KR20230128291A - 이종이량체 IgA Fc 작제물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

이종이량체 IgA Fc 작제물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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에릭 에스코바-카브레라
플로리안 헨켈
토마스 스프레터 본 크루덴스타인
메간 마리 베르스트라에트
서지트 비마라오 딕시트
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자임워크스 비씨 인코포레이티드
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Abstract

고순도 및 열안정성을 갖는 이종이량체 Fc의 형성을 허용하는 CH3 도메인에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 이종이량체 IgA Fc(IgA HetFc) 작제물이 제공된다. IgA HetFc 작제물은 하나 이상의 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다. 2개의 IgA HetFc 작제물이 J 사슬에 의해 결합되어 있는 다중 IgA HetFc 작제물을 포함하는 고차 IgA HetFc 다량체를 제조할 수 있다.

Description

이종이량체 IgA Fc 작제물 및 이의 사용 방법
본 개시내용은 IgA-기반 면역치료제 분야, 특히 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 이종이량체 IgA Fc(IgA HetFc) 작제물 및 이들 작제물의 치료제로서의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 항체 기반 치료제에는 IgG 유래 프레임워크가 포함되어 있다. Ig 아형은 안정하고, 높은 친화도로 표적에 결합하고, 유리한 약동학적 거동을 가지며, 수십 년간 집중 연구한 결과 표적 및 이펙터(effector) 세포에 대한 기능적 영향을 잘 이해하고 있다. 그러나 활성화할 수 있는 이펙터 세포 및 얻을 수 있는 원자가와 관련하여 IgG 기반 기능에는 한계가 있다.
호중구는 면역계의 필수적인 부분이며 인간 혈액에서 발견되는 가장 흔한 백혈구이다(표 1 참조). IgA는 Fc의 Cα2/Cα3(IgA CH2/CH3) 계면에 있는 잔기를 통해 호중구에서 FcαRI와 상호작용하는 유일한 Ig 동종형이다. 호중구에서 IgA와 FcαRI의 상호작용은 Neutrophil Extracellular Traps(NET)의 방출, 탈과립화 및 케모카인(chemokine) 방출을 포함하여 다양한 전염증반응을 유도한다(Heineke, 2017, Eur J Clin Invest., 47(2):184-192). IgA는 또한 생체외에서 세포독성을 매개할 수 있다. IgA에 의해 활성화된 호중구는 Her2+++ BT474 세포를 죽일 수 있는 것으로 나타났다(Borrok et al., 2015, MAbs 7:743-751). Her2 및 기타 표적을 통한 IgA 매개 종양 세포 사멸은 생체외 호중구에 의해 나타났다(Brandsma et al., 2019, Front Immunol, 10:704). 또한 IgA는 생체 내에서 종양 성장 억제를 매개할 수 있다. 특히, IgA는 Fca RI 형질전환(Tg) 마우스 모델에서 생체내 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다(Boross et al., 2013, EMBO Mol Med, 5:1213-1226).
인간 혈액의 면역 세포 *
세포 유형 인간 혈액의 중간 농도 [세포 x 10 9 /L] 백혈구의
중간 비율
호중구 3.65 53.0
림프구(T 세포, B 세포,
NK 세포 포함)		 2.5 36.1
호산구 0.15 3.2
호염기구 0.03 0.6
단핵구 0.43 7.1
*291명의 성인으로부터 수집된 데이터(Orfanakis, et al., 1970, Am J Clin Pathol, 53:647-651 참조)
IgA를 통한 호중구의 모집 및 활성화는 항체 기반 면역 요법을 위한 새로운 생물학적 기능을 제공한다.
이종이량체 IGA Fc 작제물 및 이의 사용 방법이 본원에 설명된다. 본 개시내용의 일 양태는 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 IgA 이종이량체 Fc(IgA HetFc) 작제물에 관한 것이며, 제1 Fc 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인 서열을 포함하고 제2 Fc 폴리펩티드는 제2 CH3 도메인 서열을 포함하고, 제1 및 제2 CH3 도메인 서열은 변형된 CH3 도메인을 형성하며, 여기서 제1 및 제2 CH3 도메인 서열은 동종이량체 Fc보다 이종이량체 Fc의 형성을 촉진하는 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 A6085YF, A6085YY, A6085YM, A6085YW 및 A6085YH에서 선택된 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환 및 T6086Y, T6086F, T6086M, T6086W 및 T6086H에서 선택된 위치 T6086에서의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 W6081T, W6081L, W6081A, W6081V 및 W6081I로부터 선택된 위치 W6081에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 이종이량체 Fc는 70% 이상의 순도로 형성되고, 아미노산 위치의 넘버링은 IMGT 넘버링에 따른다.
본 개시내용의 다른 양태는 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 IgA 이종이량체 Fc(IgA HetFc) 작제물에 관한 것이며, 제1 Fc 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인 서열을 포함하고 제2 Fc 폴리펩티드는 제2 CH3 도메인 서열을 포함하고, 제1 및 제2 CH3 도메인 서열은 변형된 CH3 도메인을 형성하며 , 여기서 제1 및 제2 CH3 도메인 서열은 동종이량체 Fc보다 이종이량체 Fc의 형성을 촉진하는 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서:
(a) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YY 및 T6086L을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079T, W6081L 및 I6088L을 포함하거나,
(b) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YY 및 T6086Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079T, W6081L 및 I6088L을 포함하거나,
(c) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YF 및 T6086YF를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081L 및 I6088L을 포함하거나,
(d) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
(e) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: T6022V, A6085YF 및 T6086Y을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
(f) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: T6022L, A6085YF 및 T6086Y을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
(g) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: T6022I, A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
(h) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6007F, L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
(i) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005Y, A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005Y, L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
(j) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005C, A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: P6010C, L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
(k) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005C, P6010C, A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005C, P6010C, L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
(l) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005C, P6010C, A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005C, P6010C, L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
상기 이종이량체 Fc는 순도 70% 이상으로 형성되고, 아미노산 위치의 넘버링은 IMGT 넘버링에 따른다.
본 개시내용의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 IgA HetFc 작제물 및 하나 이상의 치료제, 진단제 또는 표지물질을 포함하는 접합체(conjugate )에 관한 것이다.
본 개시내용의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 2개 이상의 IgA HetFc 작제물 및 J 사슬을 포함하는 IgA HetFc 다량체에 관한 것이며, 여기서 IgA HetFc 작제물 중 2개는 J 사슬에 의해 결합된다.
본 개시내용의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 IgA HetFc 작제물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 IgA HetFc 작제물 및 하나 이상의 치료제, 진단제 또는 표지물질 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 접합체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 2개 이상의 IgA HetFc 작제물 및 J 사슬을 포함하는 IgA HetFc 다량체 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세트에 관한 것이다.
본 개시내용의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 IgA HetFc를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 세트 또는 벡터 세트들에 관한 것이다.
본 개시내용의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 IgA HetFc를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 개시내용의 다른 양태는 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 숙주 세포를 형질감염시키고, IgA HetFc 작제물의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 IgA HetFc 작제물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 다른 양태는 α-테일피스를 포함하는 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 J 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 숙주 세포를 형질감염시키고, IgA HetFc 작제물 및 J 사슬의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 IgA HetFc 다량체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 IgA Fc의 이종이량체화를 유도하는 돌연변이에 대한 음성 및 양성 설계 개념을 묘사한 카툰(cartoon)을 나타낸다.
도 2는 CaptureSelect™ IgA 친화성 정제 후 IgA Fc 1 외팔(one armed) 항체(OAA) 작제물의 비환원성 CE-SDS 프로필을 나타낸다. (2a) WT IgA CH3(변이체 수 32595) 또는 입체 설계 1, 2, 3, 4 또는 6(변이체 수 각각 32516, 32517, 32518, 32519 및 32521)을 포함하는 IgA Fc OAA 작제물, (2b) 입체 설계 7, 8, 9, 10 또는 11(변이체 수 각각 33330, 33331, 33332, 33333 및 33334)을 포함하는 IgA Fc OAA 작제물.
도 3은 CaptureSelect™ IgA 친화성 정제 후 IgA Fc OAA 작제물의 UPLC-SEC 크로마토그램을 나타낸다. (3a) WT IgA CH3(변이체 수 32595)을 포함하는 IgA Fc OAA 작제물의 UPLC-SEC 크로마토그램, (3b~3k) 입체 설계 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11(변이체 수 각각 32516, 32517, 32518, 32519, 32521, 33330, 33331, 33332, 33333 및 33334)을 포함하는 IgA OAA 작제물의 UPLC-SEC 크로마토그램.
도 4는 Preparative SEC로 정제 후 IgA Fc OAA 작제물의 UPLC-SEC 크로마토그램을 나타낸다: (4a) WT IgA CH3 (변이체 수 32595)를 포함하는 IgA OAA 작제물, (4b~4j) 입체 설계 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11(변이체 수 각각 32516, 32517, 32518, 32519, 32521, 33330, 33331, 33332, 33333 및 33334)을 포함하는 IgA OAA 작제물.
도 5는 Preparative SEC로 정제 후 IgA Fc OAA 작제물의 비환원성 및 환원성 CE-SDS 프로필을 나타낸다. (5a) WT IgA CH3 (변이체 수 32595) 또는 입체 설계 1, 2, 3 또는 6(변이체 수 각각 32516, 32517, 32518 및 32521)을 포함하는 IgA OAA 작제물, (5b) 입체 설계 7, 8, 9, 10 또는 11(변이체 수 각각 33330, 33331, 33332, 33333 및 33334)을 포함하는 IgA OAA 작제물.
도 6은 Preparative SEC로 정제 후 IgA Fc OAA 작제물의 DSC 서모그램(thermogram)의 오버레이를 나타낸다. (6a) WT IgA CH3(변이체 수 32595) 또는 입체 설계 1, 2, 3 또는 6(변이체 수 각각 32516, 32517, 32518 및 32521)을 포함하는 IgA Fc 작제물, (6b) 입체 설계 7~11(변이체 수 각각 33330, 33331, 33332, 33333 및 33334)을 포함하는 IgA Fc 작제물.
도 7은 IgA HetFc 결합 단위의 구성요소 및 구성의 예를 도시한다. (7a) IgA HetFc 결합 단위를 형성하기 위해 결합 도메인이 융합된 IgA HetFc 스캐폴드, (7b) 2개의 예시적인 결합 도메인이 부착된 IgA HetFc 스캐폴드를 보여주는 예시적인 IgA HetFc 결합 단위, (7c~7h) 상이한 구성으로 IgA HetFc 스캐폴드에 융합된 1 내지 4개의 결합 도메인을 갖는 예시적인 IgA HetFc 결합 단위. 결합 도메인은 설명을 위해 Fab로 표시되지만, 다양한 다른 결합 도메인(예: scFv) 및 결합 도메인의 조합일 수 있다. 제공된 형식은 설명을 위한 것이며 어떠한 방식으로도 본 개시내용을 제한하지 않는다.
도 8은 J 사슬(점묘)에 의해 결합된 2개, 4개 및 5개의 IgA HetFc 결합 단위를 포함하는 예시적인 고차 IgA HetFc 다량체를 도시한다. IgA HetFc의 두 사슬은 회색과 줄무늬로 표시된다. 각 구조의 중앙에 테일피스 어셈블리가 표시되어 있다. 각 어셈블리에 대해 단일 방향이 표시되지만, 많은 방향이 가능하다. J 사슬과 Fc:Fc 상호작용은 사슬 A 또는 사슬 B에 대해 선택적이지 않기 때문에 각 결합 단위의 결합 도메인의 방향이 역전될 수 있다. (8a) J 사슬에 의해 결합된 2개의 이중특이적 IgA HetFc 결합 단위를 포함하는 이량체 IgA HetFc 다량체, (8b) J 사슬에 의해 결합된 4개의 이중특이적 IgA HetFc 결합 단위를 포함하는 사량체 IgA HetFc 다량체 및 (8c) J 사슬에 의해 결합된 5개의 이중특이적 IgA HetFc 결합 단위를 포함하는 오량체 IgA HetFc 다량체.
도 9는 사슬 A와 사슬 B가 표시된 IgA HetFc 설계(스테릭 6)의 구조적 표현을 나타낸다. 단백질 백본은 카툰(cartoon) 표현으로 묘사되고 측쇄는 선 표현으로 표시된다. 비극성 수소는 표시되지 않는다. (9a)는 완전한 IgA 이종이량체 Fc를 나타내고, (9b)는 코어 위치 A6085, T6086(둘 다 사슬 A) 및 W6081(사슬 B) 주위에 집중된 돌연변이 잔기의 확대도를 나타낸다.
도 10은 IgA1, IgA2m1 및 IgA2m2 Fc 영역에 대한 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
도 11은 Fc의 하나 또는 둘 다 사슬에서 FcαR의 결합을 제거하는 돌연변이를 갖는 IgA HetFc에 기초한 IgA OAA 변이체를 나타낸다.
도 12는 FcαR 및 FcRn 모두에 결합할 수 있는 IgA HetFc에 기초한 변형된 IgA mAb를 나타낸다.
본 발명은 아미노산 돌연변이를 이종이량체 IgA Fc(IgA HetFc)의 형성을 촉진하는 CH3 도메인에 도입하기 위한 IgA Fc 영역의 조작에 관한 것이다. IgA HetFc는 IgA 기반 다량체 결합 단백질뿐 아니라 IgA 기반 이중특이적 또는 다중특이적 결합 단백질의 구성을 허용한다. 본 개시내용에 따르면, IgA HetFc 작제물에 의해 포함된 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 적어도 약 70%의 순도를 갖는 이종이량체 Fc의 형성을 가능하게 한다. 본 발명의 IgA HetFc 작제물은 또한 내열성이다. 예를 들어, 특정 실시예에서, IgA HetFc의 CH3 도메인은 약 60℃이상의 융점(Tm)을 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc의 CH3 도메인은 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 10℃(+10℃) 이내에 있는 Tm을 갖는다.
본 개시내용의 IgA HetFc 작제물은 힌지 영역과 함께 IgA Fc 영역을 포함하는 IgA HetFc 스캐폴드; IgA 스캐폴드 및 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 IgA HetFc 결합 단위; 및 복수의(예: 2개 이상) IgA HetFc 결합 단위를 포함하는 IgA HetFc 다량체를 포함한다.
본 개시내용의 IgA HetFc 작제물은 IgG에 의해 개발되지 않은(untapped) 기능을 가진 IgA 동종형에 대한 다중특이적 가능성을 도입한다. 예를 들어, 특정 실시예에서, IgA HetFc는 FcαRI를 통해 호중구를 모집할 수 있는 다중특이적 및 다량체 생물학적 제제의 생성을 촉진한다. 호중구는 면역계의 필수적인 부분이고 인간 혈액에서 발견되는 가장 흔한 백혈구이기 때문에 IgA를 통한 호중구의 모집 및 활성화는 항체 기반 면역 요법을 위한 새로운 생물학적 기능을 제공한다. 본 개시내용의 특정 실시예는 치료제로서 IgA HetFc 결합 단위 및 IgA HetFc 다량체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 특정 실시예는 진단제로서 IgA HetFc 결합 단위 및 IgA HetFc 다량체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용되는 용어 "약"은 달리 지시되지 않는 한 주어진 값의 대략 ±10% 편차를 지칭한다. 이러한 편차는 그것이 구체적으로 언급되는지 여부와 관계없이 본원에 제공된 임의의 주어진 값에 항상 포함된다는 것을 이해해야 한다.
"포함하는"이라는 용어와 함께 본원에서 사용될 때 "한" 또는 "하나의"라는 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 특정 실시예에서는 "하나 이상", "적어도 하나" 또는 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다.
본원에 사용되는 용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)" 및 이들의 문법적 변형은 포괄적이거나 개방형이며 추가의 인용되지 않은 요소 및/또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 조성물, 용도 또는 방법과 관련하여 본원에서 사용될 때 용어 "본질적으로 이루어진"은 추가 요소 및/또는 방법 단계가 존재할 수 있지만, 이러한 추가가 인용된 조성물, 방법 또는 용도가 기능하는 방식에 실질적으로 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 본원에서 조성물, 용도 또는 방법과 관련하여 사용될 때 "~로 이루어진"이라는 용어는 추가 요소 및/또는 방법 단계의 존재를 배제한다. 특정 요소 및/또는 단계를 포함하는 것으로 본원에 기재된 조성물, 용도 또는 방법은 또한 특정 실시예에서 이러한 요소 및/또는 단계로 본질적으로 이루어질 수 있고, 다른 실시예에서는 이러한 실시예가 구체적으로 언급되었는지 여부와 관계없이 이러한 요소 및/또는 단계로 이루어질 수 있다.
"융합된"은 본원에 기재된 다량체의 구성요소(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 Fc 도메인 폴리펩티드)가 직접 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 펩티드 결합에 의해 연결됨을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일 사슬"은 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 항원-결합 단편은 단일 사슬 가변 영역(scFv)을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 "IgA HetFc 작제물"은 IgA HetFc 스캐폴드(이종이량체 IgA Fc), IgA HetFc 결합 단위(이종이량체 IgA 결합 단위) 및 IgA HetFc 다량체를 포함하는 본원에 기재된 임의의 IgA HetFc 작제물을 포함하는 것을 의미한다.
변형된 J 사슬과 관련하여 용어 "기능성"은 J 사슬이 천연 J 사슬, 예를 들어 천연 인간 J 사슬의 주요 기능, 특히, IgA의 효율적인 중합(이량체화, 사량체화) 및 이러한 중합체(이합체, 사합체)의 분비 성분(SC)/중합체 (p)Ig에 대한 결합을 가능하게 하는 능력을 유지함을 의미한다.
물질과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단리된"은 물질이 원래 환경(예를 들어, 자연 발생인 경우 자연 환경)에서 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리되는 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물이 그의 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열과 같은 아미노산 서열과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열이 서열의 기능에 큰 영향을 미치지 않으면서 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산의 치환, 추가 또는 결실에 의해 변경되었음을 의미한다. 예를 들어, 보존적으로 변형된 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 변경된 아미노산 서열일 수 있다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 하기 8개 그룹은 각각 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M) (예를 들어, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993) 참고). 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물에 대한 염기 서열로 사용되는 IgA 서열은 보존적으로 변형된 변이체일 수 있다.
아미노산 서열과 관련하여 본원에서 사용된 "실질적으로 동일한"이란, 예를 들어 하기 기재된 방법을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 아미노산 서열이 정의된 제2 아미노산 서열(또는 참조 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 특정 실시예에서, 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 참조 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. "실질적인 동일성"은 전장 서열(full-length sequence) 또는 기능적 도메인과 같은 다양한 유형 및 길이의 서열을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 2개 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 당업계에 알려진 다양한 방식, 예를 들어, Smith Waterman Alignment(Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7); GeneMatcher Plus™Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. O., Ed pp 353-358에 통합된 바와 같은 "BestFit"(Smith & Waterman, 1981, Advances in Applied Mathematics, 482-489 10 (1981)); BLAST program (Basic Local Alignment Search Tool (Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) 및 BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL 및 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 포함하는 이의 변형과 같은 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 당업자는 비교되는 서열의 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 일반적으로, 아미노산 서열의 경우, 비교 서열의 길이는 적어도 10개 아미노산이 될 것이다. 당업자는 실제 길이가 비교되는 서열의 전장에 의존할 것이고 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150 또는 적어도 200개의 아미노산일 수 있거나, 아미노산 서열의 전체 길이일 수 있다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 본원의 표(들)에 기재된 바와 같은 참조 아미노산 서열 또는 단편과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
재조합 아미노산 서열과 관련하여 사용될 때 용어 "~로부터 유도된" 및 "~에 기초한"은 재조합 아미노산 서열이 상응하는 야생형 아미노산 서열의 서열과 실질적으로 동일함을 의미한다. 예를 들어, 야생형 IgA Fc 서열로부터 유도된(또는 이에 기초한) IgA Fc 아미노산 서열은 야생형 IgA Fc 서열과 실질적으로 동일하다(예: 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97 %, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유함)
본원에 사용되는 용어 "대상체(subject)"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물, 일부 실시예에서는 포유동물을 지칭한다. 동물은, 인간, 비-인간 영장류, 반려 동물(예: 개, 고양이 등), 농장 동물(예: 소, 양, 돼지, 말 등) 또는 실험 동물(예: 래트, 마우스, 기니피그 등)을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "포유동물"은 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 쥐, 소, 말 및 돼지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "녹아웃"은 결합 표적에 대한 결합을 제거하거나 감소시키는 변이체의 다양한 위치 이내의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 지칭한다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 인용된 범위 내에서 임의의 정수의 값 및 ,적절할 때, 이들의 적절한 분율(예: 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하도록 이해되어야 한다.
본원에 논의된 임의의 실시예는 본원에 개시된 임의의 방법, 용도 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있음이 고려된다.
본원에 개시된 실시예와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조 및/또는 특성은 하나 이상의 추가 실시예를 제공하기 위해 임의의 적합한 방식으로 본원에 개시된 다른 실시예와 관련하여 기재된 특징, 구조 및/또는 특성과 조합될 수 있다.
또한, 일 실시예에서 특징의 긍정적인 언급은 대안 실시예에서 이 특징을 배제하기 위한 근거 역할을 한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 주어진 실시예 또는 청구범위에 대해 옵션 목록이 제시되는 경우, 하나 이상의 옵션이 이 목록에서 삭제될 수 있고 짧아진 목록은 이러한 대안 실시예가 구체적으로 언급되었는지 여부와 관계없이 대안 실시예를 형성할 수 있음을 이해해야 한다.
항체 기술 분야의 당업자에 의해 이해되는 용어는 각각, 본원에서 명시적으로 달리 정의되지 않으면, 당분야에서 획득된 의미가 부여된다. 항체는 가변 영역, 힌지 영역 그리고 불변 도메인을 갖는 것으로 알려져 있다. 면역글로불린 구조와 기능은 예로서, Harlow et al (Eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)에서 재검토된다.
본원에서 달리 명시하지 않는 한, IgA Fc 영역 및 IgA 테일피스의 아미노산 잔기의 넘버링은 IMGT 넘버링 시스템에 따른다(Lefranc, et al., 2003, Dev Comp Immunol,27:55-77; Lefranc, et al. , 2005, Dev Comp Immunol,29:185-203 참고).표 2는 IgA2m1 Fc CH2 및 CH3 도메인에 대한 IMGT 넘버링 및 아미노산 서열을 동등한 EU 넘버링(정렬에 의한)과 함께 제공한다. 다른 IgA Fc 서열의 넘버링은 공지 기법을 사용하여 표 2에 나타낸 서열과의 간단한 서열 정렬에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 표 3은 IgA 테일피스에 대한 IMGT 넘버링 및 아미노산 서열을 제공한다.
IgA2m1 * Fc CH2 및 CH3 도메인 서열, IMGT 및 EU 넘버링
CH2 도메인 CH3 도메인
IMGT 번호 EU 번호 아미노산 IMGT 번호 EU 번호 아미노산
5001 231 C 6001 341 G
5001A 232 C 6001A 342 N
5001Z 237 H 6001B 343 T
5002 238 P 6001Y 344 F
5003 239 R 6001Z 345 R
5004 240 L 6002 346 P
5005 241 S 6003 347 E
5006 242 L 6004 348 V
5007 243 H 6005 349 H
5008 244 R 6006 350 L
5009 245 P 6007 351 L
5010 246 A 6008 352 P
5011 247 L 6009 353 P
5012 248 E 6010 354 P
5013 249 D 6011 355 S
5014 250 L 6012 356 E
5015 251 L 6013 357 E
5015A 252 L 6014 358 L
5016 254 G 6015 359 A
5017 255 S 6015A 359A L
5018 256 E 6016 360 N
5019 257 A 6017 361 E
5020 258 N 6018 362 L
5021 259 L 6019 363 V
5022 260 T 6020 364 T
5023 261 C 6021 365 L
5024 262 T 6022 366 T
5025 263 L 6023 367 C
5026 264 T 6024 368 L
5027 265 G 6025 369 A
5028 266 L 6026 370 R
5029 267 R 6027 371 G
5030 268 D 6028 372 F
5031 269 A 6029 373 S
5035 271 S 6030 374 P
5036 272 G 6035 375 K
5037 273 A 6036 376 D
5038 274 T 6037 377 V
5039 275 F 6038 378 L
5040 276 T 6039 379 V
5041 277 W 6040 380 R
5042 278 T 6041 381 W
5043 279 P 6042 382 L
5044 280 S 6043 383 Q
5045 281 S 6044 384 G
5045A 282 G 6045 385 S
5045B 283 K 6045A 386 Q
5045Z 283A S 6045B 387 E
5078 287 A 6045C 388 L
5079 288 V 6045X 389 P
5080 289 Q 6045Y 389A R
5081 290 G 6045Z 389B E
5082 291 P 6077 390 K
5083 292 P 6078 391 Y
5084 293 E 6079 392 L
5084A 294 R 6080 393 T
5084B 295 D 6081 394 W
5084C 296 L 6082 395 A
5084Y 297 C 6083 396 S
5084Z 298 G 6084 397 R
5085 299 C 6084A 398 Q
5085A 300 Y 6084B 399 E
5085B 301 S 6084C 400 P
5085Z 302 V 6084X 401 S
5086 303 S 6084Y 401A Q
5087 304 S 6084Z 401B G
5088 305 V 6085 401C T
5089 306 L 6085A 402 T
5090 307 P 6085B 403 T
5091 308 G 6085C 404 F
5092 309 C 6085Y 405 A
5093 310 A 6085Z 406 V
5094 311 Q 6086 407 T
5095 312 P 6087 408 S
5096 313 W 6088 409 I
5097 314 N 6089 410 L
5098 315 H 6090 411 R
5099 316 G 6091 412 V
5100 317 E 6092 413 A
5101 318 T 6093 414 A
5102 319 F 6094 415 E
5103 320 T 6095 416 D
5104 321 C 6096 417 W
5105 322 T 6097 418 K
5106 323 A 6098 419 K
5107 324 A 6099 420 G
5108 325 H 6100 421 D
5109 326 P 6101 422 T
5110 327 E 6102 423 F
5113 328 L 6103 424 S
5114 329 K 6104 425 C
5115 330 T 6105 426 M
5116 331 P 6106 427 V
5117 332 L 6107 428 G
5118 333 T 6108 429 H
5119 334 A 6109 430 E
5120 335 N 6110 431 A
5121 336 I 6112 432 L
5122 337 T 6113 433 P
5123 338 K 6114 434 L
5124 339 S 6115 435 A
6116 436 F
6117 437 T
6118 438 Q
6119 439 K
6120 440 T
6121 441 I
6122 442 D
6123 443 R
6124 444 L
6125 445 A
6129 446 G
Chintalacharuvu, et al., 1994, J Immunol 152:5299-5304
IgA 테일피스 서열 및 IMGT 넘버링
IMGT 번호 아미노산
7001 K
7002 P
7003 T
7004 H
7005 V
7006 N
7007 V
7008 S
7009 V
7010 V
7011 M
7012 A
7013 E
7014 V
7015 D
7016 G
7017 T
7018 C
7019 Y
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이종이량체 IGA FC(IGA HETFC) 작제물
본 발명은 이종이량체 IgA Fc(IgA HetFc) 작제물에 관한 것이다. IgA HetFc 작제물은 IgA Fc 영역에서 유도된 이종이량체 Fc 영역을 포함한다. 이종이량체 Fc 영역은 이종이량체 형성을 촉진하는 하나 이상의 비대칭 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물에 의해 포함된 이종이량체 Fc 영역은 하나 이상의 결합 도메인이 융합되어 IgA HetFc 결합 단위를 제공할 수 있는 스캐폴드(IgA HetFc 스캐폴드)로 작용할 수 있다. 특정 실시예에서, 다중(예: 2개 이상) IgA 결합 단위는 예컨대 J-사슬을 통해 함께 융합되어 IgA HetFc 다량체를 제공할 수 있다. 다른 제제(예: 치료제 또는 진단제)는 임의로 특정 실시예에서 IgA HetFc 작제물에 접합될 수 있다.
