CN106456760A - 人源化的抗‑Tau(pS422)抗体脑穿梭物及其应用 - Google Patents

人源化的抗‑Tau(pS422)抗体脑穿梭物及其应用 Download PDF

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Abstract

本文报道了特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体与抗‑血脑屏障受体/半抗原双特异性抗体的非共价复合物。

Description

人源化的抗-Tau(pS422)抗体脑穿梭物及其应用
发明领域
本发明涉及特异结合SEQ ID NO：03的磷酸化的Tau片段的人源化的抗-Tau(pS422)抗体脑穿梭物构建体，及其用于治疗脑疾病的用途。
背景
人Tau(微管相关蛋白Tau(神经原纤维缠结蛋白，配对螺旋丝-Tau(Pairedhelical filament-Tau)，PHF-Tau))是主要在轴突中发现的神经元的微管相关蛋白，其功能是促进微管蛋白聚合并稳定微管。在人脑中发现八种同种型(同种型A，B，C，D，E，F，G，胎儿-Tau)，最长的同种型包含441个氨基酸(同种型F，Uniprot P10636-8)。Tau及其性质也被Reynolds，C.H.等人，J.Neurochem.69(1997)191-198描述。
处于超磷酸化形式的Tau是配对螺旋丝(PHF)的主要成分，配对螺旋丝(PHF)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)脑中神经原纤维损伤的结构单元。Tau可在其丝氨酸或苏氨酸残基被数种不同的激酶(包括GSK3β，cdk5，MARK和MAP激酶家族的成员)磷酸化。
Tau病(tauopathies)以Tau的异常超磷酸化为特征，并且根据Iqbal，K.等人(Biochim.Biophysica Acta 1739(2005)198-210)，Tau病是：
·阿尔茨海默病(Alzheimer disease)，包括该病的仅有缠结的形式(tangle-only form)
·唐氏综合征，成人病例(Down syndrome，adult cases)
·关岛型帕金森综合征痴呆复合征(Guam parkinsonism dementia complex)
·拳击员痴呆(Dementia pugilistica)
·皮克病(Pick disease)
·具有嗜银颗粒的痴呆(Dementia with argyrophilic grains)
·额颞叶痴呆(Fronto-temporal dementia)
·皮质基底节变性(Cortico-basal degeneration)
·苍白球脑桥黑质变性(Pallido-ponto-nigral degeneration)
·进行性核上性麻痹(Progressive supranuclear palsy)
·具有缠结的格-施-沙病(Gerstmann--Scheinker disease withtangles)。
迄今为止，在阿尔茨海默病的脑中已经发现近40个丝氨酸(S)/苏氨酸(T)磷酸化位点(Hanger，D.P.等人，J.Biol.Chem.282(2007)23645-23654)。在阿尔茨海默病中Tau病理学的发展与其磷酸化状态有关。然而，40个磷酸化位点的大部分不与疾病病理学相关，因为它们也在从健康的、胎儿脑组织提取的Tau中发现。仅有一些磷酸化位点是疾病状态特有的，推测其负责异常的、聚集和特征性的不溶性，它们定义了阿尔茨海默脑PHFs中的Tau(Morishima-Kawashima，M.等人，J.Biol.Chem.270(1995)823-829)。根据Pei，J.J.等人，(J.Alzheimer’s Disease 14(2008)385-392)，现有文献对于这些位点中的哪些是AD脑特异性的提供了有限且不清楚的信息。Pei使用一系列Tau的磷酸特异性抗体并测量它们在来自22个AD患者和10个对照的内侧颞叶皮质的匀浆中的水平。
Bussiere，T.等人(神经病理学学报(Acta Neuropathol.)97(1999)221-230)描述了Tau蛋白上磷酸化的丝氨酸422是在数种具有神经原纤维变性的疾病中发现的病理性表位。Augustinack，J.C.等人，(神经病理学学报(Acta Neuropathol)103(2002)26-35)描述了pS422与阿尔茨海默病中神经元病理学的严重性相关。Guillozet-Bongaarts，A.(神经化学杂志(J.Neurochem)97(2006)1005-1014)描述了Tau在丝氨酸422的磷酸化是PHFs成熟过程的一部分。也发现Tau pS422与阿尔茨海默病的各种转基因小鼠模型中的病理学发展相关。因此，Deters，N.等人在生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)379(2009)400-405中提到双重转基因Dom5/pR5小鼠显示7倍数目增加的含有特异性磷酸化病理性S422表位的海马神经元。Goetz，J.等人(科学(Science)293(2001)1491-1495)报道注射Aβ42原纤维的Tau P301L转基因小鼠脑中出现在S422处磷酸化的Tau。
EP 2 009 104涉及来自阿尔茨海默病PHFs的Tau蛋白磷酸化状态中存在的Tau蛋白的表位，以及所述表位用于产生特异性检测阿尔茨海默Tau蛋白的抗体中的应用。WO2002/062851和US 7,446,180涉及对异常截短形式的Tau蛋白具有特异性的抗体以及与阿尔茨海默病和相关Tau病有关的诊断和治疗方面。
WO 98/22120涉及治疗患有阿尔茨海默病的患者的方法，包括向该患者施用针对氨基酸约207至约222，氨基酸约224至约240和氨基酸约390至约408的磷酸化Tau片段的抗体的步骤。使用磷酸化Tau片段379-408[P-Ser396，404]来疫苗接种Tau转基因小鼠的动物研究在Asuni，A.A.等人，神经科学杂志(J.Neuroscience)27(2007)9115-9129中提及。US2008/0050383涉及通过施用Tau蛋白片段治疗和预防受试者中阿尔茨海默病或其它Tau病的方法。
Hasegawa，M.，等人(FEBS Lett.384(1996)25-30)报道了对微管相关蛋白tau中磷酸丝氨酸422特异的单克隆抗体(AP422)。
在WO 01/55725中，报道了用于体内诊断tau蛋白病变(tauopathy)和/或用于体内相对于非tau蛋白病变差异诊断tau蛋白病变的方法的特异识别tau的抗体和特异识别磷酸化-tau(181)的抗体。
在WO 02/027017中，报道了从具有磷酸化的丝氨酸的多肽免疫原制备的抗体。WO02/062851涉及对Tau蛋白的异常截短形式具有特异性的抗体以及与阿尔茨海默病和相关Tau蛋白病变相关的诊断和治疗方面。
在WO 2004/016655中，报道了对中枢神经系统(CNS)tau蛋白特异的抗体，其中所述抗体特异识别CNS tau蛋白，但不识别外周神经系统tau蛋白，并且其中所述抗体特异识别作为表位的由编码tau蛋白的基因的外显子4编码的氨基酸序列和由其外显子5编码的氨基酸序列之间的连接部分的氨基酸序列。
针对Tau pS422的单克隆抗体在例如EP 1 876 185中描述。针对Tau pS422的多克隆抗体是可商购的(例如ProSci Inc.和BiosourceInternational)。
在WO 2006/055178中，报道了抑制tau蛋白在Ser202/Thr205处的磷酸化的方法，所述方法包括将含有tau蛋白的样品与结合淀粉样蛋白β-衍生的扩散性配体的抗体或抗原结合片段相接触，由此抑制tau蛋白在Ser202/Thr205处的磷酸化。
在WO 2007/019273中报道了特异结合在tyr394和/或tyr310处磷酸化的tau的抗体制剂。在Asuni，A.A.等人，J.Neuroscience 27(2007)9115-9129中提及其中磷酸化的Tau片段379-408[P-Ser396，404]用于免疫接种Tau转基因小鼠的动物研究。
EP 2 009 104涉及来自阿尔茨海默病PHFs的Tau蛋白中以磷酸化状态出现的Tau蛋白的表位，并涉及所述表位用于产生特异检测阿尔茨海默病Tau蛋白的抗体的用途。
US 2008/0050383涉及通过施用Tau蛋白片段治疗和预防受试者中阿尔茨海默病或其他Tau蛋白病变的方法。
在WO 2010/037135中，报道了分离的、合成的或重组多肽或肽，其包含含有或由针对血脑屏障(BBB)受体的配体或等效物组成的第一结构域和含有或由减缓蛋白聚集体的聚集速率、抑制蛋白聚集体的形成，或逆转、消化或溶解蛋白聚集体的酶或组合物组成的第二结构域。在WO 2010/115843中报道了能够体外和/或体内识别和结合tau蛋白的抗体，特别是单克隆抗体或其功能部分。
在WO 2011/026031中，报道了特异结合tau寡聚物并且不结合可溶tau或tau纤丝的单克隆抗体或其片段，其用于治疗蛋白病变例如阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹和皮质基底节变性。在WO 2011/053565中报道了特异结合在Ser(238)和Thr(245)中的一个或多个处磷酸化的人tau蛋白的分离的抗体。
在WO 2012/045882中，报道了特异结合哺乳动物Tau蛋白上的磷酸化表位的抗体，其用于治疗神经变性病症如Tau蛋白病变，和用于治疗或缓解认知缺陷。在WO 2012/049570中报道了人单克隆抗-tau抗体或其tau结合片段。在WO 2012/106363中报道了用于预防或治疗受试者中阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的方法，其包括向需要对于阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的治疗的人施用抗体，所述抗体对tau蛋白的异常形式具有特异性，所述抗体对正常tau蛋白不显示结合和/或反应性，并且在有效预防或治疗阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的条件下和以有效预防或治疗阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的量施用。
在WO 2012/149365中，报道了对聚集的tau显示反应性并且对非聚集的Tau基本上不显示反应性的抗体，其中所述聚集的tau包含直接或通过接头在一个或多个半胱氨酸处彼此交联的至少两个tau蛋白。
在WO 2010/142423中报道了用于治疗Tau蛋白病变例如阿尔茨海默病的组合物，其包含结合Tau的抗体、在特异结合特定的磷酸化的Tau的特定位置处磷酸化的丝氨酸修饰的化合物及其片段以及载体。
在EP 1 876 185 A中，报道了识别磷酸化的多肽的抗体。在WO 2013/151762中，报道了人源化的tau抗体。在WO 2014/016737中，报道了针对人磷酸化的tau的新的鸡单克隆抗体及其用途。
在WO 2004/050016中，报道了通过人胰岛素受体递送药剂。Manich，G.，等人(Eur.J Pharm.Sci.49(2013)556-564)报道了小鼠中具有Fab′货物的抗-转铁蛋白受体抗体胞转穿过血脑屏障的研究。Dufes，C.，等人报道了转铁蛋白和转铁蛋白受体用于将治疗剂靶向递送至脑和癌细胞(Ther.Deliv.4(2013)629-640)。Feng，J-M.，等人，Neurometh.45(2010)15-34报道了受体-介导的穿过BBB的药物运输。Pardridge，W.，等人报道了利用分子特洛伊木马(Trojan horses)对生物药剂重新改造以递送至脑(Bioconjug.Chem.19(2008)1327-1338)。在WO 2004/045642中，报道了多特异性非共价复合物用于靶向递送治疗剂的应用。Ferrari，A.，等人报道了在组织培养中β-淀粉样蛋白诱导配对的螺旋细丝样tau细丝(J.Biol.Chem.278(2003)40162-40168)。Deters，N.，等人，Biochem.Biophys.Res.379(2009)400-405报道了PP2A活性的底物特异性减少增加了tau病理学。
概述
本发明提供抗-人Tau(pS422)抗体脑穿梭物构建体和使用它们的方法。
已经发现，与没与脑穿梭物模块缀合的抗-人Tau(pS422)抗体相比，抗-人Tau(pS422)抗体与脑穿梭物模块(诸如，例如，单价的单价抗-人转铁蛋白受体抗体或抗体片段)的共价缀合物在减少Tau-相关的病理学方面有效性较差。并且，脑穿梭物缀合物似乎是有(神经)毒性的。不希望收到该理论的束缚，这可能是由于抗体的作用模式和抗体靶标的细胞定位导致。
由此，本文报道了本文报道的非共价复合物用于转运功能性抗-Tau(pS422)抗体穿过血脑屏障的应用。
本文报道的构建体包含血脑屏障-穿梭物模块(BBB-穿梭物模块)，其是一种双特异性抗体，具有针对半抗原的第一结合特异性和针对血脑屏障受体(BBBR)的第二结合特异性。此类BBB-穿梭物模块识别血脑屏障上的可胞转的细胞表面靶标(诸如TfR，LRPs或其他靶标＝BBBR)，并且同时结合半抗原化的有效负载物。
已经发现不必须满足关于结合价态、抗体形式、BBBR结合亲和性的其他的要求。
进一步发现，为了调节半抗原化的有效负载物的胞转，不需要本文报道的基于双特异性抗体的穿梭物模块整体，即，作为复合物从血脑屏障的内皮细胞释放。相反，复合到/非共价结合到基于双特异性抗体的穿梭物模块上的半抗原化的有效负载物：i)在BBB细胞内，即，在细胞内囊泡系统中内在化之后，从基于双特异性抗体的穿梭物模块上释放，ii)与所述穿梭物模块分离，并且iii)随后由BBB细胞胞吐进入脑(将所述双特异性抗体留在BBB细胞内)。
本文报道的基于双特异性抗体的穿梭物模块在BBBR结合特异性价态以及BBBR结合特异性亲和性方面非常多变。同时，其能够允许有效负载物从穿梭物模块上释放。
本文报道的一个方面是i)特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体与ii)抗-血脑屏障受体/半抗原双特异性抗体的非共价复合物。
所述抗-血脑屏障-受体/半抗原双特异性抗体是一种双特异性抗体，其包含特异性结合半抗原(例如，特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原)的第一结合特异性和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性。
本文报道的一个方面是i)特异性结合人Tau(pS422)和半抗原的双特异性抗体与ii)半抗原化的抗-血脑屏障受体抗体的非共价复合物。
所述特异性结合人Tau(pS422)和半抗原的抗体是双特异性抗体，其包含特异性结合半抗原(例如，特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原)的第一结合特异性，和特异性结合人Tau(pS422)的第二结合特异性。
本文报道的一个方面是包含下述的非共价复合物：i)特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体和ii)双特异性抗体，其具有特异性结合半抗原化抗体的半抗原的第一结合特异性(所述半抗原化抗体特异性结合人Tau(pS422))和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体通过所述双特异性抗体的第一结合特异性特异性结合。
本文报道的一个方面是包含下述的非共价复合物：i)半抗原化抗体，其特异性结合血脑屏障受体，和ii)双特异性抗体，其具有特异性结合人Tau(pS422)的第一结合特异性和特异性结合半抗原化抗体的半抗原的第二结合特异性(所述半抗原化抗体特异性结合血脑屏障受体)，其中特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体通过所述双特异性抗体的第二结合特异性特异性结合。
本文报道的一个方面是特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体与抗-血脑屏障受体/半抗原双特异性抗体的非共价复合物用于转运特异性结合人Tau(pS422)的抗体穿过血脑屏障的应用。
本文报道的一个方面是特异性结合人Tau(pS422)和半抗原的双特异性抗体与半抗原化的抗-血脑屏障受体抗体的非共价复合物用于转运特异性结合人Tau(pS422)的抗体穿过血脑屏障的应用。
本文报道的一个方面是包含特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体与双特异性抗体的非共价复合物用于转运特异性结合人Tau(pS422)的抗体穿过血脑屏障的应用，所述双特异性抗体具有特异性结合半抗原化抗体的半抗原的第一结合特异性(所述半抗原化抗体特异性结合人Tau(pS422))和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体通过所述双特异性抗体的第一结合特异性特异性结合。
本文报道的一个方面是包含特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体与双特异性抗体的非共价复合物用于转运特异性结合人Tau(pS422)的抗体穿过血脑屏障的应用，所述双特异性抗体具有特异性结合人Tau(pS422)的第一结合特异性和特异性结合半抗原化抗体的半抗原的第二结合特异性(所述半抗原化抗体特异性结合血脑屏障受体)，其中所述特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体通过所述双特异性抗体的第一结合特异性特异性结合。
在一个实施方案中，所述半抗原化抗体选自由下述组成的组：生物素化的抗体(biotinylated antibody)，茶碱化的抗体(theophyllinylated antibody，)，洋地黄毒苷化的抗体(digoxigenylated antibody)，碳硼烷化的抗体(carboranylated antibody)，荧光素化的抗体(fluoresceinylatedantibody)，helicarylated的抗体(helicarylatedantibody)和溴脱氧尿苷化的抗体(bromodeoxyuridinylated antibody)。在一个优选的实施方案中，所述半抗原化抗体是生物素化的抗体或洋地黄毒苷化的抗体。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体选自由下述组成的组：特异性结合人Tau(pS422)的生物素化的抗体，特异性结合人Tau(pS422)的茶碱化的抗体，特异性结合人Tau(pS422)的洋地黄毒苷化的抗体，特异性结合人Tau(pS422)的碳硼烷化的抗体，特异性结合人Tau(pS422)的荧光素化的抗体，特异性结合人Tau(pS422)的helicarylated的抗体和特异性结合人Tau(pS422)的溴脱氧尿苷化的抗体。在一个优选的实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体是特异性结合人Tau(pS422)的生物素化的抗体或特异性结合人Tau(pS422)的洋地黄毒苷化的抗体。
在一个实施方案中，所述特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体选自由下述组成的组：特异性结合血脑屏障受体的生物素化的抗体，特异性结合血脑屏障受体的茶碱化的抗体，特异性结合血脑屏障受体的洋地黄毒苷化的抗体，特异性结合血脑屏障受体的碳硼烷化的抗体，特异性结合血脑屏障受体的荧光素化的抗体，特异性结合血脑屏障受体的helicarylated抗体和特异性结合血脑屏障受体的溴脱氧尿苷化的抗体。在一个优选的实施方案中，所述特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体是特异性结合血脑屏障受体的生物素化的抗体或特异性结合血脑屏障受体的洋地黄毒苷化的抗体。
在一个实施方案中，所述血脑屏障受体选自由下述组成的组：转铁蛋白受体(TfR)，胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体(IGF受体)，低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，和肝素-结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。在一个优选的实施方案中，所述血脑屏障受体是转铁蛋白受体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体是包含两个结合位点的全长抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体是已经融合了一个或两个scFvs或scFabs或CrossFabs或scCrossFabs并且包含三个或四个结合位点的全长抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体是抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体片段选自F(ab')2和双抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体是人源化的抗体或人抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体没有效应子功能。在一个实施方案中，所述双特异性抗体没有功能性Fc-区。在一个实施方案中，所述双特异性抗体没有Fc-区。在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有包含突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的Fc-区，其中位置按照Kabat Fc-区编号(Kabat EU索引)确定。在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有包含突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的Fc-区，其中位置按照Kabat Fc-区编号(Kabat EU索引)确定。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：
a)一个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
b)两个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
c)一个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点，或
d)两个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：
a)一个针对特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
b)两个针对特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
c)一个针对特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和和两个针对血脑屏障受体的结合位点，或
d)两个针对特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：
a)一个针对特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
b)两个针对特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
c)一个针对特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
d)两个针对特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对人Tau(pS422)的结合位点。
在前述实施方案的情形b)和c)中，所述双特异性抗体的一条重链包含孔洞突变，并且相应的另一条链包含凸起突变。
在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含两个针对特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点。
在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含两个针对特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对人Tau(pS422)的结合位点。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两个特异性结合半抗原化抗体的半抗原的结合特异性(所述半抗原化抗体特异性结合人Tau(pS422))(两个抗-半抗原结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8的结合特异性(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两个特异性结合半抗原化抗体的半抗原的结合特异性(所述半抗原化抗体特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-半抗原结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8)(两个抗-半抗原结合特异性))和两个特异性结合人Tau(pS422)的结合特异性。
在一个实施方案中，特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ IDNO：66的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是人源化的结合特异性。
在一个实施方案中，特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))包含上述实施方案中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
在一个实施方案中，特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ IDNO：74的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：68或76的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的重链可变结构域(VH)。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-洋地黄毒苷抗体保留结合洋地黄毒苷的能力。在某些实施方案中，在SEQ IDNO：68或76中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。任选地，所述洋地黄毒苷结合特异性包含SEQID NO：68或76中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其进一步包含与SEQ ID NO：72或80的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-洋地黄毒苷抗体保留结合洋地黄毒苷的能力。在某些实施方案中，在SEQID NO：72或80中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。任选地，所述洋地黄毒苷结合特异性包含SEQ ID NO：72或80中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合生物素化的抗体的生物素的第一结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))(抗-生物素结合特异性；抗-BI结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两个特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))(两个抗-生物素结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
在一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ IDNO：85的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是人源化的结合特异性。
在一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))包含上述实施方案中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
在一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ IDNO：93的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：84或92的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-生物素抗体保留结合生物素的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：84或92中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。任选地，所述生物素结合特异性包含SEQ ID NO：84或92中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO：88或96的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-生物素抗体保留结合生物素的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：88或96中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。任选地，所述生物素结合特异性包含SEQ ID NO：88或96中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的第一结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))(抗-茶碱结合特异性；抗-THEO结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两个特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所示茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))(两个抗-茶碱结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
在一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是人源化的结合特异性。
在一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))包含上述实施方案中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
在一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ IDNO：109的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：100或108的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-茶碱抗体保留结合茶碱的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：100或108中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。任选地，所述茶碱结合特异性包含在SEQ ID NO：100或108中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO：104或112的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-茶碱抗体保留结合茶碱的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：104或112中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。任选地，所述茶碱结合特异性包含SEQ ID NO：104或112中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的第一结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))(抗-荧光素结合特异性；抗-FLUO结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两个特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))(两个抗-生物素结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
在一个实施方案中，所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQID NO：114的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：118的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是人源化的结合特异性。
在一个实施方案中，所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))包含上述实施方案中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
在一个实施方案中，所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-荧光素抗体保留结合荧光素的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：116中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。任选地，所述荧光素结合特异性包含SEQ ID NO：116中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO：120的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-荧光素抗体保留结合荧光素的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：120中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。任选地，所述荧光素结合特异性包含SEQ ID NO：120中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的第一结合特异性(抗-溴脱氧尿苷结合特异性；抗-BrdU结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两个特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的结合特异性(两个抗-溴脱氧尿苷结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
在一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是人源化的结合特异性。
在一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))包含上述实施方案中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
在一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：121或122的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：123或124的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：129或131的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-溴脱氧尿苷抗体保留结合溴脱氧尿苷的能力。在某些实施方案中，在SEQID NO：129或131中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。任选地，所述溴脱氧尿苷结合特异性包含SEQ ID NO：129或131中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO：130或132的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-溴脱氧尿苷抗体保留结合溴脱氧尿苷的能力。在某些实施方案中，在SEQID NO：130或132中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。任选地，所述溴脱氧尿苷结合特异性包含SEQ ID NO：130或132中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体包含在所述半抗原与所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体之间的接头。在一个实施方案中，所述接头是肽接头。在一个实施方案中，所述接头是化学接头(非肽接头)。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是全长抗体。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
i)特异性结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异性结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau。
相对于未磷酸化的野生型人Tau和Tau突变体S422A，如本文报道的特异性结合人Tau(pS422)的抗体显示关于在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau的选择性。所述未磷酸化的野生型人Tau和所述Tau突变体S422A分别根本不被结合或以较低的亲和力被结合。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体还
a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或
b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR，或
c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08，09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含：
a)SEQ ID NO：20的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或
b)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：16的轻链可变结构域，或
c)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或
d)SEQ ID NO：21的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域。
在一个实施方案中，所述非共价复合物用于治疗阿尔茨海默病。
在一个实施方案中，所述复合物中的两个抗体都是效应子功能沉默的。在一个实施方案中，所述复合物中的两个抗体都不具有效应子功能。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体具有如下EC50值：
a)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段，6ng/mL或更小，和/或
b)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)，4.5ng/mL或更小，和/或
c)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体，30ng/mL或更小，和/或
d)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau，125ng/mL或更小。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)的抗体不结合人Tau(SEQ ID NO：01)。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是结合人Tau(pS422)并且具有以下性质的抗体片段：
i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是
a)人IgG1亚类的全长抗体，或
b)人IgG4亚类的全长抗体，或
c)具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的全长抗体，
d)具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类全长抗体，
e)在两条重链中都具有突变L234A、L235A和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG1亚类的全长抗体，或
f)在两条重链中都具有突变S228P和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG4亚类的全长抗体。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两条抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：10的HVR，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两条抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的HVR，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：10的HVR，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：05和SEQ ID NO：15的HVR，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：10的HVR，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的HVR，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
在所有方面的一个优选实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体在重链可变结构域中4、24和78位具有缬氨酸残基。
在所有方面的一个优选实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体在重链可变结构域中71位具有精氨酸残基。
本文报道的一个方面是包含本文报道的非共价复合物和药用载体的药物制剂。
在一个实施方案中，所述药物制剂还包含另外的治疗剂。
在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是抗-淀粉样蛋白治疗剂。在一个实施方案中，所述抗-淀粉样蛋白治疗剂是抗人α-突触核蛋白抗体或抗-Aβ抗体。在一个实施方案中，所述抗-人α-突触核蛋白抗体或所述抗-Aβ抗体是半抗原化的。在一个实施方案中，所述抗-人α-突触核蛋白抗体或所述抗-Aβ抗体与抗-血脑屏障受体/半抗原双特异性抗体复合。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物，其用作药物。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物，其用于治疗阿尔茨海默病。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物，其用于治疗前驱(prodromal)阿尔茨海默病。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物，其用于治疗轻度阿尔茨海默病。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物，其用于减轻Tau(pS422)-诱导的神经变性。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物，其用于维持认知和功能。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物，其用于减缓认知和功能下降的速率。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物在制备药物中的用途。
在一个实施方案中，所述药物用于治疗阿尔茨海默病。
在一个实施方案中，所述药物用于治疗前驱阿尔茨海默病。
在一个实施方案中，所述药物用于治疗轻度阿尔茨海默病。
在一个实施方案中，所述药物用于减轻Tau(pS422)诱导的神经变性。
在一个实施方案中，所述药物用于维持认知和功能。
在一个实施方案中，所述药物用于减缓认知和功能下降速率。
本文报道的一个方面是治疗患有阿尔茨海默病的个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的如本文报道的非共价复合物。
本文报道的一个方面是减轻个体中Tau(pS422)诱导的神经变性的方法，其包括向所述个体施用有效量的本文报道的非共价复合物以减轻Tau(pS422)诱导的神经变性。
本文报道的一个方面是维持个体中认知和功能的方法，其包括向所述个体施用有效量的本文报道的非共价复合物以维持认知和功能。
本文报道的一个方面是减缓个体中认知和功能下降速率的方法，其包括向所述个体施用有效量的本文报道的非共价复合物以减缓认知和功能下降速率。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物在减轻Tau(pS422)诱导的神经变性方面的用途。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物在维持认知和功能方面的用途。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物在减缓认知和功能下降速率中的用途。
本文报道的非共价复合物可用于治疗阿尔茨海默病。
使用本文报道的非共价复合物可以实现阿尔茨海默病和神经病理学的进程的抑制/减轻。
本文报道的非共价复合物可以用于保护免于发展为阿尔茨海默病或甚至用于终止阿尔茨海默病的进展。
在一个实施方案中，本文报道的非共价复合物i)结合Tau(pS422)转基因小鼠和阿尔茨海默病患者的脑切片上的Tau(pS422)；和/或标记Tau(pS422)转基因细胞中的Tau(pS422)。
本文报道的一个方面是特异性结合人Tau(pS422)中SEQ ID NO：03的氨基酸序列的非共价复合物。
本文报道的非共价复合物特异性结合/识别人Tau(pS422)的早期和晚期疾病相关形式。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物用于预防人Tau(pS422)-相关阿尔茨海默病扩散的用途。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物用于减少溶酶体膜分解的用途。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物用于针对人Tau(pS422)诱导的去稳定和/或分解作用使溶酶体膜稳定的用途。
本文报道的一个方面是本文报道的非共价复合物用于防止阿尔茨海默病进展的用途。
本文报道的非共价复合物通过抗体介导的对人Tau(pS422)接种和细胞间扩散的抑制而行使功能。
本文报道的非共价复合物通过结合人Tau(pS422)来保护溶酶体免于纤维损伤。
附图简述
图1：兔和人源化的轻链可变结构域的序列比对；CDR用框框出。
图2：兔和人源化的重链可变结构域的序列比对；CDR用框框出。
图3：人源化的VH和VL的不同组合与下述的生化结合：(A)磷酸化的tau肽，(B)磷酸化的全长人tau，(C)非磷酸化的tau肽，(D)非磷酸化的全长人tau；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH20/VL22，(4)＝VH32/VL22，(5)＝VH33/VL22；包被浓度：磷酸化的tau肽：50ng/ml，所有其他靶标：1μg/ml；(如果磷酸化的tau肽以1μg/ml包被，则获得类似的结果(数据未显示))。
图4：人源化的VH和VL的不同组合与下述的生化结合：(A)＝全长人tau S422A突变体，(B)＝聚集的人Tau(pS422)；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH20/VL22，(4)＝VH32/VL22，(5)＝VH33/VL22；包被浓度：磷酸化的tau肽：50ng/ml，所有其他靶标：1μg/ml；(如果磷酸化的tau肽以1μg/ml包被，则获得类似的结果(数据未显示))。
图5：显示选择的人源化的VH/VL组合的选择性的蛋白质印迹；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH20/VL22，(4)＝VH32/VL22，(5)＝VH33/VL22。
图6：对阿尔茨海默病患者的脑提取物中的超磷酸化的tau的结合；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH32/VL22。
图7：血脑屏障-穿梭物模块组成的示意图。
图8：实施例14制备的血脑屏障-穿梭物模块的SEC模式和SDS PAGE。
图9：FACS分析的结果，所述分析使用hCMEC/D3细胞作为表达TfR的BBB-来源的细胞系和Dig-Cy5作为荧光有效负载物。
