TW201625680A - 人類化抗Ｔａｕ（ｐＳ４２２）抗體腦部穿梭子及其用途 - Google Patents

人類化抗Ｔａｕ（ｐＳ４２２）抗體腦部穿梭子及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體及抗血腦屏障受體/半抗原雙特異性抗體的非共價複合物。

Description

人類化抗Tau(pS422)抗體腦部穿梭子及其用途
本發明係關於人類化抗Tau(pS422)抗體腦部穿梭子構築體，其特異性結合於SEQ ID NO：03之磷酸化Tau片段且其用於治療腦部疾病。
人類Tau(微管相關蛋白Tau(神經元纖維纏結蛋白、成對螺旋纖絲-Tau，PHF-Tau))為主要存在於軸突中之神經元微管相關蛋白且用於促進微管蛋白聚合及穩定微管。人類大腦中存在八種同功異型物(同功異型物A、B、C、D、E、F、G、胎兒-Tau)，最長的同功異型物包含441個胺基酸(同功異型物F，Uniprot P10636-8)。亦藉由Reynolds,C.H.，等人，J.Neurochem.69(1997)191-198描述Tau及其特性。
呈過磷酸化形式之Tau是成對螺旋長絲(PHF)之主要組分、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease，AD)大腦中之神經元纖維病變之構築嵌段。Tau可藉由數種不同激酶在其絲胺酸或蘇胺酸殘基處磷酸化，該等激酶包括GSK3β、cdk5、MARK及MAP激酶家族成員。
Tau蛋白病可藉由Tau之異常過磷酸化加以表徵化，且係根據Iqbal,K.，等人(Biochim.Biophys.Acta 1739(2005)198-210)：
‧阿茲海默氏病，包括該疾病之僅纏結形式
‧唐氏症候群(Down syndrome)，成人病例
‧關島型帕金森氏症癡呆複合症(Guam parkinsonism dementia complex)
‧拳擊員癡呆
‧皮克氏病(Pick disease)
‧嗜銀粒性癡呆
‧額顳葉型癡呆
‧皮質基底核退化症
‧蒼白球-腦橋-黑質退化症
‧進行性核上麻痹
‧具有纏結之傑茨曼-斯脫司勒-史茵克疾病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)
迄今為止，已在來自阿茲海默氏病大腦之Tau中發現幾乎40個絲胺酸(S)/蘇胺酸(T)磷酸化位點(Hanger,D.P.，等人，J.Biol.Chem.282(2007)23645-23654)。阿茲海默氏病中之Tau病變之發展係關於其磷酸化狀態。然而，40個磷酸化位點中之大部分與疾病病變無關，因為其亦存在於自健康胎兒大腦組織提取之Tau中。僅少量磷酸化對疾病病況而言是唯一的且大概負責界定阿茲海默氏病大腦之PHF中之Tau的異常凝集及特殊的不可溶性(Morishima-Kawashima,M.，等人，J.Biol.Chem.270(1995)823-829)。根據Pei,J.J.，等人(J.Alzheimer's Disease 14(2008)385-392)，現存文獻提供的關於此等對AD大腦具有特異性的位點之資訊有限且不明確。Pei使用Tau磷酸化特異性抗體之清單且量測其在來自22個AD患者及10個對照組之內側顳葉皮層勻漿中之含量。
Bussiere,T.，等人(Acta Neuropathol.97(1999)221-230)描述Tau蛋白上之磷酸化絲胺酸422為在伴隨神經元纖維退化之數種疾病中發現 的病理性抗原決定基。Augustinack,J.C.，等人，(Acta Neuropathol.103(2002)26-35)描述與阿茲海默氏病中之神經元病變之嚴重程度相關的pS422。Guillozet-Bongaarts,A.,(J.Neurochem.97(2006)1005-1014)將絲胺酸422處之Tau磷酸化描述為PHF之成熟過程的一部分。亦發現Tau pS422與阿茲海默氏病之各種轉殖基因小鼠模型之病變發展有關聯。因此，Deters,N.，等人在Biochem.Biophys.Res.Commun.379(2009)400-405中提到雙轉殖基因Dom5/pR5小鼠展示含有使病理性S422抗原決定基特異磷酸化之Tau的海馬神經元數量提高7倍。Goetz,J.，等人，(Science 293(2001)1491-1495)報導在注射有Abeta42原纖維之Tau P301L轉殖基因小鼠之大腦中在S422處磷酸化之Tau外觀。
EP 2 009 104係關於來自阿茲海默氏病PHF之Tau蛋白中以磷酸化狀態存在之Tau蛋白之抗原決定基及該抗原決定基之用途，其用於產生特異地偵測阿茲海默氏病Tau蛋白之抗體。WO 2002/062851及US 7,446,180係關於對異常截短形式之Tau蛋白具有特異性之抗體及關於阿茲海默氏病及相關Tau蛋白病之診斷性及治療性態樣。
WO 98/22120係關於治療患有阿茲海默氏病之患者的方法，其包含向患者投與針對具有約207個至約222個胺基酸，約224個至約240個胺基酸及約390個至約408個胺基酸之磷酸化Tau片段之抗體的步驟。Asuni,A.A.，等人，J.Neuroscience 27(2007)9115-9129中提到使用磷酸化Tau片段379-408[P-Ser396,404]來對Tau轉殖基因小鼠進行疫苗接種之動物研究。US 2008/0050383係關於藉由投與Tau蛋白片段來在個體體內治療及預防阿茲海默氏病或其他Tau蛋白病的方法。
Hasegawa,M.，等人(FEBS Lett.384(1996)25-30)報導對微管相關蛋白tau中之磷絲胺酸422具有特異性之單株抗體(AP422)。
在WO 01/55725中，報導了特異識別tau之抗體及特異識別磷酸化tau(181)之抗體，其用於活體內診斷tau蛋白病及/或活體內鑑別診斷 tau蛋白病與非tau蛋白病之方法中。
在WO 02/027017中，報導了自具有磷酸化絲胺酸之多肽免疫原製備之抗體。WO 02/062851係關於對異常截短形式之Tau蛋白具有特異性的抗體及關於阿茲海默氏病及相關Tau蛋白病之診斷性及治療性態樣。
在WO 2004/016655中，報導了對中樞神經系統(CNS)Tau蛋白具有特異性之抗體，其中該抗體特異地識別CNS tau蛋白而非tau蛋白，且其中該抗體特定地識別在由編碼tau蛋白之基因之外顯子4編碼的胺基酸序列與由其外顯子5編碼的胺基酸序列之間的結締部分之胺基酸序列作為抗原決定基。
針對Tau pS422之單株抗體描述於例如EP 1 876 185中。針對Tau pS422之多株抗體為市售可得的(例如ProSci Inc.and Biosource International)。
在WO 2006/055178中報導了用於抑制Ser202/Thr205處之tau蛋白之磷酸化，該方法包含使含有tau蛋白之樣品與結合澱粉狀蛋白β衍生可擴散配位體之抗體或抗原結合片段接觸，從而抑制Ser202/Thr205處之tau蛋白之磷酸化。
WO 2007/019273中報導了與在tyr394及/或tyr310處磷酸化之tau特異結合之抗體製劑。Asuni,A.A.等人，J.Neuroscience 27(2007)9115-9129中提到使用磷酸化Tau片段379-408[P-Ser396,404]來對Tau轉殖基因小鼠進行疫苗接種之動物研究。
EP 2 009 104係關於來自阿茲海默氏病PHF之Tau蛋白中以磷酸化狀態存在之Tau蛋白之抗原決定基及該抗原決定基之用途，其用於產生特異地偵測阿茲海默氏病Tau蛋白之抗體。
US 2008/0050383係關於藉由投與Tau蛋白片段來在個體體內治療及預防阿茲海默氏病或其他Tau蛋白病的方法。
在WO 2010/037135中報導了經分離之合成或重組多肽或肽，該多肽或肽包含第一結構域，其包含血腦屏障(BBB)受體或等效物之配位體或由其組成；及第二結構域，其包含減慢蛋白質聚集體之聚集速率、抑制蛋白質聚集體之形成或逆轉、分解或溶解蛋白質聚集體的酶或組合物或由其組成。WO 2010/115843中報導了一種抗體，尤其單株抗體或其功能性部分，其能夠識別且活體外及/或活體內結合tau蛋白。
在WO 2011 026031中報導了特異地結合tau寡聚物且並不結合可溶性tau或tau原纖維之單株抗體或其片段，其適用於治療tau蛋白病，例如阿茲海默氏病、進行性核上麻痹及皮質基底核退化症。WO 2011/053565中報導了一種分離抗體，其特異地結合在Ser(238)及Thr(245)中之一或多者處磷酸化之人類tau蛋白。
在WO 2012/045882中報導了特異地結合哺乳動物Tau蛋白上之磷酸化抗原決定基之抗體，其適用於治療諸如tau蛋白病之神經退化性疾病且適用於治療或緩解認知缺陷。WO 2012/049570中報導了人類單株抗tau抗體或其tau結合片段。WO 2012/106363中報導一種預防或治療個體體內之阿茲海默氏病或其他Tau蛋白病的方法，其包含向需要針對阿茲海默氏病或其他tau蛋白病之療法的人類投與抗體，該等抗體對異常形式之Tau蛋白具有特異性，該抗體對正常Tau蛋白不顯示結合及/或反應性且在有效預防或治療阿茲海默氏病或其他tau蛋白病之條件及量下投與。
WO 2012/149365中報導了展示與聚集tau有反應且實質上與非聚集Tau無反應之抗體，其中聚集tau包含至少兩個在一或多個半胱胺酸殘基處直接或經由連接子彼此交聯之tau蛋白。
WO 2010/142423中報導了適用於治療例如阿茲海默氏病之Tau蛋白病之組合物，其包含與Tau結合之抗體、在特定位置處與特異磷酸 化Tau及其片段特異地結合之經磷酸化絲胺酸修飾的化合物及載體。
EP 1 876 185 A中報導了識別磷酸化多肽之抗體。WO 2013/151762中報導了人類化tau抗體。WO 2014/016737中報導了針對人類磷酸化tau之新穎的雞單株抗體及其用途。
在WO 2004/050016中報導醫藥劑經由人類胰島素受體之傳遞。Manich,G.等人，(Eur.J Pharm.Sci.49(2013)556-564)報導小鼠中使用跨血腦屏障Fab'負荷的抗運鐵蛋白受體抗體轉胞吞作用研究。Dufes,C.等人報導用於將治療劑靶向傳遞至腦及癌細胞的運鐵蛋白及運鐵蛋白受體(Ther.Deliv.4(2013)629-640)。Feng,J-M.等人，Neurometh.45(2010)15-34報導受體介導之藥物跨BBB傳輸。Pardridge,W.等人報導重新工程改造生物藥品用於與分子特洛伊木馬(Trojan horse)一起傳遞至腦部(Bioconjug.Chem.19(2008)1327-1338)。在WO 2004/045642中報導使用多重特異性非共價複合物靶向傳遞療法。Ferrari,A.等人報導β-澱粉樣蛋白誘導組織培養物中之成對螺旋纖絲樣tau長絲(J.Biol.Chem.278(2003)40162-40168)。Deters,N.等人，Biochem.Biophys.Res.379(2009)400-405)報導PP2A活性之底物特異性還原擴大tau病變。
本發明提供抗人類Tau(pS422)抗體腦部穿梭子構築體及其使用方法。
已發現抗人類Tau(pS422)抗體與腦部穿梭子模組之共價結合物(諸如單價抗人類運鐵蛋白受體抗體或抗體片段)減少Tau相關病變相較於未結合於腦部穿梭子模組之抗人類Tau(pS422)抗體效率較低。此外，腦部穿梭子結合物似乎具有(神經)毒性。不受此理論約束，此可能由於抗體之作用模式及抗體目標之細胞定位。
因此，此處報導如本文所報導之非共價複合物用於將功能性抗 Tau(pS422)抗體傳輸通過血腦屏障之用途。
如本文所報導之構築體包含血腦屏障穿梭子模組(BBB-穿梭子模組)，其為具有針對半抗原之第一結合特異性及針對血腦屏障受體(BBBR)之第二結合特異性的雙特異性抗體。此類BBB-穿梭子模組識別血腦屏障上能夠轉胞吞作用的細胞表面目標(諸如TfR、LRP或其他目標=BBBR)且同時結合於半抗原化淨負荷。
已發現無更多關於結合價數、抗體型式、BBBR結合親和力的要求必須滿足。
另外發現並不需要如本文所報導的基於雙特異性抗體之穿梭子模組全部(即以複合物形式)自血腦屏障的內皮細胞釋放來介導半抗原化淨負荷的轉胞吞作用。實情為，藉由基於雙特異性抗體之穿梭子模組複合/非共價結合於基於雙特異性抗體之穿梭子模組之半抗原化淨負荷，i)自BBB細胞內基於雙特異性抗體之穿梭子模組釋放，亦即在胞內囊泡系統中內化後，ii)與穿梭子模組分離，及iii)隨後自BBB細胞胞吐至腦中(在BBB細胞中留下雙特異性抗體)。
如本文所報導之基於雙特異性抗體之穿梭子模組關於BBBR結合特異性價數以及BBBR結合特異性親和力高度可變。同時，其使淨負荷能夠自穿梭子模組釋放。
如本文所報導之一個態樣為i)特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體與ii)抗血腦屏障受體/半抗原雙特異性抗體之非共價複合物。
抗血腦屏障受體/半抗原雙特異性抗體為一種雙特異性抗體，其包含特異性結合於半抗原(例如特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體的半抗原)之第一結合特異性，及特異性結合於血腦屏障受體之第二結合特異性。
如本文所報導之一個態樣為i)特異性結合於人類Tau(pS422)及半 抗原之雙特異性抗體與ii)半抗原化抗血腦屏障受體抗體之非共價複合物。
特異性結合於人類Tau(pS422)及半抗原之抗體為一種雙特異性抗體，其包含特異性結合於半抗原(例如特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體)的第一結合特異性，及特異性結合於人類Tau(pS422)之第二結合特異性。
如本文所報導之一個態樣為非共價複合物，其包含i)特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體及ii)雙特異性抗體，其具有特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的半抗原化抗體之半抗原的第一結合特異性及特異性結合於血腦屏障受體之第二結合特異性，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體藉由雙特異性抗體之第一結合特異性特異性結合。
如本文所報導之一個態樣為非共價複合物，其包含i)特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體，及ii)雙特異性抗體，其具有特異性結合於人類Tau(pS422)之第一結合特異性及特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的半抗原化抗體之半抗原的第二結合特異性，其中特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體藉由雙特異性抗體之第二結合特異性特異性結合。
如本文所報導之一個態樣為一種特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體與抗血腦屏障受體/半抗原雙特異性抗體之非共價複合物的用途，其用於將特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體傳輸通過血腦屏障。
如本文所報導之一個態樣為一種特異性結合於人類Tau(pS422)及半抗原之雙特異性抗體與半抗原化抗血腦屏障受體抗體之非共價複合物的用途，其用於將特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體傳輸通過血腦屏障。
如本文所報導之一個態樣為一種包含特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體與雙特異性抗體之非共價複合物的用途，其具有特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的半抗原化抗體之半抗原的第一結合特異性及特異性結合於血腦屏障受體之第二結合特異性，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體藉由雙特異性抗體之第一結合特異性特異性結合，該非共價複合物用於將特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體傳輸通過血腦屏障。
如本文所報導之一個態樣為一種包含特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體與雙特異性抗體之非共價複合物的用途，該雙特異性抗體具有特異性結合於人類Tau(pS422)之第一結合特異性及特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的半抗原化抗體之半抗原的第二結合特異性，其中特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體藉由雙特異性抗體之第一結合特異性特異性結合，該非共價複合物用於將特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體傳輸通過血腦屏障。
在一個實施例中，半抗原化抗體係選自由以下組成之群：生物素化抗體、茶鹼化抗體、地高辛化抗體、碳硼化抗體、螢光素化抗體、螺旋化抗體及溴去氧尿苷化抗體。在一個較佳實施例中，半抗原化抗體為生物素化抗體或地高辛化抗體。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體係選自由以下組成之群：特異性結合於人類Tau(pS422)之生物素化抗體、特異性結合於人類Tau(pS422)之茶鹼化抗體、特異性結合於人類Tau(pS422)之地高辛化抗體、特異性結合於人類Tau(pS422)之碳硼化抗體、特異性結合於人類Tau(pS422)之螢光素化抗體、特異性結合於人類Tau(pS422)之螺旋化抗體及特異性結合於人類Tau(pS422)之溴去氧尿苷化抗體。在一個較佳實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體為特異性結合於人類Tau(pS422)之生物素化 抗體或特異性結合於人類Tau(pS422)之地高辛化抗體。
在一個實施例中，特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體係選自由以下組成之群：特異性結合於血腦屏障受體之生物素化抗體、特異性結合於血腦屏障受體之茶鹼化抗體、特異性結合於血腦屏障受體之地高辛化抗體、特異性結合於血腦屏障受體之碳硼化抗體、特異性結合於血腦屏障受體之螢光素化抗體、特異性結合於血腦屏障受體之螺旋化抗體及特異性結合於血腦屏障受體之溴去氧尿苷化抗體。在一個較佳實施例中，特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體為特異性結合於血腦屏障受體之生物素化抗體或特異性結合於血腦屏障受體之地高辛化抗體。
在一個實施例中，血腦屏障受體係選自由以下組成之群：運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1(LRP1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。在一個較佳實施例中，血腦屏障受體為運鐵蛋白受體。
在一個實施例中，雙特異性抗體為包含兩個結合位點之全長抗體。
在一個實施例中，雙特異性抗體為已融合一個或兩個scFv或scFab或CrossFab或scCrossFab且包含三個或四個結合位點之全長抗體。
在一個實施例中，雙特異性抗體為抗體片段。在一個實施例中，抗體片段係選自F(ab')2及雙功能抗體。
在一個實施例中，雙特異性抗體為人類化抗體或人類抗體。
在一個實施例中，雙特異性抗體不含效應功能。在一個實施例中，雙特異性抗體不具有功能性Fc區。在一個實施例中，雙特異性抗體不具有Fc區。在一個實施例中，雙特異性抗體具有包含突變 L234A、L235A及P329G之人類IgG1子類之Fc區，其中該等位置根據Kabat(Kabat EU索引)之Fc區編號測定。在一個實施例中，雙特異性抗體具有包含突變S228P、L235E及P329G之人類IgG4子類的Fc區，其中該等位置根據Kabat(Kabat EU索引)之Fc區編號測定。
在一個實施例中，雙特異性抗體包含a)一個針對半抗原化抗體之半抗原的結合位點及一個針對血腦屏障受體之結合位點，或b)兩個針對半抗原化抗體之半抗原的結合位點及一個針對血腦屏障受體之結合位點，或c)一個針對半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對血腦屏障受體之結合位點，或d)兩個針對半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對血腦屏障受體之結合位點。
在一個實施例中，雙特異性抗體包含a)一個針對特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及一個針對血腦屏障受體之結合位點，或b)兩個針對特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及一個針對血腦屏障受體之結合位點，或c)一個針對特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對血腦屏障受體之結合位點，或d)兩個針對特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對血腦屏障受體之結合位點。
在一個實施例中，雙特異性抗體包含a)一個針對特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及一個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或b)兩個針對特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體之半抗 原的結合位點及一個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或c)一個針對特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或d)兩個針對特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對人類Tau(pS422)之結合位點。
在前述實施例之情況b)及c)下，雙特異性抗體之一條重鏈包含臼突變且各別其他鏈包含杵突變。
在一個較佳實施例中，雙特異性抗體包含兩個針對特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對血腦屏障受體之結合位點。
在一個較佳實施例中，雙特異性抗體包含兩個針對特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對人類Tau(pS422)之結合位點。
在一個實施例中，雙特異性抗體具有特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的半抗原化抗體之半抗原的兩種結合特異性(兩種抗半抗原結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)之兩種結合特異性。
在一個實施例中，雙特異性抗體具有特異性結合於與(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗半抗原結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(兩種抗半抗原結合特異性)特異性結合的半抗原化抗體之半抗原的兩種結合特異性及特異性結合於人類Tau(pS422)之兩種結合特異性。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：65之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：66之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：67之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：69之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：70之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：71之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為人類化結合特異性。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性包含如上述實施例中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：73之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：74之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：75之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：77之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：78之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：79之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：68或76具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗地高辛抗體保留結合於地高辛之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：68或76中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在CDR外部區域中(亦即在FR中)。視情況而言，地高辛結合特異性包含SEQ ID NO：68或76中之 VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：72或80具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗地高辛抗體保留結合於地高辛之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：72或80中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在CDR外部區域中(亦即在FR中)。視情況而言，地高辛結合特異性包含SEQ ID NO：72或80中之VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中雙特異性抗體包含特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的第一結合特異性(抗生物素結合特異性；抗BI結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性；抗-(h)TfR結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性；抗LRP8結合特異性)的第二結合特異性。
在一個實施例中，雙特異性抗體具有特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的兩種結合特異性(兩個抗生物素結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)的兩種結合特異性。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈 可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：81之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：82之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：83之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：85之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：86之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：87之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為人類化結合特異性。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性包含如上述實施例中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：89之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：90之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：94之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：95之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：84或92具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗生物素抗體保留結合於生物素之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：84或92中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。 在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在CDR外部區域中(亦即在FR中)。視情況而言，生物素結合特異性包含SEQ ID NO：84或92中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：88或96具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗生物素抗體保留結合於生物素之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：88或96中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在CDR外部區域中(亦即在FR中)。視情況而言，生物素結合特異性包含SEQ ID NO：88或96中的VL序列，其包括彼序列的轉譯後修飾。
在一個實施例中，雙特異性抗體包含特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的第一結合特異性(抗茶鹼結合特異性；抗THEO結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性；抗-(h)TfR結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性；抗LRP8結合特異性)的第二結合特異性。
在一個實施例中，雙特異性抗體具有特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的兩種結合特異性(兩個抗茶鹼結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩個抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)的兩種結合特異性。
在一個實施例中，特異性結合與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：97之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：98之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：99之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：101之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：102之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：103之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為人類化結合特異性。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性包含如上述實施例中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
在一個實施例中，特異性結合與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：105之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：106之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：107之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：109之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：110之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：111之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：100或108具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，相對於參考序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含 彼序列之抗茶鹼抗體保留結合於茶鹼之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：100或108中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在CDR外部區域中(亦即在FR中)。視情況而言，茶鹼結合特異性包含SEQ ID NO：100或108中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：104或112具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，相對於參考序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗茶鹼抗體保留結合於茶鹼之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：104或112中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在CDR外部區域中(亦即在FR中)。視情況而言，茶鹼結合特異性包含SEQ ID NO：104或112中之VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，雙特異性抗體包含特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的第一結合特異性(抗螢光素結合特異性；抗FLUO結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性；抗-(h)TfR結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性；抗LRP8結合特異性)的第二結合特異性。
在一個實施例中，雙特異性抗體具有特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的兩種結合特異性(兩個抗螢光素結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗(人 類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)之兩種結合特異性。
在一個實施例中，特異性結合與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：113之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：114之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：115之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：117之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：118之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：119之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為人類化結合特異性。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性包含如上述實施例中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：116具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗螢光素抗體保留結合於螢光素之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：116中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在CDR外部區域中(亦即在FR中)。視情況而言，螢光素結合特異性包含SEQ ID NO：116中之VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：120具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗螢光素抗體保留結合於螢光素之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：120中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在CDR外部區域中(亦即在FR中)。視情況而言，螢光素結合特異性包含SEQ ID NO：120中之VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，雙特異性抗體包含特異性結合於溴去氧尿苷化淨負荷之第一結合特異性(溴去氧尿苷結合特異性；抗BrdU結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性；抗-(h)TfR結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性；抗LRP8結合特異性)的第二結合特異性。
在一個實施例中，雙特異性抗體具有特異性結合於溴去氧尿苷化淨負荷之兩種結合特異性(兩個抗溴去氧尿苷結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)的兩種結合特異性。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：121之重鏈 CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：123之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：125之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：126之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：127之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：128之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為人類化結合特異性。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性包含如上述實施例中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：121或122之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：123或124之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：125之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：126之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：127之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：128之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：129或131具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失， 但包含彼序列之抗溴去氧尿苷抗體保留結合於溴去氧尿苷之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：129或131中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在CDR外部區域中(亦即在FR中)。視情況而言，溴去氧尿苷結合特異性包含SEQ ID NO：129或131之VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：130或132具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗溴去氧尿苷抗體保留結合於溴去氧尿苷之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：130或132中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在CDR外部區域中(亦即在FR中)。視情況而言，溴去氧尿苷結合特異性包含SEQ ID NO：130或132之VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體在半抗原與特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體之間包含連接基團。在一個實施例中，連接基團為肽連接基團。在一個實施例中，連接基團為化學連接基團(非肽連接基團)。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為全長抗體。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或 iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化的全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau。