IgA는 IgA1 및 IgA2의 두 가지 아형과 다양한 동종형 변이체(IgA2m1, IgA2m2, IgA2(n))로 존재한다. 두 가지 아형 중에서 IgA2는 힌지 영역이 짧아서 특정 박테리아 프로테아제에 저항성을 가지기 때문에 IgA1보다 더 안정적이다. 더 짧은 이 힌지는 또한 단단하고 비평면 구조를 만들어 세포 표면의 항원에 대한 lgA2의 더 나은 다가 결합을 촉진한다. 본 개시내용의 목적상, IgA HetFc 작제물의 이종이량체 Fc 영역은 IgA1 또는 IgA2 Fc 영역(이의 동종형 변이체 포함)으로부터 유도될 수 있다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 이종이량체 Fc 영역은 IgA1 Fc 영역으로부터 유도될 수 있다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 이종이량체 Fc 영역은 IgA2 Fc 영역 또는 이의 동종형 변이체로부터 유도될 수 있다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 이종이량체 Fc 영역은 인간 IgA Fc 영역으로부터 유도될 수 있다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 이종이량체 Fc 영역은 인간 IgA2 또는 IgA2m1 Fc 영역으로부터 유도될 수 있다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 이종이량체 Fc 영역은 IgA2m1 Fc 영역으로부터 유도될 수 있다. 표 4는 야생형 인간 IgA2m1 Fc 서열의 아미노산 서열 및 테일피스를 제거하기 위해 절단되고 유리 시스테인 및 글리코실화 부위를 제거하기 위해 돌연변이된 변형된 형태의 IgA2m1 Fc 서열의 아미노산 서열을 제공한다. Fc 서열은 인간 IgA2m1 중쇄의 IMGT 넘버링 5001~6129에 해당한다. IgA2m1의 CH3 서열(밑줄)은 전장 인간 IgA1 중쇄의 아미노산 6097-6129(IMGT 넘버링)를 포함한다( 예를 들어, Chintalacharuvu, et al., 1994, J Immunol, 152:5299-5304 참조). IgA 테일피스의 서열도 표시된다. IgA1 및 IgA2m2 Fc 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO 44 및 45로서 서열표 B에 제공된다. Fc 서열의 정렬은 도 10에 제공된다.
IgA2m1 Fc 아미노산 서열
IgA2m1 야생형 서열1 CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG [SEQ ID NO:42]
변형된 IgA2m1 서열 (C5092S/N5120T/I5121L/T5122S/Δα-테일피스2) CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPG S AQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTA TLS KSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG [SEQ ID NO:43]
IgA1/IgA2m1 테일피스 KPTHVNVSVVMAEVDGTCY [SEQ ID NO:46]
1 Chintalacharuvu, et al., 1994, J Immunol, 152:5299-5304
2 Lohse et al., 2016, Cancer Res, 76:403-417. 돌연변이는 볼드체와 밑줄로 표시된다.
본원에서 상호교환이 가능하게 사용된 용어 "Fc 영역", "Fc 도메인" 및 "Fc"는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. Fc 영역은 일반적으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. Fc 영역은 또한 특정 실시예에서 힌지 영역을 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이량체 Fc의 "Fc 폴리펩티드"는 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드, 즉, 안정된 자기-결합을 할 수 있는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 하나를 지칭한다. 예를 들어, 이량체 IgA Fc의 Fc 폴리펩티드는 IgA CH3 도메인을 포함하고 IgA CH2 도메인을 포함할 수 있다.
따라서 IgA HetFc 작제물의 Fc 영역은 2개의 Fc 폴리펩티드(제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드)로 구성되며, 이는 본원에서 사슬 A 및 사슬 B로도 지칭될 수 있다. 용어 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드( 또는 사슬 A 및 사슬 B) 각각의 Fc 영역이 하나의 제1 Fc 폴리펩티드 및 하나의 제2 Fc 폴리펩티드(또는 하나의 사슬 A 폴리펩티드 및 하나의 사슬 B 폴리펩티드)를 포함한다면 상호교환적으로 사용될 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드는 "계면(interface)"에서 만난다. "계면"은 제2 Fc 폴리펩티드의 하나 이상의 "접촉" 아미노산 잔기와 상호작용하는 제1 Fc 폴리펩티드의 "접촉" 아미노산 잔기를 포함한다.
Fc 영역의 CH3 도메인은 2개의 CH3 도메인 서열을 포함하고, 이량체 Fc의 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드 각각으로부터 하나씩 유래된다. CH2 도메인은 2개의 CH2 도메인 서열을 포함하고, 이량체 Fc의 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드 각각으로부터 하나씩 유래된다.
본 발명의 IgA HetFc 작제물은 이종이량체 Fc 영역을 생성하도록 비대칭적으로 변형된 IgA CH3 도메인을 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 IgA CH3 도메인에 비대칭 방식으로 도입되어 이종이량체 Fc가 된다. 본원에 사용되는 비대칭 아미노산 돌연변이는 하나의 Fc 폴리펩티드의 특정 위치에 있는 아미노산이 동일한 위치에 있는 제2 Fc 폴리펩티드의 아미노산과 상이한 돌연변이를 초래한다. 이는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 두 아미노산 중 하나만 돌연변이 되거나 두 아미노산이 두 개의 다른 아미노산으로 돌연변이된 결과일 수 있다. 본원에 개시된 IgA HetFc 작제물은 CH3 도메인에 하나 이상의 비대칭 아미노산 돌연변이를 포함한다.
야생형 동종이량체의 IgA HetFc 영역의 설계는 안정성과 특이성의 균형을 유지함으로써 단백질 공학의 맥락에서 양성 및 음성 설계의 개념으로 설명되며, 돌연변이는 폴리펩티드가 세포 배양 조건에서 발현될 때 동종이량체 형성보다 이종이량체 형성을 유도할 목적으로 도입된다. 양성 및 음성 설계의 이러한 일반적인 설계 개념은 도 1에 개략적으로 설명되어 있다.
음성 설계 전략은 하나의 사슬에 부피가 큰 측쇄를 도입하고 반대쪽에 작은 측쇄를 도입하거나(예: 놉-인투-홀(knobs-into-holes) 전략((Ridgway, et al., 1996, Protein Eng., 9(7):617-21; Atwell, et al., 1997, J Mol Biol., 270(1):26-35)), 동종이량체 형성의 반발을 초래하는 정전기 공학에 의해(예: Gunasekaran, et al. 21010, J Biol Chem., 285(25):19637-19646이 개발한 정전기 스티어링 전략) 동종이량체 형성을 위한 불리한 상호작용을 최대화한다.
양성 설계 전략에서 아미노산 돌연변이는 단백질 내 또는 단백질 간의 유리한 상호작용을 최대화하기 위해 폴리펩티드에 도입된다. 이러한 전략은 동종이량체에 대한 효과를 무시하면서 원하는 이종이량체를 특이적으로 안정화시키는 다중 돌연변이를 도입할 때 순 효과가 동종이량체에 대한 원하는 이종이량체 상호작용에 대한 더 나은 특이성이고 따라서 더 큰 이종이량체 특이성이 될 것이라고 가정한다. 양성 설계 전략이 원하는 단백질 상호작용의 안정성을 최적화하지만, 90% 이상의 특이성을 거의 달성하지 못한다는 것이 단백질 공학의 맥락에서 이해된다(Havranek & Harbury, 2003, Nat Struct Biol., 10(1):45-52). ; Bolon, et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA, 102(36):12724-9; Huang, et al., 2007, Protein Sci., 16(12):2770-4).
안정하고 고도로 특이적인 이종이량체 형성을 초래하는 IgA Fc 이종이량체를 설계하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 이 설계 방법은 구조 및 계산 모델링 유도 단백질 공학 기술과 함께 음성 및 양성 설계 전략을 모두 결합한다(본원의 실시예 1 참조). 본원에서 IgA HetFc 작제물을 생성하는 방법에 사용되는 계산 도구 및 구조-함수 분석은 예를 들어 분자 역학 분석(MD), 측쇄/백본 재패킹, KBP(Knowledge Base Potential), 캐비티(소수성) 패킹 분석(LJ, AMBER, SASA, dSASA(탄소/전원자)), 정전기-GB 계산 및 결합 분석을 포함할 수 있다. 변이체 Fc 영역을 생성하기 위한 계산 방법은 또한 국제 특허 공개 번호 WO 2012/058768, WO 2015/021540, WO 2014/201566, WO 2014/138994, WO 2014/026296, WO 2013/188984, WO 2013/138923, WO 2012/040833, WO 2012/037659 및 WO 2011/063518에 기재되어 있다.
특정 실시예에서, 이 방법의 구현으로부터 생성된 IgA HetFc 작제물은 70% 이상의 순도 및 60℃이상의 안정성(CH3 도메인의 용융 온도(Tm)에 의해 측정됨)을 갖는다. 특정 실시예에서, 이 방법의 구현으로부터 생성된 IgA HetFc 작제물은 70% 이상의 순도 및 상응하는 야생형 IgA Fc의 CH3 도메인 Tm의10℃이내의 안정성 CH3 도메인 Tm(안정성)을 갖는다.
본 개시내용에 따르면, IgA Fc의 CH3 도메인에 도입된 아미노산 돌연변이는 동종이량체 형성에 비해 이종이량체 형성을 촉진한다. 동종이량체 형성과 비교하여 이러한 이종이량체 형성은 본원에서 "순도", "특이성", "이종이량체 순도" 또는 "이종이량체 특이성"으로 상호교환적으로 언급된다. 이 이종이량체 순도는 표준 세포 배양 조건 하의 용액에서 형성된 동종이량체 종과 비교하여 형성된 원하는 이종이량체의 백분율을 의미하는 것으로 이해된다. 이종이량체 순도는 이종이량체 종의 선택적 정제 전에 평가된다. 특정 실시예에서 순도는 동종이량체/이종이량체 정제에 선택적이지 않은 IgA 친화성 정제 단계 후에(예를 들어, CaptureSelect™ IgA 친화성 정제 후) 평가될 수 있다. 예를 들어, 70%의 이종이량체 순도는 IgA 친화성 정제 단계 후 세포 배양으로부터 단리된 Fc 이량체의 70%가 원하는 Fc 이종이량체임을 나타낸다.
일부 실시예에서, IgA HetFc는 약 70%를 초과하는 순도를 가지며, 예를 들어, 약 71% 초과, 약 72% 초과, 약 73% 초과, 약 74% 초과, 약 75% 초과, 약 76% 초과, 약 77% 초과, 약 78% 초과, 약 79% 초과 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc는 약 80%를 초과하는 순도를 가지며, 예를 들어, 약 81% 초과, 약 82% 초과, 약 83% 초과, 약 84% 초과, 약 85% 초과, 약 86% 초과, 약 87% 초과, 약 88% 초과, 약 89% 초과 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc는 약 90%를 초과하는 순도를 가지며, 예를 들어, 약 91% 초과, 약 92% 초과, 약 93% 초과, 약 94% 초과, 약 95% 초과, 약 96% 초과, 약 97% 초과, 약 98% 초과, 약 99% 초과 순도를 갖는다.
특정 실시예에서, IgA HetFc는 약 70% 내지 100%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc는 약 70% 내지 약 98% 또는 약 70% 내지 약 97% 또는 약 70% 내지 약 96%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc는 약 72% 내지 약 98% 또는 약 74% 내지 약 98% 또는 약 75% 내지 약 96%의 순도를 갖는다.
IgA HetFc 샘플에서 이종이량체 및 동종이량체의 상대적인 양과 그에 따른 IgA HetFc의 순도는 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 비환원성 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 비환원성 모세관 전기영동 소듐 도데실 설페이드(CE-SDS) 및 액체 크로마토그래피 질량분석법(LC-MS)을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시예에서, IgA HetFc는 비환원성 CE-SDS에 의해 측정 시 약 70% 초과의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc는 CE-SDS LabChip®GXII(Perkin Elmer, Waltham, MA)를 사용하여 High Throughput Protein Express 분석을 실행하여 수행된 비환원성 CE-SDS에 의해 결정된 바와 같이 약 70% 초과의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc는 본원의 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행된 비환원성 CE-SDS에 의해 결정된 바와 같이 약 70% 초과의 순도를 갖는다.
일부 실시예에서, IgA HetFc는 UPLC-SEC에 의해 결정된 바와 같이 약 70% 초과의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetF는 25℃에서 Agilent Technologies AdvanceBio SEC 300A 컬럼을 사용하여 Agilent Technologies 1260 Infinity LC 시스템에서 수행된 UPLC-SEC에 의해 결정된 바와 같이 약 70% 초과의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, IgA는 HetFc는 본원의 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행된 UPLC-SEC에 의해 결정된 바와 같이 약 70% 초과의 순도를 갖는다.
본 발명에 따른 IgA HetFc 작제물은 내열성이다. 본원에 개시된 IgA HetFc 작제물의 맥락에서, "내열성"은 IgA HetFc 작제물이 약 60℃ 이상의 CH3 도메인 용융 온도(Tm)를 갖거나 해당 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 10℃(±10℃ 이내의 CH3 도메인 Tm을 갖는다는 것을 의미한다.
특정 실시예에서, IgA HetFc는 약 60℃ 이상의 CH3 도메인 Tm을 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc는 약 62oC 이상, 예를 들어 약 63oC 이상, 또는 약 64oC 이상, 또는 약 65oC 이상, 또는 약 66℃, 또는 약 67oC 이상, 또는 약 68oC 이상, 또는 약 69oC 이상의 CH3 도메인 Tm을 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc는 약 70℃이상, 예를 들어 약 71℃ 이상, 또는 약 72℃ 이상, 또는 약 73℃ 이상의 CH3 도메인 Tm을 갖는다.
특정 실시예에서, IgA HetFc는 약60℃ 내지 약 74℃ 의 CH3 도메인 Tm을 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc는 약 62℃ 내지 약 74℃, 또는 약 63℃ 내지 약 74℃ 또는 약 64℃ 내지 약 74℃, 또는 약 65℃ 내지 약 74℃ 의 CH3 도메인 Tm을 갖는다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 10℃(+10℃) 이내에 있는 CH3 도메인 Tm을 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 해당 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 9℃(+9℃) 이내, 예를 들어 8℃(+8℃ 이내), 또는 7℃(+7℃) 이내, 또는 6℃(+6℃) 이내, 또는 5℃(+5℃) 이내에 있는 CH3 도메인 Tm을 갖는다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 약 60℃ 이상인 CH3 도메인 Tm을 갖거나, CH3 도메인에 임의의 추가 이황화 결합이 없는 경우 해당 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 10℃(+10℃) 이내에 있는 CH3 도메인 Tm을 갖는다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 야생형 IgA CH3 도메인과 비교하여 CH3 도메인에 하나 이상의 추가 디설파이드 결합을 포함하지만, 60℃ 이상인 CH3 도메인 Tm을 갖거나, 하나 이상의 이황화 결합이 없는 경우 해당 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 10℃(+10℃) 이내에 있는 CH3 도메인 Tm을 갖는다.
Tm으로 측정된 안정성은 시차 주사 열량계(DSC), 시차 주사 형광법(DSF), 원편광 이색성 분광법(CD) 및 수소 교환(HX)과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시예에서, Tm은 DSC에 의해 결정된다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 약 60℃ 이상인CH3 도메인 Tm을 갖거나, Tm이 DSC에 의해 결정되는 경우, 해당 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 10℃(+10℃) 이내에 있는 CH3 도메인 Tm을 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 약 60℃ 이상인CH3 도메인 Tm을 갖거나, Tm이 NanoDSC(TA Instruments, New Castle, DE, USA)을 사용하여 DSC에 의해 결정되는 경우, 해당 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 10℃(+10℃) 이내에 있는 CH3 도메인 Tm을 갖는다. 일부 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 약 60℃ 이상인 CH3 도메인 Tm을 갖거나, Tm이 본원의 실시예 6에 기재된 프로토콜에 따라 DSC에 의해 결정되는 경우, 해당 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 10℃(+10℃) 이내에 있는 CH3 도메인 Tm을 갖는다.
특정 실시예에서, IgA HetFc는,
(i) 약 70% 초과, 예를 들어, 약 71% 초과, 또는 약 72% 초과, 또는 약 73% 초과, 또는 약 74% 초과, 또는 약 75% 초과, 또는 약 76% 초과, 또는 약 77% 초과, 또는 약 78% 초과, 또는 약 79% 초과, 또는 약 80% 초과, 또는 약 81% 초과, 또는 약 82% 초과 또는 약 83% 초과, 또는 약 84% 초과, 또는 약 85% 초과, 또는 약 86% 초과, 또는 약 87% 초과, 또는 약 88% 초과, 또는 약 89% 초과, 또는 약 90% 초과, 또는 약 91% 초과, 또는 약 92% 초과, 또는 약 93% 초과, 또는 약 94% 초과, 또는 약 95% 초과, 또는 약 96% 초과, 또는 약 97% 초과, 또는 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과하는 순도를 갖고,
(ii) 약 60℃ 내지 약 74℃, 예를 들어, 약 62℃ 내지 약 74℃, 또는 약 63℃ 내지 약 74℃, 또는 약 64℃ 내지 약 74℃, 또는 약 65℃ 내지 약 74℃의 CH3 도메인 Tm을 갖는다.
특정 실시예에서, IgA HetFc는,
(i) 약 70% 초과, 예를 들어, 약 71% 초과, 또는 약 72% 초과, 또는 약 73% 초과, 또는 약 74% 초과, 또는 약 75% 초과, 또는 약 76% 초과, 또는 약 77% 초과, 또는 약 78% 초과, 또는 약 79% 초과, 또는 약 80% 초과, 또는 약 81% 초과, 또는 약 82% 초과 또는 약 83% 초과, 또는 약 84% 초과, 또는 약 85% 초과, 또는 약 86% 초과, 또는 약 87% 초과, 또는 약 88% 초과, 또는 약 89% 초과, 또는 약 90% 초과, 또는 약 91% 초과, 또는 약 92% 초과, 또는 약 93% 초과, 또는 약 94% 초과, 또는 약 95% 초과, 또는 약 96% 초과, 또는 약 97% 초과, 또는 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과하는 순도를 갖고,
(ii) 해당 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 10℃(+10oC) 이내에 있는 CH3 도메인 Tm, 예를 들어, 9℃(+9℃) 이내, 또는 8℃(+8℃) 이내, 또는 7℃(+7℃) 이내, 또는 6℃(+6℃) 이내, 또는 5℃(+5℃) 이내에 있는 CH3 도메인 Tm을 갖는다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 결합 표적에 대한 결합을 제거하기 위한 하나 이상의 돌연변이, 또는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 도입하기 위한 하나 이상의 돌연변이, 또는 둘 모두를 포함한다.
변형된 CH3 도메인
본원에 개시된 IgA HetFc 작제물은 하나 이상의 비대칭 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 구체적으로, IgA HetFc 작제물은 2개의 Fc 폴리펩티드를 포함한다: 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 제1 CH3 도메인 서열을 포함하는 제1 Fc 폴리펩티드 및 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 제2 CH3 도메인 서열을 포함하는 제2 Fc 폴리펩티드, 여기서 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이 중 적어도 하나는 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이와 상이하다. 제1 및 제2 CH3 도메인 서열은 함께 변형된 CH3 도메인을 형성한다. 제1 및 제2 CH3 도메인 서열에 비대칭적으로 도입된 아미노산 돌연변이는 두 개의 CH3 도메인 서열이 이량체화될 때 동종이량체 Fc가 아닌 이종이량체 Fc를 형성한다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 문맥에서 "비대칭 아미노산 돌연변이"는 제1 CH3 도메인 서열의 특정 위치에 있는 아미노산이 동일한 위치에 있는 제2 CH3 도메인 서열에 있는 아미노산과 다른 돌연변이를 의미한다. 비대칭 돌연변이는 각 CH3 도메인 서열에서 동일한 각각의 아미노산 위치에 있는 2개 아미노산 중 하나만의 돌연변이 또는 제1 및 제2 CH3 서열 각각의 동일한 각각의 위치에서 아미노산 둘 다의 상이한 돌연변이의 결과일 수 있다. IgA HetFc의 CH3 도메인 서열은 하나 또는 둘 이상의 비대칭 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 계산 전략을 사용함으로써, 이종이량체 Fc의 형성을 촉진하는 원하는 특성을 제공하기 위해 IgA CH3 도메인에 대한 비대칭 돌연변이의 핵심 세트를 확인하였다. 이 핵심 돌연변이 세트는 표 5에 나와 있다.
IgA HetFc 핵심 돌연변이
사슬 위치(IMGT) 아미노산 치환
A A6085Y F, Y, M, W, H
T6086 Y, F, M, W, H
B W6081 T, L, A, V, I
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 A6085YF, A6085YY, A6085YM, A6085YW 및 A6085YH로부터 선택된 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환 및 T6086Y, T6086F, T6086M, T6086W 및 T6086H로부터 선택된 위치 T6086에서의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 W6081T, W6081L, W6081A, W6081V 및 W6081I로부터 선택된 위치 W6081에서 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 표 7에 제시된 설계 중 임의의 하나에 대해 제시된 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 CH3 도메인 서열의 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환은 A6085YF, A6085YY 또는 A6085YW이다. 일부 실시예에서, 제1 CH3 도메인 서열의 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환은 A6085YF 또는 A6085YY이다.
일부 실시예에서, 제1 CH3 도메인 서열의 위치 T6086에서의 아미노산 치환은 T6086Y, T6086F 또는 T6086W이다. 일부 실시예에서, 제1 CH3 도메인 서열의 위치 T6086에서의 아미노산 치환은 T6086Y이다.
일부 실시예에서, 제2 CH3 도메인 서열의 위치 W6081에서의 아미노산 치환은 W6081T 또는 W6081L이다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 아미노산 치환 A6085YF 및 T6086W를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 아미노산 치환 W6081T 또는 W6081L을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 아미노산 치환 A6085YF 및 T6086W를 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 W6081T를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 제1 CH3 도메인 서열은 선택적으로 다음 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
(i) T6022V, T6022I, T6022L 및 T6022A로부터 선택된 위치 T6022에서의 아미노산 치환; 및/또는
(ii) H6005Y, H6005F, H6005M 및 H6005W로부터 선택된 위치 H6005에서의 아미노산 치환.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 제2 CH3 도메인 서열은 선택적으로 다음 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
(i) H6005Y, H6005F, H6005M 및 H6005W로부터 선택된 위치 H6005에서의 아미노산 치환; 및/또는
(ii) L6079V, L6079T, L6079A 및 L6079I로부터 선택된 위치 L6079에서의 아미노산 치환; 및/또는
(iii) I6088L, I6088A, I6088V 및 I6088T로부터 선택된 위치 I6088에서의 아미노산 치환; 및/또는
(iv) L6007F, L6007Y, L6007M, L6007W, L6007H 및 L6007I로부터 선택된 위치 L6007에서의 아미노산 치환.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 A6085YF, A6085YY, A6085YM, A6085YW 및 A6085YH로부터 선택된 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환 및 T6086Y, T6086F, T6086M, T6086W 및 T6086H로부터 선택된 위치 T6086에서의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 W6081T, W6081L, W6081A, W6081V 및 W6081I로부터 선택된 위치 W6081에서의 아미노산 치환을 포함한다.
(i) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 T6022V, T6022I, T6022L 및 T6022A로부터 선택된 위치 T6022에서의 아미노산 치환을 더 포함한다; 및/또는
(ii) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 H6005Y, H6005F, H6005M 및 H6005W로부터 선택된 위치 H6005에서의 아미노산 치환을 더 포함한다; 및/또는
(iii) 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 H6005Y, H6005F, H6005M 및 H6005W로부터 선택된 위치 H6005에서의 아미노산 치환을 더 포함한다; 및/또는
(iv) 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 H6005Y, H6005F, H6005M 및 H6005W로부터 선택된 위치 H6005에서의 아미노산 치환을 더 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 H6005Y, H6005F, H6005M 및 H6005W로부터 선택된 위치 H6005에서의 아미노산 치환을 더 포함한다; 및/또는
(v) 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 L6079V, L6079T, L6079A 및 L6079I로부터 선택된 위치 L6079에서의 아미노산 치환을 더 포함한다; 및/또는
(vi) 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 I6088L, I6088A, I6088V 및 I6088T로부터 선택된 위치 I6088에서의 아미노산 치환을 더 포함한다; 및/또는
(vii) 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 L6007F, L6007Y, L6007M, L6007W, L6007H 및 L6007I로부터 선택된 위치 T6022에서의 아미노산 치환을 더 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 CH3 도메인 서열의 위치 T6022에서의 아미노산 돌연변이는 T6022V, T6022I 및 T6022L로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 제1 CH3 도메인 서열의 위치 H6005에서의 아미노산 돌연변이는 H6005Y이다.
