MXPA01011023A

MXPA01011023A - Tratamiento de la fibrosis por antagonismo de il-13 y de cadenas receptoras de il-13.

Info

Publication number: MXPA01011023A
Application number: MXPA01011023A
Authority: MX
Inventors: Tamlyn Neben
Original assignee: Genetics Inst
Priority date: 1999-04-28
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2002-05-06
Also published as: US20050096268A1; KR100862931B1; JP2014087345A; CA2370306C; ATE515513T1; IL146082A; EP2123674A1; CA2370306A1; EP1173484A1; HUP0200862A2; JP4988988B2; EP1173484A4; PT1173484E; AU4680500A; CN1348465A; BR0010061A; HUP0200862A3; US6664227B1; IL146082A0; JP2003527311A

Abstract

Se proporcionan metodos para el tratamiento o inhibicion de la formacion de fibrosis tisular que utilizan antagonistas de IL-13, entre los que se incluyen de manera irrestricta, las formas solubles del receptor de IL-13.

Description

TRATAMIENTO DE LA FIBROSIS POR ANTAGONISMO DE IL-13 Y DE CADENAS RECEPTORAS DE IL-13 Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud con No. de serie 08/841,751 presentada el 30 de abril de 1997 y que era una solicitud divisional de la solicitud con No. de serie 08/609,572 presentada el 1 de marzo de 1996.

CAMPO DE A INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el tratamiento e inhibición de la fibrosis por medio de antagonismo de la interacción de IL-13 con su receptor y componentes receptores .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una variedad de moléculas reguladoras, conocidas como citocinas, han sido identificadas y entre éstas se incluye la interleucina-13 (IL-13) . Diversas formas de proteína de IL-13 y de ADN que codifica para varias formas de la actividad de IL-13 se describen en McKenzie et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:3735 (1993); Minty et al., Nature 362:248 (1993) y Aversa et al., O94/04680. De esta manera, el término "IL-13" incluye proteínas que tienen la secuencia y/o la actividad biológica descrita en estos -M_^MI_Í_ÍÉiÍ_Í_í_ documentos, ya sea producidas por técnicas de ingeniería genética recombinante, purificadas a partir de fuentes celulares que producen el factor de manera natural o durante la inducción con otros factores, o sintetizadas por técnicas químicas o por una combinación de las anteriores. La IL-13 es una citocina que se ha implicado en la producción de varias actividades biológicas, entre las que se incluye: la inducción de conexión de IgE e IgG4, que se incluye en células B humanas inmaduras (Punnonen et al., J. Immunol. 152:1094(1994)); la inducción de expresión CD23 y transcripción de cadena pesada IgE (e) de la línea germinal en células B humanas (Punnonen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:3730(1993)) y la inducción de proliferación de células B en presencia de mAb anti-CD40 o CD40L (Cocks et al., Int. Immunol . 5:657(1993)). Aunque muchas actividades de IL-13 son similares a las de IL-4, en contraste con IL-4, IL-3 no tiene efectos promotores del crecimiento sobre células T activadas o clones de células T (Zurawski et al., EMBO J. 12:2663 (1993)). Como la mayoría de las citocinas, IL-13 exhibe ciertas actividades biológicas interactuando con un receptor de IL-13 ("IL-13R") en la superficie de células blanco. El IL-13R y el receptor IL-4 ("IL-4R") comparten un componente común que se requiere para la activación del receptor; sin embargo, IL-13 no se une a células ••-*• - • - --"•-- - - ***-*&%a»*" transfectadas con el IL-4R 130 kD (Zurawski et al., supra) . Por lo tanto, el IL-13R debe contener por lo menos, otra cadena de unión de ligando. Los receptores de citocina se componen, normalmente de dos o tres cadenas. Se ha reportado recientemente la clonación de una cadena de unión de ligando para IL-13 (Hilton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 93:497-501) . Sería deseable identificar y clonar la secuencia para cualquier otra cadena de unión de IL-13 del IL-13R de manera que puedan producirse proteínas de IL-13R para diversas razones, entre las que se incluye la producción de agentes terapéuticos y el tamizado para inhibidores de IL-13 que se unen al receptor y a la señalización de receptor.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención, se exponen los polinucleótidos que codifican para las cadenas de unión de IL-13 del receptor de interleucina-13 , entre los que se incluyen, sin limitación, los provenientes de los receptores humanos y murinos. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO : 1 del nucleótido 256 al nucleótido 1404; (b) la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO : 3 del nucleótido 103 al nucleótido 1242; (c) una secuencia de nucleótido que varía de la secuencia de la secuencia de nucleótido especificada en (a) o (b) como resultado de la degeneración del código genético; (d) una secuencia de nucleótido capaz de hibridizar bajo condiciones rigurosas para el nucleótido especificado en (a) o (b) ; (e) una secuencia de nucleótido que codifica para una especie homologa de la secuencia especificada en (a) o (b) ; y (f) una variante alélica de la secuencia de nucleótido especificada en (a) o (b) . De preferencia, la secuencia de nucleótido codifica para una proteína que tiene una actividad biológica del receptor humano IL-13. La secuencia de nucleótido puede estar ligada de manera funcional a una secuencia de control de expresión. En las modalidades preferidas, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO : 1 del nucleótido 256 al nucleótido 1404; la SEQ ID NO : 1 del nucleótido 319 al nucleótido 1257; la SEQ ID NO:l del nucleótido 1324 al nucleótido 1404; la SEQ ID NO : 3 del nucleótido 103 al nucleótido 1242; la SEQ ID NO : 3 del nucleótido 178 al -.^fa-li nucleótido 1125; la SEQ ID NO : 3 del nucleótido 1189 al nucleótido 1242. La invención proporciona también polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica para un péptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; (b) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 22 a 334; (c) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; de los aminoácidos 357 a 383; (d) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4; (e) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 26 a 341; (f) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 363 a 380; y (g) fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de unión del receptor IL-13. Otras modalidades preferidas codifican la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 1 a 331 y la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 26 a 331.

