JP2023552220A - ヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ構築物及びその使用の方法 - Google Patents

ヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ構築物及びその使用の方法 Download PDF

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Abstract

高純度及び熱安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を可能にする１つ以上のアミノ酸変異をＣＨ３ドメインに含む、ヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物。当該ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、１つ以上の標的結合ドメインを含んでもよい。Ｊ鎖によって２つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物が連結された複数のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を含む、高次ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体が作製されてもよい。【選択図】なし

Description

本開示は、ＩｇＡベースの免疫治療薬の分野に関し、特に、１つ以上の結合ドメインを含むヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物及びこれらの構築物の治療薬としての使用に関する。
背景
一般に、抗体ベースの治療薬は、ＩｇＧ由来のフレームワークを含む。Ｉｇサブタイプは、安定で、高い親和性で標的と結合し、有利な薬物動態学的挙動を有し、何十年もの焦点を絞った研究の結果として標的及びエフェクター細胞に対する機能的影響が十分に理解されている。しかしながら、活性化することができるエフェクター細胞及び得られ得る結合価に対するＩｇＧに基づく機能性には制限がある。
好中球は、免疫系の不可欠な部分であり、ヒト血液で見られる最も一般的な白血球である（表１を参照）。ＩｇＡは、ＦｃのＣα２／Ｃα３（ＩｇＡ ＣＨ２／ＣＨ３）接合面の残基を介して好中球上のＦｃαＲＩと相互作用する唯一のＩｇアイソタイプである。好中球上のＦｃαＲＩとのＩｇＡの相互作用は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の放出、脱顆粒及びケモカイン放出を含む様々な炎症促進応答を誘発する（Ｈｅｉｎｅｋｅ， ２０１７，Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，４７（２）：１８４－１９２（非特許文献１））。ＩｇＡはまた、エクスビボにおける細胞傷害性にも関係することがある。ＩｇＡによって活性化された好中球は、Ｈｅｒ２＋＋＋ＢＴ４７４細胞を死滅させることができることも示された（Ｂｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＭＡｂｓ ７：７４３－７５１（非特許文献２））。Ｈｅｒ２及びその他の標的を介したＩｇＡが関係する腫瘍細胞死滅がエクスビボで好中球によって示された（Ｂｒａｎｄｓｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０：７０４（非特許文献３））。さらに、ＩｇＡはインビボにおける腫瘍増殖阻害に関係することがある。特に、ＩｇＡは、ＦｃαＲＩトランスジェニック（Ｔｇ）マウスモデルでインビボにおいて腫瘍増殖を阻害することを示した（Ｂｏｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，５：１２１３－１２２６（非特許文献４））。
Figure 2023552220000001
 *２９１人の成人から収集されたデータ（Ｏｒｆａｎａｋｉｓ， ｅｔ ａｌ．， １９７０， Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ， ５３：６４７－６５１（非特許文献５）を参照）
ＩｇＡによる好中球の動員及び活性化は、抗体ベースの免疫療法に新しい生物学的機能を提供する。
Ｈｅｉｎｅｋｅ， ２０１７，Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，４７（２）：１８４－１９２ Ｂｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＭＡｂｓ ７：７４３－７５１ Ｂｒａｎｄｓｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０：７０４ Ｂｏｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，５：１２１３－１２２６ Ｏｒｆａｎａｋｉｓ， ｅｔ ａｌ．， １９７０， Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ， ５３：６４７－６５１
概要
ヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ構築物及びその使用の方法が本明細書に記載されている。本開示の一態様は、第１のＣＨ３ドメイン配列を含む第１のＦｃポリペプチドと、第２のＣＨ３ドメイン配列を含む第２のＦｃポリペプチドとを含み、第１及び第２のＣＨ３ドメイン配列が改変型ＣＨ３ドメインを形成する、ＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物であって、第１及び第２のＣＨ３ドメイン配列は、ホモ二量体Ｆｃよりもヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するアミノ酸変異を含み、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ａ６０８５Ｙに、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹ、Ａ６０８５ＹＭ、Ａ６０８５ＹＷ及びＡ６０８５ＹＨから選択されるアミノ酸置換、ならびに位置Ｔ６０８６に、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６Ｆ、Ｔ６０８６Ｍ、Ｔ６０８６Ｗ及びＴ６０８６Ｈから選択されるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｗ６０８１に、Ｗ６０８１Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ、Ｗ６０８１Ａ、Ｗ６０８１Ｖ及びＷ６０８１Ｉから選択されるアミノ酸置換を含み、ヘテロ二量体Ｆｃは、７０％以上の純度で形成され、アミノ酸位置のナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングに従う、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物に関する。
本開示の別の態様は、第１のＣＨ３ドメイン配列を含む第１のＦｃポリペプチドと、第２のＣＨ３ドメイン配列を含む第２のＦｃポリペプチドとを含み、第１及び第２のＣＨ３ドメイン配列が改変型ＣＨ３ドメインを形成する、ＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物であって、第１及び第２のＣＨ３ドメイン配列は、ホモ二量体Ｆｃよりもヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するアミノ酸変異を含み、
（ａ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＹ及びＴ６０８６Ｌを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｂ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＹ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｃ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｌ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｄ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｅ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｔ６０２２Ｖ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｆ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｔ６０２２Ｌ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｇ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｔ６０２２Ｉ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｈ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｌ６００７Ｆ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｉ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｙ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｙ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｊ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｐ６０１０Ｃ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｋ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｐ６０１０Ｃ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｌ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ｐ６０１０Ｃ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ｐ６０１０Ｃ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含み、
ヘテロ二量体Ｆｃは、７０％以上の純度で形成され、アミノ酸位置のナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングに従う、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物に関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物と、１つ以上の治療用薬剤、診断用薬剤または標識薬剤とを含む、複合物に関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の２つ以上のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物及びＪ鎖を含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体であって、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のうちの２つがＪ鎖によって連結されている、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体に関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物に関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物と、１つ以上の治療用薬剤、診断用薬剤または標識薬剤とを含む、複合物、ならびに、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物に関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の２つ以上のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物及びＪ鎖を含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む、医薬組成物に関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする、単離ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（複数）のセットに関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクターセットまたはベクター（複数）のセットに関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞に関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を作製する方法であって、宿主細胞に、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチドをトランスフェクトする工程と、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の発現に適した条件下で、宿主細胞を培養する工程とを含む、方法に関する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を作製する方法であって、宿主細胞に、α－テールピースを含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチド及びＪ鎖をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトする工程と、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物及びＪ鎖の発現に適した条件下で、宿主細胞を培養する工程とを含む、方法に関する。
ＩｇＡ Ｆｃのヘテロ二量体化に至らせる変異に関するネガティブ及びポジティブデザイン概念を示す図を示す。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ片腕抗体（ＯＡＡ）構築物の非還元ＣＥ－ＳＤＳプロフィールを示す。ＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３（バリアント番号３２５９５）または立体デザイン１、２、３、４もしくは６（それぞれバリアント番号３２５１６、３２５１７、３２５１８、３２５１９及び３２５２１）を含むＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ片腕抗体（ＯＡＡ）構築物の非還元ＣＥ－ＳＤＳプロフィールを示す。立体デザイン７、８、９、１０または１１（それぞれバリアント番号３３３３０、３３３３１、３３３３２、３３３３３及び３３３３４）を含むＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。ＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３（バリアント番号３２５９５）を含むＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１（バリアント番号３２５１６）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン２（バリアント番号３２５１７）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン３（バリアント番号３２５１８）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン４（バリアント番号３２５１９）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン６（バリアント番号３２５２１）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン７（バリアント番号３３３３０）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン８（バリアント番号３３３３１）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン９（バリアント番号３３３３２）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１０（バリアント番号３３３３３）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１１（バリアント番号３３３３４）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。ＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３（バリアント番号３２５９５）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１（バリアント番号３２５１６）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン２（バリアント番号３２５１７）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン３（バリアント番号３２５１８）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン６（バリアント番号３２５２１）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン７（バリアント番号３３３３０）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン８（バリアント番号３３３３１）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン９（バリアント番号３３３３２）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１０（バリアント番号３３３３３）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１１（バリアント番号３３３３４）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物の非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロフィールを示す。ＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３（バリアント３２５９５）または立体デザイン１、２、３もしくは６（それぞれバリアント番号３２５１６、３２５１７、３２５１８及び３２５２１）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物の非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロフィールを示す。立体デザイン７、８、９、１０または１１（それぞれバリアント番号３３３３０、３３３３１、３３３３２、３３３３３及び３３３３４）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物に対するＤＳＣサーモグラムのオーバーレイを示す。ＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３（バリアント番号３２５９５）または立体デザイン１、２、３もしくは６（それぞれバリアント番号３２５１６、３２５１７、３２５１８及び３２５２１）を含むＩｇＡ Ｆｃ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物に対するＤＳＣサーモグラムのオーバーレイを示す。立体デザイン７～１１（バリアント番号３３３３０～３３３３４）を含むＩｇＡ Ｆｃ構築物。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。結合ドメインが融合されて、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を形成するＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。２つの例示的な結合ドメインが結合したＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格を示す実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 Ｊ鎖（網点）によって連結された２つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、実例となるさらに高次のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃの２つの鎖を灰色及び縞模様で示す。各構造の中心にテールピース集合体が示される。それぞれの集合体に関して単一の配向が示されているが、多くの配向が可能である。Ｊ鎖及びＦｃ：Ｆｃ相互作用は、鎖Ａまたは鎖Ｂに対して選択的ではないため、各結合単位の結合ドメインの配向は逆も可能である。Ｊ鎖によって連結された２つの二重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、二量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体。 Ｊ鎖（網点）によって連結された４つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、実例となるさらに高次のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃの２つの鎖を灰色及び縞模様で示す。各構造の中心にテールピース集合体を示す。各集合体に関して単一の配向が示されるが、多くの配向が可能である。Ｊ鎖及びＦｃ：Ｆｃ相互作用は、鎖Ａまたは鎖Ｂに対して選択的ではないため、各結合単位の結合ドメインの配向は逆も可能である。Ｊ鎖によって連結された４つの二重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、四量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体。 Ｊ鎖（網点）によって連結された５つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、実例となるさらに高次のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃの２つの鎖を灰色及び縞模様で示す。各構造の中心にテールピース集合体を示す。各集合体に関して単一の配向が示されるが、多くの配向が可能である。Ｊ鎖及びＦｃ：Ｆｃ相互作用は、鎖Ａまたは鎖Ｂに対して選択的ではないため、各結合単位の結合ドメインの配向は逆も可能である。Ｊ鎖によって連結された５つの二重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、五量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体。 鎖Ａ及び鎖Ｂを表示したＩｇＡ ＨｅｔＦｃデザイン（立体６）の構造的表現を示す。タンパク質骨格はカートゥーン表示で示され、側鎖は線表示として示されている。非極性水素は示していない。完全なＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃを示す。 鎖Ａ及び鎖Ｂを表示したＩｇＡ ＨｅｔＦｃデザイン（立体６）の構造的表現を示す。タンパク質骨格はカートゥーン表示で示され、側鎖は線表示として示されている。非極性水素は示していない。コア位置Ａ６０８５、Ｔ６０８６（両方とも鎖Ａ）及びＷ６０８１（鎖Ｂ）周辺を中心とした変異残基の拡大図を示す。 ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１及びＩｇＡ２ｍ２ Ｆｃ領域に関するアミノ酸配列のアラインメントを示す。 Ｆｃの一方または両方の鎖におけるＦｃαＲの結合を排除する変異を有するＩｇＡ ＨｅｔＦｃに基づくＩｇＡ ＯＡＡバリアントを示す。 ＦｃαＲ及びＦｃＲｎの両方との結合が可能なＩｇＡ ＨｅｔＦｃに基づく改変型ＩｇＡ ｍＡｂを示す
詳細な説明
本開示は、ヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）の形成を促進するアミノ酸変異をＣＨ３ドメインに導入するＩｇＡ Ｆｃ領域の操作に関する。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、ＩｇＡベースの二重特異性または多重特異性結合タンパク質、ならびにＩｇＡベースの多量体結合タンパク質の構築を可能にする。本開示によると、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物に含まれる１つ以上のアミノ酸変異は、少なくとも約７０％の純度を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を可能にする。本開示のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物はまた、熱安定性である。例えば、特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃのＣＨ３ドメインは、約６０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ Ｈｅｔ ＦｃのＣＨ３ドメインは、野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの１０℃（±１０℃）以内のＴｍを有する。
本開示のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、ヒンジ領域とともにＩｇＡ Ｆｃ領域を含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格；ＩｇＡ骨格及び１つ以上の結合ドメインを含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位；ならびに複数の（例えば、２つ以上の）ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を含む。
本開示のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、ＩｇＧが未利用の機能を有するＩｇＡアイソタイプに、多重特異性の可能性を導入する。例えば、特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、ＦｃαＲＩを介して好中球を動員することができる多重特異性及び多量体の生物製剤の生成を容易にする。好中球は、免疫系の不可欠な部分であり、ヒト血液で見られる最も一般的な白血球であるため、ＩｇＡによる好中球の動員及び活性化は、抗体ベースの免疫療法に新しい生物学的機能を提供する。本開示の特定の実施形態は、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位及びＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を治療薬として使用する方法に関する。本開示の特定の実施形態は、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位及びＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を診断法として使用する方法に関する。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段示されない限り、所与の値からのおよそ＋／－１０％の変動を指す。そのような変動は常に、それが具体的に言及されているか否かにかかわらず、本明細書で提供される任意の所与の値に含まれることを理解されたい。
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語の使用は、「含む」という用語と併せて本明細書で使用される場合、「１つ」を意味し得るがそれはまた、ある特定の実施形態では、「１つ以上」、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」の意味と一致する。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する」という用語及びその文法的変化形は、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素及び／または方法工程を排除しない。組成物、使用または方法に関連して本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、追加の要素及び／または方法工程が存在する場合があるが、これらの追加は、列挙される組成物、方法または使用が機能する様式に実質的に影響を及ぼさないことを示す。組成物、使用または方法に関連して本明細書で使用される場合、「からなる」という用語は、追加の要素及び／または方法工程の存在を除外する。ある特定の要素及び／または工程を含むものとして本明細書に記載される組成物、使用または方法はまた、ある特定の実施形態では、それらの要素及び／または工程から本質的になる場合もあり、他の実施形態では、それらの要素及び／または工程からなる場合もあり、これらの実施形態が特に参照されるか否かを問わない。
「融合される」とは、本明細書に記載の多量体の構成要素（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント及びＦｃドメインポリペプチド）が、直接または１つ以上のペプチドリンカーを介してかのいずれかでペプチド結合によって連結されることを意味する。
本明細書で使用される場合、「一本鎖」という用語は、ペプチド結合によって線状に連結されたアミノ酸単量体を含む分子を指す。例えば、抗体の抗原結合フラグメントは、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を含む場合もある。
本明細書中で使用される場合、「ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物」は、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格（ヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ）、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位（ヘテロ二量体ＩｇＡ結合単位）及びＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を含む、任意の本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を含むことを意味する。
改変型Ｊ鎖に関連した「機能的」という用語は、Ｊ鎖が、未変性Ｊ鎖、例えば、未変性ヒトＪ鎖の主要な機能、特に、ＩｇＡの効率的な重合（二量体形成、四量体形成）及びそのような重合体（二量体、四量体）の分泌性成分（ＳＣ）／重合体（ｐ）Ｉｇとの結合を可能にする能力を保持することを意味する。