일부 실시예에서, 제2 CH3 도메인 서열의 위치 H6005에서의 아미노산 돌연변이는 H6005Y이다.
일부 실시예에서, 제2 CH3 도메인 서열의 위치 L6079에서의 아미노산 돌연변이는 L6079V 또는 L6079T이다.
일부 실시예에서, 제2 CH3 도메인 서열의 위치 I6088에서의 아미노산 돌연변이는 I6088L이다.
일부 실시예에서, 제2 CH3 도메인 서열의 위치 L6007에서의 아미노산 돌연변이는 L6007F이다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 변형된 CH3 도메인은 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 도입하기 위한 아미노산 치환을 더 포함한다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 변형된 CH3 도메인은 CH3 도메인에 하나의 이황화 결합을 도입하는 2개의 시스테인 치환을 더 포함한다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 변형된 CH3 도메인은 CH3 도메인에 이황화 결합을 도입하는 4개의 시스테인 치환을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 시스테인 치환은 하나의 CH3 도메인 서열에서 돌연변이 H6005C 및 다른 CH3 도메인 서열에서 돌연변이 P6010C를 포함한다. 일부 실시예에서, 시스테인 치환은 하나의 CH3 도메인 서열에서 돌연변이 H6005C 및 P6010C 및 다른 CH3 도메인 서열에서 돌연변이 P6010C 및 H6005C를 포함한다.
따라서, 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 1개 또는 2개의 도입된(즉, 비-천연) 이황화 결합을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하며, 여기서:
(i) 하나의 CH3 도메인 서열은 돌연변이 H6005C를 포함하고 다른 CH3 도메인 서열은 돌연변이 P6010C를 포함한다; 또는
(ii) 하나의 CH3 도메인 서열은 돌연변이 H6005C 및 P6010C를 포함하고 다른 CH3 도메인 서열은 돌연변이 P6010C 및 H6005C를 포함한다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 A6085YF, A6085YY, A6085YM, A6085YW 및 A6085YH로부터 선택된 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환 및 T6086Y, T6086F, T6086M, T6086W 및 T6086H로부터 선택된 위치 T6086에서의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 W6081T, W6081L, W6081A, W6081V 및 W6081I로부터 선택된 위치 W6081에서 아미노산 치환을 포함하며, 여기서
(i) IgA HetFc 작제물의 제1 CH3 도메인은 T6022V, T6022I, T6022L 및 T6022A로부터 선택된 위치 T6022에서의 아미노산 치환을 더 포함하고,
(ii) IgA HetFc 작제물의 제2 CH3 도메인은 L6079V, L6079T, L6079A 및 L6079I로부터 선택된 위치 L6079에서의 아미노산 치환; 및/또는 I6088L, I6088A, I6088V 및 I6088T로부터 선택된 위치 I6088에서의 아미노산 치환; 및/또는 L6007F, L6007Y, L6007M, L6007W, L6007H 및 L6007I로부터 선택된 위치 L6007에서의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하고,
(iii) 변형된 CH3 도메인은 상술한 바와 같이 1개 또는 2개의 도입된(즉, 비천연) 이황화 결합을 포함한다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 위치 A6085Y 및 T6086에서의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 위치 W6081에서의 아미노산 치환 및 위치 L6079 및 I6088 중 하나 또는 둘 다에서 선택적으로 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 CH3 돌연변이를 포함한다.
위치 A6085에서의 아미노산 치환은 A6085YF, A6085YY, A6085YM, A6085YW 및 A6085YH로부터 선택되고,
위치 T6086에서의 아미노산 치환은 T6086Y, T6086F, T6086M, T6086W 및 T6086H로부터 선택되고,
위치 W6081에서의 아미노산 치환은 W6081T, W6081L, W6081A, W6081V 및 W6081I로부터 선택되고,
위치 L6079에서의 선택적 아미노산 치환은 L6079V, L6079T, L6079A 및 L6079I로부터 선택되고,
위치 I6088에서의 선택적 아미노산 치환은 I6088L, I6088A, I6088V 및 I6088T로부터 선택된다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 표 8에 제시된 설계 중 임의의 하나에 대해 제시된 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 표 9에 제시된 설계 중 임의의 하나에 대해 제시된 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 표 10에 제시된 설계 중 임의의 하나에 대해 제시된 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환은 A6085YF, A6085YY 또는 A6085YW이다. 일부 실시예에서, 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환은 A6085Y, A6085YF 또는 A6085YY이다. 일부 실시예에서, 위치 T6086에서의 아미노산 치환은 T6086Y, T6086F 또는 T6086W이다. 일부 실시예에서, 위치 T6086에서의 아미노산 치환은 T6086Y이다. 일부 실시예에서, 위치 W6081에서의 아미노산 치환은 W6081T 또는 W6081L이다. 일부 실시예에서, 위치 L6079에서의 선택적 아미노산 치환은 L6079V 또는 L6079T이다. 일부 실시예에서, 위치 I6088에서의 선택적 아미노산 치환은 I6088L이다.
일부 실시예에서, IgA HetFc 작제물은, 위 실시예 중 하나에 기재된 바와 같이, 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 위치 A6085Y 및 T6086에서의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 위치 W6081에서의 아미노산 치환 및 위치 L6079 및 I6088 중 하나 또는 둘 다에서 선택적으로 아미노산 치환을 포함하는 변형된 CH3 돌연변이를 포함하고, 제1 CH3 도메인 서열 또는 제2 CH3 도메인 서열 또는 제1 및 제2 CH3 도메인 서열 모두는 H6005Y, H6005F, H6005M 및 H6005W로부터 선택된 위치 H6005에서 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 CH3 도메인 서열 또는 제2 CH3 도메인 서열 또는 제1 및 제2 CH3 도메인 서열 모두는 아미노산 치환 H6005Y를 더 포함한다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 A6085Y 및 T6086에서의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 위치 W6081에서 및 위치 L6007, L6079 및 I6088 중 하나 또는 둘 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하며, 여기서
위치 A6085에서의 아미노산 치환은 A6085YF, A6085YY, A6085YM, A6085YW 및 A6085YH로부터 선택되고,
위치 T6086에서의 아미노산 치환은 T6086Y, T6086F, T6086M, T6086W 및 T6086H로부터 선택되고,
위치 W6081에서의 아미노산 치환은 W6081T, W6081L, W6081A, W6081V 및 W6081I로부터 선택되고,
위치 L6007에서의 선택적 아미노산 치환은 L6007F, L6007Y, L6007M, L6007W, L6007H 및 L6007I로부터 선택되고,
위치 L6079에서의 선택적 아미노산 치환은 L6079V, L6079T, L6079A 및 L6079I로부터 선택되고,
위치 I6088에서의 선택적 아미노산 치환은 I6088L, I6088A, I6088V 및 I6088T로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환은 A6085YF, A6085YY 또는 A6085YW이다. 일부 실시예에서, 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환은 A6085Y, A6085YF 또는 A6085YY이다. 일부 실시예에서, 위치 T6086에서의 아미노산 치환은 T6086Y, T6086F 또는 T6086W이다. 일부 실시예에서, 위치 T6086에서의 아미노산 치환은 T6086Y이다. 일부 실시예에서, 위치 W6081에서의 아미노산 치환은 W6081T 또는 W6081L이다. 일부 실시예에서, 위치 L6007에서의 아미노산 치환은 L6007F이다. 일부 실시예에서, 위치 L6079에서의 아미노산 치환은 L6079V 또는 L6079T이다. 일부 실시예에서, 위치 I6088에서의 아미노산 치환은 I6088L이다.
일부 실시예에서, IgA HetFc 작제물은, 위 실시예 중 하나에 기재된 바와 같이, 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 위치 A6085Y 및 T6086에서의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이가 위치 W6081에서의 아미노산 치환 및 위치 L6007, L6079 및 I6088 중 하나 또는 둘 이상에서 선택적으로 아미노산 치환을 포함하는 변형된 CH3 돌연변이를 포함하고, 제1 CH3 도메인 서열 또는 제2 CH3 도메인 서열 또는 제1 및 제2 CH3 도메인 서열 모두는 H6005Y, H6005F, H6005M 및 H6005W로부터 선택된 위치 H6005에서 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 CH3 도메인 서열 또는 제2 CH3 도메인 서열 또는 제1 및 제2 CH3 도메인 서열 모두는 아미노산 치환 H6005Y를 더 포함한다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 아미노산 돌연변이가 변이체 v32516, v32517, v32518, v32521, v33330, v33331, v33332, v33333, v33334, v34688, v34689 또는 v34690 중 임의의 하나에 대해 표 6에 열거된 아미노산 치환인 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 아미노산 돌연변이가 변이체 v32521, v33333 또는 v33334 중 임의의 하나에 대해 표 6에 열거된 아미노산 치환인 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
예시적인 IgA HetFc 변이체
변이체 설계 CH3 도메인 서열 돌연변이
사슬 A 사슬 B
32516 스테릭 1 A6085YY_T6086L L6079T_W6081L_I6088L
32517 스테릭 2 A6085YY_T6086Y　 L6079T_W6081L_I6088L
32518 스테릭 3 A6085YF_T6086Y L6079V_W6081L_I6088L
32521 스테릭 6 A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
33330 스테릭 7 T6022V_A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
33331 스테릭 8 T6022L_A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
33332 스테릭 9 T6022I_A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
33333 스테릭 10 A6085YF_T6086Y L6007F_L6079V_W6081T_I6088L
33334 스테릭 11 H6005Y_A6085YF_T6086Y H6005Y_L6079V_W6081T_I6088L
34688 스테릭 6 + 이황화 H6005C_A6085YF_T6086Y P6010C_L6079V_W6081T_I6088L
34689 스테릭 6 + 이황화 P6010C_A6085YF_T6086Y H6005C_L6079V_W6081T_I6088L
34690 스테릭 6 + 2x 이황화 H6005C_P6010C_A6085YF_ T6086Y H6005C_P6010C_L6079V_W6081T_I6088L
특정 실시예에서, 본 발명의 IgA HetFc 작제물은 SEQ ID NO 15 및 20; SEQ ID NO. 16 및 20; SEQ ID NO. 17 및 21; SEQ ID NO. 17 및 23; SEQ ID NO. 24 및 23; SEQ ID NO. 25 및 23; SEQ ID NO. 26 및 23; SEQ ID NO. 17 및 27; SEQ ID NO. 28 및 29; SEQ ID NO. 30 및 31; SEQ ID NO. 32 및 33; 또는 SEQ ID NO. 34, 35에 의해 포함된 CH3 도메인 서열에 제시된 아미노산 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. IgA CH2 및 CH3 도메인은 본원의 표 2 및 4에 제공된 IgA 서열과 비교하여 표시된 SEQ ID NO 내에서 쉽게 식별할 수 있다.
변형된 CH2 도메인
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어 CH2 도메인의 하나 이상의 기능을 변경하는 돌연변이를 포함하는 변형된 CH2 도메인을 더 포함한다. 예시적인 돌연변이는 위치 C5092(WT IgA의 분비 구획에 부착됨)에서의 돌연변이 및 위치 N5120에서의 글리코실화 부위에서의 돌연변이를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시예에서, 변형된 CH2는 위치 C5092에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시예에서, 위치 C5092에서의 돌연변이는 C5092S, C5092A, C5092T, C5092N 및 C5092Q로부터 선택된 아미노산 치환이다. 일부 실시예에서, 위치 C5092에서의 돌연변이는 C5092S이다. 특정 실시예에서, 변형된 CH2 도메인은 위치 N5120에서의 글리코실화 부위에 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이는 글리코실화를 방지한다. 일부 실시예에서, 위치 N5120에서의 돌연변이는 아미노산 치환 N5120T이다.
특정 실시예에서, HetFc IgA 작제물은 위치 C5092, N5120, I5121 및 T5122 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함하는 변형된 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, HetFc IgA 작제물은 C5092S, N5120T, I5121L 및 T5122S로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, HetFc IgA 작제물은 아미노산 치환 C5092S, N5120T, I5121L 및 T5122S를 포함하는 변형된 CH2 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 변형된 CH2 도메인은 제1 및/또는 제2 Fc 폴리펩티드 사슬에서 비대칭 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 변형된 CH2 도메인은 CH2 도메인의 한 사슬이 Fc 수용체에 선택적으로 결합하도록 하는 비대칭 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시예에서, 변형된 CH2 도메인은 Fcα 수용체에 대한 선택적 결합을 촉진하는 비대칭 아미노산 돌연변이를 포함한다.
당업자는 본 발명의 IgA HetFc 작제물이 변경된 리간드(예: FcαRI) 결합 특성(결합 특성의 예에는 결합 특이성, 평형 해리 상수(KD), 해리 및 결합 속도(각각 koff 및 kon), 결합 친화도 및/또는 결합력이 포함되나 이에 제한되지 않음)을 가질 수 있고 특정 변경이 IgA HetFc 작제물의 최종 용도에 따라 다소 바람직할 수 있음을 이해할 것이다. 평형 해리 상수(KD)가 koff/kon으로 정의된다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 적용의 경우, 일반적으로 낮은 KD를 갖는 IgA HetFc 작제물이 높은KD를 갖는 IgA HetFc 작제물보다 바람직할 수 있음이 이해된다. 그러나 어떤 경우에는 kon 또는 koff 값이 KD 값보다 더 관련이 있을 수 있다. 당업자는 주어진 IgA HetFc 작제물 적용에 대해 어떤 동역학 매개변수가 가장 중요한지 결정할 수 있다.
특정 실시예에서, IgA HetFc는 Fcα수용체에 대한 결합을 감소시키거나 제거하는 치환을 포함한다(예: Carayannopoulos, 1996, JEM, 183:1579-1586; Bakema, 2006, J Immunol, 176:3603-3610, https://www.pnas.org/content/115/38/E8882). Fcα수용체에 대한 결합이 감소되거나 제거된 IgA HetFc 작제물은 예를 들어 IgA HetFc 작제물이 호중구의 활성화를 피하면서 이를 필요로 하는 대상체에서 사이토카인을 결합하고 제거할 수 있는 사이토카인 방출 증후군의 설정과 같이 호중구의 활성화가 바람직하지 않은 설정에서 유용할 수 있다. FcαRI 결합 부위가 하나만 있는 IgA HetFc는 FcaRI 결합의 원자가에 대한 IgA 의존성 호중구 활성화의 의존성을 조사하는 데 유용할 수 있다.
IgA HetFc는 단일 Fc에서 FcaRI 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합할 수 있는 분자를 생성하는 데 유용할 수 있다. FcaRI 및 FcRn에 대한 결합 부위가 각각 IgA 및 IgG의 구조적으로 동등한 영역에 위치하기 때문에(Kelton, W. et al., 2014, Chem Biol 21:1603-1609, https://www.sciencedirect.com/ science/article/ pii/S1074552114004098? via %3Dihub), Fc의 사슬에 도입하는 것은 상호 배타적이며 이종이량체 Fc가 필요하다. 하나의 사슬에 접목된 FcRn 결합 부위를 가진 IgA HetFc는 FcaRI를 통해 호중구를 활성화할 수 있을 뿐만 아니라 FcαRn과의 상호작용 도입으로 인해 증가된 반감기를 가질 수 있어 유용하며, 따라서 치료 효과를 위해 IgA를 사용하는 경우 알려진 반감기 제한을 해결한다.
IgA HetFc는 1가 방식으로 수용체 또는 정제 수지 또는 검출 분자에 결합할 수 있는 분자를 생성하는 데 더 유용할 수 있다. 마찬가지로, Fc의 상호 배타적인 영역에 존재하는 수용체 결합 부위, 정제 또는 검출 부위의 조합으로 IgA HetFc 기반 분자를 생성하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 예 중 하나는 고유한 생물학적 활성을 갖는 Fcγ 수용체 결합 프로필을 생성하기 위해 Fc의 2개 사슬에 상이한 Fcγ 수용체 결합 부위를 갖는 이전에 기술된 IgG/A 하이브리드 분자(Kelton, W. et al., 2014, Chem Biol 21:1603-1609, Borrok, M. J. et al., 2015, mAbs, 7:4, 743-751, DOI: 10.1080/19420862.2015.1047570)를 장비하는 것이다. 수용체 결합 부위는 FcαR, FcRn, Fcγ 수용체, C1q, 분비 성분, SSL7, 연쇄상구균 IgA 결합 단백질, N. 메닌지티디스 2형 IgA1 프로테아제, H. 인플루엔자 2형 IgA1 프로테아제를 포함한다. 정제 및 검출 부위에는 단백질 A, 폴리히스티딘 태그, FLAG 태그 및 Myc 태그가 포함된다. 예를 들어, 단백질 A 결합 부위를 도입하는 것은 단백질 A 결합의 결여로 인해 WT IgA Fc에 적합하지 않은 IgG 기반 치료제에 대해 확립되고 널리 사용되는 기술을 사용하여 IgA HetFc 기반 분자를 정제하는 데 사용될 수 있다.
표적 결합 도메인
본원에 기재된 IgA HetFc는 다양한 상이한 결합 도메인 또는 다른 모이어티가 융합될 수 있는 이종이량체 스캐폴드로서 기능할 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명은 IgA HetFc에 융합된 하나 이상의 표적 결합 도메인을 포함하는 IgA HetFc 결합 단위인 IgA HetFc 작제물에 관한 것이다. IgA HetFc 결합 단위에 사용하기 위한 표적 결합 도메인은 관심 표적에 특이적으로 결합하는 다양한 단백질성 모이어티를 포함한다. 이 문맥에서 "구체적으로 결합하다"는 결합이 원하는 표적에 대해 선택적이고 원치 않거나 비특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 표적에 특이적으로 결합하는 결합 도메인의 능력은 당업자에게 친숙한 다양한 기술, 예를 들어, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), SPR(표면 플라스몬 공명) 기술 (예: BIAcore™ 기구에서 분석)(Liljeblad et al, Glyco J 17, 323-329 (2000) 또는 전통적인 결합 분석(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정될 수 있다.
표적 결합 도메인의 예에는 수용체, 수용체 단편(예: 세포외 부분), 리간드, 사이토카인 및 항체의 항원-결합 단편이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 항원-결합 도메인, 예를 들어 수용체 또는 항체 단편인 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 항원-결합 항체 단편인 하나 이상의 표적 결합 도메인을 포함한다. 이러한 항원-결합 항체 단편은 IgA 또는 IgG, IgM, IgD 또는 IgE와 같은 다른 항체 동종형으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시예에서, 항원-결합 항체 단편은 합성, 키메라 또는 인간화될 수 있다. 항원-결합 항체 단편은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 또는 초가변 영역(VL, VH), 가변 단편(Fv), Fab' 단편, F(ab') 2 단편, Fab 단편, 단일쇄 항체(scAb), 단일쇄 가변 영역(scFv), VHH, 상보성 결정 영역(CDR), 도메인 항체(dAb), 단일 도메인 중쇄 면역글로불린 및 단일 도메인 경쇄 면역글로불린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항체의 항원-결합 부위는 일반적으로 항원에 대한 결합 부위의 친화도에 다양한 정도로 기여하는 6개의 CDR을 함유한다. 3개의 중쇄 가변 도메인 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3개의 경쇄 가변 도메인 CDR(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)이 존재한다. CDR 및 프레임워크 구역(framework region: FR)의 정도는 항체/항원 복합체로부터 서열 및/또는 구조 정보 중에서 구역이 가변성에 따라 정의된 아미노산 서열의 파일로 된 데이터베이스에 대한 비교에 의해 결정된다. 또한 본 개시내용의 범위 내에 포함되는 것은 더 적은 수의 CDR로 구성된 기능적 항원-결합 부위(즉, 결합 특이성이 3, 4 또는 5개의 CDR에 의해 결정되는 경우)이다. 전체 6개 CDR 세트 미만이면 일부 결합 표적에 결합하기에 충분할 수 있다. 따라서, 일부 경우에, VH 또는 VL 도메인의 CDR만으로는 특이적 결합에 충분할 것이다. 또한, 특정 항체에는 항원에 대한 비-CDR 연관 결합 부위가 있을 수 있다. 그러한 결합 부위는 본원에서 구체적으로 고려된다. 항원-결합 항체 단편은 단일 종에서 유래하거나 키메라 또는 인간화될 수 있다.
특정 실시예에서, 결합 도메인은 항원-결합 수용체 단편, 예를 들어 T 세포 수용체(TCR)의 MHC-펩티드 복합체 결합 단편을 포함한다. 본원의 IgA HetFc 작제물에 사용하기 위한 TCR 단편은 αβTCR 또는 γδ 이종이량체의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본원의 IgA HetFc 작제물은 적어도 TCR α 사슬 가변 도메인 및 TCR β 사슬 가변 도메인을 포함하는 αβTCR 이종이량체의 항원-결합 단편을 포함할 수 있어 αβTCR 단편이 동족 MHC/펩티드에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 항원-결합 TCR 단편은 단일 사슬 TCR(scTCR) 또는 가용성 TCR 도메인이다(예: International Patent Publication Nos. WO 1999/018129 and WO 2009/117117 참고). 다른 TCR 항원-결합 단편은 당업계에 공지되어 있다(예: Wilson & Garcia, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:839-848; van Boxel, et al., 2009, J. Immunol. Methods, 350:14-21; Stone, et al., 2012, Methods Enzymol., 503:189-222 and Li, et al., 2005, Nat. Biotechnol., 23:349-354).
다른 표적 결합 도메인에는 면역조절 Ig 도메인, 비-Ig 바이러스 수용체 디코이, 안티칼린(anticalin), 아필린(affilin), 아피바디(affibody) 분자, 아피머(affimer), 아피틴(affitin), 알파바디(alphabody), 아비머(avimer), DARPin, 파이노머(fynomer), 쿠니츠 도메인 펩티드(kunitz domain peptide), 모노바디(monobody)와 같은 항체 결합 및 구조를 모방한 비-면역글로불린 단백질 및 SpA, GroEL, 피브로넥틴, 리포칼린 및 CTLA4 스캐폴드와 같은 다른 조작된 스캐폴드를 기반으로 한 결합 도메인이 포함된다. 표적 결합 도메인의 추가 예에는 원하는 수용체에 대한 리간드, 수용체의 리간드 결합 부분, 렉틴 및 하나 이상의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 펩티드가 포함된다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 치료 또는 진단 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위에 의해 포함된 표적 결합 도메인은 단백질, 지질 또는 다당류와 같은 세포 표면 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위에 의해 포함된 결합 도메인은 종양 세포, 바이러스 감염 세포, 박테리아 감염 세포, 손상된 적혈구, 동맥 플라크 세포, 염증 또는 섬유성 조직 세포에서 발현되는 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위에 의해 포함된 표적 결합 도메인은 면역 반응 조절제이다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위에 의해 포함된 표적 결합 도메인은 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위에 의해 포함된 표적 결합 도메인은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위에 의해 포함된 표적 결합 도메인은 면역 체크포인트 단백질이거나 이에 특이적으로 결합한다.
IgA HetFc의 이종이량체 성질의 결과로, 다양한 결합 도메인이 Fc 이종이량체의 하나 또는 두 사슬에 융합되어 광범위한 기능적 다중특이적 IgA HetFc 결합 단위를 생성할 수 있다. 이러한 다중특이적 IgA HetFc 결합 단위의 비제한적 예시는 도 7에 제시되어 있다. 또한, 고차 IgA HetFc 다량체는 예를 들어 J 사슬과 결합하여 여러 IgA HetFc 결합 단위를 함께 결합함으로써 생성될 수 있다. 다량체 IgA 구조는 일반적으로 J 사슬에 의해 연결된 꼬리-꼬리 구성의 IgA 이량체와 테일피스-테일피스 상호작용을 포함하며, 추가 IgA 단량체는 테일피스-테일피스 매개된 이황화 결합을 통해 이량체에 연결되며 복합체 내의 J 사슬에 대한 직접적인 접촉은 없다(예를 들어, Kumar, et al., 2020, Science, 10.1126/science.aaz5807 참조). 이러한 IgA HetFc 다량체의 비제한적인 예시적 예가 도 8에 도시되어 있다.
본 개시내용에 따른 IgA HetFc 결합 단위는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적일 수 있거나 더 큰 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 IgA HetFc 결합 단위는 원하는 표적 분자의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나, 상이한 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있거나, 표적 분자뿐 아니라 이종 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질과 같은 이종 에피토프에 결합할 수 있다.
일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 각각 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 표적 결합 도메인을 포함한다. 이와 관련하여, 결합 도메인은 동일한 표적에 결합할 수 있지만, 동일한 표적 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 각각 상이한 표적에 결합할 수 있다.
특정 실시예에서, IgA Fc 결합 단위는 하나의 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 A)에 융합된 표적 결합 도메인을 포함하고 다른 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 B)에 융합된 표적 결합 도메인이 없거나 다른 표적 결합 도메인을 포함한다. 따라서 IgA HetFc의 사슬 A와 사슬 B는 Fc 영역이 다르며(위에서 설명한 바와 같이 이종이량체 형성을 유도하기 위해 CH3 도메인에 돌연변이가 있음) 결합 특이성도 다를 수 있다.
용어 IgA HetFc 결합 단위는 본원에 기재된 바와 같은 이종이량체 Fc(예를 들어, 각각이 적어도 IgA CH3 도메인을 포함하는 한 쌍의 IgA Fc 폴리펩티드)를 갖는 IgA HetFc 작제물을 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 여기서 적어도 하나의 IgA Fc 폴리펩티드는 표적 결합 도메인에 융합된다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 두 Fc 폴리펩티드는 각각 독립적으로 표적 결합 도메인에 융합된다. 도 7에 도시된 바와 같이, IgA HetFc 결합 단위는 다양한 상이한 구성으로 HetFc에 융합된 1 내지 4개의 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, IgA HetFc에 융합된 표적 결합 도메인에 하나 이상의 추가 표적 결합 도메인을 융합함으로써 추가 표적 결합 도메인이 IgA HetFc 결합 단위에 포함될 수 있다.
본 개시내용에 따른 IgA HetFc 결합 단위는 단일 종으로부터 유래될 수 있거나, 키메라 또는 인간화될 수 있다. 예를 들어, IgA Fc 폴리펩티드는 인간일 수 있고 표적 결합 도메인은 다른 포유동물(예: 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류 등)과 같은 다른 종으로부터 유래될 수 있다.