También se proporcionan células huésped, de preferencia células de mamífero, transformadas con los polinucleótidos . En otras modalidades, la invención proporciona un proceso para la producción de una proteína IL-13bc. El proceso comprende: (a) el crecimiento de un cultivo de la célula huésped de la presente invención en un medio de cultivo adecuado ; y (b) la purificación de la proteína IL-13bc humana a partir del cultivo. También se proporcionan las proteínas producidas de conformidad con estos métodos. La presente invención proporciona también una proteína IL-13bc aislada que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; (b) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 22 a 334; (c) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; de los aminoácidos 357 a 383; (d) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 ; (e) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 - ni ^^^agAgn de los aminoácidos 26 a 341; (f) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 363 a 380; y (g) fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de unión del receptor IL- 13. De preferencia, la proteína comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; la secuencia del aminoácido 22 a 334 de la SEQ ID NO : 2 ; la secuencia de SEQ ID NO: 4 o la secuencia del aminoácido 26 a 341 de la SEQ ID NO : 4. En otras modalidades preferidas, la secuencia de aminoácido especificada es parte de una proteína de fusión (con una secuencia de aminoácido adicional no derivada de IL-13bc) . Las proteínas de fusión preferidas comprenden un fragmento de anticuerpo, como por ejemplo, un fragmento Fc . Las modalidades particularmente preferidas comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 1 a 331 y la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 26 a 331. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona además composiciones que comprenden un anticuerpo que reacciona de manera específica con una proteína de la presente invención. También se proporcionan los métodos para identificar un inhibidor de la unión de IL-13 al receptor IL-13bc o IL-13. Estos métodos comprenden: (a) combinar una proteína IL-13bc o un fragmento de la misma con IL-13 o un fragmento de la misma, esta combinación forma una primera mezcla de unión; (b) medir la cantidad de unión entre la proteína y la IL-13 o el fragmento en la primera mezcla de unión; (c) combinar un compuesto con la proteína y la IL-13 o el fragmento para formar una segunda mezcla de unión; (d) medir la cantidad de unión en la segunda mezcla de unión; y (e) comparar la cantidad de unión en la primera mezcla de unión con la cantidad de unión en la segunda mezcla de unión; en donde el compuesto es capaz de inhibir la unión de IL-13 al receptor IL-13 o a la proteína IL-13bc cuando se presenta una disminución en la cantidad de unión de la segunda mezcla de unión. También se proporcionan inhibidores de IL-13R identificados por estos métodos y las composiciones farmacéuticas que los contienen. También se exponen los métodos para inhibir la unión de IL-13 a las proteínas IL-13bc o al receptor de IL-13 en un sujeto mamífero y comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que contiene una proteína IL-13bc, un inhibidor de IL-13bc o IL-13R o un anticuerpo para una proteína IL-13bc. También se proporcionan los métodos para potenciar la actividad de IL-13 que comprenden la combinación de una proteína que tiene actividad IL-13 con una proteína de la presente invención y poner en contacto esta combinación con una célula que expresa por lo menos una cadena de IL-13R distinta a IL-13bc. De preferencia, el paso de poner en contacto se efectúa mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de esta combinación a un sujeto mamífero. Se proporcionan métodos adicionales para el tratamiento de una condición relacionada con la IL-13 en un sujeto mamífero, este método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un antagonista de IL-13 y un portador farmacéuticamente aceptable. Otros métodos proporcionan un método para inhibir la interacción de IL-13 con una proteína IL-13bc en un sujeto mamífero, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un antagonista IL-13 y un portador farmacéuticamente aceptable. De preferencia, el antagonista se selecciona del grupo que consiste de una proteína IL-13bc, una forma soluble de IL-13R0.1, un anticuerpo para IL-13 o un fragmento de unión de IL-13 del mismo, un anticuerpo para IL-13bc o un fragmento de unión de IL-13bc del mismo, un anticuerpo para IL-13R0C1 o un fragmento de unión de IL-13Ral del mismo, mutantes de unión de IL-13R de IL-4, una molécula pequeña capaz de inhibir la interacción de IL-13 con IL-13bc y una pequeña molécula capaz de inhibir la interacción de IL-13 con IL-13R0C1. En otras modalidades adicionales, la invención proporciona un método para el tratamiento de fibrosis de tejido en un sujeto mamífero. El método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende una proteína y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; (b) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 22 a 334; (c) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; de los aminoácidos 357 a 383; (d) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 ; (e) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 26 a 341; (f) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 363 a 380; y (g) fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de unión del receptor IL- 13. La invención proporciona también un método para inhibir la formación de fibrosis de tejido en un sujeto mamífero. El método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéuticas que comprende una proteína y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; (b) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 22 a 334; (c) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; de los aminoácidos 357 a 383; (d) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 ; (e) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4 de los aminoácidos 26 a 341; (f) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 363 a 380; y (g) fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de unión del receptor IL- 13. Otras modalidades de la invención proporcionan un método para el tratamiento o inhibición de la fibrosis de tejido en un sujeto mamífero. El método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende: (a) una molécula seleccionada del grupo que consiste de un antagonista IL-13 y un antagonista IL-4 y (b) un portador farmacéuticamente aceptable . En la práctica, estos métodos para el tratamiento o inhibición de la fibrosis, de preferencia de la fibrosis del tejido, afecta un tejido seleccionado del grupo que consiste de: hígado, epidermis, endodermis, músculo, tendón, cartílago, tejido cardiaco, tejido pancreático, tejido pulmonar, tejido del útero, tejido neural, testis, ovario, glándula adrenal, arteria, vena, colon, intestino delgado, tracto biliar e intestino; con la máxima preferencia, tejido del hígado (incluyendo tejido infectado con esquistosoma) . En ciertas modalidades, la fibrosis es resultado de la cicatrización de una herida (incluyendo una incisión quirúrgica) . En la práctica de estos métodos para el * - * - *- ' tratamiento o inhibición de la fibrosis en donde se utiliza un antagonista, este antagonista se selecciona, de preferencia, entre el grupo que consiste de una proteína IL-13bc, una forma soluble de IL-13R0.1, un anticuerpo para IL-13 o un fragmento de unión de IL-13 del mismo, un anticuerpo para IL-13bc o un fragmento de unión de IL-13bc del mismo, un anticuerpo para IL-13R0C1 o un fragmento de unión de IL-13R0C1 del mismo, mutantes de unión de IL-13R de IL-4, una molécula pequeña capaz de inhibir la interacción de IL-13 con IL-13bc y una pequeña molécula capaz de inhibir la interacción de IL-13 con IL-13R0C1. En modalidades particularmente preferidas, el antagonista es una proteína IL-13bc que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; (b) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 22 a 334; (c) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; de los aminoácidos 357 a 383; (d) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 ; (e) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 26 a 341; (f) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: de los aminoácidos 363 a 380; y (g) fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de unión del receptor IL-13. En otros métodos preferidos para la práctica de estos métodos que utilizan un antagonista, el antagonista se selecciona del grupo que consiste de una forma soluble de IL-4R, un anticuerpo para IL-4 o un fragmento de unión de IL-4 del mismo, un anticuerpo para IL-4R o un fragmento de unión de IL-4R del mismo y una molécula pequeña capaz de inhibir la interacción de IL-4 con IL-4R.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: La Figura presenta fotografías de IL-13, IL-4, IL-11 y células COS con transfección simulada después de la exposición a IL-13bc-Fc según se describe en el Ejemplo 4 que se presenta más adelante. Figura 2 : Caracterización de las funciones de IL-4 e IL-3 en fatogénesis de esquistosomiasis. Ratones C57BL/6WT y deficientes en IL-4 (4KO) se infectaron con 25 cercarías de Schistosoma mansoni y después se sacrificaron a la semana 8 posterior a la infección para evaluar el tamaño de granulomas hepáticos (panel A) , eosinofilia del tejido (panel B) y fibrosis hepática (panel C) . Los grupos separados de ratones se trataron con Fc control o sIL-13Ra2-Fc, como se describe en la sección de Métodos. Los datos mostrados son mediciones de ratones individuales y las líneas designan las medias para cada grupo. Se hicieron comparaciones estadísticas mediante prueba t Student (paneles A y B) y mediante análisis de covarianza (panel C) . Se indican en la figura las comparaciones significativas y sus valores p. Todos los datos se reprodujeron en un segundo estudio. Figura 3 : Se reduce el colágeno hepático en ratones infectados/tratados con sIL-13Ra2-Fc . Las secciones de hígado se prepararon 8 semanas después de la infección administrada. Las secciones de ratones tratados con Fc de control (paneles A y B) y WT infectados y tratados con sIL-13Ra2-Fc que contenían cargas de huevecillos tisulares casi idénticas, se tiñeron con rojo picrosirio (paneles A y C) y se iluminaron utilizando luz polarizada para hacer resaltar las áreas ricas en colágeno (paneles B y D) . Las áreas birrefringentes indican teñido positivo de colágeno y las áreas mostradas son representativas de cada hígado (amplificación, X40). Las secciones de hígado de ratones tratados con sIL-13R0t2-Fc mostraron sólo muy poco colágeno asociado al tracto portal y granuloma, en comparación con los animales control. Figura 4: El perfil de citocina del tipo Thl/Th2 no es afectado por el tratamiento con sIL-13Ra2-Fc . Los ^tj mu » ratones WT con deficiencia de IL-4 (4K0) y C57BL/6 fueron infectados con 25 cercarías de Schistosoma mansoni y grupos separados de ratones se trataron con sIL-13Ra2-Fc o Fc control, según se describe en la sección de Métodos. Las células de nodo linfático mesentérico se aislaron de los ratones individuales y se prepararon suspensiones de una sola célula (3 x 106 células/pozos en 24 placas de pozos) y se estimularon con medio solo (cuadrados), SEA a 20 ug/ml (círculos) o con SEA y 50 ug/ml de mAb anti-CD4 (triángulos). Todas las citocinas se analizaron en sobrenadantes de cultivo mediante ELISA 72 horas después de la estimulación, como se describe en la sección de Métodos. Estos símbolos representan valores para ratones individuales y las barras indican las medias dentro de cada grupo. Figura 5: La expresión mRNA de citocina del tipo Th2 se reduce en los hígados de ratones deficientes en IL-4 infectados pero no afectados por bloqueo de IL-13. Ratones deficientes en IL-4 (4KO) y WT C57BL/6 fueron infectados con 25 cercarías de Schis tosoma mansoni y grupos separados de ratones se trataron con sIL-13Ra2-Fc o Fc control, según se describe en la sección de Métodos. Todos los animales fueron sacrificados en la semana 8 después de la infección y los hígados se prepararon para análisis de RT-PCR, como se describe en la sección de Métodos. Los datos mostrados ^¡¿ti son los valores individuales de 9 a 10 animales por grupo y la barra indica el promedio dentro de cada grupo. El símbolo * indica que los datos son significativamente distintos al los del grupo Fc control WT, como se determina por la prueba t Student (p<0.05). Los valores promedio de cinco ratones WT no infectados (círculo negro) y cinco ratones deficientes en IL-4 no infectados (círculo abierto), se muestran en el eje Y para cada citocina. Todos los datos se reprodujeron en un segundo estudio. Figura 6: La expresión ARNm de Colágeno I y Colágeno III se reducen en los hígados de ratones tratados con sIL-13Ra2-Fc infectados, pero no infectados por deficiencia de IL-4. Los ratones deficientes en IL-4 (4KO) y WT C57BL/6 fueron infectados con 25 cercarías de Schistosoma mansoni y grupos separados de ratones se trataron con sIL-13R 2-Fc o Fc control, según se describe en la sección de Métodos. Todos los animales se sacrificaron en la semana 8 después de la infección y los hígados se prepararon para análisis RT-PCR como se describe en la sección de Métodos. Los datos mostrados son los valores individuales de 9 a 10 animales por grupo y la barra indica el promedio dentro de cada grupo. El símbolo * indica que los datos son significativamente distintos a los grupos Fc control con deficiencia de IL-4 y WT, como se determina por la prueba t de alumno (p<0.05) . Los valores promedio de cinco ratones WT no infectados (círculo negro) y cinco ratones con deficiencia de IL-4 no infectados (círculo abierto), se muestran en el eje Y para cada citocina. Todos los datos se reprodujeron en un estudio separado. Figura 7: La IL-13 induce la síntesis de colágeno del tipo I en fibroblastos 3T3 de murinos. Las células se estimularon con medio (carril 1) , rIL-4 a 1000 Unidades/ml (carril 2) o rIL-13 a 20 ng/ml (carriles 3 y 4, del R&D Systems and Genetics Institute, respectivamente) por 48 horas. Se separaron los lisados celulares totales en SDS-PAGE al 6% bajo condiciones de reducción, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y se sondearon con colágeno del tipo I antirratón IgG de conejo. El doblete superior y la banda inferior (flechas) corresponden a colágeno de rata purificado del tipo I separado en el carril 5 (panel A) . La Figura del fondo (panel B) son los valores densitométricos (unidades de pixel arbitrarias).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Los inventores de la presente solicitud han identificado y proporcionado, por primera vez, los polinucleótidos que codifican para la cadena de unión de IL-13 del IL-13R (en lo sucesivo "IL-13bc") que incluyen, sin limitación, los polinucleótidos que codifican para la ü-- i '*- - • - - -**-" * - - - *•-—^ IL-13bc murina y humana. La SEQ ID NO : 1 proporciona la secuencia de nucleótido de una ADNc que codifica para la IL-13bc murina. La SEQ ID NO : 2 proporciona la secuencia pronosticada de aminoácido de la cadena receptora, incluyendo una secuencia de señal putativa de los aminoácidos 1-21. Se cree que la IL-13bc murina madura tiene la secuencia de los aminoácidos 22-383 de la SEQ ID NO : 2. La cadena receptora murina madura tiene por lo menos tres dominios distintos: un dominio extracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos 22-334 de la secuencia SEQ ID NO : 2 ) , un dominio transmembrana (que comprende aproximadamente los aminoácidos 335-356 de la SEQ ID NO : 2 ) y un dominio intracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos 357-383 de la SEQ ID NO : 2 ) . La SEQ ID NO : 3 proporciona la secuencia de nucleótido de un ADNc que codifica para la IL-13bc humana. La SEQ ID NO : 4 proporciona la secuencia de aminoácido pronosticada de la cadena receptora, incluyendo una secuencia de señal putativa de los aminoácidos 1-25. Se cree que la IL-13bc humana madura tiene la secuencia de los aminoácidos 26-380 de la SEQ ID NO : 4. La cadena receptora humana madura tiene por lo menos tres dominios distintos: un dominio extracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos 26-341 de la secuencia SEQ ID NO : 4 ) , un dominio .. .^-ai-i-transmembrana (que comprende aproximadamente los aminoácidos 342-362 de la SEQ ID NO: 4) y un dominio intracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos 363-380 de la SEQ ID NO : 4 ) . Los primeros 81 aminoácidos de la secuencia de IL-13bc humana son idénticos a la secuencia traducida de una etiqueta de secuencia expresada (EST) identificada como "yg99fl0.rl Homo sapiens ADNc clone 41648 5" y con el número de acceso a la base de datos R52795. gb_est2. No hay motivos de secuencia u homologías en esta secuencia EST que conduzcan a los experimentados en la técnica a identificar la proteína codificada como un receptor de citocina. Un clon de ADNc que corresponde a esta entrada de la base de datos está disponible al público, de I.M.A.G.E. Consortium. Subsecuente a la fecha de prioridad de la presente solicitud, este clon fue ordenado y secuenciado por los solicitantes. Se determinó que la secuencia de este clon es la secuencia anteriormente reportada aquí por los solicitantes como SEQ ID NO : 3. También pueden producirse las formas solubles de la proteína IL-13bc. Estas formas solubles incluyen, sin limitación, las proteínas que comprenden los aminoácidos 1-334 o 22-334 de la SEQ ID NO : 2 o los aminoácidos 1-342 ó 26-341 de la SEQ ID NO : 4. Las formas solubles de la IL-13bc se caracterizan además por ser solubles en solución acuosa, de preferencia, a temperatura ambiente. También pueden producirse las proteínas IL-13bc que comprenden sólo el dominio intracelular o una porción del mismo. Cualquiera de las formas de IL-13bc o menores a la longitud 5 total quedan abarcadas dentro de la presente invención y se hace referencia aquí a las mismas en forma colectiva con las formas maduras y de longitud completa, como "IL-13bc" o "proteínas IL-13bc". Las proteínas IL-13bc o menores a la longitud total pueden producirse mediante la expresión de 10 un fragmento correspondiente del polinucleótido que codifica para la proteína IL-13bc de longitud total (SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO : 3 ) . Estos fragmentos de polinucleótidos correspondientes también son parte de la presente invención. Los polinucleótidos modificados como se 15 describe en lo anterior, pueden elaborarse mediante técnicas de biología molecular estándar, entre las que se incluye la construcción de mutantes de deleción deseados apropiados, métodos de mutagénesis dirigida en el sitio o por reacción de cadena de polimerasa utilizando cebadores 20 de oligonucleótido apropiados. Para los propósitos de la presente invención, una proteína tiene "una actividad biológica de la cadena de unión del receptor IL-13" si posee una o más de las siguientes características: (1) la capacidad de unir la IL- 25 13 o un fragmento de la misma (de preferencia un fragmento de la misma biológicamente activo); y/o (2) la capacidad de interactuar con la segunda cadena que no es de unión a la IL-13 de IL-13R para producir una señal característica de la unión de IL-13 o IL-13R. De preferencia, la actividad biológica que posee la proteína es la capacidad de unir IL-13 o un fragmento de la misma, con más preferencia con un KD de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 nM. Los métodos para determinar si un polipéptido o proteína en particular tiene esta actividad incluyen, sin limitación, los métodos descritos en los ejemplos proporcionados aquí. La IL-13bc o los fragmentos activos de la misma (proteínas IL-13bc) pueden fusionarse con moléculas portadoras como las inmunoglobulinas. Por ejemplo, las formas solubles de la IL-13bc pueden fusionarse a través de secuencias "enlazadoras" con la porción de Fc de una inmunoglobulina. También pueden utilizarse otras fusiones de proteínas, tales como las fusiones con GST, Lex-A o MBP. La invención también incluye variantes alélicos de las secuencias de nucleótido, como se establece en la SEQ ID NO:l o en la SEQ ID NO : 3 , es decir, las formas alternativas que se presentan en la naturaleza, del polinucleótido aislado de SEQ ID NO : 1 o de la SEQ ID NO: 3 que también codifica para las proteínas IL-13bc, de preferencia para las proteínas que tienen una actividad biológica de IL-13bc. Incluidos en la invención, también se encuentran los polinucleótidos aislados que hibridizan para la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NO : 1 o SEQ ID NO: 3 bajo condiciones altamente restrictivas (por ejemplo, 0. lxSSC a 65°C) . Los polinucleótidos aislados que codifican para las proteínas IL-13bc pero que difieren de la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NO : 1 o SEQ ID NO : 3 debido a la degeneración del código genético también se incluyen en la presente invención. Las variaciones en la secuencia de nucleótido, según se establece en la SEQ ID NO : 1 o SEQ ID NO : 3 que son ocasionadas por mutaciones de punto o por modificaciones inducidas también se incluyen en la invención. La presente invención también proporciona polinucléotidos que modifican para homologas de la IL-13bc murina o humana a partir de otras especies animales, en particular de otras especies de mamíferos. Los homólogos de especie pueden identificarse y aislarse elaborando sondas o cebadores de secuencias murinas o humanas expuestas en la presente y tamizando una biblioteca de una especie apropiada, como por ejemplo las bibliotecas construidas a partir de PBMC, timo o testis de las especies relevantes . Los polinucleótidos aislados de la invención pueden ligarse de manera operativa a una secuencia control de expresión, por ejemplo a los vectores de expresión pMT2 sgj?» o pED expuestos en Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19 , 4485-4490 (1991) , a fin de producir la proteína IL-13bc de manera recombinante. En la técnica se conocen muchas secuencias control de expresión adecuadas. También son conocidos los métodos generales para la expresión de proteínas recombinantes y se ejemplifican en R. Kaufman, Methods in Ezymology 185, 537-566 (1990) . Tal como se define aquí, "ligado de manera operativa" significa ligados en forma enzimática o química para formar un enlace covalente entre el polinucleótido aislado de la invención y la secuencia control de expresión, de tal manera que la proteína IL-13bc se expresa mediante una célula huésped que ha sido transformada (transfectada) con la secuencia control de expresión/polinucleótido ligado. Varios tipos de células pueden actuar como células huésped adecuadas para la expresión de la proteína IL-13bc. Cualquier tipo de célula capaz de la expresión funcional de la proteína IL-13bc puede utilizarse. Las células huésped de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células COS de mono, células de ovario de Hámster chino (CHO), células 293 de riñon humano, células A431 de epidermis humana, células Colo205 humanas, células 3T3, células CV-1, otras líneas celulares de primate transformadas, células diploide normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes - - - »^««^t". primarios, células HeLa, células L de ratón, células BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2 , BaF3 , 32D, FDCP-1, PC12, Mix o C2C12. La proteína IL-13bc también puede producirse 5 enlazando de manera operativa el polinucleótido aislado de la invención con secuencias control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insecto y empleando un sistema de expresión de insectos. Los materiales y métodos para los sistemas de expresión celular de insecto/baculovirus se 10 encuentran comercialmente disponibles en la forma de estuche, de por ejemplo: Invitrogen, San Diego, California, U.S.A. (el estuche MaxBac®) , y estos métodos son muy conocidos en la técnica, como se describe en Summers and Smith, Texas Aqricultural Experiment Station Bulletin No. 15 1555 (1987 ) , que se incorpora aquí como referencia. Las formas solubles de la proteína IL-13bc pueden producirse también en células de insecto utilizando polinucleótidos aislados apropiados, según se describe arriba. De manera alternativa, la proteína IL-13bc puede 20 producirse en eucariotes inferiores, por ejemplo en levadura o en procariotes como bacterias. La cepas de levadura adecuadas incluyen: cepas de Kluyveromyces, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, Candida o cualquier cepa de levadura capaz de expresar para 25 proteínas heterólogas. Las cepas bacteriales adecuadas incluyen: Escherichia coli , Bacillus Subtilis, Salmonella typhimurium o cualquier cepa bacterial capaz de expresar para proteínas heterólogas . La expresión en bacterias puede dar por resultado la formación de cuerpos de inclusión que incorporen la proteína recombinante. Por lo tanto, puede requerirse el replegado de la proteína recombinante para producir material activo o más activo. Varios métodos para la obtención de proteínas heterólogas correctamente plegadas de cuerpos de inclusión bacterial son conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, de manera general, solubilizar la proteína de los cuerpos de inclusión, desnaturalizar después la proteína completamente utilizando un agente caotrópico. Cuando están presentes residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína, a menudo es necesario completar el replegado en un ambiente que permita la formación correcta de uniones de disulfuro (un sistema redox) . Los métodos generales de repliegue se exponen en Kohno, Meth. Enzym. , 185:187-195 (1990) . La EP 0433225 y la solicitud copendiente USSN 08/163,877 describen otros métodos apropiados. La proteína IL-13bc de la invención puede expresarse también como un producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente de la leche de vacas, cabras, cerdas u ovejas transgénicas que se _¿_«_taiiiti_É_ caracteriza por células germinales o somáticas que contienen una secuencia de polinucleótido que codifica para la proteína IL-13bc. La proteína IL-13bc de la invención puede 5 prepararse por el crecimiento de un cultivo de células huésped transformadas bajo condiciones de cultivo necesarias para expresar la proteína deseada. La proteína expresada resultante puede purificarse entonces del medio de cultivo o extractos celulares. Las formas solubles de 0 la proteína IL-13bc de la invención pueden purificarse del medio condicionado. Las formas de unión de membrana de la proteína IL-13bc de la invención pueden purificarse mediante la preparación de una fracción de membrana total de la célula de expresión y la extracción de las membranas 5 con un detergente no iónico, como por ejemplo el Tritón X- 100. La proteína IL-13bc puede purificarse utilizando los métodos conocidos por los experimentados en la técnica. Por ejemplo, la proteína IL-13bc de la invención puede 0 concentrarse utilizando un filtro de concentración de proteína que se encuentra disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, puede aplicarse el concentrado a una matriz de purificación, por 5 ejemplo, a un medio de filtración de gel. De manera alternativa, puede emplearse una resina de intercambio de aniones, por ejemplo, una matriz o substrato que tenga grupos de polietilenimina (PEÍ) o dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser: acrilamina, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos normalmente empleados en la purificación de proteínas. De manera alternativa, puede emplearse una etapa de intercambio de cationes . Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo (por ejemplo, columnas de S-Sepharose®) . La purificación de la proteína IL-13bc del sobrenadante de cultivo también puede incluir una o más etapas de columnas en estas resinas de afinidad, como: A-agarosa de concanavalina, heparin-toyopearl® o Cibacrom azul 3GA Sepharose®, o por cromatografía de interacción hidrofóbica que utiliza resinas como: fenil éter, butil éter o propil éter; o por cromatografía de inmunoafinidad. Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medio RP-HPLC hidrofóbico, por ejemplo gel de sílice que tiene grupos metilo colgantes u otros grupos alifáticos, pueden emplearse para purificar además a la proteína IL-13bc. Las columnas de afinidad que incluyen IL-13 o fragmentos de la misma o que incluyen anticuerpos para la proteína IL-13bc también pueden —'M * * utilizarse en la purificación de conformidad con los métodos conocidos. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones o con otros métodos conocidos, también pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante aislada y prácticamente purificada. De preferencia la proteína IL-13bc aislada se purifica de manera que está prácticamente libre de otras proteínas de mamífero. Las proteínas IL-13bc de la invención pueden utilizarse también para tamizar agentes que son capaces de unirse a IL-13bc o IL-13R o que interfiere con la unión de IL-13 al IL-13 o IL-13bc (ya sea los dominios extracelulares o intracelulares) y pueden actuar así, como inhibidores de la unión normal y de la acción de la citocina ("inhibidores de IL-13R"). Los análisis de unión que utilizan una proteína de unión deseada, inmovilizada o no, son muy conocidos en la técnica y pueden utilizarse para este propósito utilizando la proteína IL-13bc de la invención. Pueden utilizarse análisis de tamizado basado en proteínas (célula libre) o basado en células purificadas, para identificar estos agentes. Por ejemplo, la proteína IL-13bc puede inmovilizarse en forma purificada en un portador y la unión a la proteína IL-13bc purificada puede medirse en la presencia y en la ausencia de agentes de inhibición potenciales. Un análisis de unión adecuado puede emplear de manera alternativa, una forma soluble de la IL-13bc de la invención. Otro ejemplo de un sistema en donde los inhibidores pueden tamizarse se describe en el Ejemplo 2 que aparece más adelante. En este análisis de tamizado, se forma una primera mezcla de unión combinando la proteína IL-13 o un fragmento de la misma y la proteína IL-13bc y se mide la cantidad de unión en la primera mezcla de unión (Bo) . También se forma una segunda mezcla de unión combinando la proteína IL-13 o un fragmento de la misma, IL-13bc y el compuesto o agente que va a tamizarse y se mide la cantidad de unión en la segunda mezcla de unión (B) . Las cantidades de unión en la primera y segunda mezclas se comparan, por ejemplo, efectuando un cálculo de la proporción B/Bo. Un compuesto o agente se considera capaz de inhibir la unión si se observa una disminución en la unión en la segunda mezcla de unión, en comparación con la primera mezcla de unión. Opcionalmente, la segunda cadena de IL-13R puede añadirse a una o a ambas mezclas de unión. La formulación y optimización de las mezclas de unión quedan dentro del nivel de pericia en la técnica; estas mezclas de unión pueden contener también amortiguadores y sales necesarias para mejorar o para optimizar la unión y pueden incluirse análisis de control adicionales en el análisis de tamizado de la invención.

