CN110382528A - 治疗或预防认知障碍的人源化抗体、其生产方法及使用其用于治疗或预防认识障碍的剂 - Google Patents

治疗或预防认知障碍的人源化抗体、其生产方法及使用其用于治疗或预防认识障碍的剂 Download PDF

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卡尔·美斯高夫斯基
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Abstract

本发明提供使用人源化抗体的方法和所述人源化抗体的组合物，所述人源化抗体结合在位置413的丝氨酸处被磷酸化的tau蛋白。

Description

治疗或预防认知障碍的人源化抗体、其生产方法及使用其用 于治疗或预防认识障碍的剂
I.相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月27日提交的日本申请第2017-035594号的权益，其内容通过引用整体明确地并入本文。
II.序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且据此通过引用整体并入。2018年2月27日创建的所述ASCII拷贝命名为063785-06-5002-WO-SeqLstg-_ST25.txt，大小为323,584字节。
技术领域
本公开涉及用于治疗性或预防性治疗认知障碍的人源化抗体、产生该人源化抗体的方法、使用该抗体的用于认知障碍的治疗剂或预防剂，以及使用本文公开的治疗剂治疗或预防认知障碍的方法。更具体地，本公开涉及具有改善认知功能的优良效果的新型人源化抗磷酸化tau抗体、产生该人源化抗体的方法、含有该人源化抗体的用于认知障碍的治疗剂或预防剂，以及使用人源化抗磷酸化tau抗体治疗或预防认知障碍的方法。
IV.发明背景
认知障碍或痴呆症是由于某些后天原因而发展的智力下降，从而导致社会适应障碍的疾患。认知障碍被分类为神经退行性疾病、血管性认知疾病、朊病毒疾病、传染病、代谢/内分泌疾病、创伤和脑外科疾病以及中毒性疾病(参见Toshifumi Kishimoto和ShigekiTakahashi(编辑)，“STEP Series Seishinka”(日文文件)，第2版，Kaibashobo,2008，第103-104页)。截至2010年，日本约有210万痴呆患者，65岁以上老年人中的发病流行率(morbidity prevalence rate)约为8％至10％，甚至超过10％，并且这被认为是全球老龄化社会中的严重问题(Takashi Asada,“Igaku no Ayumi”(日本文件),补充卷，"Cognitivedisorders",Ishiyaku Publishing,2011，第5-10页)。有关认知障碍的基础疾病的数据表明，大多数是神经退行性疾病，诸如阿尔茨海默病(AD)和额颞叶变性(FTLD)，约35％为AD，约15％为AD和脑血管疾病的组合，5％是FTLD(同上)与神经退行性疾病相关的认知障碍的特征在于发展至少六个月或更长的时期的记忆损伤和/或人格改变的隐匿发作。神经退行过程与认知功能的损害程度高度相关，并且其中涉及的一致特征是存在神经原纤维缠结(NFT)(Alistair Burns等(编辑)，Dementia，2005年第3版，CRC Press，第408-464页)。
tau蛋白是由位于人基因组的17号染色体(17q21)上的MAPT基因编码的蛋白质。tau蛋白是在中枢神经系统中大量表达的微管结合蛋白之一。已发现tau是在AD(最突出的神经退行性疾病之一)中形成NFT的成对的螺旋细丝和直的细丝中的主要成分蛋白，并且其细胞内积累已经在多种神经病理疾患中得到证实。
tau首先牵涉在神经退行性疾病中，所述疾病基于MAPT基因中的突变与17号染色体相关的额颞叶痴呆及帕金森病(chromosome 17-linked frontotemporal dementiawith Parkinsonism,FTDP-17)中tau的累积之间的关系。据报道，MAPT基因中超过40个基因突变与FTDP-17相关(Tetsuaki Arai,“Shinkei Naika”(日文文件)，第72卷，特别期，(增刊6)，2010，第46-51页)。这些基因突变被认为是改变tau同种型的比例或改变结构以及改变突变型tau与微管之间的相互作用，从而促成病状的发展。然而，与家族性神经退行性疾病不同，在散发性神经退行性疾病诸如AD中极少观察到MAPT中的突变。此外，在神经退行性疾病中累积的tau的特征在于通过磷酸化被高度修饰。此外，在表现出轻度认知损伤(MCI)的患者中，观察到脊髓液中磷酸化tau水平与垂体萎缩程度之间存在相关性，表明磷酸化tau作为tau蛋白病患者神经退行的高度可靠的生物标志物(Wendy Noble等，Expert Opinionon Drug Discovery,2011，第6卷，第8期，第797-810页)。基于这些发现，已经尝试开发使用针对激酶的抑制剂的治疗，所述激酶是参与磷酸化的酶，特别是针对GSK-3β，用于抑制tau的过度磷酸化(同上)。然而，存在关于可能的副作用的担忧，因为诸如GSK-3β的激酶不仅牵涉于病理疾况，而且也牵涉于及正常生理过程中的功能控制。事实上，tau被GSK-3β磷酸化所在的一些位点与胎儿和正常人脑中所见的tau磷酸化位点一致(Burnes等人，同上)，表明该策略可影响正常tau功能的可能性。
尽管认为细胞外tau源于细胞死亡导致的变性神经细胞的渗漏，但最近的研究表明，在过度的细胞内磷酸化后，tau被加工，然后主动分泌出细胞。从细胞分泌的磷酸化tau被认为在某些磷酸化位点被去磷酸化，随后作用于周围细胞的毒蕈碱受体M1和M3，从而产生各种效应，诸如促进细胞内tau磷酸化并促成细胞死亡(Miguel Diaz-Hernandes等，Journal of Biological Chemistry,2010，第285卷，第42期，第32539-32548页和VenessaPlouffe等，PLoS ONE,2012，第7卷，第36873页)。已经报道关于使用tau蛋白作为靶标的tau蛋白病的免疫疗法的实验，作为旨在执行针对tau的特定行为的尝试(参见Noble，同上，Kishimoto，同上，Asada，同上和Burns，同上)。
人认知障碍的主要症状是记忆损伤和认知功能损伤，鉴于认知功能在基于记忆的判断、交流和表现中的作用，这是尤其重要。在另一方面，运动功能虽然是在与17号染色体相关的额颞叶痴呆与帕金森病(FTDP-17)和终末期阿尔茨海默病中发现的症状，但不一定是认知障碍中表现出的主要症状。因此，治疗认知障碍所要考虑的主要问题是认知功能的改善。然而，目前存在用于测试与tau蛋白病相关的认知功能功能损害的合适的动物模型，其将允许鉴定用于治疗认知障碍的治疗剂或预防剂。另外，不存在针对认知障碍表现出特异性和优异效果的此类剂。
鉴于针对人对象的认知障碍的治疗性和预防性应用，需要人源化抗磷酸化tau抗体，其不仅对磷酸化tau具有高结合亲和力，而且对人体表现出降低的抗原性。
V.发明内容
在此背景下，在阿尔茨海默病的情况下可经历异常磷酸化的tau蛋白中的大量磷酸化位点中，本发明人着重于位置413处的丝氨酸残基(Ser413)的磷酸化位点，并且成功地产生了对Ser413磷酸化的tau具有特异性的多克隆兔抗体和单克隆小鼠抗体。本发明人还向显示磷酸化tau蛋白异常表达的认知障碍的模型小鼠施用了单克隆小鼠抗体，并证实观察到认知功能的改善(WO2013/180238A)。
在一些实施方案中，本公开提供了包含与丝氨酸残基413(pS413-Tau)处被磷酸化的tau蛋白特异性结合的抗原结合部分的蛋白质，例如抗体。在一些实施方案中，本公开提供了编码所述蛋白质的核酸。在一些实施方案中，本公开提供了包含编码所述蛋白质的此类核酸的细胞。在一些实施方案中，本公开提供了通过向有需要的患者施用本文公开的蛋白质、核酸或细胞来治疗tau蛋白病(例如，阿尔茨海默病)的方法。
因此，在一些方面，本发明提供了人源化抗体或其片段或衍生物，其引起与至少在对应于SEQ ID NO:1的Ser413的氨基酸残基上磷酸化的tau蛋白或tau肽的抗原-抗体反应。在一些情况下，人源化抗体或其片段或衍生物具有1.86×10-8M或更小的对于于tau蛋白或tau肽的平衡解离常数。
在另外的方面，与非磷酸化tau蛋白(或tau肽，例如SEQ ID NO:69)相比，人源化抗体或其片段或衍生物与磷酸化tau蛋白(或tau肽，例如SEQ ID NO:8)具有改善的选择性亲和力。
在另一方面，本文所述的人源化抗体或其片段或衍生物在施用于血液中时具有改善的进入脑的能力。
在另外的方面，人源化抗体或其片段或衍生物包含如下CDR：CDR-H1序列，与序列1M具有80％或更高同源性的氨基酸序列；与序列2M或2H1具有84％或更高同源性的氨基酸序列作为CDR-H2序列；与序列3M具有80％或更高同源性的氨基酸序列作为CDR-H3序列；与序列4L1或4M具有87％或更高同源性的氨基酸序列作为CDR-L1序列；与序列5M具有85％或更高同源性的氨基酸序列作为CDR-L2序列；和与序列6M具有77％或更高的同源性的氨基酸序列作为CDR-L3序列。
在另外的方面，人源化抗体或其片段或衍生物包含如下CDR：序列1M的氨基酸序列作为CDR-H1序列；序列2H1的氨基酸序列或与序列2H1不同在于位置15处的Ala被Asp取代的氨基酸序列作为CDR-H2序列；序列3M的氨基酸序列作为CDR-H3序列；序列4L1的氨基酸序列或与序列4L1不同在于位置5处的Ser中被Asn取代的氨基酸序列作为CDR-L1序列；序列5M的氨基酸序列作为CDR-L2序列；以及序列6M的氨基酸序列作为CDR-L3序列。
在另外的方面，人源化抗体或其片段或衍生物具有如下CDR：(1)1M的氨基酸序列作为CDR-H1序列；2H1的氨基酸序列作为CDR-H2序列；3M的氨基酸序列作为CDR-H3序列；4L1的氨基酸序列作为CDR-L1序列；5M的基酸序列作为CDR-L2序列；以及6M的氨基酸序列作为CDR-L3序列，或(2)1M的氨基酸序列作为CDR-H1序列；2H1的氨基酸序列作为CDR-H2序列；3M的氨基酸序列作为CDR-H3序列；4M的氨基酸序列作为CDR-L1序列；5M的氨基酸序列作为CDR-L2序列；以及6M的氨基酸序列作为CDR-L3序列；或(3)1M的氨基酸序列作为CDR-H1序列；2M的氨基酸序列作为CDR-H2序列；3M的氨基酸序列作为CDR-H3序列；4M的氨基酸序列作为CDR-L1序列；氨5M的基酸序列作为CDR-L2序列；以及6M的氨基酸序列作为CDR-L3序列。
在另外的方面，人源化抗体或其片段或衍生物包含：与选自序列VH11、VH12、VH47、VH61、VH62、VH64和VH65的序列具有90％或更高的同源性的氨基酸序列作为重链可变区；以及与选自序列VL15、VL36、VL46、VL47、VL48和VL50的序列具有90％或更高的同源性的氨基酸作为轻链可变区。
在另外的方面，人源化抗体或其片段或衍生物包含：序列VH65的氨基酸序列或与序列VH65不同在于包含选自由以下组成的组的一个或多个取代的氨基酸序列作为重链可变区：位置28(Kabat编号：H28)处Thr对Ala的取代、位置30(Kabat编号：H30)处Ser对Asn的取代、位置49(Kabat编号：H49)处Gly对Val的取代、位置64(Kabat编号：H61)处Asp对Ala的取代以及位置78(Kabat编号：H75)处Lys对Gln的取代；和序列VL47的氨基酸序列或与序列VL47不同在于包含一个或多个选自由以下组成的组的取代的氨基酸序列作为轻链可变区：位置17(Kabat编号：L17)处Glu对Asp的取代、位置28(Kabat编号：L27A)处Asn对Ser的取代、位置42(Kabat编号：L37)处Leu对Gln的取代、位置50(Kabat编号：L45)处Arg对Gln的取代以及位置51(Kabat编号：L46)处Leu对Arg的取代。
在另外的方面，人源化抗体或其片段或衍生物包含以下序列组合中的任一种：(a)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL15；(b)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL36；(c)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL46；(d)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL47；(e)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL48；(f)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL50；(g)作为重链可变区的序列VH12和作为轻链可变区的序列VL48；(h)作为重链可变区的序列VH47和作为轻链可变区的序列VL48；(i)作为重链可变区的序列VH61和作为轻链可变区的序列VL48；(j)作为重链可变区的序列VH62和作为轻链可变区的序列VL48；(k)作为重链可变区的序列VH64和作为轻链可变区的序列VL47；(l)作为重链可变区的序列VH64和序列VL48，以及(m)作为重链可变区的序列VH65和序列VL47。
在另外的方面，本发明提供了用于治疗或预防痴呆的剂，其包含如本文所述的人源化抗体或其片段或衍生物。
在另外的方面，本发明提供了用于治疗或预防痴呆或tau蛋白病的方法和剂，所述病变包括阿尔茨海默病、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、皮克病、嗜银颗粒性痴呆(嗜银颗粒病)、伴有早老性痴呆的多系统性tau蛋白病(MSTD)、与17号染色体相关的额颞叶痴呆及帕金森病(FTDP-17)、伴有神经原纤维缠结的痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结(DNTC)、伴有球状神经胶质包涵体的白质tau蛋白病(WMT-GGI)或具有tau病理学的额颞叶变性(FTLD-tau)。
在另外的方面，本发明提供了药物组合物，其包含如本文所述的人源化抗体或其片段或衍生物和药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了抗pSer413 tau抗体，其包含：a)重可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:86的vhCDR1、含有SEQ ID NO:115的vhCDR2和含有SEQ ID NO:88的vhCDR3；以及b)轻可变结构域，其包含一组选自由以下组成的组的vlCDR：i)包含SEQ ID NO:102的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；ii)包含SEQ ID NO:91的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；iii)包含SEQ IDNO:92的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；iv)包含SEQID NO:93的vlCDR1、包含SEQ ID NO82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；v)包含SEQID NO:94的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；vi)包含SEQ ID NO:95的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；vii)包含SEQ ID NO:96的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；viii)包含SEQ ID NO:97的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；ix)包含SEQ ID NO:98的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；x)包含SEQ ID NO:99的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；xi)包含SEQ ID NO:100的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ IDNO:83的vlCDR3；以及xii)包含SEQ ID NO:101的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3。在一些情况下，抗体具有至少约40的结合SEQ ID NO:8的磷酸化肽的抗体与结合SEQ ID NO:69的非磷酸化肽的抗体的比率。
在另外的方面，本发明提供了抗pSer413 tau抗体，其包含：a)选自SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117的重可变结构域；以及b)选自SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:114的轻可变结构域。在一些情况下，抗体具有至少约40的结合SEQ ID NO:8的磷酸化肽的抗体与结合SEQ ID NO:69的非磷酸化肽的抗体的比率。
在另外的方面，本发明的抗体包含选自SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ IDNO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:144的重恒定结构域。
在另外的方面，本发明的抗体包含选自SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80的轻恒定结构域。
在另外的方面，本发明的抗体包含选自SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117的可变重结构域。
在另外的方面，本发明的抗体包含选自SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:114的可变轻结构域。
在另外的方面，抗体包含选自以下对的重链和轻链：LC SEQ ID NO:184和HC SEQID NO:144；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:145；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:146；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:147；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:148；LCSEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:149；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:150；LC SEQ IDNO:184和HC SEQ ID NO:151；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:152；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:153；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:154；LC SEQ ID NO:184和HCSEQ ID NO:155；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:156；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ IDNO:157；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:158；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:159；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:160；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:161；LC SEQID NO:185和HC SEQ ID NO:144；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:145；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:146；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:147；LC SEQ ID NO:185和HCSEQ ID NO:148；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:149；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ IDNO:150；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:151；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:152；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:153；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:154；LC SEQID NO:185和HC SEQ ID NO:155；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:156；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:157；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:158；LC SEQ ID NO:185和HCSEQ ID NO:159；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:160以及LC SEQ ID NO:185和HC SEQID NO:161。