「単離された」という用語は、物質に関して本明細書で使用される場合、物質がその元の環境（例えば、天然に存在する場合はその天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、動物生体内に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されているものではないが、天然系において共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、及び／またはそのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であり得るが、そのようなベクターまたは組成物は、その天然環境の一部ではないという点で単離されている。
「保存的に改変されたバリアント」という用語は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列などのアミノ酸配列に関して本明細書中で使用される場合、アミノ酸配列が配列の機能に著しく影響を与えることのない単一のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸の置換、付加または除去によって改変されたことを意味する。例えば、保存的に改変されたバリアントは、１つ以上の保存的なアミノ酸置換によって改変されたアミノ酸配列である場合もある。機能的に類似したアミノ酸を示す保存的置換表が当業者に知られている。例えば、以下の８つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び［０１３９］８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照）。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のための基礎の配列として使用されるＩｇＡ配列は、保存的に改変されたバリアントであってもよい。
アミノ酸配列に関して本明細書中で使用される「実質的に同一」という用語は、例えば、下に示される方法を使用して最適にアラインメントされた場合に、配列が、定義された第２のアミノ酸配列（または「参照配列」）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を共有することを示す。特定の実施形態において、実質的に同一のアミノ酸配列は、参照配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。「実質的な同一性」は、完全長配列または機能的ドメインなどの配列の様々な種類及び長さを言及するために使用される場合もある。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、当該技術分野において周知の様々な方法、例えば、一般的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ， Ｔ． Ｆ． ａｎｄ Ｍ． Ｓ． Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４７：１９５－７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）、Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ， Ｍ． Ｏ．， Ｅｄ ｐｐ３５３－３５８に組み込まれた「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２－４８９ １０（１９８１））；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， Ｗ． Ｇｉｓｈ， ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０）ならびにＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、ＣＬＵＳＴＡＬ、及びＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含むそのバリエーションを使用して求めることができる。加えて、当業者であれば、比較される配列の長さにわたって最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。一般に、アミノ酸配列に関しては、比較配列の長さが少なくとも１０アミノ酸になる。実際の長さは比較される配列の全長によって決まることになり、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、もしくは少なくとも２００アミノ酸である場合もあり、または完全長のアミノ酸配列である場合もあることを当業者は理解するであろう。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、本明細書の表（複数可）に記載される参照アミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
「由来の」及び「に基づく」という用語は、組み換えアミノ酸配列に関して使用される場合、組み換えアミノ酸配列が対応する野生型アミノ酸配列の配列と実質的に同一であることを意味する。例えば、野生型ＩｇＡ Ｆｃ配列由来の（またはそれに基づく）ＩｇＡ Ｆｃアミノ酸配列は、野生型ＩｇＡ Ｆｃ配列と実質的に同一である（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を共有する）。
「対象」という用語は、本明細書中で使用される場合、処置、観察または実験の対象である動物、いくつかの実施形態では哺乳動物を指す。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜動物（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。
「哺乳動物」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタを含むが、これらに限定されない。
「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔもしくはｋｎｏｃｋｏｕｔ）」という用語は、本明細書で使用される場合、結合標的との結合を排除または低減するバリアントの様々な位置内の変異または一連の変異を指す。
本記載では、いずれの濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲も、別段の指示がない限り、列挙される範囲内の任意の整数、ならびに適切な場合、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）の値も含むと理解されるべきである。
本明細書で論述される任意の実施形態は、本明細書に開示される任意の方法、使用または組成物に関して実行され得ることが企図される。
本明細書に開示される実施形態と組み合わせて記載される特定の特徴、構造及び／または特性は、本明細書に開示される別の実施形態と組み合わせて記載される特徴、構造及び／または特性と任意の好適な様式で組み合わされて１つ以上のさらなる実施形態が提供され得る。
一実施形態における特徴の積極的な列挙が、代替的な実施形態において特徴を除外するための基礎として機能することも理解されるべきである。例えば、所与の実施形態または特許請求の範囲について選択肢の一覧が提示される場合、１つ以上の選択肢が一覧から削除される場合があり、短縮された一覧が、代替的な実施形態を形成する場合があると理解されるべきであり、そのような代替的な実施形態が特に参照されるか否かを問わない。
抗体技術の当業者によって理解される用語は、本明細書で異なるような別段の明示的な定義がない限り、各々が当該技術分野で得られた意味を付与される。抗体は、可変領域、ヒンジ領域、及び定常ドメインを有することが知られている。免疫グロブリンの構造及び機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ（Ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）に概説されている。
本明細書において他に指定がない限り、ＩｇＡ Ｆｃ領域及びＩｇＡテールピースのアミノ酸残基のナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従う（Ｌｅｆｒａｎｃ， ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５５－７７；Ｌｅｆｒａｎｃ， ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２９：１８５－２０３を参照）。表２は、（アラインメントによる）対応するＥＵナンバリングとともにＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのＩＭＧＴナンバリング及びアミノ酸配列を示す。他のＩｇＡ Ｆｃ配列のナンバリングは、既知の技術を使用した表２に示される配列との単純な配列アラインメントによって、当業者が容易に決定できる。表３は、ＩｇＡテールピースのＩＭＧＴナンバリング及びアミノ酸配列を示す。
Figure 2023552220000002
Figure 2023552220000003
Figure 2023552220000004
Figure 2023552220000005
本明細書で使用される節の見出しは、系統化のためにすぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
ヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物
本開示は、ヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物に関する。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、ＩｇＡ Ｆｃ領域由来のヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む。ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体形成を促進する１つ以上の非対称アミノ酸変異を含む改変型ＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物に含まれるヘテロ二量体Ｆｃ領域は、１つ以上の結合ドメインが融合して、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位をもたらすことができる骨格（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格）として働くことができる。特定の実施形態において、複数（例えば、２つ以上）のＩｇＡ結合単位が一緒に、例えば、Ｊ鎖を介して融合して、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体をもたらすことができる。特定の実施形態において、他の薬剤（例えば、治療用薬剤または診断用薬剤）を、任意にＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物とコンジュゲートさせてもよい。
ＩｇＡは、２つのサブタイプとして、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２、ならびに様々なアロタイプバリアント（ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、ＩｇＡ２（ｎ））が存在する。２つのサブタイプのうちＩｇＡ２は、短いヒンジ領域により特定の細菌プロテアーゼに対して抵抗性になるため、ＩｇＡ１よりも安定である。この短いヒンジはまた、細胞表面上の抗原とのｌｇＡ２のさらに良好な複数の結合を容易にする堅い非平面構造をもたらす。本開示のために、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のヘテロ二量体Ｆｃ領域は、そのアロタイプバリアントを含む、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２Ｆｃ領域由来であってもよい。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ＩｇＡ１ Ｆｃ領域由来であってもよい。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ＩｇＡ２ Ｆｃ領域またはそのアロタイプバリアント由来であってもよい。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＡ Ｆｃ領域由来であってもよい。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＡ２またはＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ領域由来であってもよい。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ領域由来であってもよい。表４は、野生型ヒト ＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ配列及びテールピースを除去するために切断され、遊離システイン及びグリコシル化部位を除去するために変異させたＩｇＡ２ｍ１ Ｆｃ配列の改変型のアミノ酸配列を示す。Ｆｃ配列は、ヒトＩｇＡ２ｍ１重鎖のＩＭＧＴナンバリング５００１～６１２９と対応する。ＩｇＡ２ｍ１のＣＨ３配列（下線）は、完全長ヒトＩｇＡ１重鎖のアミノ酸６０９７～６１２９（ＩＭＧＴナンバリング）を含む（例えば、Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ， ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５２９９－５３０４を参照）。ＩｇＡテールピースの配列も示す。ＩｇＡ１及びＩｇＡ２ｍ２ Ｆｃ領域のアミノ酸配列を、配列番号４４及び４５として配列表Ｂに示す。Ｆｃ配列のアラインメントを図１０に示す。
Figure 2023552220000006
「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」及び「Ｆｃ」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために本明細書では区別なく使用される。Ｆｃ領域は、典型的に、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域はまた、特定の実施形態ではヒンジ領域を含むものと見なされる場合もある。二量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定な自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、二量体ＩｇＡ ＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＡ ＣＨ３ドメインを含み、ＩｇＡ ＣＨ２ドメインも含んでもよい。
したがって、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のＦｃ領域は、２つのＦｃポリペプチド：第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドから構成され、これらは、本明細書において鎖Ａ及び鎖Ｂと呼ばれる場合もある。各Ｆｃ領域が１つの第１のＦｃポリペプチド及び１つの第２のＦｃポリペプチド（または１つの鎖Ａポリペプチド及び１つの鎖Ｂポリペプチド）を含む場合は、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチド（または鎖Ａ及び鎖Ｂ）という用語は区別なく使用することができる。第１及び第２のＦｃポリペプチドは、「接合面」で接触する。「接合面」は、第２のＦｃポリペプチドの１つ以上の「接触」アミノ酸残基と相互作用する、第１のＦｃポリペプチドの「接触」アミノ酸残基を含む。
Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは、２つのＣＨ３ドメイン配列を含み、１つは二量体Ｆｃの第１及び第２のＦｃポリペプチドの各々からのものである。ＣＨ２ドメインは、２つのＣＨ２ドメイン配列を含み、１つは二量体Ｆｃの第１及び第２のＦｃポリペプチドの各々からのものである。
本開示のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、非対称に改変されたＩｇＡ ＣＨ３ドメインを含み、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する。具体的には、１つ以上のアミノ酸変異が、ＩｇＡ ＣＨ３ドメインに非対称の様式で導入されて、ヘテロ二量体Ｆｃをもたらす。本明細書で使用される場合、非対称アミノ酸変異は、同じ位置の第２のＦｃポリペプチドのアミノ酸とは異なる、１つのＦｃポリペプチドの特定の位置のアミノ酸をもたらす変異である。これは、第１及び第２のＦｃポリペプチドの２つのアミノ酸のうちの一方のみの変異または両方のアミノ酸の２つの異なるアミノ酸への変異の結果であり得る。本明細書で開示されているＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、ＣＨ３ドメインに１つ以上の非対称アミノ酸変異を含む。
野生型ホモ二量体からのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ領域の設計は、安定性と特異性の釣り合いを保つことによるタンパク質操作と関連したポジティブ及びネガティブデザインの概念によって示され、この場合、ポリペプチドが細胞培養条件で発現させられる場合に、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成に至らせる目的で変異が導入される。これらのポジティブ及びネガティブデザインの概括的なデザイン概念が図１に概略的に示される。
ネガティブデザイン戦略は、一方の鎖に大きい側鎖を、反対の鎖に小さな側鎖を導入すること、例えば、ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）戦略（Ｒｉｄｇｗａｙ， ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（７）：６１７－２１；Ａｔｗｅｌｌ， ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２７０（１）：２６－３５）、またはホモ二量体形成の反発力をもたらす静電操作、例えば、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ， ｅｔ ａｌ．２１０１０，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８５（２５）：１９６３７－１９６４６により開発された静電ステアリング戦略のいずれかによって、ホモ二量体の形成に対して不利な相互作用を最大にする。
ポジティブデザイン戦略では、タンパク質内またはタンパク質間の有利な相互作用を最大にするアミノ酸変異がポリペプチドに導入される。そのような戦略は、ホモ二量体に対する効果を無視しながら、所望のヘテロ二量体を特異的に安定させる複数の変異を導入する場合、正味の効果が、ホモ二量体よりも所望のヘテロ二量体相互作用に対して良好な特異性、したがって、より高いヘテロ二量体特異性になると考えられる。タンパク質操作の状況において、ポジティブデザイン戦略は所望のタンパク質相互作用の安定性を最適化するが、９０％を超える特異性はめったに実現しないことが理解される（Ｈａｖｒａｎｅｋ ＆ Ｈａｒｂｕｒｙ，２００３，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，１０（１）：４５－５２；Ｂｏｌｏｎ， ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０２（３６）：１２７２４－９；Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１６（１２）：２７７０－４）。
安定で高度に特異的なヘテロ二量体形成をもたらすＩｇＡ Ｆｃヘテロ二量体を設計するための方法が本明細書中で開示されている。この設計方法は、構造的及び計算モデリング誘導タンパク質操作技術とともにネガティブ及びポジティブデザイン戦略の両方を組み合わせる（本明細書の実施例１を参照）。本明細書のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を生成する方法に使用される計算ツール及び構造機能分析としては、例えば、分子動力学的分析（ＭＤ）、側鎖／主鎖再パッキング、ナレッジベースポテンシャル（Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ｂａｓｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＫＢＰ）、空洞（疎水性）パッキング分析（ＬＪ、ＡＭＢＥＲ、ＳＡＳＡ、ｄＳＡＳＡ（炭素／全原子））、静電ＧＢ計算及び結合分析を挙げることができる。変異Ｆｃ領域を形成するための計算方法は、国際特許公開第ＷＯ２０１２／０５８７６８号、同第ＷＯ２０１５／０２１５４０号、同第ＷＯ２０１４／２０１５６６号、同第ＷＯ２０１４／１３８９９４号、同第ＷＯ２０１４／０２６２９６号、同第ＷＯ２０１３／１８８９８４号、同第ＷＯ２０１３／１３８９２３号、同第ＷＯ２０１２／０４０８３３号、同第ＷＯ２０１２／０３７６５９号及び同第ＷＯ２０１１／０６３５１８号にも記載されている。
特定の実施形態において、この方法の実施から得られるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、７０％以上の純度、及び６０℃以上の安定性（ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）によって測定される）を有する。特定の実施形態において、この方法の実施から得られるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、７０％以上の純度、及び対応する野生型ＩｇＡ ＦｃのＣＨ３ドメインＴｍの１０℃以内の安定性ＣＨ３ドメインＴｍ（安定性）を有する。
本開示によると、ＩｇＡ ＦｃのＣＨ３ドメインに導入されるアミノ酸変異は、ホモ二量体形成と比較してヘテロ二量体形成を促進する。ホモ二量体形成と比較したこのヘテロ二量体形成は、本明細書では「純度」、「特異性」、「ヘテロ二量体純度」または「ヘテロ二量体特異性」と区別なく言及される。このヘテロ二量体純度が、標準的な細胞培養条件下において溶液中で形成されるホモ二量体種と比較した形成される所望のヘテロ二量体のパーセンテージを指すことが理解される。ヘテロ二量体純度は、ヘテロ二量体種の選択的精製の前に評価される。特定の実施形態において、純度は、ホモ二量体／ヘテロ二量体精製に対して選択的ではないＩｇＡアフィニティー精製工程後（例えば、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後）に評価されてもよい。例えば、７０％のヘテロ二量体純度とは、ＩｇＡアフィニティー精製工程後に細胞培養物から単離されたＦｃ二量体の７０％が所望のＦｃヘテロ二量体であることを示す。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約７０％を超える、例えば、約７１％を超える、または約７２％を超える、または約７３％を超える、または約７４％を超える、または約７５％を超える、または約７６％を超える、または約７７％を超える、または約７８％を超える、または約７９％を超える純度を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約８０％を超える、例えば、約８１％を超える、または約８２％を超える、または約８３％を超える、または約８４％を超える、または約８５％を超える、または約８６％を超える、または約８７％を超える、または約８８％を超える、または約８９％を超える純度を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約９０％を超える、例えば、約９１％を超える、または約９２％を超える、または約９３％を超える、または約９４％を超える、または約９５％を超える、または約９６％を超える、または約９７％を超える、または約９８％を超える、または約９９％を超える純度を有する。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約７０％から１００％の間の純度を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約７０％から約９８％の間、または約７０％から約９７％の間、または約７０％から約９６％の間の純度を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約７２％から約９８％の間、または約７４％から約９８％の間、または約７５％から約９８％の間の純度を有する。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃのサンプル中のヘテロ二量体及びホモ二量体の相対量、したがって、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃの純度は、以下に限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、非還元キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）及び液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ－ＭＳ）を含む当該技術分野において既知の様々な技術を使用して求めることができる。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、非還元ＣＥ－ＳＤＳによって求められる場合、約７０％を超える純度を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、ＣＥ－ＳＤＳ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用したハイスループットタンパク質表現アッセイを行うことによって実施される非還元ＣＥ－ＳＤＳによって求められる場合、約７０％を超える純度を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、本明細書の実施例４に記載されるとおりに実施される非還元ＣＥ－ＳＤＳによって求められる場合、約７０％を超える純度を有する。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、ＵＰＬＣ－ＳＥＣによって求められる場合、約７０％を超える純度を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、２５℃でＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａカラムを使用してＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムにおいて実施されるＵＰＬＣ－ＳＥＣによって求められる場合、約７０％を超える純度を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、本明細書の実施例４に記載されるとおりに実施されるＵＰＬＣ－ＳＥＣによって求められる場合、約７０％を超える純度を有する。
本開示によるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、熱安定性である。本明細書で開示されているＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の文脈において、「熱安定性」とは、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物が約６０℃以上のＣＨ３ドメイン融解温度（Ｔｍ）を有するか、または対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの１０℃（±１０℃）以内のＣＨ３ドメインＴｍを有することを意味する。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約６０℃以上のＣＨ３ドメインＴｍを有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約６２℃以上、例えば、約６３℃以上、または約６４℃以上、または約６５℃以上、または約６６℃以上、または約６７℃以上、または約６８℃以上、または約６９℃以上のＣＨ３ドメインＴｍを有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約７０℃以上、例えば、約７１℃以上、または約７２℃以上、または約７３℃以上のＣＨ３ドメインＴｍを有する。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約６０℃から約７４℃の間のＣＨ３ドメインＴｍを有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、約６２℃から約７４℃の間、または約６３℃から約７４℃の間、または約６４℃及び約７４℃、または約６５℃から約７４℃の間のＣＨ３ドメインＴｍを有する。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの１０℃（±１０℃）以内のＣＨ３ドメインＴｍを有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの９℃（±９℃）以内、例えば、対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの８℃（±８℃）以内、または７℃（±７℃）以内、または６℃（±６℃）以内、または５℃（±５℃）以内のＣＨ３ドメインＴｍを有する。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、約６０℃以上のＣＨ３ドメインＴｍを有するか、またはＣＨ３ドメインのあらゆる付加的なジスルフィド結合の非存在下において対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの１０℃（±１０℃）以内のＣＨ３ドメインＴｍを有する。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインと比較してＣＨ３ドメインに１つ以上の付加的なジスルフィド結合を含むが、約６０℃以上のＣＨ３ドメインＴｍを有するか、または１つ以上のジスルフィド結合の非存在下において対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの１０℃（±１０℃）以内のＣＨ３ドメインＴｍを有する。
Ｔｍとして測定される安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）、円偏光二色性分光法（ＣＤ）及び水素交換（ＨＸ）によってなど当該技術分野において既知の技術を使用して求めることができる。特定の実施形態において、Ｔｍは、ＤＳＣによって求められる。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、約６０℃以上のＣＨ３ドメインＴｍを有するか、または対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの１０℃（±１０℃）以内のＣＨ３ドメインＴｍを有し、Ｔｍは、ＤＳＣによって求められる。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、約６０℃以上のＣＨ３ドメインＴｍを有するか、または対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの１０℃（±１０℃）以内のＣＨ３ドメインＴｍを有し、Ｔｍは、ＮａｎｏＤＳＣ（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ、ＵＳＡ）を使用したＤＳＣによって求められる。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、約６０℃以上のＣＨ３ドメインＴｍを有するか、または対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの１０℃（±１０℃）以内のＣＨ３ドメインＴｍを有し、Ｔｍは、本明細書の実施例６に記載されているプロトコールに従うＤＳＣによって求められる。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、