Los compuestos encontrados para reducir la actividad de unión de la proteína IL-13bc a IL-13 o sus fragmentos a cualquier grado, de preferencia por lo menos al 10% aproximadamente, con más preferencia a más del 50%, pueden identificarse de esta manera y tamizarse después de manera secundaria en otros análisis de unión y en análisis in vivo. Por estos medios pueden identificarse los compuestos que tienen actividad inhibidora para la unión de IL-13bc que pueden ser adecuados como agentes terapéuticos. Las proteínas IL-13bc y los polinucleótidos que codifican para las mismas, pueden utilizarse también como agentes de diagnóstico para detectar la expresión o presencia de IL-13bc, IL-13R, IL-13 o células que expresan IL-13bc, IL-13R o IL-13. Las proteínas o polinucleótidos pueden emplearse para este propósito en procedimientos estándar para análisis de diagnóstico que utilizan estos tipos de materiales . Los métodos adecuados son muy conocidos para los experimentados en la técnica. Como se utiliza aquí, "IL-13R" se refiere a IL-13bc y/o a una segunda cadena de receptor IL-13 conocida como "IL-13R0.1" o "NR4" (ver: murine receptor chain, Hilton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996, 93:497-501; human receptor chain, Aman et al., J. Biol. Chem. 1996, 271:29265-70 y Gauchat et al., Eur. J. Immunol . 1997, 27:971-8) .