在另外的方面，本发明的抗体具有包含SEQ ID NO:184或由其组成的轻链和包含SEQ ID NO:144或由其组成的重链。
在另外的方面，本发明的抗体具有包含SEQ ID NO:184或由其组成的轻链和包含SEQ ID NO:152或由其组成的重链。
在另外的方面，本发明提供了核酸组合物，其包含：a)编码选SEQ ID NO:162、SEQID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:185的轻链的第一核酸；以及b)编码选自SEQ ID NO:144；SEQ ID NO:145；SEQID NO:146；SEQ ID NO:147；SEQ ID NO:148；SEQ ID NO:149；SEQ ID NO:150；SEQ ID NO:151；SEQ ID NO:152；SEQ ID NO:153；SEQ ID NO:154；SEQ ID NO:155；SEQ ID NO:156；SEQID NO:157；SEQ ID NO:158；SEQ ID NO:159；SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161的重链的第二核酸。
在另外的方面，本发明提供了包含第一核酸和第二核酸的表达载体组合物，其中第一核酸包含在第一表达载体中，并且第二核酸包含在第二表达载体中。
在另外的方面，本发明提供了表达载体组合物，其中第一核酸和第二核酸包含在单一表达载体中。
在另外的方面，本发明提供了包含表达载体组合物的宿主细胞和制备抗pSer413tau抗体的方法，所述方法包括在其中表达所述抗体的条件下培养宿主细胞并回收所述抗体。
在另外的方面，本发明提供了治疗对象的tau蛋白病的方法，其包括施用本发明的抗体。
VI.附图说明
当结合附图来阅读以下详细描述时，可从中最佳地理解本发明。附图中包括以下图：
图1A和图1B共同显示了使用ClustalW制备的Tau蛋白的各种人同种型的比对。
图2A显示了根据本公开的一些实施方案的几种抗pS413-Tau结合蛋白的轻链可变区序列(突出显示了CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，根据Kabat编号系统)的比对。
图2B显示了根据本公开的一些实施方案的几种抗pS413-Tau结合蛋白的重链可变区序列(突出显示了CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，根据Kabat编号系统)的比对。
图3举例说明了根据本公开的一些实施方案的几种抗pS413-Tau抗体相对于非磷酸化肽PD17对于磷酸化肽PD17P的选择性结合亲和力。
图4举例说明了根据本公开的一些实施方案的几种抗pS413-Tau抗体对于来自阿尔茨海默病患者的脑匀浆中的磷酸化Tau的结合亲和力。
图5A和图5B显示了小鼠血浆中人源化抗体变体随时间推移的药代动力学。图5A展示五种初始人源化抗体变体2、5、6、9和10表现出从小鼠血浆中的快速消除。图5B展示三种后来开发的人源化抗体变体L15H11、L46H11和L47H65表现出与嵌合抗体相当的药代动力学特征。
图6A和图6B显示了不同人源化抗体变体具有不同脑内迁移。图6A显示脑匀浆中各种人源化抗体的浓度。图6B显示了脑中代表性人源化抗体水平与血浆中相应抗体水平的比率。
图7A和7B显示代表性人源化抗体变体与亲本小鼠抗体的轻链可变区(图7A)和重链可变区域(图7B)的氨基酸序列的比对。
图8A-图8D展示亲本小鼠抗体(图8A和图8B)和嵌合抗体(图8C和图8D)与磷酸化肽结合(图8A和图8C)但不与非磷酸化的对应物结合(图8B和图8D)。
图9A-图9C显示代表性人源化抗体变体与pS413肽的结合。
图10A-图10E显示亲本小鼠抗体(图10A)、嵌合抗体(图10B)和选定的人源化抗体变体(图10C-10E)与来自阿尔茨海默病患者的脑匀浆中的S413-磷酸化Tau蛋白的相当的结合特征。
图11A-图11E显示了本发明的一些抗pSer413 tau蛋白人源化抗体的可变重和可变轻区。
图12显示了许多不同的人IgG恒定结构域，其可用于抗pSer413tau抗体的可变重链和可变轻链的组合。“人_IgG1_”是人野生型IgG1的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)。“人_IgG1_L234A_L235A”是具有两个氨基酸取代L234A和L235A(有时称为“LALA”突变)的人野生型IgG1的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)，所述取代降低/消除效应功能。“人_IgG1__L234A_L235A_D265S”是具有三个氨基酸取代L234A、L235A和D265S的人野生型IgG1的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)，所述取代降低/消除效应功能。“人_IgG1_YTE_”或“人IgG1_YTE(M252Y_S254T_T256E)”是具有三个氨基酸取代M252Y、S254T、T256E的人野生型IgG1的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)，所述取代增加血清中抗体的半衰期。“人_IgG1_N297A_”是具有氨基酸取代N297A的人野生型IgG1的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)，所述取代消除糖基化位点并且降低/消除效应功能。“人_IgG1_N297Q_”是具有氨基酸取代N297Q的人野生型IgG1的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)，所述取代消除糖基化位点并且降低/消除效应功能。“_人_IgG2”是人野生型IgG2的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)。“_人_IgG4”是人野生型IgG4的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)。“人_IgG4_S228P_”是具有氨基酸取代S228P(以防止臂交换)的人野生型IgG4的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)。
图13显示连同图12的主链的H11和H65可变区的全长重链。“斜杠”(“/”)指示可变结构域与恒定结构域的接合处，并且CDR加以下划线。
图14显示了具有人κ或λ轻恒定结构域的12个不同可变轻结构域的全长轻链。“斜杠”(“/”)指示可变结构域与恒定结构域的接合处，并且CDR加以下划线。
图15描绘了本发明的重链和轻链的可能组合的矩阵。框中的“A”指示使用重恒定结构域“人_IgG1_”。框中的“B”指示使用重恒定结构域“人_IgG1_L234A_L235A”。框中的“C”指示使用重恒定结构域“人_IgG1__L234A_L235A_D265S”。框中的“D”表示使用重恒定结构域“人_IgG1_YTE_”。框中的“E”表示使用重恒定结构域“人_IgG1_N297A_”。框中的“F”表示使用重恒定结构域“人_IgG1_N297Q_”。框中的“G”表示使用重恒定结构域“_人_IgG2”。框中的“H”表示使用重恒定结构域“_人_IgG4”。框中的“I”表示使用重恒定结构域“人_IgG4_S228P_”。框中的“J”表示使用具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的人IgG1恒定结构域。
具体实施方式
A.概述
本公开提供了包含与丝氨酸残基413处被磷酸化的Tau蛋白(pSer413-Tau)特异性结合的抗原结合部分的抗体。还提供了编码所述蛋白质的核酸和包含此类核酸的细胞。在一些实施方案中，所提供的方法和组合物用于治疗tau蛋白病(例如，阿尔茨海默病)。
编码tau的MAPT基因已被鉴定为由排列在基因组上的13个外显子组成，其可通过选择性剪接表达为多种不同的蛋白质同种型(参见Arai，同上)。tau蛋白包含含有0-2个(取决于外显子2和外显子3的选择性剪接(N0-N2))29个氨基酸的重复序列(N)的N末端酸性结构域、富含脯氨酸的中间结构域和促成微管结合的含有3个(3R)或4个(4R)重复序列(R)的C-末端微管结合结构域(由外显子9至12编码)(Burns，同上和Arai，同上)。因此，人tau具有六种代表性同种型：3R0N(352个氨基酸)、3R1N(381个氨基酸)、3R2N(410个氨基酸)、4R0N(383个氨基酸)、4R1N(412个氨基酸)和4R2N(441个氨基酸)，这取决于其含有的29个氨基酸重复序列(N)和微管结合重复序列(R)的数量。在这些同种型中，胚胎脑中仅存在3R0N，而成年人脑中存在所有六种同种型，4R最丰富(Burns，同上)。3R与4R同种型之间的差异由外显子10是通过选择性剪接而被除去(3R)还是存在(4R)导致。为了明确地鉴定这些tau同种型中的任一种中的氨基酸残基的位置，将最长同种型即4R2N(在SEQ ID NO:1中限定)的氨基酸编号(1至441)用作参考。例如，“Ser413”是指4R2N(在SEQ ID NO:1中限定)中第413位氨基酸位置处的丝氨酸残基，其对应于4R1N(在SEQ ID NO:2中限定)中第384位的丝氨酸、4R0N(在SEQ ID NO:3中限定)中的第355位的丝氨酸、3R2N(在SEQ ID NO:4中限定)中的第382位的丝氨酸、3R1N(在SEQ ID NO:5中限定)中的第353位的丝氨酸以及3R0N(在SEQ IDNO:6中限定)中的第324位的丝氨酸。
Tau在对应于SEQ ID NO:1中限定的氨基酸序列的位置413处的丝氨酸残基(Ser413，当被磷酸化时，其在本文中被称为“pSer413”)的位置处具有磷酸化氨基酸残基(因此在Ser413处磷酸化的tau蛋白是“pSer413 tau”或“pSer413-tau”)，所述磷酸化氨基酸残基为在AD中特异性磷酸化的位点。如先前在WO 2013/180238中所示，向在成熟时发展认知功能损害的转基因小鼠施用参与与PSer413-tau的特异性抗原-抗体反应的抗体，导致认知功能恢复至与对照组的认知功能水平几乎相同的水平。有趣的是，施用相似浓度的针对在对应于SEQ ID NO:1中限定的氨基酸序列的Ser396的位置处具有磷酸化氨基酸残基的tau蛋白的单克隆抗体(其具有比上述抗体更强的对于等同抗原的亲和力)未导致认知功能的充分改善。由于关于tau的结构和功能，没有关于在对应于SEQ ID NO:1中限定的氨基酸序列的Ser413的位置处包含氨基酸残基的区域的特定信息，因此完全出乎意料的结果是与该区域结合的抗体具有改善认知功能的强烈效果。
因此，本发明涉及人源化和优化的抗pSer413 tau抗体，其可用作用于治疗人对象的认知障碍(诸如tau蛋白病)的治疗剂或预防剂。
根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体对磷酸化tau表现出高结合亲和力，同时对人体具有显著降低的抗原性，并且可有效地用作认知障碍(诸如人对象的tau蛋白病)的治疗剂或预防剂。另外，与鼠CDR相比，CDR内的氨基酸修饰减少脱酰胺，导致稳定性增加；参见实施例8、9和10。
B.定义
如本文中所用，以下术语中的每一个均具有与其在本章节中相关的含义。
冠词“一个/种(a)”和“一个/种(an)”在本文中用于指一个/种或不止一个/种(即，至少一个/种)的所述冠词的语法对象。以举例的方式，“一个元素”意指一个元素或不止一个元素。
当提及可测量值诸如量、时间持续期等时，如本文中所用的“约”表示包括与指定值相差±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，仍然更优选±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所公开的方法。
本文的“消除”是指活性的降低或去除。因此，例如，“消除FcγR结合”意指与不含特定变体的Fc区相比，Fc区氨基酸变体具有小于50％的起始结合，其中小于70-80-90-95-98％的活性损失是优选的，并且通常地，其中活性低于Biacore测定中可检测的结合水平。
如本文中所用，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合的抗体，随后引起靶细胞的裂解。ADCC与对FcγRIIIa的结合相关；与FcγRIIIa的结合增加导致ADCC活性增加。如本文中所论述的，本发明的许多实施方案完全消除ADCC活性。
如本文中所用，“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合的抗体，随后引起靶细胞的吞噬作用。
本文中的“抗原结合结构域”或“ABD”是指一组六个互补决定区(CDR)，当作为多肽序列的部分存在时，其特异性结合如本文所论述的靶抗原。因此，“抗原结合结构域”结合如本文概述的靶抗原。如本领域已知的，这些CDR通常作为第一组可变重CDR(vhCDR或VHCDR或CDR-HC)和第二组可变轻CDR(vlCDR或VLCDR或CDR-LC)存在，每个组包含3个CDR：重链的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3和轻链的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3。CDR分别存在于可变重链和可变轻链结构域中，并且一起形成Fv区。因此，在一些情况下，抗原结合结构域的六个CDR由可变重链和可变轻链贡献。在“Fab”形式中，6个CDR的组由两个不同的多肽序列贡献，可变重链结构域(vh或VH；包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和可变轻结构域(vl或VL；含有vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，其中vh结构域的C-末端连接到重链的CH1结构域的N-末端，并且vl结构域的C-末端连接到恒定轻结构域的N-末端(从而形成轻链)。在scFv形式中，vh和vl结构域通常通过使用如本文概述的接头共价连接成单个多肽序列，其可以是(从N-末端开始)vh-接头-vl或vl-接头-vh，其中前者通常是优选的(包括每侧上的任选的结构域接头，具体取决于使用的形式。如本领域所理解的，CDR由可变重结构域和可变轻结构域中的每一个中的框架区分隔：对于轻可变结构域，这些是FR1-vlCDR1-FR2-vlCDR2-FR3-vlCDR3-FR4，而对于重可变结构域，这些是FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR4，其中框架区显示出与人种系序列的高同一性。本发明的抗原结合结构域包括Fab、Fv和scFv。
本文中的“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的改变。例如，修饰可以是与蛋白质连接的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另有说明，否则氨基酸修饰始终是由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用不同的氨基酸替代亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代是指非天然存在于特定位置，非天然存在于生物体内或任何生物体中的氨基酸。例如，取代M252Y是指其中位置252处的甲硫氨酸被酪氨酸替代的变体多肽，在该情况下是指Fc变体。为清楚起见，已被工程改造以改变核酸编码序列但不将起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)改变成CGA(仍然编码精氨酸)以提高宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代“；也就是说，尽管产生了编码同一蛋白质的新基因，但如果蛋白质在其起始的特定位置处具有同一氨基酸，则其不是氨基酸取代。
如本文中所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指与亲本蛋白质的氨基酸序列不同在于至少一个氨基酸修饰的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含所述蛋白质的组合物，或编码其的氨基酸序列。优选地，蛋白质变体与亲本蛋白质相比具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比，约1个至约70个氨基酸修饰，优选约1至约5个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽，是人野生型序列，诸如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。本文中的蛋白质变体序列优选与亲本蛋白质序列具有至少约80％同一性，最优选至少约90％同一性，更优选至少约95％-98％-99％同一性。变体蛋白质可以指蛋白质本身、包含所述蛋白质的组合物，或编码其的DNA序列。
因此，如本文中所用，“抗体变体”或“变体抗体”意指与亲本抗体不同在于至少一个氨基酸修饰的抗体，如本文中所用，“IgG变体”或“变体IgG”意指与亲本IgG(再次地，在许多情况下，来自人IgG序列)不同在于至少一个氨基酸修饰的抗体，以及如本文中所用，“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指与亲本免疫球蛋白序列不同在于至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白序列。如本文中所用，“Fc变体”或“变体Fc”意指在Fc结构域中包含氨基酸修饰的蛋白质。根据组成它们的氨基酸修饰来定义本发明的Fc变体。因此，例如M252Y或252Y是相对于亲本Fc多肽在位置252处具有取代酪氨酸的Fc变体，其中编号根据EU索引。同样地，M252Y/S254T/T256E定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M252Y、S254T和T256E的Fc变体。WT氨基酸的身份可以是未指定的，在该况下，前述变体被称为252Y/254T/256E。应注意，其中提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，252Y/254T/256E是与254T/252Y/256E相同的Fc变体，等等。对于本发明中讨论的与抗体有关的所有位置，除非另有说明，否则氨基酸位置编号是根据Kabat(对于可变结构域编号)和根据EU索引(对于恒定结构域，包括Fc结构域)。Eu索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引是指EU抗体的编号(Edelman等，1969,ProcNatl Acad Sci USA 63:78-85，由此通过引用整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。取代可包括天然存在的氨基酸，并且在一些情况下，可包括合成氨基酸。
