CN117586400A - 结合4-1bb的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合人4‑1BB的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。还提供了一种编码该抗体的核酸分子、一种表达载体、一种宿主细胞和一种表达该抗体的方法。本公开还提供了一种双特异性分子和一种包含该抗体或双特异性分子的药物组合物，以及一种使用本公开的抗4‑1BB抗体的治疗方法。

Description

结合4-1BB的抗体及其用途
本申请为2020年9月30日提交的、发明名称为“结合4-1BB的抗体及其用途”的PCT申请PCT/CN2020/119388的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2022年4月8日，申请号为202080071050.2。
相关申请案交叉引用
本申请要求于2019年10月11日提交的美国临时申请第62/913,744号的优先权，其全文通过引用方式整体并入本文。
技术领域
本公开整体涉及一种特异性结合人4-1BB并具有功能性的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体，或其抗原结合部分。还提供了一种编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子、一种表达载体、一种宿主细胞和一种表达该抗体或其抗原结合部分的方法。本公开还提供了一种双特异性分子。此外，本公开还提供了一种包含该抗体或其抗原结合部分的药物组合物，以及一种使用本公开的抗体或其抗原结合部分的治疗方法。
背景技术
4-1BB，也称为CD137或TNFRSF9，是肿瘤坏死因子受体家族的成员。其最主要的特征是作为T细胞表面上调节TCR诱导的T细胞激活的共刺激分子。4-1BB在与4-1BBL(4-1BB的表达于激活的抗原呈递细胞上的主要天然配体)结合后，上调抗细胞凋亡分子，并促进细胞因子的产生和效应子功能。4-1BB也存在于树突状细胞、激活的单核细胞、NK细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，并且据报道，4-1BB信号传导刺激IFN-γ分泌并促进NK细胞增殖和DC激活(Cariad Chester等(2018)Blood 131(1):49-57)。
另一方面，在肿瘤细胞上和癌症患者的血清中观察到4-1BB表达。4-1BB在炎症部位(主要在肿瘤微脉管和动脉粥样硬化区域内)沿血管壁的表达表明其可以介导白细胞迁移(Drenkard D等(2007)FASEB J.21(2):456-463)。此外，将4-1BB连接到调节性T细胞(Treg)上可诱导Treg增殖(Zhang P等(2007)Scand J Immunol.66(4):435-440)。
为了探究4-1BB的复杂功能，Melero等在1997年测试了激动性抗4-1BB抗体对低免疫原性Ag104A肉瘤和高免疫原性P815肥大细胞瘤的作用，并揭示了4-1BB激动剂的抗肿瘤活性(Melero I等(1997)Nature Med.3(6):682-685)。后来有报道称，约60％的12月龄4-1BBL-/-小鼠患上了B细胞淋巴瘤，并且4-1BBL-/-小鼠的NK细胞数量和活性均有所下降(Middendorp S等(2009)Blood114(11):2280-2289；Vinay D.S.等(2004)J.Immunol.173(6):4218-4229)。注射B16.F10黑色素瘤细胞后，4-1BB-/-小鼠的死亡率升高，但4-1BB+/+小鼠则未见该效应(Ju S.A等(2005)Immunol.Cell Biol.83(4):344-351)。根据这些发现，4-1BB已成为强力的免疫系统激活剂和候选免疫治疗靶点。研究表明，4-1BB激动剂可用于治疗肿瘤、病毒感染和自身免疫性疾病，以及提高移植物的存活率(Seo S.K等(2004)NatureMed.10(10):1088-1094；Sun Y等(2002)J.Immunol.168(3):1457-1465；Agarwal A等(2008)Curr.Opin.Organ.Transplant13(4):366-372)。
特别地，对4-1BB在癌症中的作用的研究远多于对其在其他病理状态中的作用的研究。研究发现，4-1BB信号传导破坏并逆转细胞毒性T淋巴细胞中建立的免疫失能。例如，在B16.SIY黑色素瘤模型中，施用抗4-1BB单克隆抗体使丧失了IL-2分泌能力的CD8+TIL的功能得到了恢复(Cariad Chester等(2018)，同上)。尽管抗4-1BB单克隆抗体的大部分抗肿瘤作用由CD8+T细胞实现，但NK细胞、NKT细胞、树突细胞和CD4+T细胞也被证明是肿瘤治疗的关键和必要条件(Dass S.V等(2014)BMB Rep.47(3):122-129)。此外，研究发现，在施用抗4-1BB抗体后，一些粘附分子(诸如ICAM-1和CXAM-1)的上调促进了T细胞向肿瘤位点的迁移(Palazon A等(2011)Cancer Res.71(3):801-811)。更重要的是，抗4-1BB疗法的有效性也已在其他实体瘤和淋巴瘤(诸如滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌和鳞状肺癌)的临床前模型中得到了证实(Cariad Chester等(2018)，同上)。
Urelumab是BMS公司开发的全人IgG4单克隆抗体，是首个进入临床试验的抗4-1BB治疗药物。它特异性结合并激活表达4-1BB的免疫细胞，并在1期和2期单一疗法试验中显示出可喜的有效性，但具有剂量依赖性肝毒性。耐受剂量下Urelumab的单一疗法和组合疗法虽然显示出有潜力的免疫刺激药效学效应，但抗肿瘤作用有限。Utomilumab是辉瑞公司的人源化IgG2单克隆抗体，其显示出优异的安全性，但与Urelumab相比是较弱的4-1BB激动剂。目前正在开展Utomilumab联合利妥昔单抗、帕博利珠单抗(可瑞达)、阿维鲁单抗和一些其他抗肿瘤抗体治疗各种癌症的临床试验研究(Cariad Chester等(2018)，同上)。
此外，抗4-1BB抗体和其他抗体(诸如抗PD-1抗体)的组合疗法也正在进行临床试验。例如，需要可以同时靶向PD-L1和4-1BB从而阻断PD-1/PD-L1通路并在表达PD-L1的肿瘤细胞进行PD-L1交联时通过4-1BB提供共刺激信号的双特异性抗体。然而，专利US_2017_0198050_A1中所述的双特异性抗体无需与靶细胞交联即可激活或诱导4-1BB信号传导，引起了对4-1BB在高浓度下诱导的潜在毒性的担忧。
因此，本领域仍然需要开发在安全性和激动作用之间取得最佳平衡的新型抗4-1BB抗体。此外，此类抗4-1BB抗体也将有助于构建新型双特异性抗体，包括可以结合4-1BB和其他抗原(例如，PD-L1)的双特异性抗体。此类可以特异性结合4-1BB同时以较高的亲和力结合其他抗原(诸如PD-L1)的双特异性抗体也是4-1BB抗体领域开发工作的目的。
发明内容
本公开提供了一种特异性结合4-1BB(例如，人4-1BB)的分离的单克隆激动性抗体，例如人、小鼠、嵌合或人源化单克隆抗体，或其抗原结合部分。在一个实施方案中，本发明的抗体提供了在安全性和激动作用之间的最佳平衡。
本公开的抗体或其抗原结合部分可用于多种应用，包括检测4-1BB蛋白以及治疗4-1BB相关疾病，诸如肿瘤、感染和自身免疫性疾病。
因此，在一个方面，本公开涉及一种结合4-1BB的分离的单克隆抗体(例如，人抗体)或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分具有包含CDR1区、CDR2区和CDR3区的重链可变区，其中该CDR1区、该CDR2区和该CDR3区包含分别与以下序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3；(2)SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；(3)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；或(4)SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
在一个方面，本公开的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ IDNO:77具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段结合4-1BB。
在一个方面，本公开的结合4-1BB的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中该CDR1区、该CDR2区和该CDR3区包含分别与以下序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；(2)SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQID NO:12；(3)SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；或(4)SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24。
在一个方面，本公开的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:26(X1＝S或G)、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:78具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段结合4-1BB。
在一个方面，本公开的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和该轻链可变区各自包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中该重链可变区CDR1、CDR2和CDR3以及该轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3包含分别与以下序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；(2)SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；(3)SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；或(4)SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24，其中该抗体或其抗原结合片段结合4-1BB。
在一个实施方案中，本公开的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和该轻链可变区包含分别与以下序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(X1＝S)；(2)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(X1＝G)；(3)SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；(4)SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30；(5)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32，(6)SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78，其中该抗体或其抗原结合片段结合4-1BB。
在一个实施方案中，本公开的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，该轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中该重链恒定区可以是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，该轻链恒定区可以是人λ或κ恒定区，并且该重链可变区和该轻链可变区包含上述氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段结合4-1BB。在另一个实施方案中，重链恒定区包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，轻链恒定区包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。重链恒定区可以是其他合适的恒定区，诸如来源于人IgG恒定区的恒定区，例如具有SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的含突变S228P的IgG4恒定区，或具有SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的含突变L234A、L235A、D265A、P329A(Eu编号)的IgG1恒定区。轻链恒定区可以是来源于人κ或λ恒定区的其他合适的恒定区。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含通过二硫键连接的两条重链和两条轻链或由其组成，其中每条重链都包含上述重链恒定区、重链可变区或CDR序列，并且每条轻链都包含上述轻链恒定区、轻链可变区或CDR序列，其中重链可变区的C末端与重链恒定区的N末端连接，并且轻链可变区的C末端与轻链恒定区的N末端连接。本公开的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4同种型的全长抗体。本公开的抗体可含有κ或λ恒定区。在其他实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合部分可以是单链可变片段(scFv)抗体，或抗体片段，诸如Fab或Fab'2片段。
本公开的示例性抗体或其抗原结合部分是特异性结合4-1BB，特别是人4-1BB并激活4-1BB信号传导的激动性抗4-1BB抗体。
本公开还提供了一种双特异性分子，该双特异性分子包含本公开的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与具有与该抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性的第二功能性部分(例如，第二抗体)连接。双特异性分子可结合4-1BB和另一种分子，诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4，优选地，该分子是PD-L1。
在一个方面，本公开的抗体是指双特异性抗体。因此，本公开还提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含特异性结合4-1BB(例如，人4-1BB)的第一结合区和特异性结合与癌症、感染或自身免疫性疾病相关的第二抗原的第二结合区。在一个实施方案中，第二抗原选自(人)PD-1、PD-L1或CTLA-4。更优选地，第二抗原是(人)PD-L1。在一个实施方案中，特异性结合4-1BB的第一结合区包含如上所述的重链可变区，和/或如上所述的轻链可变区。在一个实施方案中，第一结合区包含如上所述的重链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区，和/或如上所述的轻链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区。在一个实施方案中，第一结合区以高亲和力特异性结合(人)4-1BB和第二抗原。
在一个实施方案中，上述双特异性抗体包含以高亲和力特异性结合人4-1BB的第一结合区和以高亲和力特异性结合人PD-L1的第二结合区，以便仅在具有PD-L1表达的肿瘤微环境中具有活性，同时避免全身性刺激T细胞。
还提供了包含本公开的抗体或其抗原结合部分或双特异性分子，以及药学上可接受的载体的组合物。在一个实施方案中，该组合物是药物组合物。
本公开还涵盖编码本公开的抗体或其抗原结合部分或抗体链的核酸分子，以及包含此类核酸的表达载体和包含此类表达载体或基因组整合有编码抗体或其抗原结合部分的多核苷酸的宿主细胞。还提供了一种使用包含表达载体的宿主细胞制备抗4-1BB抗体的方法，该方法包括以下步骤：(i)在该宿主细胞中表达该抗体，以及(ii)从该宿主细胞或其细胞培养物中分离该抗体。
在又一个方面，本公开提供了一种治疗受试者的癌症疾病的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用本公开的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该方法包括在受试者中施用本公开的组合物或双特异性分子，或另选的能够表达本公开的组合物或双特异性分子的核酸分子。双特异性分子可结合4-1BB和另一种蛋白质，诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4，优选PD-L1。在一些实施方案中，至少一种另外的抗体可与本公开的抗体或其抗原结合部分，诸如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体一起施用。在一些实施方案中，至少一种另外的抗癌药物可与本公开的抗体或其抗原结合部分一起施用。癌症可以是实体或非实体癌，例如胃肠道癌，诸如结肠癌、结肠直肠癌或直肠癌。
在另一方面，本公开公开了一种治疗受试者的感染的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用本公开的抗体、其抗原结合部分、特异性分子或药物组合物，任选地与另外的抗病毒剂、抗细菌剂或抗真菌剂一起施用。
在另一方面，本公开公开了一种治疗自身免疫性疾病的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用本公开的抗体、其抗原结合部分、特异性分子或药物组合物。自身免疫性疾病可以是哮喘或类风湿性关节炎。任选地，可施用另外的抗哮喘剂或抗类风湿性关节炎剂。
从下文具体实施方式和实施例中可以清楚地了解本公开的其他特征和优点，这些具体实施方式和实施例不应理解为是限制性的。本申请全文中引用的所有参考文献、Genbank条目、专利和公开的专利申请的内容明确通过引用方式并入本文。
附图说明
图1A至图1D示出了ELISA测定中抗4-1BB抗体41BB-2-IgG2(A)、41BB-9-IgG2(B)、41BB-13-IgG2(C)和41BB-27-IgG2(D)与人4-1BB的结合能力。
图2A和图2B示出了ELISA测定中抗4-1BB抗体41BB-2-IgG2、41BB-9-IgG2、41BB-13-IgG2(A)和41BB-27-IgG2(B)与人CD40、人HVEM、人OX40、人CD27、人GITR和恒河猴4-1BB的结合能力。
图3A至图3G示出了抗4-1BB抗体41BB-2-IgG2、41BB-9-IgG2、41BB-13-IgG2和41BB-27-IgG2在存在或不存在交联的情况下对4-1BB信号传导的激动活性。
图4A至图4B示出了抗4-1BB抗体41BB-2-IgG1、41BB-9-IgG1、41BB-13-IgG1和41BB-27-IgG4在存在或不存在交联剂的情况下对4-1BB信号传导的激动活性。
图5A至图5B示出了双特异性抗体P4B-3(A)和P4B-2(B)的结构。
图6示出了ELISA测定中双特异性抗体与人PD-L1的结合。
图7示出了ELISA测定中双特异性抗体与人4-1BB的结合。
图8示出了在存在靶细胞CHO-K1-PDL1细胞的情况下的4-1BB报告基因测定中，双特异性抗体(P4B-3和NM21-PRO1186)诱导PD-L1结合依赖性4-1BB刺激的能力。
图9A和图9B示出了在存在和不存在靶细胞A375/PD-L1的情况下的4-1BB报告基因测定中，双特异性抗体(P4B-3和INBRX-105-1)诱导4-1BB刺激的能力。
图10示出了P4B-3激活人PBMC释放IL-2。
图11示出了治疗后的肿瘤生长曲线。
图12示出了TME(肿瘤微环境)中mCD3的mCD8+T细胞百分比。
图13示出了TME中mCD4的mTreg百分比。
具体实施方式
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
术语“4-1BB”是指肿瘤坏死因子受体超家族成员9。术语“4-1BB”包括变体、同种型、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，特异于人4-1BB蛋白的抗体在某些情况下可与来自人以外的物种(诸如猴)的4-1BB蛋白发生交叉反应。在其他实施方案中，特异于人4-1BB蛋白的抗体可完全特异于人4-1BB蛋白，并且对其他物种或其他类型不表现出交叉反应性，或者可与来自某些其他物种但并非所有其他物种的4-1BB发生交叉反应。
术语“人4-1BB”是指具有来自人的氨基酸序列，诸如Genbank登录号为NP_001552.2的人4-1BB的氨基酸序列的4-1BB蛋白质。在一个实施方案中，人4-1BB包含SEQ IDNO:39所示的氨基酸序列。术语“猴或恒河猴4-1BB”和“小鼠4-1BB”分别指猴和小鼠4-1BB序列，例如具有Genbank登录号分别为NP_001253057.1和NP_033430.1的氨基酸序列的猴和小鼠4-1BB序列。