（ｉ）約７０％を超える、例えば、約７１％を超える、または約７２％を超える、または約７３％を超える、または約７４％を超える、または約７５％を超える、または約７６％を超える、または約７７％を超える、または約７８％を超える、または約７９％を超える、または約８０％を超える、または約８１％を超える、または約８２％を超える、または約８３％を超える、または約８４％を超える、または約８５％を超える、または約８６％を超える、または約８７％を超える、または約８８％を超える、または約８９％を超える、または約９０％を超える、または約９１％を超える、または約９２％を超える、または約９３％を超える、または約９４％を超える、または約９５％を超える、または約９６％を超える、または約９７％を超える、または約９８％を超える、または約９９％を超える純度を有し、
（ｉｉ）約６０℃から約７４℃の間、例えば、約６２℃から約７４℃の間、または約６３℃から約７４℃の間、または約６４℃及び約７４℃、または約６５℃から約７４℃の間のＣＨ３ドメインＴｍを有する。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、
（ｉ）約７０％を超える、例えば、約７１％を超える、または約７２％を超える、または約７３％を超える、または約７４％を超える、または約７５％を超える、または約７６％を超える、または約７７％を超える、または約７８％を超える、または約７９％を超える、または約８０％を超える、または約８１％を超える、または約８２％を超える、または約８３％を超える、または約８４％を超える、または約８５％を超える、または約８６％を超える、または約８７％を超える、または約８８％を超える、または約８９％を超える、または約９０％を超える、または約９１％を超える、または約９２％を超える、または約９３％を超える、または約９４％を超える、または約９５％を超える、または約９６％を超える、または約９７％を超える、または約９８％を超える、または約９９％を超える純度を有し、
（ｉｉ）対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの１０℃（±１０℃）以内、例えば、対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインのＴｍの９℃（±９℃）以内、または８℃（±８℃）以内、または７℃（±７℃）以内、または６℃（±６℃）以内、または５℃（±５℃）以内のＣＨ３ドメインＴｍを有する。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、結合標的との結合を排除する１つ以上の変異、もしくは胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合を導入する１つ以上の変異のいずれか、または両方を含む。
改変型ＣＨ３ドメイン
本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、非対称アミノ酸変異を含む改変型ＣＨ３ドメインを含む。具体的には、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、２つのＦｃポリペプチド：１つ以上のアミノ酸変異を含む第１のＣＨ３ドメイン配列を含む第１のＦｃポリペプチドと、１つ以上のアミノ酸変異を含む第２のＣＨ３ドメイン配列を含む第２のＦｃポリペプチドとを含み、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異の少なくとも１つは、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異と異なる。第１及び第２のＣＨ３ドメイン配列は、一緒に改変型ＣＨ３ドメインを形成する。第１及び第２のＣＨ３ドメイン配列に非対称に導入されるアミノ酸変異は、２つのＣＨ３ドメイン配列が二量体化するとき、ホモ二量体Ｆｃよりもむしろヘテロ二量体Ｆｃの形成をもたらす。
上述のとおり、この文脈において「非対称アミノ酸変異」とは、第１のＣＨ３ドメイン配列の特定の位置のアミノ酸が同じ位置の第２のＣＨ３ドメイン配列のアミノ酸とは異なる変異を指す。非対称変異は、各ＣＨ３ドメイン配列の同じそれぞれのアミノ酸位置にある２つのアミノ酸のうちの一方のみの変異、または第１及び第２の各ＣＨ３ドメイン配列の同じそれぞれの位置にある両方のアミノ酸の異なる変異の結果であり得る。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃのＣＨ３ドメイン配列は、１つ、または２つ以上の非対称アミノ酸変異を含む場合がある。
本明細書で開示されている計算戦略を使用することによって、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する所望の特性をもたらすために、ＩｇＡ ＣＨ３ドメインに対する非対称変異のコアセットを特定した。この変異のコアセットを表５に示す。
Figure 2023552220000007
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ａ６０８５Ｙに、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹ、Ａ６０８５ＹＭ、Ａ６０８５ＹＷ及びＡ６０８５ＹＨから選択されるアミノ酸置換、ならびに位置Ｔ６０８６に、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６Ｆ、Ｔ６０８６Ｍ、Ｔ６０８６Ｗ及びＴ６０８６Ｈから選択されるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｗ６０８１に、Ｗ６０８１Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ、Ｗ６０８１Ａ、Ｗ６０８１Ｖ及びＷ６０８１Ｉから選択されるアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、表７に示されるデザインのいずれか１つに関して記載されたアミノ酸変異を含む改変型ＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第１のＣＨ３ドメイン配列の位置Ａ６０８５Ｙのアミノ酸置換は、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹまたはＡ６０８５ＹＷである。いくつかの実施形態において、第１のＣＨ３ドメイン配列の位置Ａ６０８５Ｙのアミノ酸置換は、Ａ６０８５ＹＦまたはＡ６０８５ＹＹである。
いくつかの実施形態において、第１のＣＨ３ドメイン配列の位置Ｔ６０８６のアミノ酸置換は、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６ＦまたはＴ６０８６Ｗである。いくつかの実施形態において、第１のＣＨ３ドメイン配列の位置Ｔ６０８６のアミノ酸置換は、Ｔ６０８６Ｙである。
いくつかの実施形態において、第２のＣＨ３ドメイン配列の位置Ｗ６０８１のアミノ酸置換は、Ｗ６０８１ＴまたはＷ６０８１Ｌである。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｗ６０８１ＴまたはＷ６０８１Ｌを含む。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｗ６０８１Ｔを含む。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の第１のＣＨ３ドメイン配列は、任意に以下の１つ以上をさらに含んでもよい：
（ｉ）位置Ｔ６０２２に、Ｔ６０２２Ｖ、Ｔ６０２２Ｉ、Ｔ６０２２Ｌ及びＴ６０２２Ａから選択されるアミノ酸置換；及び／または
（ｉｉ）位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の第２のＣＨ３ドメイン配列は、任意に以下の１つ以上をさらに含んでもよい：
（ｉ）、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換；及び／または
（ｉｉ）位置Ｌ６０７９に、Ｌ６０７９Ｖ、Ｌ６０７９Ｔ、Ｌ６０７９Ａ及びＬ６０７９Ｉから選択されるアミノ酸置換；及び／または
（ｉｉｉ）位置Ｉ６０８８に、Ｉ６０８８Ｌ、Ｉ６０８８Ａ、Ｉ６０８８Ｖ及びＩ６０８８Ｔから選択されるアミノ酸置換；及び／または
（ｉｖ）位置Ｌ６００７に、Ｌ６００７Ｆ、Ｌ６００７Ｙ、Ｌ６００７Ｍ、Ｌ６００７Ｗ、Ｌ６００７Ｈ及びＬ６００７Ｉから選択されるアミノ酸置換。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ａ６０８５Ｙに、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹ、Ａ６０８５ＹＭ、Ａ６０８５ＹＷ及びＡ６０８５ＹＨから選択されるアミノ酸置換、ならびに位置Ｔ６０８６に、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６Ｆ、Ｔ６０８６Ｍ、Ｔ６０８６Ｗ及びＴ６０８６Ｈから選択されるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｗ６０８１に、Ｗ６０８１Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ、Ｗ６０８１Ａ、Ｗ６０８１Ｖ及びＷ６０８１Ｉから選択されるアミノ酸置換を含み、
（ｉ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｔ６０２２に、Ｔ６０２２Ｖ、Ｔ６０２２Ｉ、Ｔ６０２２Ｌ及びＴ６０２２Ａから選択されるアミノ酸置換をさらに含み；及び／または
（ｉｉ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換をさらに含み；及び／または
（ｉｉｉ）第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換をさらに含み；及び／または
（ｉｖ）第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換をさらに含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換をさらに含み；及び／または
（ｖ）第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｌ６０７９に、Ｌ６０７９Ｖ、Ｌ６０７９Ｔ、Ｌ６０７９Ａ及びＬ６０７９Ｉから選択されるアミノ酸置換をさらに含み；及び／または
（ｖｉ）第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｉ６０８８に、Ｉ６０８８Ｌ、Ｉ６０８８Ａ、Ｉ６０８８Ｖ及びＩ６０８８Ｔから選択されるアミノ酸置換をさらに含み；及び／または
（ｖｉｉ）第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｌ６００７に、Ｌ６００７Ｆ、Ｌ６００７Ｙ、Ｌ６００７Ｍ、Ｌ６００７Ｗ、Ｌ６００７Ｈ及びＬ６００７Ｉから選択されるアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態において、第１のＣＨ３ドメイン配列の位置Ｔ６０２２のアミノ酸変異は、Ｔ６０２２Ｖ、Ｔ６０２２Ｉ及びＴ６０２２Ｌから選択される。
いくつかの実施形態において、第１のＣＨ３ドメイン配列の位置Ｈ６００５のアミノ酸変異は、Ｈ６００５Ｙである。
いくつかの実施形態において、第２のＣＨ３ドメイン配列の位置Ｈ６００５のアミノ酸変異は、Ｈ６００５Ｙである。
いくつかの実施形態において、第２のＣＨ３ドメイン配列の位置Ｌ６０７９のアミノ酸変異は、Ｌ６０７９ＶまたはＬ６０７９Ｔである。
いくつかの実施形態において、第２のＣＨ３ドメイン配列の位置Ｉ６０８８のアミノ酸変異は、Ｉ６０８８Ｌである。
いくつかの実施形態において、第２のＣＨ３ドメイン配列の位置Ｌ６００７のアミノ酸変異は、Ｌ６００７Ｆである。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の改変型ＣＨ３ドメインは、ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を導入するアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の改変型ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメインに１つのジスルフィド結合を導入する２つのシステイン置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の改変型ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメインに２つのジスルフィド結合を導入する４つのシステイン置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、システイン置換は、一方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｈ６００５Ｃを、及び他方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｐ６０１０Ｃを含む。いくつかの実施形態において、システイン置換は、一方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｈ６００５Ｃ及びＰ６０１０Ｃを、ならびに他方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｐ６０１０Ｃ及びＨ６００５Ｃを含む。
したがって、特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、１または２つのいずれかの導入された（すなわち、非天然）ジスルフィド結合を含む改変型ＣＨ３ドメインを含み、
（ｉ）一方のＣＨ３ドメイン配列が変異Ｈ６００５Ｃを含み、他方のＣＨ３ドメイン配列が変異Ｐ６０１０Ｃを含む、または
（ｉｉ）一方のＣＨ３ドメイン配列が変異Ｈ６００５Ｃ及びＰ６０１０Ｃを含み、他方のＣＨ３ドメイン配列が変異Ｐ６０１０Ｃ及びＨ６００５Ｃを含む。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ａ６０８５Ｙに、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹ、Ａ６０８５ＹＭ、Ａ６０８５ＹＷ及びＡ６０８５ＹＨから選択されるアミノ酸置換、ならびに位置Ｔ６０８６に、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６Ｆ、Ｔ６０８６Ｍ、Ｔ６０８６Ｗ及びＴ６０８６Ｈから選択されるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｗ６０８１に、Ｗ６０８１Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ、Ｗ６０８１Ａ、Ｗ６０８１Ｖ及びＷ６０８１Ｉから選択されるアミノ酸置換を含み、
（ｉ）ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の第１のＣＨ３ドメインは、任意に位置Ｔ６０２２に、Ｔ６０２２Ｖ、Ｔ６０２２Ｉ、Ｔ６０２２Ｌ及びＴ６０２２Ａから選択されるアミノ酸置換をさらに含んでもよく、
（ｉｉ）ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の第２のＣＨ３ドメインは、任意に位置Ｌ６０７９に、Ｌ６０７９Ｖ、Ｌ６０７９Ｔ、Ｌ６０７９Ａ及びＬ６０７９Ｉから選択されるアミノ酸置換；及び／または位置Ｉ６０８８に、Ｉ６０８８Ｌ、Ｉ６０８８Ａ、Ｉ６０８８Ｖ及びＩ６０８８Ｔから選択されるアミノ酸置換；及び／または位置Ｌ６００７に、Ｌ６００７Ｆ、Ｌ６００７Ｙ、Ｌ６００７Ｍ、Ｌ６００７Ｗ、Ｌ６００７Ｈ及びＬ６００７Ｉから選択されるアミノ酸置換の１つ以上をさらに含んでもよく、
（ｉｉｉ）改変型ＣＨ３ドメインは、上記のとおり１または２つのいずれかの導入された（すなわち、非天然）ジスルフィド結合を含む。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ａ６０８５Ｙ及びＴ６０８６のアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｗ６０８１のアミノ酸置換及び任意に位置Ｌ６０７９及びＩ６０８８の一方または両方のアミノ酸変異を含み、
位置Ａ６０８５のアミノ酸置換は、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹ、Ａ６０８５ＹＭ、Ａ６０８５ＹＷ及びＡ６０８５ＹＨから選択され；
位置Ｔ６０８６のアミノ酸置換は、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６Ｆ、Ｔ６０８６Ｍ、Ｔ６０８６Ｗ及びＴ６０８６Ｈから選択され；
位置Ｗ６０８１のアミノ酸置換は、Ｗ６０８１Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ、Ｗ６０８１Ａ、Ｗ６０８１Ｖ及びＷ６０８１Ｉ選択され；
位置Ｌ６０７９の任意のアミノ酸置換は、Ｌ６０７９Ｖ、Ｌ６０７９Ｔ、Ｌ６０７９Ａ及びＬ６０７９Ｉから選択され；
位置Ｉ６０８８の任意のアミノ酸置換は、Ｉ６０８８Ｌ、Ｉ６０８８Ａ、Ｉ６０８８Ｖ及びＩ６０８８Ｔから選択される。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、表８に示されるデザインのいずれか１つに関して記載されたアミノ酸変異を含む改変型ＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、表９に示されるデザインのいずれか１つに関して記載されたアミノ酸変異を含む改変型ＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、表１０に示されるデザインのいずれか１つに関して記載されたアミノ酸変異を含む改変型ＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、位置Ａ６０８５Ｙのアミノ酸置換は、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹまたはＡ６０８５ＹＷである。いくつかの実施形態において、位置Ａ６０８５Ｙのアミノ酸置換は、Ａ６０８５ＹＦまたはＡ６０８５ＹＹである。いくつかの実施形態において、位置Ｔ６０８６のアミノ酸置換は、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６ＦまたはＴ６０８６Ｗである。いくつかの実施形態において、位置Ｔ６０８６のアミノ酸置換は、Ｔ６０８６Ｙである。いくつかの実施形態において、位置Ｗ６０８１のアミノ酸置換は、Ｗ６０８１ＴまたはＷ６０８１Ｌである。いくつかの実施形態において、位置Ｌ６０７９の任意のアミノ酸置換は、Ｌ６０７９ＶまたはＬ６０７９Ｔである。いくつかの実施形態において、位置Ｉ６０８８の任意のアミノ酸置換は、Ｉ６０８８Ｌである。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、上記実施形態のいずれか１つに記載されているとおり、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ａ６０８５Ｙ及びＴ６０８６のアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｗ６０８１ならびに任意に位置Ｌ６０７９及びＩ６０８８の一方または両方のアミノ酸置換を含み、第１のＣＨ３ドメイン配列もしくは第２のＣＨ３ドメイン配列のいずれか、または第１及び第２のＣＨ３ドメイン配列の両方は、位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のＣＨ３ドメイン配列もしくは第２のＣＨ３ドメイン配列のいずれか、または第１及び第２のＣＨ３ドメイン配列の両方は、アミノ酸置換Ｈ６００５Ｙをさらに含む。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ａ６０８５Ｙ及びＴ６０８６のアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｗ６０８１のアミノ酸置換及び任意に位置Ｌ６００７、Ｌ６０７９及びＩ６０８８の１つ以上のアミノ酸変異を含み、
位置Ａ６０８５のアミノ酸置換は、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹ、Ａ６０８５ＹＭ、Ａ６０８５ＹＷ及びＡ６０８５ＹＨから選択され；
位置Ｔ６０８６のアミノ酸置換は、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６Ｆ、Ｔ６０８６Ｍ、Ｔ６０８６Ｗ及びＴ６０８６Ｈから選択され；
位置Ｗ６０８１のアミノ酸置換は、Ｗ６０８１Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ、Ｗ６０８１Ａ、Ｗ６０８１Ｖ及びＷ６０８１Ｉ選択され；
位置Ｌ６００７の任意のアミノ酸置換は、Ｌ６００７Ｆ、Ｌ６００７Ｙ、Ｌ６００７Ｍ、Ｌ６００７Ｗ、Ｌ６００７Ｈ及びＬ６００７Ｉから選択され；
位置Ｌ６０７９の任意のアミノ酸置換は、Ｌ６０７９Ｖ、Ｌ６０７９Ｔ、Ｌ６０７９Ａ及びＬ６０７９Ｉから選択され；
位置Ｉ６０８８の任意のアミノ酸置換は、Ｉ６０８８Ｌ、Ｉ６０８８Ａ、Ｉ６０８８Ｖ及びＩ６０８８Ｔから選択される。
いくつかの実施形態において、位置Ａ６０８５Ｙのアミノ酸置換は、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹまたはＡ６０８５ＹＷである。いくつかの実施形態において、位置Ａ６０８５Ｙのアミノ酸置換は、Ａ６０８５ＹＦまたはＡ６０８５ＹＹである。いくつかの実施形態において、位置Ｔ６０８６のアミノ酸置換は、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６ＦまたはＴ６０８６Ｗである。いくつかの実施形態において、位置Ｔ６０８６のアミノ酸置換は、Ｔ６０８６Ｙである。いくつかの実施形態において、位置Ｗ６０８１のアミノ酸置換は、Ｗ６０８１ＴまたはＷ６０８１Ｌである。いくつかの実施形態において、位置Ｌ６００７のアミノ酸置換は、Ｌ６００７Ｆである。いくつかの実施形態において、位置Ｌ６０７９のアミノ酸変異は、Ｌ６０７９ＶまたはＬ６０７９Ｔである。いくつかの実施形態において、位置Ｉ６０８８のアミノ酸変異は、Ｉ６０８８Ｌである。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、上記実施形態のいずれか１つに記載されているとおり、第１のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ａ６０８５Ｙ及びＴ６０８６のアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメイン配列中のアミノ酸変異は、位置Ｗ６０８１ならびに任意に位置Ｌ６００７、Ｌ６０７９及びＩ６０８８の１つ以上のアミノ酸置換を含み、第１のＣＨ３ドメイン配列もしくは第２のＣＨ３ドメイン配列のいずれか、または第１及び第２のＣＨ３ドメイン配列の両方は、位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のＣＨ３ドメイン配列もしくは第２のＣＨ３ドメイン配列のいずれか、または第１及び第２のＣＨ３ドメイン配列の両方は、アミノ酸置換Ｈ６００５Ｙをさらに含む。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、アミノ酸変異は、バリアントｖ３２５１６、ｖ３２５１７、ｖ３２５１８、ｖ３２５２１、ｖ３３３３０、ｖ３３３３１、ｖ３３３３２、ｖ３３３３３、ｖ３３３３４、ｖ３４６８８、ｖ３４６８９またはｖ３４６９０のいずれか１つに関して表６に列挙されているアミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、改変型ＣＨ３ドメインを含み、アミノ酸変異は、バリアントｖ３２５２１、ｖ３３３３３またはｖ３３３３４のいずれか１つに関して表６に列挙されているアミノ酸置換である。
Figure 2023552220000008
特定の実施形態において、本開示のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、配列番号１５及び２０；配列番号１６及び２０；配列番号１７及び２１；配列番号１７及び２３；配列番号２４及び２３；配列番号２５及び２３；配列番号２６及び２３；配列番号１７及び２７；配列番号２８及び２９；配列番号３０及び３１；配列番号３２及び３３；または配列番号３４及び３５に含まれるＣＨ３ドメイン配列に示されるアミノ酸配列を有する改変型ＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡ ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、本明細書の表２及び４に示されるＩｇＡ配列との比較により記載の配列番号内で容易に特定することができる。
改変型ＣＨ２ドメイン
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、１つ以上のアミノ酸変異、例えば、ＣＨ２ドメインの１つ以上の機能を変える変異を含む改変型ＣＨ２ドメインをさらに含む。例示的な変異としては、（ＷＴ ＩｇＡの分泌区画に結合している）位置Ｃ５０９２の変異及び位置Ｎ５１２０のグリコシル化部位の変異が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、改変型ＣＨ２は、位置Ｃ５０９２に変異を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｃ５０９２の変異は、Ｃ５０９２Ｓ、Ｃ５０９２Ａ、Ｃ５０９２Ｔ、Ｃ５０９２Ｎ及びＣ５０９２Ｑから選択されるアミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、位置Ｃ５０９２における変異は、Ｃ５０９２Ｓである。特定の実施形態において、改変型ＣＨ２ドメインは、位置Ｎ５１２０のグリコシル化部位に変異を含み、この変異は、グリコシル化を妨げる。いくつかの実施形態において、位置Ｎ５１２０の変異は、アミノ酸置換Ｎ５１２０Ｔである。
特定の実施形態において、ＨｅｔＦｃ ＩｇＡ構築物は、位置Ｃ５０９２、Ｎ５１２０、Ｉ５１２１及びＴ５１２２の１つ以上に変異を含む改変型ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨｅｔＦｃ ＩｇＡ構築物は、Ｃ５０９２Ｓ、Ｎ５１２０Ｔ、Ｉ５１２１Ｌ及びＴ５１２２Ｓから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む改変型ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨｅｔＦｃ ＩｇＡ構築物は、アミノ酸置換Ｃ５０９２Ｓ、Ｎ５１２０Ｔ、Ｉ５１２１Ｌ及びＴ５１２２Ｓを含む改変型ＣＨ２ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、改変型ＣＨ２ドメインは、第１及び／または第２のＦｃポリペプチド鎖に非対称アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、改変型ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの１つの鎖がＦｃ受容体と選択的に結合するのを可能にする非対称アミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、改変型ＣＨ２ドメインは、Ｆｃα受容体との選択的な結合を促進する非対称アミノ酸変異を含む。
本開示のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物が、改変されたリガンド（例えば、ＦｃαＲＩ）結合特性（結合特性の例としては、結合特異性、平衡解離定数（ＫＤ）、解離及び結合速度（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）、結合親和性及び／またはアビディティーが挙げられるが、これらに限定されない）を有してもよいこと、ならびに特定の改変がＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の最終用途によってはある程度望ましい場合もあることを当業者は理解するであろう。平衡解離定数（ＫＤ）がｋｏｆｆ／ｋｏｎと定義されることは、当該技術分野において周知である。特定の用途に関しては、低いＫＤを有するＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物が高いＫＤを有するＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物よりも好ましい場合もあることは一般に理解されている。ただし、場合によっては、ｋｏｎまたはｋｏｆｆの値の方がＫＤの値よりも関連性がある場合もある。当業者は、どの動態パラメーターが所与のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の用途に対して最も重要であるかを判断することができる。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、Ｆｃα受容体との結合を低減または排除する置換を含む（例えば、Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，１９９６，ＪＥＭ，１８３：１５７９－１５８６；Ｂａｋｅｍａ，２００６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７６：３６０３－３６１０、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１１５／３８／Ｅ８８８２を参照）。Ｆｃα受容体との結合が低減または排除されたＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、例えば、サイトカイン放出症候群の状況などの好中球の活性化が望ましくない状況において有用な場合があり、この場合、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、サイトカインとの結合及びその排除を必要とする対象において、好中球の活性化を回避しながら、サイトカインと結合し、それを排除することができる。１つのみのＦｃαＲＩ結合部位を有するＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、ＦｃαＲＩ結合の結合価に対するＩｇＡ依存的好中球活性化の依存性を調査するのに有用な場合がある。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、ＦｃαＲＩならびに胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と結合することができる分子を単一Ｆｃとして作製するのに有用な場合がある。ＦｃαＲＩ及びＦｃＲｎに対する結合部位は、それぞれＩｇＡ及びＩｇＧの構造的に対応する領域に位置するため（Ｋｅｌｔｏｎ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２１：１６０３－１６０９、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｐｉｉ／Ｓ１０７４５５２１１４００４０９８？ｖｉａ％３Ｄｉｈｕｂ）、それらのＦｃの鎖への導入は相互に排他的であり、ヘテロ二量体Ｆｃが必要とされる。１つの鎖にグラフトされたＦｃＲｎ結合部位を有するＩｇＡ ＨｅｔＦｃは有用であり、それは、ＦｃαＲＩを介して好中球を活性化することができるだけでなく、ＦｃＲｎとの相互作用の導入により増加した半減期を有し、したがって、治療的利益のためにＩｇＡを使用する場合の既知の半減期の制約に対処するためである。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、受容体または精製樹脂または検出分子と一価の様式で結合することができる分子を作り出すのにさらに有用な可能性がある。同様に、これは、他の場合にはＦｃの相互に排他的な領域にあるであろう受容体結合部位、精製または検出部位の組み合わせを用いてＩｇＡ ＨｅｔＦｃベースの分子を作り出すのに有用な可能性がある。そのような例の１つは、以前に示されたＩｇＧ／Ａハイブリッド分子（Ｋｅｌｔｏｎ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２１：１６０３－１６０９、Ｂｏｒｒｏｋ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．，２０１５，ｍＡｂｓ，７：４，７４３－７５１、ＤＯＩ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１５．１０４７５７０）にＦｃの２つの鎖に異なるＦｃγ受容体結合部位を装備させて、固有の生物学的活性を有するＦｃγ受容体結合プロフィールを作り出すことであろう。受容体結合部位としては、ＦｃαＲ、ＦｃＲｎ、Ｆｃγ受容体、Ｃ１ｑ、分泌成分、ＳＳＬ７、連鎖球菌の（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）ＩｇＡ結合タンパク質、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）２型ＩｇＡ１プロテアーゼ、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）２型ＩｇＡ１プロテアーゼが挙げられる。精製及び検出部位としては、プロテインＡ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びＭｙｃタグが挙げられる。例えば、プロテインＡ結合部位の導入は、プロテインＡ結合の欠如のためＷＴ ＩｇＡ Ｆｃに適していないＩｇＧベースの治療薬に対して確立され、広く使用されている技術を使用してＩｇＡ ＨｅｔＦｃベースの分子を精製するために使用することができる。