如本文中所用，本文中的“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基可包含天然存在的氨基酸和肽键。
如本文中所用，“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以单独指代该区域，或者在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白的的上下文中指代该区域。
如本文中所用，“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含单个抗原结合结构域(ABD)的VL和VH结构域的多肽。如本领域技术人员所理解的，这些通常由两条链组成，或者可被组合(通常利用本文所述的接头)以形成scFv。
如本文中所用，“氨基酸”和“氨基酸身份”意指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
如本文中所用，“效应功能”意指由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。
如本文中所用，“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcgammaR”意指结合IgG抗体Fc区并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人中，该家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2)(Jefferis等，2002,Immunol Lett 82:57-65，通过引用整体并入)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。在一些情况下，如本文所概述，与FcγR受体中的一种或多种的结合被减少或消除。例如，减少与FcγRIIIa的结合降低了ADCC，并且在一些情况下，期望减少与FcγRIIIa和FcγRIIb的结合。
如本文中所用，“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区并至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知的，功能性FcRn蛋白包含两种多肽，通常称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。除非本文另有说明，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。
如本文中所用，“亲本多肽”意指随后被修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程改造形式。亲本多肽可指多肽本身、包含所述亲本多肽的组合物或编码其的氨基酸序列。因此，如本文中所用，“亲本免疫球蛋白”意指未修饰的免疫球蛋白多肽，其被修饰来产生变体，并且如本文中所用，“亲本抗体”意指未修饰的抗体，其被修饰来产生变体抗体。应注意，“亲本抗体”包括如下概述的已知的商业重组产生的抗体。
本文中的“重恒定区”意指抗体的CH1-铰链-CH2-CH3部分，通常来自人IgG1、IgG2或IgG4。
如本文中所用，“靶抗原”意指由给定抗体的可变区特异性结合的分子。在本情况下，靶抗原是在位置Ser413处被磷酸化的tau蛋白(“pSer413-tau”)。
如本文中所用，“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。
如本文中所用，“可变区”意指免疫球蛋白的区域，其包含一个或多个基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座的V.κ、V.λ和/或VH基因编码的Ig结构域。
本文中的“野生型或WT”意指自然界中存在的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本文使用的术语“tau蛋白”是指具有SEQ ID NO:1至6中限定的氨基酸序列的人tau蛋白的六种同种型中的任一种，即4R2N(在SEQ ID NO:1中限定)、4R1N(在SEQ ID NO:2中限定)、4R0N(在SEQ ID NO:3中限定)、3R2N(在SEQ ID NO:4中限定)、3R1N(在SEQ ID NO:5中限定)和3R0N(在SEQ ID NO:6中限定)，以及其基因变体。如上文发明背景部分所解释的，超过40种突变与FTDP-17相关，所述FTDP-17是与认知障碍相关的家族性神经退行性疾病。然而，tau蛋白中的突变位点不应限定于与FTDP-17牵涉的那些位点。引入SEQ ID NO:1至6的氨基酸序列的氨基酸突变的数量不应受到限制，但可以是1至50，特别地1至30，更特别地1至10。然而，对应于SEQ ID NO:1的位置413处的丝氨酸残基(Ser413)中限定的氨基酸序列的氨基酸残基优选应当是保守的。根据本发明的tau蛋白还涵盖根据BLAST方法(利用由NCBI提供的PBLAST的默认条件)与SEQ ID NO:1中限定的人tau蛋白的氨基酸序列具有80％或更高的相似性或同一性的蛋白质及其同种型。这种tau蛋白包括源自非人物种诸如黑猩猩、猕猴、马、猪、狗、小鼠、兔和大鼠的tau。为了改善靶标动物的认知功能，可能产生靶向源自这种非人动物的tau的治疗剂或预防剂。
本文使用的术语“tau肽”意指包括tau蛋白的氨基酸序列的一部分的肽。源自tau蛋白的tau肽的氨基酸序列的位置和长度不应受到限制，但优选应含有例如一系列至少三个连续氨基酸，特别地至少五个连续氨基酸，更特别地至少八个连续氨基酸，所述连续氨基酸源自对应于SEQ ID NO:1的氨基酸编号410至421的氨基酸残基，至少包括对应于Ser413的氨基酸。tau肽的长度应该也不受限制，但优选应具有为4个或更多，特别地为6个或更多，更特别地为8个或更多的氨基酸的长度。
本文使用的术语“tau”意指共同的tau蛋白或tau肽。
术语“抗pSer413 tau蛋白”意指与在位置413处的丝氨酸处未被磷酸化的tau蛋白的结合相比，与在位置413处的丝氨酸处被磷酸化的tau蛋白优先结合的本文所述的抗体。在Ser413处磷酸化的tau蛋白可以是人和/或鼠的。
如本文中所用，“位置”是指蛋白质序列中的位置。位置可被依序编号，或根据确定的格式(例如抗体编号的EU索引)编号。
如本文中所用，“残基”意指蛋白质中的位置及其相关氨基酸身份。例如，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人抗体IgG1中位置297处的残基。
在本发明的上下文中，tau蛋白或tau肽中氨基酸残基的位置由氨基酸编号指示，其是基于SEQ ID NO:1(用于说明)中限定的氨基酸序列鉴定的。例如，对应于SEQ ID NO:1的Ser413的氨基酸残基意指SEQ ID NO:1(4R2N)的位置413处的丝氨酸残基、SEQ ID NO:2(4R1N)的位置384、SEQ ID NO:3(4R0N)的位置355、SEQ ID NO:4(3R2N)的位置382、SEQ IDNO:5(3R1N)的位置353或SEQ ID NO:6(3R0N)的位置324。tau同种型之间氨基酸残基位置的对应关系如下表1中示。
表1：人tau蛋白的同种型
虽然表1显示了对应于SEQ ID NO:1中限定的氨基酸序列的位置410至421的这些同种型的氨基酸残基的位置，但可基于例如图1A和图1B容易地识别其它区域中氨基酸残基的位置的对应性。本领域技术人员将能够使用成对序列比对(诸如Needleman-Wunsch法或Smith-Waterman法)或多序列比对(诸如ClustalW法或PRRP法)确定同种型或同源物中氨基酸的相应位置。作为对应位置的分析的示例，图1A和图1B显示了基于ClustalW的六种人同种型的氨基酸序列(用一字母代码表示)的比对。这些图表明，对应于SEQ ID NO:1中限定的氨基酸序列的Ser413的氨基酸残基周围的结构在所述六种同种型中是保守的。
本发明的抗体通常是分离的或重组的。当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”意指已从表达其的细胞或细胞培养物中鉴定并与所述细胞或细胞培养物分离和/或从中回收的多肽。通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。“重组”是指使用重组核酸技术在外源宿主细胞中产生抗体。
关于蛋白质序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比后，且不将任何保守性取代视为序列同一性的部分时，候选序列中与特定(亲本)序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以在本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。一个特定的程序是美国公开号20160244525(由此通过引用并入)的段落[0279]至[0280]中概述的ALIGN-2程序。另一个用于核酸序列的近似比对由Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics,2:482-489(1981)的算法提供。该算法可通过使用由Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff(编辑),第5次增刊3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA开发以及由Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)归一化的评分矩阵应用于氨基酸序列。
用于确定序列的同一性百分比的该算法的实现的实例由Genetics ComputerGroup(Madison,WI)在“BestFit”应用程序中提供。该方法的默认参数见述于WisconsinSequence Analysis Package Program Manual,第8版(1995)(可从Genetics ComputerGroup,Madison,WI获得)中。本发明的说明书中的确定同一性百分比的另一方法是使用版权归University of Edinburgh所有的程序的MPSRCH包，其由John F.Collins和ShaneS.Sturrok开发，并由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)分销。通过这套软件包，可以采用Smith-Waterman算法，其中将默认参数用于评分表(例如，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为1，以及空位为6)。通过生成的数据，“匹配”值反映”序列同一性”。其它用于计算序列间同一性或相似性百分比的合适程序在本领域中通常是熟知的，例如，另一比对程序为BLAST，使用默认参数。例如，可以通过以下默认参数使用BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；预期值＝10；矩阵＝BLOSUM62；说明＝50个序列；排序方式＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译库+Swiss蛋白数据库+Spupdate+PIR。这些程序的详细信息可见于互联网，网址为http://in front ofblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。
本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与亲本氨基酸序列之间的同一性程度计算为两个序列比对中的精确匹配数除以“发明序列的长度”，或亲本序列的长度，以最短者为准。结果以同一性百分比表示。
在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性。在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸序列具有至少95％、97％、98％、99％或甚至100％同一性。
“特异性结合”特定抗原或表位或“与特定抗原或表位特异性结合”或“对特定抗原或表位具有特异性”意指与非特异性相互作用可测量地不同的结合。例如，可通过测定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量特异性结合，所述对照分子通常是具有不具有结合活性的类似结构的分子。例如，可通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定特异性结合。
如本文中所用，术语“Kassoc”或“Ka”意欲指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文中所用，术语“Kdis”或“Kd”意欲指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文中所用，术语“KD”旨在指解离常数，其由Kd与Ka的比率(即,Kd/Ka)获得，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可使用本领域良好建立的方法来测定。在一些实施方案中，用于测定抗体的KD的方法是通过使用表面等离振子共振，例如，通过使用生物传感器系统，诸如系统。在某些实施方案中，KD值用磷酸化Tau蛋白来测量。在一些实施方案中，KD值用磷酸化肽来测量。在一些实施方案中，KD值用固定的抗原(例如，磷酸化Tau蛋白或磷酸化肽)来测量。在其它实施方案中，KD值用固定的抗体(例如，亲本小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体变体)来测量。在其它实施方案中，KD值用磷酸化Tau蛋白作为分析物来测量。在仍然其它实施方案中，KD值用磷酸化肽作为分析物来测量。在某些实施方案中，以二价结合模式测量KD值。在其它实施方案中，以单价结合模式测量KD值。
“疾病”包括动物(包括人)的健康状态，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则动物的健康继续恶化。
相反地，动物(包括人)中的“病症”包括其中动物能够维持体内平衡的的健康状态，但其中动物的健康状况不如其在所述病症不存在的情况下的健康状态良好。如果不治疗，病症不一定会导致动物的健康状态进一步下降。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等是指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状或降低疾病或其症状的可能性而言，所述作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的副作用而言所述作用可以是治疗性的。如本文中所用，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有其的对象中发生；(b)抑制疾病，即，阻止其发展或进展；以及(c)缓解疾病，即，引起疾病消退和/或缓解一种或多种疾病症状。“治疗”还意味着涵盖递送剂以提供药理学作用，即使在疾病或疾患不存在的情况下亦如此。例如，“治疗”涵盖递送可在疾病状况不存在的情况下引发免疫应答或赋予免疫力(例如，在疫苗的情况下)的组合物。
如本文中所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠，以及兔形目的哺乳动物，诸如兔子。在一些实施方案中，哺乳动物来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。在一些实施方案中，哺乳动物来自偶蹄目(包括牛族动物(母牛)和猪(猪(pigs))或奇蹄目(包括马科动物(马))。最优选的是哺乳动物属于灵长目、四足猴目或猴目(猴)或属于类人猿目(人和猿)。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
如本文中所用，术语“消退”以及由此产生的词语不一定意味着100％或完全消退。相反，存在不同程度的消退，本领域普通技术人员认为所述消退具有潜在的益处或治疗作用。在这方面，所公开的方法可提供任何量的任何水平的哺乳动物的tau蛋白病消退。此外，本发明方法提供的消退可包括疾病(例如，tau蛋白病)的一种或多种病况或症状的消退。而且，出于本文的目的，“消退”可以包括延迟疾病的发作、延迟症状的发作和/或延迟其疾患的发作。关于进行性疾病和病症，“消退”可涵盖减缓疾病或病症的进展，减缓疾病或病症的症状的进展，和/或减缓其疾患的进展。
组合物的“有效量”或“治疗有效量”包括足以对向其施用组合物的对象提供有益作用的组合物的量。递送媒介物的“有效量”包括足以有效结合或递送组合物的量。
“个体”或“宿主”或“对象”或“患者”意指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物对象，特别是人。其它对象可包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。
如本文中所用，术语“与......组合”是指以下用途：其中例如在第二疗法的整个施用过程中施用第一疗法；其中施用第一疗法，持续与第二疗法的施用重叠的一段时间，例如其中第一疗法的施用在第二疗法施用之前开始，并且第一疗法的施用在第二疗法的施用结束之前结束；其中第二疗法的施用在第一疗法施用之前开始，并且第二疗法的施用在第一疗法的施用结束之前结束；其中第一疗法的施用在第二疗法的施用开始之前开始，并且第二疗法的施用在第一疗法的施用结束之前结束；其中第二疗法的施用在第一疗法的施用开始之前开始，并且第一疗法的施用在第二疗法的施用结束之前结束。因此，“组合(incombination)”还可以指涉及施用两种或更多种疗法的方案。如本文中所用，“与......组合”还指施用两种或更多种疗法，所述疗法可在相同或不同的制剂中，通过相同或不同的途径，以及以相同或不同的剂型施用。
“编码”包括多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作用于在生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板的固有性质，所述聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果例如对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链以及用作用于基因或cDNA的转录的模板的非编码链均可称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。
术语“核酸”包括以任何形式(包括单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸)存在的具有不止一个核苷酸的RNA或DNA。术语“核苷酸序列”包括以单链核酸形式存在的寡核苷酸或多核苷酸中的核苷酸的排序。
“核酸构建体”是指已被构造成包含一个或多个合在一起不存在于自然界中的功能单元的核酸序列。实例包括环状、线性、双链、染色体外DNA分子(质粒)、粘粒(包含来自λ噬菌体的COS序列的质粒)、包含非天然核酸序列的病毒基因组等等。
如本文中所用，术语“可操作地连接”包括与第二多核苷酸具有功能关系的多核苷酸，例如包含以使两个核苷酸中的至少一个能够对另一个发挥其特征性生理学作用的方式排列在核酸部分内的两个多核苷酸的单链或双链核酸部分。举例来说，可操作地连接到基因编码区的启动子能够促进编码区的转录。当指示可操作的键联时指定的顺序并不重要。例如，短语：“启动子与核苷酸序列可操作地连接”和“核苷酸序列与启动子可操作地连接”在本文中可互换使用并被认为是等同的。在一些情况下，当编码所需蛋白质的核酸还包含启动子/调控序列时，启动子/调控序列位于所需蛋白质编码序列的5'末端，使得其驱动所需蛋白质在细胞中表达。
