WO2018199595A1 - 4-1bbl 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질 - Google Patents

4-1bbl 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질 Download PDF

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WO2018199595A1
WO2018199595A1 PCT/KR2018/004745 KR2018004745W WO2018199595A1 WO 2018199595 A1 WO2018199595 A1 WO 2018199595A1 KR 2018004745 W KR2018004745 W KR 2018004745W WO 2018199595 A1 WO2018199595 A1 WO 2018199595A1
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WO
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seq
1bbl
fragment
fusion protein
type
Prior art date
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PCT/KR2018/004745
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문지원
박은주
신은주
임혜성
이해준
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주식회사 제넥신
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Publication date
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/54—Interleukins [IL]
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    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention is directed to novel 4-1BBL variants and fusion proteins comprising them.
  • 4-1BB ligand (4-1BBL, CD137L) is a membrane protein belonging to the tumor necrosis factor superfami ly. Recently, efforts have been made to use 4-1BBL as an anticancer agent. However, monomeric recombinant 4-1BBL is known to have low affinity with 4-1BB protein.
  • Protein that can form complexes to prepare 4-1BBL trimers conventionally Domain was used.
  • two or one 4-1BBLs were fused to the heavy and light chain regions of the Fc terminus to induce 2 + 1 or 1 + 2.
  • the length of the linker was adjusted. Recently, a technique for introducing artificial disulfide bonds between molecules has been disclosed (W0 2016/029043), but there is still a need for the development of a highly stable and effective 4-1BBL trimer.
  • the present inventors prepared 4-1BBL variants having a trimer structure stabilized by introducing mutations at new positions in the 4-1BBL sequence to form artificial bonds.
  • the present invention was completed by confirming that the fusion protein attached with the protein having various activities to the trimer shows excellent pharmacological effect.
  • an object of the present invention is to provide a fusion protein in which an active protein is bound to a 4-1BBL variant, a trimer, variant or trimer thereof, wherein a specific position of wild type 4-1BBL is substituted with cysteine.
  • the 4-1BBL variant or a fragment thereof; and an active protein Provides a type 1 fusion protein. Also provided is a trimer of 4-1BBL variant or fragment thereof comprising the 4-1BBL variant or fragment thereof. In addition, it provides a type 2 fusion protein comprising the trimer and the active protein.
  • the 4-1BBL variant or a fragment thereof provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or infectious disease comprising any one of the protein selected from the group consisting of the crab type 1 fusion protein trimer.
  • Variants of the 4-1BBL of the present invention may form structurally stable trimers.
  • the variant trimer of 4-1BBL can effectively bind 4-1BB in the individual.
  • various active proteins when various active proteins are bound to the mutant trimer of 4-1BBL, it can be used as an anticancer composition or a composition for preventing or treating infectious diseases.
  • La is a schematic diagram showing a specific example of the wild type (wild type) 4-1BBL trimer fragment and a fusion protein including the same.
  • Lb is a schematic diagram showing specific examples of 4-1BBL variant (Q146C / T241C) fragments, trimers containing the same, and fusion proteins containing trimers.
  • Lc shows 4-1BBL variant (I244C / A232C) fragments and trimesters comprising the same It is a schematic diagram which showed a specific example.
  • FIG. ID is a schematic diagram showing specific examples of the 4-1BBL variant (F199C / V140C) fragment and the trimer including the same.
  • FIG. Le is a schematic diagram showing specific examples of 4-1BBL variant (L181C / G231C or L204C / Q94C) fragments and trimers comprising the same.
  • TAA tumor-associated antigen
  • scFv tumor-associated antigen
  • trimer including 4-1BBL variant (Q146C / T241C) fragment.
  • Figure lg is a schematic diagram showing a specific example of the fusion protein structure that binds the anti-PD-L1 scFv or anti-scFv to the 4-1BBL variant as an immune gateway inhibitor.
  • Figure 2 shows the productivity and purity of Ver. 14, 4-1BBL variant, on a gel.
  • 3A shows the productivity and purity of 4-1BBL variant Ver.17 on gel.
  • 3B shows the productivity and purity of Ver.7, 4-1BBL variant, on gels.
  • Figure 4 shows the activity of the fusion protein comprising a trimer composed of 4-1BBL or variants thereof.
  • 5A and 5B show the productivity and purity of Ver.32, a 4-1BBL variant, on gel and graph.
  • 6A and 6B show the production and purity of 4-1BBL variant Ver.33 in gel phase and purity. It is shown on the graph.
  • 7A and 7B show the productivity and purity of Ver. 34, 4-1BBL variant, on gel and graph.
  • 9A and 9B show the productivity and purity of Ver.38, 4-1BBL variant, on gel and graph.
  • 11A to 11L show ver. Sequence information # of l to ver .42 is shown. ver. The amino acid sequence of l to ver .42 is as described in SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 83. In this case, the underlined part in the figure represents a linker sequence.
  • the present invention provides a 4-1BBL variant or fragment thereof in which the amino acid present at positions 146/241, 232/244 or 140/199 of wild type 4-1BBL is substituted with cysteine.
  • 4-1BB ligand as used herein is a membrane protein belonging to the tumor necrosis factor superfamily called 4-1BBL or CD137L. 4-1BBL is found in antigen presenting cells. In addition, 4-1BBL can specifically bind 4-1BB. At this time, the wild type 4-1BBL is a natural found in mammals 4-lBBL. In one embodiment, the 4-1BBL may be a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 which is 4-1BBL derived from human or SEQ ID NO: 2 which is 4-1BBL derived from mouse.
  • Human-derived 4-1BBL consists of intracellular domains (amino acids 1-28), transmembrane proteins (amino acids 29-49), and extracellular domains (amino acids 50-254). have.
  • the extracellular domain was formed as a secondary structure consisting of a total of 10 beta strands (PDB 2X29).
  • the first beta strand starts at the 83rd amino acid and the last beta strand is up to the 239th. That is, the fragment containing the 83rd to 239th amino acids is known to be active because it contains all the secondary structures.
  • Mouse-derived 4-1BBL consists of intracellular domains (amino acids 1-82), transmembrane proteins (83-103 amino acids), and extracellular domains (amino acids 104-309). have.
  • the extracellular domain has no protein structure, but is similar when comparing sequences with human-derived proteins, and has been formed as a secondary structure that forms a beta strand ( ⁇ strand) similar to human-derived proteins by structure-based prediction (PR0MALS3D).
  • the first structure, betastrand starts with the 133th amino acid and the last betastrand is made up to the third. That is, in the case of fragments containing amino acids 133 to 301, it is expected that the fragment contains all secondary structures and has 4 activities.
  • the 146th and 241th amino acids may be substituted with cysteine based on the amino acids of human 4-1BBL.
  • the 4-1BBL variant may be one of Q146C and T241C.
  • the 4-1BBL variant may be a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the 4-1BBL variant may be a substitution of cysteine with the 232rd and 244th amino acid (232/244) based on the amino acid of human 4-1BBL. That is, the 4-1BBL variant may be A232C and I244C. At this time, the 4-1BBL variant may be a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the 4-1BBL variant may be one in which the 140th and 199th amino acid (140/199) is substituted with cysteine based on the amino acid of human 4-1BBL. That is, the 4-1BBL variant may be one of V140C and F199C. At this time, the 4-1BBL variant may be a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • one embodiment of the mouse-derived 4-1BBL variant may be substituted with cysteine amino acids 213 and 303 based on the mouse 4-1BBL amino acids ie, the 4-1BBL variant may be E213C and K303C have.
  • Another embodiment of the 4-1BBL variant derived from the mouse may be the 294 and 306th amino acid based on the mouse 4-1BBL amino acid is substituted with cysteine. That is, the 4-1BBL variant may be T294C and N306C.
  • mouse-derived 4-1BBL variant may be one in which the 197th and 257th amino acids are substituted with cysteine based on the mouse 4-1BBL amino acid. That is, the 4 ′ 1BBL variant may be one of L197C and W257C.
  • the 4-1BBL variant fragment may be an extracellular domain (extracel lular domain, ECD) of the mutated 4-1BBL.
  • extracellular region refers to a region exposed outside the cell as part of a membrane protein. In this case, it may mean a portion excluding a transmembrane domain and an intracellular region.
  • the other one of 4-1BBL cell region may be a polypeptide (SEQ ID NO: 6) containing the 254th amino acid from the 50th amino acid of the human 4-1BBL, specifically, from 83 amino acid, amino acid 239 It may mean a polypeptide (SEQ ID NO: 7) comprising a.
  • the extracellular region of the mutated 4-1BBL may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 13.
  • the 4-1BBL variant fragment means a part of the extracellular region ' 4-1BBL including the above-described mutations of 146/241, 232/244 or 140/199.
  • the 4-1BBL variant fragment is substituted with cysteine at the position of 146/241, 232/244 or 140/199 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, starting with the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 6
  • One, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 or 33 amino acid residues may be deleted.
  • amino acid at position 205 of SEQ ID NO: 6, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 9 C-terminals from the N-terminal direction 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acid residues may be deleted.
  • the extracellular region fragment of 4-1BBL having the amino acid residue deleted may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. More specifically, the extracellular region fragment of the mutated 4-1BBL having the amino acid residue deleted may be a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
  • One embodiment of such a 4-1BBL variant fragment may be represented by a polypeptide represented by the following structural formula (I):
  • the core domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 15 or 16;
  • N ⁇ terminal expansion domain is a polypeptide that receives the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 17 from 1 to 33 amino acids in sequence from the N-terminal to the C-terminal direction Can be fruitful;
  • domain is a polypeptide which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and starts with the amino acid of position 16 of SEQ ID NO: 18, and deletes 1 to 15 amino acids consecutively from the C-terminal to the N-terminal direction.
  • the N-terminal expansion domain may be 30 amino acids in a row starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 17 in the direction from the N- terminal to the C- terminal.
  • the N-terminal extension domain may be one in which 22 amino acids are continuously deleted starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 17 from the N-terminal to the C-terminal direction.
  • the N-terminal expansion domain may be a series of 17 amino acids consecutively deleted starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 17 from the N- terminal to the C- terminal direction.
  • the C-terminal extension domain may be one in which seven amino acids are continuously deleted starting from the amino acid at position 16 of SEQ ID NO: 18 from the C-terminal to the N-terminal direction.
  • the 4-1BBL variant fragment may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 to SEQ ID NO: 16. In another embodiment, the 4-1BBL variant fragment may be any one selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 19 to 27. In another embodiment, the 4-1BBL variant fragment may be any one selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 28 to SEQ ID NO: 30. In another embodiment, the 4-1BBL variant fragment may be any one selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12.
  • the present invention in another aspect, the above-described 4-1BBL variant or fragment thereof; And a type 1 fusion protein comprising an active protein.
  • the active protein is cytokine, scFv region of the anti-tumor-associated antigen (TM) antibody, It may be any one selected from the group consisting of an immune gateway inhibitor and an immunostimulatory molecule.
  • the cytokines are IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-27 IFN-a, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ and GM It may be any one selected from the group consisting of -CSF.
  • the tumor-associated antigens are CD2, CD5, CD7, CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, CD25 CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD71, CD72, CD73, CD105, CD117, CD123, c-Met, PDGFR, IGF1-, HMW-MAA, TAG— 72, GD2, GD3, GM2, folate receptor, Ley, me 1 anoma antigen E (MAGE), NY—ESO— 1, care i noembr yon ic antigen ( CEA), mucin 1 cell —surface associated (MUC-1), MUC-2, PSMA, PSCA, uPAR, prostatic acid phosphatase (PAP), prostate specific antigen (PSA), survivin, tyrosine related protein 1 (tyrpl), tyrosine related protein 1 (tyrp2), Brachyury, Mesothel in, Epidermal growth factor receptor (EGFR),
  • the immune checkpoint inhibitor (I ⁇ une checkpoint inhibitor, ICI) means a substance that inhibits the mechanism of cancer cells that interfere with the activation of T cells, anti-PD-L1 antibody, anti- ⁇ 1 antibody, anti- CTLA4 antibody, anti-PD-L2 antibody, LTF2 regulatory antibody, anti-LAG3 antibody, anti-A2aR antibody, anti-TIGIT antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-B7-H3 antibody, anti-B7-H4 antibody, anti -VISTA Antibody, anti-CD47 Antigen, anti-BTLA Antibody, anti-KIR Antigen, anti-ID0 Antibody and its It may be any one selected from the group consisting of a combination.