標的結合ドメイン
本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃは、様々な異なる結合ドメインまたはその他の部分が融合され得るヘテロ二量体骨格として機能する場合もある。特定の実施形態において、本開示は、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃに融合された１つ以上の標的結合ドメインを含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位であるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物に関する。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位に使用するための標的結合ドメインは、目的とする標的と特異的に結合する様々なタンパク質部分を含む。この文脈における「特異的に結合する」とは、結合が所望の標的に対して選択的であり、望ましくないまたは非特異的な相互作用と区別可能であることを意味する。標的と特異的に結合する結合ドメインの能力は、当業者によく知られた様々な技術、例えば、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）機器において分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ， ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｌｙｃｏ Ｊ．， １７：３２３－３２９）または従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，２００２，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ．，２８：２１７－２２９）によって測定することができる。
標的結合ドメインの例としては、受容体、受容体フラグメント（例えば、細胞外部分）、リガンド、サイトカイン及び抗体の抗原結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、抗原結合ドメイン、例えば、受容体または抗体フラグメントである１つ以上の結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、抗原結合抗体フラグメントである１つ以上の標的結合ドメインを含む。そのような抗原結合抗体フラグメントは、ＩｇＡまたは他の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥ由来であってもよい。いくつかの実施形態において、抗原結合抗体フラグメントは、合成、キメラまたはヒト化であってもよい。抗原結合抗体フラグメントとしては、抗体の軽鎖及び／または重鎖の可変または高頻度可変領域（ＶＬ、ＶＨ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨ、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、シングルドメイン重鎖免疫グロブリン及びシングルドメイン軽鎖免疫グロブリンが挙げられるが、これらに限定されない。抗体の抗原結合部位は、一般に抗原に対する結合部位の親和性に様々な程度で寄与する６つのＣＤＲを含む。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）ならびに３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、それらの領域が配列間のばらつき及び／または抗体／抗原複合体からの構造的情報に従って定義されたアミノ酸配列の集計データベースと比較することによって決定される。少数のＣＤＲから構成される（すなわち、結合特異性が３、４または５つのＣＤＲによって決定される）機能的抗原結合部位も本開示の範囲内に含まれる。６つのＣＤＲの完全なセットよりも少なくても、一部の結合標的と結合するのに十分な場合もある。したがって、場合によっては、ＶＨまたはＶＬドメイン単独のＣＤＲでも特異的結合に十分である。さらに、特定の抗体は、抗原に対してＣＤＲが関連しない結合部位を有する場合もある。そのような結合部位は、本明細書において特に意図される。抗原結合抗体フラグメントは、単一の種由来であっても、またはキメラもしくはヒト化であってもよい。
特定の実施形態において、結合ドメインは、抗原結合受容体フラグメント、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＭＨＣ・ペプチド複合体結合フラグメントを含む。本明細書のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物に使用するためのＴＣＲフラグメントは、αβＴＣＲまたはγδＴＣＲヘテロ二量体の抗原結合フラグメントを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本明細書のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、αβＴＣＲフラグメントが同種のＭＨＣ／ペプチドと結合できるよう、少なくともＴＣＲ α鎖可変ドメイン及びＴＣＲ β鎖可変ドメインを含むαβＴＣＲヘテロ二量体の抗原結合フラグメントを含んでもよい。いくつかの実施形態において、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）または可溶性ＴＣＲドメインである（例えば、国際特許公開第ＷＯ１９９９／０１８１２９号及び同第ＷＯ２００９／１１７１１７号を参照）。他のＴＣＲ抗原結合フラグメントが当該技術分野で知られており、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｇａｒｃｉａ，１９９７，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ７：８３９－８４８；ｖａｎ Ｂｏｘｅｌ， ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５０：１４－２１；Ｓｔｏｎｅ， ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５０３：１８９－２２２及びＬｉ， ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：３４９－３５４に示されている。
他の標的結合ドメインとしては、免疫調節性Ｉｇドメイン、非Ｉｇウイルス受容体デコイ、抗体結合及び構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４骨格などの他の操作された骨格に基づく結合ドメインが挙げられる。標的結合ドメインのさらなる例としては、所望の受容体に対するリガンド、受容体のリガンド結合部分、レクチン、及び１つ以上の標的抗原に特異的に結合するペプチドが挙げられる。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、治療用または診断用抗体の抗原結合フラグメントを含む結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位に含まれる標的結合ドメインは、タンパク質、脂質または多糖などの細胞表面分子と特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位に含まれる結合ドメインは、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷した赤血球、動脈プラーク細胞、炎症組織細胞または線維化組織細胞に発現した標的抗原と特異的に結合する。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位に含まれる標的結合ドメインは、免疫応答モジュレーターである。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位に含まれる標的結合ドメインは、サイトカイン受容体と特異的に結合する。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位に含まれる標的結合ドメインは、腫瘍抗原と特異的に結合する。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位に含まれる標的結合ドメインは、免疫チェックポイントタンパク質であるか、またはそれと特異的に結合する。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃのヘテロ二量体の性質の結果として、様々な結合ドメインがＦｃヘテロ二量体の一方または両方の鎖に融合されて、広範囲な機能的多重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を形成することができる。そのような多重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の非限定例を図７に示す。さらに、複数のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を一緒に、例えば、Ｊ鎖による連結によって連結することによってさらに高次のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を形成することができる。多量体ＩｇＡ構造は、一般にＪ鎖及びテールピース・トゥ・テールピース相互作用によって連結されるテイル・トゥ・テイル構成でＩｇＡ二量体を含み、付加的なＩｇＡ単量体は、ジスルフィド結合が関係するテールピース・トゥ・テールピースのみを介して二量体に連結されており、複合体のＪ鎖と直接接触しない（例えば、Ｋｕｍａｒ， ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｚ５８０７を参照）。そのようなＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体の非限定例を図８に示す。
本開示によるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、四重特異性であってもよく、またはさらに多くの多重特異性を有してもよい。多重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、所望の標的分子の異なるエピトープと特異的に結合する場合もあり、または異なる標的分子と特異的に結合する場合もあり、または標的分子ならびに異種エピトープ、例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持材料と結合する場合もある。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、それぞれが異なる結合特異性を有する２つ以上の標的結合ドメインを含む。この点において、結合ドメインは、同じ標的に結合するが、同じ標的上の異なるエピトープと結合してもよく、またはそれぞれが異なる標的と結合してもよい。
特定の実施形態において、ＩｇＡ Ｆｃ結合単位は、一方のＦｃポリペプチド（例えば、鎖Ａ）に融合された標的結合ドメインを含み、他方のＦｃポリペプチド（例えば、鎖Ｂ）に標的結合ドメインを含まないか、または融合された異なる標的結合ドメインを含むか、のいずれかである。したがって、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃの鎖Ａ及び鎖Ｂは、（上記のとおり、ＣＨ３ドメインにヘテロ二量体形成に至らせる変異を有する）Ｆｃ領域が異なり、結合特異性も異なる場合もある。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位という用語は、本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃ（例えば、それぞれが少なくともＩｇＡ ＣＨ３ドメインを含む一組のＩｇＡ Ｆｃポリペプチド）を有するＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を指すために本明細書中で使用され、この場合、少なくとも１つのＩｇＡ Ｆｃポリペプチドが標的結合ドメインに融合される。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の両Ｆｃポリペプチドは、それぞれ独立して標的結合ドメインに融合されている。図７に示されるとおり、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、様々な異なる構成でＨｅｔＦｃに融合された１から４つの標的結合ドメインを含んでもよい。特定の実施形態において、１つ以上の付加的な標的結合ドメインを、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃに融合された標的結合ドメインに融合することによって、付加的な標的結合ドメインがＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位に含まれてもよい。
本開示によるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、単一の種由来であってもよく、またはキメラもしくはヒト化であってもよい。例えば、ＩｇＡ Ｆｃポリペプチドはヒトであってもよく、標的結合ドメインは、別の種、例えば、別の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類など）由来であってもよい。
図７は、標的結合ドメイン（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位）を含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の例示的な構成を示す図である。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃに融合された１、２、３または４つの標的結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、一方のＦｃポリペプチドは標的結合ドメインに融合されているが、他方のＦｃポリペプチドは標的結合ドメインに融合されていない、片腕構成を有する。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、一方のＦｃポリペプチド（例えば、鎖Ａ）のＮ末端に融合された１つの標的結合ドメイン、及び他方のＦｃポリペプチド（例えば、鎖Ｂ）のＮ末端に融合された１つの標的結合ドメインを含む（例えば、図７Ｂ、図７Ｃを参照）。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、一方のＦｃポリペプチド（例えば、鎖Ａ）のＮ末端に融合された１つの標的結合ドメイン、及び他方のＦｃポリペプチド（例えば、鎖Ｂ）のＣ末端に融合された１つの標的結合ドメインを含む（例えば、図７Ｆを参照）。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、一方のＦｃポリペプチド（例えば、鎖Ａ）のＣ末端に融合された１つの標的結合ドメイン、及び他方のＦｃポリペプチド（例えば、鎖Ｂ）のＣ末端に融合された１つの標的結合ドメインを含む（例えば、図７Ｄを参照）。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、一方のＦｃポリペプチドの両端（例えば、鎖ＡのＮ末端及びＣ末端）に融合された標的結合ドメインを含む（例えば、図７Ｅを参照）。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、一方のＦｃポリペプチドの両端（例えば、鎖ＡのＮ末端及びＣ末端）に融合された標的結合ドメイン、及び他方のＦｃポリペプチド（例えば、鎖Ｂ）の一方の末端（Ｎ末端またはＣ末端のいずれか）に融合された標的結合ドメインを含む（例えば、図７Ｇを参照）。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、一方のＦｃポリペプチドの両端（例えば、鎖ＡのＮ末端及びＣ末端）に融合された標的結合ドメイン、及び他方のＦｃポリペプチドの両端（例えば、鎖ＢのＮ末端及びＣ末端）に融合された標的結合ドメインを含む（例えば、図７Ｈを参照）。タンデムに融合された付加的な標的結合単位を含む他の構成も考えられる。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、二重特異性であり、すなわち、それぞれが異なる特異性を有する２つの標的結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、三重特異性であり、すなわち、それぞれが異なる特異性を有する３つの標的結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、四重特異性であり、すなわち、それぞれが異なる特異性を有する４つの標的結合ドメインを含む。さらに多くの特異性は、いくつかの標的結合ドメインをタンデムに含むことによって実現可能であり得る。いくつかの実施形態において、二重特異性、三重特異性または四重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の標的結合ドメインの少なくともいくつかは、同じ標的に結合するが、標的上の異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、二重特異性、三重特異性または四重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の標的結合ドメインの少なくともいくつかは、異なる標的分子に結合する。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の特異性は、必ずしもそれが含む標的結合ドメインの数と相関関係がある訳ではないことに留意すべきであり、例えば、両方の標的結合ドメインが同じ標的と結合する場合、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、２つの標的結合ドメインを含むが、それでも単一特異性であり得る。
特定の実施形態において、本開示は、２つ以上のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、さらに高次のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を提供する。特定の実施形態において、本開示のさらに高次のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は、２、４または５つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体に含まれる少なくとも２つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、Ｊ鎖によってテールピースにより接続される。本明細書で開示されるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体において、Ｊ鎖は完全長未変性Ｊ鎖でもよいが、Ｊ鎖が機能的なままである限り、置換、挿入、欠失、切断などのアミノ酸改変も含むことができ、特に、Ｊ鎖フラグメントを含む。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体に含まれるＪ鎖は、国際公開第ＷＯ２０１５／１５３９１２号に記載されている改変型Ｊ鎖である。特定の実施形態において、Ｊ鎖は、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する。
上述のとおり、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、多量体で多重特異性のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体の集合を可能にする。ＩｇＡ Ｈｅｔ Ｆｃ多量体は、低親和性標的結合ドメインの見かけの親和性を増加させ、クラスター化及び特異性ならびに結合価の増加と関連づけられる関連機能性を増加させることができるアビディティー効果を微調整する可能性を有する。図８は、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体の例示的な構成を示す図である。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は、Ｊ鎖によって連結された２つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む点で「二量体」であり得る。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は単一特異性であっても、もしくは二重特異性（例えば、図８Ａを参照）であっても、またはそれらの組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態において、本開示の二量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は、それぞれの結合単位が同じ結合特異性（ＡＢ、ＡＢ）を有する２つの二重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む。いくつかの実施形態において、本開示の二量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は、２つの結合単位の少なくとも１つが異なる結合特異性（例えば、ＡＢ、ＢＣまたはＡＣ、ＢＣまたはＡＢ、ＣＤ）を有する２つの二重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む。したがって、特定の実施形態において、２つの結合単位のそれぞれが２つの特異性を有し、これは、同じであっても（ＡＢ、ＡＢ）、または異なってもよい（例えば、ＡＢ、ＣＤもしくはＡＢ、ＡＣ）。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は、少なくとも２つがＪ鎖によって連結されている４つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む点で「四量体」であり得る。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、単一特異性であっても、もしくは二重特異性であっても（例えば、図８Ｂを参照）、またはそれらの組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態において、本開示の四量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は、それぞれの結合単位が同じ結合特異性（ＡＢ、ＡＢ、ＡＢ、ＡＢ）を有する４つの二重特異性結合単位を含む。単一特異性または二重特異性のいずれかであり、異なる結合特異性を有するＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む四量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体もいくつかの実施形態では意図される。
いくつかの実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は、少なくとも２つがＪ鎖によって連結されている５つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む点で「五量体」であり得る。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は、単一特異性であっても、もしくは二重特異性であっても（例えば、図８Ｃを参照）、またはそれらの組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態において、本開示の五量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は、それぞれの結合単位が同じ結合特異性（ＡＢ、ＡＢ、ＡＢ、ＡＢ、ＡＢ）を有する５つの二重特異性結合単位を含む。単一特異性または二重特異性のいずれかであり、異なる結合特異性を有するＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む五量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体もいくつかの実施形態では意図される。
「価」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物中の特定の数の結合部位の存在を示す。例えば、「二価」、「四価」、「六価」、「八価」及び「十価」という用語は、それぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位、６つの結合部位、８つの結合部位、及び１０個の結合部位が存在することを示す。したがって、本明細書の図８を参照して、２つの二重特異性結合単位を含む図８Ａに示される二量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は四価であり、図８Ｂに示される四量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は八価であり（すなわち、４つの二重特異性結合単位を含む）、図８Ｃに示される五量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は十価である（すなわち、５つの二重特異性結合単位を含む）。同様に、図７を参照して、図７Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦに示されるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は二価であり、図７Ｇに示されるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は三価であり、図７Ｈに示されるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は四価である。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位及び多量体において、異なる構成要素もしくはドメインは、互いに（すなわち、リンカーなしに）直接融合されてもよく、または１つ以上の構成要素もしくはドメインは、隣接する構成要素またはドメインにペプチドリンカーを介して間接的に融合されてもよい。多成分タンパク質の構成要素を連結するのに適したペプチドリンカーは当該技術分野において周知であり、それぞれが依然として意図される機能を果たすことができるような構成要素の配置を可能にするように選択される。
ペプチドリンカーは、約２から約１５０アミノ酸長の間である。有用なリンカーとしては、グリシン・セリン（ＧｌｙＳｅｒ）リンカーが挙げられ、これは、当該技術分野において周知であり、様々な順序で組み合わされたグリシン及びセリン単位を含む。例としては、ｎが少なくとも１つの整数であり、一般に１から約１０の間、例えば、１から約８の間、１から約６の間、または１から約５の間の整数である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ；ｎが１から５の整数である（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられるが、これらに限定されない。他の有用なリンカーとしては、免疫グロブリンヒンジ配列由来の配列が挙げられる。リンカーは、４つのＩｇＧクラスのいずれか１またはＴＣＲ由来のヒンジ配列の全てまたは一部を含んでもよく、任意に付加的な配列を含んでもよい。例えば、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ配列の一部及びグリシン・セリン配列を含んでもよい。非限定例は、ＩｇＧ１ヒンジの最初のおよそ１５残基に続く上記のものなどの約１０アミノ酸長であるＧｌｙＳｅｒリンカー配列を含むリンカーである。
複合物
本開示の特定の実施形態は、治療用薬剤、診断用薬剤または標識薬剤などの１つ以上の活性剤とコンジュゲートされた本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物（例えば、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位またはＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体）を含む複合物に関する。
治療用薬剤の例としては、代謝拮抗剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生剤、有糸分裂阻害剤、毒素、アポトーシス剤、血栓治療薬、抗血管新生剤、生体応答修飾物質、成長因子、放射性物質及び放射性金属イオンをコンジュゲートさせるのに有用な大環状キレートが挙げられるが、これらに限定されない。診断用薬剤の例としては、蛍光物質、発光物質及び放射性物質などの様々な造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。標識薬剤の例としては、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