如本文所報導之特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體顯示關於位置422處的絲胺酸處人類Tau磷酸化，關於未磷酸化野生型人類Tau及Tau突變S422A之選擇性。未磷酸化野生型人類Tau及Tau突變S422A分別根本不結合或具有較低親和力。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，或b)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體另外包含a)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，及在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR，或c)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)SEQ ID NO：20之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域， 或b)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變域，或c)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或d)SEQ ID NO：21之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域。
在一個實施例中，非共價複合物用於治療阿茲海默氏病。
在一個實施例中，複合物中的兩種抗體皆為效應功能沉默。在一個實施例中，複合物的兩種抗體皆不具有效應功能。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化的全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異地結合在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體具有以下EC50值a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：03的人類Tau(pS422)片段，6ng/mL或6ng/mL以下，及/或b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：02的全長人類Tau(pS422)，4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或c)具有胺基酸序列SEQ ID NO：02的人類Tau(pS422)聚集體，30ng/mL或30ng/mL以下，及/或d)具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A的人類Tau，125ng/mL或125ng/mL以下。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)之抗體不結合於人類Tau(SEQ ID NO：01)。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為單株抗體。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為如下抗體片段，其結合於人類Tau(pS422)及i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為a)人類子類IgG1之全長抗體，或b)人類子類IgG4之全長抗體，或c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類IgG1之全長抗 體，d)具有突變S228P、L235E及P329G之人類子類IgG4之全長抗體，e)在兩條重鏈中具有突變L234A、L235A及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C及在另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1之全長抗體，或f)在兩條重鏈中具有突變S228P及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG4之全長抗體。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：10之HVR，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之HVR，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類 Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：10之HVR，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：05及SEQ ID NO：15之HVR，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區， 及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：10之HVR，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定 域，其中i)可變域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之HVR，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：20，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不 存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中 i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：19，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：16，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體 a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：19，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A 之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：21，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體 具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
在全部態樣之一個較佳實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體在位置4、24及78處之重鏈可變域中具有纈胺酸殘基。
在全部態樣之一個較佳實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體在位置71處之重鏈可變域中具有精胺酸殘基。
如本文所報導之一個態樣為醫藥調配物，其包含如本文所報導之非共價複合物及醫藥學上可接受之載劑。
在一個實施例中，醫藥調配物另外包含額外治療劑。
在一個實施例中，額外治療劑為抗澱粉樣蛋白治療劑。在一個實施例中，抗澱粉樣蛋白治療劑為抗人類α突觸核蛋白抗體或抗Aβ抗體。在一個實施例中，抗人類α突觸核蛋白抗體或抗Aβ抗體經半抗原化。在一個實施例中，抗人類α突觸核蛋白抗體或抗Aβ抗體與抗血腦屏障受體/半抗原雙特異性抗體複合。
如本文所報導之一個態樣為用作藥劑的如本文所報導之非共價複合物。
如本文所報導之一個態樣為用於治療阿茲海默氏病的如本文所報導之非共價複合物。
如本文所報導之一個態樣為用於治療前驅性阿茲海默氏病的如本文所報導之非共價複合物。
如本文所報導之一個態樣為用於治療輕度阿茲海默氏病的如本文所報導之非共價複合物。
如本文所報導之一個態樣為用於減輕Tau(pS422)誘導之神經退化的如本文所報導之非共價複合物。
如本文所報導之一個態樣為用於維持認知及功能的如本文所報 導之非共價複合物。
如本文所報導之一個態樣為用於減緩認知及功能減退速率的如本文所報導之非共價複合物。
如本文所報導之一個態樣為用於製造藥劑的如本文所報導之非共價複合物。
在一個實施例中，藥劑用於治療阿茲海默氏病。
在一個實施例中，藥劑用於治療前驅性阿茲海默氏病。
在一個實施例中，藥劑用於治療輕度阿茲海默氏病。
在一個實施例中，藥劑用於減輕Tau(pS422)誘發之神經退化。
在一個實施例中，藥劑用於維持認知及功能。
在一個實施例中，藥劑用於減緩認知及功能減退之速率。
如本文所報導之一個態樣為一種治療患有阿茲海默氏病之個體的方法，其包含向個體投與有效量的如本文所報導之非共價複合物。
如本文所報導之一個態樣為一種減輕個體中Tau(pS422)誘發之神經退化的方法，其包含向個體投與有效量之如本文所報導之非共價複合物以減輕Tau(pS422)誘發之神經退化。
如本文所報導之一個態樣為一種維持個體之認知及功能的方法，其包含向個體投與有效量之如本文所報導之非共價複合物以維持認知及功能。
如本文所報導之一個態樣為一種減緩個體中認知及功能減退速率的方法，其包含向個體投與有效量的如本文所報導之非共價複合物以減緩認知及功能減退的速率。
如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之非共價複合物的用途，其用於減輕Tau(pS422)誘發之神經退化。
如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之非共價複合物的用途，其用於維持認知及功能。
如本文所報導之一個態樣為用於減緩認知及功能減退速率的如本文所報導之非共價複合物的用途。
如本文所報導之非共價複合物可用於治療阿茲海默氏病。
使用如本文所報導之非共價複合物可實現抑制/減輕阿茲海默氏病及神經病理學之進展。
如本文所報導之非共價複合物可用於防止阿茲海默氏病發展或甚至用於終止阿茲海默氏病之進展。
在一個實施例中，如本文所報導之非共價複合物i)結合於Tau(pS422)轉殖基因小鼠及阿茲海默氏病患者之腦部切片上的Tau(pS422)；及/或Tau(pS422)轉殖基因細胞中的經標記Tau(pS422)。
如本文所報導之一個態樣為特異性結合於人類Tau(pS422)中的胺基酸序列SEQ ID NO：03之非共價複合物。
如本文所報導之非共價複合物特異性結合於/識別早期及晚期疾病相關形式之人類Tau(pS422)。
如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之非共價複合物之用途，其用於預防人類Tau(pS422)相關阿茲海默氏病擴散。
如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之非共價複合物之用途，其用於減少溶酶體膜崩解。
如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之非共價複合物之用途，其用於針對人類Tau(pS422)誘發之不穩定及/或崩解穩定溶酶體膜。
如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之非共價複合物之用途，其用於預防阿茲海默氏病進展。
如本文所報導之非共價複合物藉由細胞之間人類Tau(pS422)接種及擴散之抗體介導性抑制來起作用。
如本文所報導之非共價複合物藉由結合於人類Tau(pS422)來保 護溶酶體免於原纖損傷。
圖1：家兔及人類化輕鏈可變域之序列比對；CDR加框。
圖2：(A)及(B)：家兔及人類化重鏈可變域之序列比對；CDR加框。
圖3：人類化VH及VL與(A)磷酸化tau肽、(B)磷酸化全長人類tau、(C)未磷酸化tau肽、(D)未磷酸化全長人類tau之不同組合的生物化學結合；(1)=VH00/VL00，(2)=VH32/VL21，(3)=VH20/VL22，(4)=VH32/VL22，(5)=VH33/VL22；塗佈濃度：磷酸化tau肽：50ng/ml，所有其他目標：1μg/ml；(若用1μg/ml塗佈磷酸化tau肽，則獲得可相當的結果(資料未示出))。
圖4：不同組合的人類化VH及VL與(A)=全長人類tau S422A突變、(B)=聚集人類Tau；(1)=VH00/VL00，(2)=VH32/VL21，(3)=VH20/VL22，(4)=VH32/VL22，(5)=VH33/VL22；塗佈濃度：磷酸化tau肽：50ng/ml，所有其他目標：1μg/ml；(若用1μg/ml塗佈磷酸化tau肽，則獲得相當之結果(資料未圖示))。
圖5：西方墨點法展示所選人類化VH/VL組合之選擇性；(1)=VH00/VL00，(2)=VH32/VL21，(3)=VH20/VL22，(4)=VH32/VL22，(5)=VH33/VL22。
圖6：結合於阿茲海默氏病患者之腦部提取物中之過磷酸化tau；(1)=VH00/VL00，(2)=VH32/VL21，(3)=VH32/VL22。
圖7：血腦屏障-穿梭子模組組合物之流程。
圖8：如實例14中產生之血腦屏障-穿梭子模組的SEC特徵及SDSPAGE。
圖9：使用作為TfR表現BBB源細胞株之hCMEC/D3細胞及作為螢光淨負荷之Dig-Cy5的FACS分析之結果。
圖10：半抗原結合雙特異性抗體血腦屏障-穿梭子模組之轉胞吞作用及自內皮細胞的釋放；A：抗CD33-dig抗體傳斯維爾分析法(transwell assay)，huFc ELISA；B：抗TfR1抗體傳斯維爾分析法，huFc ELISA；C：抗TfR1抗體-Dig傳斯維爾分析法，huFc ELISA；D：抗TfR2抗體傳斯維爾分析法，huFc ELISA；E：抗TfR2抗體Dig傳斯維爾分析法，huFc ELISA。
圖11：A：雙特異性抗體-半抗原化淨負荷非共價複合物之組成及定量；B：使用對TfR具有降低之親和力的雙特異性抗體半抗原化淨負荷之轉胞吞作用及自內皮細胞之釋放(A：抗CD33-Dig+Dig-DNA傳斯維爾分析法，qPCR；B：抗CD33-Bio+Bio-DNA傳斯維爾分析法，qPCR，C：抗TfR2-Dig+Dig-DNA傳斯維爾分析法，qPCR，D：抗TfR2-Bio+Bio-DNA傳斯維爾分析法，qPCR)。
圖12：施加對TfR具有高親和力之不可釋放血腦屏障-穿梭子模組的半抗原化淨負荷之轉胞吞作用及自內皮細胞之釋放；A：抗TrF1-Dig+Dig-DNA傳斯維爾分析法，qPCR，B：抗TfR1抗體-Bio+Bio-DNA傳斯維爾分析法，qPCR)。
圖13：半抗原化淨負荷自對TfR具有高親和力之不可釋放血腦屏障-穿梭子模組的結合、攝入及胞內分離；顯示在37℃下培育三小時後，hCMEC/D3細胞中雙特異性抗體-複合之半抗原化螢光淨負荷的亞細胞分離。不同胞內囊泡中出現DIG-DNA-CY5或Bio-DNA-Cy5(深灰色)，不與內化抗地高辛-或抗生物素-結合雙特異性抗體(中等灰色)重疊。
圖14：使用2.5mol過量之含有HeliCar基元胺基酸序列之化合物的抗體0155與HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體2偶合形成共價複合物0156的SDS PAGE凝膠；1=HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體2；2=抗體0019；3=抗體0155。
圖15：抗體0157與HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1之偶合的SDS PAGE凝膠；1=HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1(氧化)；2=對照偶合(氧化)；3=共價結合物(氧化)；4=分子量標記物；5=共價結合物(還原)；6=對照偶合(還原)；7=HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1(還原)。
圖16：抗體0155、具有SEQ ID NO：28之C端離胺酸殘基缺失含有HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1之綠膿桿菌外毒素分子LR8M及其共價結合物之SEC層析圖。
圖17：藉由SDS-CE、Caliper分析非還原樣品之結合效率。
圖18：A：進行SEC-MALLS分析以鑑別及表徵抗TfR/BRDU雙特異性抗體與BRDU標記的DNA之複合物以及游離雙特異性抗體及游離BRDU-DNA。自管柱溶離MW為244.9kDa的複合物，偵測到MW為215.4kDa的游離雙特異性抗體且偵測到MW為16.4kDa之游離BRDU-DNA。
B：進行SEC-MALLS分析以鑑別及表徵抗TfR/BRDU雙特異性抗體與BRDU標記的DNA之複合物以及游離雙特異性抗體及游離BRDU-DNA。複合物展現6.8nm之流體動力半徑，而游離雙特異性抗體展現6.2nm之流體動力半徑。
圖19：A：進行SEC-MALLS分析以鑑別及表徵anti-TfR/生物素雙特異性抗體與生物素化之抗pTau抗體的複合物以及游離雙特異性抗體及游離生物素化之抗pTau抗體。複合物展現8.0nm之流體動力半徑，而游離雙特異性抗體展現6.2nm之流體動力半徑且游離生物素化之抗pTau抗體展現5.5nm之流體動力半徑。
B：進行SEC-MALLS分析以鑑別及表徵anti-TfR/生物素雙特異性抗體與生物素化之抗pTau抗體的複合物以及游離雙特異性抗體及游離生物素化之抗pTau抗體。自管柱溶離MW為501kDa之複合物，偵測 到MW為205kDa之游離雙特異性抗體且偵測到MW為150kDa之游離生物素化之抗pTau抗體。
C：若使用錯誤的半抗原及抗半抗原抗體組合，則不形成複合物。
圖20：生物素化之抗pTau抗體與抗CD33/生物素雙特異性抗體之複合物(左上圖)及游離生物素化之抗pTau抗體(右上圖)未有效胞吞(細胞溶解，線)且未傳輸至底外側(左部管柱，淺灰色)或頂部(右部管柱，黑色)隔室(負載量3.8μg/ml)。
生物素化之抗pTau抗體與抗TfR/生物素雙特異性抗體1(左下圖)或抗TfR/生物素雙特異性抗體2(右下圖)之複合介導有效胞吞作用(細胞溶解，線)且隨後將生物素化之抗pTau抗體傳輸至底外側(左部管柱，淺灰色)以及傳輸回到頂部(右部管柱，黑色)隔室(負載量3.8μg/ml)。
圖21：雙特異性抗人類Tau(pS422)/生物素抗體之非共價複合物及生物素化之抗TfR抗體Fab片段的轉胞吞作用分析法之結果。
I.定義
如本文所用，根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述的Kabat編號系統對重鏈及輕鏈之全部恆定區及結構域的胺基酸位置進行編號且在本文中稱為「根據Kabat編號」。具體來說，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)之Kabat編號系統(參看第647-660頁)用於κ及λ同型的輕鏈恆定域CL且Kabat EU索引編號系統(參看第661-723頁)用於恆定重鏈結構域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)。
出於本文之目的，「接受體人類構架」為包含來源於人類免疫球蛋白構架或人類共同構架(如以下所定義)之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、 8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下、或2個或2個以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架在序列上一致。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另作指示，否則如本文所使用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(kd)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。量測結合親和力之具體說明性及例示性實施例描述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個變化之親本抗體，在一或多個高變區(HVR)中具有一或多個變化之抗體，此等變化使抗體對抗原之親和力得到改良。
術語「抗人類Tau(pS422)抗體」及「特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體」係指能夠以足夠親和力結合人類Tau(pS422)以使得抗體適用作靶向人類Tau(pS422)之診斷劑及/或治療劑的抗體。在一個實施例中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測，抗人類Tau(pS422)抗體與不相關非人類Tau(pS422)蛋白之結合程度小於抗體與人類Tau(pS422)之結合程度的約10%。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所要抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指不同於完整抗體之分子，其包含完整抗體中結合該完整抗體所結合之抗原的部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈 抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「生物素」，簡寫「BI」，表示5-[(3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸。生物素亦稱為維生素H或輔酶R。
術語「特異性結合於人類Tau(pS422)的生物素化之抗體」表示包含生物素部分、視情況存在之連接基團及特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的結合實體。連接基團可為任何連接基團，諸如肽連接基團或化學連接基團。
術語「雙特異性抗體」表示具有兩個不同(抗原/半抗原)結合特異性之抗體。在一個實施例中，雙特異性抗體對兩種不同抗原(亦即半抗原及非半抗原之抗原)具有特異性。
術語「溴去氧尿苷」，簡寫為「BrdU」，表示5-溴-2'-去氧尿苷。溴去氧尿苷亦稱為溴尿苷、BudR、BrdUrd。
術語「特異性結合於人類Tau(pS422)之溴去氧尿苷化抗體」表示包含溴去氧尿苷部分、視情況存在之連接基團及特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的結合實體。連接基團可為任何連接基團，諸如肽連接基團或化學連接基團。
術語「地高辛」，簡寫為「DIG」，表示3-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-3,12,14-三羥基-10,13-二甲基-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-十四氫-環戊并[a]-菲-17-基]-2H-呋喃-5-酮(CAS號1672-46-4)。地高辛(DIG)為植物毛地黃(Digitalis purpurea)、東方地黃(Digitalis orientalis)及毛花洋地黃(Digitalis lanata)(毛地黃(foxgloves))的花及葉中專門發現之類固醇(Polya,G.,Biochemical targets of plant bioactive compounds,CRC Press,New York(2003)第847頁)。
術語「特異性結合於人類Tau(pS422)的地高辛化抗體」表示包含地高辛部分、視情況存在之連接基團及特異性結合於人類Tau (pS422)之抗體的結合實體。連接基團可為任何連接基團，諸如肽連接基團或化學連接基團。
術語「螢光素」，簡寫為「FLUO」，表示6-羥基-9-(2-羧基苯基)-(3H)-二苯并哌喃-3-酮，或者2-(6-羥基-3-側氧基-(3H)-二苯并哌喃-9-基)-苯甲酸。螢光素亦稱為螢光黃、C.I.45350、溶劑黃94、D & C 7號黃、安吉福(angiofluor)、日本黃(Japan yellow)201或肥皂黃。
術語「特異性結合於人類Tau(pS422)的螢光素化抗體」表示包含螢光素部分、視情況存在之連接基團及特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的結合實體。連接基團可為任何連接基團，諸如肽連接基團或化學連接基團。
術語「茶鹼」，簡寫為「THEO」，表示1,3-二甲基-7H-嘌呤-2,6-二酮。茶鹼亦稱為二甲基黃嘌呤。
術語「特異性結合於人類Tau(pS422)的茶鹼化抗體」表示包含茶鹼部分、視情況存在之連接基團及特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的結合實體。連接基團可為任何連接基團，諸如肽連接基團或化學連接基團。
術語「半抗原」表示僅在連接於大型載劑(諸如蛋白質)時可引起免疫反應的小分子。例示性半抗原為苯胺、鄰、間及對胺基苯甲酸、醌、組織胺-丁二醯基-甘胺酸(HSG)、肼酞嗪、氟烷、銦-DTPA、螢光素、生物素、地高辛、茶鹼、溴去氧尿苷及二硝基苯酚。在一個實施例中，半抗原為生物素或地高辛或茶鹼或螢光素或溴去氧尿苷。
術語「特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體」表示(共價)結合於特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的半抗原。活化半抗原衍生物可用作形成此類結合物之起始物質。在一個實施例中，半抗原經連接基團結合(在一個實施例中經其3-羥基)至特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體。在一個實施例中，連接基團包含a)一或多個(在 一個實施例中三至六個)亞甲基-羧基-甲基(-CH2-C(O)-)，及/或b)1至10(在一個實施例中1至5)個胺基酸殘基(在一個實施例中，選自甘胺酸、絲胺酸、麩胺酸、β-丙胺酸、γ-胺基丁酸、ε-胺基己酸或離胺酸)，及/或c)一或多種(在一個實施例中，一種或兩種)具有結構式NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH之化合物，其中n為2或3且x為1至10，在一個實施例中，1至7。最後元素導致(至少部分)式-NH-[(CH2)nO]xCH2-CH2-C(O)-之連接基團(部分)。此類化合物之一個實例為例如12-胺基-4,7,10-三氧雜十二酸(導致TEG(三乙二醇)連接基團)。在一個實施例中，連接基團另外包含順丁烯二醯亞胺基。另外，連接基團可在空間上幫助抗半抗原抗體與特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體的半抗原結合。在一個實施例中，連接基團結合於特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的胺基酸側鏈(例如經胺基或硫醇基結合於離胺酸或半胱胺酸側鏈)。在一個實施例中，連接基團結合於特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的胺基端或羧基端。連接基團與特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的結合位置通常選擇位於與連接基團之結合不影響特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的生物活性的區中。因此，連接基團之連接位置視負責特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的生物活性的相關結構元件而定。可在結合之前或之後在活體外分析法中測試特異性結合於與半抗原連接之人類Tau(pS422)之抗體的生物活性。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在5個主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中數個類別可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA1及IgA2。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。
「效應功能」係指隨抗體類別變化可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下且持續必需時間有效達成所要治療或防治結果之量。
本文之術語「Fc區」用於定義含有恆定區之至少一部分之免疫球蛋白重鏈的C端區。術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所描述。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域之FR通常由4個FR域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列一般按以下順序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用來指代結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。術語「全長抗體」表示由藉由雙硫鍵連接之兩個抗體輕鏈多肽及兩個抗體重鏈多肽組成之多聚多肽，其中在兩個抗體重鏈多肽中C端離胺酸殘基(K)可存在或不存在。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」在本文中可互換使用且係指已引入外源核酸的細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及由其獲得之子代而不考慮繼代次數。子代在核酸含量上可能不完全與母細胞相同，而是可能含有突變。本文中包括具有與關於在原始轉型細胞中所篩檢或選擇相同之功能或生物活性的突變型子代。
「人類共同構架」為代表所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列子組為如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242，第1-3卷中之子組。在一個實施例中，對於VL，子組為如Kabat等人，上文中之子組κI。在一實施例中，對於VH而言，子群為如Kabat等人(同上文)中之子群III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部HVR(例如CDR)皆對應於非人類抗體之HVR，且全部或實質上全部FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已進行人類化之抗體。
如本文所使用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變(「互補決定區」或「CDR」)且形成結構上定義環(「高變環」)，及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)之各區域。一般而言，抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1，H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2，L3)。
此處之HVR包括(a)出現在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處之高變環(Chothia,C.及Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；(b)出現在胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處之CDR(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；(c)出現在胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處之抗原觸點(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
除非另外指示，否則本文中可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)係根據Kabat等人之上述文獻進行編號。
「免疫結合物」為與一或多個異源分子結合之抗體。
「個體(individual)」或「個體(subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如母牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴子)、兔子及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體為人類。
「分離」之抗體為與自然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，抗體係純化至大於95%或99%純度，如由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評定抗體純度之方法之綜述參看例如，Flatman, S.等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。「經分離」核酸係指已與其天然環境之組分分離之核酸分子。經分離核酸包括如下核酸分子：該核酸分子含於通常含有該核酸分子之細胞中，但該核酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置上。
「編碼抗人類Tau(pS422)抗體之經分離之核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括單一載體或各別載體中之此類核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置處之此類核酸分子。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體獲得的抗體，亦即除可能之變異型抗體(例如含有天然產生之突變或在產生單株抗體製劑期間出現之變異型抗體，此等變異體通常以較小量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體係自實質上均質之抗體群體獲得之特性，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製備，該等技術包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體呈現法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，此等方法及製備單株抗體之其他例示性方法在本文中描述。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然產生之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓之雜四聚醣蛋白，由經二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，繼而為3個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，繼而為恆定輕(CL)域。抗體 輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為κ及λ。
術語「藥品說明書」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用該等治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告之信息。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分率。可以此項技術內之多種方式，例如使用公開可得之計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件，達成比對以測定胺基酸序列一致性百分比。熟習此項技術者可確定適於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需之任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較計算機程序ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較計算機程序係由Genentech,Inc.創作且原始碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office)(Washington D.C.,20559)存檔，其中其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程序可自Genentech,Inc.(South San Francisco,California)公開獲得，或可由原始碼編譯。ALIGN-2程序應經編譯以供在UNIX操作系統(包括數字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程序設定且不變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，如下計算既定胺基酸序列A對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可稱為既定胺基酸序列A具有或包含某一對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%)：100分數X/Y
其中X為利用序列比對程序ALIGN-2對A與B進行比對時評為一致匹配的胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中胺基酸殘基的總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性%將不等於B與A之胺基酸序列一致性%。除非另外具體說明，否則本文中使用之所有胺基酸序列一致性%值均係使用ALIGN-2計算機程序如剛剛前一段落中所述獲得。
術語「醫藥調配物」係指呈某種形式以允許所含活性成分之生物活性有效且不含對該調配物所投與之個體有不可接受之毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外的對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所使用之術語「人類Tau(pS422)」係指天然人類Tau(pS422)(UniProt P37840)。該術語涵蓋「全長」未經處理之人類Tau(pS422)以及由在細胞中處理產生之任何形式之人類Tau(pS422)。該術語亦包涵天然存在之人類Tau(pS422)之變異體，例如突變，剪接變異體或對偶基因變異體。人類Tau(pS422)之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：02中。
如本文所用之「治療(treatment)」(及其語法變體，諸如「治療(treat)」或「治療(treating」)係指試圖改變所治療之個體的自然病程之臨床介入，且可進行以用於預防或在臨床病理學病程中進行。合乎需要之治療作用包括(但不限於)預防疾病出現或復發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展率、改善或減輕疾病病況，及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明抗體用於延遲疾病產生或減緩疾病進展。
術語「x價」，例如「單價」或「二價」或「三價」或「四價」， 表示抗體分子中存在指定數目之結合位點，亦即「x」。因而，術語「二價」、「四價」及「六價」表示抗體分子中分別存在兩個結合位點，四個結合位點及六個結合位點。雙特異性抗體至少為「二價」的且可為「三價」或「多價」(例如「四價」或「六價」)。在一實施例中，雙特異性抗體為二價、三價或四價的。在一個實施例中，雙特異性抗體為二價的。在一個實施例中，雙特異性抗體為三價的。在一個實施例中，雙特異性抗體為四價的。
甚至在存在兩個以上結合位點(亦即抗體為三價或多價)的情況下，雙特異性抗體可為雙特異性的。術語雙特異性抗體包括例如多價單鏈抗體、雙功能抗體及三功能抗體，以及具有全長抗體之恆定域結構的抗體，其經經一或多個肽連接基團連接有其他抗原結合位點(例如單鏈Fv、VH結構域及/或VL結構域、Fab或(Fab)2)。抗體可為來自單個物種之全長抗體，或為嵌合或人類化抗體。對於具有兩個以上抗原結合位點之抗體，一些結合位點可相同，只要抗體具有針對兩個不同抗原之結合位點。亦即，鑒於第一結合位點對半抗原具有特異性，第二結合位點對非半抗原之抗原具有特異性，且反之亦然。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體結合於抗原之域。天然抗體之重鏈及輕鏈的可變域(分別為VH及VL)一般具有類似結構，其中各域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參看例如Kindt,T.J.等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman及Co.,N.Y.(2007)，第91頁)，單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用來自結合抗原之抗體的VH或VL結構域分離結合特定抗原之抗體以分別篩選互補VL或VH結構域之文庫。參看例如Portolano,S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628)。
如本文所用之術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳播其 所連接之另一核酸。該術語包括呈自我複製型核酸結構(self-replicating nucleic acid structure)形式之載體以及併入其所引入之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠引導其可操作地連接之核酸之表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。
II.組合物及方法 A.如本文所報導之血腦屏障穿梭子
如本文所報導之非共價複合物的一部分為血腦屏障-穿梭子模組(BBB-穿梭子模組)，其為具有針對半抗原之第一結合特異性及針對血腦屏障受體(BBBR)之第二結合特異性的雙特異性抗體。此類BBB-穿梭子模組識別血腦屏障上能夠轉胞吞作用的細胞表面目標(諸如TfR、LRP或其他目標，BBBR)且同時結合於半抗原化淨負荷。
已發現無更多關於結合價數、抗體型式、BBBR結合親和力的要求必須滿足。
另外已發現如本文所報導的基於雙特異性抗體之穿梭子模組並非必須自血腦屏障之內皮細胞釋放以介導半抗原化淨負荷之轉胞吞作用。實情為，藉由基於雙特異性抗體之穿梭子模組複合/結合於基於雙特異性抗體之穿梭子模組之半抗原化淨負荷當結合於BBBR時，自BBB細胞內基於雙特異性抗體之穿梭子模組釋放，亦即在胞內囊泡系統中，與穿梭子模組分離，及隨後自BBB細胞胞吐至腦中在BBB細胞中留下雙特異性抗體。
如本文所報導之基於雙特異性抗體之穿梭子模組就BBBR結合特異性價數以及BBBR結合特異性親和力而言高度可變。同時，其使淨負荷能夠自穿梭子模組釋放。
多特異性抗體
已藉由融合例如IgG抗體型式與單鏈結構域開發多種重組抗體型式(例如四價雙特異性抗體)(參看例如Coloma,M.J.等人，Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342；及Morrison,S.L.,Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。