本文中可互换使用的术语“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸分子”是指具有任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(如通常可存在于RNA或DNA中的)或经修饰的或取代的糖或磷酸基团。
当应用于多核苷酸时，术语“重组”意指多核苷酸是克隆、限制或连接步骤的各种组合，以及导致与天然存在的多核苷酸不同和/或相异的构建体的其它方法的产物。该术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制和原始病毒构建体的后代。
如本文中所用，术语“启动子”包括与待转录的核酸序列诸如编码所需分子的核酸序列可操作地连接的DNA序列。启动子通常位于待转录的核酸序列的上游，并提供被RNA聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。
“载体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导目标基因表达并且可将基因序列转移至靶细胞(这可通过全部或部分载体的基因组整合，或载体作为染色体外元件的瞬时或可遗传维持来实现)的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达媒介物，以及整合载体。
如本文中所用，术语“调控元件”包括控制核酸序列表达的某些方面的核苷酸序列。调控元件的实例说明性地包括增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、内含子、复制起点、多腺苷酸化信号(pA)、启动子、增强子、转录终止序列和上游调控结构域，所述调控元件促成核酸序列的复制、转录和/或转录后加工。在某些情况下，调控元件还可包括顺式-调控DNA元件以及转座元件(TE)。本领域普通技术人员仅使用常规实验就能够在表达构建体中选择和使用这些和其它调控元件。表达构建体可使用遗传重组方法产生或使用熟知的方法合成产生。
“控制元件”或“控制序列”是参与促成多核苷酸功能性调控(包括多核苷酸的复制、重复(duplication)、转录、剪接、翻译或降解)的分子相互作用的核苷酸序列。该调控可影响该过程的频率、速度或特异性，并且在性质上可以增强或抑制性的。本领域已知的控制元件包括，例如，转录调控序列诸如启动子和增强子。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(在3'方向上)的编码区转录的DNA区域。
本文中使用的氨基酸残基被“磷酸化”的陈述意指磷酸基团与氨基酸残基的侧链通过酯连接。可被磷酸化的典型氨基酸残基包括丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)。
VIII.抗体
本发明涉及结合在位置413处被磷酸化的人tau蛋白的抗体和抗原结合片段。
常规抗体结构单元通常包含四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。人轻链被分类为κ轻链和λ轻链。本发明涉及通常基于IgG类的抗体，其具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，IgG1、IgG2和IgG4的使用频率高于IgG3。应当注意，IgG1具有不同的同种异型，所述同种异型在356(D或E)和358(L或M)处具有多态性。本文描绘的序列使用356D/358L同种异型，然而本文包括其他同种异型。也就是说，包括本文包括的IgG1Fc结构域的任何序列可用356E/358M替代356D/358L同种异型。
如本领域技术人员将理解的，CDR的确切编号和放置在不同编号系统之间可以是不同的。然而，应该理解，可变重链序列和/或可变轻链序列的公开内容包括相关(固有)CDR的公开内容。因此，每个可变重区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个可变轻区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。
用于鉴定抗体的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的序列的方法包括：Kabat方法(Kabat等，The Journal of Immunology,1991，第147卷，第5期，第1709-1719页)和Chothia方法(Al-Lazikani等，Journal of Molecular Biology,1997，第273卷，第4期，第927-948页)。这些方法在本领域技术人员的技术常识范围内，其概要可在例如Dr.Andrew C.R.Martin’s Group的网站(http://www.bioinf.org.uk/abs/)上获得。
CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等，Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003):
表1
在整个本说明书中，当提及可变结构域中的残基(大致地，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统，并且对于恒定区诸如Fc区，通常使用EU编号系统(例如，Kabat等，同上(1991))。
本发明提供了许多不同的CDR组。在该情况下，“完全CDR组”包括三个可变轻CDR和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可以分别是较大的可变轻结构域或可变重结构域的一部分。另外，如本文中更全面概述的，当使用重链和轻链时(例如当使用Fab时)，可变重结构域和可变轻结构域可以在分开的多肽链上，或者在scFv序列的情况下，在单条多肽链上。
CDR促成抗体的抗原结合位点，或更具体地表位结合位点的形成。“表位”是指与称为互补位的抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是分子诸如氨基酸或糖侧链的分组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可具有不止一个表位。
在本发明情况下，表位不仅包含直接参与本发明抗体的结合的氨基酸残基，而且还包含Ser413处的磷酸化。
每条链的羧基末端部分界定主要负责效应功能的恒定区。Kabat等收集了许多重链和轻链可变区的一级序列。基于序列的保守程度，他们将单个一级序列分类为CDR和框架并制作了其列表(参见SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第5版，NIH publication,No.91-3242,E.A.Kabat等，通过引用整体并入)。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在几个免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中意指具有独特三级结构的免疫球蛋白的区域。在本发明中所关注的是重链结构域，包括恒定重(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的情况下，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，IgG背景下的“CH”结构域如下：“CH1”是指根据如Kabat中的EU索引的位置118-220。“CH2”是指根据如Kabat中的EU索引的位置237-340，并且“CH3”是指根据如Kabat中的EU索引的位置341-447。
重链的Ig结构域的另一种类型是铰链区。本文中“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”意指在抗体的第一与第二恒定结构域之间包含氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置220处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置237处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中被定义为包括位置221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些实施方案中，例如在Fc区的背景下，包括下铰链，其中“下铰链”通常指的是位置226或230。如本文中所述，也可在铰链区中制备pI变体。
轻链通常包含两个结构域，可变轻结构域(包含轻链CDR并与可变重结构域一起形成Fv区)和恒定轻链区(通常称为CL或Cκ)。
下面概述的用于另外的取代的另一个目标区域是Fc区。
因此，本发明提供了不同的抗体结构域。如本文中所述和本领域已知的，本发明的抗体包含重链和轻链内的不同结构域，其也可以重叠。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、可变重结构域、可变轻结构域、轻恒定结构域、Fab结构域和scFv结构域。
因此，“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域，和任选的铰链结构域。重链包含可变重结构域和恒定结构域，其包括包含CH2-CH3的CH1-铰链-Fc结构域。轻链包含可变轻链和轻恒定结构域。scFv包含可变重链、scFv接头和可变轻结构域。本发明的一些实施方案包含至少一个scFv结构域，其虽然不是天然存在的，但通常包括通过scFv接头连接在一起的可变重结构域和可变轻结构域。如本文所概述的，虽然scFv结构域通常从N-末端至C-末端定向为vh-scFv接头-vl，但对于任何scFv结构域(或使用来自Fab的vh和vl序列构建的那些)，这可被反向成vl-scFv接头-vh。
如本文中所示，存在许多可使用的合适的scFv接头，包括通过重组技术产生的常规肽键。接头肽可主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽应具有足以以使得两个分子相对于彼此采取正确构象，从而使得它们保持所需的活性的方式连接所述两个分子的长度。在一个实施方案中，接头长度为约1至50个氨基酸，优选长度为约1至30个氨基酸。在一个实施方案中，可使用长度为1至20个氨基酸的接头，在一些实施方案中可使用约5至约10个氨基酸。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n(其中n为至少为1(通常为3至4)的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性接头。或者，各种非蛋白质性质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物，可用作接头，即可用作接头。
其它接头序列可包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但不包括CL/CH1结构域的所有残基；例如，CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头可源自免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。接头可源自任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。接头序列还可源自其它蛋白质诸如Ig样蛋白质(例如TCR、FcR、KIR)、铰链区衍生的序列和来自其它蛋白质的其它天然序列。
在一些实施方案中，接头是“结构域接头”，用于将本文概述的任何两个结构域连接在一起。虽然可使用任何合适的接头，但许多实施方案使用甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n(其中n为至少为1(并且通常为3至4至5)的整数)以及允许两个结构域重组连接，具有足够的长度和柔性以允许每个结构域保留其生物功能的任何肽序列。
A.嵌合抗体和人源化抗体
在一些实施方案中，本文的抗体可源自来自不同物种的混合物，例如嵌合抗体和/或人源化抗体。一般而言，“嵌合抗体”和“人源化抗体”是指组合来自不止一种物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”常规地包含来自小鼠(或在一些情况下来自大鼠)的一个或多个可变区和来自人的一个或多个恒定区。“人源化抗体”通常指可变结构域框架区已交换成人抗体中存在的序列的非人抗体。一般而言，在人源化抗体中，整个抗体除了CDR之外，由人来源的多核苷酸编码或者除了其CDR内之外与此抗体相同。其部分或全部由来源于非人生物体的核酸编码的CDR被移植入人抗体可变区的β折叠框架中以产生抗体，所述抗体的特异性由移入的CDR决定。此类抗体的产生描述于例如WO 92/11018,Jones,1986,Nature 321:522-525,Verhoeyen等，1988,Science 239:1534-1536，所有文献均通过引用整体并入。通常需要所选择的受者框架残基至相应供体残基的“回复突变”来重新获得在初始移植的构建体中丧失的亲和力((US 5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US5859205；US 5821337；US 6054297；US 6407213,所有文献均通过引用整体并入)。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少一部分，并且因此通常将包含人Fc区域。人源化抗体还可使用具有基因工程改造的免疫系统的小鼠产生。Roque等，2004,Biotechnol.Prog.20:639-654，通过引用整体并入。用于人源化和重塑非人抗体的多种技术和方法是本领域熟知的(参见Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)，和其中引用的参考文献，所有参考文献通过引用并入)。人源化方法包括但不限于以下文献中描述的方法：Jones等，1986,Nature 321:522-525；Riechmann等，1988；Nature 332:323-329；Verhoeyen等，1988,Science,239:1534-1536；Queen等，1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33；He等，1998,J.Immunol.160:1029-1035；Carter等，1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9,Presta等，1997,Cancer Res.57(20):4593-9；Gorman等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185；O’Connor等，1998,Protein Eng 11:321-8，所有文献均通过引用整体并入。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化或其它方法可包括表面重塑方法，如例如Roguska等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973(通过引用整体并入)中描述的。
在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可包含人抗体或由其组成，所述人抗体包含作为特定种系序列“的产物”或“源自”特定种系序列的重链或轻链可变区。可这样通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择在序列上与人抗体的序列最接近(即，最大同一性％)的人种系免疫球蛋白序列，来鉴定作为人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“源自”其的人抗体。由于例如天然存在的体细胞突变或定点突变的有意引入，与种系序列相比，作为特定人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“源自”其的人抗体可包含氨基酸差异。然而，人源化抗体的氨基酸序列通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少80％同一性，并且当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)相比时，含有将抗体鉴定为源自人序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体的氨基酸序列可与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％或甚至至少96％、97％、98％或99％同一性。通常，源自特定人种系序列的人源化抗体将显示与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比不超过10-20个氨基酸差异。在某些情况下，人源化抗体可显示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸差异。
在一个实施方案中，亲本抗体已经亲和力成熟，这在本领域是已知的。基于结构的方法可用于人源化和亲和力成熟，例如如美国专利第7,657,380号中所述。可以采用基于选择的方法来对抗体可变区进行人源化和/或亲和力成熟，所述方法包括但不限于以下文献中描述的方法：Wu等，1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等，1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等，1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618；Rader等，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915；Krauss等，2003,Protein Engineering 16(10):753-759，所有文献通过引用整体并入。其它人源化方法可包括仅移植部分CDR，包括但不限于以下文献中描述的方法：Tan等，2002,J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等，2002,J.Immunol.169:3076-3084，所有文献通过引用整体并入。
术语“抗体”以最广义使用，并且包括例如完整免疫球蛋白或抗原结合部分。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解产生。因此，术语抗体包括两条重链和两条轻链的常规四聚体抗体，以及抗原结合片段诸如Fv、Fab和scFv。在一些情况下，本发明提供双特异性抗体，其包括至少一个如本文所述的抗原结合结构域。
根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体应优选表现出改善的血浆动力学。本文中人源化抗体的血浆动力学的改善意味着与对应于人源化抗体的非人源化抗体相比，代表人源化抗体在血浆中的动力学的参数被改变。代表血浆动力学的参数的实例包括：血浆半衰期、血浆中的平均保留时间和血浆清除率。这种参数被“改变”意味着参数增加或减少。与人源化抗体“对应”的非人源化抗体意指用作产生人源化抗体的基础的非人源化抗体，例如小鼠抗体或嵌合抗体。
术语“嵌合抗体”是指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其它抗体的一个或多个区域的抗体。“CDR移植抗体”是包含一个或多个源自特定物种的抗体或同种型的CDR以及同一或不同物种的另一种抗体或同种型的框架的抗体。
IX.组合物
本发明提供了许多不同的抗原结合结构域(通常掺入抗体中)，其在“抗原-抗体反应”中与在Ser413处被磷酸化(pSer413)的人tau蛋白结合。