  • the immunostimulatory molecule may be any one selected from the group consisting of ICOS, CD28, 0X40, CD27, and CD40.
  • the first immunogate therapy is ipilimumab, an inhibitory monoclonal antibody of cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4), a concurrent inhibitory immune gateway receptor.
  • CTLA-4 cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4
  • the improved immune gateway therapies are monoclonal antibodies against progra ed cell death-1 (PD-1) and its ligand programmed death ligand-1 (PD_L1).
  • Representative drugs include nivolumab, pembrolizumab, and avelumab, and the latter include atzolizumab and durvalumab.
  • GITR glucocorticoid-induced TNFR-related protein
  • KIR killer eel 1 immunoglobul in-1 ike receptor
  • LAG— 3 lymphocyte-act i vat ion gene ⁇ 3
  • T Various monoclonal antibodies against cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3 (TIM-3) and tumor-necrosis factor receptor super family member 4 (TNFRSF4 or 0X40) are under development or in clinical trials.
  • an immune gateway inhibitor may be an antibody such as Ipilimumab, Nivolumab, Pembrolizumab, Atezolizumab, Avelumab or Durvalumab or a fragment thereof.
  • the fusion protein may further include a linker and / or a fusion partner.
  • the linker may be a peptide consisting of 1 to 50, 2 to 45, 3 to 40, 5 to 30, 7 to 25 amino acids, specifically, 3 to 40 It may be a peptide consisting of amino acids.
  • the distance between the 4-1BBL variant or fragment thereof and the active protein may be 10 to 50A.
  • Peptide linkers consisting of 3 to 40 amino acids can be used.
  • the linker is G4S (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 32), SPKAQAGGGGSAQPQAEGSLGGGGSAKASAPAGGGGS (SEQ ID NO: 33),
  • GGSGGSGGSGGSGGSEQEER SEQ ID NO: 34
  • GGGGSGGGGSGGS SEQ ID NO: 35
  • SGGGGSGGGGSGGGGSGTHTCPPCP SEQ ID NO: 36
  • GGSGGGGS SEQ ID NO: 37
  • GGGGSGGGGSGGGS SEQ ID NO: 38
  • US2015-0274827, W02016-075278, US2006-0235201, US2016-0340399, W02016— 029043 disclose a variety of linkers capable of making trimers of TSFSFC Tumor necros is factor super f ami ly), including 4-1BBL. .
  • the linker only serves to link these monomers, and their effects on structure and effects are very limited.
  • the fusion partner may be any one or more selected from the group consisting of Fc regions, Fc fragments, variants of Fc regions, hybrid Fc regions, PEG, XTEN, CTP and albumin.
  • Fc region As used herein, the terms “Fc region”, “Fc fragment” or “Fc” include heavy chain constant region CH1), heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) of immunoglobulin, and Globulin chain and light chain variable region and light chain constant region 10X1) refers to a protein that does not contain.
  • c region variant '' is substituted for some amino acids in the Fc region, or different types of Fc Means produced by combining the regions.
  • the Fc region of the immunoglobulin may be an entire Fc region or a fragment thereof, or an Fc region variant.
  • the Fc region may include a monomer or a multimeric molecule, and may further include a hinge region of the heavy chain constant region.
  • the Fc region variant may be modified to prevent cleavage at the hinge site.
  • the hinge sequence of the Fc may be amino acid to reduce antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ant ibody-dependent eel 1 -mediated cytotoxi ci ty, " ADCC) or complement-dependent cytotoxi ci ty (CDC).
  • the hinge sequence of the Fc may be substituted with a portion of the amino acid sequence to suppress rearrangement of the Fab region, and furthermore, the lysine (K) at the Fc C-terminus may be removed. .
  • the Fc ' region of the immunoglobulin specifically, any one of the Fc region of IgGl, IgG2, I G3, IgG4 and IgD; Or a hybrid Fc consisting of a combination thereof.
  • the hybrid Fc may specifically include an IgG4 region and an IgD region.
  • the hybrid Fc may include a portion of a hinge sequence of IgD Fc and CH2, and a CH2 and CH3 sequence of IgG4 Fc.
  • the Fc fragment of the present invention may be a wild type sugar chain, an increased sugar chain compared to wild type, a reduced sugar chain compared to wild type, or a sugar chain removed form.
  • the increase, decrease or removal of the sugar chains may be carried out by conventional methods known in the art such as chemical methods, enzymatic methods and genetic engineering methods using microorganisms.
  • the fusion protein comprising the 4-lBBL variant or fragment thereof and the active protein may further comprise a linker and / or a fusion partner. Thus, a combination of these can produce a variety of fusion proteins.
  • a fusion protein is 0 AP-4-1BBL ', ii) 4-lBBL'-AP, iii) AP-4-lBBL'-AP, iv) AP-L-4-1BBL', v) 4 — LBBL '-(L) n — AP, vi) AP- (L) n-4-lBBL'-(L) n-AP, vii) AP- (L) n-fusion partner _ (L) n-4 -lBBL ', viii) 4-lBBL'-(Dn-FP- (L) n-AP and ix)
  • AP- (L) n-FP— (L) n-4-lBBL '-(L) n-FP- (L) n-AP can be any one selected from the group consisting of.
  • the 4-1BBL variant or fragment thereof is represented as "4-1BBL '”.
  • the active protein is designated as AP.
  • the fusion partner was designated "FP”.
  • the linker is indicated by "L”. In this case, n may be 0 or 1, and when n is 0, it means that a linker is not included.
  • the present invention provides a 4-1BBL variant comprising three 4-1BBL variants or fragments thereof in which amino acids present at positions 146/241, 232/244 or 140/199 of wild type 4-1BBL are substituted with cysteines or Provides trimers of fragments thereof.
  • the trimer may include three 4-1BBL variants of Q146C and T241C. In another embodiment, it may include three 4-1BBL variants of the trimers A232C and I244C. In another embodiment, the trimer may include three 4-1BBL variants of V140C and F199C.
  • the trimer may be in the form of 4-1BBL variant or a fragment thereof directly connected to each other have. However, the trimer may be in the form of 4-1BBL variant or a fragment thereof linked through a linker.
  • the linker present in the trimer may be a peptide consisting of 1 to 50, 2 to 45, 3 to 40, 5 to 30, 7 to 25 amino acids as described above, specifically, 3 to It may be a peptide consisting of 40 amino acids.
  • the trimer of the 4-1BBL variant or fragment thereof may be a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 41.
  • each monomer constituting the trimer may have the same mutation site.
  • Q146C and T241C must be included to form a structurally stable trimer. It should also include A232C and I244C or V140C and F199C. However, the length of each monomer can be adjusted as needed.
  • the linker may also be included in any portion of the monomers making up the trimer.
  • a trimer comprising a linker is 0 4-lBBL '-4-lBBL'-4-lBBL', ii) 4-1BBL '-(L) n-4-lBBL' -4-1BBL ' iii) 4-1BBL'-4-1BBL '-(L) n-4-lBBL' and iv) 4-lBBL '-(L) n-4-lBBL'-(L) n-4-lBBL ' It may be any one selected from the group consisting of. At this time, the 4-1BBL variant or fragment thereof is represented as "4-1BBL".
  • the active protein is designated as AP.
  • the linker is represented by.
  • n may be 0 or 1, and when n is 0, it means that no linker is included.
  • the present invention provides a type 2 fusion protein comprising a trimer and an active protein of the 4-1BBL variant or fragment thereof.
  • the active protein may be linked to the N terminus or C terminus of the trimer described above.
  • One embodiment of such a type 2 fusion protein may be i) active protein-trimer, ii) trimer-active protein or H i) active protein-trimeric-active protein.
  • the trimer and the active protein may further include a linker or a fusion partner. That is, the Type 12 fusion protein may be in the form of directly connecting the 4-1BBL trimer and the active protein, but may be in the form of a linker or a fusion partner.
  • the linker may be a peptide consisting of 1 to 50, 2 to 45, 3 to 40, 5 to 30, 7 to 25 amino acids, specifically, 3 to 40 amino acids It may be a peptide.
  • the fusion partner may be any one or more selected from the group consisting of Fc region, variant 1 of Fc region, hybrid Fc region, PEG, XTEN, CTP, and albumin.
  • the active protein may be any one or more selected from the group consisting of cytokines, scFv regions of anti-tumor-associated antigen (TM) antibodies, immunogate inhibitors and immunostimulatory molecules. Embodiments of each active protein are as described above.
  • Type 2 fusion proteins may exist in various forms by combinations of trimers, active proteins, linkers, and fusion partners.
  • One embodiment of such a type 2 fusion protein may be any one selected from the following structural formulas:
  • the 4-1BBL variant or fragment thereof is represented as "4-1BBL '".
  • the trimer of the 4-1BBL variant or fragment thereof is represented by "(4-lBBL ') 3".
  • the active protein is designated as AP.
  • the fusion partner is represented by TP ".
  • the linker is represented by" L ", where n may be 0 or 1, and when n is 0, it means that the linker is not included. 4-1BBL variant or a fragment thereof, and a trimer of type 1 fusion protein comprising a fusion protein comprising the active protein.
  • the type 1 fusion protein may have various forms as described above.
  • the trimer of the type 1 fusion protein may be composed of the same type of type 1 fusion protein. However, it may be a hetero form trimer containing three different type 1 fusion proteins. In particular, the kind of active protein bound to the type 1 fusion protein may be different from each other.
  • the active protein may be any one or more selected from the group consisting of cytokines, tumor-associated antigens (TM), scFv regions, and immune gateway inhibitors.
  • TM tumor-associated antigens
  • scFv regions tumor-associated antigens
  • immune gateway inhibitors the first type fusion of any one of the monomers constituting the trimer of the fusion protein Proteins may be cytokine, other monomers may be tumor-associated antigens, and other monomers may be in the form of a combination of scFv regions or immunogate inhibitors. Such combination may be appropriately selected depending on the purpose of utilizing the trimer.
  • the present invention in another aspect, i) the 4-1BBL variant or fragment thereof; ii) said type 1 fusion protein; iii) a trimer of said 4-1BBL variant or fragment thereof; iv) said type 2 fusion protein; And V) provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or infectious diseases comprising any one protein selected from the group consisting of the first type fusion protein trimer.
  • the cancer as described above stomach cancer, liver cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer, acute myeloid leukemia, brain tumor, neuroblastoma, retinal blastoma, head and neck cancer , Salivary gland cancer and lymphoma.
  • the infectious disease may be selected from hepatitis B, hepatitis C, human papilloma virus (HPV) infection, cytomegalovirus infection, viral respiratory disease, influenza.
  • the present invention in another aspect, i) the 4-1BBL variant or fragment thereof; ⁇ ) said type 1 fusion protein; iii) a trimer of said 4-1BBL variant or fragment thereof; iv) said type 2 fusion protein; And V) any one protein selected from the group consisting of the type 1 fusion protein trimer.
  • Pharmaceutical for the prevention or treatment of cancer or infectious disease comprising a recombinant virus containing a nucleotide encoding as an active ingredient To provide a composition.
  • the cancer or infectious disease is as described above.
  • the virus may be any one selected from the group consisting of adenovirus, Adeno-associated virus (AAV), retrovirus, lentivirus, herpes simplex virus or vaccinia virus.