此外，已開發出不再保留抗體核心結構(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)之若干其他型式，諸如二功能抗體、三功能抗體或四功能抗體、微型抗體、若干單鏈型式(scFv、Bis-scFv)，其能夠結合兩種或兩種以上抗原(Holliger,P.等人，Nature Biotech 23(2005)1126-1136；Fischer,N.,Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；Shen,J.等人，Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74；Wu,C.等人，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。
全部此類型式使用連接基團融合抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)與另一結合蛋白(例如scFv)或融合例如兩個Fab片段或scFv(Fischer,N.及Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14)或CrossFab。必須記住的是，可能需要藉由保持與天然存在之抗體高度的相似性來保留可經由Fc受體結合介導之效應功能，諸如補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
在WO 2007/024715中報導了作為經工程改造之多價及多重專一性結合蛋白之雙重可變域免疫球蛋白。US 6,897,044中報導製備生物活性抗體二聚體之方法。具有至少四個經肽連接基團彼此連接的可變域之多價FV抗體構築體報導於US 7,129,330中。二聚及多聚抗原結合結構報導於US 2005/0079170中。US 6,511,663中報導包含三個或四個藉由連接結構彼此共價結合之Fab片段的三價或四價單特異性抗原結合蛋白，該蛋白質並非天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報導可有效表現於原核及真核細胞中且適用於治療及診斷方法中的四價雙特異性抗體。US 2005/0163782中報導一種自包含兩種多肽二聚體之混合物自未經至少一個鏈間雙硫鍵聯之二聚體分離或較佳合成經至少一個鏈間雙硫鍵聯連接的二聚體之方法。雙特異性四價受體報導於 US 5,959,083中。具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之工程改造抗體報導於WO 2001/077342中。
WO 1997/001580中報導多特異性及多價抗原結合多肽。WO 1992/004053報導通常自結合於相同抗原決定子的IgG類單株抗體製備的均結合物藉由合成交聯共價鍵聯。WO 1991/06305中報導對抗原具有高親合力之寡聚單株抗體，藉此分泌通常為IgG類之寡聚物，其具有關聯在一起的兩個或兩個以上免疫球蛋白單體形成四價或六價IgG分子。在US 6,350,860中報導了綿羊源性抗體及經工程改造之抗體構築體，其可用於治療干擾素γ活性病原性疾病。在US 2005/0100543中報導了作為雙重專一性抗體之多價載體的可靶向之構築體，亦即可靶向之構築體之各分子可充當兩個或兩個以上雙重專一性抗體之載體。WO 1995/009917中報導基因工程改造之雙特異性四價抗體。在WO 2007/109254中報導由穩定scFv組成或包含穩定scFv之穩定結合分子。
在某些實施例中，本文提供之抗體或如本文所報導之結合物中的抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者是針對半抗原且另一者是針對任何其他(非半抗原)抗原。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位至細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參看Milstein,C.及Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540；WO 93/08829；及Traunecker,A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)及「杵-臼」工程改造(參看例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可由以下製得：製備抗體Fc-雜二聚分子之工程改造靜電轉向效應(WO 2009/089004)；交聯兩種或兩種以上抗體或片段(參看例如US 4,676,980及Brennan,M.等人， Science 229(1985)81-83)；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參看例如Kostelny,S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用製備雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參看例如Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；及使用單鏈Fv(scFv)二聚體(參看例如Gruber,M等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；及如例如Tutt,A.等人J.Immunol.147(1991)60-69中所描述製備三特異性抗體。
在一個實施例中，雙特異性抗體之重鏈的CH3結構域藉由「杵-臼」技術改變，該技術在例如WO 96/027011、WO 98/050431、Ridgway J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621、Merchant,A.M.等人，Nat Biotechnol 16(1998)677-681中以若干實例詳細描述。在此方法中，改變兩個CH3結構域之相互作用表面以提高含有此等兩種CH3結構域之兩條重鏈的雜二聚。(兩條重鏈之)兩個CH3結構域中的每一者可為「杵」，而另一者可為「臼」。引入二硫橋鍵使雜二聚體穩定(Merchant,A.M等人，Nature Biotech 16(1998)677-681；Atwell,S.等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)且提高產量。
在全部態樣之一個實施例中，雙特異性抗體特徵在於- 一條重鏈之CH3結構域及另一重鏈之CH3結構域各自在界面處會合，其包含抗體CH3結構域之間的初始界面，其中改變該界面以促進形成雙特異性抗體，其中改變的特徵在於a)一條重鏈之CH3結構域改變，使得在初始界面內，一條重鏈之CH3結構域遇到雙特異性抗體中另一重鏈之CH3結構域的初始界面，一個胺基酸殘基經一個具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在一條重鏈之CH3結構域之界面內產生一個隆凸，該隆凸可位於 另一重鏈之CH3結構域之界面內的一個凹穴中；及b)另一重鏈之CH3結構域改變，使得在雙特異性抗體內遇到第一CH3結構域之初始界面的第二CH3結構域之初始界面內
一個胺基酸殘基經一個具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第二CH3結構域之界面內產生一個凹穴，第一CH3結構域之界面內的一個隆凸可位於該凹穴中。
因此，在一個實施例中，如本文所報導之抗體特徵在於- 全長抗體之第一重鏈之CH3結構域及全長抗體之第二重鏈之CH3結構域各自在抗體CH3結構域之間的初始界面中包含改變的界面處相遇，其中i)在第一重鏈之CH3結構域中
一個胺基酸殘基經一個具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在一條重鏈之CH3結構域之界面內產生一個隆凸，該隆凸可位於另一重鏈之CH3結構域之界面內的一個凹穴中；且其中ii)在第二重鏈之CH3結構域中
一個胺基酸殘基經一個具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第二CH3結構域之界面內產生一個凹穴，第一CH3結構域之界面內的一個隆凸可位於該凹穴中。
在一個實施例中，具有較大側鏈體積之胺基酸殘基係選自由以下組成之群：精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。
在一個實施例中，具有較小側鏈體積之胺基酸殘基係選自由以下組成之群：丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、纈胺酸(V)。
在一個實施例中，兩個CH3結構域藉由在各CH3結構域的相應位置中引入半胱胺酸(C)作為胺基酸來進一步改變，使得可在兩個CH3 結構域之間形成二硫橋鍵。
在一個較佳實施例中，多特異性抗體包含「杵鏈」之第一CH3結構域中的胺基酸T366W突變及「臼鏈」之第二CH3結構域中的胺基酸T366S、L368A、Y407V突變。例如藉由向「臼鏈」之CH3結構域中引入胺基酸Y349C突變及向「杵鏈」之CH3結構域中引入胺基酸E356C突變或胺基酸S354C突變，亦可使用CH3結構域之間的額外鏈間二硫橋鍵(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681)。
在一個實施例中，雙特異性抗體包含兩個CH3結構域中之一者中的Y349C、T366W突變及兩個CH3結構域中之另一者中的E356C、T366S、L368A、Y407V突變。在一個實施例中，雙特異性抗體包含兩個CH3結構域中之一者中的Y349C、T366W突變及兩個CH3結構域中之另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變(一個CH3結構域中的額外Y349C突變與另一CH3結構域中的額外E356C或S354C突變形成鏈間二硫橋鍵)(根據Kabat之EU索引編號；(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)))。可替代或另外地使用如EP 1 870 459 A1所述的其他杵-臼技術。因此，雙特異性抗體之另一實例為「杵鏈」之CH3結構域的R409D、K370E突變及「臼鏈」之CH3結構域中的D399K、E357K突變(根據Kabat之EU索引編號；(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。
在一個實施例中，雙特異性抗體包含「杵鏈」之CH3結構域中的T366W突變及「臼鏈」之CH3結構域中的T366S、L368A、Y407V突變，及「杵鏈」之CH3結構域中的額外R409D、K370E突變及「臼鏈」之CH3結構域中的D399K、E357K突變。
在一個實施例中，雙特異性抗體包含兩個CH3結構域中之一者中的Y349C、T366W突變及兩個CH3結構域中之另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變或雙特異性抗體包含兩個CH3結構域中之一者中的Y349C、T366W突變及兩個CH3結構域中之另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變及「杵鏈」之CH3結構域中的額外R409D、K370E突變及「臼鏈」之CH3結構域中的D399K、E357K突變。CH3結構域中的此類杵及臼突變通常用於SEQ ID NO：58之人類重鏈恆定區(人類IgG1子類異型)(高加索人(Caucasian)及美國黑人(Afro-American)或突變體L234A/L235A，及L234A/L235A/P329G)(根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)之EU索引編號)。
在一個實施例中，雙特異性抗體包含在CH3結構域中另外包括此類「杵」及「臼」突變(例如兩個CH3結構域中之一者中的Y349C、T366W突變及兩個CH3結構域中之另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變)的SEQ ID NO：58之人類重鏈恆定區(根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)之EU索引編號)。
本文中亦包括具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之工程改造抗體，包括「章魚抗體」(參看例如US 2006/0025576)。
此處之抗體或片段亦包括包含結合於半抗原以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙重影響Fab」或「DAF」(參看例如US 2008/0069820)。
此處之抗體或片段亦包括描述於以下中之多特異性抗體：WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2010/145793。
在一個較佳實施例中，多特異性抗體(其在各重鏈中包含CH3結構域)包含兩個CH3結構域中之一者中的胺基酸S354C、T366W突變及兩個CH3結構域之另一者中的胺基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突變(一個CH3結構域中的額外胺基酸S354C突變及另一CH3結構域中之額外胺基酸Y349C突變形成鏈間二硫橋鍵)(根據Kabat編號)。
涵蓋實施雜二聚之CH3修飾的其他技術作為替代方式且例如描述於WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。
在一個實施例中，使用EP 1 870 459 A1中所述之雜二聚方法。此方法基於在兩條重鏈之間的CH3/CH3結構域界面中的特定胺基酸位置處引入具有相反電荷之帶電胺基酸的取代/突變。在一個較佳實施例中，多特異性抗體包含(多特異性抗體之)第一重鏈之CH3結構域中的胺基酸R409D、K370E突變及(多特異性抗體之)第二重鏈之第二CH3結構域中的胺基酸D399K、E357K突變(根據Kabat編號)。
在另一實施例中，多特異性抗體包含「杵鏈」之CH3結構域中的胺基酸T366W突變及「臼鏈」之CH3結構域中的胺基酸T366S、L368A、Y407V突變及另外「杵鏈」之CH3結構域中的胺基酸R409D、K370E突變及「臼鏈」之CH3結構域中的胺基酸D399K、E357K突變。
在另一實施例中，多特異性抗體包含兩個CH3結構域中之一者中的胺基酸S354C、T366W突變及兩個CH3結構域之另一者中的胺基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突變或多特異性抗體包含兩個CH3結 構域中之一者中的胺基酸Y349C、T366W突變及兩個CH3結構域之另一者中的胺基酸S354C、T366S、L368A、Y407V突變及另外「杵鏈」之CH3結構域中的胺基酸R409D、K370E突變及「臼鏈」之CH3結構域中的胺基酸D399K、E357K突變。
在一個實施例中，使用WO2013/157953中所述之雜二聚方法。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸T366K突變且第二CH3結構域包含胺基酸L351D突變。在另一實施例中，第一CH3結構域另外包含胺基酸L351K突變。在另一實施例中，第二CH3結構域另外包含選自Y349E、Y349D及L368E(較佳L368E)的胺基酸突變。
在一個實施例中，使用WO2012/058768中所述之雜二聚方法。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸L351Y、Y407A突變且第二CH3結構域包含胺基酸T366A、K409F突變。在另一實施例中，第二CH3結構域包含以下位置處的另一胺基酸突變：T411、D399、S400、F405、N390或K392，例如選自a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c)S400E、S400D、S400R或S400K、F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W、N390R、N390K或N390D、K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。在另一實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸L351Y、Y407A突變且第二CH3結構域包含胺基酸T366V、K409F突變。在另一實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸Y407A突變且第二CH3結構域包含胺基酸T366A、K409F突變。在另一實施例中，第二CH3結構域另外包含胺基酸K392E、T411E、D399R及S400R突變。
在一個實施例中，WO2011/143545中所述的雜二聚方法與例如選自由368及409組成之群組的位置處之胺基酸修飾一起使用。
在一個實施例中，使用WO2011/090762中所述的雜二聚方法，其 亦使用上文所述的杵-臼技術。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸T366W突變且第二CH3結構域包含胺基酸Y407A突變。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸T366Y突變且第二CH3結構域包含胺基酸Y407T突變。
在一個實施例中，多特異性抗體具有IgG2同型且使用WO2010/129304中所述的雜二聚方法。
在一個實施例中，使用WO2009/089004中所述之雜二聚方法。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸殘基K392或N392經帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳K392D或N392D)取代且第二CH3結構域包含胺基酸殘基D399、E356、D356或E357經帶正電胺基酸(例如離胺酸(K)或精胺酸(R)，較佳D399K、E356K、D356K或E357K且更佳D399K及E356K)取代。在另一實施例中，第一CH3結構域另外包含胺基酸殘基K409或R409經帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳K409D或R409D)取代。在另一實施例中，第一CH3結構域另外或或者包含胺基酸殘基K439及/或K370經帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))取代。
在一個實施例中，使用WO2007/147901中所述之雜二聚方法。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸K253E、D282K及K322D突變且第二CH3結構域包含胺基酸D239K、E240K及K292D突變。
在一個實施例中，使用WO2007/110205中所述之雜二聚方法。
B.如本文所報導之非共價複合物
如本文所報導之血腦屏障穿梭子用作特異性結合於人類Tau(pS422)傳遞媒介之抗體。特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體與半抗原結合且因此藉由血腦屏障穿梭子之半抗原結合位點複合。此複合物經定義且將特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體穩定且特異性跨血腦屏障傳遞。因為特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化 抗體以非共價方式與血腦屏障穿梭子複合，一方面，特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體在其循環時間期間結合於其傳遞媒介(=血腦屏障穿梭子=雙特異性抗體)，但是另一方面亦可在轉胞吞作用之後有效釋放。可在無特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的活性干擾下實現與半抗原結合。血腦屏障穿梭子不含異常共價加成且因此避免任何免疫原性風險。如本文所報導的含有半抗原特異性結合位點的特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體與雙特異性抗體的複合物賦予特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體以良性生物物理學特性。此外，此類複合物能夠將負荷靶向呈現雙特異性抗體之第二結合特異性識別之抗原的細胞或組織。
特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體儘管經半抗原化以及儘管經血腦屏障穿梭子複合(=雙特異性抗體)但仍保留其官能性。此外，雙特異性抗體之血腦屏障受體結合位點在特異性結合於人類Tau(pS422)的複合半抗原化抗體存在下保留其結合特異性及親和力。如本文所報導的特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體與雙特異性抗體之複合物可用於將特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體特異性靶向表現血腦屏障受體之細胞。因為特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體以非共價方式偶合至雙特異性抗體，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體可在內化或轉胞吞作用之後釋放。
由於其化學及物理特性，諸如分子量及結構域架構(包括二級修飾)，抗體之後續加工非常複雜。舉例而言，不僅經調配之藥物而且後續加工(DSP)濃縮溶液中之中間體需要實現低體積以供經濟處置及應用儲存。
隨著抗體濃度增加，可觀測形成聚集體之趨勢。此等聚集抗體相較於經分離抗體具有削弱之特徵。如本文所報導之複合物的聚集可藉由在血腦屏障穿梭子模組之單鏈抗體的重鏈及輕鏈可變域之間引入 二硫鍵來降低。此改良之穩定性不僅適用於生產過程期間而且亦適用於複合物儲存。在一個實施例中，雙特異性抗體中包含的單鏈抗體之可變域之間的二硫鍵獨立於各單鏈抗體選自：i)重鏈可變域位置44至輕鏈可變域位置100，ii)重鏈可變域位置105至輕鏈可變域位置43，或重鏈可變域位置101至輕鏈可變域位置100。
在一個實施例中，雙特異性抗體中包含的單鏈抗體之可變域之間的二硫鍵在重鏈可變域位置44與輕鏈可變域位置100之間。
在一個實施例中，雙特異性抗體中包含的單鏈抗體之可變域之間的二硫鍵在重鏈可變域位置105與輕鏈可變域位置43之間。
C.特異性結合於人類Tau(PS422)之例示性抗體
如本文所報導之非共價複合物的特異性結合於人類Tau(pS422)之人類化抗體藉由標準人類化方法不可用。需要在胺基酸序列中引入非標準突變以獲得與親本家兔抗體具有相當的結合特徵之人類化抗體。此為尤其重要的，因為如本文中所報導之抗體意欲穿過人類血腦屏障且在人類腦部中起作用。因此，選擇人類化抗體之一般應用準則不夠嚴格以至於無法直接應用於當前情況中。
已發現，為了獲得適合且可展的人類化抗體，兩個在CDRL3(輕鏈CDR3)中形成二硫橋鍵之半胱胺酸必須分別由絲胺酸及異白胺酸置換。除確保相同CDRL3之恰當定向以外，存在於家兔CDRL3中間的異白胺酸殘基亦缺失，從而產生比親本家兔CDRL3少一個胺基酸殘基之人類化CDRL3。
另外發現在位置4、24及78處之重鏈中保持三個纈胺酸胺基酸殘基為有利的。不受此理論約束，假定需要此等殘基以確保恰當表現重鏈可變區之抗原結合環。另外，位置71處存在精胺酸殘基為有利的。
不同人類化輕鏈可變域之序列比對顯示於圖1中。不同人類化重 鏈可變域之序列比對展示於圖2中。如本文所使用之所有編號係基於Kabat可變域編號方案。
在下表中，分別顯示與人類化重鏈可變域VH14及VH20組合之家兔輕鏈可變域之不同人類化變異體的特徵。結合搭配物為人類Tau(pS422)。
參考值VH00與VL00(家兔抗體)：25℃：kd=2.6E-04；t/2=44min。
37℃：ka=3.7E+04，kd=5.25E-03，KD=1.4E-08，t/2=22min。
在下表中，分別顯示與人類化輕鏈可變域VL17及VL19組合的家免輕鏈可變域之不同人類化變異體的特徵。
參考值VH00與VL00(家兔抗體)：25℃：kd=2.6E-04；t/2=44min。
37℃：ka=3.7E+04，kd=5.25E-03，KD=1.4E-08，t/2=22min。
在下表中，展示不同VH/VL組合之動力學常數。
人類化VH與VL之不同組合之生物化學結合顯示於圖3及圖4中。
在下表中顯示不同VH/VL組合之結合特異性(EC50值以[ng/ml]為單位)。
所選人類化VH/VL組合對人類tau突變S422A之敏感性自圖5中所示之西方墨點可見。所有人類化變異體均選擇性地結合至在S422處磷酸化之人類tau。存在對親本家兔抗體之非S422磷酸化抗原決定基的低水準x反應性，而所示之人類化變異體在此方面與親代家兔抗體相比具有較低的交叉反應。
在圖6中顯示親代家兔抗體及所選人類化抗人類Tau(pS422)抗體 結合至阿茲海默氏病患者腦部提取物中之PHF-tau。
下表概述所選人類化VH/VL組合之生物特性。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含至少一個或兩個或三個或四個或五個或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：08之胺基酸序列；(b)HVR-H2；其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含至少一個或兩個或三個或四個或五個或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：08之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：09之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：05之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含至少一個或兩個或三個或四個或五個或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：08之胺基酸序列；(b)HVR-H2；其包含SEQ ID NO：09之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列i)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；或ii)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：09；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含i)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；或ii)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：09；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10。
在另一實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體另外包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列i)(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15；或ii)(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：05；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15。
在另一實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含i)(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(b)HVR- L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15；或ii)(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：05；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15。
在一個實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含i)(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：08之胺基酸序列；(b)HVR-H2；其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，或ii)(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：08之胺基酸序列；(b)HVR-H2；其包含SEQ ID NO：09之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：05之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，或iii)(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：08之胺基酸序列；(b)HVR-H2；其包含SEQ ID NO：09之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
在另一實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的VH或VL相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗人類Tau(pS422)抗體保留結合於人類Tau(pS422)之能力。
在另一實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在一個實施例中，特異性結合 於人類Tau(pS422)之抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、CrossFab、scCrossFab、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為全長抗體，例如，完整IgG1或IgG 4抗體或如本文所定義的其他抗體類型或同型。
在另一實施例中，根據上述實施例中任一者的特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體可合併單獨或組合的合併任何特徵，如以下1-5部分中所述。
1.抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供之抗體之解離常數(KD)100nM，50nM或在1nM與100nM之間(例如10-7M或10-7M以下，例如10-7M至10-9M)。
在一個實施例中，藉由放射性標記之抗原結合分析(RIA)量測Kd。在一個實施例中，用所關注之抗體之Fab型式及其抗原進行RIA。舉例而言，藉由在未經標記抗原滴定系列存在下使Fab與最小濃度之經(125I)標記之抗原平衡，隨後用經抗Fab抗體塗佈之板捕獲結合抗原來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(參看例如Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。為了確立分析條件，將MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕獲抗-Fab抗體(Cappel Labs)塗佈隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷二至五小時。在無吸附劑培養盤(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]抗原與連續稀釋之所關注之Fab混合(例如與抗VEGF抗體Fab-12之評定相一致，Presta,L.G.等人，Cancer Res.57(1997)4593-4599))。隨後培育所關注之Fab隔夜；然而，可繼續培育較長時間(例如約65小時)以確保達到平衡。此後，在室溫下將混合物轉移至捕捉板中以用於培育(例如1小時)。接著移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)之PBS將盤洗滌 8次。當盤已乾燥時，每孔添加150μl閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM計數器(Packard)上對盤計數10分鐘。選擇提供小於或等於20%最大結合之各Fab的濃度用於競爭性結合分析。
根據另一實施例，使用BIACORE®表面電漿子共振分析法量測Kd。舉例而言，使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下用固定抗原CM5晶片以約10反應單位(RU)進行分析。在一個實施例中，根據供應商之說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)來活化羧基甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨後在5μl/min之流動速率下注射以獲得大約10個反應單位(RU)之偶合蛋白質。繼注射抗原之後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應基團。關於動力學量測，在25℃下，以約25μl/min之流速注射含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)界面活性劑之PBS(PBST)中的Fab兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE®評估軟件3.2版)，同時擬合締合及解離傳感器圖譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。以koff/kon比率來計算平衡解離常數(Kd)(參看例如Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。藉由以上表面電漿子共振分析，若締合速率超過106 M-1 S-1，則締合速率可使用螢光淬滅技藝量測，該技藝係在如光譜儀(諸如具有攪拌式比色管之止流裝備型光譜儀(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM光譜儀(ThermoSpectronic))中所量測之濃度增大之抗原存在下、在25℃量測PBS(pH 7.2)中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)之增加或降低。
2.抗體片段
在某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、CrossFab、scCrossFab、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參看Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。關於scFv片段之綜述，參看例如Plueckthun,A.,In；The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg and Moore(編)，Springer-Verlag,New York(1994)，第269-315頁；亦參看WO 93/16185；US 5,571,894及US 5,587,458。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基且活體內半衰期增加之Fab及F(ab')2片段之論述參看US 5,869,046。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之可具有二價或雙特異性的抗體片段。參看例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134；及Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(20039 129-134)中。
單域抗體為包含抗體之全部或部分重鏈可變域或全部或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參看例如US 6,248,516)。
抗體片段可藉由各種技術製備，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生，如本文所述。
3.人類化抗體
通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況將亦包 含全長人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro,J.C.及Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，且進一步描述於例如Riechmann,I.等人，Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321及US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人，Methods 36(2005)25-34(描述特異性測定區(SDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述「表面再塑」)；Dall'Acqua,W.F.等人，Methods 36(2005)43-60(描述「FR改組」)；及Osbourn,J.等人，Methods 36(2005)61-68及Klimka,A.等人，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述FR改組之「導引選擇」方法)中。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參看例如Sims,M.J.等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308)；衍生自具有輕鏈或重鏈可變區之特定亞群之人類抗體共有序列的構架區(參看例如Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；及Presta,L.G.等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參看例如Almagro,J.C.及Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；及衍生自篩選FR庫之構架區(參看例如Baca,M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684及Rosok,M.J.等人，J.Biol.Chem.271(1996922611-22618)。
4.多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單 株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對人類Tau(pS422)且另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至人類Tau(pS422)之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
用於製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參看Milstein,C.及Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829，及Traunecker,A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)及「杵-臼」工程改造(參見例如US 5,731,168)。多特異性抗體亦可由以下製得：製得抗體Fc-雜二聚分子之工程改造靜電轉向效應(WO 2009/089004)；交聯兩種或兩種以上抗體或片段(參看例如US 4,676,980及Brennan,M.等人，Science 229(1985)81-83)；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參看例如Kostelny,S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用製得雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參看例如Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參看例如Gruber,M等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；及如例如Tutt,A.等人J.Immunol.147(1991)60-69中所描述製備三特異性抗體。
本文中亦包括具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之工程改造抗體，包括「章魚抗體」(參看例如US 2006/0025576)。
本文中之抗體或片段亦包括「雙效Fab」或「DAF」，其包含結合至人類Tau(pS422)以及另一不同抗原之抗原結合位點(參看例如US 2008/0069820)。
此處之抗體或片段亦包括描述於以下中之多特異性抗體：WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2010/145793。
5.抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成進行製備。此等修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內進行殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合。
a)取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於進行取代突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守性取代展示於標題為「較佳取代」之下表中。更多實質性變化提供於標題為「例示性取代」之下表中，且參考胺基酸側鏈類別如下文進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體中且篩檢具有所要活性，例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC的產物。
胺基酸可根據共有側鏈性質進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別的成員。