“抗原-抗体反应”通过抗体对磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽的亲和力(即，平衡解离常数(KD))来测量。在某些实施方案中，KD值用磷酸化Tau蛋白来测量。在一些实施方案中，KD值用磷酸化Tau肽来测量。在一个实施方案中，磷酸化Tau肽仅在一个残基处被磷酸化(例如，SEQ ID NO:75)。在另一个实施方案中，磷酸化肽在多个残基处被磷酸化(例如，SEQ IDNO:76或SEQ ID NO:78)。在一些实施方案中，KD值用固定的抗原(例如，磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽)来测量，在该情况下，亲和力测量包括亲合力组分，即，以二价结合模式。在一些实施方案中，KD值用固定的抗体(例如，小鼠亲本抗体、嵌合抗体或人源化抗体变体)来测量，在该情况下，亲和力测量不包括亲合力组分，即，以单价结合模式。在其它实施方案中，KD值用固定的抗体和用磷酸化Tau蛋白作为分析物来测量。在其它实施方案中，KD值用固定的抗体和用磷酸化肽作为分析物来测量。在某些实施方案中，以二价结合模式测量KD值。在其它实施方案中，以单价结合模式测量KD值。
因此，在某些实施方案中，KD值为5×10-8M或更低；在一些实施方案中，KD值是5×10-9M或更低；在其它实施方案中，KD值是5×10-10M或更低；在其它实施方案中，KD值是1.86×10-8M或更低；在其它实施方案中，KD值是2×10-9M或更低；在其它实施方案中，KD值是2×10-10M或更低。在具体实施方案中，本文公开的抗体与磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽结合(其中KD为5×10-8M或更低)，所述KD值用固定的抗体和磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽作为分析物来测量。在具体实施方案中，本文公开的抗体与磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽结合(其中KD为5×10-9M或更低)，所述KD值用固定的磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽和抗体作为分析物来测量。在另一个具体实施方案中，本文公开的抗体与磷酸化tau蛋白或磷酸化tau肽结合(其中KD为2×10-9M或更低)，所述KD值用固定的磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽和抗体作为分析物来测量。在一个另外的具体实施方案中，本文公开的抗体与磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽结合(其中KD为5×10-10M或更低)，所述KD值用固定的磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽和抗体作为分析物来测量。在具体实施方案中，本文公开的抗体与磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽结合(其中KD为2×10-10M或更低)，所述KD值用固定的磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽和抗体作为分析物来测量。
另外，如本文中所概述，本发明的抗体优先于在位置413处不含磷酸的蛋白质或肽而与在位置S413处被磷酸化的tau肽或蛋白质结合。
根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体是可引起与根据本发明的磷酸化tau蛋白或磷酸化tau肽的抗原-抗体反应的抗体。
可与根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体引起抗原-抗体反应的磷酸化tau蛋白和tau肽是在神经退行性疾病诸如AD中被特异性磷酸化的氨基酸残基处磷酸化的那些。具体地，此类tau蛋白和tau肽至少在SEQ ID NO:1中限定的氨基酸序列的位置413处的丝氨酸残基(Ser413)处被磷酸化，并且还可在对应于氨基酸编号410至421的一个或多个氨基酸残基(即，对应于SEQ ID NO:1中限定的氨基酸序列的位置412处的丝氨酸残基(Ser412)、位置414处的苏氨酸残基(Thr414)和位置416处的丝氨酸残基(Ser416))处被磷酸化。典型的此类磷酸化肽包括但不限于：pSer412/pSer413(Cys-)，其具有SEQ ID NO:7中限定的氨基酸序列；pSer413(Cys-)，其具有SEQ ID NO:8中限定的氨基酸序列，和pSer409/pSer412/pSer413(Cys-)，其具有SEQ ID NO:9中限定的氨基酸序列。
根据本发明的磷酸化tau肽可用于产生根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体，或用作用于研究反应性的抗原。
本领域技术人员可通过使用适当的合成方法或基因工程方法产生根据本发明的磷酸化tau肽。通过合成产生磷酸化肽的方法的实例包括Boc法(Wakamiya T.,ChemistryLetters，第22卷，第1401页,1993)、Fmoc法(Perich,J.W.,International Journal ofPeptide and Protein Research，第40卷，第134-140页，1992以及JP3587390B和WO2013/180238)，尽管本领域技术人员可以适当地采用任何其它方法。通过基因工程产生磷酸化肽的方法的实例包括这样的方法，在所述方法中制备具有编码待产生的肽或其前体的核酸序列的遗传物质(DNA或RNA)，并在任选的步骤(诸如引入至表达载体中和添加启动子序列)之后，将其引入合适的表达宿主或经历无细胞蛋白质合成系统。在该情况下，可通过酶(例如激酶)在宿主中引起磷酸化反应或通过从宿主回收靶肽，然后使用酶诸如激酶引起磷酸化反应而在所需位点使肽磷酸化，所述酶可以是宿主固有的或通过基因工程而使得表达的。在后一种情况下，磷酸化反应可通过使靶肽经历酶(诸如糖原合酶激酶3(GSK3)或细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5(CDK5))而在体外引起，已知所述酶在tau的磷酸化反应中发挥作用。从宿主中或在体外根据上述方法磷酸化的肽中，可通过例如通过抗体-抗原反应选择与上述抗磷酸化tau抗体特异性结合的肽，来回收在所需氨基酸残基处磷酸化的肽。
根据本发明的磷酸化tau肽可以在其N-末端序列和/或C-末端序列处用具有适合于所需目的的其它功能的物质进行修饰。例如，根据本发明的磷酸化tau肽可以在其N-末端和/或C-末端处添加例如甲硫氨酸残基、乙酰基或焦谷氨酸，或在其N-末端和/或C末端处用例如荧光材料进行修饰。或者，可以用例如肽或蛋白质修饰根据本发明的磷酸化tau肽的N-末端和/或C-末端。可用于这种修饰的肽的实例包括合适的标签序列(通常为组氨酸标签或FLAG标签)、具有可被T细胞受体(TCR)或主要组织相容性复合物(MHC)识别的氨基酸序列的肽、源自病毒或细菌的蛋白质或具有源自此类蛋白质的序列的肽。另外，根据本发明的磷酸化tau肽包括具有至少一个用任何其它化合物或肽修饰的除N末端和C末端残基外的氨基酸残基的肽。本领域技术人员能够使用任何已知方法(诸如Hermanson等，“BioconjugateTechniques”,(US),Academic Press,1996中描述的方法)对磷酸化tau肽进行这种修饰。
通过在固相或液相系统中选择合适的结合测定，本领域技术人员将能够进行抗原-抗体反应的测量。此类测定的实例包括但不限于：酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、表面等离子体共振(SPR)、荧光共振能量转移(FRET)和发光共振能量转移(LRET)。抗原-抗体结合亲和力的测量可通过例如用例如酶、荧光材料、发光材料或放射性同位素标记抗体和/或抗原，并使用适合用于测量所用标记物特有的物理和/或化学性质的方法检测抗原-抗体反应来进行。
根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体应当优选具有相对于其对非磷酸化tau蛋白或tau肽的结合亲和力增强的对磷酸化tau蛋白或tau肽的选择性结合亲和力。在本说明书中抗体对磷酸化tau蛋白或tau肽的选择性结合亲和力的增强意指抗体对磷酸化tau蛋白或tau肽的结合亲和力与其对相应的非磷酸化tau蛋白或tau肽的结合亲和力的比率增加。可以通过例如使用其上固定有磷酸化tau蛋白或tau肽的平板和其上固定有相应的非磷酸化tau蛋白或tau肽的平板，通过例如ELISA测量抗体对这些蛋白质或肽中的每一种的结合亲和力(例如，作为发射波长的吸光度OD值)，并将对于磷酸化tau蛋白或tau肽获得的结合亲和力的值(例如，吸光度OD值)除以对于相应的非磷酸化tau蛋白或tau肽获得的值，来分析此类选择性结合亲和力。用于ELISA的具体条件可以是以下实施例部分中描述的那些条件。
根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体应当优选具有至少约40或更大，特别地至少约50或更大，更特别地至少约60或更大的对磷酸化tau蛋白或tau肽的选择性结合亲和力与对非磷酸化tau蛋白或tau肽的结合亲和力的比率，条件是选择性结合亲和力是根据下面实施例2中描述的方法获得的。在一个实施方案中，通过比较抗pSer413tau抗体对磷酸化肽(诸如SEQ ID NO:8)的结合亲和力与对SEQ ID NO:69的非磷酸化肽的结合亲和力来计算比率。
当施用于血液中时，根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体应当优选表现出改善的进入脑的能力。在本说明书中当施用于血液中时抗体进入脑的能力的改善意味着当将抗体施用至人或任何其它哺乳动物(例如，小鼠或大鼠)的血液中时，脑中的抗体浓度与血浆中的抗体浓度的比率增加。可以例如通过经血液向动物(例如，小鼠或大鼠)施用抗体，并在预定的时期(例如，一周)后收集血液并制备脑匀浆，使用已知方法(例如，使用抗人多克隆抗体的夹心ELISA)测量所获得的血浆样品和所获得的脑匀浆样品中每一种中的抗体浓度，并将脑中的抗体浓度除以血浆中的抗体浓度来分析抗体进入脑的能力。用于ELISA的具体条件可以是以下实施例部分中描述的那些条件。已知进入脑的抗体浓度通常为血浆中抗体浓度的约0.1％至0.3％。
根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体应当优选具有0.30％或更大，特别地0.35％或更大，更0.40％或更大，甚至更特别地0.45％或更大的脑中的抗体浓度与血浆中的抗体浓度的比率，条件是该比例是根据以下实施例的“[7]实施例7：脑内迁移分析”部分中描述的方法获得的。
A.本发明的抗原结合结构域
本发明提供了优先于本文所述的在Ser413处未被磷酸化的tau蛋白而与人pSer413 tau蛋白结合的抗原结合结构域。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:91的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:92的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:93的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:94的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:95的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:96的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:97的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:98的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:99的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:100的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:101的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合结构域，其包含具有SEQ ID NO:102的vlCDR1、具有SEQ ID NO:82的vlCDR2、具有SEQ ID NO:83的vlCDR3、具有SEQ ID NO:86的vhCDR1、具有SEQ ID NO:115的vhCDR2和具有SEQ ID NO:88的vhCDR3。
本发明提供了针对人pSer413 tau蛋白的抗原结合结构域。如实施例中所示，提供了许多人源化可变重和可变轻结构域，其可以以任何组合进行组合，并且可以以任何组合添加至人IgG恒定结构域。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46(SEQ ID NO:84)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合以形成结合pSer413 tau的Fv结构域。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQ ID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46(SEQ ID NO:84)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQ ID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL47(SEQ ID NO:104)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQ ID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL47(SEQ ID NO:104)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQ ID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_G34A(SEQ ID NO:105)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_G34A(SEQ ID NO:105)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_G34S(SEQ ID NO:106)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_G34S(SEQ ID NO:106)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_G34T(SEQ ID NO:107)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_G34T(SEQ ID NO:107)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_N33Q(SEQ ID NO:108)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_N33Q(SEQ ID NO:108)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_N33Q_G34A(SEQ ID NO:109)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQ ID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_N33Q_G34A(SEQ ID NO:109)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQ ID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_N33D(SEQ ID NO:110)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_N33D(SEQ ID NO:110)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_N33S(SEQ ID NO:111)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_N33S(SEQ ID NO:111)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_N33T(SEQ ID NO:112)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_N33T(SEQ ID NO:112)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_S28N(SEQ ID NO:113)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_S28N(SEQ ID NO:113)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_G34A_S28N(SEQ ID NO:114)与可变重结构域Ta1505-VH11(SEQ ID NO:116)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQ ID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
在一个实施方案中，将可变轻结构域Ta1505-VL46_G34A_S28N(SEQ ID NO:114)与可变重结构域Ta1505-VH65(SEQ ID NO:117)组合。在该实施方案中，人重恒定结构域选自SEQ ID NO:118、119、120、121、122、123、124、125和126并且人轻κ恒定结构域为SEQ ID NO:52。
根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体还应当优选地具有拥有特定氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区，具体如下所述。
作为重链可变区，本发明的抗体应当优选包括与选自以下序列的序列具有80％或更高，特别地85％或更高，更特别地90％或更高，甚至更特别地95％或更高，甚至更特别地100％同一性的氨基酸序列：序列VH11(在SEQ ID NO:18中限定)、序列VH12(在SEQ ID NO:20中限定)、序列VH47(在SEQ ID NO:22限定)、序列VH61(在SEQ ID NO:24中限定)、序列VH62(在SEQ ID NO:26中限定)、序列VH64(在SEQ ID NO:28中限定)和序列VH65(在SEQ IDNO:30中限定)。在一个实施方案中，本发明的抗体可包括以下氨基酸序列作为重链可变区：序列VH65的氨基酸序列，或通过选自由以下组成的组的一个或多个取代源自序列VH65的氨基酸序列：Thr对位置28(Kabat编号：H28)处的Ala的取代；Ser对位置30(Kabat编号：H30)处的Asn的取代；Gly对位置49(Kabat编号：H49)处的Val的取代；Asp对位置64(Kabat编号：H61)处的Ala的取代；以及Lys对位置78(Kabat编号：H75)处的Gln的取代。
作为轻链可变区，本发明的抗体应当优选包括与选自以下序列的序列具有80％或更高，特别地85％或更高，更特别地90％或更高，甚至更特别地95％或更高，甚至更特别地100％同一性的氨基酸序列：序列VL15(在SEQ ID NO:32中限定)、序列VL36(在SEQ ID NO:34中限定)、序列VL46(在SEQ ID NO:36中限定)、序列VL47(在SEQ ID NO:38中限定)、序列VL48(在SEQ ID NO:40中限定)以及序列VL50(在SEQ ID NO:42中限定)。在一个实施方案中，本发明的抗体可包括以下氨基酸序列作为轻链可变区：序列VL47的氨基酸序列，或通过选自由以下组成的组的一个或多个取代源自序列VL47的氨基酸序列：Glu对位置17(Kabat编号：L17)处的Asp的取代；Asn对位置28(Kabat编号：L27A)处的Ser的取代；Leu对位置42(Kabat编号：L37)处的Gln的取代；Arg对位置50(Kabat编号：L45)处的Gln的取代；以及Leu对位置51(Kabat编号：L46)处的Arg的取代。