  • AAV Adeno-associated virus
  • retrovirus retrovirus
  • lentivirus lentivirus
  • herpes simplex virus herpes simplex virus
  • vaccinia virus adeno-associated virus
  • the virus may be adeno-associated virus (AAV).
  • AAV adeno-associated virus
  • the adeno appendage virus is not limited to a specific serotype, and preferably, may be any one of AAV1 to MV9.
  • MV adeno-associated virus
  • AAV vectors and details of their manufacture and use are disclosed in detail in US Pat. Nos. 5,139, 941 and 4,797,368.
  • MV viruses can be prepared by co-transfection of a plasmid comprising the gene sequence of interest with two MV terminal repeats flanked by and an expression plasmid comprising a wild type MV coding sequence without terminal repeats.
  • the active ingredient can exhibit activity in a composition for preventing or treating cancer or infectious disease of the present invention, it may be included in any amount (effective amount) depending on the use, formulation, formulation purpose, etc. It will be determined in the range of 0.001% to 20.0% by weight based on Here, "effective amount 1 " means an active ingredient that can induce a therapeutic effect of an anticancer or emotional disease. Say the sheep. Such effective amounts can be determined experimentally within the range of ordinary skill in the art.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier can be any carrier as long as it is a non-toxic material suitable for delivery to a patient. Distilled water, alcohols, fats, waxes and inert solids may be included as carriers. Pharmacologically acceptable adjuvants (buffers, dispersants) may also be included in the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in a parenteral formulation according to the route of administration by a conventional method known in the art, including a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • compositions of the present invention When the pharmaceutical compositions of the present invention are prepared in parenteral formulations, they may be formulated in the form of injections, transdermal administrations, nasal inhalants and suppositories with suitable carriers according to methods known in the art.
  • suitable carriers When formulated as an injection, suitable carriers may be sterile water, ethanol, polyols such as glycerol or propylene glycol, or mixtures thereof.
  • Ringer's solution and triethane contain amine.
  • PBS Phosphate buf fered salin
  • sterile water for injection PBS
  • isotonic solutions such as 5% dextrose
  • Preferred dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention range from 0.01 ug / kg to 10 g / kg per day, preferably 0.01 mg / kg to day, depending on the condition, body weight, sex, age, severity of the patient and route of administration. May range from 1 g / kg. Administration can be done once a day or divided into several times. Such dosage should not be construed as limiting the scope of the invention in any aspect.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer or infectious disease, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising the 4-1BBL variant or a fusion protein comprising the same or a virus encoding the same.
  • the administration may be carried out through any one route selected from the group consisting of intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, nasal, pulmonary, rectal and intratumoral.
  • the method of administration may vary depending on the type of drug being administered.
  • the present invention in another aspect, i) the 4-1BBL variant or fragment thereof; i i) said U-shaped fusion protein; i) trimers of the 4-1BBL variants or fragments thereof; iv) said type 2 fusion protein; And V) a nucleotide encoding any one protein selected from the group consisting of the type 1 fusion protein trimer.
  • the nucleotide may further include a signal sequence or a leader sequence.
  • Terminology used here "Signal sequence" means a nucleic acid encoding a signal peptide that directs the secretion of the protein of interest.
  • the signal peptide is cleaved after being translated in the host cell.
  • the signal sequence of the present invention is a nucleotide encoding an amino acid sequence that initiates the movement of the protein across the ER (endoplasmic reticulum) membrane.
  • useful signal sequences in the present invention include antibody light chain signal sequences, for example antibody 14.18 (Gillies et al., J. I'unol. Meth 1989.
  • antibody heavy chain signal sequences for example, M0PC141 antibody.
  • Heavy chain signal sequence Sakano et al., Nature, 1980. 286: 676-683
  • other signal sequences known in the art see, for example, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12: 5145-5164). It includes.
  • Signal sequences are well known in the art and typically include from 16 to 30 amino acid residues, but may include more or fewer amino acid residues.
  • a typical signal peptide consists of three regions, the basic N-terminal region, the hydrophobic region of the core, and the more polar C-terminal region.
  • the central hydrophobic region contains 4 to 12 hydrophobic residues that immobilize the signal sequence through the membrane lipid layer during migration of the immature polypeptide.
  • signal sequences are cleaved in the lumen of the ER by cellular enzymes, commonly known as signal peptidases.
  • the signal sequence may be a t issue Plasminogen Act ivat ion (tPa), a signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D (HSV gDs), or a secretion signal sequence of growth hormone.
  • tPa Plasminogen Act ivat ion
  • HSV gDs Herpes simplex virus glycoprotein D
  • secretory signal sequences used in higher eukaryotic cells, including mammals can be used.
  • the secretory signal sequence of the present invention is The signal sequence included in wild type IL-7 may be used, or may be used by substituting codon with a high expression frequency in the host cell.
  • the present invention provides an expression vector loaded with the nucleotides.
  • the term “vector” can be introduced into a host cell to be recombined and inserted into the host cell genome.
  • the vector is understood as a nucleic acid means comprising a nucleotide sequence which can be spontaneously replicated as an episome.
  • Such vectors include linear nucleic acids, plasmids, phagemid cosmids, RNA vectors, viral vectors and analogs thereof.
  • viral vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
  • the plasmid may comprise a selection marker such as an antibiotic resistance gene, and the host cell holding the plasmid may be cultured under selective conditions.
  • the term “gene expression” or “expression” of a protein of interest is understood to mean the transcription of DNA sequences, the translation of mRNA transcripts and the secretion of fusion protein products or fragments thereof. May be RcCMV (Invi trogen, Cars sbad) or a variant thereof
  • the expression vector is a human cytomegalovi rus (CMV) promoter for promoting the transcription of a target gene in mammalian cells, and the steady state level of RNA after transcription It may include a bovine growth hormone polyadenylation signal sequence to increase.
  • the present invention provides a host cell transfected with the expression vector.
  • the host cell is a cell transformed with the expression vector containing the polynucleotide according to the present invention, may be a prokaryote or eukaryotic cell. Specifically, it may be a mammalian cell. The transformation can be carried out by methods known in the art. Meanwhile, one example of the prokaryotic cell may be E. «7 //, and one example of the eukaryotic cell may be yeast.
  • the mammalian cells may be NS / 0 myeloma cells (NS / 0 myeloma cel l), 293 cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cel l), HeLa cells, CapT cells (human amniotic fluid-derived cells) or COS cells. have.
  • the present invention provides i) the 4-1BBL variant or fragment thereof from the transfected host cell; ii) the crab type 1 fusion protein; iii) trimers of the 4-1BBL variants or fragments thereof; iv) said type 2 fusion protein; And V) obtaining a protein selected from the group consisting of the type 1 fusion protein trimer.
  • Example 1 Gene Construct As shown in FIG. 1, various forms of recombinant 4-1BBL (SEQ ID NOs. To 42) were prepared. Specifically, in the preparation of the gene construct, the gene sequence to be inserted was prepared by three methods.
  • the first method is to directly synthesize the gene to be inserted. After synthesizing the entire gene sequence, pcDNA TM 3. 1 expression vector.: Was inserted into the (111 1 1 "0 £ 611 ⁇ )
  • the second method is a gene sequence to be inserted by PCR based on the ready-made construct was synthesized
  • third method is a complete construct PCR based gene sequence was altered.
  • PCR was performed by repeating the denature, annealing and extension processes 35 times.
  • the denaturation process was performed at 98 ° C for 15 seconds, the annealing process at 55 ° C for 30 seconds, and the extension process at 72 0 C for 60 seconds.
  • the obtained PCR product was subjected to electrophoresis for 20 minutes at a voltage of 200 V on a 1% agarose gel to gel extract a band having a size of about 2, 625 bp.
  • EcoRI and Xhol New England Biolabs, UK
  • expression vectors of Ver. L to Ver. 42 were prepared, including the following substances: Anti-HER2 scFv, Anti-EGFR scFv, Anti-MUC-1 scFv, Anti—CTLA-4 scFv, Anti ⁇ LAG — 3 scFv, Ant i-TIM-3 scFv, Anti -KIR scFv, IL-2,4,6,7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-27, IFN-a, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ and GM-CSF.
  • Example 2 Production of Recombinant 4-1BBL and Fusion Proteins Containing the Same
  • Example 1 The expression vector obtained in Example 1 was transfected into Exp iCHO-STM (Thermo fisher, # A29127) cells using an ExpiCHO TM expression system (Thermo fisher, USA, Cat No. A29129). 37 ° C, wet conditions (humidified), 8% C0 2 and 120 rpm conditions with shaking (shaking) and 1 stand, C0 2 of the incubator 18 to 22 hours incubation after ExpiCHOTM in enhancer (enhancer) and feed (feed of ) was added. Afterwards, 32 ° C, humidified ,
  • the obtained culture was basically stored at 4 ° C and purified as soon as possible.
  • Protein A affinity chromatography was performed using Mabselect SuRe resin CGEHC, Cat No. 28926977) as shown in Table 1 below.
  • Purified amount (productivity) of the recombinant 4-1BBL variant was immediately determined using Nano-drop UV quantitation.
  • ProtParam t oo 1 (ht t ps: // web. Expasy. Org / rotparam /) was used to measure the extinction coefficient of the protein (Ext inct i on coef fi cients). In this case, the extinction coefficient was expressed in units of M1 1 cm "1 at 280 nm measured in water.
  • the absorption coefficient of the protein to be measured was input and quantified. The above procedure was repeated three times and quantified by the average value. In addition, the purity of the recombinant 4-1BBL variant was confirmed by the following experimental conditions.
  • Mobi le phase 50 mM Na-Pi, 300 mM NaCl, 10% ACN pH 7.0 Flow rate: 0.5 ml / min
  • linker was used to produce trimers. 3 to 40 amino acid linkers were used so that the distance between the 4-1BBL monomer and the 4-1BBL monomer could be 10 to 50 A when the 4-1BBL monomer was linked to the linker and produced in the trimer form. Ver. Such linkers were introduced at 1 to 42.
  • 4-1BBL variant KQ146C / T241C 4-1BBL variant 2 (I244C / A232C) and 4-lBBL variant 3 (to produce spontaneous disulfide bonds to form trimers when spontaneously producing monomers or linking monomers with linkers) F199C / V140C).
  • the efficacy of the material was evaluated.
  • a reporter assay was performed using Promega's 4-1BB bioassay kit.
  • the signal is transmitted to the 4-1BB receptor by the 4-1BB ligand, the NF- ⁇ gene is activated.
  • a Jurkat T cell line expressing luc i ferase by the NF- ⁇ promoter is used.
  • the engineered Jurkat T cells were placed in a 96 well plate and loaded with wild type 4-1BBL trimer
  • Ver.7 and Ver.6, and Ver. 7-1BBL variant of the present invention. 17 were treated respectively.
  • recombinant human 4-1BB ligand rM-lBBL
  • concentration a control
  • secondary antibodies were treated together to induce activity by cross-linking the 4-1BB ligand.
  • the reaction was performed in a 5% C0 2 incubator at a temperature of 37 ° C. for 6 hours, and the reaction was performed for 1 minute by treatment with a luciferase assay substrate, followed by measurement of luminescence. The results are shown in FIG.
  • Ver. The EC 50 value of 17 was 177.5 pM, which was confirmed to be an improved efficacy compared to Ver .7 having an EC 50 value of 263 pM. Ver .6 showed little activity, and compared to Ver 7 and Ver. 17 activity was significantly higher. At this time, the productivity of Ver. 7 is shown on the gel as shown in Figure 3b.
  • the 4-1BBL variant according to the present invention was produced in the form of a fusion protein by combining scFv of a tumor associated antigen (Tumor associated ant igen (TAA)), and evaluated the efficacy of these substances.
  • TAA tumor associated antigen
  • FIG. 5 when the CEF scFv was fused to the 4-1BBL trimer, purity of 78.8% and 20 ug / ml were shown.
  • the fF scF fused to the 4-1BBL trimer it showed a productivity of 97% purity and 9 ug / ml.