如本文所提到的术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。此外，如本文所提到的术语“抗体”还涵盖多特异性抗体，诸如双特异性抗体或三特异性抗体。完整抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每一条重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每一条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，即CL。VH区和VL区可以进一步细分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，所述高变区与被称为框架区(FR)的更保守的区域交替。每一个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)指的是抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如4-1BB蛋白)特异性结合的能力。已经证实的是，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；和(vii)纳米抗体，即含有单一可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使得它们能够被制成单一蛋白质链，其中所述VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这些单链抗体也意图被涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用筛选片段。
术语“双特异性”是指抗体能够特异性结合至少两个不同的抗原决定簇。通常，双特异性抗体包含两个抗原结合区，其中各抗原结合区特异于不同的抗原决定簇。在某些实施方案中，双特异性抗体能够同时结合两个抗原决定簇，特别是在两个不同的细胞上表达的两个抗原决定簇。如本文所用的术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上抗原结合部分所结合的形成抗原结合区-抗原复合物的位点(例如，氨基酸的连续区段或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)。有用的抗原决定簇可存在于例如肿瘤细胞表面、病毒感染细胞表面、其他疾病细胞表面、免疫细胞表面、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)。
如本文所用的术语“抗原结合区”是指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合区能够将其所连接的主体(例如，第二抗原结合区)引导至靶位点，例如引导至特定类型的携带抗原决定簇的肿瘤细胞。在另一个实施方案中，抗原结合区(例如，第一抗原结合区)能够通过其靶抗原，例如T细胞受体抗原激活信号传导。抗原结合区包括如本文所定义的抗体或其抗原结合片段。特定的抗原结合区包括抗体的抗原结合片段，该抗体包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中，抗原结合区可包含如本文所定义和本领域已知的抗体恒定区。
“特异性结合”是指结合对抗原具有选择性，并且可与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合区结合特定抗原决定簇的能力可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪器上进行分析)来测定。
除非另有说明，否则如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如，单克隆抗体和抗原、抗原结合区和抗原、或受体及其配体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。亲和力可通过本领域已知的公认方法来测定，包括本文所述的方法。
如本文所用的“分离的抗体”意图指的是基本上不含具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合4-1BB蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除4-1BB蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人类4-1BB蛋白的分离的抗体可以对其它抗原，如来自其它物种的4-1BB蛋白具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指的是具有单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位显示出单一结合特异性和亲和力。
如本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，可变区中的框架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本公开的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人抗体”并非旨在包括其中来源于另一哺乳动物种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
术语“激动性4-1BB抗体”或“激动性抗4-1BB抗体”是指结合4-1BB并激活或诱导4-1BB信号传导以促进免疫细胞(诸如T细胞)的激活和/或增殖的抗4-1BB抗体。
术语“同种型”指的是由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
如本文所用的“特异性结合人4-1BB”的抗体意指结合人4-1BB蛋白(和可能的来自一种或多种非人物种的4-1BB蛋白)但基本上不结合非4-1BB蛋白的抗体。优选地，抗体以1.0×10-6M或更低，优选5.0×10-7M或更低，更优选1.0×10-7M或更低的KD结合人4-1BB蛋白。
如本文所用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指不特异性结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即以1.0×10-6M或更高，优选1.0×10-5M或更高，优选1.0×10-4M或更高，更优选1.0×10-3M或更高，甚至更优选1.0×10-2M或更高的KD结合蛋白质或细胞。
对于IgG抗体或其抗原结合区，术语“以高亲和力特异性结合第二抗原(PD-L1)”是指抗体或抗原结合区具有1.0×10-8M或更低，优选5.0×10-9M或更低，更优选1.0×10-9M或更低的KD。
如本文所用的术语“K缔合”或“Ka”意图指的是特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用的术语“K解离”或“Kd”意图指的是特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用的术语“KD”意图指的是解离常数，其是由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得的并且被表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域中公认的方法来确定。用于确定抗体的KD的优选方法是通过使用表面等离子共振，优选地使用生物传感器系统，如BiacoreTM系统。
术语“EC50”也被称为半数最大有效浓度，指的是在指定的暴露时间之后引起基线与最大值之间的一半响应的抗体浓度。
术语“IC50”也称为半数抑制浓度，是指相对于抗体不存在时，将特定生物或生化功能抑制50％的抗体浓度。
术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物，尽管哺乳动物是优选的，如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛和马。
术语“治疗有效量”是指足以预防或改善与疾病或病况(诸如癌症)相关的症状和/或减轻疾病或病况的严重性的本公开抗体的量。治疗有效量被理解为与所治疗的病况有关，其中实际有效量是本领域技术人员容易辨别的。
如本文所述的术语“治疗剂”涵盖有效预防或治疗肿瘤(诸如癌症)或感染或自身免疫性疾病的任何物质，包括化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其他抗体(例如，针对免疫检查点分子的抗体)、抗感染剂、免疫调节剂、小分子药物。
术语“化疗剂”包括用于治疗癌症的化合物。
术语“抗感染剂”包括在施用浓度和施用间隔下特异性抑制或消除微生物(诸如病毒、细菌、真菌或原生动物，例如寄生虫)的生长但对宿主不致命的任何分子。
如本文所用，术语抗感染剂包括抗生素、抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂。在一个具体方面，抗感染剂在施用浓度和施用间隔下对宿主是无毒的。
免疫调节剂包括免疫检查点分子抑制剂和共刺激分子激活剂。
术语“小分子药物”是指能够调节生物过程的低分子量有机化合物。“小分子”定义为分子量通常小于2kD，优选小于1kD，更优选约0.5kD或更小的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机成分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾病。
术语“肿瘤”指所有赘生性细胞生长和增殖(无论是恶性的还是良性的)，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“感染”是指病原体引发的疾病，包括例如病毒感染、细菌感染、真菌感染或者原生动物诸如寄生虫感染。
术语“肿瘤免疫逃逸”是指肿瘤逃避免疫识别和清除。因此，作为治疗概念，当所述逃逸减弱时，肿瘤免疫得到“治疗”，肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的示例包括肿瘤结合、肿瘤收缩和肿瘤清除。
在以下小节中进一步详细描述本公开的各个方面。
对人4-1BB具有结合亲和力的抗4-1BB抗体
本公开的示例性抗体或其抗原结合部分特异性结合人4-1BB。本公开的示例性抗体或其抗原结合部分是激动性抗体，该激动性抗体激活或诱导4-1BB信号传导以促进免疫细胞(诸如T细胞)的激活和/或增殖。
在一个方面，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含三个重链可变区CDR：CDR1、CDR2和CDR3。
在另一方面，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含三个轻链可变区CDR：CDR1、CDR2和CDR3。
在又一方面，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含三个重链可变区CDR：CDR1、CDR2和CDR3；以及三个轻链可变区CDR：CDR1、CDR2和CDR3。
在另一方面，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区。
在另一方面，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区。
在又一方面，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。
在一个实施方案中，重链可变区包含三个重链可变区CDR：CDR1、CDR2和CDR3。
在另一个实施方案中，轻链可变区包含三个轻链可变区CDR：CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，三个重链可变区CDR1、CDR2和CDR3是：
(i)来源于重链可变区VH的CDR1、CDR2和CDR3，其中该VH包含SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31
或SEQ ID NO:77所示的序列或由其组成，或
(ii)(i)的CDR1、CDR2和CDR3，其与(i)的三个CDR相比，还共计包含至少一个且不超过5个氨基酸修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一个实施方案中，三个轻链可变区CDR：CDR1、CDR2和CDR3是：
(i)来源于轻链可变区VL的CDR1、CDR2和CDR3，其中该VL包含SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32
或SEQ ID NO:78所示的序列或由其组成，或
(ii)(i)的CDR1、CDR2和CDR3，其与(i)的三个CDR相比，还共计包含至少一个且不超过5个氨基酸修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
来源于该重链可变区VH的三个重链可变区CDR：CDR1、CDR2和CDR3，其中该VH由SEQID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:77所示的序列组成；和来源于该轻链可变区VL的三个轻链可变区CDR：CDR1、CDR2和CDR3，其中该VL由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:78所示的序列组成。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
(1)来源于由SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:77所示的序列组成的重链可变区的三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3；和来源于由SEQID NO:26或SEQ ID NO:78所示的序列组成的轻链可变区的三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3；
(2)来源于由SEQ ID NO:27所示的序列组成的重链可变区的三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3；和来源于由SEQ ID NO:28所示的序列组成的轻链可变区的三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3；
(3)来源于由SEQ ID NO:29所示的序列组成的重链可变区的三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3；和来源于由SEQ ID NO:30所示的序列组成的轻链可变区的三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3；
(4)来源于由SEQ ID NO:31所示的序列组成的重链可变区的三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3；和来源于由SEQ ID NO:32所示的序列组成的轻链可变区的三个CDR：CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，VH CDR1包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:19的氨基酸序列或由其组成，或VH CDR1包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:19的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，VH CDR2包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由其组成，或VH CDR2包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，VH CDR3包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由其组成，或VH CDR3包含与选自SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:21的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，VL CDR1包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:22的氨基酸序列或由其组成，或VL CDR1包含与选自SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:22的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，VL CDR2包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:23的氨基酸序列或由其组成，或VL CDR2包含与选自SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:23的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，VL CDR3包含选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成，或VL CDR3包含与选自SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:24的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，三个重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3是：
(i)分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，或
(ii)分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，或
(iii)分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，或
(iv)分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，或
(v)(i)至(iv)中的任一项的CDR1、CDR2和CDR3，其与(i)至(iv)中的任一项的三个CDR相比，还共计包含至少一个且不超过5个氨基酸修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一个实施方案中，三个轻链可变区VL CDR：CDR1、CDR2和CDR3是：
(i)分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，或
(ii)分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，或
(iii)分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，或
(iv)分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，或
(v)(i)至(iv)中的任一项的CDR1、CDR2和CDR3，其与(i)至(iv)中的任一项的三个CDR相比，还共计包含至少一个且不超过5个氨基酸修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列组成的VH CDR1、CDR2和CDR3，和分别由SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列组成的VLCDR1、CDR2和CDR3；
(ii)分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列组成的VHCDR1、CDR2和CDR3，和分别由SEQ ID NO:10、SEQID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列组成的VL CDR1、CDR2
和CDR3；
(iii)分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的序列组成的VHCDR1、CDR2和CDR3，和分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的序列组成的VL CDR1、CDR2和CDR3；或
(iv)分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的序列组成的VHCDR1、CDR2和CDR3，和分别由SEQ ID NO:22、