在另一个实施方案中，根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体可包括选自以下的任何组合：
(1)作为重链可变区的序列VH11(SEQ ID NO:116)和作为轻链可变区的序列VL15(SEQ ID NO:32)；
(2)作为重链可变区的序列VH11(SEQ ID NO:116)和作为作为轻链可变区的序列VL36(SEQ ID NO:34)；
(3)作为重链可变区的序列VH11(SEQ ID NO:116)和作为作为轻链可变区的序列VL46(SEQ ID NO:36)；
(4)作为重链可变区的序列VH11(SEQ ID NO:116)和作为作为轻链可变区的序列VL47(SEQ ID NO:38)；
(5)作为重链可变区的序列VH11(SEQ ID NO:116)和作为作为轻链可变区的序列VL48(SEQ ID NO:40)；
(6)作为重链可变区的序列VH11(SEQ ID NO:116)和作为作为轻链可变区的序列VL50(SEQ ID NO:42)；
(7)作为重链可变区的序列VH12(SEQ ID NO:20)和作为作为轻链可变区的序列VL48(SEQ ID NO:40)；
(8)作为重链可变区序列VH47(SEQ ID NO:22)的和作为作为轻链可变区的序列VL48(SEQ ID NO:40)；
(9)作为重链可变区的序列VH61(SEQ ID NO:24)和作为作为轻链可变区的序列VL48(SEQ ID NO:40)；
(10)作为重链可变区的序列VH62(SEQ ID NO:26)和作为作为轻链可变区的序列VL48(SEQ ID NO:40)；
(11)作为重链可变区的序列VH64(SEQ ID NO:28)和作为作为轻链可变区的序列VL47(SEQ ID NO:38)；
(12)作为重链可变区的序列VH64(SEQ ID NO:28)和作为作为轻链可变区的序列VL48(SEQ ID NO:40)；
(13)作为重链可变区的序列VH65(SEQ ID NO:117)和作为作为轻链可变区的序列VL47(SEQ ID NO:37)；
通过从上述那些序列中选择重链和轻链的CDR和/或可变区的氨基酸序列，并在适当时将它们与人抗体的重链和轻链的框架区和/或恒定区的氨基酸序列组合，本领域技术人员将能够设计根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体。人抗体的重链和轻链的框架区和/或恒定区的氨基酸序列可选自例如人IgG、IgA、IgM、IgE和IgD亚型的那些氨基酸序列或其变体。
B.特异性抗pSer413 tau抗体
本发明提供了许多包含一对序列(如下的重链和轻链)的特异性抗体：
mAb-aPT1:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:144
mAb-aPT2:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:145
mAb-aPT3:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:146
mAb-aPT4:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:147
mAb-aPT5:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:148
mAb-aPT6:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:149
mAb-aPT7:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:150
mAb-aPT8:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:151
mAb-aPT9:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:152
mAb-aPT10:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:153
mAb-aPT11:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:154
mAb-aPT12:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:155
mAb-aPT13:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:156
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mAb-aPT15:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:158
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mAb-aPT17:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:160
mAb-aPT18:LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:161
mAb-aPT19:LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:144
mAb-aPT20:LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:145
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mAb-aPT36:LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:161
C.竞争结合的抗体
除了与在位置413处被磷酸化(pSer413)的人tau蛋白结合的抗原结合结构域和含有它们的抗体以外，本发明还提供了与本文所述抗体竞争结合的抗体。
引起与根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体的对pSer413 tau的竞争性结合的人源化抗体也包括在本发明的范围内。本文中使用的术语“竞争性结合”意指当存在两种或更多种单克隆抗体和抗原时，抗体之一与抗原的结合被另外的抗体与抗原的结合抑制。竞争性结合通常可以通过以下方式来测量：例如向恒定量(浓度)的单克隆抗体中添加另一种具有不同的其量(浓度)的单克隆抗体，并确定以恒定量存在的前一种单克隆抗体的结合量减少时后一种单克隆抗体的量(浓度)。其抑制程度可以以IC50或Ki的单位表示。引起与根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体的竞争性结合的人源化抗体意指当以10nM使用根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体测量抗原-抗体结合时，IC50为1μM或更低，特别是100nM或更低，更特别是10nM或更低的抗体。
竞争性结合研究可以如本领域已知的那样进行，通常使用SPR/或结合测定，以及ELISA和基于细胞的测定。
在一些实施方案中，竞争性结合抗体的可变重和可变轻链结构域与本文概述的可变区中的至少一个具有至少85％、90％、95％、98％或99％同一性，并且在恒定结构域中与图13中概述的人IgG序列具有至少99％或100％同一性。
D.氨基酸取代
除了本文概述的序列以外，本发明还提供了与亲本起始序列相比可具有一个或多个氨基酸取代的抗原结合结构域和包含它们的抗体。
因此，例如，对于本文列出的所有可变重和轻结构域，可以制备其它变体。如本文中所概述，在一些实施方案中，6个CDR的组可具有0个、1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(具有特定用途的氨基酸取代)。在这些实施方案中，通常单个CDR具有不超过1个或2个氨基酸取代，并且突变的序列保持与pSer413 tau蛋白的结合。然而，当对本文概述的序列的CDR产生氨基酸变体时，所得CDR不针对PCT/JP13/65090中概述的以及SEQ ID NO:81、82和83(可变轻CDR)和SEQ ID NO:86、87和88(可变重CDR)中显示的鼠CDR。
在一些情况下，可对可变重和/或轻链结构域的框架区域进行改变。在该实施方案中，框架区(例如不包括CDR)中的优选变体与人种系序列保持至少约80％、85％、90％或95％同一性。因此，例如，可将如本文所述的相同CDR与来自人种系序列的不同框架序列组合，只要框架区与人种系序列保持至少80％、85％、90％或95％同一性。
在一些实施方案中，对于本文概述的人源化轻链，最接近的人轻链种系是IGKV2-30，其与本文中的序列具有81％同一性。因此，可在轻框架区中制备另外的变体，只要与IGKV2-30的同一性为至少80％、85％、90％或95％即可。
对于本文中的人源化重链，最接近的重链人种系是IGHV3-73，其与本文中的序列具有85％同一性。因此，可在轻框架区中制备另外的变体，只要与IGHV3-73的同一性为至少80％、85％、90％或95％即可。
或者，CDR可以具有氨基酸修饰(例如，来自在CDR组中的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(即，CDR可以被修饰，只要6个CDR的组中的变化的总数少于6个氨基酸修饰即可，其中CDR的任何组合被改变；例如，vlCDR1可存在一个变化，vhCDR2中存在两个变化，vhCDR3中没有变化等))，以及具有框架区变化，只要框架区与人种系序列保持至少80％、85％或90％同一性即可，并且所得的CDR不针对PCT/JP13/65090中概述的以及SEQ ID NO:81、82和83(可变轻CDR)和SEQ ID NO:86、87和88(可变重CDR)中显示的鼠CDR。
通常，用于抗pSer413 tau抗体之间的比较的同一性百分比为至少75％、至少80％、至少90％，其中至少约95％、96％、97％、98％或99％同一性是优选的。同一性百分比可以沿着整个氨基酸序列，例如整个重链或轻链或沿着链的一部分。例如，包括在本发明的抗pSer413 tau抗体的定义中的是沿整个可变区(例如，其中沿可变区的同一性为95％或98％相同)或沿整个恒定区共享同一性的那些抗体。
X.本发明的核酸
还提供了编码本发明的抗pSer413 tau抗体的核酸组合物，以及含有所述核酸的表达载体和/或用所述核酸和/或表达载体组合物转化的宿主细胞。如本领域技术人员所理解的，由于遗传密码的简并性，本文描述的蛋白质序列可由许多可能的核酸序列编码。
因此，本发明还提供了编码抗原结合结构域和包含它们的抗体的的核酸组合物。如本领域技术人员所理解的，在抗原结合结构域的情况下，核酸组合物通常包括编码可变重结构域的第一核酸和编码可变轻结构域的第二核酸。在scFv的情况下，可以制备编码由蛋白质性质的接头分开的可变重结构域和可变轻结构域的单个核酸。在常规抗体的情况下，核酸组合物通常包括编码重链的第一核酸和编码轻链的第二核酸，其在细胞中表达后将自发地组装成两条重链和两条轻链的“常规”四聚体形式。
如本领域所知，可将编码本发明组分的核酸整合到如本领域已知的表达载体中，并且取决于宿主细胞，用于产生本发明的异二聚抗体。如本领域技术人员所理解的，可将这两种核酸整合到单一表达载体中或两种不同的表达载体中。通常，可将核酸与许多调控元件(启动子、复制起始点、选择标记、核糖体结合位点、诱导物等)可操作地连接。表达载体可以是染色体外载体或整合载体。
然后将本发明的核酸和/或表达载体转化到本领域公知的许多不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)用于许多实施方案中。
如本领域所公知的，通过培养包含一种或多种表达载体的宿主细胞来制备本发明的抗体。一旦产生，就进行常规抗体纯化步骤。
XI.生物和生化测定
可以以几种方式测定本发明的抗pSer413 tau抗体的功效。作为初步事项，可以使用本领域已知的技术诸如ELISA技术(参见例如实施例2(1))、Octet、Biacore或FACS，测试抗体与在位置S413处被磷酸化的人tau蛋白或肽的结合，其中将与磷酸化肽(例如SEQ IDNO:8)的结合和与如本文概述的非磷酸化肽(例如SEQ ID NO:69)的结合进行比较。
在一些实施方案中，通过Biacore测定测量本文公开的抗体的结合功效。在某些实施方案中，KD值用磷酸化Tau蛋白来测量。在一些实施方案中，KD值用磷酸化Tau肽来测量。在一个实施方案中，磷酸化Tau肽仅在一个残基处被磷酸化(例如，SEQ ID NO:75)。在另一个实施方案中，磷酸化肽在多个残基处被磷酸化(例如，SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:78)。在一些实施方案中，KD值用固定的抗原(例如，磷酸化Tau蛋白或磷酸化Tau肽)来测量，在该情况下，亲和力测量包括亲合力组分，即，以二价结合模式。在一些实施方案中，KD值用固定的抗体(例如，小鼠亲本抗体、嵌合抗体或人源化抗体变体)来测量，在该情况下，亲和力测量不包括亲合力组分，即，以单价结合模式。在其它实施方案中，KD值用固定的抗体和用磷酸化Tau蛋白作为分析物来测量。在其它实施方案中，KD值用固定的抗体和用磷酸化肽作为分析物来测量。在某些实施方案中，以二价结合模式测量KD值。在其它实施方案中，以单价结合模式测量KD值。
另外，还可以测定人AD脑匀浆中本发明的抗pSer413 tau抗体的结合亲和力，以及在AD来源的au接种的中和研究中于HEC293 Tau P301L聚集测定中和/或在微流体室中使用人iPSC神经元的AD来源的tau接种和扩散模型中测定所述抗pSer413 tau抗体。
另外，本发明的抗pSer413 tau抗体也可用于AD患者脑样品的免疫组织化学测定
另外，可在包括阿尔茨海默病(AD)的认知障碍的动物模型中测定本发明的抗pSer413 tau抗体的功效。用于研究本发明的认知障碍的治疗剂或预防剂的动物包括认知障碍的动物模型，特别是tau蛋白病的动物模型。用于tau蛋白病的动物模型是在脑中表达正常型或突变型tau的动物，特别是表现出认知功能受损的动物模型。在脑中表达正常型或突变型tau的此类动物可以通过基因工程来制备，典型的例子是转基因小鼠(Tg小鼠)。表达突变型tau的动物模型诸如Tg小鼠可用作遗传性家族性tau蛋白病的模型，但为了检查治疗剂或预防剂对构成人中大多数病例的散发性tau蛋白病的作用，优选地，在表达正常型tau的Tg小鼠中表现作用。最适合作为表达正常型tau的Tg小鼠的是在本发明的制备实施例中制备的小鼠，但也可以使用Kambe等(Neurobiology of Disease，第42卷，第404-414页，2011)和Kimura等(The EMBO J.第26卷，第5143-5152页，2007)报道的Tg小鼠，所述两篇文献均通过引用整体并入本文并且特别用于转基因小鼠的产生和使用。然而，虽然在Kambe等和Kimura等的小鼠中观察到认知功能损伤，但其分别在14月龄和20月龄后出现，因此发病很快就会衰老，并且衰老效应也可以是促成因素，而长期繁育的影响和工作也是问题。
在动物模型中检查根据本发明的认知障碍的治疗剂或预防剂的作用的优选方法是测试认知功能的方法，诸如记忆学习测试。这种方法可以是Morris水迷宫测试、逐步学习测试(step-through learning test)或新物体识别测试，但优选地是行为测量测试的组合，诸如旷场测试，以便考虑到行为量和动物焦虑的状况。
作为用于检查根据本发明的认知障碍的治疗剂或预防剂的作用的方法，可能在向认知障碍的动物模型施用期间使用检查脑组织中tau蛋白或磷酸化tau水平的方法。在AD和其它神经退行性疾病中，tau蛋白的表达水平或增加的异常磷酸化tau与病理学相关(Khalid Iqbal等，Curr.Alzheimer Res.，第7卷，第654-664页，2010)。众所周知，在一些病理模型动物中降低tau表达和异常的磷酸化tau水平导致认知功能和运动功能的改善(K.Santa Cruz等，Science,30，第9卷，第476-481页，2005；Sylvie Le Corre等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，第103卷，第9673-9678页，2006)。作为检测tau蛋白或磷酸化tau的变化的方法，如实施例中所述，这可通过诸如使用脑组织匀浆的蛋白质印迹的方法来实现，但本领域技术人员可以选择另一种合适的方法，诸如ELISA(Xiyun Chai等，J.Biol.Chem.，第286卷，第34457-34467页，2011)或免疫组织化学法(David J.Irwin等，BRAIN，第135卷，第807-818页，2012)。
XII.制剂
通过将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备根据本发明使用的抗体的制剂以用于储存(如Remington's PharmaceuticalSciences第16版，Osol,A.编辑[1980]中通常概述的那样)，所述抗体制剂呈冻干制剂或水溶液的形式。
可将根据本发明的认知障碍的治疗剂或预防剂以药物组合物的形式配制，除了根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体以外，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或其它赋形剂。使用药学上可接受的载体和/或其它赋形剂的配制可以使用例如University of the Sciences in Philadelphia,“Remington:The Science andPractice of Pharmacy，第20版”,Lippincott Williams&Wilkins,2000中描述的方法来进行。这种治疗剂或预防剂可以作为液体制剂提供，或者作为其冻干制剂提，所述液体制剂通过将成分溶解、悬浮或乳化至无菌水性介质或油性介质中来制备。用于制备这种制剂的介质或溶剂可以是水性介质，其实例包括注射用蒸馏水和生理盐水溶液，其可任选地与添加渗透压调节剂(例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇和氯化钠)一起使用，和/或与合适的溶解助剂诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇或聚乙二醇)或非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80或聚氧乙烯氢化蓖麻油50)组合使用。这种制剂还可用油性介质或溶剂制备，所述油性介质或溶剂的实例包括芝麻油和大豆油，其可任选地与溶解助剂诸如苯甲酸苄酯和苯甲醇组合使用。此类液体药物通常可以使用适当的添加剂来制备，所述添加剂为诸如缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂和醋酸盐缓冲剂)、舒缓剂(例如，苯扎氯铵和盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如，人血清白蛋白和聚乙二醇)、防腐剂(例如，抗坏血酸、异抗坏血酸及其盐)、着色剂(例如，叶绿素铜β-胡萝卜素、Red#2和Blue#1)、杀菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、苯酚、氯化苄乙氧铵和苯扎氯铵)、增稠剂(例如，羟基丙基纤维素、羧甲基纤维素及其盐)、稳定剂(例如，人血清白蛋白甘露醇和山梨糖醇)和气味矫正剂(例如，薄荷醇和柑橘香气)。不同形式的治疗剂或预防剂包括固体制剂，诸如粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、栓剂和锭剂。对于以口服形式施用的固体制剂，可以使用添加剂，诸如赋形剂(例如，结晶纤维素、乳糖和淀粉)、润滑剂(例如，硬脂酸镁和滑石)、粘合剂(羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙二醇(macrogol))和崩解剂(例如，淀粉和羧甲基纤维素钙)。如果需要，可以使用添加剂诸如杀菌剂(例如，苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、抗氧化剂、着色剂、甜味剂等。其它替代形式包括用于施加到粘膜上的治疗剂或预防剂，这种制剂通常含有添加剂，诸如压敏粘合剂、压敏增强剂、粘度调节剂、增稠剂等(例如，粘蛋白、琼脂、明胶、果胶、角叉菜胶、海藻酸钠、刺槐豆胶、黄原胶、黄蓍胶、阿拉伯树胶、壳聚糖、支链淀粉、蜡质淀粉、硫糖铝、纤维素及其衍生物(诸如羟基丙基甲基纤维素)、聚甘油脂肪酸酯、丙烯酸-烷基(甲基)丙烯酸酯共聚物，或其盐和聚甘油脂肪酸酯)，主要是为了赋予粘膜吸附或保留性质。然而，用于待向身体施用的治疗剂或预防剂的形式、溶剂和添加剂不限于这些，并且本领域技术人员可以进行适当的选择。