图10：结合半抗原的双特异性抗体血脑屏障-穿梭物模块从内皮细胞的胞转和释放；A：抗-CD33-dig抗体transwell测定，huFc ELISA；B：抗-TfR1抗体transwell测定，huFcELISA；C：抗-TfR1抗体-Dig transwell测定，huFc ELISA；D：抗-TfR2抗体transwell测定，huFc ELISA；E：抗-TfR2-抗体Dig transwell测定，huFc ELISA。
图11：A：双特异性抗体-半抗原化的有效负载物非共价复合物的组成和定量；B：使用具有减小的针对TfR的亲和力的双特异性抗体由内皮细胞胞转和释放半抗原化的有效负载物(A：抗-CD33-Dig+Dig-DNA transwell测定，qPCR；B：抗-CD33-Bio+Bio-DNA transwell测定，qPCR，C：抗-TfR2-Dig+Dig-DNA transwell测定，qPCR，D：抗-TfR2-Bio+Bio-DNAtranswell测定，qPCR)。
图12：使用具有高的针对TfR的亲和力的非释放性血脑屏障-穿梭物模块由内皮细胞胞转和释放半抗原化的有效负载物；A：抗-TrF1-Dig+Dig-DNA transwell测定，qPCR，B：抗-TfR1抗体-Bio+Bio-DNA transwell测定，qPCR)。
图13：半抗原化的有效负载物由具有高的针对TfR的亲和力的非释放性血脑屏障-穿梭物模块的结合、摄入和细胞内分离；显示的是在37℃温育三小时后，在hCMEC/D3细胞中双特异性抗体-复合的半抗原化的荧光有效负载物的亚细胞分离。DIG-DNA-CY5或Bio-DNA-Cy5(深灰色)出现在截然不同的细胞内囊泡中，不与内在化的抗-洋地黄毒苷-或抗-生物素-结合性双特异性抗体(中等灰色)重叠。
图14：SDS PAGE凝胶：使用2.5摩尔过量的包含HeliCar基序氨基酸序列的化合物，抗体0155与HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2的偶联形成共价复合物0156；1＝HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2；2＝抗体0019；3＝抗体0155。
图15：抗体0157与HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的偶联的SDS PAGE凝胶；1＝HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(氧化的)；2＝对照偶联(氧化的)；3＝共价缀合物(氧化的)；4＝分子量标记；5＝共价缀合物(还原的)；6＝对照偶联(还原的)；7＝HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(还原的)。
图16：抗体0155、SEQ ID NO：28缺失C端赖氨酸残基包含假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素分子LR8M的HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1及它们的共价缀合物的SEC层析图。
图17：通过SDS-CE、测径器(Caliper)分析未还原样品的缀合效率。
图18：A：进行SEC-MALLS分析以鉴定和表征抗-TfR/BRDU双特异性抗体与BRDU-标记的DNA的复合物以及游离的双特异性抗体和游离的BRDU-DNA。复合物在244.9kDa的MW处从柱上洗脱下来，游离的双特异性抗体在215.4kDa的MW处检测到，并且游离的BRDU-DNA在16.4kDa的MW处检测到。
B：进行SEC-MALLS分析以鉴定和表征抗-TfR/BRDU双特异性抗体与BRDU-标记的DNA的复合物以及游离的双特异性抗体和游离的BRDU-DNA。复合物展现出6.8nm的水力学半径(hydrodynamic radius)，而游离的双特异性抗体展现出6.2nm的水力学半径。
图19：A：进行SEC-MALLS分析以鉴定和表征抗-TfR/生物素双特异性抗体与生物素-标记的抗-pTau抗体的复合物以及游离的双特异性抗体和游离的生物素-标记的抗-pTau抗体。复合物展现出8.0nm的水力学半径，而游离的双特异性抗体展现出6.2nm的水力学半径，并且游离的生物素-标记的抗-pTau抗体展现出5.5nm的水力学半径。
B：进行SEC-MALLS分析以鉴定和表征抗-TfR/生物素双特异性抗体与生物素-标记的抗-pTau抗体的复合物以及游离的双特异性抗体和游离的生物素-标记的抗-pTau抗体。复合物在501kDa的MW处从柱上洗脱下来，游离的双特异性抗体在205kDa的MW处检测到，并且游离的生物素-标记的抗-pTau抗体在150kDa的MW处检测到。
C：如果使用错误的半抗原和抗-半抗原抗体组合，则不形成复合物。
图20：生物素-标记的抗-pTau抗体与抗-CD33/生物素双特异性抗体的复合物(左上图)和游离的生物素-标记的抗-pTau抗体(右上图)不被有效地胞吞(细胞裂解物，线条)，并且不被转运到底外侧(左侧柱，浅灰色)或顶部(右侧柱，黑色)区室中(上样3.8μg/ml)。
生物素-标记的抗-pTau抗体与抗-TfR/生物素双特异性抗体1(左下图)或抗-TfR/生物素双特异性抗体2(右下图)的复合调控有效的胞吞作用(细胞裂解物，线条)以及后续将生物素-标记的抗-pTau抗体转运到底外侧(左侧柱，浅灰色)以及转运回顶部(右侧柱，黑色)区室中(上样3.8μg/ml)。
图21：双特异性的抗-人Tau(pS422)/生物素抗体与生物素化的抗-TfR抗体Fab片段的非共价复合物的胞转测定的结果。
序列对应表
可变结构域 CDR1 CDR2 CDR3 完整序列
VL00 04 05 06 07
VL01 04 05 06 32
VL09 31 23 06 33
VL12 30 22 06 34
VL15 30 22 24 35
VL16 30 22 25 36
VL17 12 05 06 37
VL19 12 05 06 38
VL21 12 05 15 16
VL22 13 14 15 17
VL28 13 05 29 39
VL33 13 05 27 40
VL35 13 05 27 41
VL39 13 05 26 42
VL40 13 05 29 43
VL41 13 05 28 44
VL42 13 05 28 45
VH00 08 09 10 11
VH01 08 09 10 46
VH02 08 09 10 47
VH03 08 09 10 48
VH04 08 09 10 49
VH14 08 09 10 50
VH15 08 09 10 51
VH18 08 18 10 52
VH19 08 18 10 53
VH20 08 18 10 20
VH22 08 18 10 54
VH23 08 18 10 55
VH24 08 18 10 56
VH31 08 09 10 57
VH32 08 09 10 19
VH33 08 09 10 21
发明实施方案详述
I.定义
用在本文中时，重链和轻链的所有的恒定区和结构域的氨基酸位置按照Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)中所述的Kabat编号系统进行编号，并且在本文中称为“按照Kabat编号”。具体地，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1，铰链，CH2和CH3)。
用于本文目的的“接受体人构架”是包含来源于人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“来源于”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接受体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，所述氨基酸变化为10个以下、9个以下、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下或2个以下。在一些实施方案中，VL接受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点及其结合伙伴(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文使用的，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伙伴Y的亲和力通常可以由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域中已知的一般方法测量，包括本文中描述的那些。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案在下文中描述。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有这些改变的母体抗体相比，在一个以上高变区(HVRs)中具有一个以上该改变的抗体，该改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。
术语“抗-人Tau(pS422)抗体”和“特异性结合人Tau(pS422)的抗体”是指能够以足够的亲和力结合人Tau(pS422)的抗体，从而所述抗体可在靶向人Tau(pS422)中用作诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，如例如，通过放射免疫测定(RIA)测量的，抗人Tau(pS422)抗体对不相关、非-人Tau(pS422)蛋白的结合程度小于抗体对人Tau(pS422)的结合的约10％。
以最宽泛的意义使用本文中的术语″抗体″，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示所希望的抗原-结合活性即可。
″抗体片段″是指不是完整抗体的分子，其包含结合完整抗体结合的抗原的完整抗体的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；CrossFabs；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“生物素”，缩写“BI”表示5-[(3aS，4S，6aR)-2-氧六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]戊酸。生物素也称为维生素H或辅酶R。
术语“特异性结合人Tau(pS422)的生物素化的抗体”表示包含生物素结构部分、任选地接头和特异性结合人Tau(pS422)的抗体的缀合的实体。所述接头可以是任意的接头，诸如例如，肽接头或化学接头。
术语“双特异性抗体”表示具有两种不同的(抗原/半抗原)结合特异性的抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体特异性针对两种不同的抗原，即，半抗原和非半抗原的抗原。
术语“溴脱氧尿苷”，缩写“BrdU”，表示5-溴-2’-脱氧尿苷。溴脱氧尿苷还称为溴甙(broxuridine)、BudR、BrdUrd。
术语“特异性结合人Tau(pS422)的溴脱氧尿苷化的抗体”表示包含溴脱氧尿苷结构部分、任选地接头和特异性结合人Tau(pS422)的抗体的缀合的实体。所述接头可以是任意的接头，诸如例如，肽接头或化学接头。
术语“洋地黄毒苷”，缩写“DIG”，表示3-[(3S，5R，8R，9S，10S，12R，13S，14S，17R)-3，12，14-三羟基-10，13-二甲基-1，2，3，4，5，6，7，8，9，11，12，15，16，17-十四氢-环戊基[a]-菲-17-基]-2H-呋喃-5-酮(CAS号1672-46-4)。洋地黄毒苷(DIG)是一种专属在植物紫花毛地黄(Digitalis purpurea)、东方毛地黄(Digitalis orientalis)和狭叶毛地黄(Digitalis lanata)(指顶花(foxgloves))的花和叶中发现的类固醇(Polya，G.，Biochemical targets of plant bioactive compounds(植物生物活性化合物的生化靶标)，CRC Press，New York(2003)p.847)。
术语“特异性结合人Tau(pS422)的洋地黄毒苷化的抗体”表示包含洋地黄毒苷结构部分、任选地接头和特异性结合人Tau(pS422)的抗体的缀合的实体。所述接头可以是任意的接头，诸如例如，肽接头或化学接头。
术语“荧光素”，缩写“FLUO”，表示6-羟基-9-(2-羧基苯基)-(3H)-呫吨-3-酮，备选地，2-(6-羟基-3-氧-(3H)-呫吨-9-基)-苯甲酸。荧光素还称为间苯二酚酞，C.I.45350，溶剂黄94，7号D&C黄，angiofluor，日本黄201(Japan yellow 201)或皂黄(soap yellow)。
术语“特异性结合人Tau(pS422)的荧光素化的抗体”表示包含荧光素结构部分、任选地接头和特异性结合人Tau(pS422)的抗体的缀合的实体。所述接头可以是任意的接头，诸如例如，肽接头或化学接头。
术语“茶碱”，缩写“THEO”，表示1，3-二甲基-7H-p嘌呤-2，6-二酮。茶碱还称为二甲黄嘌呤。
术语“特异性结合人Tau(pS422)的茶碱化的抗体”表示包含茶碱结构部分、任选地接头和特异性结合人Tau(pS422)的抗体的缀合的实体。所述接头可以是任意的接头，诸如例如，肽接头或化学接头。
术语“半抗原”表示仅当连接到大的载体(诸如蛋白)上时才能引发免疫应答的小分子。示例性的半抗原是苯胺，邻-、间-和对-氨基苯甲酸，苯醌，组氨酸-琥珀酰-甘氨酸(HSG)，肼苯哒嗪，氟烷(halothane)，铟-DTPA，荧光素，生物素，洋地黄毒苷，茶碱，溴脱氧尿苷和二硝基苯酚。在一个实施方案中，所述半抗原是生物素或洋地黄毒苷或茶碱或荧光素或溴脱氧尿苷。
术语“特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体”表示(共价)缀合到特异性结合人Tau(pS422)的抗体上的半抗原。活化的半抗原衍生物可以用作形成所述缀合物的起始原料。在一个实施方案中，半抗原通过接头缀合到(在一个实施方案中，通过其3-羟基)特异性结合人Tau(pS422)的抗体上。在一个实施方案中，接头包括：a)一个或多个(在一个实施方案中，3-6个)亚甲基-羧基-甲基基团(-CH2-C(O)-)，和/或b)1-10个(在一个实施方案中，1-5个)氨基酸残基(在一个实施方案中，选自甘氨酸，丝氨酸，谷氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，ε-氨基己酸或赖氨酸)，和/或c)一种或多种(在一个实施方案中，一种或两种)具有结构式NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH的化合物，其中n是2或3，x是1-10，在一个实施方案中是1-7。最后的元件导致(至少部分)式-NH-[(CH2)nO]xCH2-CH2-C(O)-的接头(部分)。所述化合物的一种实例是，例如，12-氨基-4，7，10-三氧杂十二酸(产生TEG(三乙二醇)接头)。在一个实施方案中，所述接头还包含马来酰亚胺基团。另外，其能够在空间上促进抗-半抗原抗体与特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化的抗体的结合。在一个实施方案中，接头缀合到特异性结合人Tau(pS422)的抗体的氨基酸的侧链上(例如，通过氨基或巯基缀合到赖氨酸或半胱氨酸侧链上)。在一个实施方案中，接头缀合到特异性结合人Tau(pS422)的抗体的氨基端或羧基端。接头与特异性结合人Tau(pS422)的抗体的缀合位置典型地选择在与所述接头的缀合不影响特异性结合人Tau(pS422)的抗体的生物学活性的区域中。因此，接头的连接位置取决于负责特异性结合人Tau(pS422)的抗体的生物学活性的相关结构元件。半抗原连接的特异性结合人Tau(pS422)的抗体的生物学活性可以在缀合之前和之后在体外测定中进行测试。
术语″嵌合″抗体是指其中重链和/或轻链的部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同来源或物种的抗体。
抗体的“类型”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类型的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ、和μ。
“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随着抗体类型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
药剂，例如，药物制剂的″有效量″，是指在需要的剂量和时期有效获得所需治疗或预防结果的量。
本文中的术语“Fc-区”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区域。术语包括天然序列Fc-区和变体Fc-区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc-区从Cys226，或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc-区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有说明，Fc-区或恒定区中的氨基酸残基编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中描述的。
″框架″或″FR″是指除了高变区(HVR)残基的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中通常以以下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
本文中可交换地使用术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”，是指具有与天然抗体结构基本上类似的结构或具有含有如本文定义的Fc-区的重链的抗体。术语“全长抗体”表示由通过二硫键连接的两条抗体轻链多肽和两条抗体重链多肽组成的多聚体多肽，其中在所述两条抗体重链多肽中，C-末端赖氨酸残基(K)可以存在或不存在。
术语″宿主细胞″、″宿主细胞系″和″宿主细胞培养物″可交换使用，是指向其中引入外源核酸的细胞，包括所述细胞的子代。宿主细胞包括″转化子″和″转化的细胞″，其包括原代转化的细胞和从其衍生的子代(不考虑传代数)。子代的核酸含量可以不完全与母细胞相同，而是可以含有突变。具有与对于在最初细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变体子代包括在本文中。
“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列亚群。通常，序列的亚群是如Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda MD(1991)，NIH Publication 91-3242，第1-3卷中的亚群。在一个实施方案中，对于VL，亚群是如在Kabat等人，见前中的亚群κ I。在一个实施方案中，对于VH，亚群是如Kabat等人，见前中的亚群III。
“人源化的”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化的抗体将包含基本上至少一个，并且通常两个可变结构域中的全部，其中全部或基本上全部HVRs(例如，CDRs)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些。人源化的抗体可以任选地包含至少一部分源自人抗体的抗体恒定区。抗体，例如，非人抗体的“人源化形式”是指经历人源化的抗体。
如本文使用的术语“高变区”或“HVR”，是指抗体可变结构域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)并且形成结构限定的环(“高变环”)，和/或含有抗原-接触残基(“抗原接触部位(antigen contacts)”)的各个区域。通常，抗体包含六个HVRs；三个在VH(H1、H2、H3)中，并且三个在VL(L1、L2、L3)中。
本文中HVR包括
(a)高变环，其存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)处(Chothia，C.和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)CDR，其存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、和95-102(H3)处(Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242)；
(c)抗原接触部位，其存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、和93-101(H3)处(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)、和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)、和94-102(H3)。
除非另有说明，HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，见前编号。
“免疫缀合物”是缀合于一个以上异源分子的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗、和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。
“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman，S.等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
″分离的″核酸是指从其天然环境的成分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有所述核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处的细胞中的核酸分子。
“编码抗人Tau(pS422)抗体的分离的核酸的”是指一个以上编码抗体重链和轻链(或其片段)的核酸分子，包括单个载体或分离的载体中的这样的一种或多种核酸分子，和存在于宿主细胞中一个以上位置的这样的一种或多种核酸分子。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体抗体(该变体抗体例如含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)外，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括但不限于杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和利用包含所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法描述于本文中。
″天然抗体″是指具有各种结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚的糖蛋白，由二硫键键合的两个相同轻链和两个相同重链构成。从N-末端至C-末端，各个重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，接着三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N-末端至C-末端，各个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，接着恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链可以指定为基于其恒定结构域的氨基酸序列的称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型中的一种。
术语“药品说明书(package insert)”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的使用说明，其含有关于适应症、使用、剂量、施用、组合治疗、禁忌症和/或关于使用这样的治疗产品的警告。
相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对并在必要时引入空位以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域技术人员已知的多种方法实现用于测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对，例如，使用公众可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可从Genentech，Inc.(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统、包括数字UNIX V4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比较参数并且不变。
在应用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可以这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列同一性)如下计算：
100乘以X/Y比值
其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。
术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
“药用载体”是指药物制剂中活性成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文使用的术语“人Tau(pS422)”，是指天然的人Tau(pS422)(UniProtP37840)。术语包括“全长”，未加工的人Tau(pS422)以及由在细胞中加工得到的人Tau(pS422)的任何形式。术语还包括天然存在的人Tau(pS422)的变体，例如，突变体、剪接变体或等位基因变体。人Tau(pS422)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：02中。
如本文使用的，“治疗(treatment)”(及其语法变化形式如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指改变被治疗的个体的天然过程的尝试中的临床干预，并且可以进行用于预防或在临床病理学过程期间进行。希望的治疗效果包括，但不限于，防止疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、减小疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和缓和或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“x-价”，例如，“单价”或“二价”或“三价”或“四价”，表示在抗体分子中存在特定数目的结合位点，即，“x”个。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗体分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。双特异性抗体至少是“二价的”，并且可以是“三价的”或“多价的”(例如，“四价的”或“六价的”)。在一个实施方案中，双特异性抗体是二价的、三价的或四价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的。
甚至在存在多于两个结合位点的情形中(即，所述抗体是三价的或多价的)，抗体可以是双特异性的。术语双特异性抗体包括，例如，多价单链抗体、双抗体和三抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，所述全长抗体上通过一个或多个肽接头连接其他的抗原结合位点(例如，单链Fv，VH结构域和/或VL结构域，Fab，或(Fab)2)。抗体可以是来自单一物种的全长的，或是嵌合的或人源化的。对于具有多于两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只要抗体具有针对两个不同抗原的结合位点即可。即，尽管第一结合位点是特异性针对半抗原的，第二结合位点特异性针对非半抗原抗原，反之亦然。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与其抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FRs)和三个高变区(HVRs)。(参见，例如，Kindt，T.J.等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano，S.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)150(1993)880-887；Clackson，T.等人，Nature(自然)352(1991)624-628)。
术语“载体”用于本文是指能够使与其相连的另一种核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
II.组合物和方法
A.本文报道的血脑屏障穿梭物
本文报道的非共价复合物的一部分是血脑屏障-穿梭物模块(BBB-穿梭物模块)，其是一种具有针对半抗原的第一结合特异性和针对血脑屏障受体(BBBR)的第二结合特异性的双特异性抗体。所述BBB-穿梭物模块识别血脑屏障上的可胞转的细胞表面靶标(诸如TfR、LRPs或其他靶标，BBBR)并且同时结合半抗原化的有效负载物。
已经发现，不必须满足关于结合价态、抗体形式、BBBR结合亲和力的其他要求。
还已经发现，不要求本文报道的基于双特异性抗体的穿梭物模块从血脑屏障的内皮细胞释放来调节半抗原化的有效负载物的胞转作用。相反，在与BBBR结合时与基于双特异性抗体的穿梭物模块复合/结合的半抗原化的有效负载物在BBB细胞内从所述基于双特异性抗体的穿梭物模块释放，即，在细胞内囊状系统中，与所述穿梭物模块分开，随后从BBB细胞胞吐进入脑，将所述双特异性抗体留在BBB细胞中。
本文报道的基于双特异性抗体的穿梭物模块在结合特异性价态和BBBR结合特异性的亲和性方面是非常多变的。同时，其能够允许从穿梭物模块释放有效负载物。
多特异性抗体
已经开发了宽泛种类的重组抗体形式，例如，融合例如双特异性抗体形式与单链结构域的四价双特异性抗体(参见，例如，Coloma，M.J.，等人，Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison，S.L.，Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。
还已经开发了一些其他的形式，其中不再保留抗体核心结构e(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)，诸如双抗体、三抗体或四抗体、迷你抗体、一些单链形式(scFv，Bis-scFv)，它们能够结合两种以上的抗原(Holliger，P.，等人，Nature Biotech(自然生物技术)23(2005)1126-1136；Fischer，N.，L6ger，O.，Pathobiology(病理生理学)74(2007)3-14；Shen，J.，等人，Journal of Immunological Methods(免疫学方法杂志)318(2007)65-74；Wu，C.，等人，Nature Biotech.(自然生物技术)25(2007)1290-1297)。
所有这样的形式都使用接头，以使抗体核心(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)融合到另一个结合蛋白(例如scFv)或以融合例如两个Fab片段或scFvs(Fischer，N.和Léger，O.，Pathobiology(病理生理学)74(2007)3-14)或CrossFabs。必须记住的是，一种方式想要保留效应子功能，诸如例如，补体-依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，其经由Fc受体结合通过维持与天然存在的抗体的高度相似性而调节。
WO 2007/024715中报道了作为改造的多价多特异性结合蛋白的双重可变结构域免疫球蛋白。US 6,897,044中报道了用于制备生物学活性抗体二聚体的方法。US 7,129,330中报道了具有至少四个彼此通过肽接头连接的可变结构域的多价FV抗体构建体。US2005/0079170报道了二聚体和多聚体抗原结合结构。US 6,511,663中报道了三价或四价单特异性抗原结合蛋白，其包含三个或四个彼此通过连接结构共价结合的Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。WO 2006/020258中报道了四价双特异性抗体，其可以在原核细胞和真核细胞中有效地表达，并且可用于治疗和诊断方法。从包含两种类型的多肽二聚体的混合物中与不通过至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或优先合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法报道在US 2005/0163782中。US 5,959,083中报道了双特异性四价受体。WO 2001/077342中报道了改造的具有三个以上功能性抗原结合位点的抗体。
WO 1997/001580中报道了多特异性和多价的抗原-结合多肽。WO 1992/004053报道了同型缀合物，典型的由结合相同抗原决定簇的IgG种类的单克隆抗体制备，其通过合成的交联共价连接。
WO 1991/06305中报道了具有高的针对抗原的抗体亲抗原性(avidity)的寡聚体单克隆抗体，其中分泌具有两个以上缔合在一起的免疫球蛋白单体的寡聚体(典型地IgG种类的)，以形成四价或六价IgG分子。US 6,350,860中报道了绵羊来源的抗体和改造的抗体构建体，其可以用于治疗其中干扰素γ是致病性的疾病。在US 2005/0100543中报道了可靶向的构建体，其为双特异性抗体的多价载体，即，可靶向构建体的每个分子可以作为两种以上的双特异性抗体的载体。WO 1995/009917中报道了遗传改造的双特异性四价抗体。在WO2007/109254中，报道了由稳定的scFv组成或包含scFv的稳定的结合分子。
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体或本文报道的缀合物中的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对半抗原而另一种是针对任何其他(非半抗原)抗原。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位在细胞中。双特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段形式。
制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.，Nature(自然)305(1983)537-540，WO 93/08829，及Traunecker，A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)，及“凸起-入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利号5,731,168)。也可通过以下方法制得多特异性抗体：工程改造用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电导引作用(WO 2009/089004)；将两种以上抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980，及Brennan，M.等人，Science(科学)229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见，例如Kostelny，S.A.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)148(1992)1547-1553)；使用“双抗体”技术来制得双特异性抗体片段(参见，例如Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；及使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如Gruber，M等人，J.Immunol.(免疫学杂志)152(1994)5368-5374)；及如例如Tutt，A.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。
在一个实施方案中，通过“凸起-进入-孔洞”技术改变双特异性抗体重链的CH3结构域，所述技术以一些实例详细记述在例如WO 96/027011，WO 98/050431，Ridgway J.B.，等人，Protein Eng.9(1996)617-621，Merchant，A.M.，等人，Nat Biotechnol 16(1998)677-681中。以这种方法，两个CH3结构域的相互作用表面被改变，从而增加包含这两个CH3结构域的两条重链的异源二聚体化。(两条重链的)两个CH3结构域中的任一个可以是“凸起”，而另一个是“孔洞”。二硫键的引入稳定所述异型二聚体(Merchant，A.M，等人，NatureBiotech 16(1998)677-681，Atwell，S.，等人J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并且增加产量。
在所有方面的一个实施方案中，双特异性抗体特征在于：
-一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域分别在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接，
其中改变所述界面以促进双特异性抗体的形成，其中所述改变的特征在于：
a)改变一条重链的CH3结构域，
由此，在与双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的初始界面相接的一条重链的CH3结构域的初始界面内，
氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内生成突起，该突起可以定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的凹洞中；
并且
b)改变另一条重链的CH3结构域，
由此，在与双特异性抗体内的第一CH3结构域的初始界面相接的第二CH3结构域的初始界面内，
氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二CH3结构域的界面内生成凹洞，第一CH3结构域的界面内的突起可以定位在该凹洞中。
因此，在一个实施方案中，本文报道的抗体特征在于：
-全长抗体的第一重链的CH3结构域和全长抗体的第二重链的CH3结构域分别在包括抗体CH3结构域之间的初始界面中的改变的界面处相接，
其中i)在第一重链的CH3结构域中
氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内生成突起，该突起可以定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的凹洞中，
并且其中ii)在第二重链的CH3结构域中
氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二CH3结构域的界面内生成凹洞，第一CH3结构域的界面内的突起可以定位在该凹洞中。
在一个实施方案中，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)组成的组。
在一个实施方案中，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)组成的组。
在一个实施方案中，通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域相应位置处的氨基酸，进一步改变这两个CH3结构域，从而可以形成两个CH3结构域之间的二硫键。
在一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体包含在“凸起链”第一CH3结构域中的氨基酸T366W突变和在“孔洞链”第二CH3结构域中的氨基酸T366S、L368A、Y407V突变。还可以使用在CH3结构域之间的另外的链间二硫键(Merchant，A.M，等人，Nature Biotech.(自然生物技术)16(1998)677-681)，例如，通过向“孔洞链”CH3结构域中引入氨基酸Y349C突变和向“凸起链”CH3结构域中引入氨基酸E356C突变或氨基酸S354C突变。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C、T366W突变，在这两个CH3结构域中的另一个中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突变。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变(在一个CH3结构域中的另外的Y349C突变与在另一个CH3结构域中的另外的E356C或S354C突变形成链间二硫键)(按照Kabat的EU索引编号；(Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)))。也可以备选或者另外地使用EP1 870 459A1所述的其它凸起-入-孔洞技术。因此，所述双特异性抗体的另一个实例是在“凸起链”CH3结构域中的R409D、K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K、E357K突变(按照Kabat的EU索引编号；(Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)))。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域中的T366W突变和在“孔洞链”CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变，并且额外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D、K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K、E357K突变。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变，并且额外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D、K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K、E357K突变。CH3结构域中的所述凸起和孔洞突变典型地用在SEQ ID NO：58(人IgG1亚类同种异型(高加索人和美国黑人或突变体L234A/L235A，和L234A/L235A/P329G)的人重链恒定区(编号按照Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的EU索引)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO：58的人重链恒定区，还包括在CH3结构域中的此类“凸起”和“孔洞”突变(例如，在两个CH3结构域的一个中的Y349C、T366W突变和在这两个CH3结构域的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变)(编号按照Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的EU索引)。
本文还包括改造的具有三个以上功能性抗原结合位点的抗体，包括“章鱼属(Octopus)抗体”(例如，参见US 2006/0025576)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含一个与半抗原和另一个不同的抗原结合的抗原结合位点(例如，参见US 2008/0069820)。
本文的抗体或片段还包括WO 2009/080251，WO 2009/080252，WO 2009/080253，WO2009/080254，WO 2010/112193，WO 2010/115589，WO 2010/136172，WO 2010/145792和WO2010/145793中所述的多特异抗体。
在一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体(其在每条重链中包含CH3结构域)在两个CH3结构域中的一个中包含氨基酸S354C、T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突变(在一个CH3结构域中的另外的氨基酸S354C突变与在另一个CH3结构域中的另外的氨基酸Y349C突变形成链间二硫键)(按照Kabat编号)。
包括其他用于CH3-修饰以加强异型二聚体化的技术作为备选方案，并且例如记述在WO 96/27011，WO 98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205，WO 2007/147901，WO 2009/089004，WO 2010/129304，WO 2011/90754，WO 2011/143545，WO 2012/058768，WO 2013/157954，WO2013/096291中。
在一个实施方案中，使用记述在EP 1 870 459A1中的异型二聚体化方法。该方法是基于在两条重链之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置引入具有相反电荷的带电氨基酸的置换/突变。在一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体在(多特异性抗体的)第一重链的CH3结构域中包含氨基酸R409D、K370E突变且在(多特异性抗体的)第二重链的第二CH3结构域中包含氨基酸D399K、E357K突变(按照Kabat编号)。
在另一个实施方案中，所述多特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域中的氨基酸T366W突变和在“孔洞链”CH3结构域中的氨基酸T366S、L368A、Y407V突变，并且另外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的氨基酸R409D、K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的氨基酸D399K、E357K突变。
在另一个实施方案中，所述多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含氨基酸S354C、T366W突变，且在这两个CH3结构域中的另一个中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含氨基酸Y349C、T366W突变，且在这两个CH3结构域中的另一个中包含氨基酸S354C、T366S、L368A、Y407V突变，并且，另外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的氨基酸R409D、K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的氨基酸D399K、E357K突变。
在一个实施方案中，使用WO2013/157953中所述的异型二聚体化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366K突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸L351D突变。在另一个实施方案中，第一CH3结构域还包含氨基酸L351K突变。在另一个实施方案中，第二CH3结构域还包含选自Y349E、Y349D和L368E的氨基酸突变(优选L368E)。
在一个实施方案中，使用WO2012/058768中所述的异型二聚体化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y、Y407A突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A、K409F突变。在另一个实施方案中，第二CH3结构域在位置T411、D399、S400、F405、N390或K392包含例如选自下述的另一个氨基酸突变：a)T411N，T411R，T411Q，T411K，T411D，T411E或T411W，b)D399R，D399W，D399Y或D399K，c)S400E，S400D，S400R或S400K，F405I，F405M，F405T，F405S，F405V或F405W，N390R，N390K或N390D，K392V，K392M，K392R，K392L，K392F或K392E、在另一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y、Y407A突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸T366V、K409F突变。在另一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸Y407A突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A、K409F突变。在另一个实施方案中，第二CH3结构域还包含氨基酸K392E、T411E、D399R和S400R突变。
在一个实施方案中，使用WO2011/143545中所述的异型二聚体化方法，例如，在选自由368和409组成的组的位置具有氨基酸修饰。
在一个实施方案中，使用WO2011/090762中所述的异型二聚体化方法，其还使用上文所述的凸起-进入-孔洞技术。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366W突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸Y407A突变。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366Y突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸Y407T突变。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体是IgG2同种型，并且使用WO2010/129304中所述的异型二聚体化方法。