IL-13bc actúa como mediador de las actividades biológicas conocidas de IL-13. Como resultado, la proteína IL-13bc (particularmente, las proteínas IL-13bc solubles) , los inhibidores de IL-13R (es decir, antagonistas de interacción de IL-13 con IL-13R (por ejemplo, anticuerpos para IL-13R (incluyendo en particular a IL-13bc o a IL-13Ral) y los fragmentos de los mismos, los anticuerpos para IL-13 y los fragmentos de los mismos, proteínas IL-13R0C1 solubles y moléculas pequeñas y otros inhibidores de la interacción de IL-13 con IL-13R (incluyendo con IL-13bc y/o con IL-13Ral)) pueden resultar útiles en el tratamiento o modulación de diversas condiciones médicas en donde IL-13 está implicado o que son efectuadas por la actividad (o por la falta de la misma) de IL-13 (de manera colectiva "condiciones relacionadas con IL-13"). Las formas mutadas de IL-4 que se unen a IL-13R también pueden utilizarse como antagonistas de IL-13 (ver, por ejemplo, las expuestas en Shanafelt et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1998, 95:9454-8; Aversa et al., J. Exp. Med. 1993, 178:2213-8; y Grunewaid et al., J. Immunol . 1998, 160:4004-9). Las condiciones relacionadas con IL-13 incluyen de manera irrestricta, enfermedades y condiciones mediadas por Ig, en particular, condiciones mediadas por IgE (incluyendo de manera irrestricta: atopia, condiciones alérgicas, asma, enfermedades complejas inmunes (por ejemplo: lupus, síndrome nefrótico, nefritis, glomerulonefritis, tiroiditis y la enfermedad de Grave)); condiciones inflamatorias de los pulmones; deficiencias de inmunidad, específicamente deficiencias en células progenitoras hematopoyéticas o desórdenes relacionados con las mismas; cáncer y otras enfermedades. Estos estados patológicos pueden ser resultado de enfermedad, exposición a radiación o fármacos e incluyen, por ejemplo: leucopenia, infecciones bacteriales y virales, anemia, deficiencias de célula B o célula T como la deficiencia de célula hematopoyética o de célula inmune posterior a un transplante de célula ósea. Puesto que IL-13 inhibe la activación macrófaga, las proteínas IL-13bc también pueden ser útiles para mejorar la activación macrófaga (es decir, en vacunación, tratamiento de organismos micobacteriales o intracelulares o infecciones parasíticas). Las proteínas IL-13bc también pueden utilizarse para potenciar los efectos de IL-13 in vitro e in vivo. Por ejemplo, una proteína IL-13bc puede combinarse con una proteína que tiene actividad IL-13 (de preferencia IL-13) y la combinación resultante puede ponerse en contacto con una célula que expresa por lo menos una cadena de IL-13R distinta a IL-13bc (de preferencia todas las cadenas de IL-13R distintas a IL-13bc, por ejemplo, IL-13R0C.1). De preferencia, la etapa de ponerse en contacto se efectúa por • "«»-l-*"» J ^^¡^ la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de esta combinación a un sujeto mamífero, in vivo. La asociación preestablecida de la proteína IL-13 con la proteína IL-13bc ayudará en la formación del complejo IL-13/IL-13R completo, necesario para la señalización apropiada. Ver por ejemplo, los métodos descritos por Economides et al., Science 270:1351 (1995). Los inhibidores de IL-13R y proteína IL-13bc, purificados de las células o producidos de manera recombinante, pueden utilizarse como una composición farmacéutica cuando se combina con un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición como esta puede contener, además de IL-13bc o del inhibidor y portador, diversos diluyentes, agentes de carga, sales, amortiguadores, estabilizadores, solubilizantes y otros materiales muy conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos. Las características del portador dependerán de la vía de administración. La composición farmacéutica de la invención puede contener también citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos como: M-CSF, GM-CSF, interleucinas (por ejemplo: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4... IL-24, IL-25), G-CSF, factor de célula germinal y eritropoyetina. La composición ^^^|^?¡t^ farmacéutica puede incluir también anticuerpos anticitocina . La composición farmacéutica puede contener además otros agentes antiinflamatorios. Estos agentes y/o factores adicionales pueden incluirse en la composición 5 farmacéutica para producir un efecto sinergístico con inhibidor de IL-13bc o proteína IL-13bc aislada o para disminuir al mínimo los efectos colaterales ocasionados por el inhibidor IL-13bc o IL-13bc aislado. Por el contrario, el inhibidor IL-13bc o IL-13bc aislado puede incluirse en 10 las formulaciones de la citocina particular, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico o agente antiinflamatorio para disminuir al mínimo los efectos colaterales de la citocina, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o 15 antitrombótico o agente antiinflamatorio. La composición farmacéutica de la invención puede estar en la forma de un liposoma en donde el inhibidor IL- 13bc o la proteína IL-13bc aislada se combina, además de otros portadores farmacéuticamente aceptables, con agentes 20 antipáticos, como los lípidos que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas lamelares en solución acuosa. Los lípidos adecuados para la formulación liposomal incluyen, sin limitación: monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, fosfolípidos, 25 saponina, ácidos biliares y lo semejante. La preparación de estas formulaciones liposomales queda dentro del nivel de pericia en la técnica, como se expone, por ejemplo en la patente de los Estados Unidos No. 4,235,871, la patente de los Estados Unidos No. 4,501,728; la patente de los Estados Unidos No. 4,837,028 y la patente de los Estados Unidos No. 4,737,323, incorporadas todas ellas aquí, como referencia. Como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad total de cada componente activo del método o composición farmacéutica que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el paciente, por ejemplo: disminución de los síntomas, curación o aumento del índice de curación de estas condiciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, que se administra solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan por resultado un efecto terapéutico, ya sea que se administren en combinación, en serie o de manera simultánea. En la práctica, el método de tratamiento o uso de la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de inhibidor IL-13bc o proteína IL-I3bc aislada se administra a un mamífero. El inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc aislada pueden administrarse de conformidad con el método de la invención, ya sea solo o en combinación con otras terapias, como por ejemplo, tratamientos que emplean citocinas, linfocinas u otras factores hematopoyéticos. Cuando se coadministran con una o más citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos, el inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc puede administrarse ya sea simultáneamente con las citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos, factores trombolíticos o anti-trombóticos o de manera secuencial. Si se administra de manera secuencial, el médico tratante decidirá sobre la secuencia de administración adecuada del inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc en combinación con las citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos, factores antitrombóticos o trombolíticos . La administración de inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc utilizados en la composición farmacéutica o para la práctica del método de la presente invención pueden llevarse a cabo en una variedad de formas convencionales, como por ejemplo: ingestión oral, inhalación, inyección cutánea, subcutánea o intravenosa. Se prefiere la administración intravenosa para el paciente. Cuando se administra una cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc por vía oral, el inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc estará en la forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de _¿ÉÍÉ_ÜMil_Í tableta, la composición farmacéutica de la invención puede contener además un portador sólido, por ejemplo una gelatina o un adyuvante. La tableta, cápsula y polvo contienen aproximadamente entre el 5% y 95% del inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc y, de preferencia entre el 25% y 90% del inhibidor. Cuando se administra en forma de líquido, puede añadirse un portador líquido como el agua, petróleo, aceites de origen animal o de plantas, como por ejemplo: aceite de cacahuate, aceite mineral, aceite de soya, aceite de ajonjolí o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles, como por ejemplo: etilen glicol, propilen glicol o polietilen glicol. Cuando se administra en forma liquida, la composición farmacéutica contiene aproximadamente entre 0.5% y 90% en peso del inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc y, de preferencia entre 1% y 50% del inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc. Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc se administra mediante inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable y libre de pirógenos. La preparación de estas soluciones de proteína parenteralmente aceptables, respetando el pH, isotonicidad, estabilidad y los semejante, queda dentro de la pericia en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener además del inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc, un vehículo isotónico, por ejemplo: inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de cloruro de sodio y dextrosa, inyección de Ringer lactado u otro vehículo, como se conoce en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención puede contener también estabilizadores, conservadores, amortiguadores, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los experimentados en la técnica. La cantidad de inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y gravedad de la condición que va a tratarse y de la naturaleza de tratamientos previos que el paciente ha sufrido. Finalmente, el médico tratante decidirá la cantidad de inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc con la cual tratar a cada paciente en lo individual. Inicialmente, el médico tratante administrará dosis bajas de inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc y observará la respuesta del paciente. Pueden administrarse dosis más grandes de inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc hasta que el paciente obtenga el efecto terapéutico óptimo y en ese punto, generalmente, la dosis - i jj»--ya no se aumenta más . Se contempla que varias composiciones farmacéuticas utilizadas para practicar el método de la presente invención deben contener aproximadamente entre 0.1 µg y 100 mg (de preferencia aproximadamente entre 20 µg y 500 µg) de inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc por kg de peso corporal. La duración de la terapia intravenosa que utiliza la composición farmacéutica de la presente invención variará, dependiendo de la gravedad de la enfermedad que va a tratarse y de la condición y respuesta idiosincrática potencial de cada paciente en forma individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de inhibidor IL-13bc o proteína IL-13bc estará en el intervalo de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. Finalmente, el médico tratante decidirá sobre la duración apropiada de la terapia intravenosa que utiliza la composición farmacéutica de la presente invención. Las proteínas IL-13bc de la invención pueden utilizarse también para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionen específicamente con la proteína Il-13bc y que puedan inhibir la unión de IL-13 o los fragmentos de la misma, al receptor. Estos anticuerpos pueden obtenerse utilizando la IL-13bc entera como un inmunógeno o utilizando fragmentos de IL-13bc, por ejemplo la IL-13bc madura soluble. Pueden utilizarse también fragmentos más pequeños de la IL-13bc para inmunizar animales. Los inmunógenos péptidos pueden contener además un residuo de cisteína en la terminal carboxilo y estar conjugados con un hapteno, por ejemplo hemocianina limpet aceptora (KLH) . pueden generarse inmunógenos de péptido adicionales reemplazando los residuos de tirosina con residuos de tirosina sulfatada. Los métodos para sintetizar estos péptidos son conocidos en la técnica, por ejemplo, como en R.P. Merrifield, J.Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); J.L. Krstenansky, et al., FEBS Lett. 211, 10(1987). Los anticuerpos de neutralización o no neutralización (de preferencia anticuerpos monoclonales) que se unen a la proteína IL-13bc pueden resultar también terapéuticos útiles para ciertos tumores y también en el tratamiento de las condiciones descritas en lo anterior. Estos anticuerpos monoclonales de neutralización pueden ser capaces de bloquear la unión de IL-13 a IL-13bc.

Ejemplo 1 Aislamiento de las ADNc de IL-13bc Aislamiento de la cadena receptora 11-13 murina. 5 ug de poliA+ARN se prepararon a partir de los timos de ratones C3H/HeJ de 6-8 semanas de edad. Se preparó ADNc hemimetilado de hebra doble utilizando el estuche i de síntesis de ADNc de Stratagene, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, la primera hebra sé cebó con un cebador oligodT-Xho y después de la segunda ! síntesis de hebra, se añadieron adaptadores EcoRI y el ADNc ' se digirió con Xhol y se purificó. El ADNc se ligó a los ¡sitios Xhol-EcoRI del vector lambda Zap Express (Stratagene) y se empacó utilizando extractos de empacado (Strataíjene) Gigapak II Gold de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes . Una biblioteca de fago recombinante resultante de 1.5 x 105 se amplificó siguiendo las instrucciones del fabricante. Esta biblioteca se tamizó con una sonda de oligonucleótido de 17 mer de la secuencia KSRCTCCABKCRCTCCA (SEQ ID NO : 5 ) (K=G+T; S=C+G; R=A+G; B=C+G+T) utilizando condiciones de hibridización TMAC estándar como se describe (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., editores, John Wiley and Sons, 1995, sección 6.4.3). Se identificó el clon A25 porque hibridizó en la sonda 17mer, pero no se derivaron sondas de los receptores de hematopoyetina conocidos. Este clon se aisló en forma de plásmido del vector ZapExpress conforme a la instrucción de los fabricantes y se determinó la secuencia de ADN. La secuencia de ADN codificó para un miembro novedoso de la familia del receptor de hematopoyetina . El clon A25 que contiene el polinucleótido que "'•* • • * - - -»-^«»^-»"*, tiene la secuencia de SEQ ID NO : 1 se depositó con ATCC como pA25pBKCMV en el acceso número 69997 el 22 de febrero de 1996.

Aislamiento de la cadena de receptor IL-13 humano. Un fragmento parcial del homólogo humano del receptor murino se aisló por PCR utilizando oligonucleótidos derivados de la secuencia murina. Se preparó ADNc a partir de poliA+ARN de testis humanos que se obtuvo de Clontech. Un fragmento de ADN de 274 pares de bases se amplificó a partir de este ADN por PCR con los siguientes oligonucleótidos: ATAGTTAAACCATTGCCACC (SEQ ID NO: 6) y CTCCATTCGCTCCAAATTCC (SEQ ID NO : 7 ) utilizando polimerasa AmpliTaq (Promega) en amortiguador Taq IX que contiene 1.5 mM mgC12 para 30 ciclos de incubación (94°C x 1 minuto, 42 °C por 1 minuto y 72 °C por 1 minuto) . Se determinó la secuencia de ADN de este fragmento y se prepararon dos oligonucleótidos a partir de una porción interna de este fragmento con la siguiente secuencia: AGTCTATCTTACTTTTACTCG (SEQ ID NO : 8 ) y CATCTGAGCAATAAATATTCAC (SEQ ID NO : 9 ) . Estos oligonucleótidos se utilizaron como sondas para tamizar una biblioteca de ADNc de testis humano adquirida de CLONTECH (cat #HL1161) . Se hibridizaron los filtros a 52°C utilizando condiciones de hibridización estándar 5XSSC y se ^M^ lavaron en SSC 2X a 52°C. Se aislaron veintidós clones que hibridizaron a ambos oligonucleótidos en un tamiz de 400,000 clones. La secuencia de ADN se determinó a partir de cuatro de los clones de ADNc y todos codificaron para el mismo receptor novedoso de hematopoyetina. La secuencia de ADN pronosticada de la cadena de receptor humano de longitud completa se muestra como la SEQ ID NO: 3. El clon humano se depositó con ATCC como phA25#llpDR2 en el acceso número 69998 el 22 de febrero de 1996.

Ejemplo 2 Expresión de la proteína soluble IL-13bc y análisis de la actividad Producción y purificación de IL-13bc-Ig soluble. Los aminoácidos 1-331 que codifican para ADN del dominio extracelular de IL-13bc se fusionaron con una secuencia separadora que codifica para gly-ser-gly por PCR y se ligó en marco con las secuencias que codifican para las regiones de CH2 CH3 de articulación de IgGl humano del pED.Fc del vector de expresión COS-1. Se produjo IL-13bc- Ig a partir de células COS-1 transfectadas de dextrano DEAE y purificadas mediante cromatografía por sefarosa A de proteína (Pharmacia) .

Examen de proliferación de B9 La estimulación de proliferación de células B9 (Aarden et al. Eur. J. Immunol . 1987.17:1411-1416) en respuesta a IL-13 o IL-4 se midió por la incorporación de 3H-timidina en ADN. Se sembraron células (5x103 /pozo) en placas de 96 pozos con medio que contiene factores de crecimiento a concentraciones que varían, en presencia o ausencia de IL-13bc-Ig a 1 ug/ml. Después de la incubación por 3 días se añadió luCi/pozo de 3H-timidina y las células se incubaron por un adicional de 4 horas. Se determinó la radioactividad incorporada utilizando un lector de placa LKB 1205. La línea celular B9 proliferó en respuesta a IL-13, IL-4 o IL-6. Sólo las respuestas a IL-13 se inhibieron por la IL-13bc-Ig soluble, lo que indica que este receptor se une a IL-13 específicamente, pero no a IL-4 o IL-6. Las tablas muestran cpm. Se muestran dos experimentos separados .