  • FIG. 7 when 4-1BBL trimer was fused with scFv of EpCAM, the productivity was 91.5% pure and 28 ug / ml.
  • the 4-1BBL variant of the fusion protein containing TM is active It confirmed by the same method as Example 5. As shown in FIG. 8, all three TAA-hyFc-4-lBBL substances (Ver .32 to Ver .34) showed high activity. Compared to the control human recombinant 4-1BB ligand (rM-lBBL) it was found to be stratified due to its high efficacy.
  • EC 50 values are Ver 0.32 for the case of 136.8 pM, 246.4 pM For Ver .33, .34 Ver was confirmed as having the EC 50 value of 240.3 pM.
  • the biological activity of this value is a level sufficient to activate surrounding T cells or NK cells with tumor-specific distribution of the fusion protein.
  • a fusion protein was prepared by fusing PD-1 / PDL-1 as an immune gateway inhibitor to the 4-1BBL variant according to the present invention.
  • PD-1 / PDL-1 as an immune gateway inhibitor to the 4-1BBL variant according to the present invention.
  • Figure 9 when the ant i-PD-Ll scFV fusion to produce the 4-1BBL variant, it showed a high productivity of 88.3 ⁇ 4 and 46 ug / ml purity.
  • the material produced was confirmed to have activity, as shown in Figure 10, it was confirmed that the EC 50 value of 233.8 pM. It is active enough to have anticancer efficacy, and may work synergistically with the effect of a fused PD-1 / PDL-1 immunogate inhibitor.

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Abstract

본 발명은 신규한 4-1BBL 변이체 및 이를 포함 하는 융합 단백질에 대한 것이다. 본 발명의 4-1BBL의 변이체는 구조적으로 안정한 삼량체를 형성할 수 있다. 따라서, 상기 4-1BBL의 변이체 삼량체는 개체내에서 4-1BB와 효과적으로 결합할 수 있다. 그 뿐 아니라, 4-1BBL의 변이체 삼량체에 다양한 활성 단백질을 결합할 경우 항암용 조성물이나 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
4-1BBL 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질
【기술분야】
본 발명은 신규한 4-1BBL 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질에 대한 것이다. 【배경기술】
4-1BB 리간드 (4-1BBL, CD137L)는 종양 괴사 인자 수퍼패밀리 (superfami ly)에 속하는 막단백질이다. 최근 4-1BBL을 항암제로 사용하기 위한 노력이 이루어지고 있다. 그러나 단량체 형태의 재조합 4-1BBL는 4-1BB 단백질과의 친화력이 낮다고 알려져 있다.
자연계의 h4-lBB 및 h4-lBBL 단백질은 삼중합체 (trimer) 형태로 결합하는 것으로 보고되었다 (Idriss HT, Naismith JH. TNF alpha and the TNF receptor superfami ly: structure— function relat ionship(s) . Microsc Res Tech. 50(3)： 184-95. 2000.). 따라서， 4- IBB 및 4-1BBL 단백질을 활용하기 위하여， 연구자들은 4-1BBL 삼량체를 개발하기 위해 많은 노력을 해왔다. 그러나 구조적인 측면에서， 자연적으로는 안정된 형태의 4-1BBL 삼량체를 생산하는 것은 어려움이 있었다.
종래에 4-1BBL 삼량체를 제조하기 위하여 복합체를 형성할 수 있는 단백질 도메인을 이용하였다. 또는， Fc 말단의 중쇄영역과 경쇄영역에 2 또는 1개의 4-1BBL을 융합하여 2+1 또는 1+2의 구조를 유도하기도 하였다. 또한， 상기 구조를 안정화시키기 위해， 링커의 길이를 조절하기도 하였다. 최근에는 분자 간에 인위적인 이황화 결합을 도입하는 기술을 개시 (W0 2016/029043)하고 있으나， 여전히 안정성이 높고 효과적인 4-1BBL 삼량체의 개발이 필요한 실정이다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에 본 발명자들은 4-1BBL 서열 내에 새로운 위치에 돌연변이를 도입하여 인위적인 결합을 형성함으로써 안정화된 삼량체 구조를 가지는 4-1BBL 변이체를 제조하였다. 또한， 상기 삼량체에 다양한 활성을 가지는 단백질을 부착한 융합 단백질이 우수한 약리 효과를 보임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 야생형 4-1BBL의 특정 위치가 시스테인으로 치환된 4-1BBL 변이체， 이의 삼량체, 변이체 또는 삼량체에 활성 단백질이 결합된 융합 단백질을 제공한다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 야생형 4-1BBL의 146/241， 232/244 또는 140/199 위치에 상웅하는 아미노산이 시스테인으로 치환된 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편을 제공한다.
또한 상기 4-1BBL 변어체 또는 이의 단편; 및 활성 단백질을 포함하는 제 1형 융합 단백질을 제공한다. 또한， 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체를 제공한다. 또한， 상기 삼량체 및 활성 단백질을 포함하는 게 2형 융합 단백질을 제공한다.
아울러， 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편; 상기 제 1형 융합 단백질; 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체; 상기 제 2형 융합 단백질; 및 상기 게 1형 융합 단백질 삼량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
【발명의 효과]
본 발명의 4-1BBL의 변이체는 구조적으로 안정한 삼량체를 형성할 수 있다. 따라서， 상기 4-1BBL의 변이체 삼량체는 개체 내에서 4-1BB와 효과적으로 결합할 수 있다. 그 뿐 아니라， 4-1BBL의 변이체 삼량체에 다양한 활성 단백질을 결합할 경우 항암용 조성물이나 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 la는 야생형 (wi ld type) 4-1BBL 삼량체 단편 및 이를 포함하는 융합 단백질의 구체적인 예시를 나타낸 모식도이다.
도 lb는 4-1BBL 변어체 (Q146C/T241C) 단편， 이를 포함하는 삼량체， 및 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 구체적인 예사를 나타낸 모식도아다.
도 lc는 4-1BBL 변이체 ( I244C/A232C) 단편 및 이를 포함하는 삼랑체의 구체적인 예시를 나타낸 모식도이다.
도 Id는 4-1BBL 변이체 (F199C/V140C) 단편 및 이를 포함하는 삼랑체의 구체적인 예시를 나타낸 모식도이다.
도 le는 4-1BBL 변이체 (L181C/G231C 또는 L204C/Q94C) 단편 및 이를 포함하는 삼량체의 구체적인 예시를 나타낸 모식도이다.
도 If는 4-1BBL 변이체 (Q146C/T241C) 단편을 포함하는 삼량체에 종양 관련 항원 (TAA)와 scFv를 결합한 융합 단백질 구조의 구체적인 예시를 나타낸 모식도이다.
도 lg는 4-1BBL 변이체에 면역관문억제제로서 항 PD-L1 scFv또는 항 scFv를 결합한 융합 단백질 구조의 구체적인 예시를 나타낸 모식도이다.
도 2는 4-1BBL 변이체인 Ver .14의 생산성 및 순도를 겔 상에서 나타낸 것이다.
도 3a는 4-1BBL 변이체인 Ver .17의 생산성 및 순도를 겔 상에서 나타낸 것이다.
도 3b는 4-1BBL 변이체인 Ver .7의 생산성 및 순도를 겔 상에서 나타낸 것이다.
도 4는 4-1BBL 또는 이의 변이체로 구성된 삼량체를 포함하는 융합 단백질의 활성을 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 4-1BBL 변이체인 Ver .32의 생산성 및 순도를 겔 상 및 그래프 상에서 나타낸 것이다.
도 6a 및 도 6b는 4— 1BBL 변이체인 Ver .33의 생산섶 및 순도를 겔 상 및 그래프 상에서 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 4-1BBL 변이체인 Ver .34의 생산성 및 순도를 겔 상 및 그래프 상에서 나타낸 것이다.
도 8은 4-1BBL 변이체로 구성된 삼량체를 포함하는 융합 단백질 (Ver .14, 32, 33 및 34)의 활성을 나타낸 것이다.
도 9a 및 도 9b는 4-1BBL 변이체인 Ver .38의 생산성 및 순도를 겔 상 및 그래프 상에서 나타낸 것이다.
도 10은 4-1BBL 변이체로 구성된 삼량체를 포함하는 융합 단백질 (Ver . W, 34 및 38)의 활성을 나타낸 것이다.
도 11a 내지 도 llg는 ver . l 내지 ver .42의 서열정보 # 나타낸 것이다. ver . l 내지 ver .42의 아미노산 서열은 서열번호 42 내지 서열번호 83에 기술된 바와 같다. 이때， 도면에서 밑줄이 있는 부분은 링커 서열을 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
본 발명은 일 측면으로， 야생형 4-1BBL의 146/241， 232/244 또는 140/199 위치에 존재하는 아미노산이 시스테인으로 치환된 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "4-1BB 리간드 "는 4-1BBL 또는 CD137L로 불리 우는 종양 괴사 인자 수퍼패밀리 (superfami iy)에 속하는 막단백질이다. 4-1BBL은 항원 제공 세포 (ant igen present ing cel ls)에서 발견된다. 또한， 4—1BBL은 4-1BB와 특이적으로 결합할 수 있다. 이때, 야생형 4-1BBL은 포유동물에서 발견되는 천연의 4-lBBL일 수 있다. 일 구체예로， 상기 4-1BBL은 인간 유래의 4-1BBL인 서열번호 1 또는 마우스 유래의 4-1BBL인 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
인간 유래의 4-1BBL는 세포내영역 (1번째 부터 28번째까지의 아미노산)， 막통과단백질 (29번째 부터 49번째까지의 아미노산) 및 세포외영역 (50번째부터 254번째까지의 아미노산)으로 이루어져 있다. 세포외영역은 총 10개의 베타스트랜드를 이룬 2차 구조로 형성되었다 (PDB 2X29) . 첫번째 베타스트랜드는 83번째 아미노산부터 시작하며, 마지막 베타스트랜드는 239번째까지 이루어져 있다. 즉， 83 에서 239 번째 아미노산을 포함하는 단편의 경우 2차 구조를 모두 포함하고 있어 활성이 있는 것으로 알려져 있다.
마우스 유래의 4-1BBL는 세포내영역 (1번째 부터 82번째까지의 아미노산)， 막통과단백질 (83번째 부터 103번째까지의 아미노산) 및 세포외영역 (104번째부터 309번째까지의 아미노산)으로 이루어져 있다. 세포외영역은 단백질 구조가 없으나， 인간 유래 단백질과 서열을 비교시 유사하며， 구조 기반 예측으로 인간 유래 단백질과 유사하게 베타스트랜드 ( β strand)를 이루는 2차 구조로 형성되었다 (PR0MALS3D) . 첫번째 구조인 베타스트랜드는 133번째 아미노산부터 시작하며, 마지막 베타스트랜드는 3이번째까지 이루어져 있다. 즉， 133 에서 301 번째 아미노산을 포함하는 단편의 경우 2차 구조를 모두 포함하고 있 4 활성이 있는 것으로 예측된다.
상기 4-1BBL 변이체의 일 구체예는 인간 4-1BBL의 아미노산을 기준으로 146번째 및 241번째 아미노산 (146/241)이 시스테인으로 치환된 것일 수 있다. 즉， 4-1BBL 변이체는 Q146C 및 T241C인 것일 수 있다. 이때， 상기 4-1BBL 변이체는 서열번호 3으로 표시되는아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 4-1BBL 변이체의 다른 구체예는 인간 4-1BBL의 아미노산을 기준으로 232번째 및 244번째 아미노산 (232/244)이 시스테인으로 치환된 것일 수 있다. 즉， 4-1BBL 변이체는 A232C 및 I244C인 것일 수 있다. 이때， 상기 4-1BBL 변이체는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 4-1BBL 변이체의 다른 구체예는 인간 4-1BBL의 아미노산을 기준으로 140번째 및 199번째 아미노산 ( 140/ 199)이 시스테인으로 치환된 것일 수 있다. 즉， 4-1BBL 변이체는 V140C 및 F199C인 것일 수 있다. 이때， 상기 4-1BBL 변이체는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 또한， 마우스 유래의 4-1BBL 변이체의 일 구체예는 마우스 4-1BBL 아미노산을 기준으로 213번째 및 303번째 아미노산이 시스테인으로 치환된 것일 수 있다ᅳ 즉, 4-1BBL 변이체는 E213C 및 K303C인 것일 수 있다.