在一个实施方案中，使用WO2009/089004中所述的异型二聚体化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸残基K392或N392被带负电荷的氨基酸(例如，谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)，优选K392D或N392D)置换，并且第二CH3结构域包含氨基酸残基D399、E356、D356或E357被带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选D399K，E356K，D356K或E357K，并且更优选D399K和E356K)置换。在另一个实施方案中，第一CH3结构域还包含氨基酸残基K409或R409被带负电荷的氨基酸(例如，谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)，优选K409D或R409D)置换。在另一个实施方案中，第一CH3结构域还或备选地包含氨基酸残基K439和/或K370被带负电荷的氨基酸(例如，谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D))置换。
在一个实施方案中，使用WO2007/147901中所述的异型二聚体化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸K253E、D282K和K322D突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸D239K、E240K和K292D突变。
在一个实施方案中，使用WO2007/110205中所述的异型二聚体化方法。
B.本文报道的非共价复合物
本文报道的血脑屏障穿梭物用作特异性结合人Tau(pS422)递送载体(deliveryvehicle)的抗体。所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体与半抗原缀合并且由此与所述血脑屏障穿梭物的半抗原-结合位点复合。该复合物是确定的(defined)且稳定的，并且特异性递送特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体穿过血脑屏障。由于特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体以非共价形式与血脑屏障穿梭物复合，因此，一方面，所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体在其处在循环的时间过程中结合在其递送载体(血脑屏障穿梭物＝双特异性抗体)上，而另一方面还可以在胞转作用后有效地释放。与半抗原的缀合可以在不干扰特异性结合人Tau(pS422)的抗体的活性的前提下实现。所述血脑屏障穿梭物不包含稀有的共价添加，并且因此避免任何免疫原性危险。特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体与本文报道的包含半抗原-特异性结合位点的双特异性抗体的复合物赋予所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体良好的生理行为。并且，所述复合物能够将负载物靶向到展示由所述双特异性抗体的第二结合特异性识别的细胞或组织。
尽管被半抗原化，并且尽管被血脑屏障穿梭物(＝双特异性抗体)复合，特异性结合人Tau(pS422)的抗体保留其功能性。另外，在特异性结合人Tau(pS422)的复合的半抗原化抗体的存在下，所述双特异性抗体保留其结合特异性和亲和性。特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体与本文报道的双特异性抗体的复合物可以用于使所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体特异性靶向表达所述血脑屏障受体的细胞。由于特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体以非共价方式与双特异性抗体偶联，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体可以在内在化或胞转后被释放。
由于它们的化学和物理特性，诸如分子量和结构域结构，包括二级修饰，抗体的下游加工非常复杂。例如，不仅对于配制的药物，而且对于下游加工(DSP)中的中间体，需要浓缩的溶液来实现用于经济化处理和应用存储的低体积。
随着抗体浓度增加，可以观察到形成聚集物的趋势。与分离的抗体相比，这些聚集的抗体具有削弱的特征。可以通过在与血脑屏障穿梭物模块的单链抗体的重链与轻链可变结构域之间引入二硫键而减少本文报道的复合物的聚集。这种改善的稳定性不仅在生产过程中而且在抗体的存储中是有用的。在一个实施方案中，包含在所述双特异性抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键对于每个单链抗体独立地选自：
i)重链可变结构域位置44-轻链可变结构域位置100，
ii)重链可变结构域位置105-轻链可变结构域位置43，或
iii)重链可变结构域位置101-轻链可变结构域位置100。
在一个实施方案中，包含在所述双特异性抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键是在重链可变结构域位置44与轻链可变结构域位置100之间。
在一个实施方案中，包含在所述双特异性抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键是在重链可变结构域位置105与轻链可变结构域位置43之间。
C.示例性的特异性结合人Tau(pS422)的抗体
本文报道的非共价复合物的特异性结合人Tau(pS422)的人源化的抗体不可通过标准人源化方法获得。需要在氨基酸序列中引入非标准突变以获得具有与母体兔抗体相当的结合特性的人源化的抗体。这特别重要，因为本文报道的抗体意在跨越人血脑屏障并在人脑内起作用。因此，用于选择人源化抗体的通常应用的标准的严格程度不足以直接用于本案。
已经发现，为了获的合适的和可开发的人源化的抗体，在CDRL3(轻链CDR3)中形成二硫键的两个半胱氨酸必需分别被丝氨酸和异亮氨酸替代。除了保证相同CDRL3的正确取向之外，存在于兔CDRL3中间的异亮氨酸残基被缺失，得到比母体兔CDRL3少一个氨基酸残基的人源化的CDRL3。
还进一步发现，在重链位置4、24和78处维持三个缬氨酸氨基酸残基是有利的。不受该理论限制，猜想这些残基是保证重链可变区的抗原结合环的正确呈递所需的。此外，位置71处精氨酸残基的存在是有利的。
不同人源化的轻链可变结构域的序列比对显示在图1中。不同人源化的重链可变结构域的序列比对显示在图2中。如本文使用的所有编号基于Kabat可变结构域编号方案。
在下表中，显示分别与人源化的重链可变结构域VH14和VH20组合的兔轻链可变结构域的不同人源化的变体的特性。结合配偶体是人Tau(pS422)。
参考值VH00与VL00(兔抗体)：
25℃：kd＝2.6E-04；t/2＝44min。
37℃：ka＝3.7E+04，kd＝5.25E-03，KD＝1.4E-08，t/2＝22min。
在下表中，显示分别与人源化的轻链可变结构域VL17和VL19组合的兔轻链可变结构域的不同人源化的变体的特征。
参考值VH00与VL00(兔抗体)：
25℃：kd＝2.6E-04；t/2＝44min。
37℃：ka＝3.7E+04，kd＝5.25E-03，KD＝1.4E-08，t/2＝22min。
在下表中显示不同VH/VL组合的动力学常数。
人源化的VH和VL的不同组合的生物化学结合显示在图3和4中。
在下表中显示不同VH/VL组合的结合特异性(EC50值，以[ng/ml]计)。
从图5中显示的蛋白质印迹可以看出选择的人源化的VH/VL组合对人tau突变体S422A的灵敏度。所有人源化的变体选择性地结合在S422磷酸化的人tau。对母体兔抗体的非S422磷酸化表位存在低水平的x-反应性，但在这一点，显示的人源化的变体具有比母体兔抗体弱的交叉反应性。
在图6中，显示对于母体兔抗体和对于选择的人源化的抗人Tau(pS422)抗体，对阿尔茨海默病患者的脑提取物中PHF-tau的结合。
下表概述了选择的人源化的VH/VL组合的生物学性质。
在一个实施方案中，特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含至少一个、至少两个、或所有三个选自以下的VH HVR序列：
i)(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H2；和
(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；或
ii)(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；和
(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3。
在一个实施方案中，特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含：
i)(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H2；和
(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；或
ii)(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；和
(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体还包含至少一个、至少两个、或所有三个选自以下的VL HVR序列：
i)(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L1；
(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和
(c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3；或
ii)(a)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；
(b)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-L2；和
(c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含：
i)(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L1；
(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和
(c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3；或
ii)(a)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；
(b)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-L2；和
(c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含：
i)(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3，或
ii)(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3，或
iii)(a)包含SEQ ID NO：08的氨基 酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个实施方案中，相对于参比序列，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体的VH或VL含有置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗-人Tau(pS422)抗体保留结合人Tau(pS422)的能力。
在另一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化的抗体或人抗体。在一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、CrossFab、scCrossFab，双抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是全长抗体，例如，完整的IgG1或IgG4抗体或如本文定义的其他抗体类型或同种型。
在另一个实施方案中，根据上述实施方案中任一个的特异性结合人Tau(pS422)的抗体可以单独或组合并入如以下1-5节中描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤100nM，≤50nM，或1nM至100nM之间(例如10-7M或更少，例如从10-7M至10-9M)的解离常数(KD)。
在一个实施方案中，Kd通过放射标记的抗原结合测定(RIA)测量。在一个实施方案中，RIA以研究的抗体的Fab版本及其抗原进行。例如，FAB对于抗原的溶液结合亲和力通过在未标记的抗原滴定系列的存在下利用最小浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen，Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了建立测定条件，将多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)在50mM碳酸钠(pH 9.6)中包被过夜，并且随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)包被二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与研究的Fab的系列稀释物混合(例如，与在Presta，L.G.等人，Cancer Res.57(1997)4593-4599中对抗-VEGF抗体，Fab-12的评价一致)。然后将研究的Fab孵育过夜；然而，孵育可以继续更长时期(例如，约65小时)以保证达到平衡。之后，将混合物转移至捕获平板用于在室温孵育(例如，一小时)。然后移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤八次。当平板干燥时，加入150μl/孔的闪烁液(scintillant)(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNTTM计数器(Packard)上计数十分钟。选择各个Fab的给出小于或等于最大结合的20％的浓度用于竞争结合测定。
根据另一个实施方案，Kd使用表面等离子共振测量。例如，使用-2000或-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的测定在25℃利用以～10响应单位(RU)固定的抗原CM5芯片进行。在一个实施方案中，根据供应商的使用说明将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗原用10mM乙酸钠，pH4.8，稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射获得大约10响应单位(RU)的偶联的蛋白。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，将两倍系列稀释的Fab(0.78nM至500nM)在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中以大约25μl/min的速率在25℃注射。使用简单的一对一Langmuir结合模型(评价软件版本3.2)，通过同时拟合结合和解离传感曲线计算结合常数(kon)和解离常数(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon(参见，例如，Chen，Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。如果通过上述表面等离子共振测定结合速率(on-rate)超过106M-1s-1，则结合速率可以通过使用荧光猝灭技术测定，该技术在分光计，如停流装备的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌容器的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的增加的抗原浓度的存在下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发生强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括，但不限于Fab、Fab’、Fab'-SH、F(ab’)2、CrossFab、scCrossFab、Fv和scFv片段以及下文描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，参见Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。对于scFv片段的综述，参见，例如，Plueckthun，A.，In；The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore(编辑)，Springer-Verlag，纽约(1994)，pp.269-315；还参见WO 93/16185；US 5,571,894和US 5,587,458。对于包含营救受体(salvagereceptor)结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见US5,869,046。
双抗体是具有两个抗原-结合位点的抗体片段，其可以是双价的或双特异的。参见，例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。三抗体(Triabodies)和四抗体(tetrabodies)也在Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(20039129-134)中描述。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或抗体的轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，US 6,248,516)。
抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文中所述的。
3.人源化的抗体
通常，非人抗体被人源化以减小对人的免疫原性，同时保留母体非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化的抗体包含一个以上可变结构域，其中HVR，例如，CDR，(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化的抗体还将任选地包含至少一部分或全长人恒定区。在一些实施方案中，人源化的抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化的抗体和制备它们的方法，例如，在Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并且进一步例如，在Riechmann，I.等人，Nature332(1988)323-329；Queen，C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US5,821,337，US 7,527,791，US 6,982,321，和US 7,087,409；Kashmiri，S.V.等人，Methods36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)接枝)；Padlan，E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall’Acqua，W.F.等人，Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组(shufffling)”)；和Osbourn，J.等人，Methods 36(2005)61-68和Klimka，A.等人，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述对于FR改组的“导向选择”方法)中描述。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用″最佳匹配(best-fit)″方法选择的框架区(参见，例如，Sims，M.J.等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308；源自轻链或重链可变区的特定亚群的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta，L.G.等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞成熟的)框架区或人生殖系框架区(参见，例如，Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和源自筛选FR库的框架区(参见，例如，Baca，M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok，M.J.等人，J.Biol.Chem.271(1996922611-22618)。
4.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性中的一种针对人Tau(pS422)并且另一种针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合人Tau(pS422)的两个不同表位。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.，Nature305(1983)537-540，WO93/08829，以及Traunecker，A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)，和“凸起于孔洞中(knob-in-hole)”改造(参见，例如，US 5,731,168)。多特异性抗体还可以通过改造静电转向效果来制备，用于制备抗体Fc-异二聚分子(WO 2009/089004)；交联两个以上抗体或片段(参见，例如，US 4,676,980，和Brennan，M.等人，Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny，S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553；使用″双抗体″技术制备双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber，M等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备所述的三特异性抗体，例如，在Tutt，A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69)中。
具有三个以上功能性抗原结合位点的改造的抗体，包括“Octopus抗体，”也包括在本文中(参见，例如US 2006/0025576)。
本文中的抗体或片段还包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含结合人Tau(pS422)以及另一不同抗原的抗原结合位点(参见，例如US 2008/0069820)。
本文中的抗体或片段还包括在以下中描述的多特异性抗体：
WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793。
5.抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体氨基酸序列变体。例如，可以希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引编码抗体的核苷酸序列，或通过肽合成来制备。所述修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列缺失残基，和/或插入残基到抗体的氨基酸序列中和/或置换抗体的氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，条件是，最终构建体具有希望的特性，例如，抗原结合。
a)置换、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个以上氨基酸置换的抗体变体。置换性诱变的研究位点包括HVR和FR。保守置换在以下标题为″优选的置换″的表中显示。更多的重要改变在以下标题为″示例性的置换″表中显示，并且如以下参考氨基酸侧链类型描述的。可以将氨基酸置换引入研究的抗体和对于所需活性，例如，保留/改善的抗原结合、减少的免疫原性、或改善的ADCC或CDC进行筛选的产物。
表
氨基酸可以按照常见侧链的性质进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守性置换需要将这些类别中之一的成员交换为另一类。
一种类型的置换变体包括置换母体抗体(例如人源化抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，关于进一步研究所选择的得到的一种或多种变体相对于母体抗体具有某些生物学特性的改进(例如，改善)(例如，增加的亲和力、减少的免疫原性)，和/或将具有母体抗体基本上保留的特定生物学特性。一种示例性的置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以便利地产生，例如，使用基于噬菌体的亲和力成熟技术，诸如本文所述的那些技术。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗体展示在噬菌体上，并针对特定的生物学活性(例如，结合亲和力)进行筛选。
可以在HVRs中产生变化(例如置换)，例如，以改善抗体亲和性。此类改变可以在HVR“热点”和/或接触抗原的残基中产生，“热点”即在体成熟过程中以高频率进行突变的密码子所编码的残基(例如，参见Chowdhury，P.S.，Methods Mol.Biol.207(2008)179-196))，检测所得到的变体VH或VL的结合亲和力。已经描述了通过构建和从二级文库再选择的亲和力成熟，例如，在Hoogenboom，H.R.等人，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸定向的诱变)中的任一种向选择进行成熟的可变基因中引入多样性。然后产生二级文库。然后，筛选该文库，以鉴定具有所需要的亲和性的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR-定向方法，其中一些HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。参与抗原结合的HVR残基可以被特异性地鉴定出来，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别地，通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以发生在一个或多个HVRs内，只要所述变化基本上不减小抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在HVRs中进行基本上不减小结合亲和力的保守变化(例如，本文提供的保守置换)。例如，此类变化可以在HVRs中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR没有改变，或者包含不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
可用于鉴定抗体可以被靶向诱变的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science 244(1989)1081-1085所述。在该方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基，如arg，asp，his，lys，和glu)，并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可以在氨基酸位置引入其他的置换，来证明针对初始置换的功能敏感性。备选地，或另外地，抗原-抗体的晶体结构鉴定抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻的残基可以被靶向或消除，作为置换的候选物。可以筛选变体，以确定它们是否包含需要的特性。
氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，长度范围在一个残基到包含一百个以上残基的多肽，以及单一氨基酸残基或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-端或C-端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，关于ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，本文提供的抗体被改变，以增加或减少抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列，以产生或去除一个或多个糖基化位点，可以便利地实现向抗体中添加或删除糖基化位点。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体典型地包含分支的、双触角型(biantennary)的寡糖，其通常通过N-连接与Fc区的CH2结构域的Asn297连接(例如，参见，Wright，A.和Morrison，S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32)。所述寡糖可以包括多种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接到在双触角型寡糖结构的“干”中的GlcNAc上的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区，由此产生Fc区变体。所述Fc区变体可以包含这样的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2、IgG3或IgG4Fc-区)：所述Fc区序列在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如置换)。
在某些实施方案中，本发明包括具有一些而非全部效应子功能的抗体变体，这使其成为这样的应用的候选物：在所述应用中，抗体体内半衰期是重要的，而某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定来证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺少FcγR结合(由此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。调节ADCC的主要的细胞，即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性的实例记述在US 5,500,362(例如，参见Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。备选地，可以使用非放射性测定(例如，参见用于流式细胞计数的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。可用于所述测定的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，例如，在动物模型中评估，诸如Clynes，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的。也可以进行C1q结合测定来证实抗体不能结合C1q，由此缺少CDC活性。例如，参见WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(例如，参见Gazzano-Santoro，H.等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202(1996)163-171；Cragg，M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期确定(例如，参见Petkova，S.B.等人，Iht.Immunol.18(2006：1759-1769))。
具有减小的效应子功能的抗体包括具有Fc-区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个置换的那些(US 6,737,056)。该Fc-区突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两个或多个处具有置换的Fc-区突变体，包括残基265和297置换为丙氨酸(US 7,332,581)的所谓的“DANA”Fc-区突变体。
描述了某些具有改善的或减少的对FcR的结合的抗体变体(参见，例如，US 6,737,056；WO 2004/056312，和Shields，R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在一些实施方案中，在Fc-区进行改变，导致改变的(即减少)C1q结合和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，US 6,194,551，WO 99/51642，和Idusogie，E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中描述的。
具有增加的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer，R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593，和Kim，J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434))的结合的抗体在US 2005/0014934中描述。那些抗体包含其中具有一个以上改善Fc-区对FcRn的结合的置换的Fc-区。所述Fc-区变体包括在以下Fc-区残基中的一个或多个处具有置换的那些：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，Fc-区残基434的置换(US 7,371,826)。
关于Fc-区变体的其他实例，还参见Duncan，A.R.和Winter，G.，Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以希望产生半胱氨酸改造的抗体，例如“硫代MAbs”，其中抗体的一个以上残基被半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，置换的残基存在于抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，由此反应性巯基位于抗体的可接近位点并且可以用于将抗体缀合于其他部分，如药物部分或接头药物部分，以产生免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基的任意一个或多个可以被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc-区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以如例如，US 7,521,541中描述产生。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，本文中提供的抗体可以进一步修饰为含有本领域中已知的且可容易获得的另外的非蛋白部分。适于抗体的衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二噁烷、聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物、多聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇(propropylene glycol)均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造方面可以具有优势。聚合物可以是任意分子量的，并且可以是分支的或未分支的。连接于抗体的聚合物的数量可以改变，并且如果连接多于一个聚合物，则它们可以是相同或不同分子。通常，用于衍生的聚合物的数量和/或类型可以基于包括但不限于要改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否将在限定的条件下用于治疗等的考虑而确定。
在另一实施方案中，提供可以通过暴露于照射而选择性被加热的抗体和非蛋白部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白部分是碳纳米管(Kam，N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。照射可以是任意波长的，并且包括，但不限于，不对普通细胞有害的波长，但其将非蛋白部分加热至接近抗体-非蛋白部分的细胞被杀伤的温度。
D.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物，例如，US 4,816,567中所述的制备抗体。在一个实施方案中，提供编码本文中描述的抗人Tau(pS422)抗体的分离的核酸。所述核酸可以编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供一个以上包含所述核酸的载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方案中，提供包含所述核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，转化有)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗人Tau(pS422)抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码如上文提供的抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组生产抗人Tau(pS422)抗体，分离编码例如本文所述的抗体的核酸，并且插入一个以上载体用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。所述核酸可以容易地使用常规步骤分离和测序(例如，通过使用能够特异结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达抗体-编码载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中生产，尤其是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，US 5,648,237，US 5,789,199，和US 5,840,523。(还参见Charlton，K.A.，在：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo，B.K.C.(编辑)，Humana Press，Totowa，NJ(2003)，pp.245-254中，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)表达后，可以从细菌细胞糊以可溶的级分分离抗体并且可以进一步纯化。
除了原核生物以外，真核生物如丝状真菌或酵母是抗体-编码载体的合适的克隆或表达宿主，包括糖基化通路被“人源化的”真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达糖基化的抗体的合适的宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了很多可以用于与昆虫细胞联合的杆状病毒株，特别是对于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，US 5,959,177，US 6,040,498，US6,420,548，US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，可以使用在悬浮液中适应生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是用SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(如例如在Graham，F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(如例如，在Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；如例如在Mather，J.P.等人，Annals N.YAcad.Sci.383(1982)44-68中描述的TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。对于适于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo，B.K.C.(ed.)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，pp.255-268。
E.测定
可以通过本领域中已知的各种测定，鉴定本文报道的非共价复合物的抗-人Tau(pS422)抗体，筛选或表征它们的物理/化学性质和/或生物学活性。
1.结合测定和其他测定
例如，通过已知方法如ELISA、αLISA、蛋白质印迹、抗体或反相阵列等对特异性结合人Tau(pS422)的抗体测试其抗原结合活性。
在示例性ELISA或aLISA测定中，溶液(细胞上清，细胞或组织裂解物、体液等)中的Tau(pS422)被特异结合Tau(pS422)上的第一表位或某种构象的Tau(pS422)的捕获抗体结合，并且特异结合第二表位或Tau(pS422)的构象的检测抗体与检测实体偶联。结果读取基于检测实体(化学发光、荧光、能量转移引起的发光等)。在一些情况中，同一抗体可以在同一测定中用作捕获和检测抗体以检测Tau(pS422)的聚集形式(参见例如Tokuda，T.等人，Neurology 75(2010)1766-1772)。
在抗体阵列的情况中，将抗体点在玻璃或硝酸纤维素芯片上。将载玻片封闭并用含有Tau(pS422)的溶液孵育，洗涤以去除未结合的抗体并且用荧光标记的相应二抗检测结合的抗体。通过荧光载玻片扫描器测量荧光信号。类似地，对于反相阵列，将重组Tau(pS422)、细胞上清、细胞或组织裂解物、体液等点在玻璃或硝酸纤维素芯片上。将载玻片封闭并且将个体阵列用针对Tau(pS422)上的特定表位的抗体孵育。洗去未结合的抗体并且利用荧光标记的对应二抗检测结合的抗体。通过荧光载玻片扫描器测量荧光信号(Dernick，G.，等人，J.Lipid Res.52(2011)2323-2331)。
在蛋白质印迹的实例中，将源自细胞上清、细胞或组织裂解物、体液等的聚集的重组Tau(pS422)或Tau(pS422)在SDS PAGE或天然凝胶条件中通过分子量分离并且印迹到硝酸纤维素或PVDF膜上。封闭后，将膜与对Tau(pS422)的氨基酸序列或构象特异的抗体孵育。然后将膜洗涤以去除未结合的抗体。用与检测实体偶联的相应二抗检测结合的抗体，用于化学发光或荧光或其方式的检测。对Tau(pS422)的氨基酸序列特异的抗体将结合各种聚集形式和因此各种分子量的Tau(pS422)，只要表位不被聚集所遮盖。另一方面，构象特异的抗体将仅检测Tau(pS422)的某些聚集形式，仅在特定分子量处显示条带(参见例如Towbin，H.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)4350-4353；Burnette，W.N.，Anal.Biochem.112(1981)195-203)。
2.活性测定
在一个方面，提供用于鉴定具有生物活性的抗-人Tau(pS422)抗体的测定。生物活性可以包括，例如，保护免受/减少/抑制Tau(pS422)引起的细胞毒性，和/或保护免受/减少/抑制寡聚的人Tau(pS422)的细胞至细胞的传输，和/或减少LUHMES细胞中Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。还提供在体内和/或体外具有该生物活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试所述生物活性。
保护性生物活性可以通过加入含有分泌的Tau(pS422)的条件培养基来评价，所述分泌的Tau(pS422)引起接受者神经元细胞的细胞死亡。该毒性可以通过加入如本文所述的保护性抗体来逆转。之前已经确立了分泌的Tau(pS422)的毒性(Emmanouilidou，E.，等人，J.Neurosci.，30(2010)6838-6851)。
F.药物制剂
本文所述的非共价复合物的药物制剂通过将具有所需纯度的所述非共价复合物与一种以上任选的药用载体混合来制备(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编辑)(1980))，制成冻干制剂或水溶液的形式。药用载体在使用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括，但不限于：缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药用载体还包括间质药分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rhuPH20)在US 2005/0260186和US 2006/0104968中描述。在一个方面，将sHASEGP与一种以上另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于US 6,267,958。水性抗体制剂包括US 6,171,586和WO 2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文的制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。所述活性成分以对于想要的目的有效的量合适地组合存在。
可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微胶囊中，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗滴乳状液中。这些技术披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)(1980)中。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体或缀合物的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微胶囊的形式。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以通过例如经由无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
G.治疗方法和组合物
本文报道的任何非共价复合物都可以用于治疗方法。
在一方面中，提供用作药物的本文报道的非共价复合物。在另一些方面中，提供用于治疗阿尔茨海默病的本文报道的非共价复合物。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的本文报道的非共价复合物。在某些实施方案中，本发明提供本文报道的非共价复合物，所述非共价复合物用于治疗患有阿尔茨海默病的个体的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述非共价复合物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。在另一些实施方案中，本发明提供用于抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)诱导的细胞毒性的非共价复合物。在某些实施方案中，本发明提供用于在个体中抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)诱导的细胞毒性的方法中的非共价复合物，所述方法包括向所述个体施用有效剂量的所述非共价复合物，以抑制在人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)诱导的细胞毒性。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。
在进一步的方面，本发明提供本文报道的非共价复合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗阿尔茨海默病。在进一步的实施方案中，所述药物用于治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括向患有阿尔茨海默病的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量至少一种例如如下文所述的另外的治疗剂。在进一步的实施方案中，所述药物用于抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性。在进一步的实施方案中，所述药物用于在个体中抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药物以抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性。根据上述实施方案中任一项的“个体”优选为人。
在进一步的方面，本发明提供用于治疗阿尔茨海默病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有所述阿尔茨海默病的个体施用有效量的本文报道的非共价复合物。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种如下文所述的另外的治疗剂。根据上述实施方案中任一个的“个体”可以为人。
在进一步的方面，本发明提供在个体中抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文报道的非共价复合物以抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性。在一个实施方案中，“个体”是人。