選択された活性剤のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物とのコンジュゲーションは、様々な方法で達成可能であり、直接であっても、またはリンカーを介してであってもよい。活性剤のコンジュゲーションのためのリンカーは、１つ以上の活性剤をＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物と連結することができる二官能性または多官能性部分である。二官能性（または一価の）リンカーは、単一の活性剤を構築物上の単一の部位に連結するが、多官能性（または多価の）リンカーは、２つ以上の活性剤を構築物上の単一の部位と連結する。１つの活性剤をＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物上の２つ以上の部位と連結することができるリンカーも、多官能性であると見なされる場合もある。
コンジュゲーションは、例えば、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物上の表面リジン、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物上の酸化炭水化物との還元的カップリング、または鎖間ジスルフィド結合を還元することによって遊離したＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物上のシステイン残基により達成され得る。あるいは、コンジュゲーションは、付加的なシステイン残基を含むためのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の改変（例えば、米国特許第７，５２１，５４１号；同第８，４５５，６２２号及び同第９，０００，１３０号を参照）または反応性ハンドルをもたらす非天然アミノ酸、例えば、セレノメチオニン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、ホルミルグリシンもしくはｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（例えば、Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８：１２０４７－１２０５７；Ａｘｕｐ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＰＮＡＳ，１０９：１６１０１－１６１０６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００９，ＰＮＡＳ，１０６：３０００－３００５；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ．，２５：３５１－３６１を参照）によって達成されて、部位特異的なコンジュゲーションを可能にすることができる。
様々な薬剤を、免疫グロブリンを含むタンパク質とコンジュゲートさせるための方法が当該技術分野において知られている（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇ．Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照）。
ポリヌクレオチド及びＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を作製する方法
本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、標準的な組み換え法を使用して作製することができる。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の組み換え産生は、一般にＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを合成することと、１つ以上のポリヌクレオチドを適切なベクター（複数可）にクローニングすることと、ベクター（複数可）をＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の発現に適した宿主細胞に導入することとを含む。タンパク質の組み換え産生は、当該技術分野において知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８７ ＆ ｕｐｄａｔｅｓ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９０）に記載されている標準的な技術を使用して達成され得る。
したがって、本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする、単離ポリヌクレオチド、または複数のポリヌクレオチドのセットに関する。この文脈において、ポリヌクレオチドは、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の全てまたは一部をコードしてもよい。
「核酸」、「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で区別なく使用され、任意の長さのヌクレオチドの高分子形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成もしくは合成由来、またはそれらの任意の組み合わせのものであってよい。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を「コードする」ポリヌクレオチドは、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビボで（ＤＮＡの場合）転写され、（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドに翻訳される、ポリヌクレオチドである。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コーディング配列の３’側に位置し得る。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、標準的なライゲーション技術を使用して、直接または１つ以上のサブクローニング工程の後のいずれかに、好適な発現ベクター（複数可）に挿入され得る。好適なベクターの例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルスまたはＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、典型的に、採用される特定の宿主細胞で機能するように選択され、すなわち、ベクターは、宿主細胞の機構と適合し、ポリヌクレオチド（複数可）の増幅及び／または発現が可能なものである。この点に関して、適切なベクターと宿主細胞の組み合わせの選択は、当業者の通常の技術範囲である。
したがって、本開示の特定の実施形態は、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター（発現ベクターなど）に関する。ポリヌクレオチド（複数可）は、単一のベクターまたは複数のベクターに含まれてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マルチシストロン性ベクターに含まれる。
典型的に、発現ベクターは、プラスミドの維持ならびに外因性ポリヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための１つ以上の調節エレメントを含有する。そのような調節エレメントの例としては、プロモーター、エンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーが挙げられる。
調節エレメントは、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／または系統由来）、異種（すなわち、宿主細胞の種または系統以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、複数の供給源に由来する調節エレメントの組み合わせ）または合成であり得る。したがって、調節エレメントの供給源は、その隣接配列が、採用される宿主細胞の機構内で機能し、かつ当該機構により活性化され得るのであれば、いずれの原核生物または真核生物のいずれであってもよい。
任意に、ベクターは、「タグ」コーディング配列も含んでもよい。タグコーディング配列は、ポリＨｉｓ（例えば、６×Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、ｍｙｃ、金属親和性、アビジン／ストレプトアビジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはビオチンタグなどの異種ペプチド配列をコードする、コーディング配列の５’または３’末端に位置する核酸配列である。このタグは、典型的に、発現されるポリペプチドに融合された状態を維持し、ポリペプチドのアフィニティー精製または検出の手段として機能することができる。任意に、このタグは、その後、特定の切断用ペプチダーゼを使用するなどの様々な手段によって、精製ポリペプチドから除去することができる。
様々な発現ベクターが民間の供給元から容易に入手可能である。あるいは、所望の全ての調節エレメントを含有する市販のベクターが入手できない場合は、市販のベクターを出発ベクターとして使用して発現ベクターを構築してもよい。所望の調節エレメントのうちの１つ以上が予めベクターに存在していない場合は、それらを個別に得、ベクターにライゲートすることができる。様々な調節エレメントを得るための方法及び供給源が当業者によく知られている。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含む発現ベクター（複数可）の構築後、ベクター（複数可）は、増幅及び／またはタンパク質発現に好適な宿主細胞に挿入され得る。発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストランによるトランスフェクション、及び他の既知の技術を含む、よく知られた方法によって達成され得る。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞の種類に応じて決まる。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，（同前）参照）。
宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、ベクターがコードするポリペプチドを発現し、その後、ポリペプチドは、（宿主細胞がポリペプチドを分泌する場合は）培養培地から回収することができ、または（ポリペプチドが分泌されない場合は）ポリペプチドを産生する宿主細胞から直接回収することができる。宿主細胞は、原核生物（例えば、細菌細胞）または真核生物（例えば、酵母、真菌、植物または哺乳動物細胞）であり得る。適切な宿主細胞の選択は、当業者であれば、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）及び生物活性分子への折り畳み容易性などの様々な因子を考慮して、容易に行うことができる。
したがって、本開示の特定の実施形態は、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含む宿主細胞またはポリヌクレオチド（複数可）を含む１つ以上のベクターに関する。特定の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞である。
例えば、糸状菌または酵母などの真核微生物が宿主細胞として採用されてもよく、これらには、グリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌株及び酵母株が含まれる（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，２００４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２：１４０９－１４１４、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２４：２１０－２１５を参照）。植物細胞もまた宿主細胞として利用することができる（例えば、米国特許第５，９５９，１７７号；同第６，０４０，４９８号；同第６，４２０，５４８号；同第７，１２５，９７８号及び同第６，４１７，４２９号参照（ＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載されている））。
いくつかの実施形態において、真核宿主細胞は、哺乳動物細胞である。様々な哺乳動物細胞株も宿主細胞として使用され得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓株２９３（例えば、Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９に記載されるＨＥＫ２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，１９８０，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８に記載のもの）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６に記載のＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む）、及び骨髄腫細胞（Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０など）が挙げられるが、これらに限定されない。また、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，２００３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，ｐｐ．２５５－２６８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）も参照されたい。
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を作製する方法であって、宿主細胞に、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチドをトランスフェクトする工程と、コードされるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の発現に適した条件下で、宿主細胞を培養する工程とを含む、方法に関する。
典型的に、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、発現後に宿主細胞から単離され、任意に精製されてもよい。発現されたタンパク質を単離及び精製する方法は、当該技術分野において知られている。標準的な精製方法には、例えば、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズ、ゲル濾過または逆相などのクロマトグラフィー技術が含まれ、ＦＰＬＣ、ＭＰＬＣ及びＨＰＬＣなどのシステムを使用して、大気圧または中高圧で実施され得る。他の精製方法には、電気泳動法、免疫学的手法、沈殿法、透析法、及びクロマトフォーカシング技術が含まれる。タンパク質濃縮と組み合わせた限外濾過及びダイアフィルトレーション技術も有用であり得る。
抗体のＦｃ領域と結合する様々な天然タンパク質が当該技術分野において知られており、したがって、これらのタンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質の精製に使用することができる。例えば、細菌プロテインＡ及びＧは、Ｆｃ領域に結合する。精製は、多くの場合、上に記載される特定の融合パートナーまたは親和性タグによって可能となり得る。例えば、抗体は、ＧＳＴ融合が用いられる場合にはグルタチオン樹脂、Ｈｉｓタグが用いられる場合にはＮｉ＋２アフィニティークロマトグラフィー、またはｆｌａｇタグが使用される場合には固定化抗ｆｌａｇ抗体を使用して精製される場合がある。有用な精製技術の例は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９０）、及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄＥｄ．，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９９４）に記載されている。必要な精製度は、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の使用に応じて変動することになる。いくつかの場合では、精製は必要ない場合がある。
特定の実施形態において、本明細書のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、アフィニティークロマトグラフィー、非還元ＣＥ－ＳＤＳによるアフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー精製（プロテインＡ精製カラム、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製）及びサイズ排除クロマトグラフィー、例えば、ＵＰＬＣ－ＳＥＣを含むが、これらに限定されない当該技術分野において既知の１つ以上の精製方法を使用して精製される（実施例１～６も参照）。
翻訳後修飾
特定の実施形態において、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、翻訳後修飾されてもよい。
「翻訳後修飾された」という用語及びその文法的変形、例えば、「翻訳後修飾」は、天然または非天然アミノ酸がポリペプチド鎖中に導入された後にそのようなアミノ酸に生じる、天然または非天然アミノ酸の修飾を指す。本用語は、一例にすぎないが、同時翻訳インビボ修飾、同時翻訳インビトロ修飾（無細胞翻訳系におけるものなど）、翻訳後インビボ修飾及び翻訳後インビトロ修飾を包含する。
翻訳後修飾の特定の例としては、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。他の例としては、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、もしくはＮａＢＨ４による特定の化学的切断；アセチル化；ホルミル化；酸化；還元またはツニカマイシンの存在下における代謝合成を含むが、これらに限定されない既知の技術による化学修飾が挙げられる。
追加の翻訳後修飾としては、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖の化学修飾、及び原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または除去が挙げられる。
特定の実施形態において、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、任意に、検出可能な標識、例えば、酵素、蛍光、同位体または親和性標識などで修飾され、タンパク質の検出及び単離を可能にすることができる。好適な酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としてはルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例としては、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン及びフッ素の放射性同位元素が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、任意に放射性金属イオンと会合する大環状キレートに結合されてもよい。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物が翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスまたは化学修飾技術のいずれかによって修飾された実施形態では、同じ種類の修飾が、任意に所与のポリペプチドのいくつかの部位に同程度または異なる程度で存在してもよい。
特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、固体支持体に結合されてよく、これは本明細書に記載されるタンパク質によって結合されるか、またはそれに結合するか、またはそれと会合するポリペプチドのイムノアッセイまたは精製に特に有用であり得る。そのような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル及びポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の特徴づけ
本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、様々な方法で特徴づけることができる。例えば、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル、ウエスタンブロット、デンシトメトリー、マススペクトロメトリー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または非還元キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）を含むが、これらに限定されない当該技術分野において周知の技術を使用して評価することができる。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の純度は、ＳＥＣまたはＣＥ－ＳＤＳによって評価される。
タンパク質の安定性はまた、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）；ＵＶ、可視もしくはＣＤ分光法；質量分析；示差光散乱（ＤＬＳ）；ベンチトップ安定性アッセイ；他の特徴づけ技術と連結された凍結融解；示差走査熱量測定（ＤＳＣ）；示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）；疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；等電点電気泳動；受容体結合アッセイまたは相対的タンパク質発現レベルを含むが、これらに限定されない数々の当該技術分野の既知の技術を使用して特徴づけることができる。特定の実施形態において、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の安定性は、ＤＳＣまたはＤＳＦなどの当該技術分野において周知の技術を使用し、野生型ＣＨ３ドメインＴｍと比較してＣＨ３ドメイン融解温度（Ｔｍ）を測定することによって評価される。
適切な場合、本開示のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物はまた、リガンド、受容体または標的抗原（例えば、ＦｃαＲＩ、もしくはＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物に含まれる結合ドメインの標的抗原）と特異的に結合する能力に関してアッセイされてもよい。特異的結合及び交差反応性を分析するために、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用した競合及び非競合アッセイシステムを含むが、これらに限定されない当該技術分野において既知の様々なイムノアッセイが利用されてもよい。そのようなアッセイは、当該技術分野において定型化した周知のものである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。
標的リガンド、受容体または抗原と特異的に結合することが確認されたＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物はまた、任意にリガンド、受容体または抗原に対する親和性に関してアッセイされてもよい。結合親和性ならびに相互作用の結合速度及び解離速度などのパラメーターは、例えば、競合的結合アッセイによって求めることができる。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の反応速度パラメーターはまた、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）動態分析などの当該技術分野において既知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを使用して求められてもよい。様々なＳＰＲベースのアッセイが当該技術分野において知られている（例えば、Ｍｕｌｌｅｔ， ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２２：７７－９１；Ｄｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８２：３０３－２３；Ｆｉｖａｓｈ， ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９７－１０１；Ｒｉｃｈ， ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：５４－６１、ならびに米国特許第６，３７３，５７７号；第６，２８９，２８６号；第５，３２２，７９８号；第５，３４１，２１５号及び第６，２６８，１２５号を参照）。当業者に既知の技術を使用した蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）も、細胞表面に発現した分子（例えば、Ｆｃ受容体または細胞表面抗原）とのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の結合を特徴づけるために使用することができる。生体細胞を選別及び調査するためのフローサイトメーターが当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，３４７，９３５号；第５，４６４，５８１号；第５，４８３，４６９号；第５，６０２，０３９号；第５，６４３，７９６号及び第６，２１１，４７７号を参照）。その他の既知のフローサイトメーターは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）製のＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（商標）システム及びＵｎｉｏｎ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）製のＣＯＰＡＳ（商標）システムである。結合親和性及び反応速度論の詳細な説明は、抗体・免疫源相互作用に焦点を当てたＰａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，１９９９，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａにおいて見つけることができる。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の結合特性はまた、１つ以上のＦｃαＲＩの下流機能を判定するためのインビトロ機能アッセイによって特徴づけることができる（例えば、Ｂａｋｅｍａ，２００６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７６：３６０３－３６１０を参照）。
使用の方法
本開示の特定の実施形態は、治療的または診断的方法における本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の使用に関する。例えば、ＩｇＡ構築物は、ＦｃαＲＩを介して好中球と結合する方法、及びＦｃαＲＩを介して好中球を活性化する方法に使用することができる。
１つ以上の結合ドメインを含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物及び治療用薬剤とコンジュゲートされたＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、処置の方法、例えば、がん、自己免疫疾患、免疫性もしくは炎症性障害または感染性疾患を有する対象を処置する方法に使用することができる。同様に、１つ以上の結合ドメインを含むＩｇＡ構築物及び標的薬剤または診断用薬剤とコンジュゲートされたＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、診断の方法、例えば、がん、自己免疫疾患、免疫性もしくは炎症性障害または感染性疾患を有する対象を診断する方法に使用することができる。
処置の方法に使用される場合、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、治療有効量で対象に投与される。「治療有効量」という用語は、本明細書中で使用される場合、列挙した方法の目的を達成するであろう、例えば、処置される疾患または障害の症状の１つ以上をある程度軽減するであろう、投与される本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物または本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を含む組成物の量を指す。問題となっている疾患または障害の処置に有効であろう本明細書に記載の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、インビトロアッセイが、場合により最適な投与量範囲の特定を助けるために用いられてよい。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路、及び疾患または障害の重症度にも依存することになり、実施者の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。
ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物が処置の方法に使用されるいくつかの実施形態では、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、問題となっている疾患または障害の処置に対して当業者に既知の治療有効量の１つ以上の追加の治療用薬剤と組み合わせて投与されてもよい。
処置の望ましい効果には、症状の緩和、疾患もしくは障害の任意の直接的もしくは間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患進行の速度の低下、疾患状態の寛解もしくは緩和、改善された生存、寛解、改善された予後または疾患の再発の遅延のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
医薬組成物
治療的または診断的使用の場合、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物は、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物の形態で提供されてもよい。組成物は、よく知られている容易に入手可能な成分を使用して、既知の手順によって調製され得、例えば、経口（例えば、頬側または舌下を含む）、局所、非経口、直腸もしくは膣経路、または吸入もしくは噴霧によって、対象に投与するために製剤化され得る。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、皮内、関節内、静脈内、筋肉内、血管内、胸骨内または髄腔内の経路による注射または注入を含む。
組成物は、典型的に、選択される経路による対象への投与に好適な形態、例えば、シロップ剤、エリキシル剤、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、ハードもしくはソフトカプセル剤、丸剤、坐剤、油性もしくは水性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、乳剤、注射剤または液剤として製剤化される。組成物は、単位剤形製剤として提供され得る。