상기 마우스 유래의 4-1BBL 변이체의 다른 구체예는 마우스 4-1BBL 아미노산을 기준으로 294번째 및 306번째 아미노산이 시스테인으로 치환된 것일 수 있다. 즉， 4-1BBL 변이체는 T294C 및 N306C인 것일 수 있다.
상기 마우스 유래의 4-1BBL 변이체의 다른 구체예는 마우스 4-1BBL 아미노산을 기준으로 197번째 및 257번째 아미노산이 시스테인으로 치환된 것일 수 있다. 즉， 4ᅳ 1BBL 변이체는 L197C 및 W257C인 것일 수 있다. 이때， 상기 4-1BBL 변이체 단편은 변이된 4-1BBL의 세포외영역 (extracel lular domain, ECD) 일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "세포외영역 "은 막 단백질의 일부로서 세포 밖에 노출되는 영역을 의미한다. 이때， 막통과영역 (transmembrane domain) 및 세포내영역을 제외한 부분을 의미할 수 있다. 4-1BBL의 세포외영역의 일 구체예로는 인간 4-1BBL의 50번째 아미노산부터 254번째 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 (서열번호 6)일 수 있으며， 구체적으로， 83번째 아미노산부터' 239번째 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 (서열번호 7)를 의미할 수 있다. 이때， 상기 변이된 4-1BBL의 세포외영역은 서열번호 8 내지 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한， 상기 4-1BBL 변이체 단편이란， 상술한 146/241， 232/244 또는 140/199의 변이를 포함하는 4-1BBL의 세포외영역 '일부를 의미한다. 구체적으로， 4-1BBL 변이체 단편은 서열번호 6의 아미노산 서열에서 146/241， 232/244 또는 140/199의 위치가 시스테인으로 치환되며， 상기 서열번호 6의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개， 2개， 3개， 4개， 5개， 6개， 7개， 8개， 9개， 10개， 11개， 12개， 13개， 14개， 15개， 16개, 17개, 18개， 19개， 20개， 21개， 22개 , 23개， 24개， 25개， 26개， 27개， 28개， 29개 , 30개， 31개， 32개 또는 33개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 또한， 상기 서열번호 6의 205번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개， 2개， 3개， 4개， 5개， 6개， 7개， 8개， 9개， 10개， 11개， 12개， 13개， 14개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산 잔기의 결실은， 상기 기술한 말단으로부터 Cᅳ말단 방향으로" 및 "C-말단으로부터 N-말단 방향으로'' 중 어느 하나 또는 양쪽 모두에서 발생할 수 있다. 구체적으로， 상기 아미노산 잔기가 결실된 4-1BBL의 세포외영역 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 더욱 구체적으로， 상기 아미노산 잔기가 결실된 변이된 4-1BBL의 세포외영역 단편은 서열번호 9， 서열번호 11 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 4-1BBL 변이체 단편의 일 구체예는 하기 구조식 ( I )로 표시되는 폴리펩타이드로 표기될 수 있다:
N-말단 확장 도메인 -코어 도메인 -C 말단 확장 도메인 ( I )
상기 식 ( I )에서,
코어 도메인은 서열번호 14， 15 또는 16의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
Nᅳ말단 확장 도메인은 서열번호 17의 아미노산 서열을 ^는 폴리펩타이드로서， 서열번호 17의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 33개의 아미노산이 연속작으로 결실될 수 있으며；
C-말단 확장ᅵ 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 18의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 15개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다. 이때， 상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 17의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 30개의 아미노산이 연속적으로 결살 것일 수 있다. 또한, 상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 17의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 22개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 또한； 상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 17의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 17개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 또한， 상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 18의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 7개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
상기 4-1BBL 변이체 단편의 일 구체예는 서열번호 14 내지 서열번호 16의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 구체예로， 상기 4-1BBL 변이체 단편은 서열번호 19 내지 서열번호 27의 아미노산 서열에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또 다른 구체예로， 상기 4-1BBL 변이체 단편은 서열번호 28 내지 서열번호 30의 아미노산 서열에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또 다른 구체예로 상기 4-1BBL 변이체 단편은 서열번호 8， 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나일 수 있다. 본 발명은 다른 측면으로， 상술한 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편; 및 활성 단백질을 포함하는 제 1형 융합 단백질을 제공한다.
이때, 상기 4-1BBL 변이체는 또는 이의 단편은 앞서 기술한 바와 동일하다. 상기 활성 단백질은 사이토카인， 항-종양관련항원 (TM) 항체의 scFv 영역， 면역관문억제제 및 면역자극분자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이때， 상기 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-27 IFN-a, IFN-β, IFN-γ 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다
또한, 상기 종양관련항원은 CD2, CD5, CD7, CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, CD25 CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD71, CD72, CD73, CD105, CD117, CD123, c-Met, PDGFR, IGF1- , HMW-MAA, TAG— 72， GD2, GD3, GM2, folate receptor, Ley, me 1 anoma antigen E (MAGE) , NY—ESO— 1， care i noembr yon ic antigen (CEA) , mucin 1 cell —surface associated (MUC-1), MUC-2, PSMA, PSCA, uPAR, prostatic acid phosphatase (PAP) , prostate specific antigen (PSA) , survivin, tyrosine related protein 1 (tyrpl) , tyrosine related protein 1 (tyrp2), Brachyury, Mesothel in, Epidermal growth factor receptor (EGFR) , human epidermal growth factor receptor 2 (HER— 2)， HE -3, HER4, VEGFR, galectin, ERBB2, Wilms tumor protein(WTl) , fibroblast activation protein (FAP), EpCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느.하나일 수 있다.
또한, 상기 면역관문억제제 (I瞧 une checkpoint inhibitor, ICI)는 T 세포의 활성화를 방해하는 암세포의 기전을 억제하는 물질을 의미하며， 항 -PD-L1 항체， 항 -Ρ으 1 항체， 항 -CTLA4 항체， 항 PD-L2 항체， LTF2 조절 항체， 항 -LAG3 항체， 항 -A2aR 항체， 항 -TIGIT 항체, 항 -TIM-3 항체， 항 -B7-H3 항체, 항 -B7-H4 항체， 항 -VISTA 항체， 항 -CD47 항쎄， 항 -BTLA 항체, 항 -KIR 항쩨， 항 -ID0 항체 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 면역자극분자는 ICOS, CD28, 0X40， CD27 및 CD40으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
종양세포는 면역감시를 회피하는 기전으로써 , 면역관문체계를 차용 (hijacking)한다. 최초의 면역관문 치료제는 동시억제 면역관문수용체인 cytotoxic T- lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4)의 억제 단클론항체인 이필리무맙 (ipilimumab)이다. 다음으로 개잘된 면역관문치료제는 progra隱 ed cell death-1 (PD-1)과 해당 리간드 programmed death ligand— 1(PD_L1)에 대한 단클론항체들이다. 대표적 약제로 전자는 니볼루맘 (nivolumab), 펨브를리주맘 (pembrolizumab), 아벨루맙 (avelumab) 등이 있으며, 후자는 아테졸리주맙 (atezolizumab)과 둘바루맙 (durvalumab) 등이 있다.
이외에도 다양한 면역관문수용체， 예를 들면， glucocorticoid- induced TNFR-related protein (GITR) , killer eel 1 immunoglobul in-1 ike receptor (KIR) , lymphocyte-act i vat ion geneᅳ 3 (LAG— 3)， T— cell immunoglobul in and mucin-domain containing-3(TIM-3) , tumor-necrosis factor receptor super f ami ly member 4(TNFRSF4 또는 0X40) 등에 대한 다양한 단클론항체들이 개발 중 또는 임상시험 중이다.
이러한 면역관문억제제의 일 예로는 Ipilimumab, Nivolumab, Pembrolizumab, Atezolizumab, Avelumab 또는 Durvalumab과 같은 항체 또는 이의 단편 일 수 있다. 이때, 상기 융합 단백질은 링커 및 /또는 융합 파트너를 더 포함할 수 있다. 상기 링커는 1 내지 50개， 2 내지 45개， 3 내지 40개， 5 내지 30개， 7 내지 25개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있으며， 구체적으로， 3 내지 40개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있다. 일 구체예로， 본 발명에서는 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편과 활성 단백질 사이의 거리가 10 내지 50A가 될 수 있도록
3 내지 40개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 일례로， 상기 링커는 G4S (서열번호 31)， GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (서열번호 32)， SPKAQAGGGGSAQPQAEGSLGGGGSAKASAPAGGGGS (서열번호 33 )，
GGSGGSGGSGGSGGSEQEER (서열번호 34)， GGGGSGGGGSGGS (서열번호 35)，
SGGGGSGGGGSGGGGSGTHTCPPCP (서열번흐 36)， GGSGGGGS (서열번호 37) 및 GGGGSGGGGSGGGS (서열번호 38)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열일 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. US2015-0274827 , W02016-075278 , US2006-0235201 , US2016-0340399 , W02016— 029043는 4-1BBL을 포함하는 TSFSFCTumor necros i s factor super f ami ly)를 삼량체를 만들 수 있는 다양한 링커들에 대하여 개시하고 있다. 링커는 단지 이들 단량체를 연결하는 역할을 할 뿐 자체가 구조와 영향에 미치는 영향은 매우 제한적이다.
상기 융합 파트너는 Fc 영역， Fc 단편, Fc 영역의 변이체， 하이브리드형 Fc 영역， PEG , XTEN , CTP 및 알부민으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것 일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 영역"， "Fc 단편" 또는 "Fc"란， 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 CH1) , 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 증쇄와 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 10X1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 또한， 본 명세서에서 사용된 용어 c 영역 변이체' '는 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다.
상기 면역글로불린의 Fc 영역은 항체를 구성하는 Fc 영역 전체 또는 이의 단편， 또는 Fc 영역 변이체일 수 있다. 또한， 상기 Fc 영역은 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함하며， 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 또한， 상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다. 더불어， 상기 Fc의 힌지 서열은 항체 의존 세포 매개 세포독성 (ant ibody-dependent eel 1 -medi ated cytotoxi ci ty," ADCC)이나 보체 의존 세포독성 (complemant -dependent cytotoxi ci ty; CDC)을 줄이기 위해 아미노산 서열 일부가 치환될 수 있다. 또한， 상기 Fc의 힌지 서열은 Fab 영역의 재배열을 억제하기 위해 아미노산 서열 일부가 치환될 수 있다. 나아가， Fc C-말단의 라이신 (K)은 제거될 수 있다.
상기 면역글로불린의 Fc '영역은， 구체적으로， IgGl , IgG2 , I G3 , IgG4 및 IgD의 Fc 영역 중 어느 하나; 또는 이들의 조합으로 이루어진 하이브리드 Fc일 수 있다. 또한， 상기 하이브리드 Fc는， 구체적으로， IgG4 영역 및 IgD의 영역을 포함할 수 있다. 나아가， 상기 하이브리드 Fc는， IgD Fc의 힌지 서열 일부와 CH2 , 및 IgG4 Fc의 CH2와 CH3 서열을 포함할 수 있다.