23和24所示的序列组成的VL CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，重链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQID NO:77的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQID NO:77的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:77的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸修饰(优选氨基酸取代，更优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成，优选地，这些氨基酸修饰不在CDR区中发生，更优选地，这些氨基酸修饰在FR区，例如FR1、FR2、FR3或FR4区中发生。
在另一个实施方案中，轻链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQID NO:78的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQID NO:78的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:78的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸修饰(优选氨基酸取代，更优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成，优选地，这些氨基酸修饰不在CDR区中发生，更优选地，这些氨基酸修饰在FR区，例如FR1、FR2、FR3或FR4区中发生。
在一个实施方案中，可变区可进行修饰以改善抗体的纯化。例如，在重链可变区的末端，氨基酸可从S突变为G，以获得可以高纯度制备的抗体。
在另一个实施方案中，可变区可进行修饰以提高抗体或抗原结合部分(例如，scFv)的稳定性。例如，可进行突变以在重链可变区和轻链可变区之间形成二硫键。例如，重链可变区中的突变是G44C(Eu编号)和/或轻链可变区中的突变是T104C(Eu编号)。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQID NO:31或SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列或由其组成，和/或
轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32或SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种抗4-1BB抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或由其组成；和轻链可变区，该轻链可变区由SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列组成；
(2)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或由其组成；和轻链可变区，该轻链可变区由SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列组成；
(3)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或由其组成；和轻链可变区，该轻链可变区由SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列组成；
(4)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或由其组成；和轻链可变区，该重链可变区由SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列组成；或
(5)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列或由其组成；和轻链可变区，该轻链可变区由SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列组成。
在又一方面，抗4-1BB抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
在一个实施方案中，重链恒定区是或来源于人IgG恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，优选IgG1恒定区或IgG2恒定区或IgG4恒定区。
在另一个实施方案中，重链恒定区
(i)包含与SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)包含与SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸修饰(优选氨基酸取代，更优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，轻链恒定区是或来源于κ或λ轻链恒定区，例如人κ或λ轻链恒定区，例如人λ轻链恒定区。
在另一个实施方案中，轻链恒定区
(i)包含与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)包含与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸修饰(优选氨基酸取代，更优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，抗体的恒定区可进行突变以改善抗体的制备和纯化。例如，IgG4恒定区可具有S228P(EU编号)的突变。IgG1恒定区可具有L234A、L235A、D265A、P329A(EU编号)的突变。
在一个实施方案中，本公开的抗体的抗原结合片段是scFv片段。特别地，scFv片段包含通过接头连接的轻链可变区和重链可变区。在一个实施方案中，接头是柔性接头，诸如具有单独的甘氨酸和/或丝氨酸残基或它们的组合的接头。在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列(Gly4Ser)n或(GlySer4)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1-7的正整数，例如，n是2、3、4、5、6。在一个实施方案中，n是1、2、3或4。在一个具体实施方案中，接头包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或由其组成。
本公开的优选抗体是单克隆抗体。
单克隆抗4-1BB抗体
本公开的抗体可以是结构和化学特征如下文和以下实施例中所述的单克隆抗体。抗体的CDR区或重/轻链可变区的氨基酸序列ID号汇总于下表1中。抗体的重链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列的人IgG1或IgG2或IgG4重链恒定区，并且抗体的轻链恒定区可以是具有例如SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:63所示的氨基酸序列的人λ恒定区。抗体可包含通过二硫键连接的两条重链和两条轻链或由其组成，重链可变区的C末端与重链恒定区的N末端连接，并且轻链可变区的C末端与轻链恒定区的N末端连接。
表1.重/轻链可变区的氨基酸序列ID号
表1中的重链可变区CDR和轻链可变区CDR已由Kabat编号系统定义。然而，如本领域所熟知的，CDR区也可基于重链/轻链可变区序列，通过其他系统诸如Chothia和IMGT、AbM或联系人编号系统/方法来确定。应当注意，通过不同编号系统获得的同一抗体可变区的CDR的边界可能不同。即不同编号系统定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，当涉及定义具有本发明所定义的特定CDR序列的抗体时，抗体的范围还涵盖这样的抗体，其可变区序列包含特定CDR序列，但由于应用了不同的方案(例如，不同的编号系统规则或其组合)而导致其要求保护的CDR边界不同于本发明所定义的特定CDR边界。
结合人4-1BB的其他抗4-1BB抗体的VH和VL序列(或CDR序列)可与本公开的抗4-1BB抗体的VH和VL序列(或CDR序列)“混合并匹配”。优选地，当VH和VL链(或此类链内的CDR)混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被结构相似的VH序列替代。同样，优选地，来自特定VH/VL配对的VL序列被结构相似的VL序列替代。因此，在一个实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含上表1中所列的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含上表1中所列的氨基酸序列的轻链可变区，或另一种抗4-1BB抗体的VL，
其中该抗体特异性结合人4-1BB。
在另一个实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)上表1中所列的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区；和
(b)上表1中所列的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区，或另一种抗4-1BB抗体的CDR，
其中该抗体特异性结合人4-1BB。
在又一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含抗4-1BB抗体的与结合人4-1BB的其他抗体的CDR(例如，来自重链可变区的CDR1和/或CDR3，和/或来自另一种抗4-1BB抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3)组合的重链可变CDR2区。
此外，本领域公知的是，单独使用独立于CDR1和/或CDR2结构域的CDR3结构域可以测定抗体对同源抗原的结合特异性，并且可以基于共同的CDR3序列，可预测地产生具有相同结合特异性的多种抗体。参见例如Klimka等，British J.of Cancer 83(2):252-260(2000)；Beiboer等，J.Mol.Biol.296:833-849(2000)；Rader等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8910-8915(1998)；Barbas等，J.Am.Chem.Soc.116:2161-2162(1994)；Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A92:2529-2533(1995)；Ditzel等，J.Immunol.157:739-749(1996)；Berezov等，BIAjournal 8:Scientific Review 8(2001)；Igarashi等，J.Biochem(Tokyo)117:452-7(1995)；Bourgeois等，J.Virol 72:807-10(1998)；Levi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4374-8(1993)；Polymenis和Stoller，J.Immunol.152:5218-5329(1994)以及Xu和Davis，Immunity 13:37-45(2000)。还参见美国专利6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献中的每一篇均在此通过引用方式整体并入。
因此，在另一个实施方案中，本公开的抗体包含抗4-1BB抗体的重链可变区的CDR2和抗4-1BB抗体的重链和/或轻链可变区的至少CDR3，或另一种抗4-1BB抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够特异性结合人4-1BB。这些抗体优选(a)与4-1BB竞争结合；(b)保留功能特性；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有与本公开的抗4-1BB抗体相似的结合亲和力。在又一个实施方案中，抗体还可包含抗4-1BB抗体的轻链可变区的CDR2，或另一种抗4-1BB抗体的轻链可变区的CDR2，其中该抗体能够特异性结合人4-1BB。在另一个实施方案中，本公开的抗体可包括抗4-1BB抗体的重链和/或轻链可变区的CDR1，或另一种抗4-1BB抗体的重链和/或轻链可变区的CDR1，其中该抗体能够特异性结合人4-1BB。
本公开的优选抗体是双特异性抗体。
双特异性分子
在另一方面，本公开的特征在于双特异性分子，该双特异性分子包含与至少一种其他功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)连接的一种或多种本公开的抗体或抗体结合片段，以产生与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。因此，如本文所用的“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
在一个实施方案中，双特异性分子除了具有抗4-1BB结合特异性之外，还具有第二特异性。第二特异性可以是针对PD-1、PD-L1或CTLA-4的特异性。
在一个实施方案中，双特异性分子除了具有抗4-1BB结合特异性和抗PD-L1结合特异性之外，还具有第三特异性。第三特异性可以是针对用于癌症治疗的PD-1或CTLA-4的特异性。
双特异性分子可具有许多不同的形式和尺寸。尺寸最大的双特异性分子保留了传统的抗体形式，只是它具有各自具有不同特异性的两个结合臂，而非具有特异性相同的两个结合臂。尺寸最小的双特异性分子是由通过肽链连接的两个单链抗体片段(scFv)组成的双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)2构建体。尺寸中等的双特异性分子包括通过肽基接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可通过基因工程、体细胞杂交或化学方法制备。参见例如Kufer等，如上文引用；Cao和Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6),635-644(1998)；和van Spriel等，Immunology Today，21(8),391-397(2000)，以及其中引用的参考文献。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子是双特异性抗体，该双特异性抗体包含特异性结合4-1BB的第一结合区，和特异性结合与癌症、感染或自身免疫性疾病相关的第二抗原的第二结合区。双特异性抗体可具有若干种结构形式(参见例如Aran F.Labrijn等，Bispecific antibodies:a mechanistic review of the pipeline,Nature ReviewsDrug Discovery，第18卷，第585-608页(2019))。例如，双特异性抗体可以是IgG样的双特异性抗体，即全长双特异性抗体，也可以是非IgG样的双特异性抗体，它们不是全长抗体构建体。
特别地，第二抗原选自PD-1、PD-L1或CTLA-4，例如人PD-1、人PD-L1或人CTLA-4。更优选地，第二种抗原是PD-L1，例如人PD-L1。在一个实施方案中，人PD-L1包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:61具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，人PD-L1由包含SEQ ID NO:62所示的核酸序列或与SEQ ID NO:62具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列的核酸分子编码。
在一个实施方案中，第一结合区包含公开的针对上述抗4-1BB抗体或抗体结合片段的VH和/或VL。在另一个实施方案中，第一结合区包含公开的针对上述抗4-1BB抗体或抗体结合片段的重链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3；和/或轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。在另一个实施方案中，第一结合区还包含公开的针对上述抗4-1BB抗体或抗体结合片段的恒定区，例如重链恒定区或轻链恒定区。在一个实施方案中，第一结合区包含如上文公开的抗4-1BB抗体的scFv。
在另一个实施方案中，第二结合区包含公开的针对本领域抗PD-L1、抗PD-1或抗CTLA-4抗体或抗体结合片段的VH和/或VL。在另一个实施方案中，第二结合区包含公开的针对本领域抗PD-L1、抗PD1或抗CTLA-4抗体或抗体结合片段的重链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3；和/或轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。在一个实施方案中，第二结合区还包含恒定区，例如重链恒定区和/或轻链恒定区，例如本公开中公开的恒定区。
在一个具体实施方案中，第二结合区可结合人PD-L1，并且包含公开的针对本领域抗PD-L1抗体或抗体结合片段的VH和/或VL。在另一个实施方案中，第二结合区包含公开的针对本领域抗PD-L1抗体或抗体结合片段的重链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3；和/或轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。在一个实施方案中，第二结合区还包含恒定区，例如重链恒定区和/或轻链恒定区。
已知双特异性抗体的VH和/或VL可在一个或若干个氨基酸上不同于它们所衍生的用于构建双特异性抗体的单克隆抗体的VH和/或VL。例如，所衍生的VH和VL可具有一个或多个突变以使scFv更稳定。在一个实施方案中，VH和/或VL可具有突变以相互形成二硫键，从而使得抗体或其抗原结合部分更稳定。例如，VH可具有G44C(EU编号)，并且VL可具有T104C(EU编号)。
在一个具体实施方案中，双特异性抗体包含以下链：
(1)链1：在N末端或C末端通过或不通过接头与本公开的抗4-1BB抗体的scFv片段连接的针对第二抗原的抗体的重链；和
(2)链2：针对第二抗原的抗体的轻链。
在一个具体实施方案中，双特异性抗体包含通过二硫键连接的两条链1和两条链2。在另一个具体实施方案中，双特异性抗体的结构如图5A或图5B所示。
特别地，针对第二抗原的抗体的重链包含公开的针对本领域抗PD-L1、抗PD-1或抗CTLA-4抗体或抗体结合片段的VH。在另一个实施方案中，针对第二抗原的抗体的重链包含公开的针对本领域抗PD-L1、抗PD-1或抗CTLA-4的重链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。特别地，针对第二抗原的抗体的轻链包含公开的针对本领域抗PD-L1、抗PD-1或抗CTLA-4抗体或抗体结合片段的VL。在另一个实施方案中，针对第二抗原的抗体的轻链包含公开的针对本领域抗PD-L1、抗PD-1或抗CTLA-4的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。
在一个实施方案中，第二抗原是PD-L1，针对第二抗原的抗体是抗PD-L1抗体。
在一个具体实施方案中，抗PD-L1抗体的重链包含公开的针对抗PD-L1抗体的重链可变区VH。在一个具体实施方案中，VH包含公开的针对抗PD-L1抗体的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3。在一个具体实施方案中，重链包含公开的针对抗PD-L1抗体的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3。在一个具体实施方案中，重链还包含恒定区。
在一个具体实施方案中，抗PD-L1抗体的轻链包含公开的针对抗PD-L1抗体的轻链可变区VL。在一个具体实施方案中，VL包含公开的针对抗PD-L1抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3。在一个具体实施方案中，轻链包含公开的针对抗PD-L1抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3。在一个具体实施方案中，重链还包含恒定区。
在一个具体实施方案中，本公开的抗4-1BB抗体的scFv片段包含公开的针对上述抗4-1BB抗体或抗体结合片段的VH和/或VL。在另一个实施方案中，scFv包含公开的针对上述抗4-1BB抗体或抗体结合片段的重链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3；和/或轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。
特别地，抗4-1BB抗体的scFv片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列或由其组成，该轻链可变区由SEQ IDNO:26或SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列组成。