도 7은 표적 결합 도메인(IgA HetFc 결합 단위)을 포함하는 IgA HetFc 작제물의 예시적인 구성을 보여주는 다이어그램이다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 IgA HetFc에 융합된 1, 2, 3 또는 4개의 표적 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 하나의 Fc 폴리펩티드가 표적 결합 도메인에 융합되고 다른 Fc 폴리펩티드가 융합되지 않는다는 점에서 외팔 형식을 갖는다.
일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 하나의 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 A)의 N-말단 끝에 융합된 하나의 표적 결합 도메인 및 다른 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 B)의 N-말단 끝에 융합된 하나의 표적 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 7b, 도 7c 참조). 일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 하나의 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 A)의 N-말단 끝에 융합된 하나의 표적 결합 도메인 및 다른 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 B)의 C-말단 끝에 융합된 하나의 표적 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 7f 참조). 일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 하나의 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 A)의 N-말단 끝에 융합된 하나의 표적 결합 도메인 및 다른 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 B)의 C-말단 끝에 융합된 하나의 표적 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 7d 참조). 일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 하나의 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 A의 N-말단 끝 및 C-말단 끝에)의 두 끝에 융합된 표적 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 7e 참조). 일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 하나의 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 A의 N-말단 끝 및 C-말단 끝에)의 두 끝에 융합된 표적 결합 도메인 및 다른 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 B)의 한 끝(N-말단 끝 또는 C-말단 끝)에 융합된 표적 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 7g 참조). 일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 하나의 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 A의 N-말단 끝 및 C-말단 끝에)의 두 끝에 융합된 표적 결합 도메인 및 다른 Fc 폴리펩티드(예: 사슬 B의 N-말단 끝 또는 C-말단 끝)의 두 끝에 융합된 표적 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 7h 참조). 동시에(in tandem) 융합된 추가 표적 결합 단위를 포함하는 다른 구성도 고려된다.
일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 이중특이적이며, 즉 각각 상이한 특이성을 갖는 2개의 표적 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 삼중특이적이며, 즉 각각 상이한 특이성을 갖는 3개의 표적 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, IgA HetFc 결합 단위는 사중특이적이며, 즉 각각 상이한 결합 특이성을 갖는 4개의 표적 결합 도메인을 포함한다. 일부 표적 결합 도메인을 동시에 포함함으로써 더 큰 특이성을 달성할 수 있다. 일부 실시예에서, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 IgA HetFc 결합 단위의 표적 결합 도메인 중 적어도 일부는 동일한 표적에 결합하지만 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 IgA HetFc 결합 단위의 표적 결합 도메인 중 적어도 일부는 동일한 표적에 결합하지만, 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
IgA HetFc 결합 단위의 특이성은 그것이 함유하는 표적 결합 도메인의 수와 반드시 상관관계가 있는 것은 아니라는 점에 유의해야 한다. 예를 들어 IgA HetFc 결합 단위는 두 개의 표적 결합 도메인을 포함할 수 있지만, 두 표적 결합 도메인이 동일한 표적에 결합하는 경우 여전히 단일특이적일 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 2개 이상의 IgA HetFc 결합 단위를 포함하는 고차 IgA HetFc 다량체를 제공한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 고차 IgA HetFc 다량체는 2개, 4개 또는 5개의 IgA HetFc 결합 단위를 포함한다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 다량체에 포함된 IgA HetFc 결합 단위 중 적어도 2개는 J 사슬에 의해 테일피스를 통해 연결된다. 본원에 개시된 IgA HetFc 다량체에서, J 사슬은 전장 천연 J 사슬일 수 있지만, J 사슬이 기능을 유지하는 한, 특히 J 사슬 단편을 포함하는 치환, 삽입, 결실, 절단과 같은 아미노산 변경을 포함할 수도 있다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 다량체에 포함된 J 사슬은 국제 특허 공개 번호 WO 2015/153912에 기재된 바와 같은 변형된 J 사슬이다. 특정 실시예에서, J 사슬은 SEQ ID NO:48에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
위에서 언급한 바와 같이, 본원에 기재된 IgA HetFc 결합 단위는 다량체 및 다중특이적인 IgA HetFc 다량체의 조립을 가능하게 한다. IgA HetFc 다량체는 친화력이 낮은 표적 결합 도메인의 겉보기 친화도를 증가시키고 클러스터링 및 특이성, 증가된 원자가와 관련된 관련 기능을 증가시킬 수 있는 미세 조정 결합도 효과(avidity effect)에 대한 잠재력을 가지고 있다. 도 8은 IgA HetFc 다량체의 예시적인 구성을 나타내는 도면이다.
일부 실시예에서, IgA HetFc 다량체는 J 사슬에 의해 결합된 2개의 IgA HetFc 결합 단위를 포함한다는 점에서 "이량체"일 수 있다. IgA HetFc 결합 단위는 단일특이적일 수 있거나 이중특이적(예: 도 8a 참조) 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 이량체 IgA HetFc 다량체는 2개의 이중특이적 IgA HetFc 결합 단위를 포함하고, 각각의 결합 단위는 동일한 결합 특이성(AB, AB)을 갖는다. 일부 실시예에서, 본 발명의 이량체 IgA HetFc 다량체는 2개의 이중특이적 IgA HetFc 결합 단위를 포함하고, 2개의 결합 단위 중 적어도 하나는 상이한 결합 특이성(예: AB, BC 또는 AC, BC 또는 AB, CD)을 갖는다. 따라서, 특정 실시예에서, 2개의 결합 단위 각각은 2개의 상이성을 가지고, 이것은 동일하거나(AB, AB) 상이(예: AB, CD 또는 AB, AC)할 수 있다.
일부 실시예에서, IgA HetFc 다량체는 4개의 IgA HetFc 결합 단위를 포함하고 그중 적어도 2개는 J 사슬에 의해 결합된다는 점에서 "사량체"일 수 있다. IgA HetFc 결합 단위는 단일특이적일 수 있거나 이중특이적(예: 도 8b 참조) 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 사량체 IgA HetFc 다량체는 4개의 이중특이적 결합 단위를 포함하고, 각각의 결합 단위는 동일한 결합 특이성(AB, AB, AB, AB)을 갖는다. 단일특이적 또는 이중특이적이고 상이한 결합 특이성을 갖는 IgA HetFc 결합 단위를 포함하는 사량체 IgA HetFc 다량체는 또한 일부 실시예에서 고려된다.　
일부 실시예에서, IgA HetFc 다량체는 5개의 IgA HetFc 결합 단위를 포함하고 그중 적어도 2개는 J 사슬에 의해 결합된다는 점에서 "오량체"일 수 있다. IgA HetFc 결합 단위는 단일특이적일 수 있거나 이중특이적(예: 도 8c 참조) 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 오량체 IgA HetFc 다량체는 5개의 이중특이적 결합 단위를 포함하고, 각각의 결합 단위는 동일한 결합 특이성(AB, AB, AB, AB, AB)을 갖는다. 단일특이적 또는 이중특이적이고 상이한 결합 특이성을 갖는 IgA HetFc 결합 단위를 포함하는 오량체 IgA HetFc 다량체는 또한 일부 실시예에서 고려된다.　
용어 "원자가"는 본원에 사용되는 바와 같이 IgA HetFc 작제물에서 특정한 수의 결합 부위의 존재를 의미한다. 예를 들어, 용어 "2가", "4가" , "6가", "8가" 및 "10가"는 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 6개의 결합 부위, 8개의 결합 부위 및 10개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 따라서, 본원의 도 8을 참조하면, 2개의 이중특이적 결합 단위를 포함하는 도 8a에 나타낸 이량체 IgA HetFc 다량체는 4가이고; 도 8b에 나타낸 사량체 IgA HetFc 다량체는 8가이고(즉, 4개의 이중특이적 결합 단위를 포함함), 도 8c에 나타낸 오량체 IgA HetFc 다량체는 10가(즉, 5개의 이중특이적 결합 단위를 포함함)이다. 유사하게, 도 7을 참조하면, 도 7b, 도 7c, 도 7d, 도 7e 및 도 7f에 나타낸 IgA HetFc 결합 단위는 2가이고, 도 7g에 나타낸 IgA HetFc 결합 단위는 3가이고, IgA HetFc 결합 단위는 도 7h에서는 4가이다.
IgA HetFc 결합 단위 및 다량체에서, 상이한 구성요소 또는 도메인은 서로 직접적으로 융합될 수 있거나(즉, 링커 없이) 하나 이상의 구성요소 또는 도메인이 펩티드 링커를 통해 간접적으로 인접한 구성요소 또는 도메인에 융합될 수 있다. 다성분 단백질의 구성요소를 연결하는데 적합한 펩티드 링커는 당업계에 잘 알려져 있으며, 각각이 의도한 기능을 여전히 수행할 수 있도록 구성요소의 배열을 허용하도록 선택된다.
펩티드 링커는 일반적으로 약 2 내지 약 150개의 아미노산 길이이다. 유용한 링커는 글리신-세린(GlySer) 링커를 포함하며, 이는 당업계에 잘 알려져 있고 다양한 순서로 조합된 글리신 및 세린 단위를 포함한다. 예는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n 및 (GGGGS)n을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 n은 적어도 1의 정수, 일반적으로 1 내지 약 10, 예컨대 1 내지 약 8, 1 내지 약 6 또는 1 내지 약 5의 정수이며; (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1, (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n 또는 (Gly4Ser)n, 여기서 n은 1 내지 5의 정수이다. 다른 유용한 링커는 면역글로불린 힌지 서열로부터 유래된 서열을 포함한다. 링커는 4개의 IgG 클래스 중 임의의 하나 또는 TCR로부터의 힌지 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있고 선택적으로 추가 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 면역글로불린 힌지 서열 및 글리신-세린 서열의 일부를 포함할 수 있다.비제한적 예는 약 10개의 아미노산 길이인 상기 기재된 것과 같은 GlySer 링커 서열이 뒤따르는 IgG1 힌지의 대략 처음 15개 잔기를 포함하는 링커이다.
접합체(Conjugates)
본 개시내용의 특정 실시예는 하나 이상의 활성제, 예컨대 치료제, 진단제 또는 표지물질에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 IgA HetFc 작제물(예: IgA HetFc 스캐폴드, IgA HetFc 결합 단위 또는 IgA HetFc 다량체)을 포함하는 접합체에 관한 것이다.
치료제의 예는 항대사제, 알킬화제, 안트라사이클린, 항생제, 항유사분열제, 독소, 세포사멸제, 혈전제, 항혈관형성제, 생물학적 반응 조절제, 성장 인자, 방사성 물질 및 방사성 금속 이온 접합에 유용한 거대고리 킬레이터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 진단제의 예는 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질과 같은 다양한 조영제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 표지물질의 예는 효소, 보결 분자단(prosthetic groups), 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
선택된 활성제의 IgA HetFc 작제물에 대한 접합(conjugation)은 다양한 방식으로 달성될 수 있으며 직접적이거나 링커를 통해 이루어질 수 있다. 활성제의 접합을 위한 링커는 하나 이상의 활성제를 IgA HetFc 작제물에 연결할 수 있는 이작용성 또는 다기능성 모이어티이다. 이작용성(또는 1가) 링커는 단일 활성제를 작제물의 단일 부위에 연결하는 반면 다기능(또는 다가) 링커는 하나 이상의 활성제를 작제물의 단일 부위에 연결한다. 하나의 활성제를 IgA HetFc 작제물 상의 하나 이상의 부위에 연결할 수 있는 링커는 또한 다기능인 것으로 간주될 수 있다.
접합은 예를 들어 IgA HetFc 작제물의 표면 라이신, IgA HetFc 작제물의 산화된 탄수화물에 대한 환원적 결합을 통해, 또는 사슬간 이황화 결합을 감소시켜 유리된 IgA HetFc 작제물의 시스테인 잔기를 통해 달성될 수 있다. 또는, 부위 특이적 접합을 가능하게 하는 반응성 핸들을 제공하는 부가적인 시스테인 잔기(예: 미국 특허 번호 7,521,541; 8,455,622 및 9,000,130 참조) 또는 비-천연 아미노산, 예컨대 셀레노메티오닌, p-아세틸페닐알라닌, 포르밀글리신 또는 p-아지도메틸-L-페닐알라닌(예: Hofer et al., 2009, Biochemistry, 48:12047-12057; Axup et al., 2012, PNAS, 109:16101-16106; Wu et al., al ., 2009, PNAS, 106:3000-3005;Zimmerman et al., 2014, Bioconj. Chem., 25:351-361)을 포함하도록 IgA HetFc 작제물을 변형하여 접합을 달성할 수 있다.
면역글로불린을 포함하여 다양한 제제를 단백질에 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예: Bioconjugate Techniques(G.T. Hermanson, 2013, Academic Press) 참조).
폴리뉴클레오티드 및 IgA HetFc 작제물의 제조 방법
본원에 기재된 IgA HetFc 작제물은 표준 재조합 방법을 사용하여 제조할 수 있다. IgA HetFc 작제물의 재조합 생산은 일반적으로 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터 또는 벡터들로 클로닝하고, 벡터(들)를 IgA HetFc 작제물의 발현을 위해 적합한 숙주 세포에 도입하는 것을 포함한다. 단백질의 재조합 생산은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1987 & updates), John Wiley & Sons, New York, NY; and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)에 기재된 바와 같은 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
따라서 본 개시내용의 특정 실시예는 본원에 기재된 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세트에 관한 것이다. 이 문맥에서 폴리뉴클레오티드는 IgA HetFc 작제물의 전부 또는 일부를 암호화할 수 있다.
용어 "핵산", "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체 중 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 게놈, cDNA, RNA, 반합성 또는 합성 기원, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
IgA HetFc 작제물을 "암호화"하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓일 때 생체 내에서 폴리펩티드로 전사되고(DNA의 경우) 번역되는(mRNA의 경우) 폴리뉴클레오티드이다. 암호화 서열의 경계는 5'(아미노) 말단의 시작 코돈과 3'(카복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 수 있다.
IgA HetFc 작제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 표준 결찰 기술을 사용하여 직접 또는 하나 이상의 서브클로닝 단계 후에 적합한 발현 벡터 또는 벡터들에 삽입될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 박테리오파지, 배큘로바이러스, 레트로바이러스 또는 DNA 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터는 일반적으로 이용될 특정 숙주 세포에서 기능하도록 선택되며, 즉 벡터는 폴리뉴클레오티드(들)의 증폭 및/또는 발현을 허용하는 숙주 세포 기구와 호환성이다. 이와 관련하여 적절한 벡터 및 숙주 세포 조합의 선택은 당업자의 통상적인 기술 범위 내에 있다.
본 개시내용의 특정 실시예는 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예: 발현 벡터)에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드(들)는 단일 벡터에 의해 또는 하나 초과의 벡터에 의해 포함될 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 멀티시스트로닉 벡터에 의해 포함된다.
일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 유지 및 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 하나 이상의 조절 요소를 함유할 것이다. 이러한 조절 요소의 예는 프로모터, 인핸서 서열, 복제 기점, 전사 종결 서열, 공여자 및 수용자 스플라이스 부위, 폴리펩티드 분비를 위한 리더 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 폴리링커 영역 및 선택가능한 마커를 포함한다.
조절 요소는 동종(즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주로부터 유래), 이종(즉 숙주 세포 종 또는 균주 이외의 종으로부터 유래), 잡종(즉, 하나 초과의 공급원의 조절 요소의 조합) 또는 합성일 수 있다. 이와 같이, 조절 요소의 공급원은 플랭킹 서열(flanking sequence)이 사용되는 숙주 세포의 기구에서 기능하고 이에 의해 활성화될 수 있다면 임의의 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다.
선택적으로 벡터는 "태그"-암호화 서열을 포함할 수도 있다. "태그"-암호화 서열은 polyHis(예: 6xHis), FLAG®, HA(헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스), myc, 금속-친화성, 아비딘/스트렙타비딘, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 또는 비오틴 태그와 같이, 이종 펩티드 서열을 암호화하는 암호화 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치한 핵산 서열이다. 이 태그는 일반적으로 발현된 단백질에 융합된 채 유지되고 폴리펩티드의 친화성 정제 또는 검출을 위한 수단으로 역할을 할 수 있다. 선택적으로, 태그는 절단을 위한 특정 펩티다제를 사용하는 것과 같은 다양한 수단에 의해 정제된 폴리펩티드로부터 후속적으로 제거될 수 있다.
다양한 발현 벡터는 상업적 공급처로부터 쉽게 구할 수 있다. 또는, 원하는 조절 요소를 모두 함유하는 상업적 벡터를 사용할 수 없는 경우, 발현 벡터는 상업적으로 입수가능한 벡터를 시작 벡터로 사용하여 구성될 수 있다. 원하는 조절 요소 중 하나 이상이 이미 벡터에 존재하지 않는 경우, 이들은 개별적으로 얻어 벡터에 결찰될 수 있다. 다양한 조절 요소를 얻는 방법과 공급처는 당업자에게 잘 알려져 있다.
IgA HetFc 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 발현 벡터(들)의 작제 후, 벡터(들)는 증폭 및/또는 단백질 발현을 위해 적합한 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 발현 벡터의 선택된 숙주 세포로의 형질전환은 형질감염, 감염, 인산칼슘 공침전, 전기영동, 미세주입, 리포펙션, DEAE-덱스트란 매개 형질감염 및 다른 알려진 기술을 포함한 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로 사용될 숙주 세포 유형의 함수일 것이다. 이러한 방법 및 다른 적합한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예: Sambrook, 등, 본서 참조).
숙주 세포는 적절한 조건 하에 배양될 때, 벡터에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현하고 폴리펩티드는 이어서 배지로부터(숙주 세포가 폴리펩티드를 분비하는 경우) 또는 이를 생산하는 숙주 세포로부터 직접(폴리펩티드가 분비되지 않는 경우) 수집될 수 있다. 숙주 세포는 원핵성(예: 박테리아 세포) 또는 진핵성(예: 효모, 진균, 식물 또는 포유류 세포)일 수 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 원하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 또는 필요한 폴리펩티드 변형(예: 글리코실화 또는 인산화) 및 생물학적 활성 분자로의 접힘(folding) 용이성과 같은, 다양한 인자를 고려하여 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
따라서 본 개시내용의 특정 실시예는 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들) 또는 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다.
예를 들어, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 글리코실화된 경로가 "인간화"된 진균 및 효모 균주를 포함하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다(예를 들어, Gerngross,　2004, Nat. Biotech.,　22:1409-1414, and Li et al.,　2006, Nat. Biotech.,　24:210-215 참조). 식물 세포 또한 숙주 세포로서 활용될 수 있다(예를 들어, PLANTIBODIES™ 기술을 설명하는 미국 특허 번호 5,959,177; 6,040,498; 6,420,548; 7,125,978 및 6,417,429 참조).
일부 실시예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 다양한 포유류 세포주가 숙주 세포로 사용될 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7), 인간 배아 신장 세포주 293(예를 들어, Graham, 등, 1977, J. Gen Virol., 　36:59에 기재된 바와 같은 HEK293 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, Mather, 　(1980), Biol. Reprod., 23:243-251에 기재된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포(HeLa), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들어, Mather, 등, 1982, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68에 기재된 바와 같음), MRC 5 세포, FS4 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub, 등, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA　, 77:4216에기재된 바와 같은 DHFR- CHO 세포 포함) 및 골수종 세포주(예컨대 Y0, 　NS0 및 Sp2/0)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, Yazaki and Wu, 2003, Methods in Molecular Biology, Vol. 248, pp. 255-268 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, 뉴저지주 토토와)을 참조한다.
본 개시내용의 특정 실시예는 본원에 기재된 IgA HetFc 작제물의 제조 방법에 관한 것으로서, 예를 들어 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 하나 이상의 벡터 형태의 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 및 암호화된 IgA HetFc 작제물의 발현에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일반적으로, IgA HetFc 작제물은 발현 후에 숙주 세포로부터 단리되고 선택적으로 정제될 수 있다. 발현된 단백질을 단리 및 정제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 표준 정제 방법에는 예를 들어, 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화성, 사이징(sizing), 겔 여과 또는 역상과 같은 크로마토그래피 기술이 포함되며, 이는 FPLC, MPLC 및 HPLC와 같은 시스템을 사용하여 대기압 또는 중압 또는 고압에서 수행될 수 있다. 다른 정제 방법은 전기영동, 면역학적, 침전, 투석 및 크로마토포커싱 기술을 포함한다. 단백질 농축과 함께 한외여과 및 정용여과(diafiltration) 기술 또한 유용할 수 있다.
다양한 천연 단백질이 항체의 Fc 영역에 결합하는 것으로 당업계에 공지되어 있으며, 따라서 이러한 단백질은 Fc-함유 단백질의 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 단백질 A 및 G는 Fc 영역에 결합한다. 정제는 종종 상기 기재된 바와 같은 특정 융합 파트너 또는 친화성 태그에 의해 가능할 수 있다. 예를 들어, 항체는 GST 융합이 사용되는 경우 글루타티온 수지를 사용하여, His-태그가 사용되는 경우 Ni+2 친화성 크로마토그래피를 사용하여, 또는 플래그-태그가 사용되는 경우 고정된 항-플래그 항체를 사용하여 정제될 수 있다. 유용한 정제 기술의 예는 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990), 및 Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY (1994)에 기재되어 있다. 필요한 정제의 정도는 IgA HetFc 작제물의 사용에 따라 달라질 것이다. 일부 경우에, 정제가 필요하지 않을 수 있다.
특정 실시예에서, 본원의 IgA HetFc 작제물은 친화성 크로마토그래피, 비환원성 CE-SDS에 의한 친화성 크로마토그래피, 친화성 정제(단백질 A 정제 컬럼, CaptureSelect™ IgA 친화성 정제) 및 크기 배제 크로마토그래피, 예를 들어 UPLC-SEC를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 하나 이상의 정제 방법을 사용하여 정제된다(실시예 1~6 또한 참조).
번역 후 변형
특정 실시예에서, 본원에 기술된 IgA HetFc 작제물은 번역 후 변형될 수 있다.
용어 "번역 후 변형된"은 "번역 후 변형"과 같은 이의 문법적 변형은 아미노산이 폴리펩티드 사슬에 혼입된 후 이러한 아미노산에 발생하는 천연 또는 비천연 아미노산 변형을 의미한다. 이 용어는, 단지 예로서, 공-번역 생체내 변형, 공-번역 시험관내 변형(예컨대 무세포 번역계), 후-번역 생체내 변형 및 후-번역 시험관내 변형을 포함한다.
번역 후 변형의 특정 예는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 예는 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제 또는 NaBH4에 의한 특이적 화학적 절단; 아세틸화; 포르밀화; 산화; 튜니카마이신(tunicamycin)의 존재 하의 환원 또는 대사 합성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 기술에 의한 화학적 변형을 포함한다.
추가 번역 후 변형은 아미노산 백본에 대한 화학적 모이어티의 부착, N-연결 또는 O-연결 탄수화물 사슬의 화학적 변형 및 원핵 숙주 세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 추가 또는 결실을 포함한다.
특정 실시예에서 본원에 기재된 IgA HetFc 작제물은 단백질의 검출과 단리를 가능하게 하는 효소, 형광, 동위원소 또는 친화성 표지와 같은 검출가능한 표지로 임의로 변형될 수 있다. 적합한 효소 표지의 예는 호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 및 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결 분자단(prosthetic group) 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴(streptavidin/biotin) 및 아비딘/비오틴(avidin/biotin)을 포함하며; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드(dansyl chloride) 및 피코에리트린(phycoerythrin)을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀(luminol)을 포함하며; 생물발광 물질의 예는 루시페라제(luciferase), 루시페린(luciferin) 및 에쿼린(aequorin)을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 요오드, 탄소, 황, 삼중수소, 인듐, 테크네튬(technetium), 탈륨, 갈륨, 팔라듐, 몰리브덴, 크세논 또는 불소를 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 IgA HetFc 작제물은 선택적으로 방사선금속 이온과 결합하는 거대고리 킬레이터에 부착될 수 있다.
IgA HetFc 작제물이 번역 후 처리와 같은 자연적 과정에 의해 또는 화학적 변형 기술에 의해 변형되는 실시예에서, 동일한 유형의 변형이 선택적으로 주어진 폴리펩티드의 여러 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다.
특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 이는 본원에 기재된 단백질에 의해 결합되거나 단백질에 결합하거나 단백질과 회합하는 폴리펩티드의 면역검정 또는 정제에 특히 유용할 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
IgA HetFc 작제물의 특성화
본원에 기재된 바와 같은 IgA HetFc 작제물은 다양한 방식으로 특성화될 수 있다. 예를 들어, IgA HetFc 작제물의 순도는 SDS-PAGE 겔, 웨스턴 블롯, 농도측정법, 질량 분석법, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 비환원성 모세관 전기영동 나트륨 도데실 설페이트(CE-SDS)을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 순도는 SEC 또는 CE-SDS에 의해 평가된다.
단백질 안정성은 또한 크기 배제 크로마토그래피(SEC); UV, 가시광선 또는 CD 분광법; 질량 분광법; 차등 광산란(DLS); 벤치탑 안정성 분석; 다른 특성화 기술과 결합된 동결 해동; 시차주사열량계(DSC); 시차주사형광측정법(DSF); 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC); 등전 포커싱; 수용체 결합 검정 또는 상대적 단백질 발현 수준을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 기술의 어레이를 사용하여 특성화될 수 있다. 특정 실시예에서, IgA HetFc 작제물의 안정성은 DSC 또는 DSF와 같은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 야생형 CH3 도메인 Tm과 비교하여 CH3 도메인 용융 온도(Tm)를 측정함으로써 평가된다.
적절한 경우, 본 발명의 IgA HetFc 작제물은 또한 리간드, 수용체 또는 표적 항원(예: FcaRI 또는 IgA HetFc 작제물에 포함된 결합 도메인의 표적 항원)에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 분석될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 면역분석법은 웨스턴 블롯, 방사면역분석법, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침전 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체 고정 분석, 면역방사 분석, 형광 면역분석 및 단백질 A 면역분석과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 특이적 결합 및 교차 반응성을 분석하는 데 사용될 수 있다. 그러한 분석은 일상적이며 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Ausubel, et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York 참조).