一種類型之取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，所選用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體是在某些生物性質方面具有改進(例如改良)(例如增加之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物性質。一種例示性取代變異體為親和力成熟抗體，其可(例如)使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述之技術)方便地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異型抗體並篩檢具有特定生物活性(例如結合親和力)之變異型抗體。
可在HVR中進行改變(例如取代)例如以改良抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子編碼的殘基(參看例如Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，及/或接觸抗原之殘基)中用測試結合親和力之所得變異型VH或VL進行此類改變。藉由自二級文庫進行構築及再選擇之 親和力成熟技術已描述於例如Hoogenboom,H.R.等人Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。在親和力成熟技術之一些實施例中，可藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)中之任一者將多樣性引入至所選用於成熟之可變基因中。接著產生二級文庫。接著篩選文庫以鑑別具有所要親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法，其中若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)係經隨機化。參與抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來逐一鑑別。尤其常以CDR-H3及CDR-L3為目標。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不會實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文所提供之保守性取代)。此類改變可例如在HVR中接觸抗原之殘基之外。在以上提供之變異型VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種適用於鑑別可經靶向以用於突變誘發之抗體之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如由Cunningham,B.C.及Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085所描述。在此方法中，鑑別出一個殘基或一組標靶殘基(例如帶電荷殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且將其置換為中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)以判定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置引入其他取代。或者或另外，利用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之目標或排除在取代候選物之外。可篩檢變異體以確定其是否含有所要性質。
胺基酸序列插入物包括長度為一個殘基至含有一百個或更多殘 基之多肽之胺基及/或羧基未端融合體，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如，對於ADEPT而言)或增加抗體之血清半衰期之多肽的融合體。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，對本文提供之抗體進行改變以增加或減小抗體糖基化之程度。在抗體上添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來方便地達成。
在抗體包含Fc區之情況下，可變化附著於其上之醣。由哺乳動物細胞產生之天然抗體典型地包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵連接至Fc區之CH2域的Asn297(參看例如Wright,A.及Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便形成具有某些改良特性之抗體變異體。
c)Fc區變異體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，其在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體，此使得該抗體成為合乎應用需要之候選物，在該等應用中，活體內抗體半衰期較重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認 CDC及/或ADCC活性之降低/衰竭。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析，以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初生細胞、NK細胞僅表現FcγRIII，然而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch,J.V.及Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492之第464頁之表3中。評定所關注分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例描述於US 5,500,362(參看例如Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；及Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(參看Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。或者，可使用非放射性分析方法(參看例如流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用於該等分析之適用效應細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)及自然殺滅(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如，在諸如Clynes,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中所揭示之動物模型中評定相關分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此不具有CDC活性。參看例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評定補體活化，可進行CDC分析(參看例如Gazzano-Santoro,H.等人，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。亦可使用此項技術中已知之方法(參看例如Petkova,S.B.等人，Int.Immunol.18(2006：1759-1769)進行FcRn結合及活體內消除率/半衰期測定。
效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代之彼等抗體(US 6,737,056)。此類Fc區 突變包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327之兩者或兩者以上處之取代的Fc區突變，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc區突變(US 7,332,581)。
描述與FcR之結合改良或降低之某些抗體變異體(參看例如US 6,737,056；WO 2004/056312；及Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在一些實施例中，在使C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即降低)之Fc區中進行改變，例如如US 6,194,551、WO 99/51642及Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所描述。
半衰期延長且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593；及Kim,J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)之結合改良之抗體描述於US 2005/0014934中。彼等抗體包含具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此類Fc區變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代之彼等變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc區殘基434之取代(US 7,371,826)。
關於Fc區變異體之其他實例亦參看Duncan,A.R.及Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。
d)半胱胺酸工程改造抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體，例如「硫基MAb(thioMAb)」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基在抗體之可達位點處出現。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位於抗體之可達位點 且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接符-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，任一或多個以下殘基可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如US 7,521,541中所述產生半胱胺酸工程改造抗體。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，可將本文中所提供之抗體進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白質部分。適於衍生化抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三惡烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可於製造時具有優點。聚合物可具有任何分子量，且可具支鏈或不具支鏈。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特殊特性或功能，抗體衍生物是否將用於指定條件下之療法等考慮來確定。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由暴露於輻射選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害一般細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分近側之細胞之溫度的波長。
D.重組方法及組合物
可使用例如如US 4,816,567中所描述之重組方法及組合物產生抗體。在一個實施例中，提供編碼本文所描述之抗人類Tau(pS422)抗體之經分離核酸。此類核酸可編碼抗體的包含VL之胺基酸序列及/或包含VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。此核酸可編碼包含VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多種包含此核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在一個此實施例中，宿主細胞包含(例如已經以下轉型)：(1)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體，或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供製備抗人類Tau(pS422)抗體之方法，其中該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼抗體之核酸的宿主細胞且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
就重組產生抗人類Tau(pS422)抗體而言，分離例如如上文所描述之編碼抗體的核酸且將其插入一或多個載體中以便於進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。此核酸可易於使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)分離及定序。
適於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，特定言之在不需要糖基化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現參看例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參看Charlton,K.A., In：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編)，Humana Press,Totowa,NJ(2003)，第245-254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中之表現)在表現之後，抗體可以可溶性溶離份自細菌細胞糊狀物分離在且可進一步進行純化。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參看Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
適於表現糖基化抗體之宿主細胞亦可自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)獲得。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，特定言之用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參看例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978及US 6,417,429(描述在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40(COS-7)轉型之猴腎CV1株；人類胚腎株(如例如在Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(如例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；如例如在Mather,J.P.等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383 (1982)44-68中所述之TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述參看例如Yazaki,P.及Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268頁。
E.分析法
如本文所報導之非共價複合物的抗人類Tau(pS422)抗體可藉由所屬領域中已知的多種分析法針對其物理/化學特性及/或生物學活性進行鑑別、篩選或表徵。
1.結合分析法及其他分析法
例如藉由諸如ELISA、αLISA、西方墨點法、抗體或逆相陣列等之已知方法測試特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體的抗原結合活性。
在例示性ELISA或αLISA分析中，溶液(細胞上清液、細胞或組織溶菌液、體液等)中之Tau(pS422)由捕捉抗體結合，該捕捉抗體特異性結合於Tau(pS422)上之第一抗原決定基或某一構形及偶合至偵測實體之偵測抗體中的Tau(pS422)，該偵測實體特異性結合於Tau(pS422)之第二抗原決定基或構形。讀數係基於偵測實體(化學發光、螢光、能量轉移誘導之發光等)。在一些情況下，相同抗體可在相同分析中用作捕捉及偵測抗體以偵測Tau(pS422)之聚集形式(參看例如Tokuda,T.等人，Neurology 75(2010)1766-1772)。
在抗體陣列之情況中，將抗體點樣至玻璃或硝化纖維晶片上。阻斷載玻片且用含有Tau(pS422)之溶液培育，洗滌以移除未結合抗體且用螢光標記之對應二級抗體偵測結合抗體。藉由螢光幻燈片掃描器 量測螢光信號。類似地對於逆相陣列，將重組Tau(pS422)、細胞上清液、細胞或組織溶解物、體液等點樣至玻璃或硝化纖維素晶片上。阻斷載玻片且用針對Tau(pS422)上之特異性抗原決定基之抗體培育個別陣列。洗去未結合抗體且用螢光標記之對應二級抗體偵測結合抗體。藉由螢光幻燈片掃描器量測螢光信號(Dernick,G.等人，J.Lipid Res.52(2011)2323-2331)。
在西方墨點法之實例中，在SDS PAGE或天然凝膠條件中藉由分子量分離聚集重組Tau(pS422)或衍生自細胞上清液、細胞或組織溶解物、體液等之Tau(pS422)且將其吸至硝化纖維素或PVDF膜上。在阻斷之後，用對Tau(pS422)之胺基酸序列或構形具有特異性之抗體培育膜。其後洗滌膜以移除未結合抗體。藉由偶合至用於化學發光或螢光或其他偵測方式之偵測實體之對應二級抗體偵測結合抗體。對Tau(pS422)之胺基酸序列具有特異性之抗體將結合至呈各種聚集形式且因此具有各種分子量之Tau(pS422)，只要抗原決定基未因聚集而遮蔽即可。另一方面，構形特異性抗體將僅偵測僅在特定分子量下顯露條帶之Tau(pS422)之某些聚集形式(參看例如Towbin,H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)4350-4353；Burnette,W.N.,Anal.Biochem.112(1981)195-203)。
2.活性分析法
在一個態樣中，提供鑑別具有生物活性之抗人類Tau(pS422)抗體之分析。生物活性可包括例如防止/降低/抑制Tau(pS422)誘發之細胞毒性，及/或防止/降低/抑制寡聚人類Tau(pS422)之細胞間傳輸，及/或降低LUHMES細胞中Tau(pS422)誘發之卡斯蛋白酶(caspase)活性。亦提供在活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體。
在某些實施例中，測試本發明抗體之此生物活性。
可藉由添加含導致受體神經元細胞細胞死亡之分泌Tau(pS422) 之改良性培養基來評定保護性生物活性。可藉由添加如本文中所述之保護性抗體使此毒性逆轉。分泌性Tau(pS422)之毒性先前已確定(Emmanouilidou,E.等人，J.Neurosci.,30(2010)6838-6851)。
F.醫藥調配物
藉由混合此類具有所要純度之非共價複合物與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版，Osol,A.(編)(1980))，製備凍乾調配物或水溶液形式的如本文所述之非共價複合物的醫藥調配物。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無毒性，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如鋅-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®,Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP(包括rhuPH20)及使用方法描述於US 2005/0260186及US 2006/0104968中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種額外葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。
例示性凍乾抗體調配物描述於US 6,267,958中。水性抗體調配物包括描述於US 6,171,586及WO 2006/044908中之彼等調配物，描述於WO 2006/044908中之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需的活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之補充性活性的活性成分。此等活性成分適合以有效達成預定目的之量組合存在。
活性成分可包覆在例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中；膠態藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中；或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半滲透性基質，該等基質呈成形物品(例如薄膜或微囊)之形式。
欲用於活體內投藥之調配物通常無菌。無菌性可易於例如藉由經由無菌過濾膜過濾來達成。
G.治療方法及組合物
如本文所報導之任何非共價複合物可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供用作藥劑的如本文所報導之非共價複合物。在其他態樣中，提供用於治療阿茲海默氏病的如本文所報導之非共價複合物。在某些實施例中，提供用於治療方法中的如本文所報導之非共價複合物。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有阿茲海默氏病之個體的方法的如本文所報導之非共價複合物，該方法包含向個體投與有效量之非共價複合物。在一個此類實施例中，該方法另外包含投與該個體有效量之至少一種其他治療劑，例如，如下文所述。在其他實施例中，本發明提供一種非共價複合物，其用於抑制人類神 經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘導之細胞毒性。在某些實施例中，本發明提供一種用於抑制個體中人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘導之細胞毒性之方法中的非共價複合物，該方法包含向個別投與有效之非共價複合物以抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘導之細胞毒性。根據任何上述實施例之「個體」較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供如本文所報導之非共價複合物之用途，其用於製造或製備藥劑。在一個實施例中，該藥劑用於治療阿茲海默氏病。在另一實施例中，該藥劑用於治療阿茲海默氏病之方法中，該方法包含向患有阿茲海默氏病之個體投與有效量之藥劑。在一個此類實施例中，該方法另外包含投與該個體有效量之至少一種其他治療劑，例如如下文所述。在另一實施例中，藥劑用於抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘導之細胞毒性。在另一實施例中，該藥劑用於抑制個體中人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘導之細胞毒性的方法中，該方法包含向個體投與有效量之藥劑以抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘導之細胞毒性。根據上述任何實施例「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供治療阿茲海默氏病之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類阿茲海默氏病之個體投與有效量之如本文所報導之非共價複合物。在一個此類實施例中，方法另外包含向個體投與有效量之至少另一如下文所述之治療劑。根據上述任何實施例「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種用於抑制個體中人類神經元及神經膠質細胞中的Tau(pS422)誘導之細胞毒性之方法。在一個實施例中，該方法包含向個體投與有效量之如本文所報導之非共價複合物以抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘導之細胞毒性。在一 實施例中，「個體」為人類。
在另一態樣中，本發明提供包含如本文所報導之任何非共價複合物的醫藥調配物，例如用於上述治療方法中之任一者中。在一個實施例中，醫藥調配物包含如本文所報導之任何非共價複合物及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含如本文所報導之任何非共價複合物及至少一種額外治療劑，例如如下文所述。
本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明抗體可與至少一種其他治療劑共同投藥。
上文所提及之此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或兩種以上治療劑包括在同一或單獨調配物中)及單獨投與，在此情況下，本發明抗體之投與可在投與額外治療劑之前、同時及/或之後進行。在一個實施例中，非共價複合物之投與及額外治療劑之投與彼此在約一個月內；或在約一週、兩週或三週內；或在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內進行。
如本文所報導之非共價複合物(及任何額外治療劑)可藉由任何適合方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內，及局部治療需要時，病灶內投與。非經腸輸液包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。部分上視投藥之短期或長期性而定，可藉由任何適當途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。本文涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或經各個時間點多次投藥、快速投藥(bolus administration)及脈衝式輸注。
如本文所報導之非共價複合物將以與良好醫學實務一致的方式調配、給藥及投與。在此背景下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之起因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投藥時程及從業醫生已知之其他因素。非共價複合物無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥 劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之非共價複合物之量、病症或治療之類型及如上文所述之其他因素而定。此等藥劑通常以相同劑量且利用本文中所述之投藥途徑使用，或以本文中所述劑量之約1%至99%使用，或以任意劑量且憑經驗/臨床上確定為適當的任何途徑使用。
為預防或治療疾病，如本文所報導之非共價複合物之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視待治療疾病之類型、非共價複合物類型、疾病之嚴重程度及病程、是否出於預防或治療目的投與非共價複合物、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷而定。一次性或歷經一系列治療向患者適當地投與非共價複合物。無論藉由一或多次分開投與，或藉由連續輸注，視疾病類型及嚴重程度而定，抗體投與患者的初始候選劑量例如為約1μg/kg至15mg/kg(例如，0.5mg/kg-10mg/kg)。一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更高劑量之範圍內，此視上文所提及之因素而定。對於歷經數天或更長時間的重複投藥，治療視病狀而定通常可持續至疾病症狀之所要抑制發生為止。非共價複合物之一個例示性劑量將在約0.05mg/kg至約50mg/kg範圍內。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、15mg/kg、25mg/mg或50mg/kg(或其任何組合)中之一或多種劑量。該等劑量可間歇地投與，例如，隔週或隔三週(例如，以使得患者接受約二至約二十或例如約六個劑量的抗體)。可投與最初較高負荷劑量，接著可投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析監控。
應理解，替代或除非共價複合物以外，可使用本發明之免疫結合物進行任何上述調配或治療方法。
III.物品製造
在本發明之另一態樣中，提供一種含有可用於治療、預防及/或診斷上文所述病症之物質的製造物品。該製品包含容器及該容器上黏貼或該容器隨附之標籤或包裝插頁。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑料之多種材料形成。容器可由諸如玻璃或塑料之多種材料形成。容器容納單獨組合物或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標記或內頁說明書係指示該組合物用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a)內含組合物的第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)內含組合物的第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或治療劑。本發明之實施例中的製品可另外包含內頁說明書，該內頁說明書指示組合物可用於治療特定病狀。或者或另外，該製品可另外包含一包含醫藥學上可接受之緩衝液(諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林葛爾氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。其可另外包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應理解，替代或除抗人類Tau(pS422)抗體以外，上述製品中之任一者可包括本發明之免疫結合物。
IV.特定實施例
1.一種特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體及抗血腦屏障受體/半抗原雙特異性抗體之非共價複合物。
2.一種包含特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體及雙特異性抗體之非共價複合物，該雙特異性抗體具有特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的該半抗原化抗體之該半抗原的第一結合特異性及特異性結合於血腦屏障受體之第二結合特異性，其中特異性結 合於人類Tau(pS422)之該半抗原化抗體藉由該雙特異性抗體之該第一結合特異性特異性結合。
3.如實施例1至2中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之該半抗原化抗體係選自由以下組成之群：特異性結合於人類Tau(pS422)之生物素化抗體、特異性結合於人類Tau(pS422)之茶鹼化抗體、特異性結合於人類Tau(pS422)之地高辛化抗體、特異性結合於人類Tau(pS422)之碳硼化抗體、特異性結合於人類Tau(pS422)之螢光素化抗體、特異性結合於人類Tau(pS422)之螺旋化抗體及特異性結合於人類Tau(pS422)之溴去氧尿苷化抗體。
4.如實施例1至3中任一項之非共價複合物，其中該血腦屏障受體係選自由以下組成之群：運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1(LRP1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。
5.如實施例1至4中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體為包含兩個結合位點的全長抗體。
6.如實施例1至5中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體為已融合一個或兩個scFv或scFab或CrossFab或scCrossFab且包含三個或四個結合位點的全長抗體。
7.如實施例1至6中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體係選自抗體片段、F(ab')2及雙功能抗體。
8.如實施例1至7中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體為人類化或人類抗體。
9.如實施例1至8中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體不含效應功能。
10.如實施例1至9中任一項之非共價複合物，其中實施例中該 雙特異性抗體不具有功能性Fc區。
11.如實施例1至10中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體不具有Fc區。
12.如實施例1至12中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體具有包含突變L234A、L235A及P329G之人類IgG1子類的Fc區，其中該等位置根據Kabat Fc區編號(Kabat EU索引)確定。
13.如實施例1至12中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體具有包含突變S228P、L235E及P329G之人類IgG4子類的Fc區，其中該等位置根據Kabat Fc區編號(Kabat EU索引)確定。
14.如實施例1至13中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體包含 a)一個針對特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及一個針對血腦屏障受體之結合位點，或 b)兩個針對特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及一個針對血腦屏障受體之結合位點，或 c)一個針對特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對血腦屏障受體之結合位點，或 d)兩個針對特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對血腦屏障受體之結合位點， 其中在b)及c)之情況下，該雙特異性抗體之一條重鏈包含臼突變且各別其他鏈包含杵突變。
15.如實施例1至14中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體包含兩個針對特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對血腦屏障受體之結合位點。
16.如實施例1至15中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體具有特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合之半抗原化抗體之 半抗原的兩種結合特異性(兩種抗半抗原結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)的兩種結合特異性。
17.如實施例1至16中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：65之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：66之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：67之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：69之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：70之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：71之輕鏈CDR3。
18.如實施例1至17中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為人類化結合特異性。
19.如實施例1至18中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性包含如實施例17中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
20.如實施例1至19中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：73之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：74之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：75之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：77之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：78之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：79之輕鏈 CDR3。
21.如實施例1至20中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：68或76具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。
22.如實施例1至21中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗地高辛抗體保留結合於地高辛之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：68或76中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
23.如實施例1至22中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
24.如實施例1至23中任一項之非共價複合物，其中地高辛結合特異性包含SEQ ID NO：68或76中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
25.如實施例1至24中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：72或80具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。
26.如實施例1至25中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗地高辛抗體保留結合於地高辛之能力。在某些實施例 中，SEQ ID NO：72或80中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
27.如實施例1至26中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
28.如實施例1至27中任一項之非共價複合物，其中地高辛結合特異性包含SEQ ID NO：72或80中的VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
29.如實施例1至16中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體包含特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的第一結合特異性(抗生物素結合特異性；抗BI結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性；抗-(h)TfR結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性；抗LRP8結合特異性)之第二結合特異性。
30.如實施例1至16及29中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體具有特異性結合於生物素化淨負荷之兩種結合特異性(兩個抗生物素結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)的兩種結合特異性。
31.如實施例1至16及29至30中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：81之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：82之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：83之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：85之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：86之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：87之輕 鏈CDR3。
32.如實施例1至16及29至31中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為人類化結合特異性。
33.如實施例1至16及29至32中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性包含如實施例31中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
34.如實施例1至16及29至33中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：89之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：90之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：94之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：95之輕鏈CDR3。
35.如實施例1至16及29至34中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：84或92具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。