特别地，抗4-1BB抗体的scFv片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列或由其组成，该轻链可变区由SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列组成。
特别地，抗4-1BB抗体的scFv片段包含分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的序列组成的VH CDR1、CDR2和CDR3，和分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示的序列组成的VL CDR1、CDR2和CDR3。
特别地，连接VH和VL的接头是柔性接头，诸如具有单独的甘氨酸和/或丝氨酸残基或它们的组合的接头。在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列(Gly4Ser)n或(GlySer4)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1-7的正整数，例如，n是2、3、4、5、6。在一个实施方案中，n是1、2、3或4。在一个具体实施方案中，接头包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:51或SEQID NO:52所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个具体实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的重链可变区VH
(i)包含与选自SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含选自SEQ ID NO:46的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO:46的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸修饰(优选氨基酸取代，更优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成，优选地，这些氨基酸修饰不在CDR区中发生，更优选地，这些氨基酸修饰在FR区，例如FR1、FR2、FR3或FR4区中发生。
在一个具体实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3是：
(i)来源于重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，其中该重链可变区包含SEQ ID NO:46所示的序列或由其组成，或
(ii)(i)的CDR1、CDR2和CDR3，其与(i)的三个CDR相比，还共计包含至少一个且不超过5个氨基酸修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一个具体实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的VH CDR1包含选自SEQ ID NO:40的氨基酸序列或由其组成，或VH CDR1包含与选自SEQ ID NO:40的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个具体实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的VH CDR2包含选自SEQ ID NO:41的氨基酸序列或由其组成，或VH CDR2包含与选自SEQ ID NO:41的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个具体实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的VH CDR3包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列或由其组成，或VH CDR3包含与选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的三个重链可变区CDR1、CDR2和CDR3是：
(i)分别由SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，或
(ii)(i)的CDR1、CDR2和CDR3，其与(i)的三个CDR相比，还共计包含至少一个且不超过5个氨基酸修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一个实施方案中，重链恒定区是或来源于人IgG恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，优选IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
在另一个实施方案中，重链恒定区
(i)包含与SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)包含与SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸修饰(优选氨基酸取代，更优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个具体实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的轻链可变区VL
(i)包含与选自SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含选自SEQ ID NO:47的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO:47的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸修饰(优选氨基酸取代，更优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成，优选地，这些氨基酸修饰不在CDR区中发生，更优选地，这些氨基酸改变在FR区例如FR1、FR2、FR3或FR4区中发生。
在一个具体实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3是：
(i)来源于轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO:47所示的序列或由其组成，或
(ii)(i)的CDR1、CDR2和CDR3，其与(i)的三个CDR相比，还共计包含至少一个且不超过5个氨基酸修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一个具体实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的VL CDR1包含选自SEQ ID NO:43的氨基酸序列或由其组成，或VL CDR1包含与选自SEQ ID NO:43的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个具体实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的VL CDR2包含选自SEQ ID NO:44的氨基酸序列或由其组成，或VL CDR2包含与选自SEQ ID NO:44的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个具体实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的VL CDR3包含选自SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由其组成，或VL CDR3包含与选自SEQ ID NO:45的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，公开的针对抗PD-L1抗体的三个轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3是：
(i)分别由SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，或
(ii)(i)的CDR1、CDR2和CDR3，其与(i)的三个CDR相比，还共计包含至少一个且不超过5个氨基酸修饰(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一个实施方案中，轻链恒定区是或来源于κ或λ轻链恒定区，例如人κ或λ轻链恒定区，优选人κ轻链恒定区。
在另一个实施方案中，轻链恒定区
(i)包含与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)包含与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸修饰(优选氨基酸取代，更优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个具体实施方案中，抗PD-L1抗体为CN 109021107 A中公开的抗体。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体中的接头是柔性接头，诸如具有单独的甘氨酸和/或丝氨酸残基或它们的组合的接头。在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列(Gly4Ser)n或(GlySer4)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1-7的正整数，例如，n是2、3、4、5、6。在一个实施方案中，n是1、2、3或4，优选1或3。在一个具体实施方案中，双特异性抗体的接头包含SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或由其组成。在一个优选的实施方案中，双特异性抗体的接头包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或由其组成，其中n＝1或3。
在一个实施方案中，双特异性抗体的链1
(i)包含与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)包含与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过20个，更优选不超过10个或5个)氨基酸修饰(优选氨基酸取代，更优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，双特异性抗体的链2
(i)包含与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或
(ii)包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或由其组成；或
(iii)包含与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过20个，更优选不超过10个或5个)氨基酸修饰(优选氨基酸取代，更优选保守取代)的氨基酸序列或由其组成。
保守修饰
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的重链可变区序列和/或轻链可变区序列，它们与本发明的那些抗PD-1抗体不同之处在于一个或多个保守修饰。在本领域中应当了解的是，可以进行某些保守序列修饰，所述修饰不去除抗原结合。参见例如Brummell等(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt等(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov等(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall等(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley和O'Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy等(1998)Int.Immunol.10:341-6；以及Beers等(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。
因此，在一个实施方案中，抗体包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和/或含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR1序列包含上表1中所列的序列和/或其保守修饰；和/或
(b)重链可变区CDR2序列包含上表1中所列的序列和/或其保守修饰；和/或
(c)重链可变区CDR3序列包含上表1中所列的序列及其保守修饰；和/或
(d)轻链可变区CDR1和/或CDR2和/或CDR3序列包含上表1中所列的序列；和/或其保守修饰；并且
(e)该抗体特异性结合人4-1BB。
在另一个实施方案中，本公开的抗体包含重和/或轻链可变区序列，这些序列与本公开的抗4-1BB抗体的序列的区别在于具有一个或多个保守修饰，优选地，该修饰不在CDR中发生，优选地，该修饰在FR中发生。
在另一个实施方案中，本公开的抗体包含重和/或轻链可变区序列，这些序列与本公开的抗4-1BB抗体的序列的区别在于具有一个或多个保守修饰，优选地，该修饰不在CDR中发生，优选地，该修饰在FR中发生或在恒定区发生。
在一些实施方案中，将修饰引入重链可变区和/或轻链可变区的FR中以构建多特异性抗体，例如双特异性抗体。例如，可将修饰引入重链可变区和/或轻链可变区以相互形成二硫键，从而提高可构建双特异性抗体的scFv的稳定性。
在一些实施方案中，修饰是取代、添加和/或缺失。
在一些实施方案中，取代是保守取代。保守取代是指一个氨基酸被同一类别的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸被另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸被另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸被另一中性氨基酸置换。示例性的取代示于下表：
本公开的抗体具有一种或多种如上所述的下列功能特性，诸如特异性结合人4-1BB。
在各种实施方案中，抗体可以是例如小鼠抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如本文所用的术语“保守序列修饰”意图指的是不会显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变将修饰引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自同一侧链家族的其它氨基酸残基置换并且可以使用本文所述的功能测定来测试改变的抗体的保留功能(即上述功能)。
工程化和修饰的抗体
可以使用具有本发明的抗4-1BB抗体的VH序列/VL序列中的一个或多个的抗体作为起始材料来对修饰的抗体进行工程化以制备本发明的抗体。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来对抗体进行工程化。另外地或可选地，可以通过修饰一个或多个恒定区内的残基来对抗体进行工程化，例如以改变抗体的一种或多种效应功能。
在某些实施方案中，可以使用CDR移植来对抗体的可变区进行工程化。抗体主要通过位于六个重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。出于这个原因，在单个抗体之间CDR内的氨基酸序列比CDR之外的序列更具多样性。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此有可能通过构建表达载体来表达模拟特异性的天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上的来自所述特异性的天然存在的抗体的CDR序列(参见例如Riechmann等(1998)Nature 332:323-327；Jones等(1986)Nature 321:522-525；Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033；美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本公开的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含具有如上所述的本公开的序列的CDR1、CDR2和CDR3序列，该轻链可变区具有如上所述的本公开的序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。虽然这些抗体含有本公开的单克隆抗体的VH和VL CDR序列，但它们可以含有不同的框架序列。
这样的框架序列可以从包括生殖系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献中获得。例如，人类重链和轻链可变区基因的生殖系DNA序列可以在“VBase”人类生殖系序列数据库(可在互联网上在www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase处获得)，以及Kabat等(1991)(上文所引用)；Tomlinson等(1992),J.Mol.Biol.227:776-798；以及Cox等(1994),Eur.J.Immunol.24:827-836中找到，这些文献中的每一篇的内容明确地以引用的方式并入本文。作为另一个实例，人类重链和轻链可变区基因的生殖系DNA序列可以在基因库数据库中找到。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中发现的以下重链生殖系序列可以所附的基因库登录号：1-69(NG__0010109、NT__024637和BC070333)、3-33(NG__0010109和NT__024637)和3-7(NG__0010109和NT__024637)获得。作为另一个实例，在HCo12 HuMAb小鼠中发现的以下重链生殖系序列可以所附的基因库登录号：1-69(NG__0010109、NT__024637和BC070333)、5-51(NG__0010109和NT__024637)、4-34(NG__0010109和NT__024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)获得。
使用本领域技术人员公知的被称作Gapped BLAST的序列相似性搜索方法之一，将抗体蛋白质序列与编译的蛋白质序列数据库进行比较(Altschul等(1997)(同上))。
用于本发明的抗体中的优选的框架序列是与本发明的抗体所使用的框架序列在结构上相似的那些框架序列。VH CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列可以被移植到具有与作为框架序列的来源的生殖系免疫球蛋白基因中存在的序列相同的序列的框架区上，或CDR序列可以被移植到与生殖系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现在某些情况下，有益的是，使框架区内的残基突变以维持或增强抗体的抗原结合能力(参见例如美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是使VH和/或VL CDR1区、CDR2区和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改善所关注的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入一个或多个突变并且可以在如本文所述和实施例中所提供的体外或体内测定中评价对抗体结合或所关注的其它功能特性的影响。优选的是，引入保守修饰(如本领域已知)。所述突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，但是优选地是取代。此外，通常改变CDR区内不超过1个、2个、3个、4个或5个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含：(a)包含本发明序列或与本发明序列相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR1区；(b)包含本发明序列或与本发明序列相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR2区；(c)包含本发明序列或与本发明序列相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR3区；(d)包含本发明序列或与本发明序列相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区；(e)包含本发明序列或与本发明序列相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区；以及(f)包含本发明序列或与本发明序列相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。