在进一步的方面，本发明提供包含本文报道的非共价复合物中的任一种的药物制剂，例如，其用于上述治疗方法中的任一种。在一个实施方案中，药物制剂包含本文报道的非共价复合物中的任一种和药用载体。在另一实施方案中，药物制剂包含本文报道的非共价复合物中的任一种和至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。
在治疗中，本发明的抗体可以单独使用或与其他药剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。
上述所述组合治疗包括组合施用(在两种以上治疗剂包括在同一制剂或分开制剂中的情况下)，和分开施用(在此情况下，本发明的抗体的施用可以在施用一种或多种另外的治疗剂之前、与其同时和/或在其之后发生)。在一个实施方案中，非共价复合物的施用和另外的治疗剂的施用彼此在约一个月内，或在约一周、两周或三周内，或在约一天、两天、三天、四天、五天、或六天内发生。
本文报道的非共价复合物(和任意的另外的治疗剂)可以通过任意合适的方式施用，包括肠胃外、腹膜内、和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。剂量给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的或长期的。各种剂量给药时间安排包括但不限于经多个时间点单次或多次施用，本文中考虑快速推注(bolus)施用和脉冲输注。
本文报道的非共价复合物将以与良好医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用。在该情况下考虑的因素包括治疗的特定病症、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂递送位点、施用方法、施用时间安排、和开业医生已知的其他因素。所述非共价复合物不需要，但任选地与一种以上目前用于预防或治疗研究的疾病的药剂一起配制。所述其他药剂的有效量取决于存在于制剂中的非共价复合物的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量并且以本文中所述的施用途径，或本文所述的约1至99％的剂量，或以经验上/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本文报道的非共价复合物的适当剂量(当单独使用或与一种以上其他另外的治疗剂组合使用)将取决于要治疗的疾病类型、非共价复合物的类型、疾病的严重度和过程、非共价复合物是否施用用于预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的反应、以及主治医师的自由裁量。一次或经一系列治疗，将所述非共价复合物适当地施用于患者。不论例如，通过一次以上分开的施用，或通过连续输注，取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的非共价复合物可以是用于施用于患者的初始候选剂量。一个典型的每日剂量可能范围从约1μg/kg至100mg/kg以上，这取决于上述因素。对于经数天或更长的重复施用(取决于病况)，通常将持续治疗直到所希望的对疾病症状的遏制发生。非共价复合物的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约50mg/kg的范围内。因此，一个以上剂量的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、15mg/kg、25mg/mg或50mg/kg(或其任意组合)可以施用给患者。所述剂量可以间断地施用，例如每周或每三周使用(例如以致患者接收约二至约二十，或例如约六个剂量的抗体)。可以施用初始的更高加载剂量，接着一次以上的较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。该治疗的过程容易通过常规技术和测定监控。
要理解，替代非共价复合物或除了非共价复合物之外，还使用本发明的免疫缀合物实施任意上述制剂或治疗方法。
III.制品
在本发明的另一方面，提供含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。制品包含容器和关于容器或与容器相关的标记或药品说明书。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳组合物(所述组合物自身或与其他组合物组合有效用于治疗、预防和/或诊断病况)，并且可以具有无菌接入口(例如所述容器可以是具有可由皮下注射针刺破的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的抗体。标记或药品说明书表明组合物用于治疗选择的病况。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含进一步的细胞毒性或另外的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品可以进一步包含药品说明书，其说明该组合物可以用于治疗特定病况。备选地，或此外，所述制品可以进一步含有包含药用缓冲剂的第二(或第三)容器，所述缓冲剂如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户的立场所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
要理解，替代抗-人Tau(pS422)抗体或除了抗-人Tau(pS422)抗体之外，任意上述制品可以包括本发明的免疫缀合物。
IV.具体的实施方案
1.特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体与抗-血脑屏障受体/半抗原双特异性抗体的非共价复合物。
2.包含特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体和双特异性抗体的非共价复合物，所述双特异性抗体具有特异性结合半抗原化抗体的半抗原的第一结合特异性(所述半抗原化抗体特异性结合人Tau(pS422))和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体通过所述双特异性抗体的第一结合特异性特异性结合。
3.根据实施方案1或2任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体选自由下述组成的组：特异性结合人Tau(pS422)的生物素化的抗体，特异性结合人Tau(pS422)的茶碱化的抗体，特异性结合人Tau(pS422)的洋地黄毒苷化的抗体，特异性结合人Tau(pS422)的碳硼烷化的抗体，特异性结合人Tau(pS422)的荧光素化的抗体，特异性结合人Tau(pS422)的helicarylated抗体和特异性结合人Tau(pS422)的溴脱氧尿苷化的抗体。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的非共价复合物，其中所述血脑屏障受体选自由下述组成的组：转铁蛋白受体(TfR)，胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体(IGF受体)，低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，和肝素-结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体是包含两个结合位点的全长抗体。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体是已经融合了一个或两个scFvs或scFabs或CrossFabs或scCrossFabs并且包含三个或四个结合位点的全长抗体。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体选自抗体片段、F(ab')2和双抗体。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体是人源化的抗体或人抗体。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体没有效应子功能。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的非共价复合物，其中实施方案所述双特异性抗体没有功能性Fc区。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体没有Fc区。
12.根据实施方案1-12中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有带有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的Fc区，其中位置按照Kabat Fc区编号(Kabat EU索引)确定。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有带有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的Fc区，其中位置按照Kabat Fc区编号(Kabat EU索引)确定。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含：
a)一个针对特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
b)两个针对特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
c)一个针对特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点，或
d)两个针对特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点，
在情形b)和c)中，所述双特异性抗体的一条重链包含孔洞突变，并且相应的另一条链包含凸起突变。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含两个针对特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合半抗原化抗体的半抗原的结合特异性(所述半抗原化抗体特异性结合人Tau(pS422))(两个抗-半抗原结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8的结合特异性(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的非共价复合物，其中特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域其包含：(a)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQID NO：67的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的轻链CDR3。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的非共价复合物，其中特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是人源化的结合特异性。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的非共价复合物，其中特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))包含实施方案17中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的非共价复合物，其中特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQID NO：75的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的轻链CDR3。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的非共价复合物，其中特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：68或76的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的重链可变结构域(VH)。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的非共价复合物，其中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-洋地黄毒苷抗体保留结合洋地黄毒苷的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：68或76中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的非共价复合物，其中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的非共价复合物，其中所述洋地黄毒苷结合特异性包含SEQ ID NO：68或76中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的非共价复合物，其中特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其进一步包含与SEQ ID NO：72或80的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的非共价复合物，其中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-洋地黄毒苷抗体保留结合洋地黄毒苷的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：72或80中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的非共价复合物，其中，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的非共价复合物，其中所述洋地黄毒苷结合特异性包含SEQ ID NO：72或80中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
29.根据实施方案1-16中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含特异性结合生物素化的抗体的生物素的第一结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))(抗-生物素结合特异性；抗-BI结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
30.根据实施方案1-16和29中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合生物素化的有效负载物的结合特异性(两个抗-生物素结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
31.根据实施方案1-16和29-30中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQID NO：83的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的轻链CDR3。
32.根据实施方案1-16和29-31中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是人源化的结合特异性。
33.根据实施方案1-16和29-32中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))包含实施方案31中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
34.根据实施方案1-16和29-33中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体中的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQID NO：91的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的轻链CDR3。
35.根据实施方案1-16和29-34中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：84或92的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
36.根据实施方案1-16和29-35中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-生物素抗体保留结合生物素的能力。
37.根据实施方案1-16和29-36中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQ ID NO：84或92中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
38.根据实施方案1-16和29-37中任一项所述的非共价复合物，其中置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
39.根据实施方案1-16和29-38中任一项所述的非共价复合物，其中所述生物素结合特异性包含SEQ ID NO：84或92中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
40.根据实施方案1-16和29-39中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO：88或96的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
41.根据实施方案1-16和29-40中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-生物素抗体保留结合生物素的能力。
42.根据实施方案1-16和29-41中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQ ID NO：88或96中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
43.根据实施方案1-16和29-42中任一项所述的非共价复合物，其中所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
44.根据实施方案1-16和29-43中任一项所述的非共价复合物，其中所述生物素结合特异性包含SEQ ID NO：88或96中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
45.根据实施方案1-16中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含特异性结合茶碱化的有效负载物的第一结合特异性(抗-茶碱结合特异性；抗-THEO结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
46.根据实施方案1-16和45中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合茶碱化的有效负载物的结合特异性(两个抗-茶碱结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
47.根据实施方案1-16和45-46中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ IDNO：102的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的轻链CDR3。
48.根据实施方案1-16和45-47中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是人源化的结合特异性。
49.根据实施方案1-16和45-48中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))包含实施方案47中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
50.根据实施方案1-16和45-49中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列的轻链CDR3。
51.根据实施方案1-16和45-50中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：100或108的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
52.根据实施方案1-16和45-51中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-茶碱抗体保留结合茶碱的能力。
53.根据实施方案1-16和45-52中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQ ID NO：100或108中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
54.根据实施方案1-16和45-53中任一项所述的非共价复合物，其中置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
55.根据实施方案1-16和45-54中任一项所述的非共价复合物，其中所述茶碱结合特异性包含在SEQ ID NO：100或108中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
56.根据实施方案1-16和45-55中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO：104或112的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
57.根据实施方案1-16和45-56中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-茶碱抗体保留结合茶碱的能力。
58.根据实施方案1-16和45-57中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQ ID NO：104或112中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
59.根据实施方案1-16和45-58中任一项所述的非共价复合物，其中所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
60.根据实施方案1-16和45-59中任一项所述的非共价复合物，其中所述茶碱结合特异性包含SEQ ID NO：104或112中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
61.根据实施方案1-16中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含特异性结合荧光素化的有效负载物的第一结合特异性(抗-荧光素结合特异性；抗-FLUO结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
62.根据实施方案1-16和61中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合荧光素化的有效负载物的结合特异性(两个抗-荧光素结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
63.根据实施方案1-16和61-62中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ IDNO：113的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：118的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列的轻链CDR3。
64.根据实施方案1-16和61-63中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是人源化的结合特异性。
65.根据实施方案1-16和61-64中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))包含实施方案63中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
66.根据实施方案1-16和61-65中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
67.根据实施方案1-16和61-66中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-荧光素抗体保留结合荧光素的能力。
68.根据实施方案1-16和61-67中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQ ID NO：116中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
69.根据实施方案1-16和61-68中任一项所述的非共价复合物，其中置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
70.根据实施方案1-16和61-69中任一项所述的非共价复合物，其中所述荧光素结合特异性包含SEQ ID NO：116中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
71.根据实施方案1-16和61-70中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO：120的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
72.根据实施方案1-16和61-71中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-荧光素抗体保留结合荧光素的能力。
73.根据实施方案1-16和61-72中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQ ID NO：120中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
74.根据实施方案1-16和61-73中任一项所述的非共价复合物，其中所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
75.根据实施方案1-16和61-74中任一项所述的非共价复合物，其中所述荧光素结合特异性包含SEQ ID NO：120中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
76.根据实施方案1-16中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的第一结合特异性(抗-溴脱氧尿苷结合特异性；抗-BrdU结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
77.根据实施方案1-16和76中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的结合特异性(两个抗-溴脱氧尿苷结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
78.根据实施方案1-16和76-77中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQID NO：121的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的轻链CDR3。
79.根据实施方案1-16和76-78中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是人源化的结合特异性。
80.根据实施方案1-16和76-79中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))包含上述实施方案中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
81.根据实施方案1-16和76-80中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQID NO：121或122的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：123或124的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ IDNO：128的氨基酸序列的轻链CDR3。
82.根据实施方案1-16和76-81中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：129或131的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
83.根据实施方案1-16和76-82中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-溴脱氧尿苷抗体保留结合溴脱氧尿苷的能力。
84.根据实施方案1-16和76-83中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQ ID NO：129或131中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
85.根据实施方案1-16和76-84中任一项所述的非共价复合物，其中置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
86.根据实施方案1-16和76-85中任一项所述的非共价复合物，其中所述溴脱氧尿苷结合特异性包含SEQ ID NO：129或131中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
87.根据实施方案1-16和76-86中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合人Tau(pS422))是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ IDNO：130或132的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
88.根据实施方案1-16和76-87中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-溴脱氧尿苷抗体保留结合溴脱氧尿苷的能力。
89.根据实施方案1-16和76-88中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQ ID NO：130或132中共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
90.根据实施方案1-16和76-89中任一项所述的非共价复合物，其中所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
91.根据实施方案1-16和76-90中任一项所述的非共价复合物，其中所述溴脱氧尿苷结合特异性包含SEQ ID NO：130或132中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
92.根据实施方案1-91中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体包含在所述半抗原与所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体之间的接头。
93.根据实施方案92所述的非共价复合物，其中所述接头是肽接头。
94.根据实施方案92所述的非共价复合物，其中所述接头是化学接头(非肽接头)。
95.根据实施方案1-94中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是全长抗体。
96.根据实施方案1-95中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异性结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau。
97.根据实施方案1-96中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR。
98.根据实施方案1-97中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体还
a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或
b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR。
99.根据实施方案1-98中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR，或
c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08，09和10的HVR，并
且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR。100.根据实施方案1-99中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性
结合人Tau(pS422)的抗体包含：
a)SEQ ID NO：20的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或
b)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：16的轻链可变结构域，或
c)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或
d)SEQ ID NO：21的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域。
101.根据实施方案1-100中任一项所述的非共价复合物，其中所述非共价复合物用于治疗阿尔茨海默病。
102.根据实施方案1-101中任一项所述的非共价复合物，其中所述复合物中的两个抗体都是效应子功能沉默的。
103.根据实施方案1-102中任一项所述的非共价复合物，其中所述复合物中的两个抗体都不具有效应子功能。
104.根据实施方案1-103中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体。
105.根据实施方案1-104中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性
结合人Tau(pS422)的抗体具有如下EC50值：
a)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段，6ng/mL或更小，和/或
b)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)，4.5ng/mL或更小，和/或
c)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体，30ng/mL或更小，和/或
d)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau，125ng/mL或更小。
106.根据实施方案1-105中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)的抗体不结合人Tau(SEQ ID NO：01)。
107.根据实施方案1-106中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是单克隆抗体。
108.根据实施方案1-107中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是结合人Tau(pS422)并且具有以下性质的抗体片段：
i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
109.根据实施方案1-108中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是
a)人IgG1亚类的全长抗体，或
b)人IgG4亚类的全长抗体，或
c)具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的全长抗体，
d)具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类全长抗体，
e)在两条重链中都具有突变L234A、L235A和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG1亚类的全长抗体，或
f)在两条重链中都具有突变S228P和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG4亚类的全长抗体。
110.根据实施方案1-109中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：10的HVR，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的HVR，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
111.根据实施方案1-110中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：10的HVR，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：05和SEQ ID NO：15的HVR，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
112.根据实施方案1-111中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：10的HVR，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的HVR，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
113.根据实施方案1-112中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
114.根据实施方案1-113中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
115.根据实施方案1-114中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
116.根据实施方案1-115中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
117.根据实施方案1-116中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体在重链可变结构域中4、24和78位具有缬氨酸残基。
118.根据实施方案1-117中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体在重链可变结构域中71位具有精氨酸残基。
119.特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体与抗-人Tau(pS422)/半抗原双特异性抗体的非共价复合物。
120.包含特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体和双特异性抗体的非共价复合物，所述双特异性抗体具有特异性结合所述半抗原化抗体的半抗原的第一结合特异性(所述半抗原化抗体特异性结合血脑屏障受体)和特异性结合人Tau(pS422)的第二结合特异性，其中所述特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体通过所述双特异性抗体的第一结合特异性特异性结合。
121.根据实施方案119-120中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体选自由下述组成的组：特异性结合血脑屏障受体的生物素化的抗体，特异性结合血脑屏障受体的茶碱化的抗体，特异性结合血脑屏障受体的洋地黄毒苷化的抗体，特异性结合血脑屏障受体的碳硼烷化的抗体，特异性结合血脑屏障受体的荧光素化的抗体，特异性结合血脑屏障受体的helicarylated抗体和特异性结合血脑屏障受体的溴脱氧尿苷化的抗体。
122.根据实施方案119-121中任一项所述的非共价复合物，其中所述血脑屏障受体选自由下述组成的组：转铁蛋白受体(TfR)，胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体(IGF受体)，低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，和肝素-结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。
123.根据实施方案119-122中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体是包含两个结合位点的全长抗体。
124.根据实施方案119-123中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体是已经融合了一个或两个scFvs或scFabs或CrossFabs或scCrossFabs并且包含三个或四个结合位点的全长抗体。
125.根据实施方案119-124中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体选自抗体片段、F(ab')2和双抗体。
126.根据实施方案119-125中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体是人源化的抗体或人抗体。
127.根据实施方案119-126中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体没有效应子功能。
128.根据实施方案119-127中任一项所述的非共价复合物，其中实施方案所述双特异性抗体没有功能性Fc-区。
129.根据实施方案119-128中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体没有Fc-区。
130.根据实施方案119-129中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有包含突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的Fc-区，其中位置按照Kabat Fc-区编号(Kabat EU索引)确定。
131.根据实施方案119-129中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有包含突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的Fc-区，其中位置按照Kabat Fc-区编号(Kabat EU索引)确定。
132.根据实施方案119-131中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含：
a)一个针对特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
b)两个针对特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
c)一个针对特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
d)两个针对特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对人Tau(pS422)的结合位点，
其中在情形b)和c)中，所述双特异性抗体的一条重链包含孔洞突变，并且相应的另一条链包含凸起突变。
133.根据实施方案119-132中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含两个针对特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对人Tau(pS422)的结合位点。
134.根据实施方案119-133中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合半抗原化抗体的半抗原的结合特异性，所述半抗原化抗体特异性结合(人)转铁蛋白受体或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-半抗原结合特异性)。
135.根据实施方案119-134中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ IDNO：65的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的轻链CDR3。
136.根据实施方案119-135中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是人源化的结合特异性。
137.根据实施方案119-136中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)包含实施方案17的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
138.根据实施方案119-137中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ IDNO：73的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的轻链CDR3。
139.根据实施方案119-138中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：68或76的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
140.根据实施方案119-139中任一项所述的非共价复合物，其中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-洋地黄毒苷抗体保留结合洋地黄毒苷的能力。在某些实施方案中，，在SEQ ID NO：68或76中共有119-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
141.根据实施方案119-140中任一项所述的非共价复合物，其中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
142.根据实施方案119-141中任一项所述的非共价复合物，其中所述洋地黄毒苷结合特异性包含SEQ ID NO：68或76中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
143.根据实施方案119-142中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合洋地黄毒苷化的抗体的洋地黄毒苷的结合特异性(所述洋地黄毒苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其进一步包含与SEQ IDNO：72或80的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
144.根据实施方案119-143中任一项所述的非共价复合物，其中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-洋地黄毒苷抗体保留结合洋地黄毒苷的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：72或80中共有119-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
145.根据实施方案119-144中任一项所述的非共价复合物，其中，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
146.根据实施方案119-145中任一项所述的非共价复合物，其中所述洋地黄毒苷结合特异性包含SEQ ID NO：72或80中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
147.根据实施方案119-134中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含特异性结合生物素化的抗体的生物素的第一结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)和特异性结合人Tau(pS422)的第二结合特异性。
148.根据实施方案119-134和147中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合(人)转铁蛋白受体或所述生物素化的抗体特异性结合低密度脂蛋白受体相关蛋白8)(两个抗-生物素结合特异性)和两个特异性结合人Tau(pS422)的结合特异性。
149.根据实施方案119-134和147-148中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQID NO：83的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的轻链CDR3。
150.根据实施方案119-134和147-149中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是人源化的结合特异性.