표적 리간드, 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 확인된 IgA HetFc 작제물은 선택적으로 리간드, 수용체 또는 항원에 대한 친화도에 대해 분석될 수도 있다. 결합 친화도 및 상호작용의 온-레이트 및 오프-레이트와 같은 매개변수는 예를 들어 경쟁적 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. IgA HetFc 작제물의 동역학 파라미터는 또한 BIAcore™ 동역학 분석과 같은 당업계에 공지된 표면 플라스몬 공명(SPR) 기반 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 다양한 SPR 기반 검정이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Mullet, et al., 2000, Methods, 22:77-91; Dong, et al., 2002, Rev. Mol. Biotech., 82:303-23; Fivash, et al., 1998, Curr Opinion in Biotechnology, 9:97-101; Rich, et al., 2000, Curr Opinion in Biotechnology, 11:54-61, and U.S. Patent Nos. 6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215 and 6,268,125 참조). 당업자에게 공지된 기술을 사용하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 또한 IgA HetFc 작제물과 세포 표면 상에 발현된 분자(예: Fc 수용체 또는 세포 표면 항원)의 결합을 특성화하기 위해 사용될 수 있다. 생물학적 세포를 분류하고 검사하기 위한 유세포 분석기는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,347,935; 5,464,581; 5,483,469; 5,602,039; 5,643,796 및 6,211,477 참조). 다른 알려진 유세포 분석기는 Becton Dickinson and Company(Franklin Lakes, NJ)에서 제조한 FACS Vantage™ 시스템과 Union Biometrica(Holliston, MA)에서 제조한 COPAS™ 시스템이다. 결합 친화도 및 동역학에 대한 상세한 설명은 항체-면역원 상호작용에 초점을 맞춘 Paul, WE, ed., 1999, Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia에서 찾을 수 있다.
IgA HetFc 작제물의 결합 특성은 또한 하나 이상의 Fca RI 다운스트림 기능을 결정하기 위한 생체외 기능 분석에 의해 특성화될 수 있다(예를 들어, Bakema, 2006, J Immunol, 176:3603-3610 참조).
사용 방법
본 개시내용의 특정 실시예는 치료 또는 진단 방법에서 본원에 기재된 IgA HetFc 작제물의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, IgA 작제물은 FcaRI를 통해 호중구를 참여시키는 방법 및 FcaRI를 통해 호중구를 활성화시키는 방법에 사용될 수 있다.
하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 IgA HetFc 작제물 및 치료제에 접합된 IgA HetFc 작제물은 치료 방법, 예를 들어 암, 자가면역 질환, 면역 또는 염증성 장애 또는 감염성 질병을 앓는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 IgA HetFc 작제물 및 표지물질 또는 진단제에 접합된 IgA HetFc 작제물은 진단 방법, 예를 들어 암, 자가면역 질환, 면역 또는 염증성 장애 또는 감염성 질병을 앓는 대상체를 진단하는 데 사용될 수 있다.
치료 방법에 사용되는 경우, IgA HetFc 작제물은 대상체에게 치료 유효량으로 투여된다. 본원에 사용되는 용어 "치료 유효량"은 본원에 기재된 IgA HetFc 작제물 또는 본원에 기재된 IgA HetFc 작제물을 포함하는 조성물이 인용된 방법의 목표를 달성할, 예를 들어, 치료 중인 질환, 병태 또는 장애의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화하기 위해 투여될 양을 의미한다. 문제의 질환 또는 장애의 치료에 효과적인 본원에 기재된 조성물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 분석이 최적 투여량 범위를 확인하는 데 도움이 되도록 사용될 수 있다. 제형(formulation)에서 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 질환 또는 장애의 중증도에 따라 결정될 것이고, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.
IgA HetFc 작제물이 치료 방법에 사용되는 일부 실시예에서, IgA HetFc 작제물은 문제의 질환 또는 장애의 치료를 위해 당업자에게 공지된 하나 이상의 추가 치료제의 치료 유효량과 함께 투여될 수 있다.
치료의 바람직한 효과는 하나 이상의 증상 완화, 질환의 임의의 직간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 개선된 생존, 관해, 예후 개선 또는 질환의 재발 지연 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약학적 조성물
치료 또는 진단 용도를 위해, IgA HetFc 작제물은 IgA HetFc 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 잘 알려져 있고 쉽게 이용가능한 성분을 사용하여 공지된 절차에 의해 제조될 수 있고 예를 들어, 경구(예: 협측 또는 설하 포함), 국소, 비경구, 직장 또는 질 경로에 의해, 또는 흡입 또는 분무에 의해 대상체에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 피내, 관절내, 정맥내, 근육내, 혈관내, 흉골내 또는 척수강내 경로에 의한 주사 또는 주입을 포함한다.
조성물은 일반적으로 선택된 경로에 의해 대상체에게 투여하기에 적합한 형식, 예를 들어, 시럽, 엘릭서, 정제, 트로키, 로젠지(lozenge), 경질 또는 연질 캡슐, 알약, 좌약, 유성 또는 수성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 유제, 주사제 또는 용액으로서 제형화될 것이다. 조성물은 단위 투여 제형으로 제공될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다. 이러한 담체의 예는 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 산화방지제 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 알코올, 벤질 알코올, 알킬 파라벤(예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤), 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥사놀, 3-펜타놀 및 m-크레솔; 저분자량(약 10개 미만의 아미노산) 폴리펩티드; 단백질 예컨대 혈청 알부민 또는 젤라틴; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 다당류, 및 다른 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체 예컨대 Zn-단백질 복합체 및 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시예에서, 조성물은 멸균 주사가 가능한 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 용액 또는 현탁액은 당업계에 알려진 적합한 분산제 또는 습윤제 및/또는 현탁제를 사용하여 제형화될 수 있다. 멸균 주사가 가능한 용액 또는 현탁액은 무독성 모체가 허용가능한 희석제 또는 용매에 IgA HetFc 작제물을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 희석제 및 용매는 예를 들어, 1,3-부탄디올, 물, 링거 용액 또는 등장성 염화나트륨 용액을 포함한다. 또한, 멸균 고정유는 용매 또는 현탁 매질(suspending medium)로 사용될 수 있다. 이 목적상, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한 다양한 무자극 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사용 제제에서 용도를 발견할 수 있다. 당업계에 공지된 국소 마취제, 보존제 및/또는 완충제와 같은 애주번트(Adjuvant)가 또한 주사 용액 또는 현탁액에 포함될 수 있다.
다른 약학적 조성물 및 약학적 조성물을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (formerly "Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000)에 기재되어 있다.
제조 키트 및 물품
본 개시내용의 특정 실시예는 본원에 기재된 하나 이상의 IgA HetFc 작제물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트의 개별 구성 요소는 개별 용기 내에, 그리고 그러한 용기와 연합하여 패키징될 수 있으며, 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의하여 규정된 형식으로 공지가 있을 수 있으며, 이 공지는 기관의 제조, 사용, 또는 판매에 대한 승인을 반영한다. 키트는 선택적으로 IgA HetFc 작제물에 대한 사용 방법 또는 투여 요법을 개괄하는 설명서 또는 지침을 포함할 수 있다.
키트의 하나 이상의 구성 요소가, 용액, 예컨대 수성 용액 또는 멸균 수성 용액으로 제공될 경우, 용기 수단은 그 자체가 용액이 대상체에 투여될 수 있거나 키트의 기타 구성 요소에 적용 및 혼합될 수 있는 흡입제, 주사기, 피펫, 점안기 또는 기타 이와 유사한 장치일 수 있다.
키트의 구성 요소는 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있으며, 키트는 추가로 동결건조된 구성 요소의 재구성을 위하여 적절한 용매를 포함할 수 있다. 용기의 수 또는 유형과 상관없이, 본원에 기재된 키트는 환자에게 조성물을 투여하는 것을 돕기 위한 기구 또한 포함할 수 있다. 그러한 기구는 흡입제, 비강 스프레이 장치, 주사기, 피펫, 겸자, 계량 스푼, 점안기 또는 이와 유사한 의학적으로 승인된 전달 수단일 수 있다.
특정 실시예는 본원에 기재된 바와 같은 환자의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품에 관한 것이다. 이 제조 물품은 용기, 용기 상에 또는 이와 연합된 표지 또는 포장 삽지를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 정맥내 수액 백 등이 포함된다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체로 또는 환자 치료에 효과적인 다른 조성물과 배합된 IgA HetFc 작제물을 포함하는 조성물을 보유하고 멸균 접근 입구가 있을 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥내 투여 수액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개가 있는 바이알일 수 있음). 표지 또는 포장 삽지는 조성물이 선택된 병태를 치료하기 위해 사용된다는 것을 표시한다. 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예를 들면, 주사용 정균수(BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 용기를 더 포함할 수 있다. 제조 물품은 선택적으로 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
하기 실시예는 예시 목적으로 제공되며 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
핵심 돌연변이를 포함하는 IgA HetFc 설계　
번호　 CH3 도메인 돌연변이 　 No.　 CH3 도메인 돌연변이
사슬 A　 사슬 B　 　 사슬 A　 사슬 B　
D1　 A6085YF_T6086Y　 W6081T　 　 D64　 A6085YW_T6086M　 W6081A　
D2　 A6085YY_T6086Y　 W6081T　 　 D65　 A6085YH_T6086M　 W6081A　
D3　 A6085YM_T6086Y　 W6081T　 　 D66　 A6085YF_T6086W　 W6081A　
D4　 A6085YW_T6086Y　 W6081T　 　 D67　 A6085YY_T6086W　 W6081A　
D5　 A6085YH_T6086Y　 W6081T　 　 D68　 A6085YM_T6086W　 W6081A　
D6　 A6085YF_T6086F　 W6081T　 　 D69　 A6085YW_T6086W　 W6081A　
D7　 A6085YY_T6086F　 W6081T　 　 D70　 A6085YH_T6086W　 W6081A　
D8　 A6085YM_T6086F　 W6081T　 　 D71　 A6085YF_T6086H　 W6081A　
D9　 A6085YW_T6086F　 W6081T　 　 D72　 A6085YY_T6086H　 W6081A　
D10　 A6085YH_T6086F　 W6081T　 　 D73　 A6085YM_T6086H　 W6081A　
D11　 A6085YF_T6086M　 W6081T　 　 D74　 A6085YW_T6086H　 W6081A　
D12　 A6085YY_T6086M　 W6081T　 　 D75　 A6085YH_T6086H　 W6081A　
D13　 A6085YM_T6086M　 W6081T　 　 D76　 A6085YF_T6086Y　 W6081V　
D14　 A6085YW_T6086M　 W6081T　 　 D77　 A6085YY_T6086Y　 W6081V　
D15　 A6085YH_T6086M　 W6081T　 　 D78　 A6085YM_T6086Y　 W6081V　
D16　 A6085YF_T6086W　 W6081T　 　 D79　 A6085YW_T6086Y　 W6081V　
D17　 A6085YY_T6086W　 W6081T　 　 D80　 A6085YH_T6086Y　 W6081V　
D18　 A6085YM_T6086W　 W6081T　 　 D81　 A6085YF_T6086F　 W6081V　
D19　 A6085YW_T6086W　 W6081T　 　 D82　 A6085YY_T6086F　 W6081V　
D20　 A6085YH_T6086W　 W6081T　 　 D83　 A6085YM_T6086F　 W6081V　
D21　 A6085YF_T6086H　 W6081T　 　 D84　 A6085YW_T6086F　 W6081V　
D22　 A6085YY_T6086H　 W6081T　 　 D85　 A6085YH_T6086F　 W6081V　
D23　 A6085YM_T6086H　 W6081T　 　 D86　 A6085YF_T6086M　 W6081V　
D24　 A6085YW_T6086H　 W6081T　 　 D87　 A6085YY_T6086M　 W6081V　
D25　 A6085YH_T6086H　 W6081T　 　 D88　 A6085YM_T6086M　 W6081V　
D26　 A6085YF_T6086Y　 W6081L　 　 D89　 A6085YW_T6086M　 W6081V　
D27　 A6085YY_T6086Y　 W6081L　 　 D90　 A6085YH_T6086M　 W6081V　
D28　 A6085YM_T6086Y　 W6081L　 　 D91　 A6085YF_T6086W　 W6081V　
D29　 A6085YW_T6086Y　 W6081L　 　 D92　 A6085YY_T6086W　 W6081V　
D30　 A6085YH_T6086Y　 W6081L　 　 D93　 A6085YM_T6086W　 W6081V　
D31　 A6085YF_T6086F　 W6081L　 　 D94　 A6085YW_T6086W　 W6081V　
D32　 A6085YY_T6086F　 W6081L　 　 D95　 A6085YH_T6086W　 W6081V　
D33　 A6085YM_T6086F　 W6081L　 　 D96　 A6085YF_T6086H　 W6081V　
D34　 A6085YW_T6086F　 W6081L　 　 D97　 A6085YY_T6086H　 W6081V　
D35　 A6085YH_T6086F　 W6081L　 　 D98　 A6085YM_T6086H　 W6081V　
D36　 A6085YF_T6086M　 W6081L　 　 D99　 A6085YW_T6086H　 W6081V　
D37　 A6085YY_T6086M　 W6081L　 　 D100　 A6085YH_T6086H　 W6081V　
D38　 A6085YM_T6086M　 W6081L　 　 D101　 A6085YF_T6086Y　 W6081I　
D39　 A6085YW_T6086M　 W6081L　 　 D102　 A6085YY_T6086Y　 W6081I　
D40　 A6085YH_T6086M　 W6081L　 　 D103　 A6085YM_T6086Y　 W6081I　
D41　 A6085YF_T6086W　 W6081L　 　 D104　 A6085YW_T6086Y　 W6081I　
D42　 A6085YY_T6086W　 W6081L　 　 D105　 A6085YH_T6086Y　 W6081I　
D43　 A6085YM_T6086W　 W6081L　 　 D106　 A6085YF_T6086F　 W6081I　
D44　 A6085YW_T6086W　 W6081L　 　 D107　 A6085YY_T6086F　 W6081I　
D45　 A6085YH_T6086W　 W6081L　 　 D108　 A6085YM_T6086F　 W6081I　
D46　 A6085YF_T6086H　 W6081L　 　 D109　 A6085YW_T6086F　 W6081I　
D47　 A6085YY_T6086H　 W6081L　 　 D110　 A6085YH_T6086F　 W6081I　
D48　 A6085YM_T6086H　 W6081L　 　 D111　 A6085YF_T6086M　 W6081I　
D49　 A6085YW_T6086H　 W6081L　 　 D112　 A6085YY_T6086M　 W6081I　
D50　 A6085YH_T6086H　 W6081L　 　 D113　 A6085YM_T6086M　 W6081I　
D51　 A6085YF_T6086Y　 W6081A　 　 D114　 A6085YW_T6086M　 W6081I　
D52　 A6085YY_T6086Y　 W6081A　 　 D115　 A6085YH_T6086M　 W6081I　
D53　 A6085YM_T6086Y　 W6081A　 　 D116　 A6085YF_T6086W　 W6081I　
D54　 A6085YW_T6086Y　 W6081A　 　 D117　 A6085YY_T6086W　 W6081I　
D55　 A6085YH_T6086Y　 W6081A　 　 D118　 A6085YM_T6086W　 W6081I　
D56　 A6085YF_T6086F　 W6081A　 　 D119　 A6085YW_T6086W　 W6081I　
D57　 A6085YY_T6086F　 W6081A　 　 D120　 A6085YH_T6086W　 W6081I　
D58　 A6085YM_T6086F　 W6081A　 　 D121　 A6085YF_T6086H　 W6081I　
D59　 A6085YW_T6086F　 W6081A　 　 D122　 A6085YY_T6086H　 W6081I　
D60　 A6085YH_T6086F　 W6081A　 　 D123　 A6085YM_T6086H　 W6081I　
D61　 A6085YF_T6086M　 W6081A　 　 D124　 A6085YW_T6086H　 W6081I　
D62　 A6085YY_T6086M　 W6081A　 　 D125　 A6085YH_T6086H　 W6081I　
D63　 A6085YM_T6086M　 W6081A　 　 　 　 　
사슬 B에서 위치 6079의 돌연변이와 조합된 핵심 돌연변이를 포함하는 IgA HetFc 설계
번호 CH3 도메인 돌연변이 No. CH3 도메인 돌연변이
사슬 A 사슬 B 사슬 A 사슬 B
D126 A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T D376 A6085YF_T6086Y L6079A_W6081T
D127 A6085YY_T6086Y L6079V_W6081T D377 A6085YY_T6086Y L6079A_W6081T
D128 A6085YM_T6086Y L6079V_W6081T D378 A6085YM_T6086Y L6079A_W6081T
D129 A6085YW_T6086Y L6079V_W6081T D379 A6085YW_T6086Y L6079A_W6081T
D130 A6085YH_T6086Y L6079V_W6081T D380 A6085YH_T6086Y L6079A_W6081T
D131 A6085YF_T6086F L6079V_W6081T D381 A6085YF_T6086F L6079A_W6081T
D132 A6085YY_T6086F L6079V_W6081T D382 A6085YY_T6086F L6079A_W6081T
D133 A6085YM_T6086F L6079V_W6081T D383 A6085YM_T6086F L6079A_W6081T
D134 A6085YW_T6086F L6079V_W6081T D384 A6085YW_T6086F L6079A_W6081T
D135 A6085YH_T6086F L6079V_W6081T D385 A6085YH_T6086F L6079A_W6081T
D136 A6085YF_T6086M L6079V_W6081T D386 A6085YF_T6086M L6079A_W6081T
D137 A6085YY_T6086M L6079V_W6081T D387 A6085YY_T6086M L6079A_W6081T
D138 A6085YM_T6086M L6079V_W6081T D388 A6085YM_T6086M L6079A_W6081T
D139 A6085YW_T6086M L6079V_W6081T D389 A6085YW_T6086M L6079A_W6081T
D140 A6085YH_T6086M L6079V_W6081T D390 A6085YH_T6086M L6079A_W6081T
D141 A6085YF_T6086W L6079V_W6081T D391 A6085YF_T6086W L6079A_W6081T
D142 A6085YY_T6086W L6079V_W6081T D392 A6085YY_T6086W L6079A_W6081T
D143 A6085YM_T6086W L6079V_W6081T D393 A6085YM_T6086W L6079A_W6081T
D144 A6085YW_T6086W L6079V_W6081T D394 A6085YW_T6086W L6079A_W6081T
D145 A6085YH_T6086W L6079V_W6081T D395 A6085YH_T6086W L6079A_W6081T
D146 A6085YF_T6086H L6079V_W6081T D396 A6085YF_T6086H L6079A_W6081T
D147 A6085YY_T6086H L6079V_W6081T D397 A6085YY_T6086H L6079A_W6081T
D148 A6085YM_T6086H L6079V_W6081T D398 A6085YM_T6086H L6079A_W6081T
D149 A6085YW_T6086H L6079V_W6081T D399 A6085YW_T6086H L6079A_W6081T
D150 A6085YH_T6086H L6079V_W6081T D400 A6085YH_T6086H L6079A_W6081T
D151 A6085YF_T6086Y L6079V_W6081L D401 A6085YF_T6086Y L6079A_W6081L
D152 A6085YY_T6086Y L6079V_W6081L D402 A6085YY_T6086Y L6079A_W6081L
D153 A6085YM_T6086Y L6079V_W6081L D403 A6085YM_T6086Y L6079A_W6081L
D154 A6085YW_T6086Y L6079V_W6081L D404 A6085YW_T6086Y L6079A_W6081L
D155 A6085YH_T6086Y L6079V_W6081L D405 A6085YH_T6086Y L6079A_W6081L
D156 A6085YF_T6086F L6079V_W6081L D406 A6085YF_T6086F L6079A_W6081L
D157 A6085YY_T6086F L6079V_W6081L D407 A6085YY_T6086F L6079A_W6081L
D158 A6085YM_T6086F L6079V_W6081L D408 A6085YM_T6086F L6079A_W6081L
D159 A6085YW_T6086F L6079V_W6081L D409 A6085YW_T6086F L6079A_W6081L
D160 A6085YH_T6086F L6079V_W6081L D410 A6085YH_T6086F L6079A_W6081L
D161 A6085YF_T6086M L6079V_W6081L D411 A6085YF_T6086M L6079A_W6081L
D162 A6085YY_T6086M L6079V_W6081L D412 A6085YY_T6086M L6079A_W6081L
D163 A6085YM_T6086M L6079V_W6081L D413 A6085YM_T6086M L6079A_W6081L
D164 A6085YW_T6086M L6079V_W6081L D414 A6085YW_T6086M L6079A_W6081L
D165 A6085YH_T6086M L6079V_W6081L D415 A6085YH_T6086M L6079A_W6081L
D166 A6085YF_T6086W L6079V_W6081L D416 A6085YF_T6086W L6079A_W6081L
D167 A6085YY_T6086W L6079V_W6081L D417 A6085YY_T6086W L6079A_W6081L
D168 A6085YM_T6086W L6079V_W6081L D418 A6085YM_T6086W L6079A_W6081L
D169 A6085YW_T6086W L6079V_W6081L D419 A6085YW_T6086W L6079A_W6081L
D170 A6085YH_T6086W L6079V_W6081L D420 A6085YH_T6086W L6079A_W6081L
D171 A6085YF_T6086H L6079V_W6081L D421 A6085YF_T6086H L6079A_W6081L
D172 A6085YY_T6086H L6079V_W6081L D422 A6085YY_T6086H L6079A_W6081L
D173 A6085YM_T6086H L6079V_W6081L D423 A6085YM_T6086H L6079A_W6081L
D174 A6085YW_T6086H L6079V_W6081L D424 A6085YW_T6086H L6079A_W6081L
D175 A6085YH_T6086H L6079V_W6081L D425 A6085YH_T6086H L6079A_W6081L
D176 A6085YF_T6086Y L6079V_W6081A D426 A6085YF_T6086Y L6079A_W6081A
D177 A6085YY_T6086Y L6079V_W6081A D427 A6085YY_T6086Y L6079A_W6081A
D178 A6085YM_T6086Y L6079V_W6081A D428 A6085YM_T6086Y L6079A_W6081A
D179 A6085YW_T6086Y L6079V_W6081A D429 A6085YW_T6086Y L6079A_W6081A
D180 A6085YH_T6086Y L6079V_W6081A D430 A6085YH_T6086Y L6079A_W6081A
D181 A6085YF_T6086F L6079V_W6081A D431 A6085YF_T6086F L6079A_W6081A
D182 A6085YY_T6086F L6079V_W6081A D432 A6085YY_T6086F L6079A_W6081A
D183 A6085YM_T6086F L6079V_W6081A D433 A6085YM_T6086F L6079A_W6081A
D184 A6085YW_T6086F L6079V_W6081A D434 A6085YW_T6086F L6079A_W6081A
D185 A6085YH_T6086F L6079V_W6081A D435 A6085YH_T6086F L6079A_W6081A
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D187 A6085YY_T6086M L6079V_W6081A D437 A6085YY_T6086M L6079A_W6081A
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D318 A6085YM_T6086W L6079T_W6081A D568 A6085YM_T6086W L6079I_W6081A
D319 A6085YW_T6086W L6079T_W6081A D569 A6085YW_T6086W L6079I_W6081A
D320 A6085YH_T6086W L6079T_W6081A D570 A6085YH_T6086W L6079I_W6081A
D321 A6085YF_T6086H L6079T_W6081A D571 A6085YF_T6086H L6079I_W6081A
D322 A6085YY_T6086H L6079T_W6081A D572 A6085YY_T6086H L6079I_W6081A
D323 A6085YM_T6086H L6079T_W6081A D573 A6085YM_T6086H L6079I_W6081A
D324 A6085YW_T6086H L6079T_W6081A D574 A6085YW_T6086H L6079I_W6081A
D325 A6085YH_T6086H L6079T_W6081A D575 A6085YH_T6086H L6079I_W6081A
D326 A6085YF_T6086Y L6079T_W6081V D576 A6085YF_T6086Y L6079I_W6081V
D327 A6085YY_T6086Y L6079T_W6081V D577 A6085YY_T6086Y L6079I_W6081V
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D329 A6085YW_T6086Y L6079T_W6081V D579 A6085YW_T6086Y L6079I_W6081V
D330 A6085YH_T6086Y L6079T_W6081V D580 A6085YH_T6086Y L6079I_W6081V
D331 A6085YF_T6086F L6079T_W6081V D581 A6085YF_T6086F L6079I_W6081V
D332 A6085YY_T6086F L6079T_W6081V D582 A6085YY_T6086F L6079I_W6081V
D333 A6085YM_T6086F L6079T_W6081V D583 A6085YM_T6086F L6079I_W6081V
D334 A6085YW_T6086F L6079T_W6081V D584 A6085YW_T6086F L6079I_W6081V
D335 A6085YH_T6086F L6079T_W6081V D585 A6085YH_T6086F L6079I_W6081V
D336 A6085YF_T6086M L6079T_W6081V D586 A6085YF_T6086M L6079I_W6081V
D337 A6085YY_T6086M L6079T_W6081V D587 A6085YY_T6086M L6079I_W6081V
D338 A6085YM_T6086M L6079T_W6081V D588 A6085YM_T6086M L6079I_W6081V
D339 A6085YW_T6086M L6079T_W6081V D589 A6085YW_T6086M L6079I_W6081V
D340 A6085YH_T6086M L6079T_W6081V D590 A6085YH_T6086M L6079I_W6081V
D341 A6085YF_T6086W L6079T_W6081V D591 A6085YF_T6086W L6079I_W6081V
D342 A6085YY_T6086W L6079T_W6081V D592 A6085YY_T6086W L6079I_W6081V
D343 A6085YM_T6086W L6079T_W6081V D593 A6085YM_T6086W L6079I_W6081V
D344 A6085YW_T6086W L6079T_W6081V D594 A6085YW_T6086W L6079I_W6081V