36.如實施例1至16及29至35中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗生物素抗體保留結合於生物素的能力。
37.如實施例1至16及29至36中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：84或92中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
38.如實施例1至16及29至37中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
39.如實施例1至16及29至38中任一項之非共價複合物，其中該生物素結合特異性包含SEQ ID NO：84或92中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
40.如實施例1至16及29至39中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：88或96具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。
41.如實施例1至16及29至40中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗生物素抗體保留結合於生物素之能力。
42.如實施例1至16及29至41中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：88或96中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
43.如實施例1至16及29至42中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
44.如實施例1至16及29至43中任一項之非共價複合物，其中生物素結合特異性包含SEQ ID NO：88或96中的VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
45.如實施例1至16中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體包含特異性結合於茶鹼化淨負荷的第一結合特異性(抗茶鹼結合特 異性；抗THEO結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性；抗-(h)TfR結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性；抗LRP8結合特異性)的第二結合特異性。
46.如實施例1至16及45中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體具有特異性結合於茶鹼化淨負荷之兩種結合特異性(兩個抗茶鹼結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩個抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)的兩種結合特異性。
47.如實施例1至16及45至46中任一項之非共價複合物，其中特異性結合與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：97之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：98之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：99之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：101之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：102之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：103之輕鏈CDR3。
48.如實施例1至16及45至47中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為人類化結合特異性。
49.如實施例1至16及45至48中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性包含如實施例47中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
50.如實施例1至16及45至49中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合 特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：105之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：106之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：107之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：109之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：110之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：111之輕鏈CDR3。
51.如實施例1至16及45至50中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：100或108具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。
52.如實施例1至16及45至51中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗茶鹼抗體保留結合於茶鹼之能力。
53.如實施例1至16及45至52中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：100或108中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
54.如實施例1至16及45至53中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
55.如實施例1至16及45至54中任一項之非共價複合物，其中茶鹼結合特異性包含SEQ ID NO：100或108中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
56.如實施例1至16及45至55中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸 序列SEQ ID NO：104或112具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。
57.如實施例1至16及45至56中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗茶鹼抗體保留結合於茶鹼之能力。
58.如實施例1至16及45至57中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：104或112中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
59.如實施例1至16及45至58中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
60.如實施例1至16及45至59中任一項之非共價複合物，其中茶鹼結合特異性包含SEQ ID NO：104或112中的VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
61.如實施例1至16中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體包含特異性結合於螢光素化淨負荷之第一結合特異性(抗螢光素結合特異性；抗FLUO結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性；抗-(h)TfR結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性；抗LRP8結合特異性)的第二結合特異性。
62.如實施例1至16及61中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體具有特異性結合於螢光素化淨負荷的兩種結合特異性(兩個抗螢光素結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)之兩種結合特異性。
63.如實施例1至16及61至62中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：113之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：114之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：115之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：117之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：118之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：119之輕鏈CDR3。
64.如實施例1至16及61至63中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為人類化結合特異性。
65.如實施例1至16及61至64中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性包含如實施例63中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
66.如實施例1至16及61至65中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：116具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。
67.如實施例1至16及61至66中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗螢光素抗體保留結合於螢光素之能力。
68.如實施例1至16及61至67中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：116中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
69.如實施例1至16及61至68中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
70.如實施例1至16及61至69中任一項之非共價複合物，其中螢光素結合特異性包含SEQ ID NO：116中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
71.如實施例1至16及61至70中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：120具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。
72.如實施例1至16及61至71中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗螢光素抗體保留結合於螢光素之能力。
73.如實施例1至16及61至72中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：120中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
74.如實施例1至16及61至73中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
75.如實施例1至16及61至74中任一項之非共價複合物，其中螢光素結合特異性包含SEQ ID NO：120中的VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
76.如實施例1至16中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體包含特異性結合於溴去氧尿苷化淨負荷的第一結合特異性(抗溴去氧尿苷結合特異性；抗BrdU結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性；抗-(h)TfR結合特異性) 或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性；抗LRP8結合特異性)的第二結合特異性。
77.如實施例1至16及76中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體具有特異性結合於溴去氧尿苷化淨負荷的兩種結合特異性(兩個抗溴去氧尿苷結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)的兩種結合特異性。
78.如實施例1至16及76至77中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：121之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：123之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：125之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：126之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：127之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：128之輕鏈CDR3。
79.如實施例1至16及76至78中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為人類化結合特異性。
80.如實施例1至16及76至79中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性包含如上述實施例中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
81.如實施例1至16及76至80中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：121或122之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸 序列SEQ ID NO：123或124之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：125之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：126之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：127之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：128之輕鏈CDR3。
82.如實施例1至16及76至81中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：129或131具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。
83.如實施例1至16及76至82中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗溴去氧尿苷抗體保留結合於溴去氧尿苷的能力。
84.如實施例1至16及76至83中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：129或131中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
85.如實施例1至16及76至84中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
86.如實施例1至16及76至85中任一項之非共價複合物，其中溴去氧尿苷結合特異性包含SEQ ID NO：129或131中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
87.如實施例1至16及76至86中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外 包含與胺基酸序列SEQ ID NO：130或132具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。
88.如實施例1至16及76至87中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗溴去氧尿苷抗體保留結合於溴去氧尿苷的能力。
89.如實施例1至16及76至88中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：130或132中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
90.如實施例1至16及76至89中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
91.如實施例1至16及76至90中任一項之非共價複合物，其中溴去氧尿苷結合特異性包含SEQ ID NO：130或132中的VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
92.如實施例1至91中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體在半抗原與特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體之間包含連接基團。
93.如實施例92之非共價複合物，其中連接基團為肽連接基團。
94.如實施例92之非共價複合物，其中連接基團為化學連接基團(非肽連接基團)。
95.如實施例1至94中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為全長抗體。
96.如實施例1至95中任一項之非共價複合物，其中特異性結合 於人類Tau(pS422)之抗體i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau。
97.如實施例1至96中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，或b)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR。
98.如實施例1至97中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體另外包含a)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR。
99.如實施例1至98中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR，或c)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR。
100.如實施例1至99中任一項之非共價複合物，其中特異性結合 於人類Tau(pS422)之抗體包含a)SEQ ID NO：20之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或b)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變域，或c)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或d)SEQ ID NO：21之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域。
101.如實施例1至100中任一項之非共價複合物，其中該非共價複合物用於治療阿茲海默氏病。
102.如實施例1至101中任一項之非共價複合物，其中該複合物中的兩種抗體為效應功能沉默的。
103.如實施例1至102中任一項之非共價複合物，其中該複合物的兩種抗體不具有效應功能。
104.如實施例1至103中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異地結合在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體。
105.如實施例1至104中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體具有以下EC50值a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：03的人類Tau(pS422)片段，6ng/mL或6ng/mL以下，及/或 b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：02的全長人類Tau(pS422)，4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或c)具有胺基酸序列SEQ ID NO：02的人類Tau(pS422)聚集體，30ng/mL或30ng/mL以下，及/或d)具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A的人類Tau，125ng/mL或125ng/mL以下。
106.如實施例1至105中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)且不結合於人類Tau(SEQ ID NO：01)之抗體。
107.如實施例1至106中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為單株抗體。
108.如實施例1至107中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為如下抗體片段，其結合於人類Tau(pS422)且i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或 viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
109.如實施例1至108中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為a)人類子類IgG1之全長抗體，或b)人類子類IgG4之全長抗體，或c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類IgG1之全長抗體，d)具有突變S228P、L235E及P329G之人類子類IgG4之全長抗體，e)在兩條重鏈中具有突變L234A、L235A及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C及在另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1之全長抗體，或f)在兩條重鏈中具有突變S228P及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG4之全長抗體。
110.如實施例1至109中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：10之HVR，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及 iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之HVR，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
111.如實施例1至110中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區， 其中i)可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：10之HVR，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：05及SEQ ID NO：15之HVR，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或 ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
112.如實施例1至111中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：10之HVR，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之HVR，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具 有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
113.如實施例1至112中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：20，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或 v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
114.如實施例1至113中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：19，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：16，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類 Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
115.如實施例1至114中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：19，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及 c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
116.如實施例1至115中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：21，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中 i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
117.如實施例1至116中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體在重鏈可變域中在位置4、24及78中具有纈胺酸殘基。
118.如實施例1至117中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體在重鏈可變域中在位置71處具有精胺酸殘基。
119.一種特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體及抗人類 Tau(pS422)/半抗原雙特異性抗體的非共價複合物。
120.一種包含特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體及雙特異性抗體之非共價複合物，該雙特異性抗體具有特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的半抗原化抗體之半抗原的第一結合特異性及特異性結合於人類Tau(pS422)的第二結合特異性，其中特異性結合於該血腦屏障受體之該半抗原化抗體藉由該雙特異性抗體之該第二結合特異性特異性結合。
121.如實施例119至120中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體係選自由以下組成之群：特異性結合於血腦屏障受體之生物素化抗體、特異性結合於血腦屏障受體之茶鹼化抗體、特異性結合於血腦屏障受體之地高辛化抗體、特異性結合於血腦屏障受體之碳硼化抗體、特異性結合於血腦屏障受體之螢光素化抗體、特異性結合於血腦屏障受體之螺旋化抗體及特異性結合於血腦屏障受體之溴去氧尿苷化抗體。
122.如實施例119至121中任一項之非共價複合物，其中該血腦屏障受體係選自由以下組成之群：運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1(LRP1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。
123.如實施例119至122中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體為包含兩個結合位點的全長抗體。
124.如實施例119至123中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體為已融合一個或兩個scFv或scFab或CrossFab或scCrossFab且包含三個或四個結合位點的全長抗體。
125.如實施例119至124中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體係選自抗體片段、F(ab')2及雙功能抗體。
126.如實施例119至125中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體為人類化或人類抗體。
127.如實施例119至126中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體不含效應功能。
128.如實施例119至127中任一項之非共價複合物，其中實施例中該雙特異性抗體不具有功能性Fc區。
129.如實施例119至128中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體不具有Fc區。
130.如實施例119至129中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體具有包含突變L234A、L235A及P329G之人類IgG1子類的Fc區，其中該等位置根據Kabat Fc區編號(Kabat EU索引)確定。
131.如實施例119至129中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體具有包含突變S228P、L235E及P329G之人類IgG4子類的Fc區，其中該等位置根據Kabat Fc區編號(Kabat EU索引)確定。
132.如實施例119至131中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體包含a)一個針對特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及一個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或b)兩個針對特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及一個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或c)一個針對特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或d)兩個針對特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對人類Tau(pS422)之結合位點，其中在b)及c)之情況下，該雙特異性抗體之一條重鏈包含臼突變且各別其他鏈包含杵突變。
133.如實施例119至132中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體包含兩個針對特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體之半抗原的結合位點及兩個針對人類Tau(pS422)之結合位點。
134.如實施例119至133中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體具有特異性結合於與(人類)運鐵蛋白受體或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8特異性結合的半抗原化抗體之半抗原的兩種結合特異性(抗半抗原結合特異性)。
135.如實施例119至134中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：65之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：66之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：67之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：69之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：70之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：71之輕鏈CDR3。
136.如實施例119至135中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為人類化結合特異性。
137.如實施例119至136中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性包含如實施例17中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
138.如實施例119至137中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：73之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：74之 重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：75之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：77之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：78之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：79之輕鏈CDR3。
139.如實施例119至138中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：68或76具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。
140.如實施例119至139中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗地高辛抗體保留結合於地高辛之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：68或76中總計119至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
141.如實施例119至140中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
142.如實施例119至141中任一項之非共價複合物，其中地高辛結合特異性包含SEQ ID NO：68或76中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
143.如實施例119至142中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的地高辛化抗體之地高辛的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：72或80具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。
144.如實施例119至143中任一項之非共價複合物，其中具有至 少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗地高辛抗體保留結合於地高辛的能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：72或80中總計119至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
145.如實施例119至144中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
146.如實施例119至145中任一項之非共價複合物，其中地高辛結合特異性包含SEQ ID NO：72或80中的VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
147.如實施例119至134中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體包含特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的生物素化抗體之生物素的第一結合特異性及特異性結合於人類Tau(pS422)之第二結合特異性。
148.如實施例119至134及147中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體具有特異性結合於與(人類)運鐵蛋白受體特異性結合的生物素化抗體或與低密度脂蛋白受體相關蛋白質8特異性結合的生物素化抗體的兩種結合特異性(兩個抗生物素結合特異性)及特異性結合於人類Tau(pS422)之兩種結合特異性。
149.如實施例119至134及147至148中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：81之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：82之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：83之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：85之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：86之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：87之輕鏈CDR3。
150.如實施例119至134及147至149中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為人類化結合特異性。
151.如實施例119至134及147至150中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性包含如實施例149中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
152.如實施例119至134及147至151中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：89之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：90之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：94之輕鏈CDR2，及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：95之輕鏈CDR3。
153.如實施例119至134及147至152中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：84或92具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。
154.如實施例119至134及147至153中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗生物素抗體保留結合於生物素 的能力。
155.如實施例119至134及147至154中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：84或92中總計119至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
156.如實施例119至134及147至155中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
157.如實施例119至134及147至156中任一項之非共價複合物，其中該生物素結合特異性包含SEQ ID NO：84或92中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
158.如實施例119至134及147至157中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的生物素化抗體之生物素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：88或96具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。
159.如實施例119至134及147至158中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗生物素抗體保留結合於生物素的能力。
160.如實施例119至134及147至159中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：88或96中總計119至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
161.如實施例119至134及147至160中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
162.如實施例119至134及147至161中任一項之非共價複合物， 其中生物素結合特異性包含SEQ ID NO：88或96中的VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