本发明的工程化的抗体包括其中已经对VH和/或VL内的框架残基进行修饰，例如以改善抗体的特性的那些抗体。通常，进行这样的框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的生殖系序列。更具体地，已经经历了体细胞突变的抗体可以含有与作为所述抗体的来源的生殖系序列不同的框架残基。这样的残基可以通过将抗体框架序列与作为抗体的来源的生殖系序列进行比较来鉴定。
另一种类型的框架修饰涉及使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也被称为“去免疫化”并且更详细地描述于美国专利公布号20030153043中。
除了在框架区或CDR区内进行修饰之外或作为在框架区或CDR区内进行修饰的替代方案，可以对本发明的抗体进行工程化以在Fc区内包括修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，可以对本发明的抗体进行化学修饰(例如可以将一个或多个化学部分连接到所述抗体上)，或对其进行修饰以改变它的糖基化，从而再次改变所述抗体的一种或多种功能特性。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰以使得铰链区中半胱氨酸残基的数量改变，例如增加或减少。这种方法进一步描述于美国专利号5,677,425中。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量以例如促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变以缩短抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中以使得相对于天然Fc铰链结构域SpA结合，所述抗体具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。这种方法更详细地描述于美国专利号6,165,745中。
在又一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其引起一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除该位点处的糖基化。这样的无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。参见例如美国专利号5,714,350和6,350,861。
另外地或可选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。已经证实这样的改变的糖基化谱增加了抗体的ADCC能力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如使抗体在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已经在本领域中描述并且可以用作用于表达本发明的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，因此在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系是通过使用两种置换型载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而产生的(参见美国专利公布号20040110704和Yamane-Ohnuki等(2004)Biotechnol Bioeng87:614-22)。作为另一个实例，EP 1,176,195描述了一种细胞系，其具有功能性破坏的FUT8基因(所述基因编码岩藻糖基转移酶)，因此通过减少或消除α-1,6键相关的酶，在这样的细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195还描述了这样的细胞系，所述细胞系具有低的将岩藻糖添加到与抗体的Fc区结合的N-乙酰葡糖胺的酶活性或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公布WO03/035835描述了一种变体CHO细胞系Lec13细胞，其具有降低的将岩藻糖连接到Asn(297)连接的碳水化合物的能力，从而也引起在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还参见Shields等(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。也可以在鸡蛋中产生具有修饰的糖基化谱的抗体，如PCT公布WO 06/089231中所述。可选地，可以在植物细胞，如浮萍中产生具有修饰的糖基化谱的抗体。用于在植物系统中产生抗体的方法公开于2006年8月11日提交的对应于Alston&Bird LLP代理人案卷号040989/314911的美国专利申请中。PCT公布WO99/54342描述了被工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，因此在所述工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，这使得抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。可选地，可以使用岩藻糖苷酶切割掉抗体的岩藻糖残基；例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖基残基(Tarentino等(1975)Biochem.14:5516-23)。
本公开考虑的对本文中的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体进行聚乙二醇化以例如延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为了将抗体进行聚乙二醇化，通常在其中使一个或多个PEG基团连接到抗体或抗体片段上的条件下，使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选的是，经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文所用的术语“聚乙二醇”意图涵盖已经用于衍生化其它蛋白质的PEG的形式中的任一种，如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。用于将蛋白质进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明的抗体。参见例如EPO 154 316和EP 0 401 384。
抗体物理特性
本发明的抗体可以通过它们的各种物理特性来表征，以检测和/或区分其不同的类别。
例如，抗体可以在轻链可变区或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。这样的糖基化位点由于改变的抗原结合而可能导致抗体的免疫原性增加或抗体的pK改变(Marshall等(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala和Morrison(2004)J Immunol172:5489-94；Wallick等(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等(1985)Nature 316:452-7；Mimura等(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处发生。在一些情况下，优选具有不含可变区糖基化的抗PD-1抗体。这可以通过选择在可变区中不含所述糖基化基序的抗体或通过使糖基化区内的残基突变来实现。
在一个优选的实施方案中，所述抗体不含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能在N-G或D-G序列上发生并且引起异天冬氨酸残基的产生，这将弯结引入到多肽链中并且降低了它的稳定性(异天冬氨酸作用)。
每一种抗体将具有独特的等电点(pI)，其一般落入6至9.5的pH值范围内。IgG1抗体的pI值通常落入7-9.5的pH值范围内并且IgG4抗体的pI值通常落入6-8的pH值范围内。据推测，具有在正常范围之外的pI值的抗体在体内条件下可能具有一些解折叠和不稳定性。因此，优选具有含有落入正常范围内的pI值的抗4-1BB抗体。这可以通过选择具有在正常范围内的pI值的抗体或通过使带电荷的表面残基突变来实现。
编码本发明的抗体的核酸分子
在另一个方面，本发明提供了编码本发明的抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。所述核酸可以全细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术纯化去除其它细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质时，核酸是“分离的”或“变成基本上纯的”。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA并且可以含有或可以不含内含子序列。在一个优选的实施方案中，所述核酸是cDNA分子。
本发明的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如如下文进一步描述，从携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从所述基因文库中回收编码这样的抗体的核酸。
本公开的优选核酸分子包括编码4-1BB单克隆抗体的VH和VL序列或CDR的核酸分子。本公开的优选核酸分子还包括编码多特异性抗体，例如双特异性抗体的VH、VL或各链的核酸分子。一旦获得编码VH和VL片段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如以将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因，或转化为多特异性(双特异性)抗体链基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质(诸如，抗体恒定区或柔性接头)的另一种DNA片段可操作地连接。如本文所用的术语“可操作地连接”意在指两个DNA片段连接，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框架内。
在一个实施方案中，本发明的示例性核酸包括编码选自SEQ ID NO:25-32、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78中任一项的氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:25-32、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78中任一项的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的核酸。
在另一个实施方案中，本发明的核酸包含选自SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80中任一项的核苷酸序列，或与选自SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80中任一项的核苷酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
可通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可操作地连接来将编码VH区的分离的DNA转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的，并且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1、IgG2或IgG4恒定区，或具有突变的恒定区，例如包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:75所示的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列或由其组成的恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子可操作地连接。
可通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操作地连接来将编码VL区的分离DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的，并且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，例如，包含SEQ ID NO:35或63所示的序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列或由其组成的轻链恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一个片段可操作地连接，以使得VH序列和VL序列可以被表达为连续的单链蛋白，其中VL区和VH区由柔性接头连接(参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等(1990)Nature348:552-554)。
本公开的抗体的制备
本发明提供了一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括在允许该抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并从培养物中回收所制备的抗体构建体。
本发明的单克隆抗体(mAb)可以使用Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495的公知的体细胞杂交(杂交瘤)技术产生。产生单克隆抗体的其他实施方案包括B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化和噬菌体展示技术嵌合抗体或人源化抗体也是本领域公知的.参见例如美国专利号4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370，这些文献的内容具体地以引用的方式整体并入本文。
本公开的双特异性抗体可根据双特异性抗体的形式，使用针对双特异性抗体的公知平台来构建。本领域已知有若干种制备双特异性抗体的方法，例如，如美国专利4,816,567和美国公开2013/0078249中所述的，其通过引用方式整体并入本文。
制备本公开的抗体的转染瘤的生成
本发明的抗体也可以使用例如本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(例如Morrison,S.(1985)Science229:1202)。在一个实施方案中，将通过标准的分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一种或多种表达载体中以使得所述基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在本文中，术语“可操作地连接”意图意指将抗体基因连接到载体中以使得所述载体内的转录和翻译控制序列发挥它们的预期的调控抗体基因的转录和翻译的功能。
术语“调控序列”意图包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这样的调控序列描述于例如Goeddel(GeneExpression Technology(《基因表达技术》)：Methods in Enzymology(酶学方法)185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press,San Diego,Calif.)(1990))中。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括引导哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，如源自于巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。可选地，可以使用非病毒调控序列，如泛素启动子或β-球蛋白启动子。更进一步，调控元件由来自不同来源的序列构成，如SRα启动子系统，所述SRα启动子系统含有来自SV40早期启动子和1型人类T细胞白血病病毒的长末端重复序列的序列(Takebe等(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。
可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入相同的或单独的表达载体中。在优选的实施方案中，使用可变区以通过将它们插入已经编码所期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中以使得VH区段与所述载体内的一个或多个CH区段可操作地连接并且VL区段与所述载体内的CL区段可操作地连接来产生任何抗体同种型的全长抗体基因。另外地或可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中以使得信号肽与抗体链基因的氨基末端在框内连接。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择其中已经引入了载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因向其中已经引入了载体的宿主细胞赋予对药物，如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在甲氨蝶呤选择/扩增的情况下用于dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意图涵盖通常用于将外源性DNA引入到原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是在真核细胞中，并且最优选地在哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，这是因为这样的真核细胞，特别是哺乳动物细胞比原核细胞更有可能组装和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中，与DHFR选择标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别是，对于与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中所公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将所述宿主细胞培养足以允许所述抗体在所述宿主细胞中表达或更优选地，将所述抗体分泌到其中生长了所述宿主细胞的培养基中的时间段来产生所述抗体。可以使用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
药物组合物
在另一方面，本公开提供了药物组合物，该药物组合物包含与药学上可接受的载体一起配制的一种或多种本公开的抗体(或其抗原结合部分，或双特异性分子)。当组合物含有多于一种抗体(或其抗原结合部分，或双特异性分子)时，这些抗体(或其抗原结合部分，或双特异性分子)可单独给药。组合物可任选地含有一种或多种另外的药学活性成分，诸如治疗剂，诸如另一种抗体或药物，诸如抗癌药物、抗微生物药物或抗哮喘药物，例如化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其他抗体(例如，针对免疫检查点分子例如PD-1的抗体)、抗感染剂、小分子药物或免疫调节剂。
如本文所述的术语“治疗剂”涵盖有效预防或治疗肿瘤(诸如癌症)的任何物质，包括化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其他抗体(例如，针对免疫检查点分子的抗体)、抗感染剂、免疫调节剂或小分子药物。
所述药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂和其组合。合适的赋形剂的选择和使用在Gennaro编著，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药学科学与实践》)，第20版(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中教导，其公开内容以引用的方式并入本文。
优选的是，所述药物组合物适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物可以被包被在材料中以保护它防止酸和可能使它失活的其它自然条件的作用。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。可选地，本发明的抗体可以经由非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部施用。