151.根据实施方案119-134和147-150中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)包含实施方案149中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
152.根据实施方案119-134和147-151中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQID NO：91的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的轻链CDR3。
153.根据实施方案119-134和147-152中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：84或92的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
154.根据实施方案119-134和147-153中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-生物素抗体保留结合生物素的能力。
155.根据实施方案119-134和147-154中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQID NO：84或92中共有119-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
156.根据实施方案119-134和147-155中任一项所述的非共价复合物，其中置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
157.根据实施方案119-134和147-156中任一项所述的非共价复合物，其中所述生物素结合特异性包含SEQ ID NO：84或92中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
158.根据实施方案119-134和147-157中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合生物素化的抗体的生物素的结合特异性(所述生物素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO：88或96的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
159.根据实施方案119-134和147-158中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-生物素抗体保留结合生物素的能力。
160.根据实施方案119-134和147-159中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQID NO：88或96中共有119-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
161.根据实施方案119-134和147-160中任一项所述的非共价复合物，其中所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
162.根据实施方案119-134和147-161中任一项所述的非共价复合物，其中所述生物素结合特异性包含SEQ ID NO：88或96中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
163.根据实施方案119-133中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的第一结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合血脑屏障受体)和特异性结合人Tau(pS422)的第二结合特异性。
164.根据实施方案119-134和45中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合茶碱化的抗体的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合(人)转铁蛋白受体或所述抗体特异性结合低密度脂蛋白受体相关蛋白8)(two抗-茶碱结合特异性)和两个特异性结合人Tau(pS422)的结合特异性。
165.根据实施方案119-134和163-164中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ IDNO：99的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ IDNO：101的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的轻链CDR3。
166.根据实施方案119-134和163-165中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是人源化的结合特异性。
167.根据实施方案119-134和163-166中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合血脑屏障受体)包含实施方案165中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
168.根据实施方案119-134和163-167中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ IDNO：107的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列的轻链CDR3。
169.根据实施方案119-134和163-168中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：100或108的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
170.根据实施方案119-134和163-169中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-茶碱抗体保留结合茶碱的能力。
171.根据实施方案119-134和163-170中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQID NO：100或108中共有119-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
172.根据实施方案119-134和163-171中任一项所述的非共价复合物，其中置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
173.根据实施方案119-134和163-172中任一项所述的非共价复合物，其中所述茶碱结合特异性包含在SEQ ID NO：100或108中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
174.根据实施方案119-134和163-173中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合茶碱化的抗体的茶碱的结合特异性(所述茶碱化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO：104或112的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
175.根据实施方案119-134和163-174中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-茶碱抗体保留结合茶碱的能力。
176.根据实施方案119-134和163-175中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQID NO：104或112中共有119-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
177.根据实施方案119-134和163-176中任一项所述的非共价复合物，其中所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
178.根据实施方案119-134和163-177中任一项所述的非共价复合物，其中所述茶碱结合特异性包含SEQ ID NO：104或112中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
179.根据实施方案119-133中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含特异性结合荧光素化的抗体的第一结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)(抗-荧光素结合特异性；抗-FLUO结合特异性)和特异性结合人Tau(pS422)的第二结合特异性。
180.根据实施方案119-134和179中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合荧光素化的抗体结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合(人)转铁蛋白受体或所述抗体特异性结合低密度脂蛋白受体相关蛋白8)和特异性结合人Tau(pS422)的第二结合特异性。
181.根据实施方案119-134和179-180中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：118的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列的轻链CDR3。
182.根据实施方案119-134和179-181中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是人源化的结合特异性。
183.根据实施方案119-134和179-182中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)包含实施方案63中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
184.根据实施方案119-134和179-183中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
185.根据实施方案119-134和179-184中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-荧光素抗体保留结合荧光素的能力。
186.根据实施方案119-134和179-185中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQID NO：116中共有119-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
187.根据实施方案119-134和179-186中任一项所述的非共价复合物，其中置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
188.根据实施方案119-134和179-187中任一项所述的非共价复合物，其中所述荧光素结合特异性包含SEQ ID NO：116中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
189.根据实施方案119-134和179-188中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合荧光素化的抗体的荧光素的结合特异性(所述荧光素化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO：120的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
190.根据实施方案119-134和179-189中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-荧光素抗体保留结合荧光素的能力。
191.根据实施方案119-134和179-190中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQID NO：120中共有119-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
192.根据实施方案119-134和179-191中任一项所述的非共价复合物，其中所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
193.根据实施方案119-134和179-192中任一项所述的非共价复合物，其中所述荧光素结合特异性包含SEQ ID NO：120中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
194.根据实施方案119-133中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的第一结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)和特异性结合人Tau(pS422)的第二结合特异性。
195.根据实施方案119-134和194中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合(人)转铁蛋白受体或所述抗体特异性结合低密度脂蛋白受体相关蛋白8)和特异性结合人Tau(pS422)的第二结合特异性。
196.根据实施方案119-134和194-195中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的轻链CDR3。
197.根据实施方案119-134和194-196中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是人源化的结合特异性。
198.根据实施方案119-134和194-197中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)包含上述实施方案中的CDRs和接纳体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
199.根据实施方案119-134和194-198中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：121或122的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO：123或124的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的轻链CDR3。
200.根据实施方案119-134和194-199中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQID NO：129或131的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
201.根据实施方案119-134和194-200中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-溴脱氧尿苷抗体保留结合溴脱氧尿苷的能力。
202.根据实施方案119-134和194-201中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQID NO：129或131中共有119-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
203.根据实施方案119-134和194-202中任一项所述的非共价复合物，其中置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
204.根据实施方案119-134和194-203中任一项所述的非共价复合物，其中所述溴脱氧尿苷结合特异性包含SEQ ID NO：129或131中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
205.根据实施方案119-134和194-204中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的抗体的溴脱氧尿苷的结合特异性(所述溴脱氧尿苷化的抗体特异性结合血脑屏障受体)是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQID NO：130或132的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
206.根据实施方案119-134和194-205中任一项所述的非共价复合物，其中相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-溴脱氧尿苷抗体保留结合溴脱氧尿苷的能力。
207.根据实施方案119-134和194-206中任一项所述的非共价复合物，其中在SEQID NO：130或132中共有119-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
208.根据实施方案119-134和194-207中任一项所述的非共价复合物，其中所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即，在FRs)中。
209.根据实施方案119-134和194-208中任一项所述的非共价复合物，其中所述溴脱氧尿苷结合特异性包含SEQ ID NO：130或132中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
210.根据实施方案119-208中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体在所述半抗原与所述特异性结合血脑屏障受体的抗体之间包含接头。
211.根据实施方案210所述的非共价复合物，其中所述接头是肽接头。
212.根据实施方案210所述的非共价复合物，其中所述接头是化学接头(非肽接头)。
213.根据实施方案119-212中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合血脑屏障受体的抗体是全长抗体。
214.根据实施方案119-213中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异性结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau。
215.根据实施方案119-214中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR。
216.根据实施方案119-215中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体还
a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或
b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR。
217.根据实施方案119-216中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR，或
c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08，09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR。
218.根据实施方案119-217中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含：
a)SEQ ID NO：20的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或
b)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：16的轻链可变结构域，或
c)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或
d)SEQ ID NO：21的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域。
219.根据实施方案119-218中任一项所述的非共价复合物，其中所述非共价复合物用于治疗阿尔茨海默病。
220.根据实施方案119-219中任一项所述的非共价复合物，其中所述复合物中的两个抗体都是效应子功能沉默的。
221.根据实施方案119-220中任一项所述的非共价复合物，其中所述复合物中的两个抗体都不具有效应子功能。
222.根据实施方案119-221中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体。
223.根据实施方案119-222中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体具有如下EC50值：
a)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段，6ng/mL或更小，和/或
b)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)，4.5ng/mL或更小，和/或
c)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体，30ng/mL或更小，和/或
d)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau，125ng/mL或更小。
224.根据实施方案119-223中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)的抗体不结合人Tau(SEQ ID NO：01)。
225.根据实施方案119-224中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合血脑屏障受体的抗体是单克隆抗体。
226.根据实施方案119-225中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体是结合人Tau(pS422)并且具有以下性质的抗体片段：
i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
227.根据实施方案119-226中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合血脑屏障受体的抗体是
a)人IgG1亚类的全长抗体，或
b)人IgG4亚类的全长抗体，或
c)具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的全长抗体，
d)具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类全长抗体，
e)在两条重链中都具有突变L234A、L235A和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG1亚类的全长抗体，或
f)在两条重链中都具有突变S228P、L235E和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG4业类的全长抗体，或
g)在两条重链中都具有突变L234A、L235A和P329G和在一条重链中具有突变T366W和Y349C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和S354C的人IgG1亚类的全长抗体，或
h)在两条重链中都具有突变S228P、L235E和P329G和在一条重链中具有突变T366W和Y349C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和S354C的人IgG4亚类的全长抗体。
228.根据实施方案119-227中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：10的HVR，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的HVR，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
229.根据实施方案119-228中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：10的HVR，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：05和SEQ ID NO：15的HVR，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
230.根据实施方案119-229中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：10的HVR，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的HVR，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
231.根据实施方案119-230中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
232.根据实施方案119-231中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
233.根据实施方案119-232中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
234.根据实施方案119-233中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)包含两个抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人IgGl恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且
iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，
b)包含两个抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中
i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，
ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，
并且
c)i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或
vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或
vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或
viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或
ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。
235.根据实施方案119-234中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体在重链可变结构域中4、24和78位具有缬氨酸残基。
236.根据实施方案119-235中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体在重链可变结构域中71位具有精氨酸残基。
237.一种药物制剂，其包含实施方案1-236中任一项的非共价复合物和药用载体。
238.根据实施方案237所述的药物制剂，其中所述药物制剂还包含另外的治疗剂。
239.根据实施方案238所述的药物制剂，其中所述另外的治疗剂是抗-淀粉样蛋白治疗剂。
240.根据实施方案239所述的药物制剂，其中所述抗-淀粉样蛋白治疗剂是抗-人α-突触核蛋白抗体或抗-Aβ抗体。
241.根据实施方案239-122中任一项所述的药物制剂，其中所述抗-人α-突触核蛋白抗体或所述抗-Aβ抗体是半抗原化的。
242.根据实施方案239-123中任一项所述的药物制剂，其中所述抗-人α-突触核蛋白抗体或所述抗-Aβ抗体与抗-血脑屏障受体/半抗原双特异性抗体复合。
243.根据实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物，其用作药物。
244.根据实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物，其用于治疗阿尔茨海默病。
245.根据实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物，其用于治疗前驱阿尔茨海默病。
246.根据实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物，其用于治疗轻度阿尔茨海默病。
247.根据实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物，其用于减轻Tau(pS422)-诱导的神经变性。
248.根据实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物，其用于维持认知和功能。
249.根据实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物，其用于减缓认知和功能下降的速率。
250.实施方案1-236中任一项的非共价复合物在制备药物中的应用。
251.根据实施方案250所述的应用，其中所述药物用于治疗阿尔茨海默病。
252.根据实施方案250-251中任一项所述的应用，其中所述药物用于治疗前驱阿尔茨海默病。
253.根据实施方案250-251中任一项所述的应用，其中所述药物用于治疗轻度阿尔茨海默病。
254.根据实施方案250-251中任一项所述的应用，其中所述药物用于减轻Tau(pS422)诱导的神经变性。
255.根据实施方案250-251中任一项所述的应用，其中所述药物用于维持认知和功能。
256.根据实施方案250-251中任一项所述的应用，其中所述药物用于减缓认知和功能下降速率。
257.一种用于治疗患有阿尔茨海默病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物。
258.一种用于减少个体中Tau(pS422)诱导的神经变性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物以减少Tau(pS422)诱导的神经变性。
259.一种维持个体中认知和功能的方法，其包括向所述个体施用有效量的实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物以维持认知和功能。
260.一种减缓个体中认知和功能下降速率的方法，其包括向所述个体施用有效量的实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物以减缓认知和功能下降速率。
261.实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物在减轻Tau(pS422)诱导的神经变性方面的用途。
262.实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物在维持认知和功能方面的用途。
263.实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物在减缓认知和功能下降速率中的用途。
264.实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物在治疗阿尔茨海默病中的用途。
265.实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物保护免于发展为阿尔茨海默病的用途。
266.实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物终止阿尔茨海默病的进展的用途。
267.实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物用于预防人Tau(pS422)-相关的阿尔茨海默病扩散的用途。
268.实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物用于减少溶酶体膜分解的用途。
269.实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物用于针对人Tau(pS422)诱导的去稳定和/或分解作用使溶酶体膜稳定的用途。
270.实施方案1-236中任一项所述的非共价复合物用于防止阿尔茨海默病进展的用途。
V.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，考虑到上文提供的一般描述，可以实践多种其他实施方案。
材料和方法
重组DNA技术
如在Sambrook，J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989中描述的，使用标准方法操作DNA。根据制造商的使用说明使用分子生物试剂。
基因和寡核苷酸合成
通过在Geneart GmbH(Regensburg，Germany)化学合成制备所需的基因片段。将合成的基因片段克隆入大肠杆菌质粒中用于繁殖/扩增。亚克隆的基因片段的DNA序列通过DNA测序验证。备选地，通过将化学合成的寡核苷酸退火或经由PCR组装短的合成的DNA片段。通过metabion GmbH(Planegg-Martinsried，Germany)制备各个寡核苷酸。
试剂
如果没有另外陈述，根据制造商的方案如所提供的使用所有商业化学品、抗体或试剂盒。
实施例1
制备和纯化兔抗体
免疫
来自Charles River Laboratories International，Inc.的NZW兔用于免疫。偶联在KLH上的磷酸肽Tau(416-430)[pS422]以浓度为1mg/ml溶解于K3PO4缓冲液pH 7,0并且与完全弗氏佐剂(CFA)(1∶1)混合直至产生稳定乳剂。三只兔接收真皮内(i.d.)注射2ml的乳剂，随之为第二次肌内(i.m.)和第三次皮下(s.c)注射，每次用1ml以一周的间隔注射。两周后进行第四次i.m.注射1ml，接着以四周的间隔进行两次进一步的s.c注射1ml。在第三、四、五、六次注射后4-6天收集每只动物的10ml外周全血样品，并用于FACS中的单细胞分选。在相同时间收集每只动物的另外0,5ml血清并且用于确定Tau(416-463)[pS422]特异性抗体应答。
抗体应答
对免疫的抗体应答使用ELISA通过连续稀释的血清来确定，其中30ng/孔的生物素化的Tau(416-430)[pS422]在1x PBS中在4℃于链霉亲和素预包被的96孔微量滴定板(MC1347，Micro Coat Biotechnologie GmbH，Bernried，德国)上温育过夜。对于检测，连接至辣根过氧化物酶(The Jackson laboratory)的山羊抗兔IgG以1∶16,000稀释使用。来自罗氏诊断(RocheDiagnostics GmbH)的随时可用的BM Blue POD底物(沉淀四甲基联苯胺(TMB))用于显示。通过1N HCl终止反应并且在Tecan Infinite中通过450/690nm测量。
B-细胞克隆
板的包被
无菌链霉亲和素包被的6孔板(细胞培养级)与3种生物素化的对照肽(未磷酸化的Tau(416-430)，MCAK_人(88-102)[95-pSer]和MAP2_人(1802-1816)[pSer-1802])的混合物或与生物素化的磷酸肽Tau(416-430)[pS422](每种以PBS中0.5-1μg/ml的浓度)一起在室温温育1小时。使用前以无菌PBS洗涤板三次。细胞培养6孔板用碳酸盐缓冲液(0，1M碳酸氢钠，34mM碳酸氢二钠(Disodiumhydrogencarbonate)，pH 9.55)中2μg/ml KLH(匙孔血蓝蛋白)在4℃包被过夜。使用前在无菌PBS中洗涤板三次。
分离兔外周血单核细胞(PBMC)
在淋巴细胞分离哺乳动物(lympholyte mammal)(Cedarlane Laboratories)上的密度离心(进行其以分离兔PBMC)之前，含EDTA的全血用1xPBS稀释两倍。用抗体染色之前洗涤PBMCs两次。
EL-4B5培养基
RPMI 1640(Pan Biotech，Aidenbach，德国)，补充有10％FCS(Hyclone，Logan，UT，USA)，2mM谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素溶液(PAA，Pasching，Austria)，2mM丙酮酸钠，10mMHEPES(PAN Biotech，Aidenbach，德国)和0，05mM β-巯基乙醇(Gibco，Paisley，苏格兰)。
巨噬细胞/单核细胞的清除
无菌6孔板(细胞培养级)用于通过非特异性粘附清除巨噬细胞和单核细胞。孔用KLH(匙孔血蓝蛋白)或用链霉亲和素和对照肽包被。每个孔填充最大4ml培养基和至多6x106个来自免疫的兔的外周血单核细胞，并且允许在恒温箱中37℃结合1小时。上清液中50％的细胞用于淘选(panning)步骤；剩余的50％的细胞直接进行免疫荧光染色和单细胞分选。
在肽上淘选B细胞
用链霉亲和素和生物素化的肽Tau(416-430)[pS422]包被的6孔组织培养板接种至多6x106个细胞/4ml培养基，并且允许在恒温箱中在37℃结合1小时。未粘附的细胞通过用1xPBS小心地洗涤孔1-2次去除。剩余的粘着细胞通过胰蛋白酶在恒温箱中在37℃10分钟进行脱附，然后在培养基中洗涤两次。细胞保持在冰上直至进行免疫荧光染色。
免疫荧光染色和单细胞分选
用于单细胞分选的抗兔IgG FITC来自AbD Serotec(STAR121F，Düsseldorf，德国)。对于表面染色，来自清除和淘选步骤的细胞与PBS中抗兔IgG FITC抗体在冷室内于暗中在4℃滚动温育30分钟。离心后，上清液通过抽吸去除。PBMCs用冰冷PBS进行2个循环的离心和洗涤。最后，PBMCs在冰冷PBS中重悬浮并且立即进行FACS分析。在FACS分析前添加5μg/ml浓度的碘化丙啶(BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)以便分辨死亡细胞和活细胞。FACS使用带有FACSDiva软件的Becton Dickinson FACSAria(BD Biosciences，USA)进行，单个、FITC-标记的活细胞沉积于96孔板中。
B-细胞培养
B细胞培养通过类似于Zubler，R.H.等，免疫学杂志(J.Immunol.)134(1985)3662-3668所述的方法制备。简言之，单个分选的B细胞在96孔板中培养，用210μl/孔EL-4B5培养基和Pansorbin细胞(1∶20000)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，德国)，5％兔胸腺细胞上清液和γ-照射的EL-4-B5鼠胸腺瘤细胞(2×104个/孔)于恒温箱中在5％CO2的气氛中37℃培养7天。为了筛选，去除B细胞培养上清液，立即收获细胞用于可变区基因克隆或在100μlRLT缓冲液(Qiagen，Hilden，德国)中冰冻于-80℃。
B-细胞克隆筛选
通过ELISA筛选B细胞培养上清液对生物素化的Tau(416-430)[pS422]的结合。非磷酸化的Tau(416-430)，KLH(匙孔血蓝蛋白)和不相关的磷酸肽MCAK_人(88-102)[95-pSer]用作对照抗原。对于ELISA板的制备，链霉亲和素预包被的微量滴定板与50ng/ml的生物素化的Tau(415-430)[pS422]在室温温育1小时。KLH或对照肽的包被于1μg/mL进行。B细胞上清液以1∶5至1∶10稀释并且与抗原包被的微量滴定板温育60分钟。强烈洗涤后，兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。与生物素化的Tau(416-430)[pS422]但是不与KLH和MCAK_人(88-102)[95-pSer]产生高于背景的信号的B细胞克隆被进一步考虑，并且进行可变区基因克隆。
V-结构域的PCR扩增和测序
总RNA使用8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4，740698)根据制造商的方案制备。所有步骤在epMotion 5075液体处理系统(Eppendorf)上进行。RNA用60μl无RNAse水洗脱。6μl的RNA用于通过逆转录酶反应使用Superscript III第一链合成超混合物(Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix，Invitrogen 18080-400)和寡聚dT引物根据制造商的说明产生cDNA。4μl的cDNA用于扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)，使用AccuPrime Super Mix(Invitrogen 12344-040)，终体积50μl，使用引物rbHCfinal.up和rbHCfinal.do用于重链和使用引物rbLCfinal.up和rbLCfinal.do用于轻链(参见下表)。PCR条件如下：热启动于94℃5min；94℃，20s，70℃，20s，68℃，45s，35个循环；最终延伸在68℃进行7min。
表：
50μl PCR溶液中的8μl加载于48E-Gel 2％(Invitrogen G8008-02)上。阳性PCR反应物使用Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)根据制造商的方案清洁并且洗脱在50μl洗脱缓冲液中。12μl的纯化的PCR产物在两个方向上使用rbHCfinal.up和rbHCfinal.do用于重链和rbLCfinal.up和rbLCfinal.do用于轻链(参见上表)进行直接测序。
兔单克隆抗体和兔/小鼠嵌合抗体的重组表达
为了重组表达兔单克隆抗体，编码VH或VL的PCR产物作为cDNA通过悬突(overhang)克隆方法(Haun，R.S.等人，生物技术(BioTechniques)13(1992)515-518；Li，M.Z.，等人，自然方法(Nature Methods)4(2007)251-256)克隆至表达载体中。编码兔κ或γ恒定区的线性化表达质粒和VL或VH插入物通过PCR使用重叠引物扩增。纯化的PCR产物与产生单链悬突的T4DNA聚合酶温育。反应通过添加dCTP终止。下一步，质粒和插入物组合并且与诱导位点特异性重组的RecA温育。重组质粒转化入大肠杆菌中。次日，挑选生长的克隆并且通过质粒制备、限制性分析和DNA测序测试正确重组的质粒。对于抗体表达，分离的HC和LC质粒瞬时共转染至HEK293细胞中，1周后收获上清液。为了克隆和表达兔小鼠嵌合抗体，VH和VL区通过PCR扩增并且亚克隆至含有小鼠恒定κ区或小鼠恒定γ1区的表达载体中。兔/小鼠嵌合HC和LC质粒被分离，通过限制性分析和DNA测序检测正确的插入，并且瞬时共转染至HEK293细胞中。转染后一周收集上清液。
抗体纯化
在MabSelectSuReTM柱(GE Healthcare)上从细胞培养上清液中纯化重组表达的兔抗体。样品装载前，柱用25mmol/L Tris-HCl，25mmol/L NaCl，pH 7.4平衡。抗体洗脱用50mmol/L乙酸盐pH3.14完成。洗脱的样品立即装载于脱盐柱(SephadexG25，GEHealthcare)并且在20mmol/L His-HCl，140mmol/L NaCl pH 6.0中洗脱。这种缓冲液也用于储存纯化的抗体。在纯化过程中一般存储温度是4℃，室温，在分装后为-80℃。来自细胞培养上清液的重组表达的兔/小鼠嵌合抗体在MabSelectSuReTM柱(GE Healthcare)上纯化。样品装载前，柱用1x PBS，pH 7.4平衡。抗体洗脱用100mmol/L柠檬酸盐pH 3.0完成。洗脱的样品立即用2mol/L Tris/HCl pH9.0中和。然后，抗体装载于尺寸排阻柱(Superdex 200，GEHealthcare)上并且在20mmol/L His-HCl，140mmol/L NaCl pH 6.0中洗脱。这种缓冲液也用于储存纯化的抗体。在纯化过程中一般存储温度是4℃，室温，在分装后为-80℃。