D345 A6085YH_T6086W L6079T_W6081V D595 A6085YH_T6086W L6079I_W6081V
D346 A6085YF_T6086H L6079T_W6081V D596 A6085YF_T6086H L6079I_W6081V
D347 A6085YY_T6086H L6079T_W6081V D597 A6085YY_T6086H L6079I_W6081V
D348 A6085YM_T6086H L6079T_W6081V D598 A6085YM_T6086H L6079I_W6081V
D349 A6085YW_T6086H L6079T_W6081V D599 A6085YW_T6086H L6079I_W6081V
D350 A6085YH_T6086H L6079T_W6081V D600 A6085YH_T6086H L6079I_W6081V
D351 A6085YF_T6086Y L6079T_W6081I D601 A6085YF_T6086Y L6079I_W6081I
D352 A6085YY_T6086Y L6079T_W6081I D602 A6085YY_T6086Y L6079I_W6081I
D353 A6085YM_T6086Y L6079T_W6081I D603 A6085YM_T6086Y L6079I_W6081I
D354 A6085YW_T6086Y L6079T_W6081I D604 A6085YW_T6086Y L6079I_W6081I
D355 A6085YH_T6086Y L6079T_W6081I D605 A6085YH_T6086Y L6079I_W6081I
D356 A6085YF_T6086F L6079T_W6081I D606 A6085YF_T6086F L6079I_W6081I
D357 A6085YY_T6086F L6079T_W6081I D607 A6085YY_T6086F L6079I_W6081I
D358 A6085YM_T6086F L6079T_W6081I D608 A6085YM_T6086F L6079I_W6081I
D359 A6085YW_T6086F L6079T_W6081I D609 A6085YW_T6086F L6079I_W6081I
D360 A6085YH_T6086F L6079T_W6081I D610 A6085YH_T6086F L6079I_W6081I
D361 A6085YF_T6086M L6079T_W6081I D611 A6085YF_T6086M L6079I_W6081I
D362 A6085YY_T6086M L6079T_W6081I D612 A6085YY_T6086M L6079I_W6081I
D363 A6085YM_T6086M L6079T_W6081I D613 A6085YM_T6086M L6079I_W6081I
D364 A6085YW_T6086M L6079T_W6081I D614 A6085YW_T6086M L6079I_W6081I
D365 A6085YH_T6086M L6079T_W6081I D615 A6085YH_T6086M L6079I_W6081I
D366 A6085YF_T6086W L6079T_W6081I D616 A6085YF_T6086W L6079I_W6081I
D367 A6085YY_T6086W L6079T_W6081I D617 A6085YY_T6086W L6079I_W6081I
D368 A6085YM_T6086W L6079T_W6081I D618 A6085YM_T6086W L6079I_W6081I
D369 A6085YW_T6086W L6079T_W6081I D619 A6085YW_T6086W L6079I_W6081I
D370 A6085YH_T6086W L6079T_W6081I D620 A6085YH_T6086W L6079I_W6081I
D371 A6085YF_T6086H L6079T_W6081I D621 A6085YF_T6086H L6079I_W6081I
D372 A6085YY_T6086H L6079T_W6081I D622 A6085YY_T6086H L6079I_W6081I
D373 A6085YM_T6086H L6079T_W6081I D623 A6085YM_T6086H L6079I_W6081I
D374 A6085YW_T6086H L6079T_W6081I D624 A6085YW_T6086H L6079I_W6081I
D375 A6085YH_T6086H L6079T_W6081I D625 A6085YH_T6086H L6079I_W6081I
사슬 B에서 위치 6088의 돌연변이와 조합된 핵심 돌연변이를 포함하는 IgA HetFc 설계
번호 CH3 도메인 돌연변이 No. CH3 도메인 돌연변이
사슬 A 사슬 B 사슬 A 사슬 B
D626 A6085YF_T6086Y W6081T_I6088L D876 A6085YF_T6086Y W6081T_I6088V
D627 A6085YY_T6086Y W6081T_I6088L D877 A6085YY_T6086Y W6081T_I6088V
D628 A6085YM_T6086Y W6081T_I6088L D878 A6085YM_T6086Y W6081T_I6088V
D629 A6085YW_T6086Y W6081T_I6088L D879 A6085YW_T6086Y W6081T_I6088V
D630 A6085YH_T6086Y W6081T_I6088L D880 A6085YH_T6086Y W6081T_I6088V
D631 A6085YF_T6086F W6081T_I6088L D881 A6085YF_T6086F W6081T_I6088V
D632 A6085YY_T6086F W6081T_I6088L D882 A6085YY_T6086F W6081T_I6088V
D633 A6085YM_T6086F W6081T_I6088L D883 A6085YM_T6086F W6081T_I6088V
D634 A6085YW_T6086F W6081T_I6088L D884 A6085YW_T6086F W6081T_I6088V
D635 A6085YH_T6086F W6081T_I6088L D885 A6085YH_T6086F W6081T_I6088V
D636 A6085YF_T6086M W6081T_I6088L D886 A6085YF_T6086M W6081T_I6088V
D637 A6085YY_T6086M W6081T_I6088L D887 A6085YY_T6086M W6081T_I6088V
D638 A6085YM_T6086M W6081T_I6088L D888 A6085YM_T6086M W6081T_I6088V
D639 A6085YW_T6086M W6081T_I6088L D889 A6085YW_T6086M W6081T_I6088V
D640 A6085YH_T6086M W6081T_I6088L D890 A6085YH_T6086M W6081T_I6088V
D641 A6085YF_T6086W W6081T_I6088L D891 A6085YF_T6086W W6081T_I6088V
D642 A6085YY_T6086W W6081T_I6088L D892 A6085YY_T6086W W6081T_I6088V
D643 A6085YM_T6086W W6081T_I6088L D893 A6085YM_T6086W W6081T_I6088V
D644 A6085YW_T6086W W6081T_I6088L D894 A6085YW_T6086W W6081T_I6088V
D645 A6085YH_T6086W W6081T_I6088L D895 A6085YH_T6086W W6081T_I6088V
D646 A6085YF_T6086H W6081T_I6088L D896 A6085YF_T6086H W6081T_I6088V
D647 A6085YY_T6086H W6081T_I6088L D897 A6085YY_T6086H W6081T_I6088V
D648 A6085YM_T6086H W6081T_I6088L D898 A6085YM_T6086H W6081T_I6088V
D649 A6085YW_T6086H W6081T_I6088L D899 A6085YW_T6086H W6081T_I6088V
D650 A6085YH_T6086H W6081T_I6088L D900 A6085YH_T6086H W6081T_I6088V
D651 A6085YF_T6086Y W6081L_I6088L D901 A6085YF_T6086Y W6081L_I6088V
D652 A6085YY_T6086Y W6081L_I6088L D902 A6085YY_T6086Y W6081L_I6088V
D653 A6085YM_T6086Y W6081L_I6088L D903 A6085YM_T6086Y W6081L_I6088V
D654 A6085YW_T6086Y W6081L_I6088L D904 A6085YW_T6086Y W6081L_I6088V
D655 A6085YH_T6086Y W6081L_I6088L D905 A6085YH_T6086Y W6081L_I6088V
D656 A6085YF_T6086F W6081L_I6088L D906 A6085YF_T6086F W6081L_I6088V
D657 A6085YY_T6086F W6081L_I6088L D907 A6085YY_T6086F W6081L_I6088V
D658 A6085YM_T6086F W6081L_I6088L D908 A6085YM_T6086F W6081L_I6088V
D659 A6085YW_T6086F W6081L_I6088L D909 A6085YW_T6086F W6081L_I6088V
D660 A6085YH_T6086F W6081L_I6088L D910 A6085YH_T6086F W6081L_I6088V
D661 A6085YF_T6086M W6081L_I6088L D911 A6085YF_T6086M W6081L_I6088V
D662 A6085YY_T6086M W6081L_I6088L D912 A6085YY_T6086M W6081L_I6088V
D663 A6085YM_T6086M W6081L_I6088L D913 A6085YM_T6086M W6081L_I6088V
D664 A6085YW_T6086M W6081L_I6088L D914 A6085YW_T6086M W6081L_I6088V
D665 A6085YH_T6086M W6081L_I6088L D915 A6085YH_T6086M W6081L_I6088V
D666 A6085YF_T6086W W6081L_I6088L D916 A6085YF_T6086W W6081L_I6088V
D667 A6085YY_T6086W W6081L_I6088L D917 A6085YY_T6086W W6081L_I6088V
D668 A6085YM_T6086W W6081L_I6088L D918 A6085YM_T6086W W6081L_I6088V
D669 A6085YW_T6086W W6081L_I6088L D919 A6085YW_T6086W W6081L_I6088V
D670 A6085YH_T6086W W6081L_I6088L D920 A6085YH_T6086W W6081L_I6088V
D671 A6085YF_T6086H W6081L_I6088L D921 A6085YF_T6086H W6081L_I6088V
D672 A6085YY_T6086H W6081L_I6088L D922 A6085YY_T6086H W6081L_I6088V
D673 A6085YM_T6086H W6081L_I6088L D923 A6085YM_T6086H W6081L_I6088V
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D675 A6085YH_T6086H W6081L_I6088L D925 A6085YH_T6086H W6081L_I6088V
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D677 A6085YY_T6086Y W6081A_I6088L D927 A6085YY_T6086Y W6081A_I6088V
D678 A6085YM_T6086Y W6081A_I6088L D928 A6085YM_T6086Y W6081A_I6088V
D679 A6085YW_T6086Y W6081A_I6088L D929 A6085YW_T6086Y W6081A_I6088V
D680 A6085YH_T6086Y W6081A_I6088L D930 A6085YH_T6086Y W6081A_I6088V
D681 A6085YF_T6086F W6081A_I6088L D931 A6085YF_T6086F W6081A_I6088V
D682 A6085YY_T6086F W6081A_I6088L D932 A6085YY_T6086F W6081A_I6088V
D683 A6085YM_T6086F W6081A_I6088L D933 A6085YM_T6086F W6081A_I6088V
D684 A6085YW_T6086F W6081A_I6088L D934 A6085YW_T6086F W6081A_I6088V
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D825 A6085YH_T6086H W6081A_I6088A D1075 A6085YH_T6086H W6081A_I6088T
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D851 A6085YF_T6086Y W6081I_I6088A D1101 A6085YF_T6086Y W6081I_I6088T
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D853 A6085YM_T6086Y W6081I_I6088A D1103 A6085YM_T6086Y W6081I_I6088T
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D871 A6085YF_T6086H W6081I_I6088A D1121 A6085YF_T6086H W6081I_I6088T
D872 A6085YY_T6086H W6081I_I6088A D1122 A6085YY_T6086H W6081I_I6088T
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D874 A6085YW_T6086H W6081I_I6088A D1124 A6085YW_T6086H W6081I_I6088T
D875 A6085YH_T6086H W6081I_I6088A D1125 A6085YH_T6086H W6081I_I6088T
사슬 B에서 위치 6079 및 6088의 돌연변이와 조합된 핵심 돌연변이를 포함하는 IgA HetFc 설계
번호 CH3 도메인 돌연변이
사슬 A 사슬 B
D1126 A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
D1127 A6085YY_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
D1128 A6085YM_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
D1129 A6085YW_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
D1130 A6085YH_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
D1131 A6085YF_T6086F L6079V_W6081T_I6088L
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D1136 A6085YF_T6086M L6079V_W6081T_I6088L
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D1155 A6085YH_T6086Y L6079V_W6081L_I6088L
D1156 A6085YF_T6086F L6079V_W6081L_I6088L
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D1181 A6085YF_T6086F L6079V_W6081A_I6088L
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D1183 A6085YM_T6086F L6079V_W6081A_I6088L
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D3062 A6085YY_T6086M L6079I_W6081A_I6088T
D3063 A6085YM_T6086M L6079I_W6081A_I6088T
D3064 A6085YW_T6086M L6079I_W6081A_I6088T
D3065 A6085YH_T6086M L6079I_W6081A_I6088T
D3066 A6085YF_T6086W L6079I_W6081A_I6088T
D3067 A6085YY_T6086W L6079I_W6081A_I6088T
D3068 A6085YM_T6086W L6079I_W6081A_I6088T
D3069 A6085YW_T6086W L6079I_W6081A_I6088T
D3070 A6085YH_T6086W L6079I_W6081A_I6088T
D3071 A6085YF_T6086H L6079I_W6081A_I6088T
D3072 A6085YY_T6086H L6079I_W6081A_I6088T
D3073 A6085YM_T6086H L6079I_W6081A_I6088T
D3074 A6085YW_T6086H L6079I_W6081A_I6088T
D3075 A6085YH_T6086H L6079I_W6081A_I6088T
D3076 A6085YF_T6086Y L6079I_W6081V_I6088T
D3077 A6085YY_T6086Y L6079I_W6081V_I6088T
D3078 A6085YM_T6086Y L6079I_W6081V_I6088T
D3079 A6085YW_T6086Y L6079I_W6081V_I6088T
D3080 A6085YH_T6086Y L6079I_W6081V_I6088T
D3081 A6085YF_T6086F L6079I_W6081V_I6088T
D3082 A6085YY_T6086F L6079I_W6081V_I6088T
D3083 A6085YM_T6086F L6079I_W6081V_I6088T
D3084 A6085YW_T6086F L6079I_W6081V_I6088T
D3085 A6085YH_T6086F L6079I_W6081V_I6088T
D3086 A6085YF_T6086M L6079I_W6081V_I6088T
D3087 A6085YY_T6086M L6079I_W6081V_I6088T
D3088 A6085YM_T6086M L6079I_W6081V_I6088T
D3089 A6085YW_T6086M L6079I_W6081V_I6088T
D3090 A6085YH_T6086M L6079I_W6081V_I6088T
D3091 A6085YF_T6086W L6079I_W6081V_I6088T
D3092 A6085YY_T6086W L6079I_W6081V_I6088T
D3093 A6085YM_T6086W L6079I_W6081V_I6088T
D3094 A6085YW_T6086W L6079I_W6081V_I6088T
D3095 A6085YH_T6086W L6079I_W6081V_I6088T
D3096 A6085YF_T6086H L6079I_W6081V_I6088T
D3097 A6085YY_T6086H L6079I_W6081V_I6088T
D3098 A6085YM_T6086H L6079I_W6081V_I6088T
D3099 A6085YW_T6086H L6079I_W6081V_I6088T
D3100 A6085YH_T6086H L6079I_W6081V_I6088T
D3101 A6085YF_T6086Y L6079I_W6081I_I6088T
D3102 A6085YY_T6086Y L6079I_W6081I_I6088T
D3103 A6085YM_T6086Y L6079I_W6081I_I6088T
D3104 A6085YW_T6086Y L6079I_W6081I_I6088T
D3105 A6085YH_T6086Y L6079I_W6081I_I6088T
D3106 A6085YF_T6086F L6079I_W6081I_I6088T
D3107 A6085YY_T6086F L6079I_W6081I_I6088T
D3108 A6085YM_T6086F L6079I_W6081I_I6088T
D3109 A6085YW_T6086F L6079I_W6081I_I6088T
D3110 A6085YH_T6086F L6079I_W6081I_I6088T
D3111 A6085YF_T6086M L6079I_W6081I_I6088T
D3112 A6085YY_T6086M L6079I_W6081I_I6088T
D3113 A6085YM_T6086M L6079I_W6081I_I6088T
D3114 A6085YW_T6086M L6079I_W6081I_I6088T
D3115 A6085YH_T6086M L6079I_W6081I_I6088T
D3116 A6085YF_T6086W L6079I_W6081I_I6088T
D3117 A6085YY_T6086W L6079I_W6081I_I6088T
D3118 A6085YM_T6086W L6079I_W6081I_I6088T
D3119 A6085YW_T6086W L6079I_W6081I_I6088T
D3120 A6085YH_T6086W L6079I_W6081I_I6088T
D3121 A6085YF_T6086H L6079I_W6081I_I6088T
D3122 A6085YY_T6086H L6079I_W6081I_I6088T
D3123 A6085YM_T6086H L6079I_W6081I_I6088T
D3124 A6085YW_T6086H L6079I_W6081I_I6088T
D3125 A6085YH_T6086H L6079I_W6081I_I6088T
실시예
실시예 1: 리드 IgA 이종이량체 설계의 인실리코 선택
이 실시예는 IgA Fc 이량체의 동종이량체화보다 이종이량체화를 유도하기 위한 잠재적인 IgA Fc Cα3(CH3) 돌연변이의 인실리코(in silico) 분석 및 선택을 설명한다.
방법
IgA Fc의 CH3:CH3 계면의 광범위한 구조 분석에서(PDB ID: 2QEJ, Ramsland et al., 2007, Proc Natl Acad Sci USA 104:15051-15056), 계면의 잔기는 그들의 이량체화에 대한 에너지 기여에 따라 특성화되었다. 이를 위해 지식 기반 및 물리 기반 전위를 기반으로 하는 구조의 에너지뿐만 아니라 연결성 분석을 위한 독점 도구가 정적 구조와 50 ns 명시적 분자 역학 궤적에 사용되었다. 이 초기 분석 및 첫 번째 "음성 설계" 라운드의 결과에 따라 이량체화에 지장을 줄 것으로 예측되는 돌연변이 도입을 위해 잔기를 선택했다. 이러한 돌연변이는 도 1에 설명된 두 가지 주요 설계 개념을 기반으로 선택되었다. 음의 정전기 설계는 동일한 전하 쌍의 도입과 계면를 통한 관련 반발에 의존하는 반면 음의 입체 설계는 계면에서 공동 또는 입체 충돌의 도입을 기반으로 한다. 이러한 음성 설계는 독점적인 인실리코 도구를 사용하여 적극적으로 모델링하고 평가했다. 두 번째 "양성 설계" 단계에서는 이종이량체화를 구하려는 목적으로 추가 돌연변이를 도입했다. 이종이량체 복합체의 안정화는 계면을 가로지르는 반대 전하를 통한 염다리(salt bridge)의 도입 또는 계면의 반대쪽에 있는 공동에 의해 큰 측쇄를 갖는 잔기의 수용을 기반으로 한다. 동종이량체와 이종이량체 간의 에너지 차이가 가장 큰 설계를 선택하여 표현하고 평가했다.
결과
분석된 메트릭을 기반으로 리드 설계의 돌연변이가 표 11에 나와 있다. 동종이량체 및 이종이량체 리드 설계 모델에 대한 인실리코 메트릭의 선택 세트가 표 12에 나와 있다. 에너지는 야생형에 관한 것이다. 음성 에너지는 유리한 상호작용을 나타내고 양성 에너지는 불리한 상호작용을 나타낸다.
특히, 동종이량체와 이종이량체 사이에 에너지 차이가 가장 큰 입체 설계는 사슬 A의 A6085Y 및 T6086 위치에서 큰 소수성 측쇄에 대한 돌연변이와 반대 사슬 B의 작은 잔기에 대한 W6081의 교환을 중심으로 이루어졌다. 리드 설계(스테릭 6)의 예가 도 9에 나와 있다. 큰 소수성 잔기가 사슬 A의 6085Y 및 6086 위치에 도입된 반면, 공동은 사슬 B의 트레오닌에 대한 W6081의 교환으로 생성되었다. 스테릭 6은 2개의 추가 사슬 B 돌연변이를 포함하지만, 사슬 A의 위치 6085Y 및 6086에 도입된 큰 소수성 잔기를 수용하는 공동을 생성하는 역할을 하는 더 작은 측쇄를 가진 잔기에 대한 위치 6081의 트립토판의 대체이다. 이 세 가지 돌연변이는 함께 이종이량체 형성을 선호하는 우세한 입체 설계를 생성하는 것으로 간주된다. 이와 같이, 이 세 위치(A: 6085Y & 6086, B:6081)에서의 돌연변이는 IgA Fc 이종이량체 형성을 촉진하는 돌연변이의 최소 핵심 세트를 구성하는 것으로 간주된다. 구체적으로, 돌연변이의 핵심 세트는 더 작은 측쇄를 갖는 잔기로 사슬 B에서 W6081의 치환과 결합된 더 크고/더 크거나 더 많은 소수성 측쇄를 함유하는 잔기로 사슬 A에서 각각의 A6085Y 및 T6086의 치환이다. 위치 6085Y 및 6086에서의 도입에 적합하다고 인실리코 분석에 의해 예측되는 더 크고/더 크거나 더 많은 소수성 잔기는 F, Y, M, W 및 H를 포함하고, 인실리코 분석에 의해 위치 6081에서의 도입에 적합하다고 예측되는 더 작은 잔기는 T, L, A, V 및 I를 포함한다.
리드 설계의 돌연변이
변이체 설계 사슬 A 돌연변이 사슬 B 돌연변이
정전기 설계
32510 정전기 1　 T6020D_L6024D_R6026D_I6088E T6020R_L6024R
32511 정전기 2　 T6020E_L6024E_R6026D_I6088D_ R6090E T6020R_L6024K
32512 정전기 3　 T6020E_R6026D_I6088D_R6090D T6020R_L6024K_I6088R
32513 정전기 4　 T6020E_R6026D_I6088E_R6090E T6020K_L6024K_R6026K_I6088R
32514 정전기 5　 R6026D_E6084BD_I6088D_R6090E L6024K_R6026K_E6084BR_ I6088K
32515 정전기 6　 R6026D_E6084BD_I6088D_R6090E L6024K_R6026K_I6088K
입체 설계
32516 스테릭 1 A6085YY_T6086L L6079T_W6081L_I6088L
32517 스테릭 2 A6085YY_T6086Y L6079T_W6081L_I6088L
32518 스테릭 3 A6085YF_T6086Y L6079V_W6081L_I6088L
32519 스테릭 4 L6024M_A6085YF_T6086W W6081L
32520 스테릭 5 A6085YY_T6086M L6079V_W6081L_I6088L
32521 스테릭 6 A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
33330 스테릭 7 T6022V_A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
33331 스테릭 8 T6022L_A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
33332 스테릭 9 T6022I_A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T_I6088L
33333 스테릭 10 A6085YF_T6086Y L6007F_L6079V_W6081T_I6088L
33334 스테릭 11 H6005Y_A6085YF_T6086Y H6005Y_L6079V_W6081T_ I6088L
리드 설계 선택에 사용되는 예시 메트릭
설계 사슬 1 Δ 물리 기반 친화도 [kcal/mol] 2,3 Δ 지식 기반 친화도 [kcal/mol] 2,3 Δ SASA
[Å 2 ] 2,4 		최대 초과 vdW 중첩 [Å] 5
스테릭 1 A/A 2.3E+02 2.3E+02 -3.1E+01 5.1E-01
B/B 6.1E+01 1.8E+02 1.1E+02 1.8E-01
A/B 2.0E+01 7.4E+01 3.3E+01 1.6E+01
B/A 1.7E+01 1.0E+02 1.0E+01 7.0E-02
스테릭 2 A/A 2.5E+02 5.5E+02 -3.5E+01 6.2E-01
B/B 6.1E+01 1.8E+02 1.1E+02 1.8E-01
A/B 1.6E+01 -7.3E+01 5.0E+01 1.8E-01
B/A 4.9E+00 -5.4E+01 -5.4E+00 1.6E+01
스테릭 3 AA 1.5E+02 7.8E+02 -3.2E+01 6.5E-01
B/B 6.3E+01 -1.3E+02 1.2E+02 2.2E-01
A/B 2.5E+00 -1.7E+02 2.4E+01 1.0E-01
B/A 5.1E-01 -1.7E+02 -3.6E+01 1.6E+01
스테릭 4 A/A 7.9E+01 5.8E+02 -8.0E+01 5.1E-01
B/B 5.5E+01 8.6E+01 1.4E+02 3.0E-02
A/B 2.1E+01 3.4E-01 1.5E+00 4.2E-01
B/A 8.5E+00 -1.3E+02 2.0E+01 2.6E-01
스테릭 5 A/A -9.5E+01 2.1E+01 -2.9E+01 4.9E-01
B/B 6.3E+01 -1.3E+02 1.2E+02 2.2E-01
A/B 1.6E+01 -7.7E+01 3.5E+01 1.3E-01
B/A 1.2E+01 -5.8E+01 -9.8E+00 1.4E+01
스테릭 6 A/A 1.0E+02 6.5E+02 -2.4E+01 6.2E-01
B/B 7.2E+01 3.0E+02 1.4E+02 2.2E-01
A/B 1.4E+01 1.0E+02 7.1E+00 1.0E-01
B/A 1.1E+01 -6.8E+01 -1.8E+01 1.8E-01
스테릭 7 A/A -1.2E+01 3.1E+02 -1.3E+00 3.5E+01
B/B 7.4E+01 3.5E+02 1.4E+02 1.9E-01
A/B 1.5E+01 1.0E+02 -8.2E+00 2.6E-01
B/A 1.1E+01 1.0E+02 3.1E+01 2.1E+01
스테릭 8 A/A -2.6E-01 2.1E+02 -3.3E+01 3.4E-01
B/B 7.4E+01 3.5E+02 1.4E+02 1.9E-01
A/B 4.2E+00 -1.6E+02 -1.1E+01 1.6E+01
B/A 1.9E-01 -9.5E+01 4.2E+00 2.9E-01
스테릭 9 A/A 1.6E+01 2.4E+02 -3.2E+01 2.6E-01
B/B 7.4E+01 3.5E+02 1.4E+02 1.9E-01
A/B 5.1E+00 -1.5E+02 -3.6E+00 1.5E-01
B/A 1.2E+01 -1.4E+02 1.3E+01 1.8E-01
스테릭 10 A/A -1.2E+01 3.3E+02 6.4E+00 4.6E-01
B/B 6.0E+01 3.2E+02 1.6E+02 1.8E-01
A/B -2.7E-01 -8.5E+01 -2.2E+01 1.6E-01
B/A 6.6E+00 1.3E+02 6.7E+00 1.9E-01
스테릭 11 A/A -2.6E-01 3.1E+02 -4.0E+01 4.0E-01
B/B 6.6E+01 2.0E+02 1.5E+02 1.9E-01
A/B 4.8E-01 -2.0E+02 -6.4E+00 1.2E+01
B/A 4.9E+00 -1.8E+02 1.2E+01 1.8E-01
정전기 1 B/B 9.4E+01 1.8E+02 -3.0E+01 2.1E+01
A/A 3.1E+01 4.4E+02 7.7E+01 1.0E-01
B/A -3.0E+02 1.4E+02 6.5E+00 1.4E+01
A/B -1.6E+00 1.3E+02 3.0E+01 1.9E-01
정전기 2 B/B 1.2E+02 3.2E+02 -6.7E+00 2.7E-01
A/A 5.8E+01 5.9E+02 7.5E+01 2.0E+01
B/A -5.2E+00 2.4E+02 5.2E+01 1.8E-01
AB -1.0E+01 2.2E+02 9.1E+00 1.6E+01
정전기 3 B/B 1.2E+02 3.1E+02 -7.0E+01 1.6E-01
A/A 5.4E+01 5.7E+02 5.3E+01 1.7E-01
B/A 6.4E+00 1.9E+02 2.3E+01 1.1E+01
A/B 9.5E+01 1.9E+02 2.6E-01 1.7E-01
정전기 4 B/B 8.9E+01 3.4E+02 -2.2E+01 3.4E-01
A/A 5.1E+01 5.8E+02 8.8E+01 1.7E-01
B/A -2.8E+00 2.5E+02 4.1E+01 1.4E-01
A/B -3.0E+00 2.3E+02 8.7E+00 2.6E-01
정전기 5 B/B 8.1E+01 4.1E+02 -5.5E+00 1.8E-01
A/A 1.9E+01 3.6E+02 1.7E+02 1.0E-01
B/A -1.7E+01 2.6E+02 6.6E+01 5.0E-02
A/B 1.5E+01 2.5E+02 2.0E+01 5.0E-02
정전기 6 B/B 5.5E+01 3.6E+02 -1.1E+01 1.9E-01
A/A 1.9E+01 3.4E+02 1.6E+02 1.2E+01
B/A -2.2E+01 3.4E+02 7.7E+01 1.8E-01
A/B -2.0E+01 3.0E+02 6.6E+01 1.1E-01
1 표 11에 정의된 바와 같이 조사된 복합체에 사용된 사슬을 의미한다. A/A 및 B/B는 선호되지 않도록 설계된 동종이량체이고, A/B 및 B/A는 선호되는 복합체로 설계된 이종이량체를 나타낸다.