药物组合物可以呈无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以被配制成微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定施用方式而变化，并且一般将是产生治疗作用的组合物的量。一般，在百分之一百中，与药学上可接受的载体组合，该量将在约0.01％至约99％的活性成分，优选地约0.1％至约70％，最优选地约1％至约30％的活性成分的范围内。
调整给药方案以提供最佳的所期望的响应(例如治疗响应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间推移施用几次分次剂量或可以按比例减少或增加剂量，如由治疗情况的紧急程度所指示。特别有利的是，将肠胃外组合物配制成剂量单位形式以易于施用和保持剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式指的是适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每一个单位含有被计算以与所需的药物载体联合产生所期望的治疗作用的预定量的活性化合物。可选地，抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下，需要不太频繁的施用。
对于抗体的施用，剂量在每公斤宿主体重约0.0001mg至100mg，并且更通常每公斤宿主体重0.01mg至5mg的范围内。例如，剂量可以是每公斤体重0.3mg、每公斤体重1mg、每公斤体重3mg、每公斤体重5mg或每公斤体重10mg或在1mg/kg-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月施用一次、每3个月施用一次或每3个月至6个月施用一次。本发明的抗PD-1抗体的优选的给药方案包括每公斤体重1mg或每公斤体重3mg，经由静脉内施用，其中使用以下给药时间表之一给予所述抗体：(i)每四周一次，持续六次剂量，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)以每公斤体重3mg施用一次，继而以每公斤体重1mg每三周施用一次。在一些方法中，调整剂量以达到约1μg/ml-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中，达到约25μg/ml-300μg/ml的血浆抗体浓度。
“治疗有效剂量”的本发明的抗4-1BB抗体优选地引起疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加或预防由于疾病困扰引起的障碍或残疾。例如，对于治疗携带肿瘤的受试者，相对于未经治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地将肿瘤生长抑制至少约20％，更优选地至少约40％，甚至更优选地至少约60％，并且还更优选地至少约80％。治疗有效量的治疗性化合物可以在受试者中减小肿瘤尺寸或以其它方式改善症状，所述受试者通常是人类或可以是另外的哺乳动物。
所述药物组合物可以是受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微封装的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems(《持续和受控释放药物递送系统》),J.R.Robinson编著,纽约的Marcel Dekker公司(Marcel Dekker,Inc.,New York),1978。
治疗组合物可以经由医疗装置施用，如(1)无针皮下注射装置(例如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824和4,596,556)；(2)微型输注泵(美国专利号4,487,603)；(3)透皮装置(美国专利号4,486,194)；(4)输注设备(美国专利号4,447,233和4,447,224)；以及(5)渗透装置(美国专利号4,439,196和4,475,196)；这些文献的公开内容以引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，可以配制本发明的人类单克隆抗体以确保在体内的适当分布。例如，为了确保本发明的治疗性抗体穿过血脑屏障，可以将它们在脂质体中配制，所述脂质体可以另外包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685；Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038；Bloeman等(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180；Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134；Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090；Keinanen和Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；以及Killion和Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
组合产品
在另一方面，本公开提供了组合产品，该组合产品包含一种或多种本公开的抗体(或其抗原结合部分，或双特异性分子)和一种或多种另外的治疗剂，诸如另一种抗体或药物，诸如抗癌药物、抗微生物药物或抗哮喘药物，例如化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其他抗体(例如，针对免疫检查点分子例如PD-1的抗体)、抗感染剂、小分子药物或免疫调节剂。
“组合产品”是指用于组合施用的单位剂型的固定或非固定组合或多部件的试剂盒，其中两种或更多种治疗剂可同时独立施用或在一定时间间隔内分开施用，尤其是当这些时间间隔允许组合伴侣显示协同作用，例如协同效应时。术语“固定组合”是指本发明的抗体和组合伴侣(例如其他治疗剂，诸如免疫调节剂，诸如免疫抑制剂或抗炎剂)以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”是指本发明的抗体和组合伴侣(例如其他治疗剂，诸如免疫调节剂，诸如免疫抑制剂或抗炎剂)作为分开的实体同时、并行或依次施用于患者，并且没有具体的时间限制，其中这种施用在患者体内提供了两种化合物的治疗有效水平。后者也适用于鸡尾酒疗法，诸如施用三种或更多种治疗剂。在一个优选的实施方案中，药物组合是非固定组合。
用途和方法
包含本公开的抗体或其抗原结合部分或双特异性分子的组合物具有许多体外和体内用途，这些体外和体内用途涉及例如癌症、感染和自身免疫性疾病的治疗。抗体可施用于人受试者，例如体内，以缓解这些疾病。
在一个方面，本发明提供了调节受试者的免疫应答的方法。
在另一方面，本发明提供了激活T细胞或诱导T细胞介导的抗肿瘤活性的方法。在一个实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在另一方面，本发明提供了减少Treg细胞，例如CD4+T细胞的方法。
在一个实施方案中，T细胞的激活包括刺激T细胞的细胞因子分泌，例如T细胞的IL-12分泌。
在一个实施方案中，本发明提供了激活4-1BB信号传导通路的方法。
在一些实施方案中，上述方法包括施用本发明的抗体或抗原结合片段、药物组合物或制剂、组合产品或核酸。
在一方面，本发明的抗体是如上所述结合4-1BB和PD-L1的双特异性抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括施用本公开的结合4-1BB和PD-L1的双特异性抗体或包含其的药物组合物或组合产品。
在一些实施方案中，癌症是肿瘤免疫逃避。
在一些实施方案中，癌症包括实体癌和非实体癌以及转移病灶。在一个实施方案中，实体癌的示例包括恶性肿瘤。癌症可以是早期、中期或晚期或转移性癌症。在一些实施方案中，癌症是需要T细胞激活的癌症，诸如具有T细胞功能障碍的癌症。
在一些实施方案中，癌症是具有例如与正常受试者或正常细胞中的水平相比增加的PD-L1蛋白质表达水平或增加的编码PD-L1的核酸水平的癌症。
优选地，该癌症是胃肠道中的癌症，例如结肠直肠癌、直肠癌或结肠癌。
在一些实施方案中，癌症的治疗将得益于：
(i)PD-L1核酸或蛋白质水平的抑制；
(ii)阻断PD-L1与其受体诸如PD-1的结合，
(iii)4-1BB信号传导通路的激活；
(iv)T细胞的激活，例如增加CD8+T细胞的增殖，或减少Treg细胞，例如CD4+T细胞；
(v)上述任一项或多项的组合。
在另一方面，本公开提供了组合疗法的方法，其中本公开的抗4-1BB抗体或其抗原结合部分或双特异性分子与有效减轻受试者的癌症、感染或自身免疫性疾病的一种或多种治疗剂，例如另外的抗体共同施用。在一个实施方案中，本公开提供了治疗受试者的癌症疾病的方法，该方法包括向受试者施用抗4-1BB抗体(或其抗原结合部分，或双特异性抗体)和一种或多种治疗剂，例如另外的抗体，诸如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体。在某些实施方案中，受试者是人。
4-1BB信号传导激活还可进一步与标准疾病治疗组合。例如，4-1BB信号传导激活可与上述抗体或化学抗癌药物的施用组合。
因此，组合疗法包括共同施用本公开的抗4-1BB抗体或其抗原结合部分或双特异性分子及其药物组合物和组合产品，与其他疗法，例如治疗模式和/或其他治疗剂的组合，优选地，该治疗方式包括手术和/或放射疗法，并且/或者其他治疗剂选自化疗剂、其他抗体、细胞毒性剂、疫苗、抗感染剂、小分子药物或免疫调节剂。
本文所讨论的治疗剂的组合可以在药学上可接受的载体中的单一组合物同时施用，或以在药学上可接受的载体中的含各药剂的单独组合物同时施用。在另一个实施方案中，治疗剂的组合可依次施用。
此外，如果依次施用多于一个剂量的组合疗法，则依次施用的顺序可在施用的每个时间点颠倒或保持相同的顺序，连续施用可与同时施用或其任何组合进行组合。
具体实施方案
在本发明的一个方面，涉及如下具体的实施方案：
1.一种结合4-1BB的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含三个重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区以及三个轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中
(1)所述三个重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ ID NO:25所示的序列组成的重链可变区；并且所述三个轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQID NO:26所示的序列组成的轻链可变区；
(2)所述三个重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ ID NO:27所示的序列组成的重链可变区；并且所述三个轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQID NO:28所示的序列组成的轻链可变区；
(3)所述三个重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ ID NO:29所示的序列组成的重链可变区；并且所述三个轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQID NO:30所示的序列组成的轻链可变区；或
(4)所述三个重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ ID NO:31所示的序列组成的重链可变区；并且所述三个轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQID NO:32所示的序列组成的轻链可变区。
2.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合部分，其中
(i)所述重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列组成，并且所述轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列组成；
(ii)所述重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:
7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列组成，并且所述轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:10、
SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列组成；
(iii)所述重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:
13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的序列组成，并且所述轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的序列组成；或
(iv)所述重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:
19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的序列组成，并且所述轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的序列组成。
3.根据实施方案1或2所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含所述重链可变区，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:77具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含所述轻链可变区，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:26(X1＝S或G)、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:78具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
5.根据实施方案3-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区包含分别与以下序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(X1＝S)；(2)SEQ ID NO:25和SEQID NO:26(X1＝G)；(3)SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；(4)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；(5)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；或(6)SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78。
6.根据实施方案5所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含与所述重链可变区连接的具有SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链恒定区，和/或与所述轻链可变区连接的具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链恒定区。
7.根据实施方案1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分激活4-1BB信号传导，并且所述抗体或其抗原结合部分是单克隆抗体。
8.根据实施方案1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分是小鼠抗体、人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
9.根据实施方案1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分是IgG1、IgG2或IgG4同种型。
10.根据实施方案1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合部分选自：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段，(v)dAb片段；(vi)纳米抗体；和(vii)单链Fv(scFv)。
11.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含第一抗原结合区和第二结合区，其中所述第一结合区结合4-1BB，并且所述第二结合区结合PD-L1、PD1或CTLA-4，其中所述第一结合区包含如实施方案1或2中所定义的重链CDR1区、CDR2区和CDR3区以及轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区；或包含如实施方案3中所定义的重链可变区和如实施方案4中所定义的轻链可变区。
12.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
(1)链1：在N末端或C末端通过或不通过接头与根据实施方案1-10中任一项所述的抗体的抗原结合部分连接的针对第二抗原的抗体的重链，其中所述抗原结合部分是scFv；和
(2)链2：针对所述第二抗原的所述抗体的轻链。
13.根据实施方案12所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体由两条链1和两条链2组成。
14.根据实施方案12或13所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原选自PD-L1、PD1或CTLA-4。
15.根据实施方案12所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原是PD-L1，并且针对PD-L1的所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中
所述重链可变区包含三个重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，所述三个重链可变区CDR1、CDR2和CDR3是分别由SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，并且
所述轻链可变区包含三个轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3，所述三个轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3是分别由SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3。
16.根据实施方案12或13所述的双特异性抗体，其中所述抗4-1BB抗体的所述scFv包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，所述三个重链可变区CDR1、CDR2和CDR3是分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3，并且所述轻链可变区包含三个轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3，所述三个轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3是分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列组成的CDR1、CDR2和CDR3。
17.根据实施方案12或13所述的双特异性抗体，其中
所述双特异性抗体的所述链1包含与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且
所述双特异性抗体的所述链2包含与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
18.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据实施方案1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据实施方案11-17中任一项所述的双特异性抗体或其链。
19.一种载体，所述载体包含根据实施方案18所述的多核苷酸。
20.一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组整合有根据实施方案18所述的多核苷酸，或所述宿主细胞包含根据实施方案19所述的载体，或所述宿主细胞包含根据实施方案18所述的多核苷酸。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据实施方案11-17中任一项所述的双特异性抗体，以及任选的药学上可接受的载体。