实施例2
抗-Tau pS422单克隆兔抗体对在pS422磷酸化的Tau是高度选择性的并且结合TaupS422的原纤维聚集体
ELISA
兔单克隆抗体在HEK 293细胞中重组表达。通过ELISA测试细胞培养上清液或纯化的兔抗体对生物素化的Tau(416-430)[pS422]，非磷酸化的Tau(416-430)，KLH(匙孔血蓝蛋白)和不相关的磷酸肽MCAK_人(88-102)[95-pSer]的结合。为了制备ELISA板，链霉亲和素预包被的微量滴定板与50ng/ml的生物素化的Tau(415-430)[pS422]在室温温育1小时。用KLH或对照肽的包被于1μg/mL进行。不同浓度的兔抗Tau pS422抗体(Abcam AB51071)或含有兔抗体的上清液在抗原标记的微量滴定板中温育60分钟。强烈洗涤后，兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。抗体结合通过其EC50值表征。结合生物素化的Tau(416-430)[pS422]和非磷酸化的Tau(416-430)肽的抗体通过其EC50值表征。与KLH或MCAK磷酸肽的交叉反应性在高浓度(即细胞培养上清液的1∶5稀释)下通过单点测量来估计。结果显示于下表中。发现结合Tau磷酸肽的EC50值比结合Tau肽的EC50值低超过100倍，表明与非磷酸化的Tau肽相比较，对磷酸化的Tau片段至少100倍的选择性。对于所有抗体，与KLH和MCAK对照磷酸肽的结合在背景水平，其是用Tau磷酸肽测量的最大值的约1＜3％。
表：
也测试了对可溶性和聚集的全长Tau pS422的特异性。Tau pS422的原纤维聚集体(300μg/ml)在RT过夜包被于基于聚苯乙烯的Maxisorb微量滴定板(Nunc)。以类似的方式，可溶性全长Tau和Tau pS422包被于Maxisorb微量滴定板。添加兔抗Tau pS422抗体对照(Abcam AB51071)或纯化的兔抗体并且以至多1000ng/ml的浓度温育60分钟。强烈洗涤后，对兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。抗体结合通过其EC50值表征。结果显示于下表中。
表：
兔单克隆抗体以低于1ng/ml的EC50值结合Tau-pS422蛋白。检测的原纤维的TaupS422的EC50值范围为0.4ng/ml至14ng/ml。结合非磷酸化的全长Tau蛋白的信号与背景水平不可区分。因此，估计相比于Tau，每种抗体以至少100倍的选择性结合Tau pS422和原纤维的Tau pS422。
BIAcore TM
通过BIAcoreTM分析进一步研究和确认对原纤维的Tau pS422聚集体的结合。测量使用BIAcore 3000仪器在37℃实施。系统和样品缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES，150mMNaCl，3.4mM EDTA，0.005％聚山梨酯20(v/v))。BIAcoreTM CM5传感器芯片进行预处理程序。对于流动池FC1，FC2，FC3和FC4相继注射0.1％SDS，50mM NaOH，10mM HCl和100mM H3PO4达30秒。使用BIAcore 3000TM wizard v.4.1根据制造商说明书进行胺偶联程序。在EDC/NHS活化传感器表面后，非-磷酸选择性的抗-Tau抗体mAb<TAU>M-4/53-IgG固定在传感器流动池FC2，FC3和FC4上。作为对照，针对CK-MM(肌酸激酶同种型)的抗体，其识别不相关抗原，被捕获于FC1。mAb<TAU>M-4/53-IgG和针对CK-MM的抗体以30μg/ml稀释在10mM NaAc pH 5.0中，并且以10μl/min注射7min接触时间以固定10.000RU的抗体捕获系统。表面通过1M乙醇胺去活化。传感器通过5个循环的用磷酸化的丝状Tau蛋白(原液0.3mg/ml，在HBS-EP中1∶100稀释)作为溶液中的分析物以10μl/min进行2min来适应。再生用10mM甘氨酸pH 2.5以30μl/min进行3min。推定结合mAb4/53的分析物不解离pTau丝，因为没有观察到pTau丝从mAb 4/53的解离。对于所有进一步的测量循环，0.3mg/ml pTau丝在HBS-EP缓冲液中稀释1∶100并且以10μl/min注射1min，以便以异质夹心方式(heterogeneous sandwich-mode)将pTau呈递给相应抗体分析物。抗体分析物在HBS-EP缓冲液中稀释至100nM浓度并且以20μl/min注射3min至系统中。3min解离后，通过以100μl/min 2次注射10mM甘氨酸pH 2.51min随之以100μl/min HBS洗涤15秒使传感器表面再生。监测相互作用的结合和解离相。由于溶液中的抗体分析物是二价的，所以抗体亲抗原性负荷的(avidity-burdened)抗体-pTau动力学通过二相性解离模型表征，其由下述组成：快速的基于亲和力(affinity-based)的早期解离步骤，随之是后面的复合物解离中的抗体亲抗原性稳定的(avidity-stabilized)但是限速的动力学步骤。分析物注射结束后10秒(早期)和50秒(晚期)，如果可能，定量kd和t/2diss。动力学测量使用双重参照程序评价。首先来自FC1参照的信号被扣除以纠正缓冲液体积效应和非特异性结合。次之0nM分析物注射被扣除以纠正来自各自捕获系统的一级抗体的解离。动力学速率使用Langmuir 1.1解离拟合模型、根据BIAcoreTM评价软件v.4.1进行评价。抗原/抗体复合物稳定性半衰期(min)根据公式ln(2)/60*kd计算。
结果总结于下表中。
表：
实施例3
抗-Tau pS422单克隆兔抗体对阿尔茨海默病患者脑切片中细胞内pTau的结合
通过免疫荧光染色实验，使用来自AD患者的人脑组织的低温切片来研究通过单克隆兔抗-Tau pS422抗体特异性和灵敏性免疫组织化学检测阿尔茨海默病脑组织中的pTau病理学。该程序与实施例X(鼠抗体)中所述的基本相同。兔IgGs通过山羊抗兔Alexa缀合的二抗(Invitrogen/Molecular Probes A11034)检测。对于克隆Mab 005，Mab 019，Mab 020，Mab 085，Mab 086和Mab 097，pTau沉积和丝的特异性和灵敏性染色是明显的。细胞内pTau沉积，如大的神经原纤维缠结和延长的嗜中性粒细胞丝线是显著的。对于所有研究的克隆，确定了范围在0.08和0.016μg/ml之间的最小有效浓度，其表明对真正的人pTau沉积的高敏感性的结合。
实施例4
兔抗人Tau(pS422)抗体的人源化
如本文使用的“可变结构域”(轻链(VL)的可变结构域，重链(VH)的可变结构域)表示直接参与抗体与Tau(pS422)抗原的结合的轻链和重链结构域对的每一个。可变轻链和重链结构域具有相同的一般结构并且每个结构域包含由三个“高变区”连接的序列广泛保守的四个框架(FR)区。
计算机模拟(in silico)分析兔抗体mAb 086的VH和VL结构域的结构，并且与人VH和VL结构域的结构数据库(IMGT)比较。选择一组结构最类似的V结构域用于将兔抗体的CDR接枝到选择的人VH和VL结构域上。此外，考虑一级序列的相似性，通过将兔抗体的VH和VL结构域的一级序列与人V结构域组库(repertoire)比对来缩小对人V结构域的选择。在一些人源化变体中在人框架区内引入向兔母体残基的回复突变。类似地，在适于可能增加对抗原的亲和力的情况下，在一些变体中引入CDR的突变，以维持CDR三级结构，并且移除不希望的特征如半胱氨酸残基或可以在抗体纯化后经历修饰的残基。
将含有人源化的变体中的每一个的重链和轻链载体以矩阵的方式共转染入微量滴定培养板中的HEK293悬浮细胞中，获得表达所有可能轻链/重链组合的全尺寸IgG的细胞培养物。在37℃5天的培养后，收获上清并以微量滴定规模通过蛋白A亲和层析纯化。
实施例5
重组表达载体的产生
a)用于表达使用人IgG1恒定区的免疫球蛋白重链的载体的产生
编码包含人IgG1恒定区(CH1，铰链，CH2，CH3)和源自兔抗体Mab086的人源化的抗人Tau(pS422)抗体VH结构域的融合基因的人源化的重链，通过将编码各个抗人Tau(pS422)-特异性抗体VH结构域的DNA片段与编码人IgGl恒定区的序列元件融合来组装。
所述人IgG1恒定区具有以下氨基酸序列：
(SEQ ID NO：58)。
表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗体重链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：
-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，其包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码重链可变(VH)结构域的核酸，
-编码人IgG1恒定区的核酸，和
-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
b)表达使用人Ig-κ恒定区的免疫球蛋白轻链的载体的产生
编码包含人Ig-κ恒定区(CL-κ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(pS422)抗体VL(κ)结构域的融合基因的人源化的κ轻链通过将编码各个抗人Tau(pS422)抗体VL(κ)结构域的DNA片段与编码人Ig-κ恒定区的序列元件融合来组装。
所述人Ig-κ恒定区具有以下氨基酸序列：
(SEQ ID NO：59)。
所述表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗体κ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：
-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，其包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码轻链可变(VL)结构域的核酸，
-编码人Ig-κ恒定区的核酸，和
-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
c)用于表达使用人Ig-λ恒定区的免疫球蛋白轻链的载体的产生
编码包含人Ig-λ恒定区(CL-λ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(pS422)抗体VL(λ)结构域的融合基因的人源化的λ轻链通过将编码各个抗人Tau(pS422)抗体VL(λ)结构域的DNA片段与编码人Ig-λ恒定区的序列元件融合来组装。
所述人Ig-λ恒定区具有以下氨基酸序列：
(SEQ ID NO：60)。
所述表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗体λ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：
-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，其包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码可变轻链(VL)结构域的核酸，
-编码人Ig-λ恒定区的核酸，和
-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
d)用于使用人Ig-κ恒定区的免疫球蛋白κ轻链的表达的载体的产生
编码包含人Ig-κ恒定区(CL-κ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(S422)抗体VL(κ)结构域的融合基因的人Ig-κ轻链，通过将编码各个抗人Tau(pS422)-抗体VL(κ)结构域的DNA片段与编码人Ig-κ恒定区的序列元件融合来组装。该构建体在基因组结构中，即内含子存在于信号肽中以及在VL(κ)和CL-κ结构域之间。
所述表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗体κ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：
-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码轻链可变(VL)结构域的核酸，
-人IgG κ恒定区，和
-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
e)用于表达使用人Ig-λ恒定区的免疫球蛋白λ轻链的载体的产生
编码包含人Ig-λ恒定区(CL-λ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(S422)抗体VL(λ)结构域的融合基因的人Ig-λ轻链，通过将编码各个抗人Tau(pS422)-抗体VL(λ)结构域的DNA片段与编码人Ig-λ恒定区的序列元件融合来组装。该构建体在基因组结构中，即内含子存在于信号肽中以及在VL(λ)和CL-λ结构域之间。
所述表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗体λ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：
-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码轻链可变(VL)结构域的核酸，
-人IgGλ恒定区，和
-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
实施例6
抗人Tau(pS422)抗体的重组生产
在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(人胚肾细胞系293-衍生的)中生产抗体。对于如在实施例5中描述的各个载体的转染，使用″无293(293-Free)″转染试剂(Novagen)。从个体表达质粒表达抗体。如在制造商的使用说明中指明的进行转染。转染后三至七天，收获含有重组抗体的细胞培养上清。在降低的温度(例如-80℃)储存上清，直到纯化。
关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息在：Meissner，P.等人，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出。
实施例7
重组抗人Tau(pS422)抗体的纯化
过滤含有抗体的培养上清并通过两个层析步骤纯化。
使用用PBS(1mM KH2PO4，10mM Na2HPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl)，pH 7.4平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)，通过亲和层析捕获抗体。通过用平衡缓冲液洗涤移除未结合的蛋白，并且用25mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.1回收抗体，其在洗脱后立即用1MTris-碱，pH 9.0调节至pH 6.0。
使用Superdex 200TM(GE Healthcare)上的尺寸排阻层析作为第二纯化步骤。在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行尺寸排阻层析。将含有抗体的溶液用装有Biomax-SK膜的Ultrafree-CL离心过滤设备(Millipore，Billerica，MA，USA)浓缩并在-80℃储存。
实施例8
动力学筛选
根据Schraeml等人(Schraeml，M.和M.Biehl，Methods Mol.Biol.901(2012)171-181)在装有BIAcore CM5传感器的BIAcore 4000仪器上进行动力学筛选。BIAcore 4000仪器在软件版本V1.1的控制下。根据制造商的说明将BIAcore CM5系列S芯片安装入所述仪器并且液体动力学处理和预处理。仪器缓冲液为HBS-EP缓冲液(10mM HEPES(pH 7.4)，150mMNaCl，1mM EDTA，0.05％(w/v)P20)。在传感器表面准备抗体捕获系统。使用NHS/EDC化学将具有人IgG-Fc特异性的多克隆山羊抗人抗体(Jackson Lab.)以在10mM乙酸钠缓冲液(pH5)中的30μg/ml，以10,000RU固定于仪器的流路池1、2、3和4中的点1、2、4和5。在各个流路池中，在点1和点5上捕获抗体。点2和点4用作参照点。将传感器用1M乙醇胺溶液去活化。将人源化的抗体衍生物以在补充以1mg/ml CMD(羧甲基右旋糖苷)的仪器缓冲液中44nM至70nM的浓度施用。将抗体以30μl/min的流速注射2min。表面存在的抗体的捕获水平(CL)以相对响应单位(RU)测量。将溶液中的分析物、磷酸化的人tau蛋白、非磷酸化的人tau蛋白和磷酸化的人tau突变体蛋白T422S以300nM，以30μl/min的流速注射3min。监测解离5min。捕获系统通过以30μL/min向所有流路池注射10mM甘氨酸缓冲液pH 1.7达1min来再生。两个报告点(在分析物注射结束之前不久记录的信号(表示为结合晚期(BL))和解离时间结束之前不久记录的信号，(稳定晚期(SL)))用于表征动力学筛选性能。此外，根据Langmuir模型计算解离速率常数kd(1/s)并且根据公式ln(2)/(60*kd)以分钟计，计算抗体/抗原复合体半衰期。根据公式MR＝(结合晚期(RU))/(捕获水平(RU))*(MW(抗体)/(MW(抗原))计算摩尔比(MR)。在传感器配置以合适量的抗体配体捕获水平的情形中，各个抗体应该能够至少功能性结合溶液中的一种分析物，其由MR＝1.0的摩尔比来表示。然后，摩尔比还是分析物结合的化合价模式的指征。对于结合两个分析物的抗体，最大化合价可以是MR＝2，每个Fab化合价为一。
在另一个实施方案中，在25℃和37℃，使用相同实验设置，但使用在0nM(缓冲液)，1.2nM，3.7nM，11.1nM，33.3nM，100nM和300nM的溶液中的多种浓度系列的各个分析物，确定动力学速率。从浓度依赖性结合行为，使用BIAcore评价软件，根据制造商的使用说明和具有RMAX整体(global)的Langmuir 1.1模型，计算动力学数据。
实施例9
ELISA
向未包被的Maxisorb板中加入PBS中的非生物素化的肽/蛋白/聚集体，并且向链霉亲和素包被的Maxisorb板中加入PBS中的生物素化的肽/蛋白/聚集体，并孵育过夜。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液(1x PBS/0.1％吐温20)洗涤三次。通过孵育一小时，剩余的反应性点用封闭缓冲液(1xPBS/2％BSA(牛血清白蛋白级分V，无脂肪酸，Roche，Cat.No.：10735078001)/0.05％吐温20)封闭。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液洗涤三次。以在ELISA缓冲液(1xPBS/0.5％BSA(牛血清白蛋白级分V，无脂肪酸，Roche，Cat.No.：10735078001)/0.05％吐温20)中的12个稀释(1∶2)制备样品和对照抗体，起始浓度为500ng/ml。在室温在摇床上孵育时间为60分钟。弃上清并且将孔用90ul洗涤缓冲液洗涤三次。在ELISA缓冲液中制备二抗溶液。将总共25μl抗体混合物转移到测定板的所有孔中并且之后将板在室温在摇床上孵育60分钟。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液洗涤三次。向所有孔中加入25μl的ABTS溶液。在405nm-492nm读取吸光度。
实施例10
重组人源化的抗-生物素抗体与生物素-标记的化合物(半抗原化的化合物)的结合
为了确定人源化方法和后续引入半胱氨酸突变是否产生保留完全的结合活性的衍生物，进行下述实验。
使用Octet QK仪器(Fortebio Inc.)通过生物层干涉测量(BLI)技术分析重组抗-生物素抗体衍生物的结合特性。充分建立该系统用于分子相互作用的研究。BLi-技术是基于测量从生物传感器尖端表面和内部参比反射的白光的干扰模式。分子与生物传感器尖端的结合导致可以测量的干扰模式的转换。为了分析上述人源化方法是否消除抗-生物素抗体结合生物素的能力，直接比较抗体的嵌合版本和人源化版本在它们结合生物素化的蛋白的能力方面的特性。通过在抗-hulgG Fc抗体捕获(anti-huIgG Fc antibody Capture(AHC))生物传感器(Fortebio Inc.)捕获抗-生物素抗体而进行结合研究。首先，将生物传感器在抗体溶液中温育1分钟，所述抗体溶液在20mM组氨酸、140mM NaCl、pH 6.0中，浓度为0.5mg/ml。然后，将生物传感器在1x PBS pH 7.4中温育1分钟，以达到稳定的基线。通过将抗体-包被的生物传感器在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中包含浓度为0.06mg/ml的生物素化的蛋白的溶液中温育5分钟而测量结合。在1x PBS pH 7.4中监测解离5分钟。直接比较关于嵌合的和人源化的抗-生物素抗体得到的结合曲线。
所述抗体的人源化版本显示出与嵌合抗体相等的或甚至比其更好的与生物素化的抗原的结合。生物素化的蛋白表现出针对所述生物传感器的残留的非特异性结合，当用不结合生物素的赫赛汀(Herceptin)包被生物传感器时，所述残留的非特异性结合减少。因此，在其人源化的变体(其由SEQ ID NO：92和96中所述的序列定义)中保留抗-生物素抗体的功能性。
表面等离子体共振
表面等离子体共振测量在T200仪器(GE Healthcare BiosciencesAB，Sweden)上在25℃进行。通过使用GE Healthcare(BR-1000-50)提供的标准胺偶联试剂盒，在pH 5.0在CM3芯片(GE Healthcare，BR-1005-36)上偶联约4300个共振单位(RU)的捕获系统(来自人抗体捕获试剂盒的10μg/ml抗-人捕获(IgG Fc)，BR-1008-39，GEHealthcare Biosciences AB，Sweden)。用于胺偶联的运行缓冲液是HBS-N(10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，GE Healthcare，BR-1006-70)。用于之后的结合研究的运行和稀释缓冲液是PBS-T(包含0.05％吐温20的10mM磷酸盐缓冲盐水)pH 7.4。通过以5μl/min的流速注入2nM溶液60秒而捕获人源化的抗-生物素抗体。将生物素化的siRNA用PBS-T稀释为0.14-100nM的浓度(1∶3连续稀释)。通过以30μl/min的流速注入每个浓度180秒而测量结合，解离时间为600秒。通过以5μl/min的流速用3M MgCl2溶液洗涤30秒而使表面再生。利用BIAevaluation软件(GE Healthcare Biosciences AB，Sweden)来评价数据。通过减去从抗-人IgG Fc表面获得的反应而校正本体折射率差异。还减去空白注射(＝双重参比)。为了计算KD和动力学参数，使用朗格缪尔1∶1模型(Langmuir 1∶1model)。
对人源化的抗-生物素抗体SEQ ID NO：92和96通过表面等离子体共振(SPR)进行动力学结合分析。浓度为2nM的抗-生物素抗体由结合在CM3传感器芯片上的抗-人IgG Fc抗体捕获。在浓度0.41，1.23，3.7，11.1，33.3，100和300nM记录生物素化的siRNA(Mw：13868Da)的结合。测量一式两份进行。关于人源化的抗-生物素抗体计算的KD为0.633nM。
实施例11
产生半抗原化的化合物与抗-半抗原抗体的非共价复合物
通用方法：
抗-半抗原抗体与半抗原化的化合物(＝缀合有效负载物的半抗原)的复合物的产生将导致确定的复合物，并且应该确保在这些复合物中的化合物(＝有效负载物)保留其活性。为了产生半抗原化的化合物与各自的抗-半抗原抗体的复合物，将所述半抗原化的化合物溶解在H2O中至1mg/ml的终浓度。将抗体在20mM组氨酸缓冲液，140mM NaCl，pH＝6.0中浓缩至1mg/ml(4.85μM)。半抗原化的有效负载物和抗体以2∶1的摩尔比例(化合物比抗体)通过吸上吸下而混合，并且在室温(RT)温育15分钟。
备选地，将半抗原化的化合物溶解在100％DMF至10mg/ml的终浓度。将抗体在50mMTris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.2中浓缩至10mg/ml的终浓度。将半抗原化的化合物和抗体以2.5∶1的摩尔比例(化合物比抗体)通过吸上吸下而混合，并且在室温(RT)和350rpm温育60分钟。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的复合物-洋地黄毒苷-PYY(3-36)/ 抗-洋地黄毒苷抗体复合物-的示例性方法
为了产生洋地黄毒苷化的多肽与抗-洋地黄毒苷抗体的非共价复合物，还将鼠杂交瘤来源的抗体(从10mM KPO4，70mM NaCl；pH 7.5冻干)溶解在12ml水中，并且针对包含20mM组氨酸、140mM NaCl pH 6.0的溶液偷袭，产生在11ml缓冲液中的300mg(2x 10-6mol)(c＝27.3mg/ml)。在1小时内以4部分2.85mg加入洋地黄毒苷-PYY(3-36)缀合物(11.57mg，4x10-6mol，2当量)，并在室温再温育一小时。复合反应结束后，经由Superdex 200 26/60GL柱(320ml)，在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中，以2.5ml/min的流速，通过大小排阻层析纯化复合物。洗脱下来的复合物收集在4ml级分中，汇合，并且针对0.2μm滤器除菌，产生浓度为14.3mg/ml的234mg复合物。以相似的方式，为了产生人源化的抗-洋地黄毒苷抗体的复合物，将抗体调整至在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中10.6mg/ml(9.81mg，6.5x10-8mol，0.93ml)的浓度。向所述抗体溶液中加入作为冻干物的0.57mg＝1.97x10-7mol＝3.03当量的洋地黄毒苷化的多肽(DIG-PYY)。将多肽和抗体在室温温育1.5小时。经由Superose 6 10/300GL柱，在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中，以0.5ml/min的流速，通过大小排阻层析去除过量的多肽。洗脱下来的复合物收集在0.5ml级分中，汇集，并且用0.2μm滤器除菌，产生浓度为1.86mg/ml的4.7mg复合物。
由于在大小排阻层析中存在单个峰，将得到的半抗原化的多肽-抗-半抗原抗体复合物定义为单体IgG样分子。得到的复合物定义为每个抗体分子携带两个洋地黄毒苷-PYY衍生物的单体IgG样分子。通过大小排阻层析验证这些肽复合物的确定组成，这还表明不存在蛋白聚集物。这些双特异性肽的确定的组成(和2∶1的多肽与蛋白的比例)还通过SEC-MALS(大小排阻层析-多角度光散射)得以证实。对于SEC-MALS分析，使用1x PBS pH 7.4作为移动相，将100-500μg各种样品以0.25-0.5ml/min的流速应用到Superdex 20010/300GL大小排阻柱上。使用Wyatt MiniDawn TREOS/QELS检测器检测光散射，用Wyatt OptilabrEX-检测器测量折射率。用软件ASTRA(版本5.3.4.14)分析得到的数据。SEC-MALLS分析的结构提供关于复合物的质量、半径和大小的信息。然后，将这些数据与对应的未复合的抗体的那些数据进行比较。这些实验的结果证明，将洋地黄毒苷化的-PYY暴露于抗-洋地黄毒苷抗体产生每个抗体分子包含两个洋地黄毒苷-PYY衍生物的复合物。因此，洋地黄毒苷化的PYY可以在确定的位点(结合区)和以确定的化学计量与抗-洋地黄毒苷抗体复合。
通过表面等离子体共振研究表征复合物提供了关于复合反应产生确定的且完全复合的分子的另外的证据。抗-洋地黄毒苷抗体可以结合到SPR芯片上，这导致信号增加。后续加入洋地黄毒苷-PYY缀合物导致进一步的信号增加，直到所有的结合位点都完全被占据。在这些条件，加入更多的洋地黄毒苷-PYY不使信号进一步增加。这表明复合反应是特异性的，并且信号不是由洋地黄毒苷化的多肽的非特异性粘性(non-specific stickiness)引起的。
用于产生半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的复合物-Ac-PYY-PEG3-Cvs-PEG2- Biot)/嵌合的抗-生物素抗体复合物-的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素化的-PYY-多肽的非共价复合物，将0.16mg Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot溶解在100％DMF中至10mg/ml的浓度。抗体以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA构成的pH 8.2的缓冲液中10.7mg/ml(约73μM)的浓度使用。Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot和抗体以2.5∶1的摩尔比例(Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot比抗体)混合，并且在室温(RT)和350rpm温育60分钟。通过大小排阻层析，将得到的复合物定义为63％的单体IgG样分子和37％的二聚体可溶性聚集物。得到的复合物进一步通过SDS-PAGE和后续的蛋白质印迹分析进行分析。将10μg的复合物与4x LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合，并且在95℃温育5分钟。将样品用于4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)，其以200V和120mA运行35分钟。将在聚丙烯酰胺凝胶上分离的分子以25V和160mA转移到PVDF膜(0.2μm孔尺寸，Invitrogen)40分钟。将膜在1x PBST(1x PBS+0.1％吐温20)中的1％(W/V)脱脂乳中在室温(RT)封闭1小时。将膜在1x PBST中洗涤3次持续5分钟，然后用以1∶2000稀释液使用的链霉抗生物素蛋白-POD-缀合物(2900U/ml，Roche)温育。使用Lumi-Light蛋白质印迹底物(Roche)进行与膜上的生物素结合的链霉抗生物素蛋白-POD的检测。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的复合物-Ac-PYY(PEG3-Cvs-PEG2-5- Fluo)/嵌合的抗-荧光素抗体复合物-的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化接头的荧光素-缀合的-PYY-多肽的非共价复合物，将0.33mg Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo溶解在100％DMF中至10mg/ml的浓度。抗体以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA构成的pH 8.2的缓冲液中9.99mg/ml(约68μM)的浓度使用。Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo和抗体以2.5∶1的摩尔比例(Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)比抗体)混合，并且在室温(RT)和350rpm温育60分钟。通过大小排阻层析，将得到的复合物定义为76％的单体IgG样分子和24％的二聚体可溶性聚集物。得到的复合物进一步通过SDS-PAGE和后续检测聚丙烯酰胺凝胶中荧光素相关的荧光进行分析。将8μg的复合物与4xLDS样品缓冲液(Invitrogen)混合，并且在95℃温育5分钟。使用LumiImager F1装置(Roche)以645nm的激发波长记录荧光素相关的荧光。
实施例12
在具有抗-半抗原抗体的缀合物和复合物中的多肽保留功能性
我们之前已经表明作为非共价半抗原-多肽缀合物的一部分并且在与抗-半抗原抗体的复合物中的多肽保留功能性(WO2011/003557，WO 2011/003780和PCT/EP2011/074273)。
实施例13
改造血脑屏障-穿梭物模块
通过将二硫键稳定的半抗原-结合性单链Fvs融合到抗-TfR抗体CH3结构域的C-端，而产生半抗原-结合性双特异性血脑屏障-穿梭物模块。相似的设计和技术按之前所述使用(例如，参见WO 2014/006124)。这些血脑屏障-穿梭物模块的组成的实例显示在图7中。
血脑屏障-穿梭物模块识别在血脑屏障的内皮细胞上的可胞转的细胞表面靶标(血脑屏障受体)。示例性地，我们使用两种不同的抗体，其以不同的亲和力结合转铁蛋白受体。抗体TfR1以高亲和力结合转铁蛋白受体，抗体TfR2以减少的亲和力结合转铁蛋白受体(例如，参见WO 2012/075037)。将来源于这些抗-TfR抗体的TfR-结合位点作为未改变的Fab臂设到双特异性抗体中，以获得二价全长IgG模块。二硫键稳定的半抗原-结合性单链Fvs通过短的GS-接头融合到所述产生的双特异性抗体CH3结构域的C-端。示例性地，使用之前所述的结合洋地黄毒苷(Dig)或生物素(Bio)的衍生物的实体作为抗-半抗原结合位点(序列见上文)。
这些穿梭载体的序列组成的实例列出如下：SEQ ID NO：134(LC抗-TfR1抗体)，SEQID NO：135(缀合到scFv抗-洋地黄毒苷抗体片段的HC抗-TfR1抗体)，SEQ ID NO：136(缀合到scFv抗-生物素抗体片段的HC抗-TfR1抗体)，SEQ ID NO：137(LC抗-TfR2抗体)，SEQ IDNO：138(缀合到scFv抗-洋地黄毒苷抗体片段的HC抗-TfR2抗体)，SEQ ID NO：139(缀合到scFv抗-生物素抗体片段的HC抗-TfR2抗体)。
实施例14
双特异性抗体(血脑屏障-穿梭物模块)的表达和纯化
如前所述(见上文)，在确定的不含血清的培养基中在哺乳动物细胞中产生血脑屏障-穿梭物模块双特异性抗体。将HEK293悬浮细胞瞬时转染编码L-链和H-链的表达质粒，以产生表达所述血脑屏障-穿梭物模块双特异性抗体的簇。
为了产生以高亲和力结合TfR的洋地黄毒苷化的有效负载物结合性血脑屏障-穿梭物模块，将包含SEQ ID NO：134编码核酸/表达盒的表达质粒与包含SEQ ID NO：135编码核酸/表达盒的表达质粒共同转染。
为了产生以高亲和力结合TfR的洋地黄毒苷化的有效负载物结合性血脑屏障-穿梭物模块，将包含SEQ ID NO：134编码核酸/表达盒的表达质粒与包含SEQ ID NO：136编码核酸/表达盒的表达质粒共同转染。
为了产生以减少的亲和力结合TfR的洋地黄毒苷化的有效负载物结合性血脑屏障-穿梭物模块，将包含SEQ ID NO：137编码核酸/表达盒的表达质粒与包含SEQ ID NO：138编码核酸/表达盒的表达质粒共同转染。
为了产生以减少的亲和力结合TfR的洋地黄毒苷化的有效负载物结合性血脑屏障-穿梭物模块，将包含SEQ ID NO：137编码核酸/表达盒的表达质粒与包含SEQ ID NO：139编码核酸/表达盒的表达质粒共同转染。
通过蛋白A层析从瞬时转染编码L-链和H-链的表达质粒的HEK293悬浮细胞上清中纯化双特异性抗体(见上文)。然后，使用大小排阻层析(SEC)获得没有聚集物或污染物的双特异性抗体。关于纯化的血脑屏障-穿梭物模块的纯度和组成的实例以SEC模式和SDS PAGE显示在图8中。
实施例15
双特异性半抗原-结合性血脑屏障-穿梭物模块同时结合半抗原化的有效负载物和血脑屏障受体
为了保证双特异性抗体的血脑屏障-穿梭功能性，它们必须同时结合血脑屏障内皮细胞上的血脑屏障受体和要被穿梭的半抗原化的有效负载物。为了评价本文报道的半抗原-结合性双特异性抗体的功能性，通过FACS分析解决同时的细胞表面和有效负载物结合。对于这些分析，通过植物赤藓素(phytoerythrin)-标记的IgG识别二级抗体检测血脑屏障-穿梭物模块(＝双特异性抗体)的细胞结合。同时的有效负载物结合通过使用半抗原化的荧光有效负载物(洋地黄毒苷化的Cy5；DIG-Cy5)检测。图9显示了FACS分析的结果，所述分析使用hCMEC/D3细胞作为表达TfR的BBB-来源的细胞系，和Dig-Cy5作为荧光有效负载物：两种转铁蛋白受体结合性双特异性抗体都结合hCMEC/D3，如通过抗-IgG-PE相关的信号所显示的。类似地，两种双特异性抗体还同时结合Dig-Cy5，如通过归因于细胞相连的Cy5的信号所显示的。(高亲和力)TfR1双特异性抗体和(减少的亲和力)TfR2双特异性抗体之间的信号强度的比较表明，(如预期地)，与中等亲和力双特异性抗体相比，在具有高亲和力的细胞上的信号强度更高。识别hCMEC/D3上不以可检测的量存在的抗原(CD33-Dig)的对照双特异性抗体(如预期地)不产生与抗-IgG抗体相关的信号，也不产生与Dig-Cy5相关的信号。
这些结果表明双特异性半抗原-结合性血脑屏障-穿梭物模块特异性结合它们在内皮细胞表面上的靶标。此外，这些双特异性抗体同时结合半抗原化的有效负载物，由此可以将它们导向血脑屏障的内皮细胞。
实施例16
血脑屏障-穿梭物模块的受体结合模式影响从脑内皮细胞的释放
我们使用脑内皮细胞(hCMEC/D3)来研究本文报道的穿梭物模块的细胞结合和胞转作用。之前的研究(Crepin等人，2010；Lesley等人，1989，WO 2012/075037，WO 2014/033074)报道了TfR结合性抗体的价态和亲和力影响与血脑屏障的内皮细胞结合、通过其胞转和从其释放的功效。为了研究在hCMEC/D3中的细胞结合和胞转作用，将在滤纸插入物上培养的hCMEC/D3细胞在顶部用双特异性抗体或母体抗体(没有半抗原-结合性scFvs，作为对照)在37℃温育1小时。细胞单层在室温(RT)在不含血清的培养基中在顶部(400μl)和底外侧(1600μl)洗涤三次，每次3-5min。收集所有的洗涤体积，以监测未结合的配体或抗体的去除效率。向顶部室中加入预先加温的培养基，并且将滤纸转移到包含1600μl预先温热的培养基的新鲜的12孔平板(用包含1％BSA的PBS封闭过夜)。在该点，将细胞在500μl RIPA缓冲液(Sigma，Munich，Germany，#R0278)中裂解，以确定特定的摄入。将得到的滤纸在37℃温育，并且在不同的时间点收集样品，以确定顶部和/或底外侧释放。样品中抗体的含量使用高灵敏性IgG ELISA定量。这些分析的结果显示在图10中：高亲和力的二价抗-TfR抗体(TfR1)有效地结合细胞，但是不释放到顶部或底外侧区室中。以相同的方式，包含高亲和力TfR结合位点的双特异性抗体(TfR1-Dig，TfR1-Bio)有效地结合细胞，但是不释放到顶部或底外侧区室中。相反，具有减少的亲和力(TfR2)的二价抗-TfR抗体有效地结合细胞，并且随后随时间释放到顶部或底外侧区室中。包含减少的亲和力的二价TfR结合位点的双特异性抗体(TfR2-Dig，TfR2-Bio)也有效地结合细胞，并且以与母体抗体相同的程度释放到顶部或底外侧区室中。与不存在于hCMEC/D3上的抗原结合的对照双特异性抗体(CD33-Dig，CD33-Bio)不结合这些细胞，并且因此也不随时间释放到顶部或底外侧区室中。
实施例17
具有减少的针对TfR的亲和力的血脑屏障-穿梭物模块穿梭穿过内皮细胞并且支持半抗原化的有效负载物的胞转和释放
使用脑内皮细胞(hCMEC/D3)来研究与半抗原-结合性血脑屏障-穿梭物模块形成非共价复合物的半抗原化的有效负载物的细胞结合和胞转作用。为了评价是否可以通过本文报道的半抗原-结合性血脑屏障-穿梭物模块(双特异性抗体)实现非共价复合的有效负载物的有效负载物胞转，将在trans-well系统中的hCMEC/D3细胞暴露于由本文报道的双特异性抗体复合的半抗原化的有效负载物(关于示例性的构建体，参见之前的实施例)1小时，以允许TfR结合。通过洗涤去除穿梭物和有效负载物后(见实施例15)，以与实施例15关于穿梭物模块所述相同的方式，随时间(实验开始＝洗涤步骤后0-5小时)监测有效负载物的结合的分子、内在化、细胞内分选、胞转和释放。用在本实施例中的有效负载物是单-半抗原化的DNA，其在用本文报道的双特异性抗体温育时，以2∶1的(摩尔)比例非共价复合，如图11A所示。可以通过qPCR检测并定量有效负载物在细胞提取物、顶部和底外侧区室中的存在。示例性地，如图11A所示，在RocheLightCycler上，末端单-生物素化的或单-洋地黄毒苷化的双链DNA 50mer(SEQ ID NO：140)作为有效负载物和两种PCR引物PrFor(SEQ ID NO：141)和PrRev(SEQ ID NO：142)用于有效负载物定量。这些分析的结果(图11B)证明非共价连接的半抗原化的有效负载物结合细胞，内在化，然后被释放到顶部和底外侧区室。结合和随后的释放由TfR-结合性血脑屏障-穿梭物模块介导，如果使用CD33-结合性对照双特异性抗体，没有检测到与细胞的结合，也没有检测到释放。此外，在使用没有双特异性抗体的半抗原化的有效负载物的情形中，没有检测到与细胞的结合，也没有检测到释放。对于包含双特异性抗体和相对应的半抗原化的有效负载物的洋地黄毒苷结合位点和生物结合位点，观察到非共价复合的有效负载物的胞转作用。这表明，可以使用不同的半抗原来设计非共价的双特异性抗体血脑屏障-穿梭物模块。因此，可以使用半抗原-结合性双特异性抗体实现非共价复合的半抗原化的有效负载物的有效负载物穿过血脑屏障的胞转。
实施例18
具有针对TfR的高亲和力的结合位点的血脑屏障-穿梭物模块结合内皮细胞但不从内皮细胞释放，但是仍然支持半抗原化的有效负载物的胞转和释放
以与前述实施例17所述相同的方式，使用脑内皮细胞(hCMEC/D3)来研究可以与半抗原-结合性血脑屏障-穿梭物模块形成非共价复合物的半抗原化的有效负载物的细胞结合和胞转作用。将在trans-well系统中的HCMEC/D3细胞暴露于与血脑屏障-穿梭物模块(双特异性抗体)复合的半抗原化的有效负载物1小时，以允许TfR结合、内在化和细胞内分选以及胞转。有效负载物是单-半抗原化的DNA，其在用所述双特异性抗体温育时，以2∶1的(摩尔)比例非共价复合，如图11A所示。如前述实施例17所述，可以通过qPCR定量单-生物素化的或单-洋地黄毒苷化的双链DNA50mer有效负载物(SEQ ID NO：140)在细胞提取物、顶部和底外侧区室中的存在。
这些分析的结果(图12)证明非共价复合的半抗原化的有效负载物结合细胞，内在化，然后被释放到顶部和底外侧区室。由于二价高亲和力穿梭物模块本身不从细胞释放，因此这是令人惊讶的发现。结合和随后的有效负载物释放由TfR-结合性双特异性抗体血脑屏障-穿梭物模块介导，原因在于，如果使用CD33-结合性对照双特异性抗体，没有检测到与细胞的结合，也没有检测到释放。此外，在使用没有双特异性抗体血脑屏障-穿梭物模块的半抗原化的有效负载物的情形中，没有检测到与细胞的结合，也没有检测到释放。对于包含双特异性抗体和相对应的半抗原化的有效负载物的洋地黄毒苷结合位点和生物结合位点，观察到非共价复合的有效负载物的胞转和释放。这表明，可以使用不同的半抗原来设计半抗原化的有效负载物与双特异性抗体血脑屏障-穿梭物模块的非共价复合物。可以通过与血脑屏障-穿梭物模块(双特异性抗体)非共价复合的半抗原化的有效负载物实现穿过包含血脑屏障的细胞的有效负载物胞转。令人惊讶地，由于甚至当使用不释放的穿梭物模块时，有效负载物也被释放，因此，胞转不依赖于穿梭载体本身的释放。
实施例19
在囊泡区室内，半抗原化的有效负载物与血脑屏障-穿梭物模块分离
使用包含与内皮细胞结合但是本身不从这些细胞释放的血脑屏障-穿梭物模块的高亲和力TfR结合位点(TfR1)的胞转测定显示了令人惊讶的结果：尽管穿梭物模块本身保持连接在细胞上/保留在细胞中，半抗原化的有效负载物穿梭穿过细胞，并且释放到顶部和底外侧区室。双特异性抗体介导的有效负载物的细胞结合、摄入和分布通过共聚焦显微镜检进行分析。因此，将脑内皮细胞(hCMEC/D3)暴露于双特异性抗体-复合的半抗原化的荧光有效负载物(半抗原-Cy5或半抗原-DNA-Cy5)，并且通过共聚焦荧光显微镜检进行分析。因此，将hCMEC/D3细胞接种在显微镜级别的玻璃盖玻片上，并且用50nM双特异性抗体-复合的半抗原化的荧光有效负载物在细胞培养基中在37℃温育三小时。然后，洗涤细胞，固定(4％低聚甲醛)，并通过用抗-κ轻链特异性抗体接着用缀合到ALEXA Fluor488上的二级抗体复染而检测穿梭物模块的IgG部分。在LEICA SP5x共聚焦显微镜上使用100x/1.46NA物镜，使用用于ALEXAFluor488(IgG)和CY5(半抗原-DNA-CY5有效负载物)的适当的带通滤波器设置，拍摄图像。这些分析的结果显示在图13中。高亲和力双特异性抗体与荧光标记的半抗原化的有效负载物(DNA-Cy5)的复合物结合TfR，并且初始位于细胞表面上。然后，它们与其同种受体共同内在化，并且出现在细胞内囊泡区室中，即，内体和溶酶体中。内在化后很快(三小时)我们观察到归因于穿梭物模块的荧光信号与归因于半抗原化的有效负载物的荧光信号的实质性分离。因此，本文报道的血脑屏障-穿梭物模块与半抗原化的有效负载物的非共价复合物可以在细胞内解离到不同的囊泡区室中。由此，有效负载物从穿梭物模块上释放，并且甚至在穿梭物模块保持与细胞结合/保留在细胞中时，可以通过胞转作用离开内皮细胞。对于洋地黄毒苷结合性以及生物素-结合性血脑屏障-穿梭物模块(双特异性抗体)和相对应的半抗原化的有效负载物，观察到非共价复合的半抗原化的有效负载物的细胞内分离。因此，可以使用不同的半抗原来设计半抗原化的有效负载物与血脑屏障-穿梭物模块的非共价复合物，所述非共价复合物能够允许有效负载物胞转。