除了根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体以外，根据本发明的认知障碍的治疗或预防剂还可含有具有治疗或预防认知障碍的作用的其它已知药物，特别是具有抑制认知障碍进展的作用的药物。或者，可将含有根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体的根据本发明的认知障碍的治疗剂或预防剂与含有具有治疗或预防认知障碍的作用的已知药物(特别是具有抑制认知障碍进展的作用的药物)的另一种治疗或预防剂组合，以试剂盒的形式制备。具有抑制认知障碍进展的作用的成分包括但不限于多奈哌齐，加兰他敏，美金刚和利斯的明。具有抑制认知障碍进展的作用的成分的剂量和含有具有抑制认知障碍进展的作用的成分的治疗剂或预防剂的剂量可以在用于正常疗法的剂量范围内，但可以根据状况增加或减少。
尽管本发明人在WO2013/180238A(专利文献4)中指示了实验结果(其证明即使在通过腹膜内施用在外周施用时，抗体通过血脑屏障作用于脑显示药效)，但也可能制备高效地将根据本发明的人源化抗磷酸化tau抗体(其包含在根据本发明的认知障碍的治疗剂或预防剂中)提供给脑组织的制剂。根据本发明的认知障碍的治疗剂或预防剂也涵盖了此类制剂。已知用于通过血脑屏障向脑组织高效提供抗体或肽的方法，诸如添加靶向物质的方法或在脂质体或纳米颗粒中包封的方法。用于靶向的物质包括通过与具有与特定受体或转运蛋白结合的性质的抗体或肽、蛋白质或其它化合物结合而经历电荷特征的全部或部分变化的那些物质。具有与特定受体或膜蛋白结合的性质的肽、蛋白质或其它化合物的实例包括与受体配体或膜蛋白结合的配体及其类似物，以及与受体配体或膜蛋白及结合的抗体、激动化合物/拮抗化合物/变构调节剂其类似化合物。作为具有与特定受体或转运蛋白结合的性质的肽、蛋白质或其它化合物的靶标的受体配体或膜蛋白的实例包括转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体(IR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)、LDL受体相关蛋白(LRP)和白喉毒素受体(HB-EGF)，其中对于这些受体配体或膜蛋白没有特别限制(Angela R.Jones等，Pharm.Res.,2007，第24卷，第9期，第1759-1771页)。可将用于靶向的物质化学地添加到抗体中以用于根据本发明的认知障碍的治疗剂或预防剂，该方法是可由本领域技术人员参考已知方法(诸如在例如Hermanson等，Bioconjugate techniques,USA,Academic Press,1996中描述的)适当地进行的方法。还可将用于靶向的物质与包封抗体或肽的脂质体或纳米颗粒结合(Sonu Bhaskar等，Particle and Fibre Toxicology,2010,7:3)。另外，当用于靶向的物质是肽或蛋白质时，其可由本领域技术人员使用基因工程技术，通过用肽化学合成产生融合肽，或者通过将包含编码肽或蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸与包含编码待使用的抗体或肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸组合以适当的融合蛋白的形式产生。
出于改善症状的目的，可向有需要的患者口服或肠胃外施用根据本发明的治疗剂或预防剂。对于口服施用，可选择剂型诸如颗粒、粉剂、片剂、胶囊剂、液体药物、糖浆剂、乳剂、混悬剂或酏剂。对于肠胃外施用，可制备经鼻剂，并且可以选择液体药物、混悬液或固体制剂。可将注射剂制备成肠胃外施用的不同形式，将注射选择为皮下注射、静脉内注射、输注、肌内注射、脑室内注射或腹膜内注射。用于肠胃外施用的其它制剂包括栓剂、舌下剂、经皮剂和除经鼻剂外的经粘膜施用剂。另外，通过在支架或血管内闭孔器上添加或涂覆的方式，可以进行血管内局部施用。
根据本发明的治疗剂或预防剂的剂量将根据患者的年龄、性别、体重和症状、治疗效果、施用方法、治疗时间或药物组合物中的活性成分的类型而不同，但对于成人，每次施用通常可在0.1mg至1g的范围内施用其，优选在0.5mg至200mg活性化合物的范围内施用其。然而，由于剂量将根据各种条件而变化，因此比上述剂量更低的剂量可能是足够的，或者可能需要超出这些范围的剂量。根据本发明的治疗或预防剂可在短的施用期内发挥作用。
XIII.抗体的施用
一旦制成，本发明的抗体可用于治疗认知障碍，诸如tau蛋白病。如本文中所讨论的，已在多种神经病理学病况中证明了tau蛋白的细胞内积累。由tau的这种细胞内积累引起的疾病统称为“tau蛋白病”(参见Arai，同上，在此通过引用整体并入并用于本文中概述的病症)。tau蛋白病包括神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病(AD)、皮质基底节变性(CBD)或皮质基底节综合征(CBS)、进行性核上性麻痹、皮克氏病、嗜银粒痴呆(嗜银粒病)、伴有痴呆的多系统tau蛋白病(multiple system tauopathy with dementia)(MSTD)、与17号染色体相关的额颞痴呆及帕金森病(FTDP-17)、神经原纤维缠结性痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结(DNTC)、伴有球状神经胶质包涵体的白质tau蛋白病(WMT-GGI)、伴有tau阳性包涵体的额颞叶变性(FTLD-tau)。Tau蛋白病还包括非神经退行性疾病，包括：传染性疾病，如Economo的脑炎后遗症和亚急性硬化性全脑炎；和创伤引起的疾病，如拳击手的脑病。
认知障碍被定义为一种智力障碍，其涉及曾经发育或获得的智力功能下降的状态(由Kunitoshi Kamijima和Shin-ichi Niwa编辑的“New Psychiatr(Nankodo’s EssentialWell-Advanced Series)”(日语书))，Nankodo Co.，Ltd.，2008，pp.69-70)，但在广义上被认为是表现出智力障碍和/或记忆损伤的疾病。在神经退行性疾病诸如AD的诊断中，该病症是否是“神经退行的”是通过例如在死亡后通过组织学分析对是否存在神经原纤维缠结(NFT)进行分析来确定的，而医生通过各种方式来诊断认知障碍，尤其是神经退行性疾病，这些方式例如：通过询问调查(诸如长谷川痴呆量表修订版(HDS-R)和简易精神状态检查(MMSE))进行的神经心理学检查；通过观察诸如临床痴呆评定(CDR)或功能评估分期(FAST)进行的神经心理学检查；基于例如脑脊液中tau和磷酸化tau水平的升高或Aβ水平的升高的生化检查；以及基于通过例如头部CT、头部MRI、SPECT或PET获得的信息的图像检查。向医生已将其诊断为患有认知障碍的患者施用根据本发明的认知障碍的治疗剂或预防剂，并且基于神经退行性疾病的诊断指标中的至少一个，所述治疗剂或预防剂具有改善(与施用前的状态相比)患者的病况，通过施用控制病况的进展，将病况维持在施用前的状态，或使病况恢复至施用前的状态的作用。
根据本发明的认知障碍的治疗剂或预防剂在人或非人动物中还可具有改善认知功能或抑制认知功能下降或维持认知功能的作用。此类非人动物的实例应当优选为表达与人tau具有高度同源性的tau的那些动物，并且包括但不限于：黑猩猩、猕猴、马、猪、狗、小鼠、兔、大鼠和猫。
XIV.实施例
A.实施例1:抗体的产生
1.小鼠抗体(亲本抗体)
将小鼠抗体Ta1505用作嵌合抗体和人源化抗体的亲本抗体。小鼠抗体Ta1505的细节描述于国际公开第WO2013/180238A号的实施例中。小鼠抗体Ta1505的轻链(L链)的氨基酸序列在SEQ ID NO:44中限定，并且编码其的核苷酸序列在SEQ ID NO:45中限定。小鼠抗体Ta1505的重链(H链)的氨基酸序列在SEQ ID NO:46中限定，并且编码其的核苷酸序列在SEQ ID NO:47中限定。
2.嵌合抗体
嵌合抗体是通过将小鼠抗体Ta1505的轻链(L链)和重链(H链)的可变区分别与人免疫球蛋白(Ig)G1(κ)的L链和H链的恒定区组合而产生的。嵌合抗体的轻链(L链)的氨基酸序列在SEQ ID NO:48中限定，并且编码其的核苷酸序列在定SEQ ID NO:49中限定。嵌合抗体的重链(H链)的氨基酸序列在SEQ ID NO:50中限定，并且编码其的核苷酸序列在SEQ IDNO:51中限定。在整个说明书中，这种嵌合抗体被称为“该嵌合抗体”或“嵌合抗体Ta1505”。
3.人源化抗体
a.VL和VH的设计
从人种系中选择具有高度同源性的一级序列，并通过互补决定区(CDR)移植(以设计多种人源化抗体)来进行人源化。
详细地，从数据库中选择具有高度同源性的人框架；将小鼠抗体Ta1505的CDR区插入到每个框架中；以及进行氨基酸取代以例如在保持活性的同时降低免疫原性。由此设计了各种轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列。VL的氨基酸序列的SEQ ID编号和编码它们的基因的核苷酸序列的SEQ ID编号示于表2A中，并且VH的氨基酸序列和编码它们的基因的核苷酸序列的SEQ ID编号示于表2B中。VL和VH的氨基酸序列的比对分别示于图2A和图2B中。
表2A：轻链可变区(VL)
代码名称 氨基酸序列 核苷酸序列
VL15 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33
VL36 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35
VL46 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:37
VL47 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:39
VL48 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:41
VL50 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43
表2B：重链可变区(VH)
b.基于免疫原性评分选择VL和VH的组合
任意组合通过上述方法设计的VL和VH，并通过体外测定软件Epibase(Lonza)计算每种组合的免疫原性评分(DRB1评分)。待用于后续实验的VL和VH的组合选自显示具有等于或低于预定值(DRB1评分：1500)的免疫原性评分的低免疫原性的组合。所选择的VL和VH组合示于表3A中，并且这些组合的免疫原性评分(DRB1评分)示于表3B中。
表3A：VL和VH的选定组合
表3B：免疫原性评分(DRB1评分)
c.人源化抗体的表达培养和纯化
对于通过上述方法选择的VL和VH的每种组合，制备编码VL和VH的氨基酸序列的基因。将VL基因与人免疫球蛋白κL链恒定区(CL)基因(其氨基酸序列及核苷酸序列分别在SEQID NO:52和SEQ ID NO:53中限定)框内融合，并将VH基因与人免疫球蛋白γ-1H-链恒定区(CH)基因(其氨基酸序列及核苷酸序列分别在SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55中限定)框内融合，使得在每个结合位点处不应发生突变或缺陷。将VL基因和VH基因的5’末端分别与源自人免疫球蛋白κL链基因的信号序列(其氨基酸序列及核苷酸序列分别在SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中限定)和源自人免疫球蛋白γ-1H-链基因的信号序列(其氨基酸序列及核苷酸序列分别在SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中限定)框内融合，使得在每个结合位点处不应发生突变或缺陷。
将通过上述方法设计的分别编码融合了信号序列的L和H链的核酸构建体各自掺入用于动物细胞表达的表达载体中，然后按照标准方案使用ExpiCHO(由Thermo FisherScientific Kk制造)进行培养以表达抗体。通过离心澄清每种培养物，并将所得培养上清液应用于蛋白A亲和柱以纯化人源化抗体。将用pH为2.8至3.5的酸性溶液洗脱的级分快速中和、浓缩，并应用于凝胶过滤柱以除去聚集体。将缓冲液更换为磷酸盐缓冲盐水(PBS)以收集主要级分，将其用溶剂稀释至合适的浓度，然后用于以下测试。
在以下描述中，可使用其VL和VH的代码名称的组合来缩定通过上述程序产生的每种人源化抗体。例如，使用L15作为VL以及H11作为VH产生的人源化抗体称为L15H11。
在以下测试中，在没有另外说明的情况下，将3％BSA/PBS用作用于调节抗体浓度的溶剂。
B.实施例2：抗原肽结合亲和力的ELISA分析
1.对抗原肽的结合亲和力的ELISA分析
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析具有表3A中所示的VL和VH的组合的一些人源化抗体对抗原肽的结合亲和力。
将未磷酸化tau肽PD17(Ser413)和磷酸化tau肽PD17P(pSer413)(其中Ser413被磷酸化)各自用冷却的PBS稀释至1μg/mL，并将所得溶液各自以50μL/孔分配至平板，并在4℃下放置过夜。除去溶液，然后以270μL/孔分配封闭缓冲液(3％牛血清白蛋白(BSA)-PBS)，并将平板在4℃下放置过夜。除去溶液后，以逐步方式用3％BSA-PBS稀释抗体溶液，然后以50μL/孔将其加入到平板中，使其在室温下反应90分钟。非磷酸化tau肽PD17(Ser413)和磷酸化tau肽PD17P(pSer413)的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:8中限定。
用含有0.05％Tween 20的含Tween 20的Tris缓冲盐水(TBS-T)洗涤各孔。将用稀释缓冲液(3％BSA-PBS)稀释2000倍的山羊抗人IgG-碱性磷酸酶标记物(由Sigma-AldrichCo.LLC.制造)以50μL/孔加入到平板中，使反应在室温下进行60分钟。在用TBS-T洗涤后，将显色溶液(1mg/mL对硝基苯基磷酸盐(pNPP)溶液)以100μL/孔加入到平板中以进行显色40分钟。在405nm的波长下测量吸光度(光密度(OD)值)。
通过测定每种抗体的OD值与0.25nM嵌合抗体的OD值的比率，并且按照以下三点量表(three-point scale)评定所得比率来评价反应性：
+：足够的反应性(0.6≤OD比率)，
±：非常轻微的反应性(0.15<OD比率<0.6)，和
-：无反应性(OD比率≤0.15)。
表4A显示了抗体与磷酸化tau肽PD17P的反应性的评估结果。表4B显示了抗体与非磷酸化tau肽PD17的反应性的评估结果。与嵌合抗体相比，所有人源化抗体表现出较高的与磷酸化tau肽PD17P的反应性，但表现出较低的与非磷酸化tau肽PD17的反应性。这些结果表明人源化抗体与磷酸化tau肽具有选择性反应性。
表4A：与磷酸化肽PD17的反应性的ELISA分析
表4B：与非磷酸化肽PD17的反应性的ELISA分析
2.对磷酸化tau肽的选择性结合亲和力的ELISA分析
使用嵌合抗体Ta1505作为参照抗体，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析具有表3A中显示的VL和VH的组合的一些人源化抗体的抗tau人源化抗体对磷酸化tau肽的选择性结合亲和力。
将含有1μg/mL的非磷酸化肽PD17或磷酸化肽PD17P的溶液以50μL/孔分配到平板中，并在4℃下静置过夜。除去溶液后，以270μL/孔分配封闭缓冲液(3％牛血清白蛋白(BSA)-PBS)，使平板在4℃下静置过夜，从而产生其中非磷酸化肽PD17或磷酸化肽PD17P被固定在每个孔上的平板。
从0.6μg/mL(4nM)的初始浓度开始，通过4倍连续稀释制备一系列五种浓度的每种抗体。将每种溶液以50μL/孔加入到平板的孔中，使反应在室温下进行1小时。在洗涤过程后，将山羊抗人IgG-碱性磷酸酶标记物(由Sigma-Aldrich Co.LLC.制造)稀释2000倍，然后将其以50μL/孔加入每个孔中，使反应再进行1小时。
洗涤过程后，将1mg/mL对硝基苯基磷酸盐(pNPP)溶液以100μL/孔加入到每个孔，使反应进行20分钟。在405nm的波长下测量吸光度(OD)。
用SoftMax Pro软件6.5版(Molecular Devices Corporation)分析每种制备的抗体在各自浓度下的吸光度OD的数据，以测定下列数值A至D，所述数值被赋予下面显示的四参数逻辑回归曲线：
其中
x表示抗体浓度，以及
y表示吸光度(OD值)。
将浓度为1nM的非磷酸化肽PD17的吸光度OD值输入表达式，以计算对应于OD值的每种抗体的浓度x。由于PD17的浓度为1nM，每种肽的基于对PD17的结合亲和力的对磷酸化tau肽PD17P的结合亲和力的比例因子通过1/x来计算，并将其用作对磷酸化tau肽的选择性结合亲和力的指标。
结果示于图3的图中。嵌合抗体Ta1505与磷酸化tau肽PD17P的结合亲和力的强度是其与非磷酸化肽PD17的结合亲和力的强度的30倍。相反，人源化抗体中的选择性结合亲和力表现出高选择性，其中比例因子为40至210倍。结果表明人源化抗体对磷酸化肽具有特异性结合亲和力。
3.使用磷酸化tau肽对针对Ser413磷酸化位点的选择性结合亲和力的ELISA分析
使用多种磷酸化肽，通过ELISA分析具有表3A中显示的VL和VH的组合的各种人源化抗体的与蛋白质的主要磷酸化位点中的Ser413磷酸化位点的选择性结合的能力。
如表5所示，使用12种磷酸化肽。名为“表位”的列指示4R2N型tau蛋白的一个或多个磷酸化位点(例如，第1号肽中的“pS46”表示Ser46的位点是磷酸化表位，并且多个表位的描述表明一个肽具有两个或三个磷酸化位点)，除第12号肽具有包含Ser413位点但未磷酸化的表位(PD17)外。
表5：用于分析与tau蛋白Ser413磷酸化位点的特异性结合的肽
表5中显示的12种肽，即肽编号1至12，或这些肽与牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)的缀合物各自用冷却至4℃的PBS稀释至1μg/mL，并将所得溶液以50μL/孔分配至平板中，并在4℃下放置过夜。除去溶液，然后以270μL/孔分配封闭缓冲液(3％BSA-PBS)，并将平板在4℃下放置过夜。除去溶液后，用3％BSA-PBS稀释纯化的抗体至150ng/mL，然后以50μL/孔将其加入到平板中，使反应在室温下进行90分钟。用含有0.05％Tween 20的Tris缓冲盐水(TBS-T)洗涤各孔。将用稀释缓冲液(3％BSA-PBS)稀释2000倍的山羊抗人IgG(H+L)-碱性磷酸酶标记物(由Sigma-Aldrich Co.LLC.)以50μL/孔加入到平板中，使反应在室温下进行60分钟。在用TBS-T洗涤后，将显色溶液(1mg/mL pNPP溶液)以100μL/孔加入到平板中以进行显色40分钟。在405nm的测量波长和550nm的参照波长下测量吸光度(OD值)。
按照以下列三点量表评价反应性：
+：足够的反应性(1.0≤OD值)，
±：非常轻微的反应性(0.5≤OD值<1.0)，和
-：无反应性(OD值≤0.5)。
结果示于表6中。所有人源化抗体仅对第9号肽(pSer412/pSer413:PRHLSNV(pS)(pS)TGSIDMVD)、第10号肽(pSer413:PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD)和第11号肽(pSer409/pSer412/pSer413:PRHL(pS)NV(pS)(pS)TGSIDMVD)显示出强结合亲和力，但不与其对应于tau蛋白的Ser413的位点未被磷酸化的另外的肽结合。结合的模式和强度与嵌合体(嵌合抗体Ta1505)的结合的模式和强度基本相同。这些结果表明人源化抗体具有对具有磷酸化Ser413位点的tau蛋白特异性的结合亲和力。