22.一种组合产品，所述组合产品包含根据实施方案1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据实施方案11-17中任一项所述的双特异性抗体，以及一种或多种另外的治疗剂，例如化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其他抗体(例如，针对免疫检查点分子例如PD-L1或PD-1的抗体)、抗感染剂、小分子药物或免疫调节剂。
23.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据实施方案11-17中任一项所述的双特异性抗体或根据实施方案21所述的药物组合物或根据实施方案22所述的组合产品。
24.一种治疗受试者的感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据实施方案11-17中任一项所述的双特异性抗体或根据实施方案21所述的药物组合物或根据实施方案22所述的组合产品。
25.一种治疗受试者的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据实施方案11-17中任一项所述的双特异性抗体或根据实施方案21所述的药物组合物或根据实施方案22所述的组合产品。
26.根据实施方案23至25中任一项所述的方法，其中可向所述受试者施用其他疗法例如治疗模式和/或其他治疗剂，优选地，所述治疗模式包括手术和/或放射疗法，并且/或者所述其他治疗剂选自化疗剂、其他抗体、细胞毒性剂、疫苗、抗感染剂、小分子药物或免疫调节剂。
本公开通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应当理解为进一步限制。本申请全文中引用的所有附图和所有参考文献、Genbank序列、专利和公开的专利申请的内容明确通过引用方式并入本文。
实施例
实施例1：噬菌体淘选、筛选和亲和力成熟
噬菌体文库
通过克隆轻链可变区(VL)的序列集合和重链可变区(VH)的序列集合来创建抗体单链噬菌体展示文库。用主要收集自外周血的人淋巴细胞进行PCR扩增来获得重链和轻链的序列集合。将VL序列集合和VH序列集合混合，并用重叠引物进行PCR。抗体的最终形式是单链Fv(scFv)，其中VH和VL片段通过柔性连接肽(GGGGSGGGGSGGGGS，SEQ ID NO:36)连接。
针对人4-1BB的噬菌体文库淘选
在Immuno 96MicroWellTM培养板(Nunc，丹麦)上选择展示特定scFv片段的噬菌体颗粒。首先用50μg/mL 4-1BB重组蛋白(义翘神州，目录号：10041-H08H)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液包被培养板，于4℃静置过夜。然后用含2％(w/v)奶粉的PBS溶液(2％MPBS)封闭该培养板，加入含有约1011个噬菌体颗粒的文库，并将该培养板于室温(RT，25℃-28℃)温育2小时。通过用含有0.1％Tween 20的PBS溶液(PBST)洗涤培养板10-20次，然后用PBS洗涤培养板10-20次，将未结合的噬菌体除去。通过加入50μL1μg/μL胰蛋白酶温育10分钟，然后用50μL 50mM甘氨酸-HCl(pH 2.0)温育10分钟，将结合的噬菌体洗脱，然后立即用50μL 200mMNa2HPO4(pH 7.5)中和。进行四轮淘选。
噬菌体筛选
从第三轮和第四轮淘选中挑取噬菌体并测试其与人4-1BB的结合。具体地，将0.1μg/mL的人4-1BB(义翘神州，目录号：10041-H08H)包被在96孔板上，并将单克隆噬菌体加入到该培养板中。然后洗去未结合的噬菌体，并通过抗M13二抗(Abcam，目录号：ab50370)检测结合的噬菌体。
对ELISA阳性克隆进行测序，从中鉴定出28条单一序列，包括41BB-2、41BB-9、41BB-13和41BB-27克隆。示例性抗4-1BB抗体的重/轻链可变区及其CDR的氨基酸序列ID号(根据Kabat编号定义)示于表2。利用这些重/轻链可变区序列制备了具有人IgG2(SEQ IDNO:33)或IgG1(SEQ ID NO:34)或IgG4(SEQ ID NO:75)重链恒定区和人轻链λ恒定区(SEQID NO:35)的完全抗体41BB-2、41BB-9、41BB-13和41BB-27，其中重链可变区的C末端与重链恒定区的N末端连接，轻链可变区的C末端与轻链恒定区的N末端连接，其中抗体41BB-2的轻链可变区包含SEQ ID NO:26(X1＝S)的氨基酸序列。
此外，41BB-2抗体的轻链可变区在最后一个位点具有S到G的突变，并且与IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:34)相连。所得的具有修饰的41BB-2可以比具有IgG1重链恒定区的41BB-2更高的纯度制备(数据未示出)。
表2：完全抗体的序列ID
具有上述序列的抗体采用本领域已知的常规方法制备和纯化。具体地，将编码抗体重链和轻链的核苷酸序列插入表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中。根据制造商的说明书，使用ExpiCHOTM表达系统(赛默飞世尔)将载体共转染到CHO-S细胞中。根据制造商的说明书，转染的细胞在ExpiCHOTM表达培养基中培养12天，然后收获培养上清液，并用蛋白A亲和层析(GE Healthcare)进行纯化。
实施例2：示例性抗4-1BB抗体与人4-1BB的结合
进行ELISA测定以确定抗体对人4-1BB的相对结合能力。
通过在4℃以25ng/孔温育过夜，将人4-1BB(义翘神州，目录号：10041-H08H)的碳酸盐缓冲溶液(pH 9.6)固定在96孔板上。然后通过在37℃加入1％BSA的PBS溶液温育一小时来封闭培养板。封闭后，将培养板用PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗涤三次。用结合缓冲液(含0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)分别制备系列稀释的抗4-1BB抗体和Urelumab对照(根据WO2005035584，使用SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的重链和轻链氨基酸序列制备)，并在37℃加入到培养板中与固定的蛋白质一起温育一小时。结合后，将培养板用PBST洗涤三次，在37℃加入用结合缓冲液以1/20,000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗人IgG F(ab')2抗体(杰克逊免疫研究，目录号：109-035-097)温育一小时，再次洗涤，用TMB(赛默飞世尔，目录号：34028)显色15分钟，然后用1M H2SO4终止反应。各培养板孔在每个步骤中均含有50μL溶液。
测定450nm-620nm处的吸光度。抗体与人4-1BB结合的EC50值和结合曲线示于图1A至图1D，表明抗4-1BB抗体41BB-2-IgG2、41BB-9-IgG2、41BB-13-IgG2和41BB-27-IgG2特异性结合人4-1BB，结合能力高于Urelumab对照。
实施例3：示例性抗4-1BB抗体与恒河猴4-1BB但不与人CD40、人HVEM、人OX40、人 CD27或人GITR的交叉反应性
进行ELISA测定以确定示例性抗4-1BB抗体与重组人CD40、人HVEM、人OX40、人CD27、人GITR或恒河猴4-1BB的结合活性。
通过在4℃以25ng/孔温育过夜，将人CD40(义翘神州，目录号：10774-H08H)、人HVEM(义翘神州，目录号：10334-H03H)、人OX40(义翘神州，目录号：10481-H08H)、人CD27(义翘神州，目录号：10039-H31H)、人GITR(义翘神州，目录号：13643-H08H)和恒河猴4-1BB(义翘神州，目录号：90847-K08H)的碳酸盐缓冲溶液(pH 9.6)中分别固定在96孔板上。然后通过在37℃加入1％BSA的PBS溶液温育一小时来封闭培养板。然后将培养板用PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗涤三次。用结合缓冲液(含0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)分别制备500ng/mL的抗4-1BB抗体和Urelumab，并在37℃加入培养板与固定的蛋白质一起温育一小时。结合后，将培养板用PBST洗涤三次，在37℃加入用结合缓冲液以1/20,000稀释的过氧化物酶标记的抗人IgG F(ab')2抗体(杰克逊免疫研究，目录号：109-035-097)温育一小时，再次洗涤，用TMB(赛默飞世尔，目录号：34028)显色15分钟，然后用1M H2SO4终止反应。各培养板孔在每个步骤中均含有50μL溶液。
测定450nm-620nm的吸光度，并示于图2A至图2B。可以看出，抗4-1BB抗体41BB-2-IgG2、41BB-9-IgG2、41BB-13-IgG2和41BB-27-IgG2不与人CD40、人HVEM、人OX40、人CD27或人GITR结合，但与恒河猴4-1BB发生交叉反应。Urelumab不与这些蛋白中的任一种蛋白结合。
实施例4：示例性抗4-1BB抗体与细胞表面4-1BB的结合以及NFκB报告基因发光信 号的诱导
在HEK293-NFκB-Luc-人4-1BB报告基因测定中，评估了示例性抗4-1BB抗体对人4-1BB信号传导的激动作用。
在实施例1中制备并纯化了完全抗体41BB-2-IgG2、41BB-9-IgG2、41BB-13-IgG2、41BB-27-IgG2、41BB-9-IgG1、41BB-13-IgG1、41BB-27-IgG4、41BB-2-IgG1。
对完全抗体41BB-2-IgG2、41BB-9-IgG2、41BB-13-IgG2、41BB-27-IgG2的评估如下：
简言之，将HEK293细胞系(ATCC，目录号：CRL-1573)维持在含10％FBS的DMEM培养基中，并置于37℃、5％CO2的加湿培养箱中。使用LipofectamineTM 2000转染试剂(Invitrogen，目录号：11668019)将编码人4-1BB(SEQ ID NO:39所示的NP_001552.2的氨基酸)和pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega，目录号：E849A)的核酸序列共转染到HEK293细胞中，并通过有限稀释获得稳定表达人4-1BB和NF-κB-Luc的克隆。在第1天，将在含10％FBS的DMEM中获得的HEK293-NFκB-Luc-4-1BB细胞接种到96孔板中(50000个细胞/孔)，并在CO2培养箱中培养过夜。在第2天，弃去96孔板上的培养基，然后用含1％FBS的DMEM将抗4-1BB抗体或Urelumab系列稀释，用2倍浓度的山羊抗人IgG(杰克逊免疫研究，目录号：109-005-098)预处理或不进行预处理，然后加入到培养板中并与HEK293-NFκB-Luc-4-1BB细胞共同培养。将培养板在37℃、5％CO2培养箱中温育六小时。然后将60μL One-GloTM试剂(Promega，目录号：E6130)加入到测定板的孔中，并使用发光酶标仪(Tecan F200 Pro)测量发光。测定EC50值，并将抗4-1BB抗体的代表性曲线示于图3A至图3G。
山羊抗人IgG与抗4-1BB抗体的Fc部分反应，以使两种或更多种抗4-1BB抗体交联在一起。抗体二聚体或多聚体的形成可能有助于对4-1BB信号传导产生更好的激动作用。
结果表明，41BB-2-IgG2、41BB-9-IgG2、41BB-13-IgG2和41BB-27-IgG2均可与细胞表面表达的4-1BB结合，从而激活4-1BB信号传导并诱导NFκB报告基因发光表达，无论它们是否交联。然而，在不存在交联的情况下，本发明的4-1BB抗体对人4-1BB信号传导的激动作用要弱得多，而在存在交联的情况下，它们的激动作用则更强。四个4-1BB克隆的激动作用依赖于Fc交联。
对完全抗体41BB-9-IgG1、41BB-13-IgG1、41BB-27-IgG4、41BB-2-IgG1的验证如下：
简言之，将HEK293细胞系(ATCC，目录号：CRL-1573)维持在含10％FBS的DMEM培养基中，并置于37℃、5％CO2的加湿培养箱中。使用LipofectamineTM 2000转染试剂(Invitrogen，目录号：11668019)将pIRESpuro3质粒和pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega，目录号：E849A)中编码人4-1BB(SEQ ID NO:39所示的NP_001552.2的氨基酸)的核酸序列共转染到HEK293细胞中，并在用嘌呤霉素(Gibco，目录号：A1113802)和潮霉素筛选后，通过有限稀释获得稳定表达人4-1BB和NF-κB-Luc的克隆。将在含10％FBS的DMEM中获得的HEK293-NFκB-Luc-人4-1BB细胞平板接种到384孔板中(20000个细胞/孔，40μL)。然后，将用含10％FBS的DMEM以10μL/孔系列稀释的抗4-1BB抗体41BB-9-IgG1、41BB-13-IgG1、41BB-27-IgG4、41BB-2-IgG1或Urelumab(起始浓度：50μg/mL，3倍稀释系列)用以两倍稀释系列稀释的山羊抗人IgG(杰克逊免疫研究，目录号：109-005-098)预处理或不进行预处理，然后加入到培养板中。将培养板在37℃、5％CO2培养箱中温育六小时。温育后，将30μL One-GloTM试剂(Promega，目录号：E6130)加入到测定板的孔中，并使用发光酶标仪(Tecan F200Pro)测量发光。结果可见图4A至图4B。
山羊抗人IgG与抗4-1BB抗体的Fc部分反应，以使两种或更多种抗4-1BB抗体交联在一起。
结果表明，在存在交联剂的情况下，除了41BB-27-IgG4之外，41BB-2-IgG1、41BB-9-IgG1、41BB-13-IgG1会激活人4-1BB信号传导，并诱导比Urelumab的NFκB报告基因信号高得多的NFκB报告基因信号。而在不存在交联剂的情况下，四种4-1BB抗体诱导的NFκB报告基因信号比Urelumab诱导的NFκB报告基因信号低得多。四个4-1BB克隆的激动作用依赖于Fc交联。
实施例5：双特异性抗体的表达和纯化
构建了两种双特异性抗体，即P4B-2和P4B-3。它们的结构示于图5B(P4B-2)和图5A(P4B-3)。
具体地，双特异性P4B-2构建如下：将4-1BB抗体的两个scFv分别与完整PD-L1抗体的两条重链的N末端连接，以构建包含从N末端至C末端由以下项组成的重链：
来自4-1BB抗体的VH(抗4-1BB的VH)-接头-来自4-1BB抗体的VL(抗4-1BB的VL)-接头-来自PD-L1抗体的VH(抗PD-L1的VH)-重链恒定区；和
来自PD-L1抗体的轻链(抗PD-L1的轻链，即抗PD-L1轻链恒定区的VL)的双特异性抗体。
双特异性P4B-3构建如下：将4-1BB抗体的两个scFv分别与完整PD-L1抗体的两条重链的C末端连接，以构建包含从N末端到C末端由以下项组成的重链：
来自PD-L1抗体的VH(抗PD-L1的VH)-重链恒定区-接头-来自4-1BB抗体的VH(抗4-1BB VH的VH)-接头-来自4-1BB抗体的VL(抗4-1BB的VL)；和
来自PD-L1抗体的轻链(抗PD-L1的轻链，即抗PD-L1轻链恒定区的VL)的双特异性抗体。
通过基因合成(金斯瑞)产生编码双特异性抗体和对照的核苷酸，并克隆到表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中。将编码轻链可变区的核酸插入到含有编码轻链恒定区的核酸的表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中，以构建表达抗体轻链的载体，并且将编码重链可变区的核酸插入到含有编码重链恒定区的核酸的表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中，以构建表达抗体重链的载体。根据制造商的说明书，使用ExpiCHOTM表达系统(赛默飞世尔，目录号：A29133)将获得的载体以1:1的摩尔比共转染到CHO-S细胞中。根据制造商的说明书，转染的细胞在ExpiCHOTM表达培养基中培养12天，然后收获培养上清液，并用蛋白A亲和层析(GEHealthcare)进行纯化。
不同区域的氨基酸序列和核酸序列可见表3。
表3.双特异性抗体的区域/结构域的SEQ ID NO
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14-1BB VH来源于单克隆抗体41BB-2的VH，通过G44C(EU编号)与VL形成二硫键，提 高了scFv的稳定性。
24-1BB VL来源于单克隆抗体41BB-2的VL，通过T104C(EU编号)与VH形成二硫键， 提高了scFv的稳定性。
实施例6：结合人PD-L1和4-1BB蛋白的抗体
通过在4℃加入碳酸盐缓冲液(pH 9.6)温育过夜，将人PD-L1，His标签蛋白(ACRO，目录号：PD1-H5229)固定在96孔板(杭州欣友，目录号：100096H)上。然后通过在37℃加入1％BSA的PBS溶液温育一小时来封闭培养板。封闭后，将培养板用PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗涤三次。用稀释缓冲液(含0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)制备从2nM系列稀释到0.003nM的系列稀释的P4B-2、P4B-3和阴性对照IgG(重链：SEQ ID NO:82；轻链：SEQ ID NO:83)，并在37℃加入与上述固定的蛋白质一起温育一小时。然后，将培养板用PBST洗涤三次，在37℃加入培养板与用稀释缓冲液以1/20,000稀释的Fcγ片段特异性的过氧化物酶AffiniPure山羊抗人IgG(杰克逊免疫研究，目录号：109-035-098)一起温育一小时，然后用PBST再次洗涤。将TMB(赛默飞世尔，目录号：34028)加入到培养板中以引发反应。15分钟后，用1M H2SO4终止反应。测定450nm-620nm处的吸光度。抗体与人PD-L1结合的EC50和代表性结合曲线示于图6。
结果表明，两种抗体P4B-2和P4B-3均可结合人PD-L1蛋白，EC50分别为0.02395nM和0.02887nM。
通过在4℃与碳酸盐缓冲液(pH 9.6)温育过夜，将人4-1BB，人Fc标签蛋白(SEQ IDNO:81，Hu4-1BB-hFc)固定在96孔板(杭州欣友，目录号：100096H)上。然后通过在37℃加入1％BSA的PBS溶液温育一小时来封闭培养板。封闭后，将培养板用PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗涤三次。用稀释缓冲液(含0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)制备从6.65nM系列稀释到0.009nM的系列稀释的P4B-2、P4B-3和阴性对照IgG(重链：SEQ ID NO:82；轻链：SEQ IDNO:83)，并在37℃加入与固定的蛋白质Hu4-1BB-hFc一起温育一小时。然后，将培养板用PBST洗涤三次，在37℃加入培养板与用稀释缓冲液以1/10,000稀释的F(ab')2片段特异性的过氧化物酶AffiniPure山羊抗人IgG(杰克逊免疫研究，目录号：109-035-097)一起温育一小时，然后用PBST再次洗涤。将TMB(赛默飞世尔，目录号：34028)加入到培养板中以引发反应。10分钟后，用1M H2SO4终止反应。测定450nm-620nm处的吸光度。克隆与人4-1BB结合的EC50和代表性结合曲线示于图7。
结果表明，两种抗体P4B-2和P4B-3均可结合人4-1BB蛋白，EC50分别为0.1126nM和0.07234nM。
因此，两种双特异性抗体P4B2和P4B3既可结合人PD-L1，也可结合人4-1BB蛋白，EC50较低。
实施例7：结合亲和力
对PD-L1蛋白的结合亲和力
通过ForteBio Octet RED 96(Fortebio)测定P4B-3抗体对人PD-L1蛋白(ACRO，目录号：PD1-H5229)和食蟹猴PD-L1蛋白(义翘神州，目录号：90251-C08H)的动力学结合活性。
用P4B-3抗体包被预平衡的抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(Fortebio，目录号：18-5060)。将人PD-L1(ACRO，目录号：PD1-H5229)和食蟹猴PD-L1(义翘神州，目录号：90251-C08H)蛋白用作分析物并用抗体捕获。使用Octet软件通过1:1结合模型对数据集进行拟合。
表4汇总了本发明的双特异性抗体P4B-3对人和食蟹猴PD-L1蛋白的亲和力。
表4.P4B-3对重组人和食蟹猴PD-L1的亲和力
结果表明，抗体P4B-3能特异性结合人PD-L1和食蟹猴PD-L1，KD分别为0.29nM和0.061nM。
对4-1BB蛋白的结合亲和力
通过ForteBio Octet RED 96(Fortebio)测定P4B-3抗体对人4-1BB蛋白(义翘神州，目录号：10041-H08H)的动力学结合活性。