2 Δ는 야생형(WT) IgA CH3 동종이량체와 비교하여 보고된 메트릭의 차이를 나타낸다.
3 WT 복합체와 비교하여 사슬 A와 사슬 B 상호작용의 에너지론에 대해 보고하는 메트릭스. 음수 값은 WT 복합체에 비해 더 유리한 상호작용을 나타내고, 양수 값은 WT 복합체에 비해 덜 유리한 상호작용을 나타낸다.
4 SASA = 용매 접근가능한 표면적 음수 값은 일반적으로 더 나은 포장 및 더 유리한 상호작용과 관련된 WT 복합체와 비교하여 SASA의 손실을 나타낸다. 양수 값은 일반적으로 더 불량한 포장 및 덜 유리한 상호작용과 관련된 SASA의 이득을 나타낸다.
5 가장 큰 반 데르 발스(vdW) 충돌 범위에 대해 보고하는 지표이다. 높은 값은 일반적으로 낮은 구조 모델 품질과 관련이 있으며 안정적인 복합체를 생성할 가능성이 적은 반면 낮은 값은 좋은 모델 품질 및 다른 메트릭의 높은 예측력과 관련된다.
실시예 2: 이종이량체 IgA Fc를 사용한 외팔 항체(OAA: One-Armed Antibody ) 작제물의 생성
실시예 1에 기술된 바와 같이 이종이량체화를 유도할 것으로 예측된 돌연변이를 IgA Fc를 함유하는 외팔 항체 작제물에 도입하여 그들의 기능을 평가하였다.
방법
효과에 대해 IgA Fc의 이종이량체 쌍을 유도하도록 설계된 돌연변이를 평가하기 위해 두 반쪽 사이에 상당한 무게 차이가 있는 IgA 외팔 항체 형식을 설계했다. 하나의 절반 항체는 중쇄에서 IgA Fc에 융합된 IgG1 기반 항-Her2 Fab(중쇄: SEQ ID NO:38, 경쇄: SEQ ID NO:39, Carter, et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89:4285-4289)로 구성되었다. IgA2 힌지(SEQ ID NO: 40)에 N-말단에 부착된 상부 IgG1 힌지(SEQ ID NO: 40)를 포함하는 키메라 힌지를 사용하여 IgG1 Fab를 IgA2 Fc에 연결했다. IgA Fc의 서열은 IgA2m1 알로타입의 CH2 및 CH3 도메인의 서열과 유사하였다(Chintalacharuvu, et al., 1994, J Immunol, 152:5299-5304). WT IgA의 분비 구획에 부착되는 위치 C5092(표 2에 나타낸 바와 같은 IMGT 넘버링) 및 N5120 글리코실화 부위를 돌연변이시키고 α-테일피스를 제거하여 Lohse et al., 2016, Cancer Res, 76:403-417에 기재된 바와 같이 작제물이 G6129로 종료되었다(표 4의 SEQ ID NO:43 참조).
외팔 항체 형식의 나머지 절반은 Fab 없이 IgA2m1 CH2 및 CH3에 융합된 IgA2 힌지(SEQ ID NO:41)으로 구성되었다. 위의 중쇄에서와 동일한 Fc-돌연변이도 포함되었다. 실시예 1에서 이종이량체 페어링을 유도하는 것으로 예측되고 표 11에 열거된 돌연변이를 외팔 항체 작제물 Fc의 CH3 도메인에 도입하여 표 13에 기재된 변이체를 생성하였다. VH 및 CH1(H1)을 포함하는 중쇄에 A 사슬 돌연변이가 도입되었고 Fc 단독 중쇄에 B 사슬 돌연변이가 도입되었다.
OAA 형식의 이종이량체 IgA 변이체
변이체 설계 클론 번호 H1 클론 번호 L1 클론 번호 H2
32595 WT IgA 21755 11150 21715
32510 정전기 1 23773 11150 23767
32511 정전기 2 23774 11150 23768
32512 정전기 3 23775 11150 23769
32513 정전기 4 23776 11150 23770
32514 정전기 5 23777 11150 23771
32515 정전기 6 23777 11150 23772
32516 스테릭 1 23778 11150 23783
32517 스테릭 2 23779 11150 23783
32518 스테릭 3 23780 11150 23784
32519 스테릭 4 23781 11150 23785
32520 스테릭 5 23782 11150 23784
32521 스테릭 6 23780 11150 23786
33330 스테릭 7 24674 11150 23786
33331 스테릭 8 24675 11150 23786
33332 스테릭 9 24676 11150 23786
33333 스테릭 10 23780 11150 24677
33334 스테릭 11 24678 11150 24679
실시예 3: 이종이량체 IgA 외팔 항체의 생산
실시예 1 및 2에서 설계되어 있는 변형된 IgA OAA 변이체의 중쇄 및 경쇄 서열을 발현 벡터로 클로닝하고 하기 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다.
방법
실시예 2에 기재된 신호 펩티드(EFATMRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG [SEQ ID NO:49])(Barash et al., 2002, Biochem and Biophys Res. Comm., 294:835-842)와 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 벡터 삽입체를 pTT5 벡터에 연결하여 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 생성하였다. 벡터를 시퀀싱하여 코딩 DNA의 정확한 리딩 프레임(reading frame) 및 서열을 확인하였다.
변형된 IgA OAA 변이체의 중쇄 및 경쇄 및 Fc-단독 사슬은 Expi293F™ 셀들TMhermo Fisher, Waltham, MA)의 25 mL 배양액에서 공동발현시켰다. Expi293™ 세포를 Expi293™ 발현 배지(Thermo Fisher, Waltham, MA) 중 37℃ 및 8% CO2의 가습 분위기에서 125 rpm으로 회전하는 오비탈 진탕기에 배양하였다. 총 세포 수가 7.5 × 107인 셀들인 25 mL 부피를 H1:L1:H2에 대해 30:40:30의 형질감염 비율로 총 25 μg의 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 전에 DNA를 1.5 mL의 Opti-MEM™ I 저혈청 배지(Thermo Fisher, Waltham, MA)에 희석하였다. 1.42 mL 부피의 Opti-MEM™ I 저혈청 배지에 80 μL의 ExpiFectamine™ 293 시약(Thermo Fisher, Waltham, MA)을 희석하고, 5분 동안 배양한 후, 총 부피 3 mL로 DNA 형질감염 믹스와 합하였다. 10 내지 20분 후 DNA-ExpiFectamine™ 293 시약 혼합물을세포 배양액에 첨가하였다. 37℃에서 18~22시간 동안 배양한 후, 150 μL의 ExpiFectamine™ 293 Enhancer 1 및1.5 mL의 ExpiFectamine™ 293 Enhancer 2(Thermo Fisher, Waltham, MA)를 각 배양액에 첨가하였다. 세포를 5 내지 7일 동안 배양하고 상등액(supernatants)을 단백질 정제를 위해 수확하였다.
정화된 상등액 샘플을 PBS로 1:1로 희석하고 AKTA™ Pure FPLC 시스템(GE Life Sciences)의 Millipore Vantage L x 250 컬럼에 사내 포장된 2 mL의 CaptureSelectTM IgA Affinity Matrix (ThermoFisher, Waltham, MA)에 적용했다. 컬럼을 PBS에서 평형화하였다. 로딩 후, 컬럼을 PBS로 세척하고 단백질을 0.1 M 글리신(pH 2.5)으로 용출시켰다. 용출된 샘플은 10%(v/v) 1 M Tris pH 9를 첨가하여 pH를 조정하여 6~7의 최종 pH를 만들었다. 변이체는 실시예 4에 기재된 바와 같이 비환원성 CE-SDS 및 UPLC-SEC에 의한 친화성 크로마토그래피 후 이종이량체 순도에 대해 평가되었다.
농축 후 동종이량체 Fc 종 및 기타 불순물로부터 이종이량체를 분리하기 위해 상당량의 이종이량체 종을 갖는 변이체 물질을 AKTA Pure FPLC System(GE Life Sciences)에 주입하고 PBS pH 7.4로 사전 평형화한 Superdex 200 Increase 10/300 GL(GE Life Sciences) 컬럼에서 실행하였다. 단백질을 0.75 mL/분의 속도로 컬럼에서 용출하였고 0.5 mL 분획으로 수집하였다. 0.5 mg/mL 이상의 표적 단백질 농도와 95% 이상의 CE-SDS 순도를 갖는 피크 분획을 Vivaspin™ 20, 30 kDa MWCO 폴리에테르설폰 농축기(MilliporeSigma, Burlington, MA)를 사용하여 풀링하고 농축하였다. 0.2 μm PALL Acrodisc™ Syringe Filters with Supor™ Membrane을 통해 멸균 여과한 후 A280 nm(Nanodrop)를 기준으로 단백질을 정량하고 냉동하여 추가 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다.
결과
정전기 설계 돌연변이를 포함해도 검출 가능한 발현이 있는 변이체가 생성되지 않았으며, 이는 이러한 돌연변이의 파괴적 특성을 나타낸다. 반대로, 모든 입체 설계는 테스트 조건 하에서 발현을 보였고 10개의 설계를 정제하고 추가로 조사했다(스테릭 1~4, 스테릭 6~11). 이러한 변이체의 일부 샘플은 친화성 크로마토그래피 후 매우 순수한 이종이량체 종을 나타내겠지만, 동종이량체 Fc 종뿐 아니라 절반 항체 및 응집체와 같은 기타 불순물의 존재로 인해 대부분의 경우 고순도 샘플을 얻기 위해 Preparative SEC가 필요했다(실시예 4 참조). WT IgA Fc OAA뿐만 아니라 스테릭 1~3 및 스테릭 6~11 설계에 대해 Preparative SEC를 수행한 후 수율은 30~200 mg/L의 발현 배양 범위였다. 샘플 순도 및 안정성 평가는 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 6에 기재되어 있다.
실시예 4: 친화성 크로마토그래피 후 리드 설계의 이종이량체 순도 평가
OAA 변이체는 CaptureSelect IgA 친화성 정제 후 및 SEC 정제 전에 비환원성 CE-SDS 및 UPLC-SEC에 의해 이종이량체 순도 및 샘플 균질성에 대해 평가했다.
방법
CaptureSelect IgA 친화성 정제 후, CE-SDS LabChip®GXII(Perkin Elmer, Waltham, MA)를 사용한 비환원성 및 환원성 고처리량 단백질 발현(High Throughput Protein Express) 검정으로 샘플의 순도를 평가하였다. HT Protein Express LabChip®사용자 가이드 버전 2에 따라 다음과 같이 수정하여 절차를 수행했다. 2 uL 또는 5 uL(농도 범위 5~2000 ng/ul)의 항체 샘플을 7 uL의 HT 단백질 발현 샘플 완충액(Protein Express Sample Buffer)(Perkin Elmer # 760328)과 함께 96웰 플레이트(BioRad, Hercules, CA)의 별도 웰에 첨가하였다. 그런 다음 샘플을 90℃에서 5분 동안 변성시키고 각 샘플 웰에 35 μl의 물을 첨가했다. LabChip® 기기는 HT Protein Express Chip(Perkin Elmer #760499) 및 HT Protein Express 200 검정 설정(14kDa-200kDa)을 사용하여 작동하였다.
UPLC-SEC를 25℃에서 Agilent Technologies AdvanceBio SEC 300A 컬럼을 사용하여 Agilent Technologies 1260 Infinity LC 시스템에서 수행하였다. 주입 전 샘플을 10000 g에서 5분간 원심분리한 후 5 μL를 컬럼에 주입하였다. 샘플을 PBS(pH 7.4)에서 1 mL/분의 유속으로 7분 동안 실행하고 190~400 nm에서 UV 흡광도로 용출을 모니터링하였다. 크로마토그램은 280 nm에서 추출되었다. 피크 통합(peak integration)은 OpenLAB CDS ChemStation 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
결과
WT IgA OAA(v32595)의 비환원성 CE-SDS 분석은 Fc 및 이종이량체 OAA 종과 함께 동종이량체 FSA(Full Sized Antibody)의 혼합을 보여주었다(도 2). 이종이량체 종은 존재하는 각 동종이량체 종의 수가 적어서 가장 두드러졌다. 이것은 존재하는 이종이량체 형성을 촉진하는 임의의 돌연변이가 없는 두 Fc 사슬의 등몰 발현에서 예상되는 종의 분포이며(Ridgway, et al., 1996, Protein Eng, 9:617-621), 또한 UPLC-SEC에 의해 보였다(도 3a).
이종이량체 형성을 촉진하는 돌연변이를 포함한 변이체는 WT IgA OAA와 비교하여 비환원성 CE-SDS(도 2)와 UPLC-SEC(도 3) 모두에서 종의 분포가 현저히 다른 것으로 나타났다. FSA 동종이량체는 도 2 및 도 3에 도시된 입체 설계 중 어느 것에도 존재하지 않았지만, OAA 이종이량체 외에 다양한 수준의 Fc 동종이량체 및 반항체(half antibody) 종을 발견할 수 있었다. 특히, 스테릭 3(v32518; 도 3d) 및 스테릭 6(v32521; 도 3f) 설계는 CE-SDS 및 UPLC-SEC 모두에 의해 95%가 넘는 이종이량체 순도에 도달하는 스테릭 6과 함께 OAA 이종이량체 종의 순도가 상당히 증가한 것으로 나타났다. 반대로, 스테릭 4(v32519; 도 3e)는 OAA 이종이량체 또는 FSA 동종이량체 종을 함유하지 않고 Fc 동종이량체 및 상응하는 반항체만을 함유하며, 이는 도입된 돌연변이에 의해 야기될 가능성이 있는 다른 중쇄의 발현 문제를 가리킨다. 머무름 시간 3분 미만의 작은 피크의 존재는 모든 샘플에서 올리고머 및 응집체와 같은 소량의 고분자량 종의 존재를 나타낸다.
실시예 5: 크기 배제 크로마토그래피 후 리드 설계의 이종이량체 순도 평가
선택된 설계의 SEC 정제 후, 하기 기술된 바와 같이 비환원성 및 환원성 CE-SDS 및 UPLC-SEC에 의해 샘플의 균질성에 대해 샘플을 평가하였다.
방법
비환원성 CE-SDS 및 UPLC-SEC를 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 환원성 조건에서 전기영동 분석을 위해, CE-SDS 프로토콜을 HT Protein Express Sample Buffer 100 μL에 DTT(1M) 3.5 μL를 추가하여 수정하였다.
결과
실시예 3에 기재된 바와 같이 SEC에 의해 정제된 이종이량체 OAA 샘플의 UPLC-SEC 추적 및 CE-SDS 전기영동 프로파일(환원 및 비환원)을 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다. UPLC-SEC의 분석은 90% ~100%의 이종이량체 OAA 종을 포함하는 매우 균일한 샘플을 보여주었다. 주요 종에 비해 낮은 머무름 시간에서 작은 피크의 존재와 높은 머무름 시간에서 숄더의 존재는 WT IgA(도 4a), 스테릭 1(도 4b) 및 스테릭 2(도 4c) 설계에 소량의 동종이량체가 존재함을 나타낸다. SEC 정제 후, 비환원성 CE-SDS는 조사된 모든 변이체에 대해 단일 우세한 종을 보여주었다. 환원성 CE-SDS에 의해 모든 변이체의 3개의 온전한 사슬에 해당하는 밴드만이 관찰되었다. 특히, 경쇄 및 Fc 단독 중쇄는 유사한 분자량(23.4 kDa 및 23.7 kDa)을 가지며 환원성 CE-SDS 프로필에서 하나의 밴드로 나타난다.
실시예 6: 리드 IgA 이종이량체 설계의 열 안정성
Preparative SEC 후 이종이량체 OAA 변이체의 정제된 샘플은 하기 기술된 바와 같이 시차 주사 열량계(DSC)로 열 안정성에 대해 평가하였다.
방법
실시예 3에 기재된 Preparative SEC 후, 이종이량체 OAA 설계의 샘플을 PBS에서 0.5~1 mg/ml로 희석하였다. NanoDSC(TA Instruments, New Castle, DE, USA)를 사용한 DSC 분석을 위해, 950 μl의 샘플 및 매칭 버퍼(PBS)를 각각 샘플 및 기준 96 웰 플레이트에 첨가하였다. DSC 실행 시작 시 기준선을 안정화하기 위해 버퍼(PBS) 블랭크 주입을 수행하였다. 이어서 각 샘플을 주입하고 60 psi 질소 압력을 사용하여 1℃/분으로 25℃에서 95℃까지 스캔하였다. 서모그램은 NanoAnalyze 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. S자형 곡선을 사용하여 매칭 버퍼 서모그램을 샘플 서모그램 및 기준선 피트(baseline fit)에서 뺐다. 이어서 데이터를 2-상태 스케일링된 DSC 모델에 맞췄다.
결과
수정되지 않은 IgA CH3-CH3 계면(v32595)가 포함된 WT IgA OAA의 DSC 서모그램은 74℃와 81℃에서 두 가지 전이를 보여준다(도 6a). 81℃에서 더 우세한 전이는 조사된 모든 설계에 존재했으며 Fab의 언폴딩(unfolding)이 CH2 도메인의 언폴딩과 겹쳤기 때문이며, 둘 다 설계에서 돌연변이되지 않았다. 반대로, 전이는 설계 전체에서 변화하는 것으로 관찰되었으며 CH3 도메인의 언폴딩에 기인했다(도 6a~b). 스테릭 2(v32517)의 변형된 CH3는 WT(Tm 55℃ 대 74℃)에 비해 상당히 불안정한 반면, 이종이량체 순도가 가장 높은 설계는 WT에 가까운 CH3 안정성을 나타낸다. 전이는 스테릭 3(v32518) 및 스테릭 6(v32521)에 대해 각각 65.9℃ 및 71.9℃에서 관찰되었다. 가장 높은 열 안정성을 보인 두 설계는 각각 72.0℃와 73.6℃에서 CH3 언폴딩 전이가 관찰된 스테릭 10(v33333)과 스테릭 11(v33334)이었다. 실시예 4에서 CE-SDS 및 UPLC-SEC에 의해 평가된 이 2가지 설계의 이종이량체 순도는 스테릭 3 및 스테릭 6보다 낮은 반면, 이러한 더 높은 열 안정성이 관찰되었다.
요약하면, IgA Fc의 이종이량체 형성을 현저하게 유도하는 IgA CH3 도메인에서 돌연변이 조합이 확인되었다. 이러한 돌연변이를 지닌 이종이량체 변이체의 CH3 도메인의 열 안정성은 스테릭 6(v32521), 스테릭 10(v33333) 및 스테릭 11(v33334) 설계에 대한 WT IgA CH3의 ~2℃ 이내였다. 테스트된 입체 설계의 특성은 표 14에 요약되어 있다.
입체 설계 1~3 및 6~11의 특성 요약
HetFc 돌연변이 CSIgA 후 정제 Prep SEC 후 정제
사슬 A 사슬 B UPLC-SEC
순도(%) 		CE-SDS
순도(%) 		수율(mg/L 배양액) UPLC-SEC
순도(%) 		CE-SDS
순도(%)
-- -- 52 49 324 91 92
A6085YY_T6086L L6079T_W6081L_
I6088L		 49 36 148 98 93
A6085YY_T6086Y L6079T_W6081L_
I6088L		 65 55 240 97 96
A6085YF_T6086Y L6079V_W6081L_
I6088L		 91 89 328 100 98
L6024M_A6085YF_
T6086W 		W6081L 5 3.7 60 ND
A6085YF_T6086Y L6079V_W6081T_
I6088L		 96 92 320 100 97
T6022V_A6085YF_
T6086Y		 L6079V_W6081T_
I6088L		 82 31 130 100
T6022L_A6085YF_
T6086Y 		L6079V_W6081T_
I6088L		 75 97 370 100
T6022I_A6085YF_
T6086Y 		L6079V_W6081T_
I6088L		 87 97 390 100
A6085YF_T6086Y L6007F_L6079V_
W6081T_I6088L		 72 88 370 100 85
H6005Y_A6085YF_
T6086Y 		H6005Y_L6079V_
W6081T_I6088L		 74 95 440 100
* DSC에 의해 결정된 CH3 도메인 Tm
실시예 7: IgA HetFc 설계의 추가 안정화
계면을 가로지르는 공유 이황화 가교를 통해 리드 IgA HetFc 설계의 열 안정성 및 이종이량체 순도를 증가시키기 위해 IgA Fc의 CH3 계면에 시스테인 돌연변이를 도입했다.
방법
IgA Fc의 계면에 있는 잔기 쌍은 이황화 결합의 구조를 수용하기에 충분하다고 결정된 Ca 및 Cb 거리에 기초하여 선택되었다. 그런 다음 선택된 잔기를 시스테인 잔기로 치환하고 생성된 공유 이황화 결합을 모델링했다. 생성된 구조는 독점적인 인실리코 도구를 사용하여 활발하게 평가되었다.
결과
시스테인 대체물은 스테릭 6 설계에 도입되었으며 독점 인실리코 도구로 평가되었다. 선택된 설계에 대한 예시 메트릭이 표 15에 나와 있다. 이어서 시스테인 치환을 WT OAA에서 단일 이황화 설계뿐 아니라 스테릭 6의 OAA 형식에서 단일 및 이중 이황화 설계로 도입하였다(표 16).
표 16에 나타낸 변이체는 이종이량체 순도 및 열 안정성에 대해 표현되고 평가될 것이다. UPLC-SEC 및 CE-SDS에 의해 평가된 스테릭 6 기반 설계(34688-34690)의 높은 이종이량체 순도는 스테릭 6과 비교할 때 보존될 것으로 예상되는 반면(CaptureSelect IgA 정제 후 UPLC-SEC 및 CE-SDS로 평가된 > 90%, 실시예 6 참조), DSC로 측정한 이러한 설계의 열 안정성은 계면에서 1개 또는 2개의 공유 이황화 결합의 추가로 인해 스테릭 6(> 71℃실시예 6 참조)과 비교할 때 상당히 증가할 것으로 예상된다. 변경되지 않은 WT IgA Fc(34691)에서 비대칭 방식으로 단일 이황화 설계로 도입될 때 UPLC-SEC 및 CE-SDS로 평가한 이종이량체 순도는 WT IgA에 비해 크게 개선될 것으로 예상되며(CaptureSelect IgA 정제 후 UPLC-SEC 및 CE-SDS로 평가한 바에 따라 50% 넘음, 실시예 6 참조) 열 안정성은 WT 이상(> 74℃실시예 6 참조)인 것으로 예측된다.
확인된 이황화 설계는 또한 실시예 1~6에서 확인된 다른 리드 HetFc 설계와 조합될 수 있고, OAA 포맷으로 표현되고, 정제되고, 실시예 2~6에 기재된 바와 같이 이종이량체 순도 및 열 안정성에 대해 평가된다.
이황화 결합 설계 선택에 사용되는 예시 메트릭
사슬 A
시스테인 돌연변이 		사슬 B
시스테인
돌연변이 		Δ 물리 기반 친화도 [kcal/mol] 1,2 Δ 지식 기반 친화도 [kcal/mol] 1,2 이황화 2면각
에너지 [kJ/mol] 3
충돌 횟수 4
H6005C P6010C 2.5E+01 -5.6E+01 1.3E+01 0
P6010C H6005C 1.4E+01 -5.7E+01 1.4E+01 0
1 Δ는 WT IgA CH3 동종이량체와 비교하여 보고된 메트릭의 차이를 나타낸다.
2 WT 복합체와 비교하여 사슬 A와 사슬 B 상호작용의 에너지론에 대해 보고하는 메트릭. 음수 값은 WT 복합체에 비해 더 유리한 상호작용을 나타내고, 양수 값은 WT 복합체에 비해 덜 유리한 상호작용을 나타낸다. 공유 이황화 가교의 형성에 의해 제공되는 에너지 차이는 포함되지 않는다.
3 이황화 결합의 이면각 스트레인(strain)에 대한 메트릭 보고. 값이 작을수록 각 스트레인이 적음을 나타낸다.
4 서로 다른 유형의 상호작용에 대해 정의된 거리 컷오프 아래에 있는 중원자(heavy atom) 사이의 거리에 대한 충돌에 플래그가 지정된다.
이황화 결합을 포함하는 선택된 이종이량체 IgA 변이체
변이체 설명 클론 번호 H1 클론 번호 L1 클론 번호 H2
34688 IgA Het_Fc OAA 스테릭 6
A H6005C B P6010C		 25880 11150 25881
34689 IgA Het_Fc OAA 스테릭 6
A P6010C B H6005C		 25882 11150 25883
34690 IgA Het_Fc OAA 스테릭 6
A H6005C P6010C
B H6005C P6010C		 25884 11150 25885
34691 WT IgA OAAA
H6005C B P6010C 		25886 11150 25887
실시예 8: IgA HetFc에 기초한 다량체, 다중특이적 형식
실시예 1~7에 기재된 IgA Fc의 이종이량체 짝짓기를 유도하는 돌연변이는 표적 결합 및 기능성에 대해 시험될 수 있는 다량체, 다중특이적 변이체를 구성하는 데 사용될 수 있다.