163.如實施例119至133中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體包含特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的茶鹼化抗體的第一結合特異性及特異性結合於人類Tau(pS422)之第二結合特異性。
164.如實施例119至134及45中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體具有特異性結合於與(人類)運鐵蛋白受體特異性結合的茶鹼化抗體或與低密度脂蛋白受體相關蛋白質8特異性結合的抗體的兩種結合特異性(兩個抗茶鹼結合特異性)及特異性結合於人類Tau(pS422)之兩種結合特異性。
165.如實施例119至134及163至164中任一項之非共價複合物，其中特異性結合與血腦屏障受體特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：97之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：98之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：99之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：101之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：102之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：103之輕鏈CDR3。
166.如實施例119至134及163至165中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為人類化結合特異性。
167.如實施例119至134及163至166中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性包含如實施例165中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
168.如實施例119至134及163至167中任一項之非共價複合物， 其中特異性結合與血腦屏障受體特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：105之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：106之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：107之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：109之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：110之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：111之輕鏈CDR3。
169.如實施例119至134及163至168中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：100或108具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。
170.如實施例119至134及163至169中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗茶鹼抗體保留結合於茶鹼之能力。
171.如實施例119至134及163至170中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：100或108中總計119至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
172.如實施例119至134及163至171中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
173.如實施例119至134及163至172中任一項之非共價複合物，其中茶鹼結合特異性包含SEQ ID NO：100或108中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
174.如實施例119至134及163至173中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的茶鹼化抗體之茶鹼的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：104或112具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。
175.如實施例119至134及163至174中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗茶鹼抗體保留結合於茶鹼之能力。
176.如實施例119至134及163至175中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：104或112中總計119至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
177.如實施例119至134及163至176中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
178.如實施例119至134及163至177中任一項之非共價複合物，其中茶鹼結合特異性包含SEQ ID NO：104或112中的VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
179.如實施例119至133中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體包含特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的螢光素化抗體之第一結合特異性(抗螢光素結合特異性；抗FLUO結合特異性)及特異性結合於人類Tau(pS422)之第二結合特異性。
180.如實施例119至134及179中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體具有特異性結合於與(人類)運鐵蛋白受體特異性結合的螢光素化抗體或與低密度脂蛋白受體相關蛋白質8特異性結合的抗體之 兩種結合特異性及特異性結合於人類Tau(pS422)之第二結合特異性。
181.如實施例119至134及179至180中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：113之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：114之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：115之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：117之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：118之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：119之輕鏈CDR3。
182.如實施例119至134及179至181中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為人類化結合特異性。
183.如實施例119至134及179至182中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性包含如實施例63中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
184.如實施例119至134及179至183中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：116具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。
185.如實施例119至134及179至184中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗螢光素抗體保留結合於螢光素 之能力。
186.如實施例119至134及179至185中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：116中總計119至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
187.如實施例119至134及179至186中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
188.如實施例119至134及179至187中任一項之非共價複合物，其中螢光素結合特異性包含SEQ ID NO：116中的VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
189.如實施例119至134及179至188中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的螢光素化抗體之螢光素的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：120具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)序列。
190.如實施例119至134及179至189中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗螢光素抗體保留結合於螢光素之能力。
191.如實施例119至134及179至190中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：120中總計119至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
192.如實施例119至134及179至191中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
193.如實施例119至134及179至192中任一項之非共價複合物， 其中螢光素結合特異性包含SEQ ID NO：120中的VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
194.如實施例119至133中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體包含特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的溴去氧尿苷化抗體的第一結合特異性及特異性結合於人類Tau(pS422)之第二結合特異性。
195.如實施例119至134及194中任一項之非共價複合物，其中雙特異性抗體具有特異性結合於與(人類)運鐵蛋白受體特異性結合的溴去氧尿苷化抗體或與低密度脂蛋白受體相關蛋白質8特異性結合的抗體之兩種結合特異性及特異性結合於人類Tau(pS422)之第二結合特異性。
196.如實施例119至134及194至195中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：121之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：123之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：125之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：126之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：127之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：128之輕鏈CDR3。
197.如實施例119至134及194至196中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為人類化結合特異性。
198.如實施例119至134及194至197中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性包含如上述實施例中之CDR及接受體人類構架(例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架)。
199.如實施例119至134及194至198中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：121或122之重鏈CDR1，(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：123或124之重鏈CDR2，(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：125之重鏈CDR3，(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：126之輕鏈CDR1，(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：127之輕鏈CDR2及(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：128之輕鏈CDR3。
200.如實施例119至134及194至199中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：129或131具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。
201.如實施例119至134及194至200中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗溴去氧尿苷抗體保留結合於溴去氧尿苷之能力。
202.如實施例119至134及194至201中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：129或131中總計119至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
203.如實施例119至134及194至202中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
204.如實施例119至134及194至203中任一項之非共價複合物，其中溴去氧尿苷結合特異性包含SEQ ID NO：129或131中的VH序列， 包括彼序列之轉譯後修飾。
205.如實施例119至134及194至204中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的溴去氧尿苷化抗體之溴去氧尿苷的結合特異性為抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域對，其另外包含與胺基酸序列SEQ ID NO：130或132具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)序列。
206.如實施例119至134及194至205中任一項之非共價複合物，其中具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗溴去氧尿苷抗體保留結合於溴去氧尿苷之能力。
207.如實施例119至134及194至206中任一項之非共價複合物，其中SEQ ID NO：130或132中總計119至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
208.如實施例119至134及194至207中任一項之非共價複合物，其中取代、插入或缺失存在於CDR外部的區域中(亦即FR中)。
209.如實施例119至134及194至208中任一項之非共價複合物，其中溴去氧尿苷結合特異性包含SEQ ID NO：130或132中的VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
210.如實施例119至208中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體在半抗原與特異性結合於血腦屏障受體之抗體之間包含連接基團。
211.如實施例210之非共價複合物，其中連接基團為肽連接基團。
212.如實施例210之非共價複合物，其中連接基團為化學連接基 團(非肽連接基團)。
213.如實施例119至212中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於血腦屏障受體之抗體為全長抗體。
214.如實施例119至213中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau。
215.如實施例119至214中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，或b)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR。
216.如實施例119至215中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體另外包含a)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR。
217.如實施例119至216中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在輕鏈 可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR，或c)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR。
218.如實施例119至217中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)SEQ ID NO：20之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或b)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變域，或c)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或d)SEQ ID NO：21之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域。
219.如實施例119至218中任一項之非共價複合物，其中非共價複合物用於治療阿茲海默氏病。
220.如實施例119至219中任一項之非共價複合物，其中該複合物中的兩種抗體為效應功能沉默的。
221.如實施例119至220中任一項之非共價複合物，其中該複合物的兩種抗體不具有效應功能。
222.如實施例119至221中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異地結合在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體。
223.如實施例119至222中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體具有以下EC50值a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：03的人類Tau(pS422)片段，6ng/mL或6ng/mL以下，及/或b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：02的全長人類Tau(pS422)，4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或c)具有胺基酸序列SEQ ID NO：02的人類Tau(pS422)聚集體，30ng/mL或30ng/mL以下，及/或d)具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A的人類Tau，125ng/mL或125ng/mL以下。
224.如實施例119至223中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)且不結合於人類Tau(SEQ ID NO：01)之抗體。
225.如實施例119至224中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於血腦屏障受體之抗體為單株抗體。
226.如實施例119至225中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體為如下抗體片段，其結合於人類Tau(pS422)且i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或 vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
227.如實施例119至226中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於血腦屏障受體之抗體為a)人類子類IgG1之全長抗體，或b)人類子類IgG4之全長抗體，或c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類IgG1之全長抗體，d)具有突變S228P、L235E及P329G之人類子類IgG4之全長抗體，e)在兩條重鏈中具有突變L234A、L235A及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C及在另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1之全長抗體，或f)在兩條重鏈中具有突變S228P、L235E及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C及在另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG4之全長抗體，或g)在兩條重鏈中具有突變L234A、L235A及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C及在另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類IgG1之全長抗體，或h)在兩條重鏈中具有突變S228P、L235E及P329G且在一條重鏈 中具有突變T366W及Y349C及在另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及S354C之人類子類IgG4之全長抗體。
228.如實施例119至227中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：10之HVR，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之HVR，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具 有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
229.如實施例119至228中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：10之HVR，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：05及SEQ ID NO：15之HVR，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或 iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
230.如實施例119至229中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：10之HVR，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之HVR，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區， 及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
231.如實施例119至230中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：20，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域， 其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
232.如實施例119至231中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：19，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不 存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：16，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
233.如實施例119至232中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定 區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：19，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
234.如實施例119至233中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體a)包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：21，ii)恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段具有6ng/mL或6ng/mL以下之EC50值，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)片段具有4.5ng/mL或4.5ng/mL以下之EC50值，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)聚集體 具有30ng/mL或30ng/mL以下之EC50值，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau具有125ng/mL或125ng/mL以下之EC50值。
235.如實施例119至234中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體在重鏈可變域中在位置4、24及78中具有纈胺酸殘基。
236.如實施例119至235中任一項之非共價複合物，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體在重鏈可變域中在位置71處具有精胺酸殘基。
237.一種醫藥調配物，其包含如實施例1至236中任一項之非共價複合物及醫藥學上可接受之載劑。
238.如實施例237之醫藥調配物，其中醫藥調配物另外包含額外治療劑。
239.如實施例238之醫藥調配物，其中額外治療劑為抗澱粉樣蛋白治療劑。
240.如實施例239之醫藥調配物，其中抗澱粉樣蛋白治療劑為抗人類α-突觸核蛋白抗體或抗Aβ抗體。
241.如實施例239至122中任一項之醫藥調配物，其中抗人類α-突觸核蛋白抗體或抗Aβ抗體經半抗原化。
242.如實施例239至123中任一項之醫藥調配物，其中抗人類α-突觸核蛋白抗體或抗Aβ抗體與抗血腦屏障受體/半抗原雙特異性抗體複合。
243.如實施例1至236中任一項之非共價複合物，其用作藥劑。
244.如實施例1至236中任一項之非共價複合物，其用於治療阿茲海默氏病。
245.如實施例1至236中任一項之非共價複合物，其用於治療前 驅性阿茲海默氏病。
246.如實施例1至236中任一項之非共價複合物，其用於治療輕度阿茲海默氏病。
247.如實施例1至236中任一項之非共價複合物，其用於減輕Tau(pS422)誘導之神經退化。
248.如實施例1至236中任一項之非共價複合物，其用於維持認知及功能。
249.如實施例1至236中任一項之非共價複合物，其用於減緩認知及功能減退速率。
250.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物的用途，其用於製造藥劑。
251.如實施例250之用途，其中藥劑用於治療阿茲海默氏病。
252.如實施例250至251中任一項之用途，其中藥劑用於治療前驅性阿茲海默氏病。
253.如實施例250至251中任一項之用途，其中藥劑用於治療輕度阿茲海默氏病。
254.如實施例250至251中任一項之用途，其中藥劑用於減輕Tau(pS422)誘導之神經退化。
255.如實施例250至251中任一項之用途，其中藥劑用於維持認知及功能。
256.如實施例250至251中任一項之用途，其中藥劑用於減緩認知及功能減退速率。
257.一種治療患有阿茲海默氏病之個體的方法，其包含向個體投與有效量的如實施例1至236中任一項之非共價複合物。
258.一種減輕個體中Tau(pS422)誘導之神經退化的方法，其包含向個體投與有效量的如實施例1至236中任一項之非共價複合物以減 輕Tau(pS422)誘導之神經退化。
259.一種維持個體之認知及功能的方法，其包含向個體投與有效量的如實施例1至236中任一項之非共價複合物以維持認知及功能。
260.一種減緩個體中認知及功能減退速率之方法，其包含向個體投與有效量的如實施例1至236中任一項之非共價複合物以減緩認知及功能減退速率。
261.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物的用途，其用於減輕Tau(pS422)誘導之神經退化。
262.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物的用途，其用於維持認知及功能。
263.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物之用途，其用於減緩認知及功能減退速率。
264.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物的用途，其用於治療阿茲海默氏病。
265.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物的用途，其用於保護免於產生阿茲海默氏病。
266.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物的用途，其用於停止阿茲海默氏病的進展。
267.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物的用途，其用於預防人類Tau(pS422)相關之阿茲海默氏病擴散。
268.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物之用途，其用於減少溶酶體膜崩解。
269.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物的用途，其用於針對人類Tau(pS422)誘導之不穩定及/或崩解穩定溶酶體膜。
270.一種如實施例1至236中任一項之非共價複合物的用途，其用於預防阿茲海默氏病進展。
V.實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，由於上文提供之一般說明，可實踐各種其他實施例。
材料及方法 重組DNA技術
使用標準方法以如Sambrook,J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述操控DNA。根據製造商之說明使用分子生物試劑。
基因及寡核苷酸合成
藉由在Geneart GmbH(Regensburg,Germany)化學合成來製備所需基因區段。將合成基因片段選殖至大腸桿菌質體中以用於繁殖/擴增。藉由DNA定序檢驗次選殖基因片段之DNA序列。或者，藉由黏接化學合成之寡核苷酸或經由PCR組裝短合成DNA片段。藉由metabion GmbH(Planegg-Martinsried,Germany)製備各別寡核苷酸。
試劑
若未另外規定，則如根據製造商之方案所提供使用所有市售化學品、抗體及套組。
實例1 製備及純化家兔抗體 免疫
將來自Charles River Laboratories International,Inc.之NZW家兔用於免疫接種。將偶合於KLH上之磷酸肽Tau(416-430)[pS422]以濃度1mg/ml溶解於K3PO4緩衝劑(pH 7.0)中且與完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)混合(1：1)直至產生穩定乳液。三隻家兔在一週間隔內接受皮膚內(i.d.)注射2ml乳液，繼而第二次肌肉內(i.m.)及 第三次皮下(s.c.)各注射1ml。第四次1ml肌肉內注射在兩週後進行，繼而在四週間隔內進行另外兩次1ml皮下注射。在第三次、第四次、第五次及第六次注射後4至6天收集10ml各動物之外周全血樣品且用於FACS中之單細胞分選。同時收集另外0.5ml各動物血清且用於測定Tau(416-463)[pS422]特異性抗體反應。
抗體反應
使用ELISA藉由連續稀釋血清來測定抗體對免疫接種之反應，在ELISA中，在預塗佈抗生蛋白鏈菌素之96孔微量滴定盤(MC1347,Micro Coat Biotechnologie GmbH,Bernried,Germany)上，在4℃下將30ng每孔之生物素化Tau(416-430)[pS422]在1×PBS中培育隔夜。關於偵測，使用呈1：16,000稀釋度之與辣根過氧化酶連接之山羊抗家兔IgG(The Jackson laboratory)。來自Roche Diagnostics GmbH之BM Blue POD受質、沈澱四甲基聯苯胺(TMB)、備用溶液用於觀測。經1N HCl停止反應且在Tecan Infinite上藉由450/690nm進行量測。
B細胞選殖 塗佈培養盤
在室溫下，在PBS中，用3種生物素化之對照肽之混合物(未磷酸化Tau(416-430)、MCAK_人類(88-102)[95-pSer]及MAP2_人類(1802-1816)[pSer-1802])或生物素化磷酸肽Tau(416-430)[pS422](各呈0.5μg/ml至1μg/ml之濃度)培育無菌抗生蛋白鏈菌素塗佈的6孔培養盤(細胞培養等級)持續1小時。在使用之前將培養盤在無菌PBS中洗滌三次。在4℃下，用碳酸鹽緩衝劑(0.1M碳酸氫鈉、34mM碳酸氫二鈉、pH 9.55)中之2μg/ml KLH(匙孔螺血氰蛋白(key hole limpet haemocyanine))塗佈細胞培養6孔培養盤隔夜。在使用之前將培養盤在無菌PBS中洗滌三次。
分離兔周邊血液單核細胞(PBMC)
在對哺乳動物淋巴細胞分離液(Cedarlane Laboratories)進行密度離心之前用1×PBS將含有EDTA之全血稀釋兩倍，進行此舉以分離家兔PBMC。在用抗體染色之前洗滌PBMC兩次。
EL-4 B5培養基
補充有10%FCS(Hyclone,Logan,UT,USA)、2mM麩醯胺酸、1%青黴素/鏈黴素溶液(PAA,Pasching,Austria)、2mM丙酮酸鈉、10mM HEPES(PAN Biotech,Aidenbach,Germany)及0.05mM β-巰基乙醇(Gibco,Paisley,Scotland)之RPMI 1640(Pan Biotech,Aidenbach,Germany)
巨噬細胞/單核細胞之消耗
使用無菌6孔培養盤(細胞培養級)使巨噬細胞及單核細胞經非特異性黏著消耗。孔塗佈有KLH(匙孔螺血氰蛋白)或抗生蛋白鏈菌素及對照肽。各孔至多填充有4ml培養基及至多6×106個來自免疫接種家兔之周邊血液單核細胞且使其在37℃下於培育箱中結合1小時。上清液中50%之細胞用於淘選步驟；殘餘50%之細胞直接進行免疫螢光染色及單細胞分選。
在肽上淘選B細胞
塗佈有抗生蛋白鏈菌素及生物素化肽Tau(416-430)[pS422]之6孔組織培養盤每4ml培養基接種有至多6×106個細胞且使其在37℃下於培育箱中結合1小時。藉由用1×PBS仔細洗滌該等孔1-2次移除未黏附細胞。剩餘黏性細胞在37℃下在培育箱中藉由胰蛋白酶分離10分鐘，且隨後在培養基中洗滌兩次。將細胞保持在冰上直至免疫螢光染色。
免疫螢光染色及單細胞分選
用於單細胞分選之抗家兔IgG FITC來自AbD Serotec(STAR121F,Düsseldorf,Germany)。關於表面染色，用含抗家兔IgG FITC抗體之PBS培育來自耗盡及淘選步驟之細胞持續30分鐘，在4℃下在黑暗 中，在冷室內滾動。在離心之後，藉由抽吸移除上清液。PBMC經歷2個週期之離心且用冰冷的PBS洗滌。最後，使PBMC再懸浮於冰冷的PBS中且立即經歷FACS分析。在FACS分析之前添加濃度為5μg/ml之碘化丙錠(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)以辨別死細胞及活細胞。使用配備FACSDiva軟體(BD Biosciences,USA)之Becton Dickinson FACSAria進行FACS且單個FITC標記之活細胞沈積於96孔培養盤中。
B細胞培養物
藉由類似於Zubler,R.H.等人，J.Immunol.134(1985)3662-3668所描述之方法製備B細胞培養物。簡言之，用Pansorbin細胞(1：20000)(Calbiochem(Merck),Darmstadt,Deutschland)、5%家兔胸腺細胞上清液及γ輻射EL-4-B5小鼠胸腺瘤細胞(2×104/孔)之210微升/孔EL-4 B5培養基於96孔培養盤中在37℃下5%CO2之氛圍中於培育箱中將單個分類B細胞培養7天。移除B細胞培養物上清液以備篩選且立即收集細胞以便於可變區基因選殖或在100μl RLT緩衝劑(Qiagen,Hilden,Germany)中在-80℃下冷凍。
B細胞純系篩選
藉由ELISA篩選結合至生物素化Tau(416-430)[pS422]之B細胞培養物上清液。非磷酸化Tau(416-430)、KLH(匙孔螺血氰蛋白)及不相關磷酸肽MCAK_人類(88-102)[95-pSer]用作對照抗原。為了製備ELISA培養盤，在室溫下，用50ng/ml生物素化Tau(415-430)[pS422]培育抗生蛋白鏈菌素預塗佈的微量滴定培養盤1小時。以1μg/ml進行KLH或對照肽塗佈。以1：5至1：10稀釋B細胞上清液且在經抗原塗佈的微量滴定培養盤中培育60分鐘。在充分洗滌之後，使用結合偵測抗體(Chemicon AQ301D)之羊抗家兔IgG地高辛偵測家兔抗體之結合。在室溫下用TMB培育之後，量測在370nm至492nm處之吸光度。進一 步考慮具有生物素化Tau(416-430)[pS422]但不具有KLH及MCAK_人類(88-102)[95-pSer]之產生以上背景信號的B細胞純系且進行可變區基因選殖。
V域之PCR擴增及定序
根據製造商之方案使用NucleoSpin® 8/96 RNA套組(Macherey&Nagel；740709.4，740698)製備全部RNA。所有步驟均在epMotion 5075液體操作系統(Eppendorf)上進行。用60μl RNA酶游離水將RNA溶離。根據製造商之說明使用Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen；18080-400)及寡聚dT-引子，使用6μl RNA藉由逆轉錄酶反應產生cDNA。使用4μl cDNA以用AccuPrime SuperMix(Invitrogen；12344-040)以50μl之最終體積針對重鏈使用引子rbHCfinal.up及rbHCfinal.do，且針對輕鏈使用rbLCfinal.up及rbLCfinal.do(參看下表)，來擴增免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區(VH及VL)。PCR條件如下：在94℃下熱起始5分鐘；在94℃下20秒，在70℃下20秒，在68℃下45秒循環35次，且在68℃下最終擴展7分鐘。
將50μl PCR溶液中之8μl裝載於48 E-Gel 2%(Invitrogen G8008-02)上。根據製造商之方案使用NucleoSpin® Extract II套組(Macherey&Nagel；740609250)清潔陽性PCR反應物且在50μl溶離緩衝劑中將其溶離。針對重鏈使用rbHCfinal.up及rbHCfinal.do且針對輕鏈使用rbLCfinal.up及rbLCfinal.do(參看上表)在兩個方向上將12μl之 純化PCR產物直接定序。
家兔單株抗體及家兔/小鼠嵌合抗體之重組表現
關於家兔單株抗體之重組表現，藉由懸垂選殖方法(Haun,R.S.等人，BioTechniques 13(1992)515-518；Li,M.Z.，等人，Nature Methods 4(2007)251-256)將編碼VH或VL之PCR產物作為cDNA選殖至表現載體中。藉由PCR使用重疊引子來擴增編碼家兔κ或γ恆定區及VH插入物之VL的線性化表現質體。經純化之PCR產物用T4 DNA-聚合酶培育此產生單股懸垂物。藉由添加dCTP停止反應。在下一步驟中，將質體及插入物合併且用RecA培育，其誘發位點特異性再結合。將重組質體轉化至大腸桿菌中。次日，藉由質體製備、限制分析及DNA-定序選取生長菌落且測試恰當的重組質體。關於抗體表現，暫時將經分離之HC及LC質體共同轉染至HEK293細胞中且1週後收集上清液。關於家兔小鼠嵌合抗體之選殖及表現，藉由PCR擴增VH及VL區域且將其次選殖於含有小鼠恆定κ或小鼠恆定γ1區之表現載體中。藉由限制分析及DNA定序針對恰當的插入分離測試分家兔/小鼠嵌合HC及LC質體且將其暫時共轉染至HEK293細胞中。在轉染一週後收集上清液。
抗體純化
在MabSelectSuReTM管柱(GE Healthcare)上，自細胞培養物上清液純化重組表現之家兔抗體。在裝載樣品之前，用25mmol/L Tris-HCl、25mmol/L NaCl(pH 7.4)平衡管柱。用50mmol/L乙酸鹽(pH 3.14)實現抗體之溶離。將溶離樣品立即裝載至脫鹽管柱(Sephadex G25,GE Healthcare)上，且將其溶離於20mmol/L His-HCl、140mmol/L NaCl(pH 6.0)中。此緩衝劑亦用於儲存經純化之抗體。一般儲存溫度為4℃，在純化製程期間為室溫且在等分之後為-80℃。在MabSelectSuReTM管柱(GE Healthcare)上，自細胞培養物上清液純化重組表現之家兔/小鼠嵌合體抗體。在裝載樣品之前，用1×PBS(pH 7.4) 平衡管柱。用100mmol/L檸檬酸鹽(pH 3.0)實現抗體之溶離。溶離樣品立即用2mol/L Tris/HCl(pH 9.0)中和。隨後，將抗體裝載於尺寸排阻管柱(Superdex 200,GE Healthcare)上，且在20mmol/L His-HCl、140mmol/L NaCl(pH 6.0)中進行溶離。此緩衝劑亦用於儲存經純化之抗體。一般儲存溫度為4℃，在純化製程期間為室溫且在等分之後為-80℃。
實例2 抗Tau pS422單株家兔抗體對在pS422處磷酸化之Tau具有高度選擇性且結合至Tau pS422之纖維聚集體 ELISA