实施例20
包含肽YY的HeliCar基序氨基酸序列
肽YY是一种由回肠和结肠中的细胞响应喂食而释放的一种短肽(36-氨基酸)。在人中，其似乎是降低食欲。最常见形式的循环的PYY是PYY3-36，其与Y受体家族的Y2受体(Y2R)结合。PYY存在于胃肠道(尤其是回肠和结肠)粘膜中的L细胞中。此外，在食道、胃、十二指肠和空肠中发现少量的PYY，约1-10％。在循环中，PYY浓度在食物摄入后增加，并且在禁食过程中下降。PYY通过NPY受体发挥其作用；其抑制胃蠕动，并且增加结肠中的水和电解质吸收。PYY和PYY模拟物已经用于解决肥胖。
修饰PYY，以包含HeliCar基序氨基酸序列，并且被抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体复合，以利用抗体的药物代谢动力学特性并且避免PYY固有的不稳定性。
非共价复合物形成
PYY3-36肽的结构研究(Nygaard，R.，等人，Biochem.45(2006)8350-8357；SEQ IDNO：143)揭示用于中心氨基酸的螺旋基序(HeliCar-样基序氨基酸序列)。由于已经记载N-端异亮氨酸和修饰的C-端对于肽的功能性活性是重要的，因此，修饰中心螺旋，以使所述氨基酸反映在HeliCar基序氨基酸序列中。
通过转染两个包含分别插入到包含恒定人IgG1和恒定人λ结构域的载体中的重链和轻链可变区的质粒而在HEK293细胞中产生完整的IgG1抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体。使用蛋白A层析，通过标准方法纯化抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体(0019)。质谱实验证实了抗体0019的性质。
通过向抗体溶液中应用少量过量的肽而在体外获得抗体0019与修饰的PYY肽PYY_HeliCar之间的复合物。形成了复合物0052。通过SEC-MALLS分析实验确定所述复合物的化学计量为1.6个肽复合到一个二价抗体上。
检测抗体0019、PYY(3-36)野生型、PYY_HeliCar和复合物0052对Y2受体家族的作用。
如证实的(Hoffmann，E.，等人，J.Cont.Rel.171(2013)48-56.)，与抗体复合的肽具有延长的体内半衰期。并且，令人惊讶地，与未复合的肽相比，所述复合物表现出略好的针对NPY2R受体的亲和性；所述抗体使所述多肽稳定，并且使所述肽以其固定的生物学活性构象呈现。
共价复合物形成(共价二硫键)
为了提高抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体与包含HeliCar基序氨基酸序列的化合物之间的复合物的体外和体内稳定性，已经使用了在结合时形成二硫键。
第一步是特异性识别步骤(高亲和力相互作用)，即，形成包含HeliCar基序氨基酸序列的化合物-抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体复合物。在第二步中，这之后是二硫键自发改组，以形成稳定性改善的共价复合物。
由于12-mer肽(HeliCar基序氨基酸序列)是相对刚性的实体(至少当被特异性的抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体复合时)，因此，已经发现必须使用用于二硫键的结构特异性设计。由于复合物形成和之后引起的共价偶联是在两个重组产生的实体之间，引入用于形成共价二硫键的人工半胱氨酸残基不必作为游离的半胱氨酸残基产生，但是以还原形式表达，即，缀合到游离的半胱氨酸或同型半胱氨酸的氨基酸上。
抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体可变结构域的氨基酸序列中引入人工游离的半胱氨酸残基的位置是至关重要的。抗体可变结构域氨基酸序列中未暴露的半胱氨酸具有更大的作为游离的半胱氨酸(没有缀合的)表达的可能性，而由于由半胱氨酸构型引入的空间位阻，暴露的邻近结合口袋的胱氨酸残基可以消除12-mer肽(HeliCar基序氨基酸序列)与另外的结构部分(如游离的半胱氨酸)的结合。
a)与包含HeliCar基序氨基酸序列的荧光化合物的复合物
为了鉴定具有最低空间位阻危险和强亲和性减少的适当的位置，已经检测了用于在HeliCar基序氨基酸序列中引入人工半胱氨酸残基的不同位置。半胱氨酸残基已被引入在12mer(HeliCar基序氨基酸序列)的C-端，从而使得大部分的互补位不变。已经合成了所述肽，并且融合到荧光基序上。
关于所述抗体，已经进行了结构设计，以允许在不同的3D环境中关于两种设计的分别包含半胱氨酸的肽形成二硫键。
将12-mer螺旋肽AHLENEVARLKK(SEQ ID NO：145，HeliCar基序氨基酸序列)建模成VH和VH结构域。在肽的C-端，残基L10和K11被鉴定为可能的位置，并且在轻链可变结构域中，鉴定了按照Kabat轻链编号的位置N55和G51。
抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体(0019)的重链可变结构域具有下述氨基酸序列：
(SEQ ID NO：148)。
抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体(0019)的轻链可变结构域具有下述氨基酸序列：
(SEQ ID NO：149)。
抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体(0155)的轻链可变结构域N55C变体具有下述氨基酸序列：
(SEQ ID NO：150)。
抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体(0157)的轻链可变结构域N51C变体具有下述氨基酸序列：
(SEQ ID NO：151)。
i)包含HeliCar基序氨基酸序列的化合物与抗体0155的共价缀合物
二价抗体0155与其没有游离的半胱氨酸的母体分子Y2R(bck)-0019类似地在HEK293细胞中表达。使用用于抗体0019的相同的方法纯化修饰的抗体。质谱分析表明实验确定的去糖基化的抗体的质量为142,001Da。这超过了计算质量259Da。还原的链具有下述实验确定的质量：48,167Da(完整的重链，计算为48,168Da，Cys＝SH，C-Term＝-K)和22,720Da(完整的轻链，N55C，计算为22,720Da，Cys＝SH)。链的序列在还原后验证。
在100％DMF中使用2.5摩尔过量的包含HeliCar基序氨基酸序列的化合物，将抗体0155偶联到HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2上，形成共价复合物0156。
在SDS page(变性条件，见图14)上，仅对抗体0155观察到荧光；在还原条件下，仅有小肽是可见的。
结果：
包含HeliCar基序氨基酸序列的荧光化合物与抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体的共价缀合是成功的。共有约43％的抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体共价缀合到两个HeliCar基序氨基酸序列上，约40％的抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体共价缀合到一个HeliCar基序氨基酸序列上，约17％的抗-HeliCar基序氨基酸序列没有缀合。
包含两个HeliCar基序氨基酸序列的缀合物被修饰至50％。该种类没有考虑进行定量。如对于起始材料已经确定的，没有HeliCar基序氨基酸序列的抗体包含两个约128Da的修饰。缀合到一个HeliCar基序氨基酸序列上的抗体仅具有一个约128Da的修饰。
ii)包含HeliCar基序氨基酸序列的化合物与抗体0157的共价缀合物
与抗体0155类似，抗体0157主要以半胱氨酰化的形式表达。质谱分析显示去糖基化的抗体的实验确定的质量为141,863Da。这超过了计算质量3Da。所述抗体主要作为单一或双同型半胱氨酰化形式存在。还原的链具有下述实验确定的质量：48,168Da(完整的重链，计算为48,168Da，Cys＝SH，C-Term＝-K)和22,777Da(完整的轻链，N51C，计算为22,777Da，Cys＝SH)。链的序列在还原后验证。
抗体0157与HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的偶联没有形成预期的共价复合物。在预期的泳道中没有观察到荧光，但是在本实验中应该是阴性的参比泳道中观察到荧光(见图15)。
抗体0157与HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1一起温育。抗体0019与同样的HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1一起温育作为对照。
结果：
包含HeliCar基序氨基酸序列的荧光化合物与抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体的共价缀合没有成功。不受该理论的限制，假设在该情形中，抗体半胱氨酰化在结合口袋中太深而不允许包含HeliCar基序氨基酸序列的荧光化合物有效地结合在适当的位置的亲核巯基基团并递送在适当的位置的亲核巯基基团区攻击C51。
b)与包含HeliCar基序氨基酸序列的重组多肽的复合物
当考虑到与重组产生的包含HeliCar基序氨基酸序列的多肽形成共价复合物时，基于HeliCar的方法变得特别有吸引性。
由于包含VL-N55C突变的抗体0155与HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(AHLENEVARLCK；SEQ ID NO：146)的缀合较备选方案(在VL上的G51C与HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2(AHLENEVARCKK；SEQ ID NO：147))更好进行，进一步研究0155与包含HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的多肽的缀合。所述多肽包含融合到N-端的HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(AHLENEVARLCK；SEQ ID NO：146)。
已经在大肠杆菌中产生了包含假单胞菌属外毒素分子LR8M、C-端赖氨酸残基缺失的HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(0236；SEQ ID NO：152)，并且使用阴离子交换层析和SEC的组合进行纯化(例如，参见WO 2011/032022)。
抗体0155共价缀合到SEQ ID NO：152的包含假单胞菌属外毒素分子LR8M、C-端赖氨酸残基缺失的HeliCar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1上。SEC层析图谱显示在图16中。对于未还原的样品，通过SDS-CE、测径器分析缀合效率(见图17)。
共有约4％的抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体共价缀合到两个SEQ ID NO：152的多肽上，约41％的抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体共价缀合到一个SEQ ID NO：152的多肽上，并且约55％的抗-HeliCar基序氨基酸序列没有缀合。
总之，抗-HeliCar基序氨基酸序列单克隆抗体可以用于通过12-mer HeliCar基序氨基酸序列的高亲和性识别而复合肽、具有肽接头的小分子和重组蛋白。可以修饰具有折叠成螺旋的倾向性的肽，以模拟初始的12-mer HeliCar基序氨基酸序列AHLENEVARLKK(SEQID NO：145)，然后可与抗-HeliCar基序氨基酸序列单克隆抗体复合。除了高亲和力复合，还允许SEQ ID NO：145的包含半胱氨酸的半胱氨酸变体与在CDRs中包含半胱氨酸的修饰的抗-HeliCar基序氨基酸序列抗体通过形成稳定的二硫键的共价缀合。由不同系统表达的重组蛋白可以在体外在以后缀合，无需特定的反应条件，而是通过自发的二硫键改组进行。
实施例21
来自具有包含BrdU的有效负载物的复合物的BrdU-结合性双特异性抗体
利用SEC-MALLS分析来评价转铁蛋白受体(TfR)-和溴代脱氧尿苷(BRDU)-结合性双特异性抗体(bsAb)是否能够结合包含BRDU的有效负载物和结合至何种程度。因此，将BRDU-DNA以2∶1的化学计量比例(350μg；2.5mg/ml)添加到TfR-BRDU bsAb中，并且在室温温育30分钟，以形成bsAb/有效负载物-复合物。作为对照试剂，我们制备游离的双特异性抗体(2.5mg/ml)和游离的BRDU-DNA(3.2mg/ml)。BRDU-DNA(BRDU-ACC AAG CCT AGA GAG GAGCAA TAC AAC AGT ACA TAT CGC GTG GTA AGC GT；SEQ ID NO：153)在DNA的5’端包含1个BRDU/DNA分子。将复合物和对照试剂保存在-80℃，直到进行分析时。
将由此产生的复合物和对照试剂进行SEC-MALLS分析以鉴定并表征游离的双特异性抗体、游离的有效负载物和二者的复合物。在装配了Wyatt miniDawnTREOS/QELS和Optilab rEX检测器的Dionex Ultimate3000HPLC上进行SEC-MALLS分析。将分析物以1mg/ml溶解在PBS缓冲液pH 7.4中，以0.5ml/min的流速应用到Superdex20010/300GL柱上，并用PBS缓冲液pH 7.4洗涤60分钟。
这些分析的结果(显示在图18中)表明，包含BRDU的DNA与双特异性抗体形成确定的复合物。这些复合物以244.9kDa的MW从柱上洗脱下来(图18A)并且展现出6.8nm的水力学半径(图18B)，这允许计算约2(1.8)个DNA分子/双特异性抗体分子的化学计量比例。与此相比较，游离的双特异性抗体在215.4kDa的MW检测到，并且其水力学半径确定为6.2nm。游离的BRDU-DNA在16.4kDa的MW检测到。
因此，表明包含BRDU的DNA被抗-TfR/BRDU双特异性抗体有效且化学计量地结合，形成2∶1摩尔比例的复合物。
实施例22
生物素-结合性双特异性抗体与包含生物素的IgGs结合
为了分析TfR/生物素双特异性抗体是否能够结合单-生物素化的全长IgG以及结合至何种程度，将特异性结合pTau(生物素-标记的抗-pTau抗体，BIO-pTau)的IgG同种型的单-生物素化的抗体以2∶1的化学计量比例(300μg，1.3mg/ml)添加到抗-TfR/生物素双特异性抗体中，并且将混合物在室温温育30分钟(形成双特异性抗体-有效负载物复合物)。通过产生在IgG同种型的凸起-进入-孔洞异型二聚体抗体的一条链的C-端具有Avi-标签的IgG-衍生物，而产生单-生物素化的IgG。所述Avi-标签以限定的方式酶促缀合到一个生物素上。
作为复合物形成的特异性的对照，将抗-TfR/洋地黄毒苷双特异性抗体与BIO-pTau混合。制备游离的双特异性抗体和游离的BIO-pTau二者作为其他的对照试剂。复合物和对照试剂保存在-80℃，直到用于分析时。
将产生的复合物进行SEC-MALLS分析，以鉴定并表征游离的双特异性抗体、游离的BIO-pTau以及它们的复合物。在装配了Wyatt miniDawnTREOS/QELS和Optilab rEX检测器的Dionex Ultimate 3000HPLC上进行SEC-MALLS分析。将分析物以1-2mg/ml溶解在PBS缓冲液pH 7.4中，以0.5ml/min的流速应用到Superose 6 10/300GL柱上，并且用PBS缓冲液pH7.4洗脱60分钟。
这些分析的结果(显示在图19中)表明，BIO-pTau与双特异性抗体形成确定的复合物。这些复合物以501kDa的MW从柱上洗脱下来(图19B)，并且展现出8.0nm的水力学半径(图19A)。与此相比较，游离的双特异性抗体在205kDa的MW检测到，并且其水力学半径确定为6.2nm。游离的BIO-pTau在150kDa的MW检测到，并且其水力学半径测量为5.5nm。
由于洋地黄毒苷-结合性双特异性抗体不与BIO-pTau形成复合物，因此，通过生物素与双特异性抗体的生物素-结合性结构部分之间的相互作用特异性地形成复合物。
实施例23
生物素-标记的抗-pTau抗体与抗-TfR/生物素双特异性抗体的复合物的胞转
为了分析抗-TfR/生物素双特异性抗体是否促进全长抗体有效负载物的胞转以及到何种程度，按照实施例22所述形成抗-TfR/生物素双特异性抗体(抗-TfR/生物素bsAb-1和抗-TfR/生物素bsAb-2)与BIO-pTau的复合物，并且如上文所述进行胞转测定，例如，如实施例18所述。作为非特异性胞转的对照，平行检测抗-CD33/生物素双特异性抗体与BIO-pTau的复合物以及游离的BIO-pTau。在负载细胞后0，1，2，3，4和5小时采集顶部和底外侧区室的样品和细胞裂解物的样品。负载总是3.8μg/ml。
通过ELISA测量生物素-标记的抗-pTau抗体的量。因此，将pTau蛋白以500ng/ml包被到NUNC Maxisorb White 384-孔平板上，在2-8℃过夜或在室温一小时。将平板用包含2％BSA和0.05％吐温20的PBS封闭至少一小时。将在包含0.5％BSA和0.05％吐温20的PBS中1/729稀释的样品稀释液上样1.5-2小时，然后上样聚-HRP40-链霉抗生物素蛋白(Fitzgerald)30分钟和超级信号ELISA Pico底物(Thermo Scientific)10分钟，都在室温下进行。在同一平板上测定BIO-pTau抗体的标准稀释液(100ng/ml-0.5pg/ml)。在连续的温育步骤之间，将平板用包含0.1％吐温20的PBS洗涤。
这些胞转测定的结果(图20)表明，将BIO-pTau与抗-TfR/生物素bsAb-1复合或与抗-TfR/生物素bsAb-2复合调节有效的内吞并随后转运BIO-pTau进入底外侧以及回到顶部区室。相反，BIO-pTau与抗-CD33/生物素双特异性抗体的复合物和游离的BIO-pTau都没有被有效地内吞或胞转，这表明观察到的胞转是由抗-TfR/生物素双特异性抗体与细胞表面上的TfR特异性结合引起的。
实施例24
双特异性抗-人Tau(pS422)/生物素抗体和生物素化的抗-TfR抗体Fab片段的复合物的胞转
与上文所述的实施例类似，已经阐明了双特异性抗-人Tau(pS422)/生物素抗体和生物素化的抗-TfR抗体Fab片段的非共价复合物的胞转。结果显示在图21中。为了分析，将人Tau(pS422)固定在平板上，使用抗-人CH2作为二级抗体，并且使用抗-洋地黄毒苷抗体POD-缀合物进行检测。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 人源化的抗-Tau(pS422)抗体脑穿梭物及其应用
<130> P32183-WO
<150> EP14174042
<151> 2014-06-26
<160> 153
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 2
<211> 441
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (422)..(422)
<223> X=磷酸丝氨酸
<400> 2
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
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Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
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Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
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Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
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Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
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Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Xaa Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=磷酸丝氨酸
<400> 3
Ser Ile Asp Met Val Asp Xaa Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp
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<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 穴兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 4
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<211> 7
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 5
Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe
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<211> 13
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 6
Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Val Ala
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<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 7
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Ser Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
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Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
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<212> PRT
<213> 穴兔
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<211> 16
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 9
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<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 10
Ser Asn Ile
1
<210> 11
<211> 108
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 11
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
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<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 12
Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn Lys Leu Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 13
Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 14
Ser Ala Ser Thr Leu Asp Tyr
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 15
Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser Ala Asp Ile Val Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 16
Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser
85 90 95
Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 17
Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser
85 90 95
Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 18
Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 19
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 19
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 20
Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 21
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 22
Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 23
Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser
1 5
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 24
Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser Ile Ala Asp Ser Val Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 25
Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser Ile Ala Asp Arg Val Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 26
Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ile Ala Asp Pro Val Ala
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 27
Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser Ile Ala Asp Ile Val Ala
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 28
Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ala Asp Pro Ile Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> umanized序列
<400> 29
Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ala Asp Pro Val Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 30
Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Thr Asn Lys Leu Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 31
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn Lys Leu Ala
1 5 10
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Lys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 34
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Thr Asn
20 25 30
Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Thr Asn
20 25 30
Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Ser Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Thr Asn
20 25 30
Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Arg Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 38
Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 39
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser
85 90 95
Ala Asp Pro Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 40
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 40
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 41
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 41
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser
85 90 95
Ile Ala Asp Pro Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 43
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
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Ala Asp Pro Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 44
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser
85 90 95
Ala Asp Pro Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 45
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn
20 25 30
Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser
85 90 95
Ala Asp Pro Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 46
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 46
Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 47
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 47
Gln Ser Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys
85 90 95
Ser Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 48
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 48
Gln Ser Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 49
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 49
Gln Ser Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105
<210> 50
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 50
Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys
85 90 95
Ser Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 51
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 51
Gln Ser Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
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65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys
85 90 95
Ser Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 52
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 52
Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys
85 90 95
Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 53
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 53
Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys
85 90 95
Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 54
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 54
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 55
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 55
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 56
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 56
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 57
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的序列
<400> 57
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 58
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 60
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 61
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rbHCfinal.up
<400> 61
aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc 37
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rbHCfinal.do
<400> 62
ccattggtga gggtgcccga g 21
<210> 63
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rbLCfinal.up
<400> 63
aagcttgcca ccatggacay gagggccccc actc 34
<210> 64
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rbLCfinal.do
<400> 64
cagagtrctg ctgaggttgt aggtac 26
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 65
Asp Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 66
Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 67
Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 68
<211> 125
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Asn Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 69
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 70
Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 71
Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr Thr
1 5
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 72
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Arg
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-洋地黄毒苷抗体HVR-H1
<400> 73
Asp Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-洋地黄毒苷抗体HVR-H2
<400> 74
Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-洋地黄毒苷抗体HVR-H3
<400> 75
Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 76
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-洋地黄毒苷抗体VH
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-洋地黄毒苷抗体HVR-L1
<400> 77
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-洋地黄毒苷抗体HVR-L2
<400> 78
Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-洋地黄毒苷抗体HVR-L3
<400> 79
Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 80
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-洋地黄毒苷抗体VL
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 81
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 81
Asp Thr Phe Phe Gln
1 5
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 82
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 83
Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 84
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 84
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Phe Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Glu Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 85
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 86
Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 87
Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr Thr
1 5
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-生物素抗体HVR-H1
<400> 89
Asp Thr Phe Phe Gln
1 5
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-生物素抗体HVR-H2
<400> 90
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-生物素抗体HVR-H3
<400> 91
Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 92
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-生物素抗体VH
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-生物素抗体HVR-L1
<400> 93
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-生物素抗体HVR-L2
<400> 94
Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-生物素抗体HVR-L3
<400> 95
Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr Thr
1 5
<210> 96