또한， 본 발명의 Fc 단편은 야생형 당쇄， 야생형에 비해 증가된 당쇄， 야생형에 비해 감소한 당쇄， 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 상기 당쇄의 증가， 감소 또는 제거는 화학적 방법， 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 수행될 수 있다. 상기 4-lBBL 변이체 또는 이의 단편 및 활성 단백질을 포함하는 융합 단백질은 링커 및 /또는 융합 파트너를 더 포함할 수 있다. 따라서， 이들의 조합으로 다양한 융합 단백질이 제조될 수 있다. 이러한 융합 단백질의 일 구체예는 0 AP-4-1BBL' , ii) 4-lBBL'-AP, iii) AP-4-lBBL'-AP, iv) AP-L-4-1BBL' , v) 4— lBBL'-(L)n— AP, vi) AP-(L)n-4-lBBL'-(L)n-AP, vii) AP-(L)n-융합 파트너 _(L)n-4-lBBL'， viii) 4-lBBL' -(Dn-FP-(L)n-AP 및 ix)
AP-(L)n-FP— (L)n-4-lBBL'-(L)n-FP-(L)n-AP으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편은 "4-1BBL'"로 나타내었다. 또한, 활성 단백질은 AP로 표기하였다. 또한， 융합 파트너는 "FP"로 표기하였다. 링커는 "L"로 나타내었다. 이때, n은 0또는 1일 수 있으며， n이 0일 때에는 링커가 포함되지 않는 것을 의미한다. 본 발명은 다른 측면으로， 야생형 4-1BBL의 146/241， 232/244 또는 140/199 위치에 존재하는 아미노산이 시스테인으로 치환된 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편이 3개가 포함된 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체를 제공한다.
이때， 상기 4-1BBL 변이체는 또는 이의 단편은 앞서 기술한 바와 동일하다. 일 구체예로， 상기 삼량체는 Q146C 및 T241C인 4— 1BBL 변이체 세 개를 포함하는 것일 수 있다. 다른 구체예로， 상기 삼량체 A232C 및 I244C인 4-1BBL 변이체 세 개를 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 구체예로， 상기 삼량체는 V140C 및 F199C인 4-1BBL 변이체 세 개를 포함하는 것일 수 있다.
상기 삼량체는 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편이 서로 직접 연결된 형태일 수 있다. 그러나 상기 삼량체는 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편이 링커를 통해 연결된 형태일 수 있다.
상기 삼량체에 존재하는 링커는 상술한 바와 같이， 1 내지 50개， 2 내지 45개， 3 내지 40개， 5 내지 30개， 7 내지 25개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로， 3 내지 40개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있다.
상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체는 서열번호 39 , 서열번호 40 또는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일.수 있다.
또한， 상기 삼량체를 구성하는 각 단량체는 모두 동일한 변이 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어， Q146C 및 T241C을 모두 포함하여야만 구조적으로 안정한 삼량체를 형성할 수 있다. 또한， A232C 및 I244C을 포함하거나， V140C 및 F199C을 포함하여야 한다. 다만， 각 단량체의 길이는 필요에 따라 조절될 수 ¾다.
또한， 링커는 삼량체를 구성하는 단량체의 임의의 부분에 포함될 수 있다. 따라서 , 링커를 포함하는 삼량체의 일 구체예는 0 4-lBBL ' -4-lBBL' -4-lBBL' , i i ) 4-1BBL ' -(L)n-4-lBBL ' -4-1BBL ' , i i i ) 4-1BBL ' -4-1BBL ' -(L)n-4-lBBL ' 및 iv) 4-lBBL ' -(L)n-4-lBBL' -(L)n-4-lBBL '으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편은 "4-1BBL" '로 나타내었다. 또한, 활성 단백질은 AP로 표기하였다. 링커는 로 나타내었다. 이때， n은 0 또는 1일 수 있으며， n이 0일 때에는 링커가 포함되지 않는 것을 의미한다. 본 발명은 다른 측면으로 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체 및 활성 단백질을 포함하는 제 2형 융합 단백질을 제공한다. 상기 활성 단백질은 상술한 삼량체의 N 말단 또는 C 말단에 결합될 수 있다. 이러한 게 2형 융합 단백질의 일 구체예로는 i ) 활성 단백질-삼량체， i i ) 삼량체 -활성 단백질 또는 H i ) 활성 단백질-삼량체 -활성 단백질일 수 있다. 이때, 삼량체와 활성 단백질은 링커 또는 융합 파트너를 추가적으로 포함할 수 있다. 즉， 거 12형 융합 단백질은 4-1BBL 삼량체 및 활성 단백질이 직접 연결된 형태일 수 있으나， 링커 또는 융합 파트너를 통해 연결된 형태일 수 있다.
상기 링커는 상술한 바와 같이, 1 내지 50개, 2 내지 45개, 3 내지 40개, 5 내지 30개， 7 내지 25개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있으며， 구체적으로， 3 내지 40개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있다.
상기 융합 파트너는 상술한 바와 같이， Fc 영역， Fc 영역의 변이처 1， 하이브리드형 Fc 영역, PEG, XTEN, CTP 및 알부민으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 활성 단백질은 상술한 바와 같이， 사이토카인， 항-종양관련항원 (TM) 항체의 scFv 영역， 면역관문억제제 및 면역자극분자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 각각의 활성 단백질의 구체예는 상술한 바와 같다.
제 2형 융합 단백질은 삼량체， 활성 단백질, 링커 및 융합 파트너의 조합에 의해 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 제 2형 융합 단백질의 일 구체예는 하기 구조식에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다:
1) AP-(4-lBBL ' )3 ; 2) AP-L-(4-lBBL ' )3； 3) AP-FP-(4-lBBL' )3； 4) AP-FP-(L)n-(4-lBBL' )3 ; 5) AP-(L)n-FP-(4-lBBL ' )3； 6) AP-(L)n-FP-(L)n-(4-lBBL ' )3； 7) (4-lBBL ' )3-AP; 8) (4-1BBL ' )3-(L)n-AP; 9) (4-1BBL' )3-FP-AP; 10) (4-lBBL ' )3-(L)n-FP-AP; 11) (4-1BBL ' )3-FP-(L)n-AP; 12)
(4-1BBL ' )3-(L)n-FP-(L)n-AP; 13) AP-(L)n-(4-lBBL ' )3-(L)n— AP; 14)
AP-(L)n-FP-(L)n-(4-lBBL ' )3-(L)n-FP; 15) AP-(L)n-FP-(L)n-(4-lBBL ' )3-(L)n-FP-(L)n-AP.
이때， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편은 "4-1BBL ' "로 나타내었다. 또한, 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체는 " (4-lBBL ' )3"으로 나타내었다. 또한， 활성 단백질은 AP로 표기하였다. 또한， 융합 파트너는 TP"로 표기하였다. 링커는 "L"로 나타내었다. 이때， n은 0 또는 1일 수 있으며, n이 0일 때에는 링커가 포함되지 않는 것을 의미한다. 본 발명은 다른 측면으로 상술한 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편; 및 활성 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 제 1형 융합 단백질의 삼량체를 제공한다.
이때， 제 1형 융합 단백질은 상술한 바와 같이 다양한 형태를 가질 수 있다. 상기 제 1형 융합 단백질의 삼량체는 동일한 형태의 제 1형 융합 단백질로 구성될 수 있다. 그러나 서로 다른 제 1형 융합 단백질 3개가 포함된 헤테로 형태의 삼량체일 수 있다. 특히， 제 1형 융합 단백질에 결합되어 있는 활성 단백질의 종류가 서로 상이할 수 있다.
상기 활성 단백질은 상술한 바와 같이, 사이토카인， 종양관련항원 (TM) , scFv 영역 및 면역관문억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 이때, 융합 단백질의 삼량체를 구성하는 단량체 중 어느 하나의 제 1형 융합 단백질에는 사이토카인， 다른 단량체에는 종양관련항원이， 다른 단량체는 scFv 영역 또는 면역관문억제제가 결합된 형태일 수 있다. 이러한 조합은 삼량체의 활용 목적에 맞게 적절히 선택될 수 있다. 본 발명은 다른 측면으로， i) 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편; ii) 상기 제 1형 융합 단백질; iii) 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체; iv) 상기 제 2형 융합 단백질; 및 V) 상기 제 1형 융합 단백질 삼량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다
이때, 상기 암은 상술한 바와 같이， 위암， 간암， 폐암, 대장암， 유방암， 전립선암， 난소암， 췌장암, 자궁경부암， 갑상선암, 후두암， 급성 골수성 백혈병， 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 또한， 상기 감염성 질환은 B형 간염, C형 간염， 인간 파필로마 바이러스 (human papilloma virus: HPV) 감염， 사이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus) 감염， 바이러스성 호흡기 질환， 인플루엔자에서 선택될 수 있다.
본 발명은 다른 측면으로， i) 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편; Π) 상기 제 1형 융합 단백질; iii) 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체; iv) 상기 제 2형 융합 단백질; 및 V) 상기 게 1형 융합 단백질 삼량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질을 . 코딩하는 뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암 또는 감염성 질환은 상술한 바와 같다.
상기 바이러스는 아데노바이러스, 아데노 -부속 바이러스 (Adeno-associ ated vi ruses : AAV) , 레트로바이러스， 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로， 상기 바이러스는 아데노 -부속 바이러스 (AAV)일 수 있다. 상기 아데노 부속 바이러스는 특정 혈청형 (serotype)에 한정되지 않으며， 바람직하게는 AAV1 내지 MV9 중 어느 하나일 수 있다.
상기 아데노 -부속 바이러스 (MV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고， 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 백터와 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5， 139 , 941호 및 제 4， 797， 368호에 상세하게 개시되어 있다.
전형적으로， MV 바이러스는 두 개의 MV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 및 말단 리피트가 없는 야생형 MV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 동시 형질전환시켜 제조될 수 있다. 본원 발명의 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에서 그 유효성분이 활성을 나타낼 수 있는 한， 용도， 제형， 배합 목적 등에 따라 임의의 양 (유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량1'이란 항암 또는 감영성 질환의 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
이때， 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비—독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수， 알코올， 지방， 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트 (완충제， 분산제) 또한 약물학적 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로， 본원 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용 (처방) 대상이 적웅 가능한 이상의 독성올 지니지 않는다는 의미이다.
본원 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우， 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제， 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. ᅳ주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수， 에탄올, 글리세를이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 흔합물을 사용할 수 있으며， 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄을 아민이 함유된
PBS(phosphate buf fered sal ine)나 주사용 멸균수， 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며， 구체적으로 문헌 [Remington ' s Pharmaceut ical Sci ences ( 19th ed. , 1995) ] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
본원 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중， 성별， 연령， 환자의 중증도， 투여 경로에 따라 1일 0.01 ug/kg ~ 10 g/kg 범위， 바람직하게는 0.01 mg/kg ~ 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 본 발명은 다른 측면으로， 상기 4-1BBL 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 이를 코딩하는 바이러스를 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 투여는 복강내， 정맥내， 근육내, 피하， 피내, 경구， 비내, 폐내， 직장내 및 종양내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행되는 것일 수 있다. 투여 방법은 투여되는 약물의 종류에 따라 달라질 수 있다. 본 발명은 다른 측면으로， i ) 상기 4— 1BBL 변이체 또는 이의 단편; i i ) 상기 거 U형 융합 단백질; i ) 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체; iv) 상기 제 2형 융합 단백질; 및 V) 상기 제 1형 융합 단백질 삼량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단^질을 코딩하는 뉴클레오티드를 제공한다.
한편， 상기 뉴클레오티드는 신호서열 (signal sequence) 또는 리더 서열 ( leader sequence)을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 코딩하는 핵산을 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로， 본원 발명의 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드다. 본원 발명에서 유용한 신호서열은 항체 경쇄 신호서열， 예를 들면 항체 14.18(Gillies et al. , J. I隱 unol. Meth 1989. 125:191-202)， 항체 중쇄 신호서열， 예를 들면， M0PC141 항체 중쇄 신호서열 (Sakano et al. , Nature, 1980. 286： 676-683), 및 당업계에 알려진 다른 신호서열 (예， Watson et al .， Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164를 참조)을 포함한다.
신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며 , 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나， 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역， 증심의 소수성 영역， 및 보다 극성인 (polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩티드가 이동하는 동안 막지질 이증층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를포함한다.