用抗4-1BB抗体包被预平衡的抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(Fortebio，目录号：18-5060)。将人4-1BB(义翘神州，目录号：10041-H08H)用作分析物并用抗体捕获。使用Octet软件通过1:1结合模型对数据集进行拟合。
表5汇总了抗人4-1BB抗体对人4-1BB蛋白的亲和力。
表5.P4B-3对重组人4-1BB的亲和力
样品 抗原 KD(M) Kon(M-1S-1) Koff(S-1) 全R^2
P4B-3 人4-1BB 1.46E-7 2.80E+4 4.09E-3 0.8444
结果表明，抗体P4B-3可结合人4-1BB蛋白，EC50为1.46E-7M。
实施例8：用HEK293-4-1BB/NFκB系统对P4B-3进行的4-1BB报告基因测定
在PD-L1依赖性4-1BB报道基因系统中评估P4B-3双特异性抗体的激活。HEK293-NFκB-Luc-人4-1BB细胞系、A375-PD-L1靶细胞系和CHO-K1-PDL-1细胞系由南京维立志博生物科技有限公司自行培育。
根据第[00222]段的实施例4指示的方法获得HEK293-NFκB-Luc-人4-1BB细胞系。
使用LipofectamineTM 2000转染试剂(Invitrogen，目录号：11668019)，用人PD-L1基因(SEQ ID NO:62，编码SEQ ID NO:61的氨基酸序列)转染A375(中科院典型培养物保藏中心的细胞库，目录号：SCSP-533)亲代细胞系。在用嘌呤霉素(Gibco，目录号：A1113802)进行筛选后，选出高表达人PD-L1的稳定单细胞克隆，以获得A375-PD-L1细胞。
使用LipofectamineTM 2000转染试剂(Invitrogen，目录号：11668019)，用人PD-L1基因(SEQ ID NO:62，编码SEQ ID NO:61的氨基酸序列)转染CHO-K1(ATCC，目录号：CCL-61)亲代细胞系。在用嘌呤霉素(Gibco，目录号：A1113802)进行筛选后，选出高表达人PD-L1的稳定单细胞克隆，以获得CHO-K1-PDL1细胞。
荧光素酶的表达与4-1BB的活性直接相关。
收集HEK293-NFκB-Luc-人4-1BB细胞和A375-PD-L1细胞，并分别用测定缓冲液(DMEM+1％FBS，起始浓度：10nM，4个稀释度)稀释至合适的细胞密度。将两种细胞混合，使得HEK293-4-1BB/NFκB细胞的细胞密度为40000个细胞/60μL，A375-PD-L1细胞的密度为20000个细胞/60μL。将混合物以60μL/孔加入到96孔板(康宁，目录号：3917)中。在测试靶细胞非依赖性刺激的平行测定中，仅将HEK293-NFκB-Luc-人4-1BB细胞加入到另一个96孔板(康宁，目录号：3917)中。
然后将60μL/孔的系列稀释的待测样品P4B-3和INBRX-105-1(PD-L1×4-1BB双特异性抗体，SEQ ID NO:84，US20170198050A1)(起始浓度：200nM，5倍的稀释系列，9个浓度)加入到所得的培养板中。在37℃培养箱中温育6小时后，将One-Glo(Promega，目录号：E6130)试剂以60μL/孔加入到培养板中。用光度计(帝肯，目录号：F200)测定相对发光单位。
图9A至图9B示出了PD-L1×4-1BB双特异性抗体(P4B-3和INBRX-105-1)在不存在PD-L1的情况下诱导4-1BB刺激的能力。P4B-3在不存在PD-L1的情况下不能刺激4-1BB信号通路，而INBRX-105-1对照在高测定浓度时可以刺激信号通路(图9B)。
还收集HEK293-NFκB-Luc-人4-1BB细胞和CHO-K1-PD-L1细胞，分别用测定缓冲液(DMEM+1％FBS)稀释至合适的细胞密度。将两种细胞混合，HEK293-NFκB-Luc-人4-1BB细胞的细胞密度为40000细胞/60μL，CHO-K1-PD-L1细胞的密度为20000细胞/60μL。将混合物以60μL/孔加入到96孔板(康宁，目录号：3917)中。
然后将60μL/孔的系列稀释的待测样品P4B-3和NM21-PRO1186(PD-L1×4-1BB双特异性抗体，WO2019072868A1)(起始浓度：200nM，5倍的稀释系列，9个浓度)加入到所得的培养板中。在37℃培养箱中温育6小时后，将One-Glo(Promega，目录号：E6130)试剂以60μL/孔加入到培养板中。用光度计(帝肯，目录号：F200)测定相对发光单位。
图8示出了PD-L1×4-1BB双特异性抗体(P4B-3和NM21-PRO1186)诱导PD-L1结合依赖性4-1BB刺激的能力。结果表明，在存在PD-L1的情况下，P4B-3和NM21-PRO1186均可刺激4-1BB信号通路，即依赖于它们与PD-L1的结合。它们的激动活性是相当的。这些结果表明，P4B-3对HEK293-NFκB-Luc-人4-1BB报道基因的激活能力严格依赖于其与PD-L1的结合。
实施例9：体外人PBMC细胞的激活
从健康供体中获得人外周血单核细胞(PBMC)。在含有Lymphoprep密度梯度试剂(StemCell Technologies)的SepMate-50管(StemCell Technologies)中回收单核细胞。将这两种细胞冷冻在液氮中备用。
在4℃用0.2μg/mL功能级抗CD3(eBioscience，目录号：16-0037-85)包被96孔板(康宁，目录号：3799)过夜。第二天，将包被的培养板用DPBS缓冲液(Hyclone，SH30256.01)洗涤两次。
将PBMC细胞(供体712023)在37℃水浴中快速复苏，并将细胞悬浮液转移到含有温热的完全培养基(90％RPMI 1640(Gibco，目录号：22400)+10％FBS(Gibco，目录号：10099-141))的管中。然后将细胞以300g离心5分钟。弃去上清液，并将PBMC细胞重悬于完全培养基(90％RPMI 1640+10％FBS)中，并调节细胞密度至1×106细胞/mL。
靶细胞Raji/PD-L1的制备如下：用慢病毒系统(GeneCopoeiaTM，目录号：LT001)中包装的人PD-L1基因(SEQ ID NO:62，编码SEQ ID NO:61的氨基酸序列)感染Raji亲代细胞系(中国科学院典型培养物保藏中心的细胞库，目录号：TCHu 44)。在用嘌呤霉素(Gibco，目录号：A1113802)进行筛选后，选出高表达人PD-L1的稳定单细胞克隆，以获得Raji/PD-L1细胞。
温育后，通过以300g离心5分钟收获靶细胞Raji/PD-L1。弃去上清液，并将靶细胞轻轻悬浮于完全培养基(90％RPMI 1640+10％FBS)中，直至细胞密度为1×106细胞/mL。将抗体P4B-3、抗PD-L1(HUL02，来自CN109021107A)、实施例1中制备的41BB-2-IgG1、抗PD-L1+41BB-2(比例1:1)和人IgG阴性对照(重链SEQ ID NO:82，轻链SEQ ID NO:83)系列稀释以制备待测样品溶液(终浓度为0.05nM、0.5nM、5nM和50nM)。
接着将Raji/PD-L1以50,000个细胞/孔加入到包被的96孔测定板中，并将各待测样品溶液以50μL/孔加入，随后将完全培养基中的PBMC以100,000个细胞/孔加入。在37℃和5％CO2条件下温育72小时后，收获细胞上清液，并根据制造商的说明书用ELISA试剂盒(R&D，目录号：DY202)对培养上清液中的人白介素-2(IL-2)水平进行定量。结果示于图10。
结果表明，P4B-3以剂量依赖性方式刺激PBMC细胞，以释放比使用单独的抗PD-L1、单独的抗4-1BB(41BB-2-IgG1mut)或抗PD-L1和抗4-1BB的组合更高水平的IL-2。
实施例10：P4B-3在携带MC38-hPD-L1的huPD-L1/hu4-1BB KI小鼠模型中的抗肿瘤 功效
将5×105MC38-huPD-L1细胞(百奥赛图)皮下植入6-7周的BALB/c-huPD-L1/hu4-1BB双敲入小鼠(百奥赛图)，并在第0天当平均肿瘤体积达到约87mm3(长度×宽度2/2)时随机分成4组。
在第0天、3天、6天、9天、12天、15天，分别向小鼠腹膜内施用P4B-3、抗PD-L1抗体(HUL02，来自CN109021107A)、41BB-2-IgG1和溶媒(PBS)。在研究期间，每周用卡尺测量两次来监测肿瘤体积。
与溶媒组相比，P4B-3显示非常显著的肿瘤抑制作用(P＜0.001)，肿瘤体积的TGI(肿瘤抑制率)＝81.8％，高于抗PD-L1组(TGItv＝70.5％)和抗4-1BB组(TGItv＝46.1％)。P4B-3的平均瘤重也显著低于溶媒组(P＜0.05)。
在研究结束时，从肿瘤中分离TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)，并用不同的细胞标记抗体(Brilliant Violet 510TM抗小鼠CD45(Biolegend，目录号：103138)，PerCP/Cy5.5抗小鼠TCRβ链(Biolegend，目录号：109228)，Brilliant Violet 421TM抗小鼠CD4(Biolegend，目录号：100438)，Brilliant Violet 711TM抗小鼠CD8a(Biolegend，目录号：100748)，PE抗小鼠/大鼠Foxp3,eBioscience(赛默飞世尔，目录号：12-5773-82))染色，然后通过FACS检测。
与溶媒组和抗PD-L1组相比，P4B-3组的CD3+T细胞中的CD8+T细胞的比率显著较高(P＜0.05)，而CD3+细胞中的Treg细胞的比率显著较低(P＜0.05)。
结果如图11、图12和图13所示。这些结果表明，在携带MC38-huPD-L1细胞的BALB/c-huPD-L1/hu4-1BB KI小鼠模型中，P4B-3显示出强大的抗肿瘤功效。此外，P4B-3还可在肿瘤微环境中提高CD8+比率并降低Treg比率。
表6.肿瘤抑制率(肿瘤体积)
注：
a肿瘤体积数据表示为平均值±SEM；
b TGI＝(1-治疗组相对肿瘤体积/溶媒组相对肿瘤体积)×100％
c为评价与溶媒组相比的效果，进行双因素方差分析，然后进行Tukey多重比较检验。
实施例11：P4B-3在大鼠体内的药代动力学研究
评估P4B-3在大鼠体内的药代动力学曲线。澎立生物审查并批准了研究中涉及动物照料和使用的程序。使用了三只雄性SD大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)。
在本研究中，P4B-3以10mg/kg的单一剂量静脉内注射到大鼠体内。在0小时至336小时(0-14天)之间的不同时间点，特别是在第0天在0分钟、10分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时，以及在第1天、第2天、第4天、第7天、第10天和第14天获得血液样品。将所有样品进行处理以获得血浆，并将血浆于-70℃至-86℃冷冻保存直至以待分析。通过PD-L1和4-1BB抗原捕获试验测定血浆中存在的P4B-3浓度。表7中列出了药代动力学参数。
4-1BB抗原捕获试验：通过在4℃在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中温育过夜，将0.5μg/mL的人4-1BB，人Fc标记蛋白(Hu4-1BB-huFc，SEQ ID NO:81)固定在96孔板(Costar，目录号：42592)上。然后通过在37℃加入1％BSA(生工生物工程，目录号：A500023-0025)的PBS(Hyclone，目录号：SH30256.01)溶液温育一小时来封闭培养板。封闭后，将培养板用PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗涤三次。将0.1μg/mL的P4B-3在血清稀释缓冲液(含有0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS，包括2％v/v大鼠血清)中稀释，3倍系列稀释6次，共得到7个浓度的抗体溶液，根据其作标准曲线。同时，分别以80ng/mL、8ng/mL、0.8ng/mL的P4B3为高、中、低质量对照，用血清稀释缓冲液稀释。所有大鼠血清样品均通过预先剂量混合的大鼠血清和稀释缓冲液(含有0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)稀释，以使终浓度保持在80ng/mL-0.8ng/mL的范围内，并且在样品稀释液中含有2％v/v大鼠血清。将标准曲线、质量对照和样品加入到培养板中，并在37℃温育一小时。然后，将培养板用PBST洗涤三次，在37℃加入用稀释缓冲液以1/10,000稀释的F(ab')2片段特异性的过氧化物酶AffiniPure山羊抗人IgG(杰克逊免疫研究，目录号：109-035-097)温育一小时，然后用PBST再次洗涤。将50μL/孔TMB(赛默飞世尔，目录号：34028)加入到培养板中，15分钟后，用1M H2SO4终止反应。测定450nm-620nm处的吸光度。
PD-L1抗原捕获试验：通过在4℃在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中温育过夜，将0.5μg/mL的人PD-L1，his标记蛋白(huPD-L1-his，ACRO，目录号：10084-H08H)固定在96孔板(Costar，目录号：42592)上。然后通过在37℃加入1％BSA的PBS溶液温育一小时来封闭培养板。封闭后，将培养板用PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗涤三次。将0.1μg/mL的P4B-3在血清稀释缓冲液(含有0.05％Tween 20和包括2％v/v大鼠血清的0.5％BSA的PBS)中稀释，3倍系列稀释6次，共得到7个浓度的抗体溶液，根据其作标准曲线。同时，分别以80ng/mL、8ng/mL、0.8ng/mL的P4B3为高、中、低质量对照，用血清稀释缓冲液稀释。所有大鼠血清样品均通过预先剂量混合的大鼠血清和稀释缓冲液(含有0.05％Tween 20和0.5％BSA的PBS)稀释，以使终浓度保持在80ng/mL-0.8ng/mL的范围内，并且在样品稀释液中含有2％v/v大鼠血清。将标准曲线、质量对照和样品加入到培养板中，并在37℃温育一小时。然后，将培养板用PBST洗涤三次，在37℃加入用稀释缓冲液以1/20,000稀释的Fc片段特异性的过氧化物酶AffiniPure山羊抗人IgG(杰克逊免疫研究，目录号：109-035-098)温育一小时，然后用PBST再次洗涤。将50μL/孔TMB(赛默飞世尔，目录号：34028)加入到培养板中，15分钟后，用1MH2SO4终止反应。测定450nm-620nm处的吸光度。
表7.P4B-3在大鼠体内的PK参数
P4B-3在大鼠体内的药代动力学表现良好，表明其可用于制药领域。
尽管上文已经结合一个或多个实施方案描述了本公开，但应当理解，本公开并不局限于这些实施方案，并且本描述旨在覆盖所有替代方案、变型和等效形式，如可以被包括在所附权利要求的精神和范围内。本文引用的所有参考文献进一步通过引用方式整体并入。
序列描述：
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Claims (10)

1.一种结合4-1BB的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含三个重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区以及三个轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中
(1)所述三个重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ ID NO:25所示的序列组成的重链可变区；并且所述三个轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ IDNO:26所示的序列组成的轻链可变区；
(2)所述三个重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ ID NO:27所示的序列组成的重链可变区；并且所述三个轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ IDNO:28所示的序列组成的轻链可变区；
(3)所述三个重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ ID NO:29所示的序列组成的重链可变区；并且所述三个轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ IDNO:30所示的序列组成的轻链可变区；或
(4)所述三个重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ ID NO:31所示的序列组成的重链可变区；并且所述三个轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区来源于由SEQ IDNO:32所示的序列组成的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中
(i)所述重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列组成，并且所述轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列组成；
(ii)所述重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:
7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列组成，并且所述轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列组成；
(iii)所述重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:
13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的序列组成，并且所述轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的序列组成；或
(iv)所述重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:
19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的序列组成，并且所述轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的序列组成。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含所述重链可变区，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:77具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含所述轻链可变区，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:26(X1＝S或G)、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:78具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区包含分别与以下序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(X1＝S)；(2)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(X1＝G)；(3)SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；(4)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；(5)SEQID NO:31和SEQ ID NO:32；或(6)SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含与所述重链可变区连接的具有SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链恒定区，和/或与所述轻链可变区连接的具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链恒定区。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分激活4-1BB信号传导，并且所述抗体或其抗原结合部分是单克隆抗体。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分是小鼠抗体、人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分是IgG1、IgG2或IgG4同种型。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合部分选自：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段，(v)dAb片段；(vi)纳米抗体；和(vii)单链Fv(scFv)。
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