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-生物素抗体VL
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 97
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 97
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 98
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 98
Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly His Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 99
Trp Val Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 100
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 100
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly His Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Phe Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Phe Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 101
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Asn Asn Arg Tyr Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 102
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 103
Tyr Gln Gly Thr His Ala Pro Tyr Thr
1 5
<210> 104
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 104
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Asn
20 25 30
Asn Arg Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys Tyr Gln Gly
85 90 95
Thr His Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 105
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-茶碱抗体HVR-H1
<400> 105
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-茶碱抗体HVR-H2
<400> 106
Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly His Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-茶碱抗体HVR-H3
<400> 107
Trp Val Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 108
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-茶碱抗体VH
<400> 108
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly His Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 109
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-茶碱抗体HVR-L1
<400> 109
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Asn Asn Arg Tyr Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-茶碱抗体HVR-L2
<400> 110
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-茶碱抗体HVR-L3
<400> 111
Tyr Gln Gly Thr His Ala Pro Tyr Thr
1 5
<210> 112
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-茶碱抗体VL
<400> 112
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Asn
20 25 30
Asn Arg Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Tyr Gln Gly
85 90 95
Thr His Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 113
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 113
His Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 114
<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 114
Gln Phe Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 115
Ala Ser Tyr Gly Met Glu Tyr
1 5
<210> 116
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 116
Gly Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Met Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Phe Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Ala Ser Tyr Gly Met Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 117
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 117
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg
1 5 10 15
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 118
Lys Val Ser Asn Arg Val Ser
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 119
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 120
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 120
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
115 120
<210> 121
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 121
Glu Tyr Pro Ile His
1 5
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 122
Gly Tyr Thr Phe Pro Glu Tyr Pro Ile His
1 5 10
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的CDR-H2
<400> 123
Gly Ile Val Pro Asn Asn Gly Phe Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 124
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 124
Val Pro Asn Asn Gly Phe
1 5
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 125
Lys Asn Leu Gly Ser Ser Pro Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 126
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His
1 5 10
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 127
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 128
Gln Gln Ser Asn Arg Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 129
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的重链可变结构域
<400> 129
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Glu Tyr
20 25 30
Pro Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Val Pro Asn Asn Gly Phe Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Asn Leu Gly Ser Ser Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的轻链可变结构域
<400> 130
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Arg Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 131
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 131
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Glu Tyr
20 25 30
Pro Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Val Pro Asn Asn Gly Phe Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Glu Val Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Asn Leu Gly Ser Ser Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 132
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln His Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Arg Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 133
Asp Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 134
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC 抗-TfR1抗体
<400> 134
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Arg Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Asn Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 135
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合到scFv抗-洋地黄毒苷抗体片段上的HC抗-TfR1抗体
<400> 135
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Pro Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
465 470 475 480
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg
485 490 495
Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly
500 505 510
Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
515 520 525
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
530 535 540
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro
545 550 555 560
Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
565 570 575
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
580 585 590
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
595 600 605
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
610 615 620
Gln Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
625 630 635 640
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val
645 650 655
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
660 665 670
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
675 680 685
Ser Ile Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile
690 695 700
Lys
705
<210> 136
<211> 706
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合到scFv抗-生物素抗体片段上的HC抗-TfR1抗体
<400> 136
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Pro Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
450 455 460
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
465 470 475 480
Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln
485 490 495
Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Lys Thr Leu
500 505 510
Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
515 520 525
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr
530 535 540
Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr
545 550 555 560
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
565 570 575
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
580 585 590
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
595 600 605
Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr Phe Phe Gln Trp Val Arg
610 615 620
Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala
625 630 635 640
Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile
645 650 655
Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
660 665 670
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Thr Tyr
675 680 685
Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
690 695 700
Ser Ser
705
<210> 137
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC 抗-TfR2抗体
<400> 137
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Val Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Arg Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Glu Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 138
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合到scFv抗-洋地黄毒苷抗体片段上的HC抗-TfR2抗体
<400> 138
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
465 470 475 480
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg
485 490 495
Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly
500 505 510
Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
515 520 525
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
530 535 540
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro
545 550 555 560
Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
565 570 575
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
580 585 590
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
595 600 605
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
610 615 620
Gln Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
625 630 635 640
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val
645 650 655
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
660 665 670
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
675 680 685
Ser Ile Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile
690 695 700
Lys
705
<210> 139
<211> 725
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合到scFv抗-生物素抗体片段上的HC抗-TfR2抗体
<400> 139
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Val Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Asn Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
465 470 475 480
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
485 490 495
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ser Trp
500 505 510
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
515 520 525
Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
530 535 540
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val
545 550 555 560
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr Thr Phe Gly
565 570 575
Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
580 585 590
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
595 600 605
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys
610 615 620
Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr Phe Phe Gln
625 630 635 640
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile
645 650 655
Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
660 665 670
Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
675 680 685
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp
690 695 700
Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
705 710 715 720
Val Thr Val Ser Ser
725
<210> 140
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 末端单生物素化或单洋地黄毒苷化的双链DNA 50 mer有效负载物
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> n=生物素或洋地黄毒苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 140
naccaagcct agagaggagc aatacaacag tacatatcgc gtggtaagcg t 51
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PrFor
<400> 141
accaagccta gagaggagca 20
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PrRev
<400> 142
acgcttacca cgcgatatgt 20
<210> 143
<211> 34
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=酪氨酸酰胺
<400> 143
Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn
1 5 10 15
Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln
20 25 30
Arg Xaa
<210> 144
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PYY3-36 helicar
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=酪氨酸酰胺
<400> 144
Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Ala His Leu
1 5 10 15
Ala Asn Glu Val Ala Arg Leu His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln
20 25 30
Arg Xaa
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<400> 145
Ala His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 146
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> helicar基序变体1
<400> 146
Ala His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Cys Lys Lys
1 5 10
<210> 147
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> helicar基序变体2
<400> 147
Ala His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Cys Lys
1 5 10
<210> 148
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-helicar抗体 VH
<400> 148
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 149
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-helicar抗体 VL
<400> 149
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 150
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-helicar抗体 VL55C
<400> 150
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Cys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 151
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-helicar抗体 VL51C
<400> 151
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Cys Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 152
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用GGG-肽接头融合到假单胞菌属外毒素上
并且缺失C-端K的helicar基序氨基酸序列
半胱氨酸变体1
<400> 152
Ala His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Cys Lys Gly Gly Gly Arg
1 5 10 15
His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Pro Thr Gly Ala Glu Phe
20 25 30
Leu Gly Asp Gly Gly Ala Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn
35 40 45
Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Gly
50 55 60
Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln
65 70 75 80
Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala
85 90 95
Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly
115 120 125
Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr
130 135 140
Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu
145 150 155 160
Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly
165 170 175
Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg
195 200 205
Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Ser Glu Ala
210 215 220
Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro
225 230 235 240
Arg Glu Asp Leu
<210> 153
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRDU-DNA缀合物
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(1)
<223> BRDU
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n是a, c, g, 或t
<400> 153
naccaagcct agagaggagc aatacaacag tacatatcgc gtggtaagcg t 51

Claims (28)

1.特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体和抗-血脑屏障受体/半抗原双特异性抗体的非共价复合物在转运所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体穿过血脑屏障中的应用。
2.特异性结合人Tau(pS422)和半抗原的双特异性抗体和半抗原化的抗-血脑屏障受体抗体的非共价复合物在转运所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体穿过血脑屏障中的应用。
3.包含特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体和双特异性抗体的非共价复合物在转运所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体穿过血脑屏障中的应用，其中所述双特异性抗体具有特异性结合所述半抗原化抗体的半抗原的第一结合特异性和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，所述半抗原化抗体特异性结合人Tau(pS422)，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体通过所述双特异性抗体的第一结合特异性特异性结合。
4.包含特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体和双特异性抗体的非共价复合物在转运特异性结合人Tau(pS422)的抗体穿过血脑屏障中的应用，所述双特异性抗体具有特异性结合人Tau(pS422)的第一结合特异性和特异性结合所述半抗原化抗体的半抗原的第二结合特异性，所述半抗原化抗体特异性结合血脑屏障受体，其中所述特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体通过所述双特异性抗体的第一结合特异性特异性结合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其中所述半抗原化抗体是生物素化的抗体或洋地黄毒苷化的抗体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其中所述血脑屏障受体是转铁蛋白受体(TfR)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其中所述双特异性抗体包含
a)一个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
b)两个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
c)一个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点，或
d)两个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点，或
e)一个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
f)两个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
g)一个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
h)两个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对人Tau(pS422)的结合位点，
其中在情形b)，c)，f)和g)中，所述双特异性抗体的一条重链包含孔洞突变，并且相应的另一条链包含凸起突变。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合所述半抗原化抗体的半抗原的结合特异性(两个抗-半抗原结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的应用，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异性结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的应用，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的应用，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体还
a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或
b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的应用，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR，或
c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08，09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的应用，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含
a)SEQ ID NO：20的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或
b)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：16的轻链可变结构域，或
c)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或
d)SEQ ID NO：21的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域。
14.特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体和抗-血脑屏障受体/半抗原双特异性抗体的非共价复合物。
15.特异性结合人Tau(pS422)和半抗原的双特异性抗体与半抗原化的抗-血脑屏障受体抗体的非共价复合物。
16.包含特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体和双特异性抗体的非共价复合物，所述双特异性抗体具有特异性结合所述半抗原化抗体的半抗原的第一结合特异性和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，所述所述半抗原化抗体特异性结合人Tau(pS422)，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的半抗原化抗体通过所述双特异性抗体的第一结合特异性特异性结合。
17.包含特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体和双特异性抗体的非共价复合物，所述双特异性抗体具有特异性结合人Tau(pS422)的第一结合特异性和特异性结合所述半抗原化抗体的半抗原的第二结合特异性，所述半抗原化抗体特异性结合血脑屏障受体，其中所述特异性结合血脑屏障受体的半抗原化抗体通过所述双特异性抗体的第二结合特异性特异性结合。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的非共价复合物，其中所述半抗原化抗体是生物素化的抗体或洋地黄毒苷化的抗体。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的非共价复合物，其中所述血脑屏障受体是转铁蛋白受体(TfR)。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体包含
a)一个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
b)两个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
c)一个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点，或
d)两个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点，或
e)一个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
f)两个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和一个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
g)一个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对人Tau(pS422)的结合位点，或
h)两个针对半抗原化抗体的半抗原的结合位点和两个针对人Tau(pS422)的结合位点，
其中在情形b)，c)，f)和g)中，所述双特异性抗体的一条重链包含孔洞突变，并且相应的另一条链包含凸起突变。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的非共价复合物，其中所述双特异性抗体具有两个特异性结合所述半抗原化抗体的半抗原的结合特异性(两个抗-半抗原结合特异性)和两个特异性结合(人)转铁蛋白受体(两个抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
22.根据权利要求14-21中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或
ii)于1μg/mL不结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或
iii)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或
iv)特异性结合在422位的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或
v)特异性结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau。
23.根据权利要求14-22中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR。
24.根据权利要求14-23中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体还
a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或
b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR。
25.根据权利要求14-24中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR，或
c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08，09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR。
26.根据权利要求14-25中任一项所述的非共价复合物，其中所述特异性结合人Tau(pS422)的抗体包含
a)SEQ ID NO：20的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或
b)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：16的轻链可变结构域，或
c)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或
d)SEQ ID NO：21的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域。
27.根据权利要求14-26中任一项所述的非共价复合物，其用作药物。
28.根据权利要求14-26中任一项所述的非共价复合物，其用于治疗阿尔茨海默病。
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