薬学的に許容される担体は、一般に、採用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性である。そのような担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルまたはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール及びｍ－クレゾールなどの保存剤；低分子量（約１０アミノ酸未満の）ポリペプチド；血清アルブミンまたはゼラチンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；Ｚｎ－タンパク質複合体などの金属複合体、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、組成物は、無菌注射剤用の水性または油性の溶液または懸濁液の形態であり得る。そのような溶液または懸濁液は、当該技術分野において知られている好適な分散剤もしくは湿潤剤及び／または懸濁化剤を使用して製剤化され得る。無菌注射用の溶液または懸濁液は、経口的に許容される非毒性の希釈剤または溶媒中にＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を含み得る。採用され得る許容される希釈剤及び溶媒には、例えば、１，３－ブタンジオール、水、リンゲル液または等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。加えて、溶媒または懸濁媒体として、無菌不揮発性油が採用されてもよい。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、様々なブランドの不揮発性油が採用され得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製に使用される。当該技術分野において知られている局所麻酔薬、保存剤及び／または緩衝剤などの補助剤も注射用溶液または懸濁液に含まれ得る。
他の医薬組成物及び医薬組成物の調製方法は、当該技術分野において知られており、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（ｆｏｒｍｅｒｌｙ “Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に記載されている。
キット及び製品
本開示の特定の実施形態は、１つ以上の本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を含むキットに関する。別個の容器に包装され、そのような容器に関連づけられるキットの個々の構成要素は、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の表示である得、その表示は製造、使用または販売の機関によって承認されていることを示す。キットは、任意にＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の使用の方法または投与レジメンを概説する説明書または指示書を含む場合もある。
キットの１つ以上の構成要素が溶液、例えば、水溶液、または滅菌水溶液として提供される場合、容器手段は、それ自体が吸入器、シリンジ、ピペット、点眼容器、または他の同様の装置であってよく、その溶液は対象に投与されるか、またはキットの他の構成要素に適用して混合されてよい。
キットの構成要素はまた、乾燥または凍結乾燥形態で提供されてよく、キットは凍結乾燥構成要素の再構成のために好適な溶媒をさらに含有し得る。容器の数または種類に関係なく、本明細書に記載されるキットはまた、患者への組成物の投与を支援するための器具を含んでよい。そのような器具は、吸入器、鼻スプレーデバイス、シリンジ、ピペット、鉗子、測定スプーン、点眼容器または同様の医学的に承認された送達ビヒクルであってよい。
ある特定の実施形態は、本明細書に記載されるような患者の処置に有用な材料を含有する製品に関する。製品は、容器及び容器上に、または容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静注液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、単独で、または患者の処置に効果的な別の組成物と組み合わせてＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を含む組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してよい（例えば、容器は、静注液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであってもよい）。ラベルまたは添付文書は、組成物の使用に好適な状態の処置に組成物が使用されることを示している。製品は、注入用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含んでもよい。製品は、場合により他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでよい。
以下の実施例は、例示のために提供され、本発明の範囲をいかなる形でも限定する意図はない。
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実施例１：リードＩｇＡヘテロ二量体デザインのイン・シリコ選択
この実施例は、ＩｇＡ Ｆｃ二量体をホモ二量体化よりもヘテロ二量体化に至らせる可能性のあるＩｇＡ Ｆｃ Ｃα３（ＣＨ３）変異のイン・シリコ分析及び選択を記載する。
方法
ＩｇＡ ＦｃのＣＨ３：ＣＨ３接合面の広範囲な構造分析では（ＰＤＢ ＩＤ：２ＱＥＪ， Ｒａｍｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４：１５０５１－１５０５６）、接合面の残基を二量体形成へのエネルギー的寄与により特徴づけた。このために、知識ベース及び物理学ベースの可能性に基づく構造の結合性ならびにエネルギー特性の分析のための独自のツールを、静的構造ならびに５０ｎｓ陽的分子動力学軌道に対して使用した。この最初の分析の結果を手がかりに、第１回の「ネガティブデザイン」において、二量体形成を妨害することが予想される変異の導入に対して残基を選択した。これらの変異は、図１に示される２つの主要なデザイン概念に基づいて選択した。ネガティブ静電デザインは同じ電荷の組の導入及び接合面にわたる関連する反発力によるが、ネガティブ立体デザインは、接合面における空洞または立体衝突の導入に基づくものであった。これらのネガティブデザインをモデル化し、独自のイン・シリコツールを使用してエネルギー的に評価した。第２の「ポジティブデザイン」工程では、ヘテロ二量体化を救済する目的で追加の変異を導入した。ヘテロ二量体複合体の安定化は、接合面にわたる反対の電荷による塩橋の導入、または接合面の反対側にある空洞による、大きな側鎖を有する残基の収容のいずれかに基づくものであった。ホモ二量体とヘテロ二量体との間に最大のエネルギー差があるデザインを発現させ、評価するために選択した。
結果
分析指標に基づくリードデザインの変異を表１１に示す。ホモ二量体及びヘテロ二量体リードデザインのモデルに対するイン・シリコ指標の選択されたセットを表１２に示す。エネルギーは野生型に対するものである。負のエネルギーは有利な相互作用を示す、正のエネルギーは不利な相互作用を示す。
特に、ホモ二量体とヘテロ二量体の間に最大のエネルギー差がある立体デザインは、鎖Ａの位置Ａ６０８５Ｙ及びＴ６０８６の大きな疎水性側鎖への変異ならびに反対の鎖ＢにおけるＷ６０８１の小さな残基との交換に集中した。大きな疎水性残基が鎖Ａの位置６０８５Ｙ及び６０８６に導入されると同時に、鎖ＢのＷ６０８１のトレオニンとの交換によって空洞が作り出されたリードデザインの例（立体６）を図９に示す。立体６は、２つの追加の鎖Ｂの変異を含むが、それは鎖Ａの位置６０８５Ｙ及び６０８６に導入された大きな疎水性残基を収容できる空洞を作り出すことに関与するより小さな側鎖を有する残基との位置６０８１のトリプトファンの置換である。これら３つの変異が一緒にヘテロ二量体形成を促進する主な立体デザインをもたらすと考えられる。したがって、これら３つの位置の変異（Ａ：６０８５Ｙ及び６０８６、Ｂ：６０８１）が、ＩｇＡ Ｆｃヘテロ二量体形成を促進する変異の最低限のコアセットを構成すると考えられる。具体的には、変異のコアセットは、より小さな側鎖を有する残基による鎖ＢのＷ６０８１の置換と組み合わせた、より大きな及び／またはより疎水性の側鎖を含む残基による鎖ＡのＡ６０８５Ｙ及びＴ６０８６のそれぞれの置換である。位置６０８５Ｙ及び６０８６の導入に適しているとイン・シリコ分析によって予想されるより大きな及び／またはより疎水性の残基としては、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｗ及びＨが挙げられ、位置６０８１の導入に適しているとイン・シリコ分析によって予想されるより小さな残基としては、Ｔ、Ｌ、Ａ、Ｖ及びＩが挙げられる。
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実施例２：ヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃを使用した片腕抗体（ＯＡＡ）構築物の形成
実施例１に記載されているヘテロ二量体化に至らせることが予想された変異をＩｇＡ Ｆｃを含む片腕抗体構築物に導入し、その機能性を評価した。
方法
ＩｇＡ Ｆｃのヘテロ二量体の対形成に至らせるよう設計された変異を有効性に関して評価するために、その２つの半分の間に顕著な重さの差があるＩｇＡ片腕抗体形式を設計した。抗体の一方の半分は、重鎖においてＩｇＡ Ｆｃに融合されたＩｇＧ１ベースの抗Ｈｅｒ２ Ｆａｂ（重鎖：配列番号３８、軽鎖：配列番号３９、Ｃａｒｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９：４２８５－４２８９）からなるものであった。ＩｇＡ２ヒンジ（配列番号４１）のＮ末端に結合した上部ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号４０）を含むキメラヒンジを、ＩｇＧ１ ＦａｂをＩｇＡ２ Ｆｃと接続するために使用した。ＩｇＡ Ｆｃの配列は、ＩｇＡ２ｍ１アロタイプのＣＨ２及びＣＨ３ドメインのものと類似していた（Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ， ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５２９９－５３０４）。Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７６：４０３－４１７に記載されているとおり、ＷＴ ＩｇＡの分泌区画に結合している位置Ｃ５０９２（表２に示されるＩＭＧＴナンバリング）、及びＮ５１２０グリコシル化部位が変異しており、α－テールピースが除去されて、構築物がＧ６１２９で終わっていた（表４の配列番号４３を参照）。
片腕抗体形式の他方の半分は、ＩｇＡ２ｍ１ ＣＨ２及びＣＨ３と融合したＩｇＡ２ヒンジ（配列番号４１）のみからなり、Ｆａｂを含まない。上記の重鎖にあるのと同じＦｃ変異も含まれた。実施例１のヘテロ二量体の対形成に至らせることが予想され、表１１に列挙されている変異を、片腕抗体構築物のＦｃのＣＨ３ドメインに導入し、表１３に記載されているバリアントを得た。鎖Ａの変異はＶＨ及びＣＨ１（Ｈ１）を含む重鎖に導入し、鎖Ｂの変異はＦｃのみの重鎖に導入した。
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実施例３：ヘテロ二量体ＩｇＡ片腕抗体の作製
実施例１及び２で設計した改変型ＩｇＡ ＯＡＡバリアントの重鎖及び軽鎖の配列を、以下に示されるとおり発現ベクターにクローニングし、発現させ、精製した。
方法
シグナルペプチド（ＥＦＡＴＭＲＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ［配列番号４９］）（Ｂａｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．，２９４：８３５－８４２）ならびに実施例２に記載の重鎖及び軽鎖配列を含むベクターインサートをｐＴＴ５ベクターにライゲートして、重鎖及び軽鎖発現ベクターを作製した。ベクターの配列決定をして、コーディングＤＮＡの正しい読み枠及び配列を確認した。
改変型ＩｇＡ ＯＡＡバリアントの重鎖及び軽鎖ならびにＦｃのみの鎖をＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の２５ｍＬの培養物中で共発現させた。Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞を、１２５ｒｐｍで回転させたオービタルシェーカー上で３７℃、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中、８％ＣＯ２の加湿雰囲気において培養した。７．５×１０７細胞の総細胞数を有する２５ｍＬの体積にＨ１：Ｌ１：Ｈ２に関して３０：４０：３０のトランスフェクション比の合計２５μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションに先立って、ＤＮＡを１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に希釈した。１．４２ｍＬの体積のＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍに、８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を希釈し、５分間のインキュベート後にＤＮＡトランスフェクションミックスと混合して、３ｍＬの総体積にした。１０から２０分後に、ＤＮＡ－ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬混合物を細胞培養物に添加した。３７℃で１８～２２時間インキュベートした後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３Ｅｎｈａｎｃｅｒ１及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３Ｅｎｈａｎｃｅｒ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を各培養物に添加した。細胞を５から７日間インキュベートし、上清をタンパク質精製のために回収した。
澄んだ上清サンプルをＰＢＳで１：１に希釈し、ＡＫＴＡ（商標）Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｖａｎｔａｇｅ Ｌ×２５０カラムに社内で充填した２ｍＬのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に適用した。カラムをＰＢＳで平衡化した。装填後、カラムをＰＢＳで洗浄し、タンパク質を０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で溶出した。溶出サンプルは、１０％（ｖ／ｖ）１Ｍトリス、ｐＨ９を添加することによってｐＨを調節して、６～７の最終ｐＨを得た。実施例４に記載されている非還元ＣＥ－ＳＤＳ及びＵＰＬＣ－ＳＥＣによって、アフィニティークロマトグラフィー後に、バリアントをヘテロ二量体純度に関して評価した。
濃縮後、ホモ二量体Ｆｃ種及びその他の不純物からヘテロ二量体種を分離するために、大量のヘテロ二量体種を含むバリアントの材料をＡＫＴＡ（商標）Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｉｅｓ）に注入し、予めｐＨ７．４のＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムに流した。タンパク質をカラムから０．７５ｍＬ／分の速度で溶出し、０．５ｍＬの画分として回収した。標的タンパク質の＞０．５ｍｇ／ｍＬの濃度及び＞９５％のＣＥ－ＳＤＳ純度を有するピーク画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）２０、３０ｋＤａ ＭＷＣＯポリエーテルスルホン濃縮器（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して濃縮した。Ｓｕｐｏｒ（商標）メンブレンを備えた０．２μｍＰＡＬＬ Ａｃｒｏｄｉｓｃ（商標）シリンジフィルターを通して滅菌濾過した後、タンパク質を、Ａ２８０ｎｍ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）に基づいて定量し、凍結し、さらなる使用まで－８０℃で保存した。
結果
静電デザイン変異を含めても発現が検出可能なバリアントは得られず、これらの変異の破壊的な性質を示す。反対に、全ての立体デザインは、試験条件下で発現を示し、１０個のデザインを精製し、さらに調査した（立体１～４、立体６～１１）。これらのバリアントのいくつかのサンプルは、アフィニティークロマトグラフィー後に極めて純粋なヘテロ二量体種を示したが、大抵、ホモ二量体Ｆｃ種ならびに半分の抗体及び凝集体などのその他の不純物の存在のため高純度のサンプルを得るためには分取ＳＥＣが必要とされた（実施例４を参照）。立体１～３及び立体６～１１デザインならびにＷＴ ＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡに対して分取ＳＥＣを実施した後、収率は、発現培養物の３０～２００ｍｇ／Ｌに及んだ。サンプル純度及び安定性の評価は、実施例４、実施例５及び実施例６に記載されている。
実施例４：アフィニティークロマトグラフィー後のリードデザインのヘテロ二量体純度の評価
ＯＡＡバリアントを、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＡアフィニティー精製後及びＳＥＣ精製前の非還元ＣＥ－ＳＤＳ及びＵＰＬＣ－ＳＥＣによってヘテロ二量体純度及びサンプル均一性に関して評価した。
方法
ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＡアフィニティー精製後、サンプルの純度を、ＣＥ－ＳＤＳ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、非還元及び還元ハイスループットタンパク質発現アッセイによって評価した。手順は、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ユーザーガイドバージョン２に従って、以下の変更を加えて実施した。抗体サンプルを２ｕｌまたは５ｕｌ（濃度範囲５～２０００ｎｇ／ｕｌ）のいずれかで、７ｕｌのＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃７６０３２８）とともに、９６ウェルプレート（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の別個のウェルに添加した。次に、サンプルを９０℃で５分間変性させ、３５μｌの水を各サンプルウェルに添加した。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）装置を、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃７６０４９９）及びＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２００アッセイ設定（１４ｋＤａ～２００ｋＤａ）を使用して稼働させた。
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａカラムを使用して２５℃でＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムでＵＰＬＣ－ＳＥＣを実施した。注入前に、サンプルを１００００ｇで５分間遠心分離し、５μＬをカラムに注入した。サンプルをＰＢＳ、ｐＨ７．４中で１ｍＬ／分の流量で７分間流し、１９０～４００ｎｍでＵＶ吸光度によって溶出を監視した。クロマトグラムを２８０ｎｍで抽出した。ＯｐｅｎＬＡＢ ＣＤＳ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用してピーク積分を実施した。
結果
ＷＴ ＩｇＡ ＯＡＡ（ｖ３２５９５）の非還元ＣＥ－ＳＤＳの分析は、Ｆｃ及びヘテロ二量体ＯＡＡ種とともにホモ二量体フルサイズ抗体（ＦＳＡ）の混合を示した（図２）。ヘテロ二量体種が最も顕著で、存在する各ホモ二量体種はそれより少なかった。これは、ヘテロ二量体形成を促進するいかなる変異も存在しない両Ｆｃ鎖の等モルの発現での種の予想される分布であり（Ｒｉｄｇｗａｙ， ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，９：６１７－６２１）、ＵＰＬＣ－ＳＥＣでも見られた（図３Ａ）。
ヘテロ二量体形成を促進する変異を含むバリアントは、特にＷＴ ＩｇＡ ＯＡＡと比較して非還元ＣＥ－ＳＤＳ（図２）及びＵＰＬＣ－ＳＥＣ（図３）の両方で種の異なる分布を示した。ＦＳＡホモ二量体は図２及び３に示されるいかなる立体デザインでも存在しなかったが、ＯＡＡヘテロ二量体に加えて様々なレベルのＦｃホモ二量体及び半抗体種を見つけることができた。最も注目すべきは、立体３（ｖ３２５１８；図３Ｄ）及び立体６（ｖ３２５２１；図３Ｆ）デザインがＯＡＡヘテロ二量体種の純度の著しい増加を示し、立体６は、ＣＥ－ＳＤＳ及びＵＰＬＣ－ＳＥＣの両方によって＞９５％のヘテロ二量体純度に達した。反対に、立体４（ｖ３２５１９；図３Ｅ）は、ＯＡＡヘテロ二量体もＦＳＡホモ二量体種も含まず、Ｆｃホモ二量体及び対応する半抗体のみを含んでおり、導入される変異が原因の可能性が高い他方の重鎖の発現の問題を指摘する。＜３分の保持時間での小さなピークの存在は、全てのサンプルにおいて少量の高分子量種、例えば、オリゴマー及び凝集体の存在を示していた。
実施例５：サイズ排除クロマトグラフィー後のリードデザインのヘテロ二量体純度の評価
選択されたデザインのＳＥＣ精製後、サンプルを、以下に示される非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳならびにＵＰＬＣ－ＳＥＣによってサンプルの均一性に関して評価した。
方法
非還元ＣＥ－ＳＤＳ及びＵＰＬＣ－ＳＥＣを実施例４に記載のとおりに実施した。還元条件下における電気泳動分析に関しては、３．５μＬのＤＴＴ（１Ｍ）を１００μＬのＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒに添加することによってＣＥ－ＳＤＳプロトコールを変更した。
結果
実施例３に記載のとおりにＳＥＣによって精製したヘテロ二量体ＯＡＡサンプルのＵＰＬＣ－ＳＥＣトレース及びＣＥ－ＳＤＳ電気泳動プロフィール（還元及び非還元）をそれぞれ図４及び図５に示す。ＵＰＬＣ－ＳＥＣの分析は、９０％～１００％のヘテロ二量体ＯＡＡ種を含んだ極めて均一なサンプルを示した。主要種と比較して短い保持時間の小さなピーク及び長い保持時間の肩の存在は、ＷＴ ＩｇＡ（図４Ａ）、立体１（図４Ｂ）及び立体２（図４Ｃ）デザインの少量のホモ二量体の存在を示す。ＳＥＣ精製後、非還元ＣＥ－ＳＤＳは、調査した全バリアントの単一の主な種を示した。全バリアントの３つの完全な鎖と対応する１つのバンドのみが還元ＣＥ－ＳＤＳによって観察された。特に、軽鎖ならびにＦｃのみの重鎖は、類似の分子量（２３．４ｋＤａ及び２３．７ｋＤａ）を有し、還元ＣＥ－ＳＤＳプロフィールでは１つのバンドとして現れた。
実施例６：リードＩｇＡヘテロ二量体デザインの熱安定性
分取ＳＥＣ後のヘテロ二量体ＯＡＡバリアントの精製サンプルを、以下に示される示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって熱安定性に関して評価した。
方法
実施例３に記載のとおりの分取ＳＥＣ後、ヘテロ二量体ＯＡＡデザインのサンプルをＰＢＳに希釈して、０．５～１ｍｇ／ｍｌにした。ＮａｎｏＤＳＣ（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ、ＵＳＡ）を使用したＤＳＣ分析のために、９５０ｕｌのサンプル及び一致する緩衝液（ＰＢＳ）を、それぞれサンプル及び参照の９６ウェルプレートに添加した。ＤＳＣ実行の開始時に、緩衝液（ＰＢＳ）ブランク注入を実施してベースラインを安定化した。次に、各サンプルを注入し、６０ｐｓｉの窒素圧で２５から９５℃まで１℃／分でスキャンした。ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅソフトウェアを使用してサーモグラムを分析した。サンプルのサーモグラムから一致する緩衝液のサーモグラムを差し引いて、ベースラインを、シグモイド曲線を使用してフィッティングした。次に、データを２状態スケールＤＳＣモデルにフィッティングした。
結果
無改変型ＩｇＡ ＣＨ３－ＣＨ３接合面を有するＷＴ ＩｇＡ ＯＡＡ（ｖ３２５９５）のＤＳＣサーモグラムは７４℃及び８１℃で２つの遷移を示した（図６Ａ）。８１℃におけるより顕著な遷移は全調査デザインで存在し、デザインにおいてどちらも変異していないＣＨ２ドメインのアンフォールディングと一部重複するＦａｂのアンフォールディングに起因した。反対に、遷移はデザイン間で変化することが観察され、ＣＨ３ドメインのアンフォールディングに起因した（図６Ａ～Ｂ）。立体２（ｖ３２５１７）の改変型ＣＨ３は、ＷＴと比較して著しく不安定化したが（７４℃に対して５５℃のＴｍ）、最高のヘテロ二量体純度を有するデザインはＷＴに近いＣＨ３安定性を示している。立体３（ｖ３２５１８）及び立体６（ｖ３２５２１）の遷移は、それぞれ６５．９℃及び７１．９℃で観察された。最高の熱安定性を示した２つのデザインは立体１０（ｖ３３３３３）及び立体１１（ｖ３３３３４）であり、それぞれ７２．０℃及び７３．６℃でＣＨ３アンフォールディング遷移が観察された。この高い熱安定性が観察されたが、実施例４のＣＥ－ＳＤＳ及びＵＰＬＣ－ＳＥＣによって評価されたこれら２つのデザインのヘテロ二量体純度は立体３及び立体６のものより低かった。
要約すると、著しくＩｇＡ Ｆｃのヘテロ二量体形成に至らせたＩｇＡ ＣＨ３ドメインの変異の組み合わせを特定した。これらの変異を有するヘテロ二量体バリアントのＣＨ３ドメインの熱安定性は、立体６（ｖ３２５２１）、立体１０（ｖ３３３３３）及び立体１１（ｖ３３３３４）デザインに関してＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３の約２℃以内であった。試験した立体デザインの特性の概要を表１４に示す。
Figure 2023552220000091
実施例７：ＩｇＡ ＨｅｔＦｃデザインのさらなる安定化
接合面にわたる共有結合性ジスルフィド架橋によりリードＩｇＡ ＨｅｔＦｃデザインの熱安定性及びヘテロ二量体純度を高めるために、ＩｇＡ ＦｃのＣＨ３接合面にシステイン変異を導入した。
方法
ＩｇＡ Ｆｃの接合面の残基の組を、ジスルフィド結合の形状を収容するのに十分であるよう決定されたＣα及びＣβ距離に基づいて選択した。次に、選択した残基をシステイン残基で置換し、結果として生じた共有結合性ジスルフィド結合をモデル化した。得られた構造を独自のイン・シリコツールを使用してエネルギー的に評価した。
結果
システイン置換を立体６デザインに導入し、独自のイン・シリコツールによって評価した。選択したデザインに関する例示的な指標を表１５に示す。次いで、立体６のＯＡＡ形式にシングル及びダブルジスルフィドデザインならびにＷＴ ＯＡＡにシングルジスルフィドデザインとしてシステイン置換を導入した（表１６）。
表１６に示されるバリアントを発現させ、ヘテロ二量体純度及び熱安定性に関して評価する。立体６のもの（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＡ精製後にＵＰＬＣ－ＳＥＣ及びＣＥ－ＳＤＳによって評価された＞９０％、実施例６を参照）と比較した場合に、ＵＰＬＣ－ＳＥＣ及びＣＥ－ＳＤＳによって評価される立体６ベースのデザイン（３４６８８～３４６９０）の高いヘテロ二量体純度が保持されていることが予想される一方で、立体６のもの（＞７１℃、実施例６を参照）と比較した場合に、接合面への１または２つの共有結合性ジスルフィド結合の付加のため、ＤＳＣによって測定されるこれらのデザインの熱安定性は著しく高まることが予想される。他の点は変更されていないＷＴ ＩｇＡ Ｆｃ（３４６９１）に非対称様式のシングルジスルフィドデザインとして導入される場合、ＵＰＬＣ－ＳＥＣ及びＣＥ－ＳＤＳによって評価されるヘテロ二量体純度はＷＴ ＩｇＡ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＡ精製後のＵＰＬＣ－ＳＥＣ及びＣＥ－ＳＤＳによって評価された＞５０％、実施例６を参照）と比較して著しく改善されることが予想され、熱安定性はＷＴ（＞７４℃、実施例６を参照）と同じであるかまたはそれを超えることが予想される。
特定されたジスルフィドデザインはまた、実施例１～６で特定された他のリードＨｅｔＦｃデザインと組み合わされ、実施例２～６に記載のとおりにＯＡＡ形式で発現させられ、精製され、ヘテロ二量体純度ならびに熱安定性に関して評価されてもよい。
Figure 2023552220000092
Figure 2023552220000093
実施例８：ＩｇＡ ＨｅｔＦｃに基づく多量体多重特異性形式
実施例１～７に記載されているＩｇＡ Ｆｃのヘテロ二量体の対形成に至らせる変異が多量体多重特異性バリアントを構築するために使用することができ、次いで、それを標的結合及び機能性に関して試験することができる。
方法
Ｃ末端テールピース（配列番号４６または４７）を含むＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１またはＩｇＡ２ｍ２ Ｆｃの２つの鎖は、実施例１～６及び表１１に記載されているとおりＣＨ３ドメインにヘテロ二量体形成に至らせる変異を備え、コアＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格を形成する。１つの標的に対して特異的な結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、免疫調節Ｉｇドメイン、非Ｉｇウイルス受容体デコイ、及び本明細書中の別の場所で記載されているとおり）を、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＧ１／ＩｇＡ２キメラヒンジを介してＩｇＡ ＨｅｔＦｃ鎖の一方のＮ末端側に連結すると同時に、同じヒンジを別の１つの標的に対して特異的な第２の結合ドメインをＩｇＡ ＨｅｔＦｃの他方の鎖のＮ末端側と連結するために使用する。次に、得られた２つの鎖を、哺乳動物発現系において連結鎖（Ｊ鎖）ならびにＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を完成するために必要とされる任意の付加的なポリペプチド鎖（例えば、標的化ドメインとして使用されるＦａｂを完成するための他の鎖）とともに一過性に発現させる。Ｆｃに使用されるＩｇＡアロタイプ及びＩｇＡ Ｆｃ鎖に対するＪ鎖の比に応じて、これは、二量体、四量体または五量体分子の形成をもたらし（Ｌｏｍｂａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１９，ＭＡｂｓ，１１：１１２２－１１３８、Ｋｕｍａｒ， ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６７：１００８－１０１４）、二量体、四量体または五量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体の各ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位は２つの結合ドメインを有する（図８を参照）。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製後、非還元及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥもしくはＣＥ－ＳＤＳ、ＵＰＬＣ－ＳＥＣ、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）または動的光散乱（ＤＬＳ）の１つ以上によって純度及び粒度の均一性に関してサンプルを評価する。必要な場合、サンプルを実施例３に記載のとおりにＳＥＣによってさらに精製し、そのサンプル品質を前に記載されているとおりに評価する。次に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリーまたは標的に特異的な機能アッセイの１つ以上によってサンプルを標的結合に関して試験する。
結果