개시 이후에， 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제 (signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘 (lumen) 내에서 절단된다. 이때， 상기 신호서열은 tPa(t issue Plasminogen Act ivat ion) , HSV gDs( signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D) , 또는 성장 호르몬 (growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게， 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다. 또한， 본원 발명의 분비 신호서열은 야생형 IL-7에 포함된 신호서열을 사용하거나， 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다. 본 발명은 다른 측면으로， 상기 뉴클레오티드가 적재된 발현 백터를 제공한다.
본원 발명에서 사용된 용어 "백터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 백터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 백터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드 코스미드， RNA 백터， 바이러스 백터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 백터의 예로는 레트로바이러스， 아데노바이러스, 및 아데노 -관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한， 상기 플라스미드는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있고， 플라스미드를 유지하는 숙주 세포는 선택적인 조건하에서 배양될 수 있다.
본원 발명에서 사용된 용어， 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현' '은, DNA 서열의 전사， mRNA 전사체의 번역 및 융합 단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 백터는 RcCMV( Invi trogen , Car l sbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 백터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속작인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV( cytomegalovi rus) 프로모터， 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자 (bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 다른 측면으로， 상기 발현 백터로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드가 포함된 발현백터가 형질전환된 세포로서， 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 구체적으로， 포유동물세포일 수 있다. 상기 형질전환은 통상의 기술분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 한편, 상기 원핵세포의 일 예는 E. «7//일 수 있으며， 진핵세포의 일 예는 효모 (Yeast )일 수 있다. 또한, 상기 포유동물세포는 NS/0 골수종 세포 (NS/0 myeloma cel l ) , 293 세포， 중국 햄스터 난소 세포 (CHO cel l ) , HeLa 세포， CapT세포 (인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포일 수 있다. 본 발명은 다른 측면으로， 상기 형질감염된 숙주세포로부터 i ) 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편; i i ) 상기 게 1형 융합 단백질; i i i ) 상기 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체; iv) 상기 제 2형 융합 단백질; 및 V) 상기 계 1형 융합 단백질 삼량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 단백질 제조 방법을 제공한다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며， 본 발명와 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실시예 1. 유전자컨스트럭트 제조 도 l에 나타낸 바와 같이， 다양한 형태의 재조합 4-1BBL (서열 ver . l 내지 42)을 제조하였다. 구체적으로， 유전자 컨스트럭트의 제조에 있어， 삽입할 유전자 서열은 세 가지 방법으로 제조하였다.
첫 번째 방법은 삽입할 유전자를 직접 합성하는 것으로， 전체 유전자 서열을 합성한 후 pcDNA™3. 1 발현 백터( 111 1：1"0£611^ )에 삽입하였다. 두 번째 방법은 이미 만들어진 컨스트럭트를 기반으로 PCR을 통해 삽입할 유전자 서열을 합성하였다. 세 번째 방법은 완성된 컨스트럭트에 PCR 기반 유전자 서열을 변경하였다.
PCR은 변성 (denature) , 어닐링 (anneal ing) 및 신장 (extension) 과정을 35회 반복하여 수행하였다. 변성 과정은 98°C에서 15초， 어닐링 과정은 55°C에서 30초， 그리고 신장 과정은 720C에서 60초 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 1% 아가로오즈 겔에서 200V의 전압으로 20분간 전기영동을 수행하여 약 2 , 625bp 크기의 밴드를 겔 추출하였다. PGP30 주형과 더불어 EcoRI과 Xhol (New England Biolabs , UK)로 37°C에서
2시간 반웅시킨 후 전기영동을 수행하고 겔 추출하였다. 절단된 pcDNA™3. 1 백터 ( Invi trogen™)와 삽입할 유전자 (약 2.6 kb)를 라이게이션하였다. DH5a 수용성 세포 (RBC)를 이용하여 형질전환 (transformat ion)과정을 거쳐 37°C에서 0/N 배양 후 콜로니를 취했다. 이후， 액체 배양액에서 37°C의 온도로 16시간 배양 후 mini prep 키트 (코스모진텍, KR)를 사용하여 플라스미드를 추출하였다. EcoRI과 Xhol으로 DNA 맵핑 (mapping)하여 8kb와 2.6 Kp의 밴드를 얻은 클론을 시퀀싱 의뢰 (코스모진텍， KR)하였다. 그 결과， 뉴클레오타이드 BLAST를 통해 최적화된 DNA 서열과 대조하여 뉴클레오티드 서열이 100% 일치하는 클론을 확보하였다. 이러한 방식으로， 하기 물질들을 포함하는 Ver.l 내지 Ver.42의 발현백터를 제조하였다: Anti-HER2 scFv, Anti-EGFR scFv, Anti-MUC-1 scFv, Anti— CTLA-4 scFv, Antiᅳ LAG— 3 scFv, Ant i-TIM-3 scFv, Anti -KIR scFv, IL-2,4,6,7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-27, IFN-a, IFN-β, IFN-γ 및 GM-CSF. 실시예 2. 재조합 4-1BBL및 이를포함하는융합단백질의 생산
상기 실시예 1에서 확보된 발현 백터를 Exp iCHO-STM(Thermo fisher, #A29127) 세포에 ExpiCHO™ 발현 시스템 (Thermo fisher, USA, Cat No. A29129)을 이용하여 형질주입하였다. 37°C, 습한 상태 (humidified), 8% C02 및 120 rpm의 조건으로 셰이킹 (shaking)하1 서 , C02 인큐베이터에서 18 내지 22시간 배양한 후 ExpiCHOTM 인헨서 (enhancer) 및 피드 (feed)를 첨가하였다. 이후， 32°C, 습한 상태 (humidified)，
5% C02 및 120 rpm의 조건으로 셰이킹하면서, C02 인큐베이터에서 7 내지 10일간 배양하였다. 배양 7일 차에 0.6 mL의 세포를 취해 Vi-cell XR을 이용하여 살아있는 세포 밀도 (viable cell density)와 생존율 (viabi 1 ity)을 측정하였다.
살아있는 세포 밀도와 세포 생존율을 측정하여 생존율이 75%에 도달하면 배양액을 모아 3，600 rpm의 속도로 15분간 원심분리하여 상층액과 세포 펠렛을 분리하였다. 7일 차 생존율이 75% 이상이면 생존율이 75%에 도달할 때까지 추가 배양한 후 수득 (harvest)하였다. 원심분리가 완료된 배양액은 저장 용기 (storage bottle)가 장착된 0.22 um의 용기 탑 필터 (bottle top filter)에 상층액을 여과하였다. 실시예 3. 재조합 4-1BBL및 이를포함하는융합단백질의 정제
수득 완료한 배양액은 기본적으로 4°C에 보관하며 가능하면 즉시 정제를 진행하였다. Mabselect SuRe resinCGEHC, Cat No.28926977)을 이용하여 Protein A 친화성 크로마토그래피를 하기 표 1과 같은 프로토콜로 수행하였다.
【표 1]
Figure imgf000031_0001
실시예 4. 재조합 4-1BBL 및 이를 포함하는 융합단백질의 생산성 및 순도 확인
재조합 4-1BBL 변이체의 정제된 양 (생산성)을 Nano-drop UV 정량법을 이용하여 즉정하였다. ProtParam t oo 1 (ht t ps： //web . expasy . org/ rotparam/ )에서 아미노산 서열을 이용하여 단백질의 흡광 계수 (Ext inct i on coef f i ci ents) 값을 측정하였다. 이때， 흡광 계수는 물에서 측정한 280 nm에서 M一1 cm"1 단위로 나타내었다.
Nano-drop(nanophotometer N50 touch, T50740)에서 protein UV 정량을 선택한 후， 측정하고자 하는 단백질의 흡광 계수를 입력하고 정량하였다. 상기와 같은 과정을 3회 반복하였고 평균값으로 정량하였다. 또한， 재조합 4-1BBL 변이체의 순도는 하기와 같은 실험 조건으로 확인하였다.
Column: TSK-GEL G3000SWxL (7.8 x 300 瞧)
Mobi le phase : 50 mM Na-Pi , 300 mM NaCl , 10% ACN pH 7.0 Flow rate: 0.5 ml/min
Running time: 40 min
Inject ion Volume: 1 mg/ml , 20 μί
재조합 4-1BBL 변이체 및 이를 포함하는 융합단백
결과를 하기 표 2에 나타내었다.
【표 2]
Figure imgf000032_0001
4.1. 야생형 4-1BBL삼량체의 생산
4-1BBL의 경우 삼량체를 생산하기 위하여 링커를 이용하였다. 4-1BBL 단량체를 링커로 연결하여 삼량체 형태로 생산할 때 4-1BBL 단량체와 4-1BBL 단량체 사이의 거리가 10 내지 50 A가 될 수 있도록 3 내지 40개의 아미노산 링커를 사용하였다. 도 1의 Ver. 1 내지 42에사 상기와 같은 링커들을 도입하였다.
상기 표 2에서 확인할 수 있듯이， 링커의 길이 또는 사용한 4-1BBL의 아미노산 개수에 상관없이 Ver.l 내지 Ver.9의 생산성이 매우 낮음을 알 수 있었고 낮은 생산성으로 인해 순도를 확인할 수 없었다. 따라서, 링커로 야생형의 4-1BBL 삼량체를 생산하는 것은 매우 어려움을 알 수 있었다.
4.2. 4-1BBL변이체로 구성된 4-1BBL삼량체의 생산
상기 실시예 4.1의 문제를 해결하기 위하여, 4-1BBL 단량체에 3 종류의 변이서열을 도입하였다. 단량체를 생산하거나 단량체를 링커로 연결하였을 때， 자발적으로 이황화 결합을 이루어 삼량체가 형성될 수 있도록 4-1BBL 변이체 KQ146C/T241C) , 4-1BBL 변이체 2( I244C/A232C) 및 4-lBBL 변이체 3(F199C/V140C)을 제조하였다.
그 결과， Ver .10 내지 Ver .13, Ver .20 내지 Ver .27이 성공적으로 생산됨을 확인하고， 이들을 포함하는 보다 복잡한 형태의 융합단백질도 제조하여 확인하였다.
상기 표 2에 나타난 바와 같이， Ver .17 및 Ver .14 각각의 재조합 4-1BBL의 경우， 배양액으로부터 각각 4.4 mg 및 3.6 mg의 목적 단백질올 정제할 수 있었다. 이는 배양액 1 mL 당 각각 17 ug 및 14 ug에 해당하는 양으로서， 변이체가 만정적으로 삼량체를 이루어 안정화되고 생산성이 향상됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 도 2 및 도 3a의 겔 상에서도 확인할 수 있었으며， protein A 정제만으로도 순도 80% 이상의 물질을 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
4.3. 공지된 4-1BBL변이체로 구성된 4-1BBL삼량체의 생산
종래 기술 (TO 2016/029043 A1)은 4-1BBL 삼량체에 대하여 공지하고 있으나， 이론적인 가능성을 제시하고 있을 뿐， 구체적인 실함예는 보여주지 않고 있다. 공지된 변이체 중 두 종류 (L181C/G231C , L204C/Q94C)를 무작위적으로 선택하여 생산하였다 (Ver .28 내지 Ver .31) .
생산 결과， 상기 표 2에 나타난 바와 같이， 변이체 Ver .30 및 Ver .31 모두 생산성 및 순도가 본 발명의 변이체인 Ver . 14에 비해 현저히 낮아 측정이 불가능하거나 극소량이었다. 따라서， 종래 기술에서 예측하였던 변이체는 실제로는 생산이 되지 않는 것을 알 수 있었다. 실시예 5. IL-7-hyFc-4-lBBL의 활성 비교
본 발명에 따른 4-1BBL 변이체를 포함하는 융합 단백질을 생산한 후, 물질의 효능을 평가하였다. 4-1BBL 변이체를 포함하는 융합 단백질의 4-1BB 수용체 (receptor )에 대한 생물학적 활성을 측정하기 위해， 프로메가사의 4-1BB 바이오어세이 키트를 이용하여 리포터 어세이 (reporter assay)를 수행하였다. 4-1BB 리간드에 의해 4-1BB 수용체에 신호가 전달되면 NF-κΒ 유전자가 활성화되는데, 이때 NF-κΒ의 promoter 작동에 의해 luc i ferase가 발현되는 Jurkat T 세포주를 이용하였다.