방법
C-말단 테일피스(SEQ ID NO:46 또는 47)를 포함하는 IgA1, IgA2m1 또는 IgA2m2 Fc의 두 사슬은 코어 IgA HetFc 스캐폴드를 형성하기 위해 실시예 1~6 및 표 11에 기재된 바와 같이 이종이량체 형성을 유도하는 CH3 도메인에서 돌연변이를 갖추고 있다. 하나의 표적에 특이적인 결합 도메인(예: Fab, scFv, VHH, 면역조절 Ig 도메인, 비-Ig 바이러스 수용체 디코이 및 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이) IgA1, IgA2 또는 IgG1/IgA2를 통해 IgA HetFc 사슬 중 하나의 N-말단에 연결되는 반면, 동일한 힌지를 사용하여 IgA HetFc의 다른 사슬의 N-말단에 또 다른 표적에 특이적인 두 번째 결합 도메인을 연결한다. 이어서 생성된 2개의 사슬은 연결 사슬(J-사슬)뿐 아니라 IgA HetFc 작제물을 완성하는 데 필요한 추가 폴리펩티드 사슬(예: 표적화 도메인으로 사용되는 Fab를 완성하기 위한 다른 사슬)과 함께 포유동물 발현 시스템에서 일시적으로 발현된다. Fc에 사용되는 IgA 알로타입 및 IgA Fc 사슬에 대한 J 사슬의 비율에 따라, 이는 이량체, 사량체 또는 오량체 분자의 형성을 초래하며(Lombana et al., 2019, MAbs, 11:1122-1138, Kumar, et al., 2020, Science, 367:1008-1014), 이량체, 사량체 또는 오량체 IgA HetFc 다량체의 각 IgA HetFc 결합 단위는 2개의 결합 도메인을 보유한다(도 8 참조). CaptureSelect™ IgA 친화성 크로마토그래피로 정제한 후 비환원성 및 환원성 SDS-PAGE 또는 CE-SDS, UPLC-SEC, 다각 광 산란(MALS) 또는 동적 광산란(DLS) 중 하나 이상을 사용하여 입자 크기의 순도와 균질성에 대해 샘플을 평가한다. 필요한 경우 샘플은 실시예 3에 설명된 대로 SEC에 의해 추가로 정제되고 샘플 품질은 이전에 설명된 대로 평가된다. 샘플은 표면 플라스몬 공명(SPR), 유세포 분석 또는 표적에 특이적인 기능 분석 중 하나 이상에 의해 표적 결합에 대해 테스트된다.
결과
IgA1 및 IgA2m1 HetFc를 기반으로 하는 IgA HetFc 다량체 변이체는 주로 이량체이지만, IgA2m2 HetFc를 기반으로 하는 것들은 SEC로 분리할 수 있는 이량체, 사량체 및 오량체 종을 나타낸다. 개별 표적에 대한 결합 연구에서, 다량체 스캐폴드에 의해 제공되는 결합력으로 인해 1가 결합에 비해 증가된 겉보기 친화성이 예상된다. 겉보기 친화도(apparent affinity)에 대한 이러한 결합력 효과(avidity effect)는 두 표적이 모두 결합 분석에 존재할 때 더욱 강화될 것으로 예상된다. IgG 기반, 단량체 및 이중특이적 항체와 비교할 때, 원자가가 증가하는 IgA HetFc 다량체(단량체 < 이량체 < 사량체 < 오량체)는 순차적으로 향상된 겉보기 친화도를 보여야 한다. 종합하면, 이 결합력 효과는 이전에 본 바와 같이 기능적 연구에 반영된 결합 표적에 대한 높은 특이성과 높은 효능으로 이어질 것으로 예상된다(Slaga et al., 2018, Sci Transl Med, 10(463):eaat5775; International Patent Publication WO 2016/141303 및 WO 2016/118641). 바이러스 또는 박테리아 병원체를 표적으로 삼을 때 IgA HetFc 다량체의 높은 원자가는 표적(들)의 응집과 제거로 이어질 것으로 예상되는 반면 다중 특이성은 돌연변이 탈출을 제한하고 지속적으로 높은 수준의 중화를 보장한다.
실시예 9: Fc α RI에 대한 결합을 제거하기 위한 돌연변이를 포함하는 이종이량체 IgA Fc
기능에 대한 IgA Fc를 통한 FcαRI 맞물림의 원자가의 영향을 평가하기 위해, 실시예 1~7에 기재된 돌연변이에 기초한 이종이량체 IgA Fc를 사용하여 단일 FcαRI 결합 부위를 갖는 IgA Fc를 구성했다.
방법
IgA Fc:FcαRI 상호작용을 방해하는 것으로 확인된 돌연변이(F6116A, Posgai, MT et al., 2018, Proc Natl Acad Sci USA 115:E8882-E8891)가 스테릭 6 설계의 OAA 변이체 중 하나 또는 둘 모두에 도입되었다(표 17). 야생형 스테릭 6 OAA(32521) 뿐만 아니라 이들 변이체를 실시예 3~6에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 다른 작제물은 이종이량체 IgA Fc의 두 사슬에서 다른 FcαRI 친화도를 달성하는 돌연변이의 조합을 포함할 수 있다. 가능한 조합이 표 18에 나와 있다. 이들 변이체는 FcαRI에 대한 결합 및 호중구 활성화에 대해 평가될 수 있다. FcαRI 결합 부위를 2개, 1개 포함하거나 포함하지 않는 변이체의 개략도가 도 11에 나와 있다.
FcαR 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 스테릭 6 OAA에 기반한 이종이량체 IgA 변이체
변이체 추가적인 돌연변이 사슬 A 추가적인 돌연변이 사슬 B 클론 번호 H1 클론 번호 L1 클론 번호 H2
35060 F6116A F6116A 26235 11150 26236
35061 F6116A 26235 11150 23786
IgA HetFc에서 FcαRI 친화도의 가능한 조합
사슬 A FcαRI 친화도 사슬 B FcαRI 친화도
WT 대비 증가 WT 대비 증가
WT 대비 증가 WT
WT 대비 증가 WT 대비 감소
WT 대비 증가 제거됨
WT WT 대비 증가
WT WT
WT WT 대비 감소
WT 제거됨
WT 대비 감소 WT 대비 증가
WT 대비 감소 WT
WT 대비 감소 WT 대비 감소
WT 대비 감소 제거됨
제거됨 WT 대비 증가
제거됨 WT
제거됨 WT 대비 감소
제거됨 제거됨
결과
결합을 증가, 감소 또는 제거하는 것을 목표로 하는 변형된 FcαRI 결합 부위를 가진 변이체는 WT IgA Fc와 비교하여 FcαRI에 대한 친화도 범위 및 호중구 활성화 검정에서 범위 활성을 나타낼 것으로 예상된다. 두 사슬의 녹아웃 돌연변이는 결합 및 호중구 활성화를 제거할 것으로 예상되는 반면, 두 사슬에서 FcαRI 결합을 증가시키는 것을 목표로 하는 돌연변이는 결합 및 호중구 활성화를 증가시키고 가능한 가장 높은 활성을 구성할 것으로 예상된다. 표 18에 나타낸 다른 모든 조합은 이러한 한계들 사이의 수준에서 결합 및 호중구 활성화를 나타낼 것으로 예상된다.
실시예 10: FcaRI 및 FcRn 결합 부위를 포함하는 이종이량체 IgA Fc
실시예 1~7에 기재된 이종이량체 IgA Fc의 어셈블리를 유도하는 돌연변이는 FcαRI를 통해 호중구를 활성화할 수 있을 뿐만 아니라 FcRn 결합 부위의 존재로 인해 증가된 반감기를 가질 수 있는 IgA 기반 변이체를 구성하는 데 사용된다.
방법
신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 IgG Fc의 결합에 중요한 잔기(Oganesyan, V. et al., 2014, J Biol Chem 289:7812-7824)는 이종이량체 IgA 변이체에 접합되어(grafted) FcRn 및 FcαRI와 결합할 수 있는 작제물을 생성한다. FcαRI 및 FcRn 결합 부위가 각각 IgA 및 IgG의 CH2/CH3 계면에서 구조적으로 동등한 위치에 위치하기 때문에 이종이량체 Fc가 필요하다(Kelton, W. et al., 2014, Chem Biol 21:1603-1609). FcRn 결합 부위의 접합은 IgA 및 IgG Fc의 펩티드 백본 원자의 오버레이 및 IgG:FcRn 결합 패치에 대한 IgA의 구조적으로 동등한 잔기의 확인에 의해 달성된다. 그런 다음 이들은 IgG 대응물로 교체된다. 또는, IgG에서 FcRn 친화성을 변형시키는 것으로 알려진 돌연변이가 포함될 수 있다(Robbie, GJ et al., 2013, Antimicrob Agents Chemother 57:6147-6153, Yeung, YA et al., 2009, J Immunol 182:7663-7671). , Hinton, PR et al., 2006, J Immunol 176:346-356, Hinton, PR et al., 2004, J Biol Chem 279:6213-6216, 1 Dall'Acqua, WF, Kiener, PA & Wu , H., 2006, J Biol Chem 281:23514-23524). 독점적인 인실리코 도구를 사용하여 여러 설계를 활발하게 평가했다. 이들은 발현, 정제된 후 FcαRI 및 FcRn에 대한 결합뿐 아니라 생체외 호중구 활성화 및 생체내 반감기에 대해 평가된다. 이러한 변이체의 개략도는 도 12에 나와 있다.
결과
FcαRI 및 FcRn 모두에 대한 결합이 달성된 변이체는 FcRn 결합 부위가 없는 IgA Fc와 비교할 때 생체내 모델에서 FcRn의 상당히 증가된 반감기뿐 아니라 호중구 ADCC 분석에서 활성을 나타낼 것으로 예상된다.
서열표
본원에 기재된 클론에 대한 SEQ ID NO의 간략한 설명이 표 19에 제공되어 있다. 각 SEQ ID NO에 대한 아미노산 서열은 표 20에 나와 있다.
IgA HetFc 작제물을 준비하는 데 사용된 클론에 대한 간략한 설명(표 13 및 표 16도 참조)
SEQ ID NO 클론 ID 도메인 구조
1. 11150 Tras* VL - IgKCL
2. 21715 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
3. 21755 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
4 23767 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
5 23768 IgA2 hinge - IgA2m1 C2 - IgA2m1 CH3
6. 23769 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
7 23770 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
8 23771 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
9 23772 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
10 23773 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
11 23774 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
12 23775 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
13 23776 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
14 23777 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
15 23778 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
16 23779 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
10 23780 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
18 23781 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
19 23782 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
20 23783 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
21 23784 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
22 23785 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
23 23786 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
24 24674 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
25 24675 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
26 24676 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
27 24677 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
28 24678 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
29 24679 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
30 25880 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
31 25881 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
32 25882 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
33 25883 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
34 25884 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
35 25885 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
36 25886 Tras VH - IgG1 CH1 - IgG1/IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
37 25887 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3
*Tras - 트라스투주맙(Trastuzumab)
아미노산 서열
SEQ
ID NO 		클론
번호 		설명 서열
1. 11150 전장 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
2. 21715 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
3. 21755 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
4 23767 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVRLTCRARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
5 23768 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVRLTCKARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
6. 23769 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVRLTCKARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSRLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
7 23770 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVKLTCKAKGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSRLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
8 23771 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCKAKGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQRPSQGTTTFAVTSKLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
9 23772 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCKAKGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSKLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
10 23773 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVDLTCDADGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSELRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
11 23774 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVELTCEADGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSDLEVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
12 23775 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVELTCLADGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSDLDVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
13 23776 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVELTCLADGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSELEVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
14 23777 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLADGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQDPSQGTTTFAVTSDLEVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
15 23778 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFYVLSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
16 23779 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFYVYSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
10 23780 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFFVYSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
18 23781 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCMARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFFVWSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
19 23782 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFYVMSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
20 23783 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYTTLASRQEPSQGTTTFAVTSLLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
21 23784 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYVTLASRQEPSQGTTTFAVTSLLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
22 23785 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTLASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
23 23786 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYVTTASRQEPSQGTTTFAVTSLLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
24 24674 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLVCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFFVYSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
25 24675 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLLCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFFVYSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
26 24676 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLICLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFFVYSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
27 24677 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLFPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYVTTASRQEPSQGTTTFAVTSLLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
28 24678 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVYLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFFVYSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
29 24679 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVYLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYVTTASRQEPSQGTTTFAVTSLLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
30 25880 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVCLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFFVYSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
31 25881 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPCSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYVTTASRQEPSQGTTTFAVTSLLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
32 25882 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPCSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFFVYSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
33 25883 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVCLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYVTTASRQEPSQGTTTFAVTSLLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
34 25884 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVCLLPPCSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFFVYSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
35 25885 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVCLLPPCSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYVTTASRQEPSQGTTTFAVTSLLRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
36 25886 전장 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVCLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
37 25887 전장 RVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPCSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
38 해당
없음		 Anti-Her2
Fab HC		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
39 해당
없음		 Anti-Her2
Fab LC		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
40 해당
없음		 IgG1 상부
힌지		 EPKSC
41 해당
없음		 IgA2 힌지 RVPPPPP
42 해당
없음		 IgA2m1
야생형 서열		 CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
43 해당
없음		 IgA2m1 C5092S/N5120T/I5121L/T5122S/ Δα-테일피스 CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGSAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
44 해당
없음		 IgA1 야생형 CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
45 해당
없음		 IgA2m2 야생형 CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTYAVTSILRVAAEDWKKGETFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAG
46 해당
없음		 α-테일피스
IgA1
IgA2m1		 KPTHVNVSVVMAEVDGTCY
47 해당
없음		 α-테일피스
IgA2m2		 KPTHINVSVVMAEADGTCY
48 해당
없음		 J 사슬 EFATMRPTWAWWLFLVLLLALWAPARGQEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
49 해당
없음		 신호
펩티드		 EFATMRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG
본원에 기재된 방법과 조성물이 본원에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 작제물 및 시약으로 제한되지 않으며, 그에 따라 변할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 목적으로만 사용되며 본원에 기재된 방법 및 조성물의 범위를 제한하려는 것이 아니며, 이는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 또한 이해해야 한다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 간행물 및 데이터베이스 항목의 개시내용은 각각의 이러한 개별 특허, 특허 출원, 간행물 및 데이터베이스 항목이 참조로 포함되도록 구체적으로 및 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 그 전체가 참조로 본원에 구체적으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ZYMEWORKS INC. <120> HETERODIMERIC IGA FC CONSTRUCTS AND METHODS OF USE THEREOF <130> V817562WO <140> PCT/CA2021/051732 <141> 2021-12-03 <150> 63/194,828 <151> 2021-05-28 <150> 63/121,180 <151> 2020-12-03 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone ID 11150 Trastuzumab VL IgKCL <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Arg 210 215 220 Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg 225 230 235 240 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys 245 250 255 Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr 260 265 270 Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu 275 280 285 Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Ser Ala Gln Pro 290 295 300 Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu 305 310 315 320 Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg 325 330 335 Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn 340 345 350 Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp 355 360 365 Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys 370 375 380 Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr 385 390 395 400 Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys 405 410 415 Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala 420 425 430 Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly 435 440 <210> 4 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone ID 23767 IgA2 hinge - IgA2m1 CH2 - IgA2m1 CH3 <400> 4 Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His 1 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Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser 35 40 45 Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val 50 55 60 Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala 85 90 95 Asn Ile Thr Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu 100 105 110 Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr 115 120 125 Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu 130 135 140 Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser 145 150 155 160 Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile 165 170 175 Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys 180 185 190 Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile 195 200 205 Asp Arg Leu Ala Gly 210 <210> 43 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified IgA2m1 <400> 43 Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg 20 25 30 Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser 35 40 45 Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val 50 55 60 Ser Ser Val Leu Pro Gly Ser Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala 85 90 95 Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu 100 105 110 Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr 115 120 125 Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu 130 135 140 Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser 145 150 155 160 Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile 165 170 175 Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys 180 185 190 Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile 195 200 205 Asp Arg Leu Ala Gly 210 <210> 44 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA1 wild type <400> 44 Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg 20 25 30 Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser 35 40 45 Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val 50 55 60 Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala 85 90 95 Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu 100 105 110 Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr 115 120 125 Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu 130 135 140 Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser 145 150 155 160 Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile 165 170 175 Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys 180 185 190 Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile 195 200 205 Asp Arg Leu Ala Gly 210 <210> 45 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA2m2 wild type <400> 45 Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg 20 25 30 Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser 35 40 45 Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val 50 55 60 Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala 85 90 95 Asn Ile Thr Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu 100 105 110 Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr 115 120 125 Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu 130 135 140 Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser 145 150 155 160 Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile 165 170 175 Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys 180 185 190 Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile 195 200 205 Asp Arg Leu Ala Gly 210 <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-tailpiece IgA1/IgA2m1 <400> 46 Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly 1 5 10 15 Thr Cys Tyr <210> 47 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-tailpiece IgA2m2 <400> 47 Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp Gly 1 5 10 15 Thr Cys Tyr <210> 48 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J Chain <400> 48 Glu Phe Ala Thr Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Leu Trp Ala Pro Ala Arg Gly Gln Glu Asp Glu Arg 20 25 30 Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg 35 40 45 Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn 50 55 60 Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro 65 70 75 80 Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys 85 90 95 Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr 100 105 110 Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys 115 120 125 Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val 130 135 140 Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala 145 150 155 160 Cys Tyr Pro Asp <210> 49 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 49 Glu Phe Ala Thr Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Leu Trp Ala Pro Ala Arg Gly 20 25

Claims (47)

  1. 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 IgA 이종이량체 Fc(IgA HetFc) 작제물에서,
    상기 제1 Fc 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인 서열을 포함하고 상기 제2 Fc 폴리펩티드는 제2 CH3 도메인 서열을 포함하고, 상기 제1 및 제2 CH3 도메인 서열은 변형된 CH3 도메인을 형성하며,
    상기 제1 및 제2 CH3 도메인 서열은 동종이량체 Fc보다 이종이량체 Fc의 형성을 촉진하는 아미노산 돌연변이를 포함하며,
    상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 A6085YF, A6085YY, A6085YM, A6085YW 및 A6085YH로부터 선택된 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환, 및 T6086Y, T6086F, T6086M, T6086W 및 T6086H로부터 선택된 위치 T6086에서의 아미노산 치환을 포함하며,
    상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 W6081T, W6081L, W6081A, W6081V 및 W6081I로부터 선택된 위치 W6081에서의 아미노산 치환을 포함하며,
    상기 이종이량체 Fc는 70% 이상의 순도로 형성되며,
    아미노산 위치의 넘버링은 IMGT 넘버링에 따르는 것인, IgA 이종이량체 Fc(IgA HetFc) 작제물.
  2. 제1항에서,
    상기 변형된 CH3 도메인은 60℃ 이상인 융점(Tm)을 갖는 것인, IgA HetFc 작제물.
  3. 제1항에서,
    상기 변형된 CH3 도메인은 상응하는 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 ±10℃인 융점(Tm)을 갖는, IgA HetFc 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서,
    상기 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환은 A6085YF, A6085YY 또는 A6085YW인, IgA HetFc 작제물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서,
    상기 위치 A6085Y에서의 아미노산 치환은 A6085YF 또는 A6085YY인, IgA HetFc 작제물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서,
    상기 위치 T6086에서의 아미노산 치환은 T6086Y, T6086F 또는 T6086W인, IgA HetFc 작제물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서,
    상기 위치 T6086에서의 아미노산 치환은 T6086Y인, IgA HetFc 작제물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에서,
    상기 위치 W6081에서의 아미노산 치환은 W6081T 또는 W6081L인, IgA HetFc 작제물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서,
    상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 상기 아미노산 치환 A6085YF 및 T6086W를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 상기 아미노산 치환 W6081T 또는 W6081L을 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  10. 제9항에서,
    상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 상기 아미노산 치환 W6081T를 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에서,
    상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 L6079V, L6079T, L6079A 및 L6079I로부터 선택된 위치 L6079에서의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에서,
    상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 L6079V 및 L6079T로부터 선택된 위치 L6079에서의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에서,
    상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 I6088L, I6088A, L6088V 및 L6088T로부터 선택된 위치 I6088에서의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에서,
    상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 상기 아미노산 치환 I6088L를 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에서,
    상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 T6022V, T6022I, T6022L 및 T6022A로부터 선택된 위치 T6022에서의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에서,
    상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 T6022V, T6022I 및 T6022L로부터 선택된 위치 T6022에서의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서,
    상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 L6007F, L6007Y, L6007M, L6007W, L6007H 및 L6007I로부터 선택된 위치 L6007에서의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서,
    상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 상기 아미노산 치환 L6007F를 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에서,
    상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 H6005Y, H6005F, H6005M 및 H6005W로부터 선택된 위치 H6005에서의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에서,
    상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 상기 아미노산 치환 H6005Y를 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서,
    상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 H6005Y, H6005F, H6005M 및 H6005W로부터 선택된 위치 H6005에서의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서,
    상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 상기 아미노산 치환 H6005Y를 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  23. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에서,
    상기 변형된 CH3 도메인은 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 도입하기 위한 아미노산 치환을 더 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  24. 제23항에서,
    상기 변형된 CH3 도메인은 상기 변형된 CH3 도메인에 1개의 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 도입하기 위한 2개의 아미노산 치환, 또는 상기 변형된 CH3 도메인에 2개의 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 도입하기 위한 4개의 아미노산 치환을 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  25. 제23항에서,
    상기 시스테인 잔기를 도입하기 위한 아미노산 치환은 1개의 CH3 도메인 서열 내 돌연변이 H6005C 및 다른 CH3 도메인 서열 내 돌연변이 P6010C를 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  26. 제23항에서,
    상기 시스테인 잔기를 도입하기 위한 아미노산 치환은 1개의 CH3 도메인 서열 내 돌연변이 H6005C 및 P6010C와 다른 CH3 도메인 서열 내 돌연변이 P6010C 및 H6005C를 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  27. 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 IgA 이종이량체 Fc(IgA HetFc) 작제물에서,
    상기 제1 Fc 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인 서열을 포함하고 상기 제2 Fc 폴리펩티드는 제2 CH3 도메인 서열을 포함하고, 상기 제1 및 제2 CH3 도메인 서열은 변형된 CH3 도메인을 형성하며,
    상기 제1 및 제2 CH3 도메인 서열은 동종이량체 Fc보다 이종이량체 Fc의 형성을 촉진하는 아미노산 돌연변이를 포함하며,
    (a) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YY 및 T6086L을 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079T, W6081L 및 I6088L을 포함하거나,
    (b) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YY 및 T6086Y를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079T, W6081L 및 I6088L을 포함하거나,
    (c) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YF 및 T6086YF를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081L 및 I6088L을 포함하거나,
    (d) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
    (e) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: T6022V, A6085YF 및 T6086Y을 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
    (f) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: T6022L, A6085YF 및 T6086Y을 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
    (g) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: T6022I, A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
    (h) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6007F, L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
    (i) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005Y, A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005Y, L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
    (j) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005C, A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: P6010C, L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
    (k) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: P6010C, A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: H6005C, L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
    (l) 상기 제1 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: A6085YF 및 T6086Y를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인 서열 내 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환: L6079V, W6081T 및 I6088L을 포함하거나,
    상기 이종이량체 Fc는 70% 이상의 순도로 형성되며,
    아미노산 위치의 넘버링은 IMGT 넘버링에 따르는 것인, IgA 이종이량체 Fc(IgA HetFc) 작제물.
  28. 제27항에서,
    상기 변형된 CH3 도메인은 60℃ 이상인 융점(Tm)을 갖는 것인, IgA HetFc 작제물.
  29. 제27항에서,
    상기 변형된 CH3 도메인은 상응하는 야생형 IgA CH3 도메인 Tm의 ±10℃인 융점(Tm)을 갖는 것인, IgA HetFc 작제물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에서,
    하나 이상의 표적 결합 도메인을 더 포함하는, IgA HetFc 작제물.
  31. 제30항에서,
    상기 하나 이상의 표적 결합 도메인은 항원-결합 항체 단편인 것인, IgA HetFc 작제물.
  32. 제31항에서,
    상기 하나 이상의 항원-결합 항체 단편 각각은 Fab 및 scFv로부터 독립적으로 선택되는 것인, IgA HetFc 작제물.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에서,
    상기 IgA HetFc 작제물은 2개의 표적 결합 도메인을 포함하고 이중특이적인, IgA HetFc 작제물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에서,
    상기 변형된 IgA CH3 도메인은 α-테일피스를 포함하는 것인, IgA HetFc 작제물.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에서,
    상기 변형된 IgA CH3 도메인은 α-테일피스가 없는 것인, IgA HetFc 작제물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따르는 상기 IgA HetFc 작제물 및 하나 이상의 치료제, 진단제 또는 표지물질을 포함하는 접합체(conjugate).
  37. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따르는 2개 이상의 IgA HetFc 작제물 및 J 사슬을 포함하는 IgA HetFc 다량체에서,
    상기 IgA HetFc 작제물 중 2개는 상기 J 사슬에 의해 결합되는 것인, IgA HetFc 다량체.
  38. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따르는 상기 IgA HetFc 작제물 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  39. 제36항에 따르는 상기 접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  40. 제37항에 따르는 상기 IgA HetFc 다량체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  41. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따르는 상기 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세트.
  42. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따르는 상기 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 세트 또는 벡터 세트들.
  43. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따르는 상기 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  44. 상기 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 및 상기 IgA HetFc 작제물의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따르는 상기 IgA HetFc 작제물을 제조하는 방법.
  45. 제34항에 따르는 상기 IgA HetFc 작제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 J 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 및 상기 IgA HetFc 작제물과 J 사슬의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 제37항에 따르는 상기 IgA HetFc 작제물을 제조하는 방법.
  46. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에서,
    상기 IgA HetFc 작제물은 결합 표적에 대한 결합을 제거하기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, IgA HetFc 작제물.
  47. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에서,
    상기 IgA HetFc 작제물은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 도입하기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, IgA HetFc 작제물.
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