ＩｇＡ１及びＩｇＡ２ｍ１ ＨｅｔＦｃに基づくＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体バリアントは主に二量体になるが、ＩｇＡ２ｍ２ ＨｅｔＦｃに基づくものはＳＥＣによって分離可能な二量体、四量体及び五量体種を示すことになる。個々の標的との結合研究では、多量体骨格によってもたらされるアビディティーのため一価の結合と比較して見かけの親和性の増加が予想される。見かけの親和性に対するこのアビディティー効果は、結合アッセイにおいて両方の標的が存在する場合、さらに高まることが予想される。ＩｇＧベースで単量体の二重特異性抗体と比較した場合、結合価が増加するＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体（単量体＜二量体＜四量体＜五量体）は順次に向上した親和性を示すはずである。まとめると、このアビディティー効果は、以前に認識された機能研究に反映される結合標的に対する高い特異性及び高い効力につながることが予想される（Ｓｌａｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，１０（４６３）：ｅａａｔ５７７５；国際特許公開第ＷＯ２０１６／１４１３０３号及び同第ＷＯ２０１６／１１８６４１号）。ウイルスまたは細菌病原体を標的とするために使用される場合、高い結合価のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体は、標的（複数可）の凝集及び除去につながることが予想されると同時に、多重特異性は変異回避を制限し、一貫して高いレベルの中和を確実にする。
実施例９：ＦｃαＲＩとの結合を排除する変異を含むヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ
ＩｇＡ Ｆｃを介したＦｃαＲＩ結合の結合価の機能性に対する影響を評価するために、実施例１～７に記載の変異に基づくヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃを使用して、単一のＦｃαＲＩ結合部位を有するＩｇＡ Ｆｃを構築した。
方法
ＩｇＡ Ｆｃ：ＦｃαＲＩ相互作用を妨害することが特定された変異（Ｆ６１１６Ａ、Ｐｏｓｇａｉ， Ｍ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１５：Ｅ８８８２－Ｅ８８９１）を立体６デザインのＯＡＡバリアントの一方または両方のいずれかの重鎖に導入した（表１７）。次に、これらのバリアントならびに野生型立体６ ＯＡＡ（３２５２１）を、実施例３～６に記載のとおりに発現させ、精製した。その他の構築物は、ヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃの２つの鎖に対する様々なＦｃａＲＩ親和性を達成する変異の組み合わせを含んでもよい。可能な組み合わせを表１８に示す。これらのバリアントをＦｃαＲＩとの結合及び好中球活性化に関して評価することができる。２つ、もしくは１つのＦｃαＲＩ結合部位を含むか、またはＦｃαＲＩ結合部位を含まないバリアントの概略図を図１１に示す。
Figure 2023552220000094
Figure 2023552220000095
結果
結合を増加させる、減少させる、または排除することを目的とした改変型ＦｃαＲＩ結合部位を有するバリアントは、ＷＴ ＩｇＡ Ｆｃと比較してＦｃαＲＩに対して様々な親和性及び好中球活性化アッセイにおいて様々な活性を示すことが予想される。両鎖におけるノックアウト変異は結合及び好中球活性化を排除することが予想されるが、両鎖のＦｃαＲＩ結合を増加させることを目的とする変異は、結合及び好中球活性化を増加させ、可能性のある最高の活性になることが予想される。表１８に示される他の全ての組み合わせは、これらの限界の間のレベルで結合及び好中球活性化を示すことが予想される。
実施例１０：ＦｃａＲＩ及びＦｃＲｎ結合部位を含むヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃ
実施例１～７に記載のヘテロ二量体ＩｇＡ Ｆｃの集合に至らせる変異を使用して、ＦｃαＲＩを介して好中球を活性化することならびにＦｃＲｎ結合部位の存在のため増加した半減期を有することが可能なＩｇＡベースのバリアントを構築する。
方法
ＩｇＧ Ｆｃの胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合に重要な残基（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８９：７８１２－７８２４）をヘテロ二量体ＩｇＡバリアントにグラフトして、ＦｃＲｎならびにＦｃαＲＩと結合することができる構築物を作り出す。ＦｃαＲＩ及びＦｃＲｎ結合部位はそれぞれＩｇＡ及びＩｇＧのＣＨ２／ＣＨ３接合面の構造的に対応する場所に位置するため、ヘテロ二量体Ｆｃが必要である（Ｋｅｌｔｏｎ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２１：１６０３－１６０９）。ＦｃＲｎ結合部位のグラフトは、ＩｇＡ及びＩｇＧ Ｆｃのペプチド骨格原子を重ね合わせること及びＩｇＧ：ＦｃＲｎ結合部分に構造的に対応するＩｇＡの残基を特定することによって達成される。次に、これらを、そのＩｇＧの対応するものと交換する。あるいは、ＩｇＧにおけるＦｃＲｎ親和性を改変することがわかっている変異が含まれてもよい（Ｒｏｂｂｉｅ， Ｇ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５７：６１４７－６１５３、Ｙｅｕｎｇ， Ｙ． Ａ． ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８２：７６６３－７６７１、Ｈｉｎｔｏｎ， Ｐ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：３４６－３５６、Ｈｉｎｔｏｎ， Ｐ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３－６２１６、１ Ｄａｌｌ｀Ａｃｑｕａ， Ｗ． Ｆ．， Ｋｉｅｎｅｒ， Ｐ． Ａ． ＆ Ｗｕ， Ｈ．，２００６，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４－２３５２４）。複数のデザインを、独自のイン・シリコツールを使用してエネルギー的に評価する。これらを、発現させ、精製した後、ＦｃαＲＩ及びＦｃＲｎとの結合ならびにインビトロにおける好中球活性化及びインビボにおける半減期に関して評価する。そのようなバリアントの概略図を図１２に示す。
結果
ＦｃαＲＩ及びＦｃＲｎの両方との結合が達成されるバリアントは、好中球ＡＤＣＣアッセイにおいて活性ならびにＦｃＲｎ結合部位のないＩｇＡ Ｆｃと比較した場合にインビボモデルにおいてＦｃＲｎにおける著しく増加した半減期を示すことが予想される。
配列表
本明細書に記載のクローンに関する配列番号の簡単な説明を表Ａに示す。各配列番号に対するアミノ酸配列を表Ｂに示す。
Figure 2023552220000096
Figure 2023552220000097
Figure 2023552220000098
Figure 2023552220000099
Figure 2023552220000100
Figure 2023552220000101
Figure 2023552220000102
Figure 2023552220000103
Figure 2023552220000104
Figure 2023552220000105
Figure 2023552220000106
Figure 2023552220000107
Figure 2023552220000108
本明細書に記載される方法及び組成物は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、細胞株、構築物、及び試薬に限定されず、そのため、変更されてよいと理解されるべきである。本明細書で使用される用語が特定の実施形態のみを記述するために使用されるものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本明細書に記載の方法及び組成物の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
本明細書で参照される全ての特許、特許出願、刊行物及びデータベースエントリーの開示は、そのような個々の特許、特許出願、刊行物及びデータベースエントリーの各々が、参照によって援用されることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、その全体が参照によって本明細書に具体的に援用される。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を作製する方法であって、宿主細胞に、α－テールピースを含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチド及びＪ鎖をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトする工程と、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物及びＪ鎖の発現に適した条件下で、宿主細胞を培養する工程とを含む、方法に関する。
[本発明１００１]
第１のＣＨ３ドメイン配列を含む第１のＦｃポリペプチドと、第２のＣＨ３ドメイン配列を含む第２のＦｃポリペプチドとを含み、前記第１及び前記第２のＣＨ３ドメイン配列が改変型ＣＨ３ドメインを形成する、ＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物であって、
前記第１及び前記第２のＣＨ３ドメイン配列が、ホモ二量体Ｆｃよりもヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するアミノ酸変異を含み、
前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ａ６０８５Ｙに、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹ、Ａ６０８５ＹＭ、Ａ６０８５ＹＷ及びＡ６０８５ＹＨから選択されるアミノ酸置換、ならびに位置Ｔ６０８６に、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６Ｆ、Ｔ６０８６Ｍ、Ｔ６０８６Ｗ及びＴ６０８６Ｈから選択されるアミノ酸置換を含み、
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｗ６０８１に、Ｗ６０８１Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ、Ｗ６０８１Ａ、Ｗ６０８１Ｖ及びＷ６０８１Ｉから選択されるアミノ酸置換を含み、
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、７０％以上の純度で形成され、
アミノ酸位置のナンバリングが、ＩＭＧＴナンバリングに従う、
前記ＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物。
[本発明１００２]
前記改変型ＣＨ３ドメインが、６０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、本発明１００１のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１００３]
前記改変型ＣＨ３ドメインが、対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）±１０℃のＴｍを有する、本発明１００１のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１００４]
位置Ａ６０８５Ｙの前記アミノ酸置換が、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹまたはＡ６０８５ＹＷである、本発明１００１～１００３のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１００５]
位置Ａ６０８５Ｙの前記アミノ酸置換が、Ａ６０８５ＹＦまたはＡ６０８５ＹＹである、本発明１００１～１００３のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１００６]
位置Ｔ６０８６の前記アミノ酸置換が、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６ＦまたはＴ６０８６Ｗである、本発明１００１～１００５のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１００７]
位置Ｔ６０８６の前記アミノ酸置換が、Ｔ６０８６Ｙである、本発明１００１～１００５のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１００８]
位置Ｗ６０８１の前記アミノ酸置換が、Ｗ６０８１ＴまたはＷ６０８１Ｌである、本発明１００１～１００７のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１００９]
前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、前記アミノ酸置換Ａ６０８５ＹＦ、及びＴ６０８６Ｗを含み、
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、前記アミノ酸置換Ｗ６０８１ＴまたはＷ６０８１Ｌを含む、
本発明１００１～１００３のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０１０]
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、前記アミノ酸置換Ｗ６０８１Ｔを含む、本発明１００９のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０１１]
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｌ６０７９に、Ｌ６０７９Ｖ、Ｌ６０７９Ｔ、Ｌ６０７９Ａ及びＬ６０７９Ｉから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、本発明１００１～１０１０のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０１２]
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｌ６０７９に、Ｌ６０７９Ｖ及びＬ６０７９Ｔから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、本発明１００１～１０１０のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０１３]
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｉ６０８８に、Ｉ６０８８Ｌ、Ｉ６０８８Ａ、Ｌ６０８８Ｖ及びＬ６０８８Ｔから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、本発明１００１～１０１２のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０１４]
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換Ｉ６０８８Ｌをさらに含む、本発明１００１～１０１２のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０１５]
前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｔ６０２２に、Ｔ６０２２Ｖ、Ｔ６０２２Ｉ、Ｔ６０２２Ｌ及びＴ６０２２Ａから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、本発明１００１～１０１４のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０１６]
前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｔ６０２２に、Ｔ６０２２Ｖ、Ｔ６０２２Ｉ及びＴ６０２２Ｌから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、本発明１００１～１０１４のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０１７]
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｌ６００７に、Ｌ６００７Ｆ、Ｌ６００７Ｙ、Ｌ６００７Ｍ、Ｌ６００７Ｗ、Ｌ６００７Ｈ及びＬ６００７Ｉから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、本発明１００１～１０１６のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０１８]
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換Ｌ６００７Ｆをさらに含む、本発明１００１～１０１６のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０１９]
前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、本発明１００１～１０１８のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０２０]
前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換Ｈ６００５Ｙをさらに含む、本発明１００１～１０１８のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０２１]
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、本発明１００１～１０２０のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０２２]
前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、前記アミノ酸置換Ｈ６００５Ｙをさらに含む、本発明１００１～１０２０のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０２３]
前記改変型ＣＨ３ドメインが、ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を導入するアミノ酸置換をさらに含む、本発明１００１～１０１０のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０２４]
前記改変型ＣＨ３ドメインが、前記改変型ＣＨ３ドメインに１つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基を導入する２つのアミノ酸置換、または前記改変型ＣＨ３ドメインに２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基を導入する４つのアミノ酸置換を含む、本発明１０２３のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０２５]
システイン残基を導入する前記アミノ酸置換が、一方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｈ６００５Ｃを、及び他方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｐ６０１０Ｃを含む、本発明１０２３のＩｇＡ Ｈｅｔ Ｆｃ構築物。
[本発明１０２６]
システイン残基を導入する前記アミノ酸置換が、一方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｈ６００５Ｃ及びＰ６０１０Ｃを、ならびに他方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｐ６０１０Ｃ及びＨ６００５Ｃを含む、本発明１０２３のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０２７]
第１のＣＨ３ドメイン配列を含む第１のＦｃポリペプチドと、第２のＣＨ３ドメイン配列を含む第２のＦｃポリペプチドとを含み、前記第１及び前記第２のＣＨ３ドメイン配列が改変型ＣＨ３ドメインを形成する、ＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物であって、
前記第１及び前記第２のＣＨ３ドメイン配列が、ホモ二量体Ｆｃよりもヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するアミノ酸変異を含み、
（ａ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＹ及びＴ６０８６Ｌを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｂ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＹ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｃ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｌ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｄ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｅ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｔ６０２２Ｖ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｆ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｔ６０２２Ｌ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｇ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｔ６０２２Ｉ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｈ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６００７Ｆ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｉ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｙ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｙ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｊ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｐ６０１０Ｃ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｋ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｐ６０１０Ｃ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
（ｌ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ｐ６０１０Ｃ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ｐ６０１０Ｃ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含み、
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、７０％以上の純度で形成され、
アミノ酸位置のナンバリングが、ＩＭＧＴナンバリングに従う、
前記ＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物。
[本発明１０２８]
前記改変型ＣＨ３ドメインが、６０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、本発明１０２７のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０２９]
前記改変型ＣＨ３ドメインが、対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）±１０℃のＴｍを有する、本発明１０２７のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０３０]
１つ以上の標的結合ドメインをさらに含む、本発明１００１～１０２９のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０３１]
前記１つ以上の標的結合ドメインが、抗原結合抗体フラグメントである、本発明１０３０のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０３２]
前記１つ以上の抗原結合抗体フラグメントのそれぞれが、Ｆａｂ及びｓｃＦｖから独立して選択される、本発明１０３１のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０３３]
前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物が、２つの標的結合ドメインを含み、二重特異性である、本発明１０３０～１０３２のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０３４]
改変型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインが、α－テールピースを含む、本発明１００１～１０３３のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０３５]
改変型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインが、α－テールピースを欠いている、本発明１００１～１０３３のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０３６]
本発明１００１～１０３５のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物と、１つ以上の治療用薬剤、診断用薬剤または標識薬剤とを含む、複合物。
[本発明１０３７]
本発明１００１～１０３４のいずれかの２つ以上のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物及びＪ鎖を含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体であって、
前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のうちの２つが、前記Ｊ鎖によって連結されている、
前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体。
[本発明１０３８]
本発明１００１～１０３５のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
[本発明１０３９]
本発明１０３６の複合物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
[本発明１０４０]
本発明１０３７のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
[本発明１０４１]
本発明１００１～１０３５のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする、単離ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（複数）のセット。
[本発明１０４２]
本発明１００１～１０３５のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクターセットまたはベクター（複数）のセット。
[本発明１０４３]
本発明１００１～１０３５のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
[本発明１０４４]
本発明１００１～１０３５のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を作製する方法であって、
宿主細胞に、前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチドをトランスフェクトする工程と、
前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の発現に適した条件下で、前記宿主細胞を培養する工程と
を含む、前記方法。
[本発明１０４５]
本発明１０３７のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を作製する方法であって、
宿主細胞に、本発明１０３４のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチド及びＪ鎖をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトする工程と、
前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物及び前記Ｊ鎖の発現に適した条件下で、前記宿主細胞を培養する工程と
を含む、前記方法。
[本発明１０４６]
前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃが、結合標的との結合を排除する１つ以上の変異を含む、本発明１００１～１０３５のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
[本発明１０４７]
前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃが、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合を導入する１つ以上の変異を含む、本発明１００１～１０３５のいずれかのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
