同时，DMDD癌症靶向药物对乳腺癌的形成具有明显的抑制作用，使用DMDD癌症靶向药物时具有比DMDD单药治疗更显著的抗肿瘤作用。
附图说明
图1是DMDD抗肿瘤靶向药物的形态观察。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例
1材料
1.1实验动物
SPF级雌性Balb/c小鼠，6-8周龄，购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证：SCXK湘2019-0014。
2方法
2.1 DMDD抗肿瘤靶向药物的制备
将30mg蛋黄卵磷脂、4.3mg胆固醇、0.3mg DSPE-PEG2000-TN、 3mg十八胺和4.3mgDMDD于烧杯中并用5mL无水乙醇溶解作为油相；在磁力搅拌的作用下，用注射器将油相缓慢匀速的注入到5mL水相PBS液面下逐渐形成脂质体；继续加热搅拌以除去无水乙醇，得到脂质体悬浮液；量取5mL 1mg/mL HA溶液于烧杯中，在持续搅拌下，用注射器将(3)中得到的脂质体悬浮液缓缓注入HA溶液中，滴加完继续搅拌30min；将所得溶液冰水浴环境下1000min，再经过0.45、 0.22μm微孔滤膜各过滤1次，即得到用DMDD制备的癌症靶向药物。
2.2 DMDD抗肿瘤靶向药物对小鼠乳腺癌的抑制作用
2.2.1乳腺癌小鼠皮下移植瘤模型的建立
雌性SPF级Balb/c小鼠(18±2g)，适应性饲养一个星期，观察小鼠身体及活动情况。
80只Balb/c小鼠适应性喂养1周后，将细胞悬液(含1×106个4T1 细胞)注射到小鼠右腋下制备小鼠皮下移植瘤模型。当大部分小鼠的肿瘤生长到100mm3时，随机挑选70只造模成功的小鼠分为7组：模型组(不进行药物干预)，DOX组(给予DOX 2.5mg/kg)，DMDD 组(给予DMDD 10mg/kg)，LP组(给予LP 10mg/kg)，DLP组(给予DLP 10mg/kg)，TN-DLP组(给予TN-DLP 10mg/kg)和HA/TN-DLP 组(给予HA/TN-DLP 10mg/kg)，另取10只未造模的小鼠作为正常组。给药14天，每两天测量一次肿瘤体积。
LP(空白脂质体：没有包封任何药物的脂质体)：精密称取一定量的蛋黄卵磷脂、胆固醇于烧杯中并用一定量无水乙醇溶解作为油相备用。在磁力搅拌的作用下，用注射器将油相缓慢匀速的注入到水相 PBS液面下，待脂质体形成后继续加热搅拌以除去无水乙醇，最后冰水浴环境下探头超声，再经过0.45、0.22μm微孔滤膜各过滤1次，于 4℃下保存。
DLP(负载DMDD脂质体)：制备方法同LP，但在油相中加入 DMDD。
TN-DLP(TN修饰负载DMDD脂质体)：制备方法同LP，但在油相中加入DMDD和DSPE-PEG2000-TN。
HA/TN-DLP(HA和TN共同修饰负载DMDD脂质体)：先制备TN-DLP备用，再精密量取1mg/mL HA溶液10mL置于烧杯中，在600 rpm搅拌速度下，用注射器将制备好的TN-DLP缓缓注入HA溶液中，滴加完继续搅拌30min，再经过0.45、0.22μm微孔滤膜各过滤1次，于4℃下保存。
2.2.2小鼠乳腺癌皮下移植瘤基础指标的检测
用游标卡尺测量肿瘤体积，体积＝(瘤体最长径×瘤体最短径2) /2；抑制率(％)＝(模型组平均瘤重－给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100％。
2.3统计学处理
应用SPSS 22.0软件进行处理，计量资料均采用
表示，多组数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组间计量资料比较采用t检验。以p<0.05或为p<0.01差异有显著性意义。
3结果
3.1 DMDD抗肿瘤靶向药物的制备
DMDD抗肿瘤靶向药物的粒径、PDI、Zeta电位、包封率以及载药量结果显示，DMDD抗肿瘤靶向药物平均粒径为115.40±2.39nm， PDI为0.206±0.023，小于0.3，表明脂质体的粒径分布均匀，稳定性较好。包封率为83.23％，载药量为9.49％，均符合脂质体要求。从图1可以看出DMDD抗肿瘤靶向药物为淡黄色澄清透明的液体，并出现明显的胶体分散系统的丁达尔现象，透射电镜也观察到DMDD抗肿瘤靶向药物的大小分布较为均匀，形貌以扁圆形为主，并带有脂质体典型的指纹状特征。
表1 DMDD抗肿瘤靶向药物的粒径、PDI、Zeta电位、包封率以及载药量
3.2 DMDD抗肿瘤靶向药物的稳定性研究
DMDD抗肿瘤靶向药物在4℃与25℃避光环境中的储存稳定性结果见表2。DMDD抗肿瘤靶向药物在两种条件下放置48h后基本处于稳定的状态，脂质体溶液呈均匀的半透明状，均未出现分层与颜色加深的状况，表明经过长时间的存放仍然能够维持脂质体的安全性和有效性。
表2 DMDD抗肿瘤靶向药物在4℃和25℃条件下储存48h的渗漏率
3.3 DMDD抗肿瘤靶向药物对乳腺癌小鼠皮下移植瘤的生长影响
小鼠体重如表3所示，各组之间小鼠的体重都没有明显变化，也没有出现明显的毒副作用，表明DMDD抗肿瘤靶向药物在体内用药较为安全。
在肿瘤的生长过程中我们每隔两天用游标卡尺测量各小鼠的肿瘤直径并计算小鼠的肿瘤体积，并绘制了肿瘤体积随时间变化曲线，实验结束时取肿瘤称重并计算各组平均瘤重。结果如表4及表5所示，与模型组相比，DMDD抗肿瘤靶向药物的干预对小鼠乳腺癌移植瘤的增长均产生了明显的抑制作用，在连续给药14天后，其最终肿瘤体积和瘤重显著低于模型组(P＜0.01)，与DMDD组相比，DMDD 抗肿瘤靶向药物的最终肿瘤体积和瘤重显著降低(P＜0.01)。说明在相同的给药剂量下，使用DMDD抗肿瘤靶向药物时具有比DMDD 单药治疗更显著的抗肿瘤作用。