家兔單株抗體重組表現於HEK 293細胞中。藉由ELISA，針對結合至生物素化Tau(416-430)[pS422]、非磷酸化Tau(416-430)、KLH(匙孔螺血氰蛋白)及不相關磷酸肽MCAK_人類(88-102)[95-pSer]測試細胞培養物上清液或經純化之家兔抗體。為了製備ELISA培養盤，在室溫下，用50ng/ml生物素化Tau(415-430)[pS422]培育抗生蛋白鏈菌素預塗佈的微量滴定培養盤1小時。以1μg/ml進行KLH或對照肽塗佈。在各種濃度下，在抗原標記微量滴定培養盤中培育家兔抗Tau pS422抗體(Abcam AB51071)或含有上清液之家兔抗體60分鐘。在充分洗滌之後，使用結合偵測抗體(Chemicon AQ301D)之羊抗家兔IgG地高辛偵測家兔抗體之結合。在室溫下用TMB培育之後，量測在370nm至492nm處之吸光度。抗體結合藉由其EC50值表徵。結合至生物素化Tau(416-430)[pS422]及非磷酸化Tau(416-430)肽之抗體藉由其EC50值表徵。藉由在較高濃度下，亦即在細胞培養物上清液之1：5稀釋度下之單點量測值估計與KLH或MCAK磷酸肽之交叉反應。結果顯示於下表中。發現結合至Tau磷酸肽之EC50值比結合至Tau肽之EC50值低100倍，指示相較於非磷酸化Tau肽，磷酸化Tau片段之選擇性高至少 100倍。在背景水準下所有抗體均結合至KLH及MCAK對照磷酸肽，其為Tau磷酸肽最大量測值之約1<3%。
亦測試可溶性及聚集全長Tau pS422之特異性。在室溫下，將Tau pS422之纖維聚集體(300μg/ml)塗佈至聚苯乙烯基Maxisorb微量滴定盤(Nunc)上隔夜。以類似方式將可溶性全長Tau及Tau pS422塗佈至Maxisorb微量滴定盤上。添加家兔抗Tau pS422抗體對照物(Abcam AB51071)或經純化之家兔抗體且以至多1000ng/ml之濃度培育60分鐘。在充分洗滌之後，使用結合偵測抗體(Chemicon AQ301D)之羊抗家兔IgG地高辛偵測家兔抗體之結合。在室溫下用TMB培育之後，量測在370nm至492nm處之吸光度。抗體結合藉由其EC50值表徵。結果顯示於下表中。
家兔單株抗體結合至Tau-pS422蛋白，其EC50值低於1ng/ml。偵測到纖維Tau pS422之EC50值在0.4ng/ml至14ng/ml範圍內。結合至非磷酸化完全長度Tau蛋白之信號無法與背景水準區分開來。因此，據 估計，抗體中之每一者以相較於Tau至少100倍之選擇性結合至Tau pS422及纖維Tau pS422。
BIAcore TM
進一步研究與纖維Tau pS422聚集體之結合且藉由BIAcoreTM分析進行確認。在37℃下使用BIAcore 3000器具進行量測。系統及樣品緩衝劑為HBS-EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005%聚山梨醇酯20(v/v))。對BIAcoreTM CM5感測器晶片進行預處理程序。持續30秒依序將0.1%SDS、50mM NaOH、10mM HCl及100mM H3PO4注射經過流量槽FC1、FC2、FC3及FC4。根據製造商之說明書，使用BIAcore 3000TM嚮導v.4.1進行胺偶合程序。在感測器表面之EDC/NHS活化之後，將非磷酸選擇性抗Tau抗體mAb<TAU>M-4/53-IgG固定在感測器流槽FC2、FC3及FC4上。在FC1上捕捉識別不相關抗原之抗體抗CK-MM(肌酸激酶同型)作為對照物。以30μg/ml將mAb<TAU>M-4/53-IgG及針對CK-MM之抗體稀釋於10mM NaAc(pH 5.0)中且以10μl/min注射7分鐘接觸時間以固定10.000 RU之抗體捕獲系統。藉由用1M乙醇胺飽和使表面去活化。感測器之條件為以10μl/min使用磷酸化絲狀Tau蛋白(以1：100稀釋於HBS-EP中之儲料0.3mg/ml)5個週期作為呈溶解狀態之被分析物持續2min。以30μl/min用10mM甘胺酸(pH 2.5)進行再生持續3分鐘。據推測，結合至mAb 4/53之分析物並不解離pTau纖絲，因為未觀測到pTau長絲與mAb 4/53解離。關於所有其他量測週期，將0.3mg/ml pTau纖絲以1：100稀釋於HBS-EP緩衝劑中且以10μl/min注射1min從而以不均勻夾層模式向各別抗體分析物呈現pTau。將抗體分析物稀釋於HBS-EP緩衝劑中達到100nM之濃度且以20μl/min注射至系統中持續3分鐘。在3分鐘解離之後，藉由以100μl/min注射2次10mM甘胺酸(pH 2.5)1分鐘，繼而以100μl/分鐘HBS洗滌15秒來使感測器表面再生。監測相互作用之結合 及解離階段。因為呈溶液狀態之抗體分析物為二價，負擔親合力之抗體pTau動力學係藉由兩相解離模型表徵，該解離模型由基於親和力之快速早期解離步驟繼而在後者複合物解離過程中親合力穩定但限速之動力學步驟組成。分析物注射結束10秒(前)及50秒(後)，在可能的情況下定量kd及t/2(解離)。使用雙參考程序評估動力學量測值。首先，減去來自FC1參考物之信號以校正緩衝劑整體效應及非特異性結合。其次，減去0nM分析物注射劑以校正初級抗體與各別捕捉系統之解離。根據BIAcoreTM評估軟體v.4.1，使用朗格繆爾1.1解離擬合模型評估動力學速率。根據式ln(2)/60*kd計算抗原/抗體複合物穩定性半衰期(min)。
結果概述於下表中。
實例3 抗Tau pS422單株家兔抗體與阿茲海默氏病患者腦部切片中之胞內pTau的結合
藉由免疫螢光染色實驗，使用來自AD患者之人類腦部組織冷凍切片，研究藉由單株家兔抗Tau pS422抗體之阿茲海默氏病腦部組織中之pTau病變的特異性及敏感性免疫組織化學偵測。該程序基本上與實例X中所描述相同(小鼠抗體)。藉由結合二級抗體(Invitrogen/Molecular Probes A11034)之山羊抗家兔Alexa Fluor488®偵測家兔IgG。對於純系Mab 005、Mab 019、Mab 020、Mab 085、Mab 086及Mab 097而言，pTau沈積物及纖絲之特異性及敏感性染色為顯而易見的。如較大神經原纖維纏結及細長嗜中性白血球細線之胞內pTau沈積為明顯的。測定出所研究的所有純系之最小有效濃度範圍均在0.08μg/ml與0.016μg/ml之間，此指示高度敏感性結合至真正的人類pTau沈積物。
實例4 家兔抗人類Tau(pS422)抗體之人類化
如本文所使用之「可變域」(輕鏈(VL)之可變域、重鏈(VH)之可變域)指示輕鏈及重鏈域對中之每一者，其直接參與抗體與Tau(pS422)抗原之結合。可變輕鏈及重鏈域具有相同的通式結構且各結構域包含四個序列為廣泛保守性的構架區(FR)，其藉由三個「高變區」相連。
經由電腦分析家兔抗體單抗086之VH及VL域之結構且將其與人類VH及VL域之結構資料庫(IMGT)進行比較。選擇結構上最類似的V域圖以將家兔抗體之CDR移植於所選人類VH及VL域上。另外，藉由比對家兔抗體VH及VL域之一級序列與人類V域抗體庫來考慮一級序列之相似性以縮小人類V域之選擇範圍。在一些人類化變異體中，將人類構架區內之回復突變引入至家兔親本殘基中。類似地，適當時在一些變異體中引入CDR中之突變從而潛在地提高抗原親和力，從而維持CDR三級結構且從而移除非所需特徵，如半胱胺酸殘基或在抗體純化之後可進行修飾之殘基。
在微量滴定培養盤中，以基質方式將含有人類化變體中之每一者之重鏈及輕鏈載體共轉染於HEK293懸浮細胞中以獲得表現所有可能的輕鏈/重鏈組合之完全尺寸IgG的細胞培養物。在37℃下培育5天之後，採集上清液且在微量滴定規模上藉由蛋白A親和性層析法進行純化。
實例5 產生重組表現載體 a)產生使用人類IgG1恆定區表現免疫球蛋白重鏈之載體
藉由將編碼各別抗人類Tau(pS422)特異性抗體VH域之DNA片段融合至編碼人類IgG1恆定區之序列元件來組裝包含人類IgG1恆定區(CH1、鉸鏈、CH2、CH3)及來源於家兔抗體Mab 086之人類化抗人類Tau(pS422)抗體VH域的人類化重鏈編碼融合基因。
人類IgG1恆定區具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：58)。
表現載體亦包含來自載體pUC18之複製起點，其允許在大腸桿菌中複製此質體，及β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌中之安比西林耐藥性。
抗體重鏈之轉錄單元在5'至3'方向上包含以下功能元件：- 包括內含子A之人類巨細胞病毒(P-CMV)之即刻早期強化子及啟動子，- 人類重鏈免疫球蛋白5'-未轉譯區(5'UTR)，- 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，- 重鏈可變(VH)域編碼核酸，- 編碼人類IgG1恆定區之核酸，及- 牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
b)產生使用人類Ig-κ恆定區表現免疫球蛋白輕鏈之載體
藉由將編碼各別抗人類Tau(pS422)抗體VL(κ)域之DNA片段融合至編碼人類Ig-κ恆定區之序列元件來組裝包含人類Ig-κ恆定區(CL-κ)及來源於家兔抗體Mab 086之抗人類Tau(pS422)抗體VL(κ)域的人類化κ輕鏈編碼融合基因。
人類Ig-κ恆定區具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：59)。
表現載體亦包含來自載體pUC18之複製起點，其允許在大腸桿菌中複製此質體，及β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌中之安比西林耐藥性。
抗體κ輕鏈之轉錄單元在5'至3'方向上包含以下功能元件：- 包括內含子A之人類巨細胞病毒(P-CMV)之即刻早期強化子及啟動子，- 人類重鏈免疫球蛋白5'-未轉譯區(5'UTR)，- 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，- 輕鏈可變(VL)域編碼核酸，- 編碼人類Ig-κ恆定區之核酸，及- 牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
c)產生使用人類Ig-λ恆定區表現免疫球蛋白輕鏈之載體
藉由將編碼各別抗人類Tau(pS422)抗體VL(λ)域之DNA片段融合至編碼人類Ig-λ恆定區之序列元件來組裝包含人類Ig-λ恆定區(CL-λ)及來源於家兔抗體Mab 086之抗人類Tau(pS422)抗體VL(λ)域的人類化λ輕鏈編碼融合基因。
人類Ig-λ恆定區具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：60)。
表現載體亦包含來自載體pUC18之複製起點，其允許在大腸桿菌中複製此質體，及β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌中之安比西林耐藥性。
抗體λ輕鏈之轉錄單元在5'至3'方向上包含以下功能元件：- 包括內含子A之人類巨細胞病毒(P-CMV)之即刻早期強化子及啟動子，- 人類重鏈免疫球蛋白5'-未轉譯區(5'UTR)，- 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，- 編碼輕鏈可變(VL)域之核酸，- 編碼人類Ig-λ恆定區之核酸，及- 牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
d)產生使用人類Ig-κ恆定區表現免疫球蛋白κ輕鏈之載體
藉由將編碼各別抗人類Tau(pS422)抗體VL(κ)域之DNA片段融合至編碼人類Ig-κ恆定區之序列元件來組裝包含人類Ig-κ恆定區(CL-κ)及來源於家兔抗體Mab 086之抗人類Tau(S422)抗體VL(κ)域的人類Ig-κ輕鏈編碼融合基因。構築體在基因組組織中，亦即內含子存在於信號肽中及VL(κ)及CL-κ域之間。
表現載體亦包含來自載體pUC18之複製起點，其允許在大腸桿菌中複製此質體，及β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌中之安比西林耐藥性。
抗體κ輕鏈之轉錄單元在5'至3'方向上包含以下功能元件：- 人類巨細胞病毒(P-CMV)之即刻早期強化子及啟動子，- 人類重鏈免疫球蛋白5'-未轉譯區(5'UTR)， - 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，- 輕鏈可變(VL)域編碼核酸，- 人類IgG κ恆定區，及- 牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
e)產生使用人類Ig-λ恆定區表現免疫球蛋白λ輕鏈之載體
藉由將編碼各別抗人類Tau(pS422)抗體VL(λ)域之DNA片段融合至編碼人類Ig-λ恆定區之序列元件來組裝編碼包含人類Ig-λ恆定區(CL-λ)及來源於家兔抗體Mab 086之抗人類Tau(S422)抗體VL(λ)域的人類Ig-λ輕鏈編碼融合基因。構築體在基因組組織中，亦即內含子存在於信號肽中及VL(λ)與CL-λ域之間。
表現載體亦包含來自載體pUC18之複製起點，其允許在大腸桿菌中複製此質體，及β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌中之安比西林耐藥性。
抗體λ輕鏈之轉錄單元在5'至3'方向上包含以下功能元件：- 人類巨細胞病毒(P-CMV)之即刻早期強化子及啟動子，- 人類重鏈免疫球蛋白5'-未轉譯區(5'UTR)，- 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，- 輕鏈可變(VL)域編碼核酸，- 人類IgG λ恆定區，及- 牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
實例6 重組產生抗人類Tau(pS422)抗體
在F17培養基(Invitrogen Corp.)中培養之短暫轉染HEK293細胞(源自人類胚腎細胞株293)中產生抗體。為了轉染如實例5中所描述之各別載體，使用「不含293」之轉染試劑(Novagen)。自個別表現質體表現抗體。如製造商之說明中所規定進行轉染。在轉染三天至七天之 後，收集含有重組抗體之細胞培養物上清液。在低溫(例如-80℃)下儲存上清液直至純化。
關於人類免疫球蛋白在例如HEK293細胞中之重組表現的一般信息提供於以下文獻中。Meissner,P.等人，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。
實例7 重組抗人類Tau(pS422)抗體之純化
過濾含有抗體之培養物上清液且藉由兩個層析步驟純化。
使用經PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)(pH 7.4)平衡之HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)藉由親和性層析法捕捉抗體。藉由用平衡緩衝液洗滌來移除未結合蛋白質，且用25mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.1)回收抗體，此緊接於用1M Tris鹼(pH 9.0)將溶離液調節至pH 6.0之後。
Superdex 200TM(GE Healthcare)上之尺寸排阻層析用作第二純化步驟。在20mM組胺酸緩衝液，0.14M NaCl，pH 6.0中進行尺寸排阻層析。用配備有Biomax-SK膜(Millipore,Billerica,MA,USA)之Ultrafree-CL離心過濾器單元將含有抗體之溶液濃縮且在-80℃下儲存。
實例8 動力學篩選
根據Schraeml等人(Schraeml,M.及M.Biehl,Methods Mol.Biol.901(2012)171-181)在裝備有BIAcore CM5感測器之BIAcore 4000器具上進行動力學篩選。BIAcore 4000器具受V1.1版軟體控制。根據製造商之說明書，BIAcore CM5串聯S晶片安裝於器具中且以水動力方式進行處理及預處理。器具緩衝劑為HBS-EP緩衝劑(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20)。抗體捕捉系統 在感測器表面上製備。使用NHS/EDC化學方法，在10,000 RU下，以30μg/ml將具有人類IgG-Fc特異性(Jackson Lab.)之多株山羊抗人類抗體於10mM乙酸鈉緩衝劑(pH 5)中固定至器具之流槽1、2、3及4中之位置1、2、4及5上。在各流槽中，在位置1及位置5上捕捉抗體。位置2及位置4用作參考位置。用1M乙醇胺溶液將感測器去活化。將濃度在44nM與70nM之間的人類化抗體衍生物施加於補充有1mg/ml CMD(羧基甲基葡聚糖)之器具緩衝劑中。以30μl/min之流動速率注射抗體持續2分鐘。以rel.反應單位(RU)量測表面呈現抗體之捕捉水準(CL)。以300nM、30μl/min之流動速率注射溶液形式之分析物、磷酸化人類tau蛋白、非磷酸化人類tau蛋白及磷酸化人類tau突變蛋白T422S持續3分鐘。監測解離5分鐘。藉由以30μL/min經過所有流槽注射10mM甘胺酸緩衝劑(pH 1.7)持續1分鐘來再生捕捉系統。兩個報導點，分析物注射結束前不久的記錄信號，表示為後期結合(BL)；及解離時間結束前不久的記錄信號，表示為後期穩定(SL)，其用於表徵動力學篩選效能。此外，根據朗格繆爾模型(Langmuir model)計算解離速率常數kd(1/s)且以分鐘計根據式ln(2)/(60*kd)計算抗體/抗原複合物半衰期。根據式MR=(後期結合(RU))/(捕捉水準(RU))*(MW(抗體)/(MW(抗原))計算莫耳比(MR)。在感測器組態成具有適合量之抗體配位體捕捉水準的情況下，各抗體應在功能上能夠至少結合至一種溶液形式之分析物，其由莫耳比MR=1.0表示。接著，莫耳比亦為分析物結合之價數模式的指示。對於結合兩個被分析物之抗體而言最大價數可為MR=2，每一者各具有Fab價數。
在另一實施例中，在25℃及37℃下，使用相同實驗性設備但使用多種濃度系列之各種呈溶液形式之分析物(在0nM(緩衝劑)、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM、100nM及300nM下)測定動力學速率。根據製造商之說明書及具有總體RMAX之朗格繆爾1.1模型，自 濃度依賴性結合狀態使用BIAcore評估軟體計算動力學資料。
實例9 ELISA
將非生物素化肽/蛋白質/聚集體添加至未經塗佈的Maxisorb培養盤中且將含生物素化肽/蛋白質/聚集體之PBS添加至抗生蛋白鏈菌素塗佈的Maxisorb培養盤中且培育隔夜。丟棄上清液且用90μl洗滌緩衝液(1×PBS/0.1%Tween 20)洗滌孔三次。藉由培育一小時，用阻斷緩衝液(1xPBS/2%BSA(牛血清白蛋白溶離份V，不含脂肪酸，Roche，目錄號：10735078001)/0.05%Tween 20)阻斷剩餘反應性斑點。丟棄上清液且用90μl洗滌緩衝液洗滌孔三次。以500ng/mL之起始濃度，於12稀釋液(1：2)中於ELISA緩衝劑中製備樣品及對照抗體(1×PBS/0.5%BSA(牛血清白蛋白溶離份V，不含脂肪酸，Roche，目錄號：10735078001)/0.05%Tween 20)。培育時間為在室溫下在震盪器上60分鐘。丟棄上清液且用90μl洗滌緩衝液洗滌孔三次。於ELISA緩衝劑中製備二次抗體溶液。將總計25μl之抗體混合物轉移入分析盤之所有孔中且此後將該盤在震盪器上在室溫下培育60分鐘。丟棄上清液且用90μl洗滌緩衝液洗滌孔三次。將25μl ABTS溶液添加至所有孔中。在405nm至492nm處讀取吸光度。
實例10 重組人類化抗生物素抗體與生物素化化合物(半抗原化化合物)之結合
為了判斷人類化程序及隨後引入半胱胺酸突變是否會產生保留完全結合活性之衍生物，進行以下實驗。
藉由生物膜干涉(BLI)技術使用Octet QK instrument(Fortebio Inc.)分析重組抗生物素抗體衍生物之結合特性。此系統經充分確立用於研究分子相互作用。BLi技術是基於自生物感測器頂端之表面反射的白光的干擾圖案的量測及內部參考。分子與生物感測器頂端之結合 導致可量測的干擾圖案移位。為了分析上文所述之人類化程序是否降低抗生物素抗體結合於生物素之能力，直接比較嵌合及人類化型式之抗體結合於生物素化之蛋白質之能力的特性。藉由在抗huIgG Fc抗體捕捉(AHC)生物感測器(Fortebio Inc.)上捕捉抗生物素抗體來進行結合研究。首先，在20mM組胺酸、140mM NaCl(pH 6.0)中的0.5mg/ml濃度之抗體溶液中培育生物感測器1分鐘。此後，在1×PBS pH 7.4中培育生物感測器1分鐘以達到穩定基線。藉由在20mM組胺酸、140mM NaCl(pH 6.0)中的0.06mg/ml濃度之含有生物素化之蛋白質之溶液中培育抗體塗佈之生物感測器5分鐘來量測結合。在1×PBS pH 7.4中監測解離5分鐘。直接比較嵌合及人類化抗生物素抗體之所得結合曲線。
人類化型式之抗體顯示與嵌合抗體相比相等或甚至較佳的生物素化抗原結合。生物素化之蛋白質顯示當生物感測器塗覆有赫賽汀(Herceptin)時減少的非特異性結合於生物感測器之殘基，赫賽汀不結合生物素。因此，其人類化變異體中保留抗生物素抗體之官能基(由如SEQ ID NO：92及96中所描繪之序列定義)。
表面電漿子共振
在25℃下，在BIAcore® T200 instrument(GE Healthcare Biosciences AB,Sweden)上進行表面電漿子共振量測。在pH 5.0下，藉由使用GE Healthcare供應之標準胺偶合套組(BR-1000-50)，在CM3晶片(GE Healthcare,BR-1005-36)上偶合約4300共振單位(RU)之捕獲系統(10μg/ml來自人類抗體捕捉套組(Human Antibody Capture Kit)之抗人類捕捉(IgG Fc)，BR-1008-39，GE Healthcare Biosciences AB,Sweden)。用於胺偶合之操作緩衝液為HBS-N(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，GE Healthcare，BR-1006-70)。用於隨後結合研究之操作及稀釋緩衝液為PBS-T(10mM磷酸鹽緩衝生理食鹽水，包 括0.05%Tween 20)pH 7.4。藉由以5μl/min之流動速率注射2nM溶液持續60秒，捕捉人類化抗生物素抗體。用PBS-T以0.14-100nM之濃度稀釋生物素化之siRNA(1：3連續稀釋)。藉由以30μl/min之流動速率，解離時間600秒注射各濃度持續180秒來量測結合。以5μl/min之流動速率，用3M MgCl2溶液洗滌30秒使表面再生。使用BIA評估軟體(GE Healthcare Biosciences AB,Sweden)評估資料。藉由減去自抗人類IgG Fc表面獲得之反應校正整體折射率差異。亦減去空白注射(=二次參考)。為了計算KD及動力學參數，使用朗格繆爾1：1模型。
藉由表面電漿子共振(SPR)對人類化抗生物素抗體SEQ ID NO：92及96進行動力學結合分析。藉由結合於CM3感測器晶片的抗人類IgG Fc抗體捕捉濃度為2nM之抗生物素抗體。記錄濃度0.41、1.23、3.7、11.1、33.3、100及300nM下的生物素化之siRNA(Mw：13868Da)的結合。一式兩份進行量測。人類化抗生物素抗體的計算KD為0.633nM。
實例11 產生半抗原化化合物與抗半抗原抗體之非共價複合物 通用方法：
抗半抗原抗體與半抗原化化合物之複合物(=與淨負荷結合之半抗原)的產生將產生所定義之複合物，且應確保此等複合物中之化合物(=淨負荷)保留其活性。為了產生半抗原化化合物與各別抗半抗原抗體之複合物，將半抗原化化合物溶解於H2O中達到最終濃度1mg/ml。在20mM組胺酸緩衝液，140mM NaCl，pH=6.0中，將抗體濃縮至最終濃度1mg/ml(4.85μM)。藉由上下抽吸將半抗原化淨負荷及抗體混合至2：1莫耳比(化合物比抗體)且在室溫下培育15分鐘。
或者，將半抗原化化合物溶解於100%DMF中達到最終濃度10mg/ml。在50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH=8.2中，將抗體濃縮至 最終濃度10mg/ml。藉由上下抽吸將半抗原化化合物與抗體混合至2.5：1莫耳比(化合物比抗體)且在室溫下及350rpm下培育60分鐘。
用於形成半抗原化多肽與抗半抗原抗體之複合物-地高辛-PYY(3-36)/抗地高辛抗體複合物的例示性方法
為了產生地高辛化多肽與抗地高辛抗體之非共價複合物，將鼠類融合瘤產生之抗體(自10mM KPO4、70mM NaCl；pH 7.5凍乾)溶解於12ml水中且針對包含20mM組胺酸、140mM NaCl，pH 6.0之溶液滲析產生含300mg(2×10-6mol)之11ml緩衝液(c=27.3mg/ml)。在1小時內分4份添加2.85mg地高辛-PYY(3-36)結合物(11.57mg，4×10-6mol，2當量)且在室溫下再培育1小時。複合反應完成之後，藉由尺寸排阻層析以流動速率2.5ml/min經Superdex 200 26/60 GL管柱(320ml)純化20mM組胺酸、140mM NaCl，pH 6.0中之複合物。溶離之複合物收集至4ml溶離份中，彙聚且經0.2μm過濾器滅菌獲得234mg濃度為14.3mg/ml之複合物。以類似方式，為了產生人類化抗地高辛抗體之複合物，將抗體在20mM組胺酸、140mM NaCl，pH 6.0中調整至10.6mg/ml之濃度(9.81mg，0.93ml中6.5×10-8mol)。向抗體溶液中添加0.57mg=1.97×10-7mol=3.03當量凍乾物形式之地高辛化多肽(DIG-PYY)。多肽及抗體在室溫下培育1.5小時。藉由尺寸排阻層析經Superose 6 10/300 GL管柱，以流動速率0.5ml/min移除在20mM組胺酸、140mM NaCl，pH 6.0中的過量多肽。溶離之複合物收集至0.5ml溶離份中，彙聚且經0.2μm過濾器滅菌獲得4.7mg濃度為1.86mg/ml之複合物。
所得半抗原化多肽-抗半抗原抗體複合物定義為尺寸排阻層析中出現單峰的單體IgG樣分子。所得複合物定義為單體IgG樣分子，每個抗體分子攜帶兩個地高辛-PYY衍生物。藉由尺寸排阻層析確認此等肽複合物之限定組成，其亦指示無蛋白質聚集體存在。藉由SEC- MALS(尺寸排阻層析-多角度光散射)進一步確認此等雙特異性肽複合物之限定組成(及2：1多肽比蛋白質比率)。對於SEC-MALS分析，100-500μg各別樣品以流動速率0.25-0.5ml/min施加於Superdex 20010/300 GL尺寸排阻管柱，以1×PBS pH 7.4作為移動相。用Wyatt MiniDawn TREOS/QELS偵測器偵測光散射，用Wyatt Optilab rEX-偵測器量測折射率。使用軟體ASTRA(5.3.4.14版)分析所得資料。SEC-MALLS分析之結果提供關於複合物之質量、半徑及尺寸的資訊。此等資料接著與相應未複合抗體的資料比較。此等實驗之結果表明地高辛化-PYY暴露於抗地高辛抗體產生每一個抗體分子含有兩個地高辛-PYY衍生物之複合物。因此，地高辛化PYY可與抗地高辛抗體在限定位點(結合區)且以限定化學計量複合。
藉由表面電漿子共振研究表徵複合物提供複合反應產生限定且完全複合之分子的額外證據。抗地高辛抗體可結合於SPR晶片，此導致信號增加。隨後添加地高辛-PYY結合物導致進一步信號增加直至完全佔據全部結合位點。在此等條件下，添加更多地高辛-PYY不會進一步增加信號。此指示複合反應為特異性的且信號並非由地高辛化多肽之非特異黏著引起。
用於形成半抗原化多肽與抗半抗原抗體之複合物-Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot)/嵌合抗生物素抗體複合物的例示性方法
為了產生含有半胱胺酸化連接基團的生物素化-PYY-多肽之非共價複合物，將0.16mg Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot溶解於100%DMF中達到10mg/ml之濃度。使用由50mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 8.2構成之緩衝液中，濃度為10.7mg/ml(約73μM)之抗體。以2.5：1莫耳比(Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot比抗體)混合Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot與抗體，且在室溫下及350rpm下培育60分鐘。經尺寸排阻層析，所得複合物定義為63%單體IgG樣分子及37%二聚可溶性聚集 體。所得複合物藉由SDS-PAGE及隨後西方墨點分析進一步分析。10μg複合物與4×LDS樣品緩衝液(Invitrogen)混合且在95℃下培育5分鐘。樣品施加於4-12%Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠(NuPAGE,Invitrogen)，且在200V及120mA下操作35分鐘。在25V及160mA下，在聚丙烯醯胺-凝膠中分離之分子轉移至PVDF膜(0.2μm孔徑，Invitrogen)持續40分鐘。在室溫下，在1×PBST(1×PBS+0.1%Tween20)中的1%(w/v)脫脂牛奶中阻斷膜1小時。膜在1×PBST中洗滌3×，持續5分鐘，且隨後與抗生蛋白鏈菌素-POD-結合物(2900U/ml，Roche)一起培育，該結合物以1：2000倍稀釋液使用。使用Lumi-Light西方墨點底物(Roche)進行膜上與生物素結合之抗生蛋白鏈菌素-POD的偵測。
用於形成半抗原化多肽與抗半抗原抗體之複合物-Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)/嵌合抗螢光素抗體複合物的例示性方法
為了產生含有半胱胺酸化連接基團的螢光素結合-PYY-多肽之非共價複合物，將0.33mg Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo溶解於100%DMF中達到10mg/ml之濃度。使用由50mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 8.2構成之緩衝液中，濃度為9.99mg/ml(約68μM)之抗體。以2.5：1莫耳比(Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)比抗體)混合Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo與抗體，且在室溫下及350rpm下培育60分鐘。經尺寸排阻層析，所得複合物定義為76%單體IgG樣分子及24%二聚可溶性聚集體。所得複合物藉由SDS-PAGE進一步分析且隨後偵測聚丙烯醯胺-凝膠中的螢光素相關螢光。8μg複合物與4×LDS樣品緩衝液(Invitrogen)混合且在95℃下培育5分鐘。使用LumiImager F1裝置(Roche)在645nm之激發波長下記錄螢光素相關螢光。
實例12 與抗半抗原抗體結合及複合之多肽保留功能性
先前已顯示作為非共價半抗原-多肽結合物之部分且與抗半抗原抗體複合之多肽保留功能性(WO2011/003557、WO 2011/003780及PCT/EP2011/074273)。
實例13 血腦屏障-穿梭子模組之工程改造
藉由融合雙硫鍵穩定之半抗原結合單鏈Fv與抗TfR抗體之CH3結構域的C端產生半抗原-結合雙特異性血腦屏障-穿梭子模組。應用與先前所述類似的設計及技術(參看例如WO 2014/006124)。此等血腦屏障-穿梭子模組之組成的實例顯示於圖7中。
血腦屏障-穿梭子模組識別血腦屏障之內皮細胞上的能夠轉胞吞作用之細胞表面目標(血腦屏障受體)。舉例而言，吾人使用以不同親和力結合運鐵蛋白受體的兩個不同抗體。抗體TfR1以高親和力結合於運鐵蛋白受體且抗體TfR2以降低之親和力結合於運鐵蛋白受體(參看例如WO 2012/075037)。源自此等抗TfR抗體之TfR結合位點設為進入雙特異性抗體的未改變之Fab臂，以獲得二價全長IgG模組。雙硫鍵穩定之半抗原結合單鏈Fv經短GS連接基團融合至所產生的雙特異性抗體之CH3結構域之C端。舉例而言，作為上述抗半抗原結合位點，使用結合地高辛(Dig)或生物素(Bio)之衍生物的實體(序列參看上文)。
此等穿梭子媒介之序列組成的實例列為SEQ ID NO：134(LC抗-TfR1抗體)、SEQ ID NO：135(與scFv抗地高辛抗體片段結合之HC抗-TfR1抗體)、SEQ ID NO：136(與scFv抗生物素抗體片段結合之HC抗-TfR1抗體)、SEQ ID NO：137(LC抗TfR2抗體)、SEQ ID NO：138(與scFv抗地高辛抗體片段結合之HC抗TfR2抗體)、SEQ ID NO：139(與scFv抗-抗生素抗體片段結合之HC抗TfR2抗體)。
實例14 雙特異性抗體(血腦屏障-穿梭子模組)之表現及純化
在如先前所描述之限定無血清培養基(參看上文)中，在哺乳動物細胞中產生血腦屏障-穿梭子模組雙特異性抗體。HEK293懸浮細胞用L鏈及H鏈編碼表現質體短暫轉染產生表現血腦屏障-穿梭子模組雙特異性抗體之培養物。
為了產生以高親和力結合TfR之地高辛化淨負荷結合血腦屏障-穿梭子模組，含有SEQ ID NO：134編碼核酸之表現質體/表現卡匣與含有SEQ ID NO：135編碼核酸之表現質體/表現卡匣共轉染。
為了產生以高親和力結合TfR之地高辛化淨負荷結合血腦屏障-穿梭子模組，含有SEQ ID NO：134編碼核酸之表現質體/表現卡匣與含有SEQ ID NO：136編碼核酸之表現質體/表現卡匣共轉染。
為了產生以降低之親和力結合TfR之地高辛化淨負荷結合血腦屏障-穿梭子模組，含有SEQ ID NO：137編碼核酸之表現質體/表現卡匣與含有SEQ ID NO：138編碼核酸之表現質體/表現卡匣共轉染。
為了產生以降低之親和力結合TfR之地高辛化淨負荷結合血腦屏障-穿梭子模組，含有SEQ ID NO：137編碼核酸之表現質體/表現卡匣與含有SEQ ID NO：139編碼核酸之表現質體/表現卡匣共轉染。
藉由蛋白質A層析法自用L鏈及H鏈編碼表現質體短暫轉染之HEK293懸浮液細胞的上清液純化雙特異性抗體(參看上文)。隨後，應用尺寸排阻層析(SEC)獲得不含聚集體或污染物之雙特異性抗體。經純化血腦屏障-穿梭子模組之純度及組合物的實例在圖8中顯示為SEC概況及SDS PAGE。
實例15 雙特異性半抗原結合血腦屏障-穿梭子模組同時結合半抗原化淨負荷及血腦屏障受體
為了實現雙特異性抗體之血腦屏障-穿梭子功能性，其必須同時結合於血腦屏障之內皮細胞上的血腦屏障受體及待穿梭之半抗原化淨 負荷。為了評估如本文所報導之半抗原結合雙特異性抗體的此功能性，藉由FACS分析解決同時細胞表面及淨負荷結合。對於此等分析，藉由藻紅蛋白標記之IgG識別二級抗體偵測血腦屏障-穿梭子模組(=雙特異性抗體)之細胞結合。藉由施加半抗原化螢光淨負荷(地高辛化Cy5；DIG-Cy5)偵測同時淨負荷結合。使用hCMEC/D3細胞作為TfR表現BBB衍生之細胞株及Dig-Cy5作為螢光淨負荷的FACS分析之結果顯示於圖9中：如抗IgG-PE相關信號所示，兩個運鐵蛋白受體結合雙特異性抗體結合於hCMEC/D3。類似地，如細胞相關Cy5可引起的信號所示，兩個雙特異性抗體亦結合且同時結合Dig-Cy5。(高親和力)TfR1雙特異性抗體與(降低之親和力)TfR2雙特異性抗體之間的信號強度之比較指示(如所預期)與中等親和力雙特異性抗體相比，具有高親和力之細胞上的較高信號強度。識別hCMEC/D3(CD33-Dig)上並非以可偵測量存在的抗原之對照雙特異性抗體不(如所預期)產生抗IgG抗體或Dig-Cy5之相關信號。
此等結果顯示雙特異性半抗原結合血腦屏障-穿梭子模組特異性結合於內皮細胞之表面上的其目標。此外，此等雙特異性抗體同時結合半抗原化淨負荷且藉此可將其引導至血腦屏障之內皮細胞。
實例16 影響自腦部內皮細胞釋放的血腦屏障-穿梭子模組之受體結合模式
吾人使用腦部內皮細胞(hCMEC/D3)來研究如本文所報導之穿梭子模組的細胞結合及轉胞吞作用。前述研究(Crepin等人，2010；Lesley等人，1989,WO 2012/075037、WO 2014/033074)報導TfR結合抗體之價數及親和力影響與血腦屏障之內皮細胞結合、經血腦屏障之內皮細胞轉胞吞作用及自血腦屏障之內皮細胞釋放的功效。為了研究hCMEC/D3中的細胞結合及轉胞吞作用，在過濾器插片上培養的hCMEC/D3細胞與雙特異性抗體或親本抗體(無半抗原結合scFv作為對 照物)在37℃下在頂端培育1小時。在室溫下在無血清培養基中頂部(400μl)及底外側(1600μl)洗滌細胞單層三次，各持續3-5分鐘。收集全部洗滌液體積來監測移除未結合配位體或抗體的效率。向頂部室添加預升溫之培養基且將過濾器轉移至含有1600μl預升溫之培養基的新鮮12孔培養盤(用含有1%BSA之PBS阻斷隔夜)中。此時，將細胞溶解於500μl RIPA緩衝液(Sigma,Munich,Germany,#R0278)中，以測定特異性攝取。剩餘過濾器在37℃下培育且在多個時間點收集樣品以判斷頂部及/或底外側釋放。使用高敏感性IgG ELISA定量樣品中的抗體含量。此等分析之結果顯示於圖10中：高親和力二價抗TfR抗體(TfR1)變得有效結合於細胞，但不釋放至頂部或底外側隔室。以相同方式，含有高親和力TfR結合位點(TfR1-Dig、TfR1-Bio)之雙特異性抗體變得有效結合於細胞，但不釋放至頂部或底外側隔室。相比之下，具有降低親和力之二價抗TfR抗體(TfR2)變得有效結合於細胞，且隨後隨時間釋放至頂部或底外側隔室。含有降低之親和力二價TfR結合位點(TfR2-Dig，TfR2-Bio)的雙特異性抗體變得亦有效結合於細胞且釋放至頂部或底外側隔室達到與親本抗體相同的程度。結合hCMEC/D3上不存在之抗原的對照雙特異性抗體(CD33-Dig，CD33-Bio)不結合於此等細胞且因此亦不隨時間釋放至頂部或底外側隔室。
實例17 對TfR穿梭子具有降低之親和力的血腦屏障-穿梭子模組跨越內皮細胞且支持轉胞吞作用及釋放半抗原化淨負荷
使用腦部內皮細胞(hCMEC/D3)研究半抗原化淨負荷的細胞結合及轉胞吞作用，該半抗原化淨負荷與半抗原結合血腦屏障-穿梭子模組形成非共價複合物。為了評估淨負荷轉胞吞作用是否可經如本文針對非共價複合淨負荷所報導之半抗原結合血腦屏障-穿梭子模組(雙特異性抗體)實現，trans-well系統中之hCMEC/D3細胞暴露於由如本文 所報導之雙特異性抗體複合的半抗原化淨負荷(參看針對例示性構築體之前述實例)一小時以允許TfR結合。在藉由洗滌移除穿梭子及淨負荷(參看實例15)之後，以實例15中針對穿梭子模組所述類似的方式隨時間(實驗開始後0至5小時=洗滌步驟)監測結合分子、內化、胞內分選、轉胞吞作用及淨負荷釋放。當前實例中所用之淨負荷為單半抗原化DNA，其在與如本文所報導之雙特異性抗體培育時變得以2：1(莫耳)比率非共價複合，如圖11A中所示。可藉由qPCR偵測及定量細胞萃取物、頂部及底外側隔室中淨負荷之存在。舉例而言，作為淨負荷的末端單生物素化或單地高辛化雙股DNA 50 mer(SEQ ID NO：140)及用於在Roche LightCycler上淨負荷定量的兩個PCR引子PrFor(SEQ ID NO：141)及PrRev(SEQ ID NO：142)如圖11A中所示。此等分析之結果(圖11B)表明非共價連接之半抗原化淨負荷結合於細胞，內化且隨後釋放至頂部及底外側隔室中。結合及隨後之釋放藉由TfR結合血腦屏障-穿梭子模組介導，若塗覆了CD33結合對照雙特異性抗體，則既未偵測到結合於細胞亦未偵測到釋放。此外，在塗覆無雙特異性抗體之半抗原化淨負荷時，既未偵測到結合於細胞亦未偵測到釋放。包含雙特異性抗體及相應半抗原化淨負荷之地高辛結合位點以及生物素結合位點觀測到非共價複合之淨負荷的轉胞吞作用。此顯示不同半抗原可用於設計非共價雙特異性抗體血腦屏障-穿梭子模組。因此，可使用針對非共價複合之半抗原化淨負荷的半抗原結合雙特異性抗體實現跨血腦屏障之淨負荷轉胞吞作用。
實例18 具有對TfR具有高親和力之結合位點的血腦屏障-穿梭子模組結合於內皮細胞但不自內皮細胞釋放，但仍支持轉胞吞作用及半抗原化淨負荷之釋放
腦部內皮細胞(hCMEC/D3)用於研究半抗原化淨負荷之細胞結合 及轉胞吞作用，該等淨負荷可以與先前實例17中所述相同的方式與半抗原結合血腦屏障-穿梭子模組形成非共價複合物。trans-well系統中之HCMEC/D3細胞暴露於血腦屏障-穿梭子模組(雙特異性抗體)複合的半抗原化淨負荷1小時以允許TfR結合、內化及胞內分選，以及轉胞吞作用。淨負荷為單半抗原化DNA，其在與雙特異性抗體培育時以2：1(莫耳)比率非共價複合，如圖11A中所示。如先前實例17中所述，藉由細胞萃取物、頂部及底外側隔室中之qPCR定量單生物素化或單地高辛化雙股DNA 50 mer淨負荷(SEQ ID NO：140)之存在。
此等分析之結果(圖12)表明非共價複合之半抗原化淨負荷結合於細胞，內化且隨後釋放至頂部及底外側隔室中。此為出人意料之表現，因為二價高親和力穿梭子模組本身不自細胞釋放。結合及隨後淨負荷釋放藉由TfR結合雙特異性抗體血腦屏障-穿梭子模組介導，因為若塗覆CD33結合對照雙特異性抗體，則既未偵測到結合於細胞亦未偵測到釋放。此外，在塗覆無雙特異性抗體血腦屏障-穿梭子模組之半抗原化淨負荷情況下，既未偵測到結合於細胞亦未偵測到釋放。包含雙特異性抗體及相應半抗原化淨負荷之地高辛結合位點以及生物素結合位點觀測到非共價複合之淨負荷的轉胞吞作用及釋放。此指示不同半抗原可用於設計半抗原化淨負荷與雙特異性抗體血腦屏障-穿梭子模組的非共價複合物。跨越包含血腦屏障之細胞的淨負荷轉胞吞作用可經血腦屏障-穿梭子模組(雙特異性抗體)非共價複合之半抗原化淨負荷實現。出人意料地，轉胞吞作用不依賴於穿梭子媒介本身之釋放，因為即使當塗覆不釋放之穿梭子模組時，淨負荷亦釋放。
實例19 囊泡隔室內半抗原化淨負荷與血腦屏障-穿梭子模組分離
使用包含結合內皮細胞但本身不自此等細胞釋放之血腦屏障-穿梭子模組(TfR1)的高親和力TfR結合位點之轉胞吞作用分析法顯示出 人意料之結果：半抗原化淨負荷跨越細胞穿梭且釋放至頂部及底外側隔室中，儘管穿梭子模組本身仍連接於細胞/包含於細胞中。藉由共焦顯微分析淨負荷的雙特異性抗體介導之細胞結合、攝入及分佈。因此，腦部內皮細胞(hCMEC/D3)暴露於雙特異性抗體複合之半抗原化螢光淨負荷(半抗原-Cy5或半抗原-DNA-Cy5)且藉由共焦螢光顯微法分析。因此，將hCMEC/D3細胞接種至顯微級玻璃蓋玻片上且與50nM雙特異性抗體複合之半抗原化螢光淨負荷一起在37℃下在細胞培養基中培育三小時。接著洗滌細胞，固定(4%三聚甲醛)且藉由用抗κ輕鏈特異性抗體隨後結合於ALEXA Fluor 488之二級抗體對比染色來偵測穿梭子模組之IgG部分。在使用100x/1.46NA接物鏡使用針對ALEXAFluor488(IgG)及CY5(半抗原-DNA-CY5淨負荷)之適當帶通濾波器設定之LEICA SP5x共焦顯微鏡上獲取影像。此等分析之結果顯示於圖13中。高親和力雙特異性抗體與螢光標記之半抗原化淨負荷(DNA-Cy5)的複合物結合於TfR且初始定位於細胞表面上。隨後，其與其同源受體共同內化且呈現於囊泡隔室中的細胞內，亦即內體及溶酶體。內化之後不久(三小時)，吾人觀測到穿梭子模組引起的螢光信號與半抗原化淨負荷引起的螢光信號實質上分離。因此，如本文所報導之血腦屏障-穿梭子模組之非共價複合物及半抗原化淨負荷可溶解至細胞內部的不同囊泡隔室中。由此，淨負荷自穿梭子模組釋放且可經轉胞吞作用離開內皮細胞，即使此時梭子模組仍結合於細胞/保留於細胞中。地高辛結合以及生物素結合血腦屏障-穿梭子模組(雙特異性抗體)及相應半抗原化淨負荷觀測到非共價複合之半抗原化淨負荷的胞內分離。因此，可使用不同半抗原設計實現淨負荷轉胞吞作用之半抗原化淨負荷與血腦屏障-穿梭子模組的非共價複合物。
實例20 含有肽YY之HeliCar基元胺基酸序列
肽YY為迴腸及結腸中之細胞回應於攝食釋放的短(36個胺基酸)肽。在人類中，其看起來食慾降低。循環PYY之最常見形式為PYY3-36，其結合於受體Y家族的Y2受體(Y2R)。PYY存在於胃腸道(尤其迴腸及結腸)黏膜中之L細胞中。另外，少量PYY(約1至10%)存在於食道、胃、十二指腸及空腸中。在循環中，PYY濃度在食物攝入之後增加且在禁食期間降低。PYY藉由NPY受體發揮其作用；其抑制胃運動且提高結腸中之水及電解質吸收。PYY及PYY模擬物已用於解決肥胖症。
PYY經修飾以包含HeliCar基元胺基酸序列且由抗HeliCar基元胺基酸序列抗體複合以獲得抗體之藥物動力學特性的優勢及避免PYY之固有不穩定性。