ＩｇＡ Ｆｃのヘテロ二量体化に至らせる変異に関するネガティブ及びポジティブデザイン概念を示す図を示す。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ片腕抗体（ＯＡＡ）構築物の非還元ＣＥ－ＳＤＳプロフィールを示す。ＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３（バリアント番号３２５９５）または立体デザイン１、２、３、４もしくは６（それぞれバリアント番号３２５１６、３２５１７、３２５１８、３２５１９及び３２５２１）を含むＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ片腕抗体（ＯＡＡ）構築物の非還元ＣＥ－ＳＤＳプロフィールを示す。立体デザイン７、８、９、１０または１１（それぞれバリアント番号３３３３０、３３３３１、３３３３２、３３３３３及び３３３３４）を含むＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。ＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３（バリアント番号３２５９５）を含むＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１（バリアント番号３２５１６）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン２（バリアント番号３２５１７）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン３（バリアント番号３２５１８）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン４（バリアント番号３２５１９）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン６（バリアント番号３２５２１）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン７（バリアント番号３３３３０）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン８（バリアント番号３３３３１）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン９（バリアント番号３３３３２）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１０（バリアント番号３３３３３）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＡアフィニティー精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１１（バリアント番号３３３３４）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。ＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３（バリアント番号３２５９５）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１（バリアント番号３２５１６）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン２（バリアント番号３２５１７）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン３（バリアント番号３２５１８）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン６（バリアント番号３２５２１）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン７（バリアント番号３３３３０）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン８（バリアント番号３３３３１）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン９（バリアント番号３３３３２）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１０（バリアント番号３３３３３）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示す。立体デザイン１１（バリアント番号３３３３４）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物の非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロフィールを示す。ＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３（バリアント３２５９５）または立体デザイン１、２、３もしくは６（それぞれバリアント番号３２５１６、３２５１７、３２５１８及び３２５２１）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物の非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロフィールを示す。立体デザイン７、８、９、１０または１１（それぞれバリアント番号３３３３０、３３３３１、３３３３２、３３３３３及び３３３３４）を含むＩｇＡ ＯＡＡ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物に対するＤＳＣサーモグラムのオーバーレイを示す。ＷＴ ＩｇＡ ＣＨ３（バリアント番号３２５９５）または立体デザイン１、２、３もしくは６（それぞれバリアント番号３２５１６、３２５１７、３２５１８及び３２５２１）を含むＩｇＡ Ｆｃ構築物。 分取ＳＥＣによる精製後のＩｇＡ Ｆｃ ＯＡＡ構築物に対するＤＳＣサーモグラムのオーバーレイを示す。立体デザイン７～１１（バリアント番号３３３３０～３３３３４）を含むＩｇＡ Ｆｃ構築物。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。結合ドメインが融合されて、ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を形成するＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。２つの例示的な結合ドメインが結合したＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格を示す実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位の構成要素及び構成の例を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ骨格に様々な構成で融合された１から４つの結合ドメインを有する実例となるＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位。結合ドメインは説明のためにＦａｂと示されているが、様々な他の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及び結合ドメインの組み合わせであってもよい。説明のために形式を示すが、決してこの開示に限定するものではない。 Ｊ鎖（網点）によって連結された２つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、実例となるさらに高次のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃの２つの鎖を灰色及び縞模様で示す。各構造の中心にテールピース集合体が示される。それぞれの集合体に関して単一の配向が示されているが、多くの配向が可能である。Ｊ鎖及びＦｃ：Ｆｃ相互作用は、鎖Ａまたは鎖Ｂに対して選択的ではないため、各結合単位の結合ドメインの配向は逆も可能である。Ｊ鎖によって連結された２つの二重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、二量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体。 Ｊ鎖（網点）によって連結された４つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、実例となるさらに高次のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃの２つの鎖を灰色及び縞模様で示す。各構造の中心にテールピース集合体を示す。各集合体に関して単一の配向が示されるが、多くの配向が可能である。Ｊ鎖及びＦｃ：Ｆｃ相互作用は、鎖Ａまたは鎖Ｂに対して選択的ではないため、各結合単位の結合ドメインの配向は逆も可能である。Ｊ鎖によって連結された４つの二重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、四量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体。 Ｊ鎖（網点）によって連結された５つのＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、実例となるさらに高次のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を示す。ＩｇＡ ＨｅｔＦｃの２つの鎖を灰色及び縞模様で示す。各構造の中心にテールピース集合体を示す。各集合体に関して単一の配向が示されるが、多くの配向が可能である。Ｊ鎖及びＦｃ：Ｆｃ相互作用は、鎖Ａまたは鎖Ｂに対して選択的ではないため、各結合単位の結合ドメインの配向は逆も可能である。Ｊ鎖によって連結された５つの二重特異性ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ結合単位を含む、五量体ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体。 鎖Ａ及び鎖Ｂを表示したＩｇＡ ＨｅｔＦｃデザイン（立体６）の構造的表現を示す。タンパク質骨格はカートゥーン表示で示され、側鎖は線表示として示されている。非極性水素は示していない。完全なＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃを示す。 鎖Ａ及び鎖Ｂを表示したＩｇＡ ＨｅｔＦｃデザイン（立体６）の構造的表現を示す。タンパク質骨格はカートゥーン表示で示され、側鎖は線表示として示されている。非極性水素は示していない。コア位置Ａ６０８５、Ｔ６０８６（両方とも鎖Ａ）及びＷ６０８１（鎖Ｂ）周辺を中心とした変異残基の拡大図を示す。 ＩｇＡ１（配列番号５９）、ＩｇＡ２ｍ１（配列番号６０）及びＩｇＡ２ｍ２（配列番号６１） Ｆｃ領域に関するアミノ酸配列のアラインメントを示す。 Ｆｃの一方または両方の鎖におけるＦｃαＲの結合を排除する変異を有するＩｇＡ ＨｅｔＦｃに基づくＩｇＡ ＯＡＡバリアントを示す。 ＦｃαＲ及びＦｃＲｎの両方との結合が可能なＩｇＡ ＨｅｔＦｃに基づく改変型ＩｇＡ ｍＡｂを示す
ペプチドリンカーは、約２から約１５０アミノ酸長の間である。有用なリンカーとしては、グリシン・セリン（ＧｌｙＳｅｒ）リンカーが挙げられ、これは、当該技術分野において周知であり、様々な順序で組み合わされたグリシン及びセリン単位を含む。例としては、ｎが少なくとも１つの整数であり、一般に１から約１０の間、例えば、１から約８の間、１から約６の間、または１から約５の間の整数である、（ＧＳ）ｎ （配列番号５０）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ （配列番号５１）、（ＧＧＧＳ）ｎ （配列番号５２）及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ （配列番号５３）；ｎが１から５の整数である（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１ （配列番号５４）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ （配列番号５５）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ （配列番号５６）、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ （配列番号５７）が挙げられるが、これらに限定されない。他の有用なリンカーとしては、免疫グロブリンヒンジ配列由来の配列が挙げられる。リンカーは、４つのＩｇＧクラスのいずれか１またはＴＣＲ由来のヒンジ配列の全てまたは一部を含んでもよく、任意に付加的な配列を含んでもよい。例えば、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ配列の一部及びグリシン・セリン配列を含んでもよい。非限定例は、ＩｇＧ１ヒンジの最初のおよそ１５残基に続く上記のものなどの約１０アミノ酸長であるＧｌｙＳｅｒリンカー配列を含むリンカーである。
任意に、ベクターは、「タグ」コーディング配列も含んでもよい。タグコーディング配列は、ポリＨｉｓ（例えば、６×Ｈｉｓ（配列番号５８））、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、ｍｙｃ、金属親和性、アビジン／ストレプトアビジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはビオチンタグなどの異種ペプチド配列をコードする、コーディング配列の５’または３’末端に位置する核酸配列である。このタグは、典型的に、発現されるポリペプチドに融合された状態を維持し、ポリペプチドのアフィニティー精製または検出の手段として機能することができる。任意に、このタグは、その後、特定の切断用ペプチダーゼを使用するなどの様々な手段によって、精製ポリペプチドから除去することができる。

Claims (47)

  1. 第１のＣＨ３ドメイン配列を含む第１のＦｃポリペプチドと、第２のＣＨ３ドメイン配列を含む第２のＦｃポリペプチドとを含み、前記第１及び前記第２のＣＨ３ドメイン配列が改変型ＣＨ３ドメインを形成する、ＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物であって、
    前記第１及び前記第２のＣＨ３ドメイン配列が、ホモ二量体Ｆｃよりもヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するアミノ酸変異を含み、
    前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ａ６０８５Ｙに、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹ、Ａ６０８５ＹＭ、Ａ６０８５ＹＷ及びＡ６０８５ＹＨから選択されるアミノ酸置換、ならびに位置Ｔ６０８６に、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６Ｆ、Ｔ６０８６Ｍ、Ｔ６０８６Ｗ及びＴ６０８６Ｈから選択されるアミノ酸置換を含み、
    前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｗ６０８１に、Ｗ６０８１Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ、Ｗ６０８１Ａ、Ｗ６０８１Ｖ及びＷ６０８１Ｉから選択されるアミノ酸置換を含み、
    前記ヘテロ二量体Ｆｃが、７０％以上の純度で形成され、
    アミノ酸位置のナンバリングが、ＩＭＧＴナンバリングに従う、
    前記ＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物。
  2. 前記改変型ＣＨ３ドメインが、６０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  3. 前記改変型ＣＨ３ドメインが、対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）±１０℃のＴｍを有する、請求項１に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  4. 位置Ａ６０８５Ｙの前記アミノ酸置換が、Ａ６０８５ＹＦ、Ａ６０８５ＹＹまたはＡ６０８５ＹＷである、請求項１～３のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  5. 位置Ａ６０８５Ｙの前記アミノ酸置換が、Ａ６０８５ＹＦまたはＡ６０８５ＹＹである、請求項１～３のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  6. 位置Ｔ６０８６の前記アミノ酸置換が、Ｔ６０８６Ｙ、Ｔ６０８６ＦまたはＴ６０８６Ｗである、請求項１～５のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  7. 位置Ｔ６０８６の前記アミノ酸置換が、Ｔ６０８６Ｙである、請求項１～５のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  8. 位置Ｗ６０８１の前記アミノ酸置換が、Ｗ６０８１ＴまたはＷ６０８１Ｌである、請求項１～７のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  9. 前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、前記アミノ酸置換Ａ６０８５ＹＦ、及びＴ６０８６Ｗを含み、
    前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、前記アミノ酸置換Ｗ６０８１ＴまたはＷ６０８１Ｌを含む、
    請求項１～３のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  10. 前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、前記アミノ酸置換Ｗ６０８１Ｔを含む、請求項９に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  11. 前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｌ６０７９に、Ｌ６０７９Ｖ、Ｌ６０７９Ｔ、Ｌ６０７９Ａ及びＬ６０７９Ｉから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  12. 前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｌ６０７９に、Ｌ６０７９Ｖ及びＬ６０７９Ｔから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  13. 前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｉ６０８８に、Ｉ６０８８Ｌ、Ｉ６０８８Ａ、Ｌ６０８８Ｖ及びＬ６０８８Ｔから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  14. 前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換Ｉ６０８８Ｌをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  15. 前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｔ６０２２に、Ｔ６０２２Ｖ、Ｔ６０２２Ｉ、Ｔ６０２２Ｌ及びＴ６０２２Ａから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  16. 前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｔ６０２２に、Ｔ６０２２Ｖ、Ｔ６０２２Ｉ及びＴ６０２２Ｌから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  17. 前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｌ６００７に、Ｌ６００７Ｆ、Ｌ６００７Ｙ、Ｌ６００７Ｍ、Ｌ６００７Ｗ、Ｌ６００７Ｈ及びＬ６００７Ｉから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  18. 前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換Ｌ６００７Ｆをさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  19. 前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  20. 前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換Ｈ６００５Ｙをさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  21. 前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、位置Ｈ６００５に、Ｈ６００５Ｙ、Ｈ６００５Ｆ、Ｈ６００５Ｍ及びＨ６００５Ｗから選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  22. 前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、前記アミノ酸置換Ｈ６００５Ｙをさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  23. 前記改変型ＣＨ３ドメインが、ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を導入するアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  24. 前記改変型ＣＨ３ドメインが、前記改変型ＣＨ３ドメインに１つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基を導入する２つのアミノ酸置換、または前記改変型ＣＨ３ドメインに２つのジスルフィド結合を形成するシステイン残基を導入する４つのアミノ酸置換を含む、請求項２３に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  25. システイン残基を導入する前記アミノ酸置換が、一方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｈ６００５Ｃを、及び他方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｐ６０１０Ｃを含む、請求項２３に記載のＩｇＡ Ｈｅｔ Ｆｃ構築物。
  26. システイン残基を導入する前記アミノ酸置換が、一方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｈ６００５Ｃ及びＰ６０１０Ｃを、ならびに他方のＣＨ３ドメイン配列に変異Ｐ６０１０Ｃ及びＨ６００５Ｃを含む、請求項２３に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  27. 第１のＣＨ３ドメイン配列を含む第１のＦｃポリペプチドと、第２のＣＨ３ドメイン配列を含む第２のＦｃポリペプチドとを含み、前記第１及び前記第２のＣＨ３ドメイン配列が改変型ＣＨ３ドメインを形成する、ＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物であって、
    前記第１及び前記第２のＣＨ３ドメイン配列が、ホモ二量体Ｆｃよりもヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するアミノ酸変異を含み、
    （ａ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＹ及びＴ６０８６Ｌを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｂ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＹ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｔ、Ｗ６０８１Ｌ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｃ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｌ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｄ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｅ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｔ６０２２Ｖ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｆ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｔ６０２２Ｌ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｇ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｔ６０２２Ｉ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｈ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｌ６００７Ｆ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｉ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｙ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｙ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｊ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｐ６０１０Ｃ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｋ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｐ６０１０Ｃ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含む、または
    （ｌ）前記第１のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ｐ６０１０Ｃ、Ａ６０８５ＹＦ及びＴ６０８６Ｙを含み、ならびに前記第２のＣＨ３ドメイン配列中の前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換：Ｈ６００５Ｃ、Ｐ６０１０Ｃ、Ｌ６０７９Ｖ、Ｗ６０８１Ｔ及びＩ６０８８Ｌを含み、
    前記ヘテロ二量体Ｆｃが、７０％以上の純度で形成され、
    アミノ酸位置のナンバリングが、ＩＭＧＴナンバリングに従う、
    前記ＩｇＡヘテロ二量体Ｆｃ（ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ）構築物。
  28. 前記改変型ＣＨ３ドメインが、６０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項２７に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  29. 前記改変型ＣＨ３ドメインが、対応する野生型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）±１０℃のＴｍを有する、請求項２７に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  30. １つ以上の標的結合ドメインをさらに含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  31. 前記１つ以上の標的結合ドメインが、抗原結合抗体フラグメントである、請求項３０に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  32. 前記１つ以上の抗原結合抗体フラグメントのそれぞれが、Ｆａｂ及びｓｃＦｖから独立して選択される、請求項３１に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  33. 前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物が、２つの標的結合ドメインを含み、二重特異性である、請求項３０～３２のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  34. 改変型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインが、α－テールピースを含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  35. 改変型ＩｇＡ ＣＨ３ドメインが、α－テールピースを欠いている、請求項１～３３のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  36. 請求項１～３５のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物と、１つ以上の治療用薬剤、診断用薬剤または標識薬剤とを含む、複合物。
  37. 請求項１～３４のいずれか１項に記載の２つ以上のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物及びＪ鎖を含むＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体であって、
    前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物のうちの２つが、前記Ｊ鎖によって連結されている、
    前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体。
  38. 請求項１～３５のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
  39. 請求項３６に記載の複合物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
  40. 請求項３７に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
  41. 請求項１～３５のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする、単離ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（複数）のセット。
  42. 請求項１～３５のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクターセットまたはベクター（複数）のセット。
  43. 請求項１～３５のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
  44. 請求項１～３５のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物を作製する方法であって、
    宿主細胞に、前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチドをトランスフェクトする工程と、
    前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物の発現に適した条件下で、前記宿主細胞を培養する工程と
    を含む、前記方法。
  45. 請求項３７に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ多量体を作製する方法であって、
    宿主細胞に、請求項３４に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチド及びＪ鎖をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトする工程と、
    前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物及び前記Ｊ鎖の発現に適した条件下で、前記宿主細胞を培養する工程と
    を含む、前記方法。
  46. 前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃが、結合標的との結合を排除する１つ以上の変異を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
  47. 前記ＩｇＡ ＨｅｔＦｃが、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合を導入する１つ以上の変異を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載のＩｇＡ ＨｅｔＦｃ構築物。
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