Tabla I Ejemplo 3 Unión directa de IL-13bc soluble a IL-13 medida por resonancia de plasmón superficial (Análisis Biacore) Se utilizó un biosensor para medir directamente la unión específica de IL-13 a IL-13bc-Ig purificada (Pharmacia, Johnsson et al., 1991). Aproximadamente entre 10,000 y 17,000 unidades de resonancia (RU) de IL-13bc-Ig purificada, IgGl humana o del receptor irrelevante se inmovilizaron, cada una, de manera covalente a distintas células de flujo en el chip del sensor, como lo recomienda el fabricante. (Las RU son un reflejo de la masa de proteína unida a la superficie del chip del sensor) . La IL-13 purificada se inyectó a través de las células de flujo a 5 ul/min por 10 minutos en presencia o ausencia de IL-3bc-Ig purificada, en exceso. La unión se cuantificó como la diferencia en UR antes y después de la inyección de muestra. Se observó la unión específica de IL-13 de 481.9 RU sólo para la IL-13-Ig inmovilizada mientras que la coinyección de IL-13 más IL-13bc-Ig dio por resultado la no unión a la IL-13bc-Ig (4 RU) inmovilizada. No se observó ninguna unión de IL-13 para IL-llR-Ig o IgG inmovilizada (3.7 y 5.4 RU respectivamente). -i-L ... - "•^^ Ejemplo 4 Unión de IL-13 expresada en células COS a la proteína de fusión IL-13BC-Ig etiquetada: Detección in si tu de COS de IL-13 con IL-13bc-Fc Los vectores de expresión para IL-13, IL-4, IL-11 o vector vacío se transfectaron en células COS-1 en placas duplicadas vía el método dextrano de DEAE. Dos días después de la transfección, las células se lavaron dos veces en solución salina amortiguada de fosfato (PBSS) y se fijaron en la placa de cultivo por 10' a 4°C con metanol. Después de la fijación, las células se lavaron dos veces con PBS, se enjuagaron una vez con amortiguador de unión (PBS, albúmina de suero de bovino al 1% (peso/volumen) ) , 0.1% (azida de sodio (peso/volumen) y se incubaron por dos horas a 4°C en amortiguador de unión con IL-13bc-Fc a 1. Oug/ml o con antisuero anticitocina relevante. Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron a 4°C con agitación en IgG antihumano F(ab)2' de conejo etiquetado de fosfatasa alcalina, diluida a 1:500 en amortiguador de unión (por detección de fusión Fc) o IgG antirrata F(ab)2' de conejo (para detección de anticitocina) . Las células se lavaron nuevamente dos veces en PBS. Se observó la actividad de fosfatasa alcalina utilizando tetrazolio azul nitro y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato .

Se observó la unión específica bajo el microscopio. Sólo las células transfectadas con IL-13 mostraron unión específica a ILl3bc-Ig. (Ver la Figura de la foto de células transfectadas) .

Ejemplo 5 Otros sistemas para la determinación de actividad biológica de la proteína IL-13bc Pueden utilizarse otros sistemas para determinar si una proteína IL-13bc exhibe una "actividad biológica" de IL-13bc como se define aquí. Los siguientes son ejemplos de estos sistemas.

Análisis para la unión de IL-13 La habilidad de una proteína IL-13bc para unirse a la IL-13 o a un fragmento de la misma puede determinarse por cualquiera de los análisis adecuados que puedan detectar esta unión. A continuación se dan algunos ejemplos adecuados. La unión de IL-13 a la región extracelular de la proteína IL-13bc ocasionará específicamente una inducción rápida de fosfotirosina en la proteína receptora. Los análisis de la actividad de unión del ligando, medidos por inducción de fosforilación, se describen más adelante. De manera alternativa, se produce una proteína ' - " - - - - -&"-¿-«« a* IL-13bc (por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular) y se utiliza para detectar la unión de IL-13. Por ejemplo, se prepara una construcción de ADN en donde el dominio extracelular (truncado antes, de preferencia inmediatamente antes, del dominio de transmembrana pronosticado) se liga en marco a un ADN que codifica para los dominios de articulación CH2 y CH3 de una inmunoglobulina (Ig) l? humana. Esta construcción se genera en un vector de expresión apropiado para células COS, por ejemplo en pED?C o pMT2. El plásmido es transfectado de manera transitoria en células COS. La proteína de fusión IL-13bc-Ig secretada se recolecta en el medio condicionado y se purifica mediante cromatografía de proteína A. La proteína de fusión IL-13bc-Ig purificada se utiliza para demostrar la unión IL-13 en una variedad de aplicaciones. La IL-13 puede recubrirse en la superficie de una placa de análisis (ELISA) inmunoabsorbente ligado por enzimas, y después los sitios de unión adicionales pueden bloquearse con caseína o albúmina de suero de bovino utilizando amortiguadores estándar ELISA. La proteína de fusión IL-13bc-Ig se une entonces a la IL-13 de fase sólida y la unión se detecta con una Ig antihumana de cabra secundaria conjugada con peroxidasa de rábano. La actividad de la enzima específicamente unida puede medirse con un substrato colorimétrico, por ejemplo lecturas de absorbancia y tetrametil bencidina. IL-13 también puede expresarse en la superficie de células, por ejemplo proporcionando un dominio 5 transmembrana o enlace de inositol fosfatidil glucosilo (GPI) . Las células que expresan la IL-13 unida por membrana pueden identificarse utilizando la proteína de fusión IL-13bcIG. La fusión IL-13bc-Ig soluble se une a la superficie de estas células y se detecta con Ig antihumano 10 de cabra conjugada con un fluorocromo, por ejemplo citometría de flujo e isotiocianato de fluoresceína.

Trampa de interacción Puede utilizarse un método de selección genética 15 de levadura, la "trampa de interacción " [Gyuris et al, Cell 75:791-803, 1993] para determinar si una proteína IL- 13bc tiene actividad biológica de IL-13bc como se define aquí. En este sistema, la expresión de genes informadores tanto de LexAop-Leu2 como de LexAop-LacZ yace en la 20 interacción entre la proteína cebo, por ejemplo en este caso, una especie que interactúa con la IL-13bc humana y la presa, por ejemplo en este caso la proteína IL-13bc. Por lo tanto, uno puede medir la fuerza de la interacción por el nivel de la expresión Leu2 o LacZ. El método más simple 25 es medir la actividad de la proteína codificada LacZ, ß- ^^^^Má S ^ galactosidasa. Esta actividad puede juzgarse por el grado de color azul en el filtro o medio que contiene X-Gal. Para la medición cuantitativa de actividad ß-galactosidasa, pueden encontrarse análisis estándar en "Methods in Yeast Genetics" Cold Spring Harbor, New York, 1990 (de Rose, M.D., Winston, F. y Hieter, P.). En estos métodos, si uno desea determinar si la proteína Il-13bc interactúa con una especie en particular (por ejemplo con una proteína cistosólica que se une al dominio intracelular de la IL-13bc ín vivo) , esa especie puede utilizarse como el "cebo" en la trampa de interacción con la proteína IL-13bc que va a probarse sirviendo como la "presa" o viceversa.

Ejemplo 6 Inhibición de fibrosis utilizando IL-13R soluble El desarrollo de tejido fibroso es parte del proceso normal de curación después de un daño. Sin embargo, en algunas circunstancias hay una acumulación destructiva de colágeno excesivo que interfiere con la función normal del tejido afectado. La síntesis de colágeno y la cicatrización del tejido, de hecho, son las mayores manifestaciones patológicas de una variedad de enfermedades crónicas y debilitantes, incluyendo enfermedades infecciosas, alérgicas y autoinmunes graves17.

Mientras que existe un gran manejo de información de la mecánica relativa al proceso de la formación de tejido de cicatrización89, hay todavía grandes huecos en nuestra comprensión de la función de las citocinas y células inflamatorias en la iniciación del proceso fibrótico. Como se utiliza aquí, "fibrosis" incluye cualquier condición que involucre la formación de tejido fibroso (ya sea que esta formación sea deseable o no deseable). Estas condiciones incluyen, sin limitación: fibrositis, formación de fibromas ( fibromatosis) , fibrogénesis (incluyendo fibrogénesis pulmonar), fibroelastosis (incluyendo fibroelastosis endocardial) , formación de fibromiomas, anquilosis fibrosa, formación de fibroides, formación de fibroadenomas , formación de fibromixomas y fibroquistotitis (incluyendo fibrosis quística) . El complejo de receptor IL-13 está compuesto de por lo menos tres componentes distintos, entre los que se incluyen: el receptor IL-4, la cadena IL-13R0.1 de unión de afinidad baja y la cadena de unión de afinidad alta IL-13Ra235 2~4. Recientemente se preparó una proteína de fusión IL-13Ra2-Fc soluble y se ha utilizado con éxito para neutralizar IL-13 tanto in vitro5 como in vivo3039 1. Ya que la proteína de fusión une a la proteína de fusión IL-13 con alta afinidad pero no neutraliza a IL-4, la proteína ü-k-ü-á-á-M-á-tei ^^^ _^^ proporcionó una excelente herramienta para determinar las funciones específicas de IL-13. En el estudio presente, se utilizó el antagonista IL-13 en ratones con deficiencia de IL-4 y del tipo silvestre para separar las contribuciones de IL-13 y IL-4 para el desarrollo de fibrosis hepática en esquistosomiasis murina. En estos estudios, la formación de granuloma se examinó en detalle, enfocándose en el reclutamiento de células de mama y eosinófilos y, de manera más importante, el desarrollo de fibrosis inducida por huevos se cuantificó utilizando técnicas bioquímicas, histológicas y moleculares. También se examinaron las contribuciones de IL-4 e IL-13 para la regulación de respuestas de citocina del tipo Thl/Th2 tanto ín vitro en cultivos de nodo linfático mesentérico, como in vivo en hígados granulomatosos . Mientras que los resultados de este estudio muestran que IL-13 e IL-4 exhiben algunas actividades redundantes en patogénesis de esquistosomiasis, también se elucidaron claramente distintas funciones para ambas citocinas. Probablemente el hallazgo más novedoso e importante fue la observación de que IL-13, y no IL-4, fue la principal citocina del tipo Th2 que impulsa la producción de ARNm de colágeno del tipo I y del tipo III y la fibrosis hepática en ratones infectados. Por lo tanto, los resultados obtenidos establecen que un antagonista/inhibidor de IL-13, como por ejemplo sIL-13Ra2-Fc puede ser de beneficio terapéutico en la prevención de fibrosis, por ejemplo de la fibrosis asociada con enfermedad infecciosa crónica.