非共價複合物形成
PYY3-36肽之構造研究(Nygaard,R.等人，Biochem.45(2006)8350-8357；SEQ ID NO：143)揭示中樞胺基酸的螺旋基元(HeliCar樣基元胺基酸序列)。因為N端異白胺酸及經修飾之C端已描述為對肽之功能活性必不可少，所以中樞螺旋經修飾以反映HeliCar基元胺基酸序列中的胺基酸。
PYY(3-36)3 36(SEQ ID NO.143)IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRYNH2 HeliCar基元AHLENEVARLKK PYY_HeliCar IKPEAPGEDASPEAHLANEVARLHYLNLVTRQRYNH2(SEQ ID NO：144)(YNH2=酪胺酸醯胺)
完全IgG1抗HeliCar基元胺基酸序列抗體藉由轉染兩個含有插入載體中的重鏈及輕鏈可變區之質體在HEK293細胞中產生，該重鏈及輕鏈分別含有恆定人類IgG1及恆定人類λ結構域。抗HeliCar基元胺基酸序列抗體(0019)藉由使用蛋白質A層析法之標準程序純化。質譜實驗確認抗體0019之一致性。
藉由向抗體溶液施加少量過量之肽來活體外獲得抗體0019與經修飾PYY肽PYY_HeliCar的複合物。形成複合物0052。藉由SEC-MALLS分析型實驗測得複合物之化學計量量為一個二價抗體上複合1.6個肽。
測試抗體0019、PYY(3-36)野生型、PYY_HeliCar及複合物0052對Y2Receptor家族的作用。
如所證明(Hoffmann,E.等人，J.Cont.Rel.171(2013)48-56.)，抗體複合之肽具有延長之活體內半衰期。此外及出人意料地，複合物證實NPY2R受體相較於非複合肽略微較佳之親和力；抗體使多肽穩定且 提供呈固定生物活性構形之肽。
共價複合物形成(共價二硫鍵)
為了提高抗HeliCar基元胺基酸序列抗體抗體與含有HeliCar基元胺基酸序列之化合物的複合物的活體外及活體內穩定性，已使用在結合時形成二硫橋鍵之方法。
第一步驟為特異性識別步驟(高親和力相互作用)，亦即形成含有HeliCar基元胺基酸序列之化合物-抗HeliCar基元胺基酸序列抗體複合物。其後在第二步驟中自發改組二硫橋鍵形成穩定性提高之共價複合物。
因為12-mer肽(HeliCar基元胺基酸序列)為相對剛性實體(至少當藉由特異抗HeliCar基元胺基酸序列抗體複合時)，已發現必須使用二硫橋鍵的結構上特異之設計。因為複合物形成及此後實現共價偶合是在兩個以重組方式產生之實體之間，所以針對形成共價二硫鍵引入的人工半胱胺酸殘基並非必需以游離半胱胺酸殘基形式產生，但以降低之量表現，亦即結合於游離半胱胺酸或homo半胱胺酸胺基酸。
抗HeliCar基元胺基酸序列抗體可變域的胺基酸序列中引入人工游離半胱胺酸殘基之位置至關重要。抗體可變域胺基酸序列中之非曝露半胱胺酸具有較大機率表現為游離半胱胺酸(不結合)，而接近結合袋的曝露半胱胺酸殘基因為與額外部分(如游離半胱胺酸)的半胱胺酸結合誘發位阻可消除12-mer肽(HeliCar基元胺基酸序列)的結合。
a)與含有HeliCar基元胺基酸序列之螢光化合物的複合物
為了鑑別具有最低位阻風險及強親和力降低之適合位置，已對在HeliCar基元胺基酸序列中引入人工半胱胺酸殘基的不同位置進行了測試。已在12mer(HeliCar基元胺基酸序列)之C端末端引入半胱胺酸殘基以使互補位的主要部分不變。肽已合成且融合至螢光基元。
野生型：AHLENEVARLKK(SEQ ID NO：145)
半胱胺酸變異體1：AHLENEVARCKK(SEQ ID NO：146)->AHLENEVARCKK(5-Fluo)-OH
半胱胺酸變異體2：AHLENEVARLCK(SEQ ID NO：147)->AHLENEVARLCK(5-Fluo)-OH x TFA
在抗體上，已進行構造設計來允許形成針對兩種設計肽的二硫橋鍵，該等肽各自包括不同3D環境中之半胱胺酸。
向VH及VH結構域中模擬12-mer螺旋肽AHLENEVARLKK(SEQ ID NO：145，HeliCar基元胺基酸序列)。在肽之C端，殘基L10及K11識別為可能位置，且在輕鏈可變域中，鑑別出根據Kabat之輕鏈編號的位置N55及G51。
抗HeliCar基元胺基酸序列抗體(0019)之重鏈可變域具有胺基酸序列： (SEQ ID NO：148)。
抗HeliCar基元胺基酸序列抗體(0019)之輕鏈可變域具有胺基酸序列： (SEQ ID NO：149)。
抗HeliCar基元胺基酸序列抗體(0155)之輕鏈可變域N55C變異體具有胺基酸序列： (SEQ ID NO：150)。
抗HeliCar基元胺基酸序列抗體(0157)之輕鏈可變域N51C變異體 具有胺基酸序列： (SEQ ID NO：151)。
i)含有HeliCar基元胺基酸序列之化合物與抗體0155的共價結合物
二價抗體0155表現於與其無游離半胱胺酸的母分子Y2R(bck)-0019類似的HEK293細胞中。經修飾抗體使用與用於抗體0019相同的方案純化。質譜分析顯示以實驗方式測定的去糖基化抗體的質量為142,001Da。此比計算質量超出259Da。還原之鏈具有以實驗方式測定的質量48,167Da(完全重鏈，計算值48,168Da，Cys=SH，C-Term=-K)及22,720Da(完全輕鏈，N55C，計算值22,720Da，Cys=SH)。在還原後確認該等鏈之序列。
抗體0155在100%DMF中使用2.5莫耳過量之含有HeliCar基元胺基酸序列的化合物偶合至HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體2形成共價複合物0156。
在SDS page(變性條件，參看圖14)上，僅在抗體0155上發現螢光；在還原條件下，僅小肽可見。
結果：
含有HeliCar基元胺基酸序列之螢光化合物與抗HeliCar基元胺基酸序列抗體的共價結合是成功的。總計約43%抗HeliCar基元胺基酸序列抗體共價結合至兩個HeliCar基元胺基酸序列，約40%抗HeliCar基元胺基酸序列抗體共價結合至一個HeliCar基元胺基酸序列，且約17%抗HeliCar基元胺基酸序列未結合。
包含兩個HeliCar基元胺基酸序列的結合物修飾達約50%。此物質尚未考慮定量。如針對起始物質已測定，不具有HeliCar基元胺基酸序列的抗體含有約128Da的兩個修飾。結合於一個HeliCar基元胺 基酸序列的抗體僅具有一個約128Da的修飾。
ii)含有HeliCar基元胺基酸序列之化合物與抗體0157之共價結合物
類似於抗體0155為通常表現為半胱胺酸化形式之抗體0157。質譜分析顯示以實驗方式測定的去糖基化抗體的質量為141,863Da。此比計算質量超出3Da。抗體主要以單高半胱胺醯化形式或二高半胱胺醯化形式存在。還原之鏈具有以實驗方式測定的質量48,168Da(完全重鏈，計算值48,168Da，Cys=SH，C-Term=-K)及22,777Da(完全輕鏈，N51C，計算值22,777Da，Cys=SH)。在還原後確認該等鏈之序列。
抗體0157與HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1的偶合不產生預期之共價複合物。預期泳道中未發現螢光，而是顯示於在此實驗中應為負值的參考泳道中(參看圖15)。
抗體0157與HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1一起培育。對照抗體0019與相同HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1一起培育。
結果：
含有HeliCar基元胺基酸序列之螢光化合物與抗HeliCar基元胺基酸序列抗體的共價結合不成功。不受此理論約束，假定在此情形下結合袋中之抗體半胱胺酸化過深以允許含有HeliCar基元胺基酸序列之螢光化合物有效結合且在適當位置傳遞親核硫醇基以攻擊C51。
b)與含有HeliCar基元胺基酸序列之重組多肽複合
當考慮與以重組方式產生之含有HeliCar基元胺基酸序列的多肽形成共價複合物時，基於HeliCar之方法尤其具有吸引力。
含有VL-N55C突變之抗體0155於HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1(AHLENEVARLCK；SEQ ID NO：146)之結合相較於替代(具有HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體2(AHLENEVARCKK； SEQ ID NO：147)的VL上之G51C)進行的好得多，進一步研究0155與含有HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1之多肽的結合。含有HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1(AHLENEVARLCK；SEQ ID NO：146)的多肽融合至N端。
已在大腸桿菌中產生具有C端離胺酸殘基缺失的含有HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1(0236；SEQ ID NO：152)之綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)分子LR8M且使用陰離子交換層析法及SEC之組合純化(參看例如WO 2011/032022)。
抗體0155與具有SEQ ID NO：152之C端離胺酸殘基缺失的含有HeliCar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1之綠膿桿菌外毒素分子LR8M共價結合。SEC層析圖展示於圖16中。藉由SDS-CE、卡立珀分析未還原樣品之結合效率(參看圖17)。
總計約4%抗HeliCar基元胺基酸序列抗體共價結合至兩個SEQ ID NO：152多肽，約41%抗HeliCar基元胺基酸序列抗體共價結合至一個SEQ ID NO：152多肽，且約55%抗HeliCar基元胺基酸序列未結合。
總之，抗HeliCar基元胺基酸序列單株抗體可用於經12-merHeliCar基元胺基酸序列的高親和力識別複合肽、具有肽連接基團之小分子以及重組蛋白質。具有摺疊為螺旋之傾向的肽可經修飾以模擬初始12-mer HeliCar基元胺基酸序列AHLENEVARLKK(SEQ ID NO：145)且此後可與抗HeliCar基元胺基酸序列單株抗體複合。除了高親和力複合之外，經形成穩定二硫鍵能夠與含有半胱胺酸之半胱胺酸變異體SEQ ID NO：145與在CDR中含有半胱胺酸之經修飾抗HeliCar基元胺基酸序列抗體共價結合。不同系統表現之重組蛋白質隨後可不使用具體反應條件但經自發二硫橋鍵改組活體外結合。
實例21 來自與含有BrdU之淨負荷複合的BrdU結合雙特異性抗體
應用SEC-MALLS分析來評估運鐵蛋白受體(TfR)-及溴去氧尿苷(BRDU)-結合雙特異性抗體(bsAb)是否能夠結合於含有BRDU之淨負荷以及結合到何種程度。因此，以2：1化學計量比率(350μg；2.5mg/ml)向TfR-BRDU bsAb中添加BRDU-DNA且在室溫下培育30分鐘形成bsAb/淨負荷複合物。吾人製備游離雙特異性抗體(2.5mg/ml)及游離BRDU-DNA(3.2mg/m)作為對照試劑。BRDU-DNA(BRDU-ACC AAG CCT AGA GAG GAG CAA TAC AAC AGT ACA TAT CGC GTG GTA AGC GT；SEQ ID NO：153)在DNA之5'末端含有每個DNA分子一個BRDU。複合物及對照試劑儲存於-80℃下直至分析。
藉此產生之複合物及對照試劑進行SEC-MALLS分析來鑑別及表徵游離雙特異性抗體、游離淨負荷及兩者之複合物。在裝備有Wyatt miniDawnTREOS/QELS及Optilab rEX偵測器之Dionex Ultimate 3000HPLC上進行SEC-MALLS分析。分析物以1mg/ml溶解於PBS緩衝液pH 7.4中，以0.5ml/min之流動速率施加至Superdex200 10/300GL管柱且用PBS緩衝液pH 7.4溶離60分鐘。
此等分析之結果(顯示於圖18)中指示含有BRDU之DNA與雙特異性抗體形成限定之複合物。MW為244.9kDa之此等複合物自管柱溶離(圖18A)且展示6.8nm之流體動力半徑(圖18B)，計算得到化學計量比為每個雙特異性抗體分子約兩個(1.8個)DNA分子。與此相比，偵測到MW為215.4kDa之游離雙特異性抗體且在6.2nm下測得其流體動力半徑。偵測到游離BRDU-DNA之MW為16.4kDa。
因此，顯示含有BRDU之DNA有效且經抗TfR/BRDU雙特異性抗體化學計量結合產生2：1莫耳比的複合物。
實例22 生物素結合雙特異性抗體結合於含有生物素之IgG
為了分析TfR/生物素雙特異性抗體是否能夠結合於單生物素化之 全長IgG及結合至何種程度，以2：1化學計量比(300μg，1.3mg/ml)向抗TfR/生物素雙特異性抗體添加特異性結合於pTau的IgG同型單生物素化抗體(生物素化之抗pTau抗體，BIO-pTau)，且在室溫下培育混合物30分鐘(形成雙特異性抗體-淨負荷複合物)。藉由製造在IgG同型之杵-臼雜二聚抗體之一條鏈的C端處具有Avi標籤的IgG衍生物來產生單生物素化IgG。Avi標籤以限定方式與一個生物素酶結合。
作為複合物形成之特異性的對照，將抗TfR/地高辛雙特異性抗體與BIO-pTau混合。作為另一對照試劑，製備游離雙特異性抗體及游離BIO-pTau兩者之等分試樣。複合物及對照試劑儲存於-80℃下直至分析。
產生之複合物進行SEC-MALLS分析以鑑別及表徵游離雙特異性抗體、游離BIO-pTau及其複合物。在裝備有Wyatt miniDawnTREOS/QELS及Optilab rEX偵測器之Dionex Ultimate 3000HPLC上進行SEC-MALLS分析。分析物以1-2mg/ml溶解於PBS緩衝液pH 7.4中，以0.5ml/min之流動速率施加至Superose 6 10/300GL管柱且用PBS緩衝液pH 7.4溶離60分鐘。
此等分析之結果(顯示於圖19)中指示BIO-pTau與雙特異性抗體形成限定之複合物。MW為501kDa之此等複合物自管柱溶離(圖19B)且展現8.0nm之流體動力半徑(圖19A)。與此相比，偵測到MW為205kDa之游離雙特異性抗體且在6.2nm下測得其流體動力半徑。偵測MW為150kDa之游離BIO-pTau且在5.5nm下量測其流體動力半徑。
藉由生物素與雙特異性抗體之生物素結合部分之間的相互作用特異性形成複合物，因為地高辛結合雙特異性抗體不與BIO-pTau形成複合物。
實例23 生物素化之抗pTau抗體與抗TfR/生物素雙特異性抗體之複合物的轉 胞吞作用
為了分析抗TfR/生物素雙特異性抗體是否有助於全長抗體淨負荷之轉胞吞作用及幫助至何種程度，如實例22中所述形成抗TfR/生物素雙特異性抗體(抗TfR/生物素bsAb-1及抗-TfR/生物素bsAb-2)與BIO-pTau之複合物且如上文(例如實例18)中所述進行轉胞吞作用分析。作為非特異性轉胞吞作用之對照，平行測試抗CD33/生物素雙特異性抗體與BIO-pTau之複合物以及游離BIO-pTau。在裝載細胞之後0、1、2、3、4及5小時後獲取頂部及底外側隔室之樣品及細胞溶解物之樣品。負載量始終為3.8μg/ml。
藉由ELISA量測生物素化之抗pTau抗體的量。因此，pTau蛋白質以500ng/ml塗佈至NUNC Maxisorb白色384孔培養盤上，在2-8℃下隔夜或在室溫下一小時。培養盤用含有2%BSA及0.05%Tween 20之PBS阻斷至少一小時。施加在含有0.5%BSA及0.05%Tween 20之PBS中高達1/729倍稀釋的樣品1.5-2小時，隨後聚-HRP40-抗生蛋白鏈菌素(Fitzgerald)30分鐘，且Super Signal ELISA Pico底物(Thermo Scientific)10分鐘，其均在室溫下進行。在同一培養盤上分析BIO-pTau抗體之標準稀釋液(100ng/ml-0.5pg/ml)。連續培育步驟之間，用含有0.1%Tween 20之PBS洗滌培養盤。
此等轉胞吞作用分析法之結果(圖20)顯示BIO-pTau與抗TfR/生物素bsAb-1或抗TfR/生物素bsAb-2之複合介導有效胞吞作用且隨後將BIO-pTau傳輸至底外側以及傳輸回頂部隔室。相比之下，BIO-pTau與抗CD33/生物素雙特異性抗體之複合物或游離BIO-pTau皆未有效內吞或轉胞吞，指示觀測到的轉胞吞作用由抗TfR/生物素雙特異性抗體與細胞表面上之TfR的特異結合引起。
實例24 雙特異性抗人類Tau(pS422)/生物素抗體與生物素化之抗TfR抗體Fab 片段之複合物的轉胞吞作用
類似於上文提出之實例，已闡明雙特異性抗人類Tau(pS422)/生物素抗體與生物素化之抗TfR抗體Fab片段的非共價複合物之轉胞吞作用。結果呈現於圖21中。為了分析，人類Tau(pS422)固定於培養盤上，抗人類CH2用作二次抗體且使用抗地高辛抗體POD結合物進行偵測。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
<120> 人類化抗Tau(pS422)抗體腦部穿梭子及其用途
<130> P32183
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<221> MISC_FEATURE
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<223> X=磷絲胺酸
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<220>
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<212> DNA
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 88
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 人類化抗生物素抗體HVR-H2
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<212> PRT
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<220>
<223> 人類化抗生物素抗體HVR-H3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗生物素抗體vH
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗生物素抗體HVR-L1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗生物素抗體HVR-L2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗生物素抗體HVR-L3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗生物素抗體VL
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<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 99
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<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 100
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<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 102
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 103
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<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 104
<210> 105
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗茶鹼抗體HVR-H1
<400> 105
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗茶鹼抗體HVR-H2
<400> 106
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗茶鹼抗體HVR-H3
<400> 107
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗茶鹼抗體VH
<400> 108
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗茶鹼抗體HVR-I1
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗茶鹼抗體HVR-L2
<400> 110
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗茶鹼抗體HVR-L3
<400> 111
<210> 112
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗茶鹼抗體VL
<400> 112
<210> 113
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 113
<210> 114
<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 114
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 115
<210> 116
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 116
<210> 117
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 117
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 118
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 119
<210> 120
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 120
<210> 121
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 121
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 122
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化CDR-H2
<400> 123
<210> 124
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 124
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 125
<210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 126
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 127
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 128
<210> 129
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化重鏈可變域
<400> 129
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化輕鏈可變域
<400> 130
<210> 131
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 131
<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 132
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 133
<210> 134
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC抗TfR1抗體
<400> 134
<210> 135
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與scFv抗地高辛抗體片段結合之HC抗TfR1抗體
<400> 135
<210> 136
<211> 706
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與scFv抗生物素抗體片段結合之HC抗TfR1抗體
<400> 136
<210> 137
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC抗TfR2抗體
<400> 137
<210> 138
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與scFv抗地高辛抗體片段結合之HC抗TfR2抗體
<400> 138
<210> 139
<211> 725
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與scFv抗生物素抗體片段結合之HC抗TfR2抗體
<400> 139
<210> 140
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 末端單生物素化或單地高辛化雙股DNA 50 mer淨負荷
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> n=生物素或地高辛
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n為a、c、g或t
<400> 140
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PrFor
<400> 141
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PrRev
<400> 142
<210> 143
<211> 34
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=酪胺酸醯胺
<400> 143
<210> 144
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PYY3-36 helicar
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=酪胺酸醯胺
<400> 144
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> 釀酒酵母
<400> 145
<210> 146
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> helicar基元變異體1
<400> 146
<210> 147
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> helicar基元變異體2
<400> 147
<210> 148
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗helicar抗體VH
<400> 148
<210> 149
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗helicar抗體VL
<400> 149
<210> 150
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗helicar抗體VL55C
<400> 150
<210> 151
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗helicar抗體VL51C
<400> 151
<210> 152
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合至假單胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)LR8M且具有GGG-肽連接基團及 C-末端K缺失之helicar基元胺基酸序列半胱胺酸變異體1
<400> 152
<210> 153
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRDU-DNA結合物
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(1)
<223> BRDU
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n為a、c、g或t
<400> 153

Claims (28)

  1. 一種特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體及抗血腦屏障受體/半抗原雙特異性抗體之非共價複合物的用途，其用於製造用以將該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體傳輸通過該血腦屏障之藥劑。
  2. 一種特異性結合於人類Tau(pS422)及半抗原之雙特異性抗體及半抗原化抗血腦屏障受體抗體之非共價複合物的用途，其用於製造用以將該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體傳輸通過該血腦屏障之藥劑。
  3. 一種包含特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體及雙特異性抗體之非共價複合物之用途，該雙特異性抗體具有特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合之該半抗原化抗體之半抗原的第一結合特異性以及特異性結合於血腦屏障受體之第二結合特異性，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之該半抗原化抗體藉由該雙特異性抗體之該第一結合特異性特異性結合，該非共價複合物用於製造用以將該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體傳輸通過該血腦屏障的藥劑。
  4. 一種包含特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體及雙特異性抗體之非共價複合物的用途，該雙特異性抗體具有特異性結合於人類Tau(pS422)之第一結合特異性及特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合之該半抗原化抗體之該半抗原的第二結合特異性，其中特異性結合於該血腦屏障受體之該半抗原化抗體藉由該雙特異性抗體之該第一結合特異性特異性結合，該非共價複合物用於製造用以將該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體傳輸通過該血腦屏障之藥劑。
  5. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該半抗原化抗體為生物素化抗體或地高辛化抗體(digoxigenylated antibody)。
  6. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該血腦屏障受體為運鐵蛋白受體(TfR)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(LRP8)。
  7. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該雙特異性抗體包含a)一個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及一個針對該血腦屏障受體之結合位點，或b)兩個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及一個針對該血腦屏障受體之結合位點，或c)一個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及兩個針對該血腦屏障受體之結合位點，或d)兩個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及兩個針對該血腦屏障受體之結合位點，或e)一個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及一個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或f)兩個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及一個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或g)一個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及兩個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或h)兩個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及兩個針對人類Tau(pS422)之結合位點，其中在b)、c)、f)及g)之情況下，該雙特異性抗體之一條重鏈包含臼突變(hole mutation)，且各別其他鏈包含杵突變(knob mutation)。
  8. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該雙特異性抗體具有特異性結合於該半抗原化抗體之該半抗原的兩種結合特異性(兩種抗 半抗原結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)之兩種結合特異性。
  9. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化的全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化的人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau。
  10. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，或b)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR。
  11. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體另外包含a)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR。
  12. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含 a)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，及在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR，或c)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR。
  13. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)SEQ ID NO：20之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或b)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變域，或c)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或d)SEQ ID NO：21之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域。
  14. 一種特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體及抗血腦屏障受體/半抗原雙特異性抗體之非共價複合物。
  15. 一種特異性結合於人類Tau(pS422)及半抗原之雙特異性抗體及半抗原化抗血腦屏障受體抗體之非共價複合物。
  16. 一種包含特異性結合於人類Tau(pS422)之半抗原化抗體及雙特異性抗體之非共價複合物，該雙特異性抗體具有特異性結合於與人類Tau(pS422)特異性結合的該半抗原化抗體之該半抗原的第一結合特異性及特異性結合於血腦屏障受體之第二結合特異性，其中特異性結合於人類Tau(pS422)之該半抗原化抗體藉由該雙特異性抗體之該第一結合特異性特異性結合。
  17. 一種包含特異性結合於血腦屏障受體之半抗原化抗體及雙特異性抗體之非共價複合物，該雙特異性抗體具有特異性結合於人類Tau(pS422)之第一結合特異性及特異性結合於與血腦屏障受體特異性結合的該半抗原化抗體之該半抗原的第二結合特異性，其中特異性結合於該血腦屏障受體之該半抗原化抗體藉由該雙特異性抗體之該第二結合特異性特異性結合。
  18. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其中該半抗原化抗體為生物素化抗體或地高辛化抗體。
  19. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其中該血腦屏障受體為運鐵蛋白受體(TfR)。
  20. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體包含a)一個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及一個針對該血腦屏障受體之結合位點，或b)兩個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及一個針對該血腦屏障受體之結合位點，或c)一個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及兩個針對該血腦屏障受體之結合位點，或d)兩個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及兩個針對該血腦屏障受體之結合位點，或e)一個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及一個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或f)兩個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及一個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或g)一個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及兩個針對人類Tau(pS422)之結合位點，或 h)兩個針對該半抗原化抗體之該半抗原的結合位點及兩個針對人類Tau(pS422)之結合位點，其中在b)、c)、f)及g)之情況下，該雙特異性抗體之一條重鏈包含臼突變，且各別其他鏈包含杵突變。
  21. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其中該雙特異性抗體具有特異性結合於該半抗原化抗體之該半抗原的兩種結合特異性(兩種抗半抗原結合特異性)及特異性結合於(人類)運鐵蛋白受體(兩種抗(人類)運鐵蛋白受體結合特異性)或低密度脂蛋白受體相關蛋白質8(抗低密度脂蛋白受體相關蛋白質8結合特異性)之兩種結合特異性。
  22. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其中該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體i)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不結合於全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化的全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合於在位置422處之絲胺酸處磷酸化的人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合於具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau。
  23. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其中該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，或b)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR。
  24. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其中該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體另外包含a)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR。
  25. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其中該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，及在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR，或c)在該重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在該輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR。
  26. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其中該特異性結合於人類Tau(pS422)之抗體包含a)SEQ ID NO：20之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或b)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變域，或c)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或d)SEQ ID NO：21之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域。
  27. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其用作藥劑。
  28. 如請求項14至17中任一項之非共價複合物，其用於治療阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)。
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