조작된 Jurkat T 세포를 96 웰 플레이트에 넣고 야생형 4-1BBL 삼량체인
Ver .7 및 Ver .6 , 그리고 본 발명의 4-1BBL 변이체인 Ver . 17을 각각 처리하였다. 대조군으로 재조합 인간 4-1BB 리간드 (rM-lBBL)를 농도별로 처리하였다. 재조합 인간 4-1BB 리간드는 단량체 형태이기 때문에 2차 항체를 함께 처리하여 4-1BB 리간드를 교차 결합 (cross-l inking)시킴으로써 활성을 유도하였다. 이후, 37°C의 온도로 5% C02 인큐베이터에서 6시간 동안 반웅시키고， 루시페라아제 어세이 기질을 처리하여 1분간 반웅시킨 뒤 발광 ( luminescence)을 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이， Ver . 17의 EC50 값은 175. 1 pM 이었으며， 이는 263 pM의 EC50 값을 가진 Ver .7에 비해 효능이 향상된 것으로 확인되었다. Ver .6의 경우 활성을 거의 보이지 않았으며， 대조군으로 사용한 재조합 4-1BBL에 비해서도 Ver 7과 Ver . 17의 활성은 월등히 높앍다. 이때， Ver .7의 생산성을 겔 상에서 도 3b와 같이 나타내었다.
한편， Ver .5 및 Ver .6은 활성이 매우 낮았다. 따라서， 복잡한 형태의 융합 단백질에서도 본 발명에 따른 4-1BBL 변이체는 활성을 가지며， 이들의 활성이 다량체 형성을 유도시킨 재조합 4-1BBL에 비해서도 월등히 높음을 확인하였다. 실시예 6. TAA-hyFc-4-lBBL의 활성 비교
본 발명에 따른 4-1BBL 변이체에 종양 관련 항원 (Tumor associ ated ant igen, TAA)의 scFv를 결합하여 융합 단백질의 형태로 생산하였고， 이들의 물질의 효능을 평가하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 4-1BBL 삼량체에 CEA의 scFv를 융합한 경우， 순도 78.8% 및 20 ug/ml의 생산성올 보였다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이， 4-1BBL 삼량체에 FAP의 scF 를 융합한 경우， 순도 97% 및 9 ug/ml의 생산성을 보였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 4-1BBL 삼량체에 EpCAM의 scFv를 융합한 경우， 순도 91.5%, 28 ug/ml의 생산성을 보였다.
또한， TM를 포함하는 융합 단백질의 4-1BBL 변이체가 활성을 가지는지 상기 실시예 5와 같은 방법으로 확인하였다. 도 8에 나타난 바와 같이， TAA-hyFc-4-lBBL 물질 3종 (Ver .32 내지 Ver .34) 모두 높은 활성을 나타내었다. 대조군인 재조합 인간 4-1BB 리간드 (rM-lBBL)에 비하여 유의적으로 높아 약효를 나타내기에 층분함을 알 수 있었다.
EC50 값은 Ver .32의 경우 136.8 pM, Ver .33의 경우 246.4 pM, Ver .34의 경우 240.3 pM의 EC50 값을 가진 것으로 확인되었다. 상기 값 정도의 생물학적 활성은 항암제로 사용하였을 때, 융합 단백질이 종양 특이적으로 분포하면서 주변의 T 세포나 NK 세포를 활성화 시키기에 충분한 수준이다. 실시예 7. ICIs-hyFc-4-lBBL의 활성 비교
본 발명에 따른 4-1BBL 변이체에 면역관문억제제로서 PD-1/PDL-1을 융합하여 융합 단백질을 제조하였다. 도 9에 나타난 바와 같이， ant i-PD-Ll scFV를 융합하여 4-1BBL 변이체를 생산한 경우, 순도 88.¾ 및 46 ug/ml의 높은 생산성을 보였다. 생산된 물질이 활성을 가지는지 확인하였을 때， 도 10에 나타난 바와 같이， 233.8 pM의 EC50 값올 가진 것으로 확인되었다. 이는 항암 효능을 가지기에 충분한 활성이며， 융합된 PD-1/PDL-1 면역관문억제제의 효과와 함께 작용하여 상승효과를 가질 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
야생형 4-1BBL의 146/241, 232/244 또는 140/199 위치에 상웅하는 아미노산이 시스테인으로 치환된 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편.
【청구항 2】
제 1항에 있어서，
상기 4-1BBL은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편.
【청구항 3]
제 1항에 있어서,
상기 4-1BBL 변이체 단편은 변이된 4-1BBL의 세포외영역인 것인， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편.
【청구항 4】
제 1항에 있어서,
상기 4-1BBL 변이체 단편은 하기 구조식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드인 것인， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편:
N-말단 확장 도메인—코어 도메인 -C 말단 확장 도메인 (I)
상기 식 (I)에서， 코어 도메인은 서열번호 14， 15 또는 16의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서， 서열번호 17의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 33개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며 ;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서， 서열번호 18의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 15개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
【청구항 5]
제 4항에 있어서,
상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 17의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N—말단으로부터 C-말단 방향으로 30개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편.
【청구항 6】
제 4항에 있어서,
상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 17의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 22개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편.
【청구항 7】
제 4항에 있어서，
상기 Nᅳ말단 확장 도메인이 서열번호 17의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 17개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편.
【청구항 8】
게 4항에 있어서，
상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 18의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 7개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편.
【청구항 9]
제 4항에 있어서，
상기 4-1BBL 변이체 단편은 서열번호 8， 서열번호 10 , 서열번호 12， 서열번호 14， 서열번호 15， 서열번호 16 , 서열번호 19， 서열번호 20， 서열번호 21， 서열번호 22， 서열번호 23， 서열번호 24 , 서열번호 25， 서열번호 26， 서열번호 27， 서열번호 28， 서열번호 29 및 서열번호 30로 표시되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나인 것인， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편.
【청구항 10]
거 U항 내지 게 9항의 어느 한 항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편; 및 활성 단백질을 포함하는 제 1형 융합 단백질.
【청구항 11】
제 10항에 있어서,
상기 활성 단백질은 사이토카인， 항-종양관련항원 (TAA) 항체의 scFv 영역 및 면역관문억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인， 제 1형 융합 단백질.
【청구항 12】
제 11항에 있어서，
상기 사이토카인은 IL-2, 11-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-27, IFN-a IFN-β, IFN-γ 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인， 제 1형 융합 단백질.
【청구항 13]
제 11항에 있어서,
상기 종양관련항원은 CD2, CD5, CD7, CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, CD25, CD30
CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD71, CD72, CD73, CD105, CD117, CD123, c-Met , PDGFR, IGFl-R, HMW-MAA, TAG-72, GD2, GD3, GM2, folate receptor, Ley, melanoma ant i gen E (MAGE) , NY-ESO-1 , carcinoembryonic antigen (CEA) , mucin 1 cell surface associated (MUC-1), MUC-2, PSMA, PSCA, uPAR, prostatic acid phosphatase (PAP), prostate specific antigen (PSA), survivin, tyrosine related protein 1 (tyrpl) , tyrosine related protein 1 (tyrp2) , Brachyury, Mesothel in, Epidermal growth factor receptor (EGFR) , human epidermal growth factor receptor 2 (HER— 2)， HER-3 , HER4, VEGF , galect in, ERBB2, Wilms tumor protein(WTl) , fibroblast activation protein (FAP) , EpCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인， 제 1형 융합 단백질.
【청구항 14]
제 11항에 있어서,
상기 면역관문억제제는 항 -PD-L1 항체, 항 -PD-1 항체, 항 -CTLA4 항체， 항 PD-L2 항체, LTF2 조절 항체， 항 -LAG3 항체, 항 -A2aR 항체， 항 -TIGIT 항체， 항 -TIM-3 항체， 항 -B7-H3 항체， 항 -B7-H4 항체， 항 -VISTA 항체， 항 -CD47 항체， 항 -BTLA 항체， 항 -KIR 항체， 항 -ID0 항체 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인， 게 1형 융합 단'백질.
【청구항 15]
제 10항에 있어서，
상기 융합 단백질은 링커 및 /또는 융합 파트너를 더 포함하는 것인， 게 1형 융합 단백질.
【청구항 16]
제 15항에 있어서，
상기 링커는 3 내지 40개의 아미노산으로 구성된 펩타이드인 것인， 제 1형 융합 단백질.
【청구항 17]
제 15항에 있어서,
상기 융합 파트너는 Fc 영역， Fc 영역의 변이체， 하이브리드형 Fc 영역, PEG, XTEN, CTP 및 알부민으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 제 1형 융합 단백질.
【청구항 18]
제 1항 내지 게 9항의 어느 한 항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편올 포함하는 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체.
【청구항 19]
제 18항에 있어서,
상기 삼량체는 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편이 직접 연결된 형태인 것인， 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체.
【청구항 20】
제 18항에 있어서，
상기 삼량체는 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편이 링커를 통해 연결된 형태인 것인， 4-1BBL 변미체 또는 이의 단편의 삼량체.
【청구항 21】
제 18항 내지 제 20항의 어느 한 항의 삼량체 및 활성 단백질을 포함하는 제 2형 융합 단백질.
【청구항 22]
제 21항에 있어서,
상기 활성 단백질은 사이토카인， 항-종양관련항원 (TAA) 항체의 scFv 영역 및 면역관문억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 게 2형 융합 단백질.
【청구항 23]
제 1항 내지 제 9항의 어느 한 항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편; 및 활성 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 제 1형 융합 단백질 삼량체 .
【청구항 24】 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
i) 게 1항 내지 제 9항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편;
ii) 제 10항 내지 제 17항의 제 1형 융합 단백질;
iii) 제 18항 내지 제 20항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체;
iv) 제 21항 및 제 22항의 제 2형 융합 단백질; 및
v) 제 23항의 게 1형 융합 단백질 삼량체.
【청구항 25】
하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
i) 제 1항 내지 제 9항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편;
ii) 제 10항 내지 제 17항의 제 1형 융합 단백질;
iii) 제 18항 내지 제 20항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체;
iv) 제 21항 및 제 22항의 제 2형 융합 단백질; 및
v) 제 23항의 게 1형 융합 단백질 삼량체 .
【청구항 26】
제 24항 또는 제 25항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법 .
【청구항 27】
제 26항에 있어서，
상기 투여는 복강내， 정맥내， 근육내, 피하， 피내， 경구， 비내， 폐내 및 직장내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행되는 것인， 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법 .
【청구항 28】
하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드: i ) 제 1항 내지 제 9항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편;
i i ) 제 10항 내지 제 17항의 제 1형 융합 단백질;
i i i ) 제 18항 내지 제 20항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체;
iv) 제 21항 및 제 22항의 제 2형 융합 단백질; 및
V) 제 23항의 제 1형 융합 단백질 삼량체.
【청구항 29】
제 28항의 뉴클레오티드가 작재된 발현 백터.
【청구항 30]
제 29항의 발현 백터로 형질감염된 숙주 세포. 【청구항 31]
제 30항의 형질감염된. 숙주세포로부터 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 단백질 제조 방법 :
i) 제 1항 내지 제 9항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편;
ii) 제 10항 내지 제 17항의 제 1형 융합 단백질;
iii) 제 18항 내지 제 20항의 4-1BBL 변이체 또는 이의 단편의 삼량체;
iv) 제 21항 및 제 22항의 제 2형 융합 단백질; 및
V) 제 23항의 제 1형 융합 단백질 삼량체.
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