RESULTADOS Efecto comparativo de IL-4, IL-13 o deficiencias de IL-4/IL-13 doble en patogénesis de esquistosomiasis : el tratamiento con sIL-13Ra2-Fc reduce de manera significativa la fibrosis hepática en ratones infectados con S. mansoni . Para comparar las funciones reguladoras de IL-4 e IL-3 en la patogénesis de esquistosomiasis, se infectaron ratones deficientes en IL-4 y C57BL/6WT, por vía percutánea, con 25 cercarías de S . mansoni . Grupos de animales separados se trataron con sIL-13Ra2-Fc o con Fc control, como se describe en los Materiales y Métodos. Los tratamientos comenzaron en la semana 5, al inicio de la puesta de huevecillos y todos los animales se sacrificaron 8 semanas después de la infección y se examinaron respecto a los parámetros inmunológicos y parasíticos graves. Como se muestra en la Tabla III, los cuatro grupos de ratones desarrollaron cargas similares de gusanos y los huevecillos de tejidos producidos por par de gusanos no varió entre los grupos. En la semana 8 postinfección, el tiempo de la respuesta de tejido pico , los ratones WT no mostraron .U-k-aUát.^-^-^ cambio significativo en el tamaño del granuloma como resultado del bloqueo de IL-13 (Figura 2A) . De manera interesante, los ratones deficientes en IL-4 tratados con Fc control, no mostraron una respuesta granulomatosa reducida y, de hecho, los granulomas fueron significativamente más grandes en estos ratones. En un marcado contraste a estas observaciones, los ratones deficientes en IL-4 mostraron una respuesta granulomatosa notoriamente reducida cuando se inhibió la IL-13 (Figura 2A, a la extrema derecha) . De hecho, los ratones deficientes en IL-4 doble/tratados con sIL-13Ra2-Fc mostraron de 40% a 50% de reducción promedio en el volumen del granuloma en comparación con los animales WT control o tratados con sIL-13Ra2-Fc y más del 75% de reducción en comparación con ratones deficientes en IL-4 tratados con Fc control . La composición celular de las lesiones también se evaluó en secciones de hígado Giemsateñidas y, como se muestra en la Tabla III, los ratones deficientes en IL-4 mostraron una reducción marcada en células de mama asociadas al granuloma. En contraste, no hubo cambio en la cantidad de células de mama sólo por la inhibición de IL-13 y el bloqueo de IL-13 no tuvo efecto adicional sobre las cantidades ya altamente reducidas de células de mama en ratones deficientes en IL-4. De alguna manera similar, ya *.*....-_ ., ..«._......_, ..fci.- ....^a -.. .........A..- . * j¿i?Ha& se observaron resultados distintos cuando se evaluaron los eosinófilos asociados al granuloma (Figura 2B) . Aquí, las cantidades de eosinófilos aumentaron de 46% a 64% en ratones WT por medio del bloqueo de IL-13 y disminuyeron significativamente (28%) como consecuencia de la deficiencia de IL-4. A pesar de las funciones contrastantes aparentes para IL-13 e IL-14 en la eosinofilia de tejido, se observó un efecto inhibidor combinado aún más impactante cuando los ratones deficientes en IL-4 fueron tratados con el inhibidor de IL-13. En estos ratones, la cantidad promedio de eosinófilos de granuloma estuvo por debajo del 10%. Finalmente, no hubo cambio en el grado de necrosis de hígado asociada a huevecillos o parénquima en los animales WT contra los animales deficientes en IL-4, mientras que, tanto los grupos WT tratados con sIL-13Ra2-Fc como los deficientes en IL-4, mostraron marcadas reducciones en la necrosis parenquimal global . Tal vez de manera más importante, el tratamiento con solo sIL-13R 2-Fc redujo de manera significativa el contenido de colágeno de granulomas de hígado en ratones WT, según se valoró en secciones de tejido teñidas con rojo picrosirio (Tabla III y Figura 3) . En contraste, los ratones deficientes en IL-4 infectados no mostraron cambio detectable en la deposición de colágeno de granuloma por j__g|¡__t_ • ^ ttr. i ' *"* '""*"•*** medio de análisis microscópico. De manera interesante, parece que no existe función sinergística o combinada para IL-13 e IL-4 en este parámetro ya que no hubo diferencia significativa entre los ratones deficientes en IL-4 y WT tratados con sIL-13R 2-Fc (Tabla III) . La Figura 3 muestra que al mismo tiempo que se encontraron tamaños de granuloma, cargas de huevecillos de tejido y cantidades similares de gusanos en los ratones WT tratados con sIL-13Ra2-Fc y control, el bloqueo de IL-13 tuvo un efecto inhibidor substancial sobre la deposición de colágeno dentro del hígado. Finalmente, el grado de fibrosis hepática también se midió por medio de la valoración de los niveles de hidroxiprolina (Figura 2C) , lo cual es más cuantitativo que las técnicas histológicas descritas arriba. El antagonista de IL-13 soluble solo, disminuyó notoriamente los niveles de hidroxiprolina hepática, mientras que la deficiencia de IL-4 dio por resultado una reducción menos significativa. La deficiencia dual IL-4/IL-13 no redujo la hidroxiprolina a niveles por debajo de los ya observados en los ratones WT tratados con sIL-13Ra2-Fc (Figura 2C) , aunque hubo una tendencia ligera en un segundo estudio (no significativa) . Estos datos en conjunto demuestran que IL-13 es la citocina asociada a Th2 dominante, responsable del desarrollo de fibrosis hepática en esquistosomiasis murina.

.¡A , ^¿¡jfc^j La producción de citocina del tipo Th2 se reduce en ratones deficientes en IL-4 pero no afectados por la inhibición de IL-13. Mientras que es muy conocido que IL-4 es la citocina primaria que impulsa el desarrollo de células21,22 CD4+Th2, la función de IL-13 en la generación y mantenimiento de respuestas del tipo Th2 ha sido controversial y puede ser influenciada tanto por huéspedes genéticos como por el modelo de enfermedad infecciosa bajo estudio30,34,38. Por lo tanto, para determinar si los cambios inducidos por sIL-13Ra2-Fc en patología hepática se generaron por alteraciones en el balance de citocina Thl/Th2, se aislaron nodos linfáticos mesentéricos y bazos de ratones infectados, se prepararon suspensiones de una sola célula y se reestimularon los cultivos in vi tro con antígenos parásitos. Se expusieron cultivos celulares adicionales a antígenos parásitos en presencia de mAbs anti-CD4 para determinar si la producción de citocina fue dependiente de una respuesta celular CD4+T. Los sobrenadantes del cultivo se analizaron por ELISA para IL-4, IL-13, IL-5, IL-10 e IFN-?. Como podría pronosticarse15, los cultivos de bazo y mesentéricos (Figura 5) (no se muestran datos) preparados a partir de ratones WT mostraron una respuesta a citocina del tipo Th2 altamente polarizada. Estos produjeron niveles altos de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 y^^ j^^^^ en respuesta a estimulación SEA y poco o nada de IFN-?. Los ratones deficientes en IL-4 mostraron, en contraste, un perfil del tipo Thl/Th2 más mezclado. De hecho, una respuesta significativa a IFN-? específica de SEA se 5 detectó en ratones con deficiencia de IL-4, que es consistente con estudios previos2324. También se detectaron IL-13, IL-10 y, en menor grado, IL-5 en estos animales, aunque los niveles de estas citocinas fueron notoriamente disminuidas al compararse con ratones WT. De manera 10 importante, el mantenimiento de la respuesta baja pero significativa de IL-13 independiente de IL-4, explica probablemente la marcada respuesta granulomatosa que se mantiene en ausencia de IL-4 (Figura 2) . Sorprendentemente, a pesar de su marcado efecto inhibidor 15 sobre la fibrosis hepática, la sIL-13Ra2-Fc no tuvo efecto significativo sobre las respuestas de citocina del tipo Thl o Th2 ni en ratones WT ni en ratones deficientes en IL-4. Debe observarse también que en todos los casos, la producción de citocina fue altamente dependiente de una 20 respuesta celular CD4+T, ya que no se detectó ninguna expresión de citocina en ninguno de los cultivos estimulados por SEA y tratados con mAB anti CD4. 25 ,* W t mt h . . . .. . - -l ...^ . ,.-»„. , ^-a Cambios en la expresión de ARNm de citocina del tipo Thl/Th2 en hígados granulomatosos de ratones deficientes en IL-4 y tratados con sIL-13Ra2-Fc. Para determinar si un patrón similar de expresión 5 de citocina se observó in vivo en el sitio de formación del granuloma, se aisló ARNm de hígado proveniente de varios grupos de ratones a las 8 semanas posteriores a la infección y se efectuó RT-PCR cuantitativa. Como se muestra en la Figura 5 los ratones WT infectados mostraron 0 un fuerte perfil de ARNm de citocina del tipo Th2 que mostró aumentos marcados en ARNm de IL-4, IL-13, IL-5 e IL- 10. Los ratones WT mostraron también aumentos modestos en la expresión de ARNm de IFN-?, que fue consistente con las observaciones previas19. En contraste con estos resultados, 5 los niveles de ARNm de IL-13 e IL-5 fueron mucho más bajos en ratones deficientes en IL-4, mientras que el ARNm de TNF-a e IL-10 aumentó significativamente y la expresión de ARNm de IFN-? no cambió. Nuevamente, al igual que los resultados in vitro obtenidos de cultivos de esplenocito y 0 nodo linfático mesentérico, el bloqueo de IL-13 no tuvieron efecto significativo sobre el patrón de expresión de ARNm de citocina ya sea en ratones WT o deficientes en IL-4. Hubo, sin embargo, un aumento modesto en los niveles de ARNm de IL-10 en ratones deficientes en IL-4 tratados con 5 la sIL-13Ra2-Fc aunque no es probable que esto explique las disminuciones de fibrosis, ya que se detectaron niveles altamente divergentes de IL-10 en ratones WT tratados con sIL-13Ra2-Fc contra ratones deficientes en IL-4, y se observó además una disminución similar de fibrosis. La expresión de ARNm de TGF-ß2 y TGF-ßl también se examinó en los tejidos granulomatosos, sin embargo no se observaron diferencias significativas ni en ratones deficientes en IL- 4 infectados o en animales tratados con sIL-13Ra2-Fc (no se muestran los datos) .

Los niveles de ARNm de colágeno I y colágeno III se reducen en los hígados de ratones tratados con sIL-13Ra2-Fc pero no afectados por deficiencia en IL-4. Los estudios in vi tro e in vivo descritos en lo anterior, sugirieron que es improbable que se explique el efecto antifibrótico de sIL-13Ra2-Fc por los cambios en la expresión de citocina del tipo Thl o Th2. Por lo tanto, en experimentos subsecuentes, se investigaron los patrones de la expresión de ARNm de colágeno I (Col I) y de colágeno III (Col III) para determinar si la reacción de fibrosis, inducida por sIL-13Ra2-Fc, estuvo acompañada por cambios directos en la expresión de estos dos importantes genes19 de producción de colágeno. Como se muestra en la Figura 6, el bloqueo de IL-13 redujo significativamente la expresión de |^ ARNm de Col I y Col III tanto en ratones WT como deficientes de IL-4. No hubo cambio en los ARNm de Col I y Col III de los niveles inducidos por infección en ratones deficientes en IL-4 y en comparación con ratones WT 5 tratados con sIL-13Ra2-Fc, no hubo reducción adicional en ratones deficientes en IL-4 tratados de manera similar.

IL-13 estimula la producción de colágeno en fibroblastos 3T3 de ratón. 10 Habiendo mostrado que el bloque de IL-13 in vivo redujo significativamente la expresión de ARNm de Col I y Col III en el hígado de ratones deficientes en IL-4 y WT infectados, se deseaba determinar si IL-13 estimularía directamente la síntesis de colágeno en fibrolastos. Para 15 responder esta pregunta, se examinó la inducción de colágenos del tipo I en fibroblastos 3T3 murinos mediante teñido Western. Como se muestra en la Figura 7, IL-13 indujo la síntesis de colágeno 48 horas después de la estimulación. Se detectó una cantidad mínima de colágeno 20 del tipo I en células no estimuladas (Figura 7, carril 1) o en puntos de tiempo tempranos en los cultivos activados por citocina (datos no mostrados) . IL-4 indujo también la síntesis de colágeno I (carril 2) y altos niveles de colágeno secretado se detectaron fácilmente en los 25 sobrenadantes obtenidos de ambos cultivos estimulados por ^^^^tf a^H^ citocina (datos no mostrados) . La especificidad de la reacción se confirmó utilizando colágeno purificado del tipo I (carril 5) y tratamientos de colagenasa bacterial mostraron que los anticuerpos fueron específicos para colágeno (datos no mostrados) .