表3 DMDD抗肿瘤靶向药物对乳腺癌小鼠体重的影响
表4 DMDD抗肿瘤靶向药物对乳腺癌小鼠肿瘤体积的影响
注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01；与DMDD组比较，#P<0.05，##P<0.01
表5抗肿瘤靶向药物对乳腺癌小鼠肿瘤重量的影响
注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01；与DMDD组比较，#P<0.05，##P<0.01
4讨论
按照中国药典2020版规定应对其脂质体制剂的形态、粒径大小及其分布、包封率、渗漏率等项目进行检查。实验结果表明，DMDD 抗肿瘤靶向药物的粒径、PDI、Zeta电位、包封率以及载药量结果显示，DMDD抗肿瘤靶向药物平均粒径为115.40±2.39nm，PDI为0.206 ±0.023，小于0.3，表明脂质体的粒径分布均匀，稳定性较好。包封率为83.23％，载药量为9.49，均符合脂质体要求。脂质体形态观察可以看出DMDD抗肿瘤靶向药物为淡黄色澄清透明的液体，并出现明显的胶体分散系统的丁达尔现象，透射电镜也观察到DMDD抗肿瘤靶向药物的大小分布较为均匀，形貌以扁圆形为主，并带有脂质体典型的指纹状特征。
脂质体的稳定性是储存的关键因素，脂质体通常以液体形式储存，脂质体的储存过程中会发生氧化、聚集、分层等问题，外界因素如温度、空气、湿度等均会影响脂质体的稳定性。结果显示，DMDD 抗肿瘤靶向药物在两种条件下放置48h后基本处于稳定的状态，脂质体溶液呈均匀的半透明状，均未出现分层与颜色加深的状况，表明经过长时间的存放仍然能够维持脂质体的安全性和有效性。
在本研究中，用小鼠乳腺癌4T1细胞建立小鼠皮下移植瘤模型，考察DMDD抗肿瘤靶向药物对乳腺癌小鼠的抑瘤作用，重点研究 DMDD抗肿瘤靶向药物的抗肿瘤效果是否优于DMDD单药治疗。研究发现，与模型组相比，DMDD抗肿瘤靶向药物的干预对小鼠乳腺癌移植瘤的增长均产生了明显的抑制作用，在连续给药14天后，其最终肿瘤体积和瘤重显著低于模型组(P＜0.01)，与DMDD组相比， DMDD抗肿瘤靶向药物的最终肿瘤体积和瘤重显著降低(P＜0.01)。说明在相同的给药剂量下，使用DMDD抗肿瘤靶向药物时具有比 DMDD单药治疗更显著的抗肿瘤作用。
综上，DMDD抗肿瘤靶向药物被成功制备，在抗肿瘤治疗中， DMDD抗肿瘤靶向药物比DMDD单药治疗在抑制肿瘤生长方面表现更好。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.DMDD在制备抗乳腺癌药物方面的应用，其特征在于，所述DMDD，是2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗乳腺癌药物，是抗乳腺癌靶向药物。
3.一种用DMDD制备的癌症靶向药物，其特征在于，是将DMDD与主动靶向配体制备成靶向药物；所述是DMDD，是2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮。
4.根据权利要求3所述的癌症靶向药物，其特征在于，所述癌症靶向药物，是乳腺癌靶向药物。
5.根据权利要求3所述的癌症靶向药物，其特征在于，所述主动靶向配体，是透明质酸及TAT-NBD复合肽。
6.根据权利要求3所述的癌症靶向药物，其特征在于，所述TAT-NBD复合肽，是用TAT多肽和NBD多肽制备成的。
7.根据权利要求6所述的癌症靶向药物，其特征在于，所述TAT多肽，是人类免疫缺陷病毒反式激活因子细胞穿透肽。
8.根据权利要求6所述的癌症靶向药物，其特征在于，所述NBD多肽，是NEMO结合结构域多肽。
9.根据权利要求3所述的癌症靶向药物，其特征在于，通过如下方法制备得到：
(1)将蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-TN、三甲胺和DMDD于烧杯中并用无水乙醇溶解作为油相；
(2)在磁力搅拌的作用下，用注射器将油相缓慢匀速的注入到水相PBS液面下逐渐形成脂质体；
(3)继续加热搅拌以除去无水乙醇，得到脂质体悬浮液；
(4)取HA溶液，保持HA溶液持续搅拌，用注射器将(3)中得到的脂质体悬浮液缓缓注入HA溶液中，滴加完继续搅拌；
(5)将所得溶液用去离子水进行透析，冰水浴环境下探头超声，再经过0.45、0.22μm微孔滤膜过滤，即得到用DMDD制备的癌症靶向药物。
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Non-Patent Citations (1)
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| XIAOLIN ZHANG等: "Averrhoa carambola extractive inhibits breast cancer via regulating CEPT1 and LYPLA1", 《CHINESE CHEMICAL LETTERS》, vol. 34, pages 1 - 6 * |
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