ANÁLISIS Un patrón de citocina del tipo Th2 CD4+ domina la respuesta inmune en ratones infectados con S. mansoni12 " . Estudios previos sobre agotamiento de IL-4 y experimentos con ratones deficientes en IL-4 sin embargo, no mostraron una función indispensable para esta citocina en la patogénesis de esquistosomiasis152324. De hecho, mientras que en algunos estudios15 se observó una reducción parcial de fibrosis, la formación de granuloma inducido por huevecillos podría continuar en la ausencia completa de IL-42324. En contraste con estas observaciones, la formación de granuloma y el desarrollo de fibrosis hepática se deterioró gravemente en ratones deficientes en Stat616, que muestra un mayor defecto en la producción de varias citocinas asociadas a Th245. IL-4 e IL-13 envían señales a través de Statd, por lo tanto las diferencias aparentes en la patología observada entre ratones deficientes en Statß y deficientes en IL-4 infectados pueden explicarse por IL-13. Sin embargo, las contribuciones distintas de IL-4 e IL-13 •* **" - __^^t__ en el avance de la enfermedad no pueden discernirse a partir de estudios en ratones deficientes en IL-4 o Stat6 solos. En este estudio se utilizó un inhibidor potente de IL-13 en ratones deficientes en IL-4 y WT infectados y demostró que IL-13 e IL-4 exhiben funciones únicas y redundantes en la patogénesis de esquistosomiasis. Diversos estudios han mostrado que esa respuesta de citocina del tipo Th2 puede desarrollarse in vivo en ausencia de IL-4 o del receptor IL-426,39, lo que es consistente con nuestros resultados ya que se detectó la expresión reducida pero significativa de IL-13, IL-10 e IL-5 en nodos (Figura 4) e hígados (Figura 5) de nodos linfáticos mesentéricos de ratones deficientes en IL-4 infectados. Su producción también fue altamente dependiente de una respuesta celular T CD4+ (Figura 4), que indica además que se estableció una respuesta del tipo Th2 convencional. Estos resultados proporcionan evidencia de que, mientras que la expresión IL-13 máxima es dependiente de IL-4, la producción continuada de IL-13 podría explicar el mantenimiento de una respuesta granulomatosa significativa en ausencia de IL-423"25. De hecho, mientras que la IL-13 de bloqueo sola no afecta el tamaño del granuloma en ratones WT, la inhibición de la IL-13 residual en ratones deficientes en IL-4 dio por resultado una reducción marcada y altamente significativa del volumen del granuloma (Figura 2A) . Estos resultados demuestran que IL-4 e IL-13 son suficientes para mediar el desarrollo del granuloma y explican formalmente la producción de granulomas en ratones deficientes en IL-4 contra la falta casi completa de granulomas en ratones deficientes en Stat61624. También soportan los resultados recientes en el modelo de granuloma de huevecillo pulmonar30. Debido a que los granulomas desempeñan una función importante de protección al huésped separando con una pared las hepatotoxinas potencialmente letales liberadas por los huevecillos47, el huésped puede haber incluido mecanismos redundantes para la formación de granuloma a fin de asegurar una relación favorable huésped-parásito. Mientras que estas observaciones demuestran claramente que IL-4 e IL-13 participan en forma activa en la formación del granuloma, las funciones únicas para ambas citocinas en el reclutamiento de célula de mama, eosinofilia de tejido y, de manera más importante, en estos estudios se reveló la generación de fibrosis hepática. Los exámenes histológicos de secciones de hígado de ratones infectados demostraron que no se requiere IL-13 para la diferenciación y reclutamiento de células de mama (Tabla III) o eosinofilas (Figura 2B) , ya que los granulomas de ratones WT tratados con sIL-13Ra2-Fc no mostraron disminución en ningún tipo de células. De hecho, las ~? . _^|¡gfe|^ cantidades de eosinofilas se aumentaron de manera significativa en las lesiones de ratones WT inhibidos en IL-13 (Figura 2B) , lo que sugiere que IL-13 puede antagonizar parcialmente este efecto. En contraste, las células de mama estuvieron ausentes casi por completo de las lesiones en ratones deficientes en IL-4 y los eosinófilos disminuyeron aproximadamente en un 50%. De manera interesante, IL-13 parece soportar parcialmente la reducida pero significativa eosinofilia de tejido inducida por huevecillos en ratones deficientes en IL-4 ya que los eosinófilos se redujeron hasta por debajo del 10% en los animales tratados con sIL-13Ra2-Fc/deficientes en IL-4. No obstante, estos datos indican que IL-4 es la citocina dominante responsable del desarrollo de poblaciones celulares de mama y eosinófilos dentro de los granulomas. Probablemente el avance más importante de este estudio fue el descubrimiento de que la fibrosis hepática podría bloquearse por sIL-13Ra2-Fc . De hecho, las técnicas moleculares (Figura 6), bioquímicas (Figura 2C) y de microscopio (Tabla III) indican que IL-13, y no IL-4, desempeñan la función más importante en el desarrollo de fibrosis hepática inducida por huevecillos. Estudios previos mostraron que el balance de citocina de Thl/Th2 puede afectar de manera significativa el grado de fibrosis de tejido en ratones infectados S. mansoni19. No obstante, este estudio sugiere que los efectos de sIL-13Ra2-Fc no fueron mediados por un sesgo en la respuesta de citocina de célula Th. La IL-13 de bloqueo no tuvo efecto significativo sobre la producción de IFN-?, IL-4, IL-5, IL- 5 10 o IL-13 por nodo linfático mesentérico (Figura 4) o células de bazo in vi tro y tampoco hubo cambio en la expresión del ARNm de citocina in vivo, en el sitio de formación de la lesión (Figura 5) . En contraste con estas observaciones, los ratones deficientes en IL-4 mostraron 10 una respuesta de IFN-? aumentada en los nodos linfáticos de drenado (Figura 4) y una expresión de IL-5 e IL-3 disminuida tanto en los nodos linfáticos (Figura 4) como en el hígado (Figura 5) . Por lo tanto, la reducción ligera de fibrosis detectada en ratones deficientes en IL-4 por medio 15 de análisis de hidroxiprolina (Figura 2C) puede ser atribuíble a la producción disminuida de IL-13. El hecho de que la producción de IL-4 no fuera afectada por el bloqueo de IL-13, y que además la fibrosis se redujera al mínimo en estos animales enfatiza el función importante 20 desempeñada por IL-13. De hecho, los ratones deficientes en IL-4 tratados con sIL-13Ra2-Fc mostraron poco aumento adicional en los niveles de hidroxiprolina (Figura 2C) y ninguna diferencia en la expresión de ARNm de Colágeno I o III (Figura 6), sobre lo observado en ratones WT tratados 25 de manera similar. Tampoco hubo cambio alguno en la mt¡ É^n^m ? expresión de ARNm de Colágeno I o II en ratones deficientes en IL-4 tratados con Fc control en comparación con animales WT, además de enfatizar la contribución de IL-4. Más aún, los estudios in vi tro con células 3T3 demostraron por primera vez, la capacidad de IL-13 para estimular la producción de colágeno en fibroblastos (Figura 7), por lo tanto, los efectos de IL-13 sobre la fibrosis pueden ser más directos y no depender de las modulaciones en la respuesta de citocina Thl/Th2. En apoyo de esta conclusión, estudios recientes demostraron que los receptores de IL-13 se expresan en fibroblastos32 y que IL-13 aumentan la molécula de adhesión y la expresión de citocina inflamatoria en fibroblastos de pulmón humano48. Finalmente, aunque IL-13 (Figura 7) e IL-449 son capaces de promover la producción de colágeno en fibroblastos, el hecho de que las células de nodo linfático cultivadas produjeron casi 100 veces más IL-13 que IL-4 (Figura 4), sólo sirve para enfatizar la contribución potencialmente importante de IL-13 en este proceso. De hecho, los estudios en el modelo de granuloma pulmonar revelaron que la expresión del ARNm de IL-4 se regula más estrechamente en el sitio de formación de la lesión, mientras que la inducción del ARNm de IL-13 es mucho más sostenida a través del tiempo30. No obstante, no se ha examinado la cinética de la expresión de ARNm de IL-13 e IL-4 en animales infectados, por lo tanto no se puede decir si un patrón similar se lleva a cabo en los hígados granulomatosos . También se mostró recientemente que IL-13 es importante para la resistencia contra nematodos intestinales27,37"39. Los estudios en ratones deficientes en IL-1337,38 e IL439 sugirieron que IL-13, en contraste con IL-4, desempeña una función de requisito en la expulsión tanto de N. brasiliensis como de T. muris . No obstante, el mecanismo específico de expulsión de gusanos continúa siendo desconocido, aunque se han sugerido los cambios inducidos por IL-13 e IL-4 en células epiteliales y la fisiología del intestino como los blancos posibles50,51. La IL-13 también realiza una función central en modelos de asma murina. En estos estudios, se encontró que IL-13 es necesaria y suficiente para la expresión de asma alérgica40,41. La hipertrofia de músculo liso de las vías aéreas y la fibrosis subepitelial son características normales del asma crónica severa5 y la fibrosis pulmonar crónica se asocia con la producción de colágeno del tipo III y del tipo I en las primeras y últimas etapas de la enfermedad, respectivamente. Por lo tanto, el enlace entre IL-13 y fibrosis revelado en este estudio elucida la etiología de varias enfermedades humanas importantes y proporciona formas de tratamiento más efectivas de enfermedades fibróticas en general.

Estos estudios previos mostraron que una respuesta de memoria de Thl inducida por IL-12 específica de huevecillo podría reducir en forma efectiva la fibrosis hepática en ratones infectados subsecuentemente19. La reducción de la patología estuvo acompañada por una conexión en la respuesta de Th2 normal con una dominada por citocinas del tipo Thl. Los resultados del estudio actual sugieren que los efectos antipatología de este protocolo de vacunación con base en IL-12 pueden explicarse por la inhibición de IL-13. De manera interesante, un segundo estudio donde se utilizó un protocolo diferente mostró que inyecciones repetidas de rIL-12 proporcionadas de 6 a 8 semanas, durante la fase dominada por Th2 del desarrollo de granuloma, resultó casi completamente ineficaz en la formación de granuloma y fibrosis52. Estudios relacionados han sugerido que IL-12 es menos capaz de modular respuestas establecidas del tipo Th253, lo que probablemente explica la imposibilidad de modular la patología en el último estudio52. En contraste con estos resultados, sIL-13R0C2-Fc resultó extremadamente efectiva para reducir la fibrosis hepática, aún cuando se administró sólo durante las etapas tardías de la infección. Estos hallazgos indican que el antagonismo de IL-13 es un enfoque terapéutico mucho más efectivo para reducir la fibrosis en situaciones en donde las respuestas inmunes patogénicas del tipo Th2 ya se han establecido. En resumen, nuestros resultados proporcionan evidencia de que los inhibidores de IL-13, por ejemplo la sIL-13Ra2-Fc, son de beneficio terapéutico general que evitan la fibrosis asociada con infecciones crónicas y demuestran la función importante y no redundante de IL-13 en la patogénesis de esquistosomiasis.

MÉTODOS Animales, parásitos y preparaciones Ag Se obtuvieron ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad deficientes en IL-4 y C57BL/6 (C57BL/6 de fondo, 10o. retrocruce) de Taconic Farras , Inc. (Germantown, NY) . Todos los ratones se alojaron en una Asociación americana NIH para la acreditación de instalación para animales aprobada para el cuidado de animales de laboratorio (NIH American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care-approved) en jaulas estériles con filtro en la parte superior y se mantuvieron en agua estéril. Cercarías de una cepa de Puerto Rico de Schistosoma mansoni (NMRI) se obtuvieron de caracoles Biomphalaria glabra ta infectados (Biomedical Research Institute, Rockville, MD) . El antígeno de huevecillo soluble (SEA) se purificó de huevecillos homogenizados , como se describió anteriormente15.

• M uí- p rirt Reactivos La proteína de fusión de a2-Fc del receptor IL-13 soluble (sIL-13Ra2-Fc) se preparó como se describió anteriormente35 y se proporcionó por Genetics Institute, 5 Cambridge MA. La contaminación de endotoxina fue de <2 EU/mg, según se determinó con el análisis Cape Cod Associates LAL (Limulus Amebocyte Lysate, Woods Hole, MA) . La ID50 in vi tro, según se determinó por la habilidad de neutralizar 3ng/ml de IL-13 murina en el ensayo de 10 proliferación B9 , fue de aproximadamente 10 ng/ml. IgG humano (Fc control), que se utilizó como control para sIL- 13Ra2-Fc, se purificó por afinidad mediante cromatografía sefarosa A de proteína recombinante, como se describe para sIL-13Ra2-Fc35. Según se describió en lo anterior, el Fc 15 control no tuvo efecto detectable sobre la expresión de citocina o patología en ratones infectados30.

Infección y tratamientos Los ratones fueron infectados por inoculación 20 percutánea de piel de cola por 40 minutos en agua conteniendo entre 20 y 25 cercarías. Los animales fueron tratados, ya sea con un Fc control o con la sIL-13Ra2-Fc mediante inyección i.p. en 0.5 ml de PBS, todos los días después del inicio de la producción de huevecillos (semana 25 5) . La concentración óptima para el uso in vivo (200 ^^ HÜHl ?i_tt------i?áii8_a_íi_?_. µg/ratón/día) se seleccionó con base en ensayos cinéticos y en experimentos de respuesta a dosis en ratones inyectados con huevecillos sensibilizados/i . v.30. Se recolectó el suero de ratones el día del sacrificio. Todos los animales fueron sacrificados mediante administración i.p. de pentobarbital de sodio (18mg/ratón, Sigma, St. Louis, MO) a la semana 8 y se perfusionaron con solución salina citratada para valorar las cargas de gusanos15. No se observó mortandad entre ningunos de los grupos tratados.

Medición de fibrosis e histopatología Para la medición de granulomas, aproximadamente la mitad del hígado se fijó con fijador Bouin-Hollande y se procesó como se describió anteriormente15. Se determinó el tamaño de los granulomas hepáticos en secciones histológicas teñidas por teñido Giemsa de Wright (Histopath of America, Clinton, MD) . El diámetro de cada granuloma que contenía un solo huevecillo viable se midió con un micrómetro ocular y el volumen de cada granuloma calculado que asumía una forma esférica. Se utilizó la media del diámetro más grande y el diámetro perpendicular con respecto a ése. El porcentaje de eosinófilos, células de mama y otros tipos de célula se evaluaron en las mismas secciones. La necrosis parenquimal se calificó en una escala de 0-4, siendo el 0 la menor necrosis y el 4 la más '«-1 ' -«o*--*-»-**.*». * - . s -• «*-««£» extensa. También se asignó la frecuencia de células de mama en una escala similar, utilizando un intervalo de 0-4. El número de huevecillos de esquistosomas en el hígado e intestino y el contenido de colágeno en el hígado, determinados como hidroxiprolina, se midieron como se describe anteriormente15. La fibrosis también se calificó histológicamente utilizando secciones teñidas con rojo picrosirio. El reactivo de picrosirio tiñe específicamente el colágeno y cuando las secciones se observaron bajo luz de polarización, se iluminaron las áreas brillantes en donde se depositó el colágeno. Todos los granulomas dentro de cada sección se calificaron respecto a la "densidad" de picrosirio (rojo) con base en una escala de 1 a 4 , y una segunda medición del "área involucrada" también se determinó utilizando la misma escala. La calificación de fibrosis total se determinó multiplicando la densidad y área por cada granuloma (es decir, una calificación de 16 sería la máxima) . Un promedio de 30 granulomas por ratón se incluyen en todos los análisis. Para el control de consistencia, el mismo individuo fue calificado en todas las características histológicas y no hubo conocimiento del diseño experimental Aislamiento y purificación del ARN Dos porciones del hígado de cada animal se ri^M^riHtMHM_? iTilf i - ""**-»""'-- — - combinaron y se colocaron en 1 ml de RNA-STAT 60 (Tel- Test) , se congelaron en hielo seco y se mantuvieron a -70°C hasta su uso. Los tejidos se homogeneizaron utilizando un politrón de tejido (Omni International Inc., Waterbury, CT) 5 y se extrajo el ARN total siguiendo las recomendaciones del fabricante. El ARN se resuspendió en agua tratada con DEPC y se cuantificó por espectrofotometrla .

Detección de RT-PCR de ARNm de citocina 10 Se utilizó un procedimiento RT-PCR para determinar las cantidades relativas de ARNm para IL-4, IL- 5, IL-10, IL-13, IFN-?, colágeno I, colágeno III, TGFßl, TGFß2 y HPRT (hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa) . El ADNc se obtuvo después de la 15 transcripción inversa de 1 g de ARN, según se describe14. Los cebadores y sondas para todos los genes se publicaron previamente1 1954. Los ciclos de PCR utilizados para cada citocina fueron como sigue: IL-4 (33), IL-5 (31), IFN- ?(29), colágeno I (26), colágeno III (22), TGFßl (34), 20 TGFß2 (34) y HPRT (23).

Análisis y cuantificación de productos PCR El ADN amplificado se analizó por electroforésis, teñido Southern e hibridización con sondas específicas de 25 citocina no radioactivas, según se describió en lo MliíiMmIM^BBmHM.t.mMmÍfcMMMi^Miiiitf' ' i " irtfnh" anterior14. Los productos PCR se detectaron utilizando un sistema de detección ECL (Amersham) . Las señales quimioluminiscentes se cuantificaron utilizando un escáner de lecho plano (Microtek modelo 600 ZS, Torrance, CA) . La 5 .cantidad de producto PCR se determinó comparando la proporción de densidad de señal específica de citocina con la densidad de señal específica de HPRT para muestras individuales. Las unidades densitométricas arbitrarias para las muestras individuales se multiplicaron 10 subsecuentemente por un factor de 100.

Cultivos in vitro Se extrajeron bazos y células de nodo linfático mesentérico (MLN) de los ratones y se prepararon 15 suspensiones de una sola célula. Los glóbulos rojos se usaron mediante tratamiento osmótico con amortiguador de lisado ACK (Biofluids, Inc., Rockville, MD) . Se colocaron las células en medio RPMl 1640 suplementado con FCS al 10%, glutamina 2mM, 100 U/ml de penicilina, 10 µg/ml de 20 estreptomicina, 25 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sodio, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales y 50 µM 2-ME a 37°C en C02 al 5%. Las células se colocaron en placas de 24 pozos (3 x 106/ml) y se estimularon con SEA (20 µg/ml) y los sobrenadantes se recolectaron después de 72 horas para 25 medir los niveles de IL-4, IL-5, IL-10 IL-13 e IFN-?. ada*_Mtifli_te_ittte Cultivos estimulados con SEA adicionales también se trataron con 50 µg/ml de mAb anti-CD4 (GK1.5). Los cultivos tratados con mAB anti-CD4 solo no mostraron cambio en la expresión de citocina en comparación con lo observado en cultivos de control de medio (datos no mostrados) . IL-5, IL-10 e IFN-? se midieron utilizando ELISA de emparedado especifico15. Los niveles de IL-13 se midieron utilizando estuches ELISA de IL-13 murina (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Se calcularon los niveles de citocina de las curvas preparadas con citocinas recombinantes. IL-4 se midió utilizando la línea celular CT.4S sensible a IL-4. La proliferación de estas células se cuantificó por la incorporación de (3H)TdR y la cantidad de citocina se determinó por comparación con cantidades conocidas de IL-4 recombinante.

Detección de teñido Western de colágeno I Se cultivaron fibroblastos 3T3 en medio 1640 RPMl suplementado con FCS al 10%, 2mM glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 25 mM de HEPES, lmM de piruvato de sodio, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales y 50 µM 2-ME a 37°C en C02 al 5%. Las células confluentes se colocaron en placas de 24 pozos (500,000 células/ml) y se estimularon con IL-4 (1000 U/ml) o rIL-13 (R&D Systems, Mineápolis, MN) (20 ng/ml) por 6, 24 y 48 horas. Los sobrenadantes de cultivo se recolectaron para analizar el colágeno I secretado. Las células se lavaron una vez con solución salina amortiguada con fosfato y se lisaron con amortiguador muestra SDS-PAGE. Los lisados celulares y los sobrenadantes de cultivo se sometieron a separación electroforética en geles de tris-glicina al 6% (Novel Experimental Technology, San Diego, CA) utilizando condiciones de reducción y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Keene, NH) . Los teñidos se sondearon con colágeno del tipo I antirratón IgG de conejo (biodesign International, Kennenbunk, ME) e IgG anticonejo etiquetada con peroxidasa (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) se utilizó como un segundo Ab. Las bandas se visualizaron utilizando un reactivo de quimioluminiscencia de teñido western (NEN Life Science Products, Boston, MA) . Para confirmar la identidad de las bandas de colágeno, los lisados celulares se trataron con 0.5 mg/ml de colagenasa (Boehringer Mannheim, Indianápolis , IN) en PBS, suplementada con 1 mM de CaCl2 y FCS al 1% durante 1 hora a 37°C. Una preparación de colágeno I de rata purificada se utilizó también como control.

Estadísticas Se compararon las cantidades de huevecillos y gusanos de Schistosome, los cambios en el ARNm de citocina y los valores para proteínas de citocina secretadas, utilizando la prueba t de dos colas de Student. Se comparó la fibrosis hepática por análisis de covarianza utilizando el registro de huevecillos de hígado totales como la 5 covariante y el registro de hidroxiprolina por huevecillo, p<0.05 se consideró significativo.

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Todas las referencias de patentes y de literatura e incorporan como referencia, en su totalidad. -b-M-l-i-i yyyyfi

Claims

REIVINDICACIONES I 1. Un método para el tratamiento de fibrosis tisular en un sujeto mamífero, el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende una proteína y un portador farmacéuticamente aceptable en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2; (b) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 22 a 334; (c) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; de los aminoácidos 357 a 383; (d) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 ; (e) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 26 a 341; (f) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 363 a 380; y (g) fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de unión del receptor de IL-13. 2. El método según la reivindicación 1, en donde la fibrosis tisular afecta a un tejido seleccionado del grupo que consiste de: hígado, epidermis, endodermis, músculo, tendón, cartílago, tejido cardiaco, tejido pancreático, tejido pulmonar, tejido uterino, tejido neural, testis, ovario, glándula adrenal, arteria, vena, colon, intestino delgado, tracto biliar e intestino. 3. El método según la reivindicación 2, en donde el tejido es hígado. 4. El método según la reivindicación 2, en donde la fibrosis es la que resulta de la infección con esquistosoma. 5. El método según la reivindicación 1, en donde la fibrosis es la que resulta de la cicatrización de una herida. 6. Un método para inhibir la formación de fibrosis tisular en un sujeto mamífero, el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende una proteína y un portador farmacéuticamente aceptable en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; (b) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 22 a 334; (c) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; de los aminoácidos 357 a 383; (d) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 ; (e) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 26 a 341; (f) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 363 a 380; y (g) fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de unión del receptor de IL-13. 7. El método según la reivindicación 6, en donde la fibrosis tisular afecta a un tejido seleccionado del grupo que consiste de: hígado, epidermis, endodermis, músculo, tendón, cartílago, tejido cardiaco, tejido pancreático, tejido pulmonar, tejido uterino, tejido neural, testis, ovario, glándula adrenal, arteria, vena, colon, intestino delgado, tracto biliar e intestino. 8. El método según la reivindicación 7, en donde el tejido es hígado. 9. El método según la reivindicación 7, en donde la fibrosis es la que resulta de la infección con esquistosoma. 10. El método según la reivindicación 6, en donde la fibrosis es la que resulta de la cicatrización de una herida. ^^^ 11. El método según la reivindicación 10, en donde la herida es una incisión quirúrgica. 12. El método según la reivindicación 5, en donde la herida es una incisión quirúrgica. 5 13. Un método para el tratamiento de fibrosis tisular en un sujeto mamífero, el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende: (a) una molécula seleccionada del grupo que consiste de un antagonista de 10 IL-13 y un antagonista de IL-4 y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. 14. El método según la reivindicación 13, en donde el antagonista se selecciona del grupo que consiste de una proteína Il-13bc, una forma soluble de IL-13RC.1, un 15 anticuerpo para IL-13 o un fragmento de unión de IL-13 del mismo, un anticuerpo para IL-13bc o un fragmento de unión de IL-13bc del mismo, un anticuerpo para IL-13R0.1 o un fragmento de unión de IL-13R0.1 del mismo, mutantes de unión de IL-13R de IL-4, una molécula pequeña capaz de inhibir la 20 interacción de IL-13 con IL-13bc y una molécula pequeña capaz de inhibir la interacción de IL-13 con IL-13Ral. 15. El método según la reivindicación 14, en donde la proteína IL-13bc es una proteína que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste 25 de : ^^^ßüH [a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; (b) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 22 a 334; 5 (c) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2; de los aminoácidos 357 a 383; (d) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 ; (e) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 10 de los aminoácidos 26 a 341; (f) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4 de los aminoácidos 363 a 380; y (g) fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de unión del receptor de 15 IL-13. 16. El método según la reivindicación 13, en donde la fibrosis tisular afecta a un tejido seleccionado del grupo que consiste de: hígado, epidermis, endodermis, músculo, tendón, cartílago, tejido cardiaco, tejido 20 pancreático, tejido pulmonar, tejido uterino, tejido neural, testis, ovario, glándula adrenal, arteria, vena, colon, intestino delgado, tracto biliar e intestino. 17. El método según la reivindicación 16, en donde el tejido es hígado. 25 18. El método según la reivindicación 17, en donde la fibrosis es la que resulta de la infección con esquistosoma . 19. El método según la reivindicación 13, en donde la fibrosis es la que resulta de la cicatrización de una herida. 20. El método según la reivindicación 19, en donde la herida es una incisión quirúrgica. 21. Un método para inhibir la formación de fibrosis tisular en un sujeto mamífero, el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende: (a) una molécula seleccionada del grupo que consiste de un antagonista de IL-13 y un antagonista de IL-4 y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. 22. El método según la reivindicación 21, en donde el antagonista se selecciona del grupo que consiste de una proteína IL-13bc, una forma soluble de IL-13R0C1, un anticuerpo para IL-13 o un fragmento de unión de IL-13 del mismo, un anticuerpo para IL-13bc o un fragmento de unión de IL-13bc del mismo, un anticuerpo para IL-13R0.1 o un fragmento de unión de IL-13Ral del mismo, mutantes de unión de IL-13R de IL-4, una molécula pequeña capaz de inhibir la interacción de IL-13 con IL-13bc y una molécula pequeña capaz de inhibir la interacción de IL-13 con IL-13R0C1. 23. El método según la reivindicación 22, en donde la proteína IL-13bc es una proteína que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; (b) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 de los aminoácidos 22 a 334; (c) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 2 ; de los aminoácidos 357 a 383; (d) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 ; (e) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 26 a 341; (f) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO : 4 de los aminoácidos 363 a 380; y (g) fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de unión del receptor de IL-13. 24. El método según la reivindicación 21, en donde la fibrosis tisular afecta a un tejido seleccionado del grupo que consiste de: hígado, epidermis, endodermis, músculo, tendón, cartílago, tejido cardiaco, tejido pancreático, tejido pulmonar, tejido uterino, tejido neural, testis, ovario, glándula adrenal, arteria, vena, colon, intestino delgado, tracto biliar e intestino. llfcA^ 25. El método según la reivindicación 24, en donde el tejido es hígado. 26. El método según la reivindicación 25, en donde la fibrosis es la que resulta de la infección con esquistosoma. 27. El método según la reivindicación 21, en donde la fibrosis es la que resulta de la cicatrización de una herida. 28. El método según la reivindicación 27, en donde la herida es una incisión quirúrgica. 29. El método según la reivindicación 21, en donde el antagonista se selecciona del grupo que consiste de una forma soluble de IL-4R, un anticuerpo para IL-4 o un fragmento de unión de IL-4 del mismo, un anticuerpo para IL-4R o un fragmento de unión de IL-4R del mismo, una molécula pequeña capaz de inhibir la interacción de IL-4 con IL-4R. 30. El método según la reivindicación 13, en donde el antagonista se selecciona del grupo que consiste de una forma soluble de IL-4R, un anticuerpo para IL-4 o un fragmento de unión de IL-4 del mismo, un anticuerpo para IL-4R o un fragmento de unión de IL-4R del mismo, una molécula pequeña capaz de inhibir la interacción de IL-4 con IL-4R. ltlfr - ... -, -*:.. . . i 4 i y.