表6：与各种磷酸化tau肽的反应性的ELISA分析结果
C.实施例3：对抗原蛋白的结合亲和力的ELISA分析
通过ELISA分析具有表3A中所示的VL和VH的组合的一些人源化抗体对抗原蛋白的结合亲和力。
为了制备磷酸化tau蛋白pTau，使用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达tau蛋白4R2N。另外，为了制备过度磷酸化的tau蛋白hpTau，产生了能够同时表达tau蛋白和GSK3β的重组杆状病毒。
在重组杆状病毒的产生中，使用pFastBac1和pFastBac Dual载体。对于磷酸化tau蛋白pTau，将编码具有His标记的C末端的tau蛋白4R2N的cDNA插入pFastBac1中。对于过度磷酸化的tau蛋白hpTau，将编码具有His标记的C末端的tau蛋白4R2N的cDNA和编码GSK3β的cDNA插入pFastBac Dual中。His标记的tau蛋白4R2N的氨基酸序列和核苷酸序列分别在SEQID NO:70和71中限定。GSK3β的氨基酸序列和核苷酸序列分别在SEQ ID NO:72和73中限定。
通过脂转染将所得载体各自引入细胞系Sf9，培养所述细胞以制备重组杆状病毒。然后将所得的重组杆状病毒用于感染细胞系Sf9或Tn5，从而表达磷酸化tau蛋白(pTau)和过度磷酸化的tau蛋白(hpTau)。
收集表达所需蛋白质的细胞，并进行超声处理和离心以获得细胞裂解物，然后将其应用于Ni-NTA柱以纯化tau蛋白。使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准样品，通过二辛可宁酸(BCA)测定法测定纯化的tau蛋白的浓度。
将所得的过度磷酸化的tau蛋白(hpTau)和磷酸化tau蛋白(pTau)用冷却的PBS稀释至1μg/mL，并将稀释的溶液以50μL/孔分配至平板，并在4℃下放置过夜。除去溶液后，然后以270μL/孔分配封闭缓冲液(3％BSA-PBS)，并将平板在4℃下放置过夜。除去溶液后，将通过利用3％BSA-PBS的连续稀释制备的一系列抗体溶液以50μL/孔加入到平板中，使其在室温下反应90分钟。
用含有0.05％Tween 20的Tris缓冲盐水(TBS-T)洗涤孔。将用稀释缓冲液(3％BSA-PBS)稀释2000倍的山羊抗人IgG-碱性磷酸酶标记物(由Sigma-Aldrich Co.LLC.)以50μL/孔加入到平板中，使反应在室温下进行60分钟。在用TBS-T洗涤后，将显色溶液(1mg/mLpNPP溶液)以100μL/孔加入到平板中以进行显色40分钟。在405nm的波长下测量吸光度(OD值)。
通过测定每种抗体的OD值与0.25nM嵌合抗体的OD值的比率，并且按照以下三点量表(three-point scale)评定所得比率来评价反应性：
+：足够的反应性(0.6≤OD比率)，
±：非常轻微的反应性(0.15<OD比率<0.6)，和
-：无反应性(OD比率≤0.15)。
表7A显示了人源化抗体与过度磷酸化的tau蛋白hpTau的反应性评估结果。表7B显示了人源化抗体与磷酸化tau蛋白pTau的反应性评估结果。结果表明，与嵌合抗体相比，所有人源化抗体与过度磷酸化的tau蛋白hpTau和磷酸化tau蛋白pTau均具有高反应性。
表7A：与过度磷酸化的tau蛋白hpTau的反应性的ELISA分析结果
表7B：与磷酸化tau蛋白pTau的反应性的ELISA分析结果
D.实施例4：通过SPR分析结合亲和力
使用嵌合抗体Ta1505作为参照抗体，通过表面等离振子共振(SPR)对具有表3A中所示的VL和VH的组合的一些人源化抗体进行结合亲和力分析。
将过度磷酸化的tau蛋白4R2N(hpTau：参见实施例3)用作抗原蛋白，并且将由大肠杆菌(Escherichia coli)产生的非磷酸化tau蛋白(Tau：His标记的非磷酸化tau蛋白4R0N：ATGen Co.Ltd.,目录号：ATGP0795)用作阴性对照。使用的抗原肽是单磷酸化tau肽(1×P)(其中仅Ser413被磷酸化)和三磷酸化tau肽(3×P)(其中除了Ser413以外，Ser409和Ser412被进一步磷酸化)。这些肽的氨基酸序列示于表8中。使用的阴性对照肽是非磷酸化tau肽(Non P)，其氨基酸序列也示于表8中。His标记的非磷酸化tau蛋白4R0N的氨基酸序列在SEQID NO:74中限定。单磷酸化tau肽1×P、三磷酸化tau肽3×P和非磷酸化tau肽Non P的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:75、76和77中限定。
表8：SPR中使用的抗原肽
按照系统中附带的评估说明书手册，用SPR系统Biacore T200(GE HealthcareJapan)测量过度磷酸化的tau蛋白4R2N(hpTau)、非磷酸化tau蛋白4R0N、单磷酸化tau肽1xP、三磷酸化tau肽3xP和非磷酸化tau肽Non P与每种抗体的结合亲和力。
通过如下方法测量结合亲和力，所述方法包括：制备NTA传感器芯片(包括已经固定有次氮基三乙酸(NTA)的羧甲基葡聚糖层：代码BR-1005-32)；使用胺偶联试剂盒(GEHealthcare Japan，代码BR-1006-33)通过胺偶联反应将每种上述与His-标签融合的肽和每种表8中所示的抗原肽通过共价键固定在传感器芯片上；并测量抗体与固定的蛋白质和肽的结合动力学。
使用HBS-N缓冲液(代码BR-1003-69)作为固定反应溶液并使氯化镍溶液与NTA传感器芯片反应(以将Ni与NTA键合)来将His标记的hpTau或Tau蛋白各自固定在传感器芯片上。随后，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐：EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液活化传感器芯片。将每种His标记蛋白的溶液(用4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(0.01M HEPES,150mM KCl,2mM DTT,1mM EDTA,pH 7.2)调节至浓度为100至500ng/mL)施加到传感器芯片上，由此通过与Ni-NTA的共价键将蛋白质固定在传感器芯片上。用乙醇胺封闭剩余的活性NHS，并用EDTA溶液除去Ni离子(Ni-亲和胺偶联：参见国际公开第WO2005/022156号)。通过用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液活化NTA传感器芯片，然后将用10mM乙酸钠缓冲液(pH:4至4.5)稀释至1至10μM的抗原肽溶液施加至传感器芯片，将抗原肽(1×P、3×P和Non P)各自固定在传感器芯片上，由此肽与传感器芯片共价结合。剩余的活性NHS用乙醇胺封闭。因此，产生分别固定有上述蛋白质和肽的传感器芯片。
将CAPS缓冲液(pH 10.5)在37℃下施加到这些传感器芯片上以稳定传感器芯片的固定有蛋白质或肽的表面。将用HEPES缓冲液(pH 7.2)作为特异性结合反应溶液制备的每种抗体的溶液以从0.2nM变化至1nM的浓度(约为估计的结合解离常数[KD])施加至传感器芯片表面，反应持续150秒(在相同评价中一致)，并测量结合动力学。使用Biacore分析软件(Biacore T200Evaluation Software，3.0版)分析所得数据。
通过从抗原蛋白4R2N(hpTau)与传感器芯片的结合动力学中减去作为阴性对照的非磷酸化蛋白4R0N与传感器芯片的结合动力学，来校正每种抗体的结合动力学。通过从抗原肽1×P和3×P的每一种的结合动力学减去作为阴性对照的非磷酸化肽Non P与传感器芯片的结合动力学来校正每种抗原肽的结合动力学。在经历测量的样品浓度范围内未观察到每种抗体与非磷酸化tau蛋白4R0N或非磷酸化肽Non P的结合。
表9A显示人源化抗体与磷酸化tau蛋白4R2N(hpTau)的结合活性。表9B显示人源化抗体与单磷酸化tau肽1×P和三磷酸化tau肽3×P的结合活性的结果。结果表明，每种人源化抗体对所有过度磷酸化的tau蛋白hpTau、单磷酸化tau肽1×P和三磷酸化tau肽3×P表现出高结合活性。
表9A：人源化抗体与磷酸化tau蛋白(hpTau)的结合活性(1:1结合模型)
表9B：人源化抗体与磷酸化肽(1×P,3×P)的结合活性(1:1结合模型)
E.实施例5：AD患者脑匀浆中pSer413-Tau的结合亲和力分析
在具有表3A中所示的VL和VH的组合的人源化抗体中，使用小鼠抗体Ta1505和嵌合抗体作为参照抗体，评价L15H11、L46H11和L47H65在液相中对源自阿尔茨海默病(AD)患者临床样品的Ser413磷酸化的tau蛋白(pSer413-Tau)的结合亲和力。
使用N-羟基琥珀酰亚胺-LC-生物素(NHS-LC-生物素)(Thermo FisherScientific K.K.)将人源化抗体、小鼠抗体和嵌合抗体各自生物素化，然后用PBS透析。
将来自Braak V/VI期AD患者脑的冷冻海马组织(160mg)加入0.8mL TBS-I(Tris缓冲盐水，蛋白酶抑制剂混合物，磷酸酶抑制剂混合物)中并在冰水中进行超声处理。将经超声处理的溶液在4℃下以3000×g离心10分钟，收集上清液，进一步在4℃下以100000×g超速离心15分钟，得到脑匀浆。使用Innotest pTau(pT181)试剂盒(Fijirebio Inc.)作为Ser413磷酸化tau蛋白(pSer413-Tau)的ELISA系统，但试剂盒中包含的生物素化抗体(标记为CONJ1)用上述产生的生物素化抗体替换。
将上述产生的每种生物素化抗体制成浓度为0.1nM的溶液，并加入到固定有HT7抗体的MT平板(包含在试剂盒中的)中，同时加入脑匀浆的1000倍稀释液。将所得样品混合并在4℃下孵育过夜。第二天，洗涤平板，并将HRP标记的链霉抗生物素蛋白(作为CONJ2包含在试剂盒中)加入到平板中，然后孵育1小时。洗涤后，加入显色试剂TMB，然后在室温下在遮光下孵育30分钟。然后用反应终止溶液(作为STOP溶液包含在试剂盒中)终止反应，并测量450nm波长处的吸光度。
结果示于表4中。如图4的图所示，人源化抗体L15H11、L46H11和L47H65均显示出对源自AD患者临床样品的Ser413磷酸化tau蛋白(pSer413-Tau)的高结合亲和力。
F.实施例6：测试血液中的动力学
与商购可得的抗体赫赛汀(Genentech,south San Francisco,CA)和嵌合Ta1505抗体相比，在正常小鼠中测试了五种初始人源化抗体变体的药代动力学。每种人源化抗体变体的轻链和重链概述于下面的表10中。
表10.一些初始人源化抗体变体的轻链和重链
抗体 LC HC
变体2 L1(SEQ ID NO:130) H2(SEQ ID NO:134)
变体5 L2(SEQ ID NO:131) H1(SEQ ID NO:133)
变体6 L2(SEQ ID NO:131) H2(SEQ ID NO:134)
变体9 L3(SEQ ID NO:132) H1(SEQ ID NO:133)
变体10 L3(SEQ ID NO:132) H2(SEQ ID NO:134)
将抗体以10mg/kg的剂量腹膜内注射至11周龄雄性C57BL/6J小鼠(Charles RiverLaboratories Japan,Inc.)。从给药后1小时、3小时、8小时、24小时和72小时收集的血液中获得血浆。样本大小为每种抗体2只动物。
使用利用抗人IgG多克隆抗体的夹心ELISA来测定血浆抗体浓度。通过用小鼠血浆连续稀释每种抗体来绘制校准曲线。
将血浆稀释1,000倍并测量抗体浓度。
将1μg/mL山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体的PBS溶液移液至96孔板(MaxSorp(NUNC))中，并使其在4℃下放置过夜。然后，用3％BSA/PBS完成封闭以制备具有固定的山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体的平板。使用小鼠血浆连续稀释抗体并获得标准物质。将血浆和标准物质用3％BSA/PBS稀释，并以50μL/孔移液到具有固定的山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体的平板中。使混合物在室温下反应1.5小时，然后用TBS-T(TBS，0.05％Tween 20)洗涤平板。然后，以50μL/孔移取通过用3％BSA/PBS将碱性磷酸酶标记的抗人IgG(H+L)多克隆抗体(Southern Biotech，目录号2087-04)稀释2000倍制备的溶液，并且使反应在室温下进行1小时。接着，用TBS-T洗涤平板，以100μL/孔加入着色试剂，并将平板在室温下孵育1小时。此后，使用读板器测量405nm和550nm处的吸光度。
用标准物质绘制校准曲线并将其用于计算血浆抗体浓度。结果示于图5A中。
与赫赛汀和嵌合抗体的水平相比，测试的初始人源化变体(变体2、5、6、9和10)显示在施用后8小时血浆浓度迅速降低，所述赫赛汀和嵌合抗体的水平保持高水平且稳定至注射后3天。与嵌合抗体相比，这些初始人源化抗体呈现更短的半衰期和差的PK特征，这可能归因于这些变体的高pI值。需要进一步改进来达到嵌合抗体的PK。
在具有表3A中所示的VL和VH的组合的人源化抗体中，对L15H11、L46H11和L47H65进行血液动力学测试。所使用的参照抗体是嵌合抗体Ta1505和用于AD治疗的临床试验研究中的已知人源化抗体，其通过基于专利信息或数据库信息中公开的氨基酸序列信息的重组表达产生。具体而言，将国际ImMunoGeneTics信息系统(注册商标)(IMGT)的数据库(http://www.imgt.org)推荐用于苏兰珠单抗(抗A□抗体，Eli Lilly and Company)；将WO2014/200921 A1中公开的VH2Vk3的氨基酸序列用于IPN007(抗Tau N-末端抗体，Bristol-Myers Squibb iPierian)；WO2015/091656A1中公开的VH32VL21的氨基酸序列用于MAb3221(抗Tau-pS422抗体，Roche Diagnostics K.K.)。
以每种10mg/kg的浓度向11周龄雄性C57BL/6J小鼠(Charles RiverLaboratories Japan,Inc.)腹膜内施用每种抗体。在1小时、3小时、8小时和24小时以及随后在施用后第3天和第7天抽血以收集血浆。将每种抗体以一式三份进行测试(N＝3)。
使用抗人多克隆抗体通过夹心ELISA测量血浆中的抗体浓度。具体地，将含有1μg/mL山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体(Southern Biotech)的PBS溶液加入96孔板(Max Sorp(NUNC))中，在4℃下固定过夜，然后用3％BSA-PBS封闭，由此产生固定有山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体的平板。
单独地，通过用获自未施用抗体的小鼠的血浆连续稀释每种抗体来制备一系列已知浓度的标准抗体样品，并对其进行测量以用于校准曲线的制备。
将待测量的血浆样品和标准样品各自稀释10000倍，并以50μL/孔加入到固定有山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体的平板中，以在室温下反应1小时30分钟，然后用TBS-T(Tris缓冲盐水，0.05％Tween 20)洗涤平板。随后，以50μL/孔向平板中加入用3％BSA-PBS稀释2000倍的碱性磷酸酶标记的抗人IgG(H+L)多克隆抗体(Southern Biotech)溶液，使反应在室温下进行1小时。在用TBS-T洗涤后，将显色溶液(1mg/mL pNPP溶液)以100μL/孔加入到平板中，随后在室温下孵育1小时。然后在405nm的测量波长和550nm的参照波长处用板读数器测量吸光度。基于标准样品的测量结果制备校准曲线，并使用校准曲线计算每个血浆样品中的抗体浓度。
图5B是显示血浆中的抗体浓度随时间的变化的图。从图中可以明显看出，人源化抗体L15H11(LC SEQ ID NO:32HC SEQ ID NO:18)、L46H11(LC SEQ ID NO:36、HC SEQ IDNO:18)和L47H65(LC SEQ ID NO:38、HC SEQ ID NO:30)(均使用人IgG1(SEQ ID NO:135)和人κ(SEQ ID NO:79))在血液中显示与嵌合抗体Ta1505的动力学基本上相同的动力学。这些人源化抗体L15H11、L46H11和L47H65在血液中的动力学与已知的人源化抗体IPN007和MAb3221的动力学相当，并且显著优于已知的人源化抗体苏兰珠单抗的动力学。
G.实施例7：脑内迁移的分析
进行了研究以分析具有改善的血浆药代动力学的人源化变体的脑浓度。
在注射抗体后1周，从注射亲本小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体变体(L15H11、L36H11、L46H11、L48H12、L48H47、L48H64、L47H65或L48H11)的小鼠收集血液。接着，用3种麻醉剂的混合物麻醉动物，将其剖腹，并通过腹主动脉放血。然后，收集脑组织。将收集的脑组织分成左半球和右半球，在干冰/乙醇上冷冻，并于-80℃下储存。将每个冷冻的半球称重并转移至2mL管中。然后，加入0.8mL TBS-I(Tris缓冲盐水，蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物)，并将混合物在冰水中进行超声处理。将经超声处理的混合物在4℃下以3000×g离心10分钟，并收集上清液。将上清液进一步在4℃下以100,000×g离心15分钟，以获得脑匀浆。
将10μg/mL山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体的PBS溶液移液至96孔板(MaxSorp(NUNC))中，并使其在4℃下放置过夜。然后，用3％BSA/PBS完成封闭以制备具有固定的山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体的平板。从未注射抗体的小鼠获得的脑匀浆用于连续稀释抗体并获得标准物质。
将脑匀浆和标准物质稀释10倍，并以50μL/孔移液到具有固定的山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体的平板中。使混合物在室温下反应2小时，然后用TBS-T(TBS，0.025％Tween 20)洗涤平板。然后，以50μL/孔移取通过用3％BSA/PBS将碱性磷酸酶标记的抗人IgG(H+L)多克隆抗体(Sigma,Cat#SAB3701337-1MG)稀释2000倍制备的溶液，使反应在室温下进行1小时。接着，用TBS-T洗涤平板，以100μL/孔加入着色试剂pNPP(Sigma，目录号P7998)，并将平板在室温下孵育1小时。此后，使用读板器测量405nm和550nm处的吸光度。
用标准物质绘制校准曲线并将其用于计算脑匀浆中的抗体浓度。测定每脑重量(全脑体积)的抗体浓度并计算与血浆浓度的比率。
图6A表明具有良好药代动力学的人源化抗体变体(例如，根据图5B的L15H11、L46H11和L47H65)在脑中具有提高的浓度。
使用嵌合抗体Ta1505和已知的人源化抗苏兰珠单抗、IPN007和MAb3221(所述抗体用于AD治疗的临床试验研究)作为参照抗体，分析人源化抗体L15H11、L46H11和L47H65中的每一种的脑内迁移。
在实施例6中施用每种抗体后一周，从小鼠抽取血液，然后在利用三种类型的混合麻醉剂麻醉下对所述小鼠进行剖腹手术。在从腹腔静脉放血死亡后，收集脑组织。将收集的脑组织分成右半球和左半球，将其在干冰乙醇中冷冻并于-80℃下储存。将每个冷冻的半球称重并转移至2mL管中，向其中加入0.8mL TBS-I(Tris缓冲盐水，蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物)。然后将每个半球在冰水中进行超声处理。将经超声处理的溶液在4℃下以3000×g离心10分钟，收集上清液，进一步在4℃下以100000×g超速离心15分钟，得到脑匀浆。
使用抗人多克隆抗体通过抗原ELISA测量脑匀浆中的抗体水平。具体地，将含有10μg/mL山羊抗人IgG Fc的PBS溶液加入96孔板(Max Sorp(NUNC))中，在4℃下固定过夜，然后用3％BSA-PBS封闭，由此产生固定的平板。
单独地，通过用获自未施用抗体的小鼠的脑匀浆连续稀释每种抗体来制备一系列已知浓度的标准抗体样品，并对其进行测量以用于校准曲线的制备。
将脑匀浆和待测标准样品各自用0.1％脱脂牛奶-3％BSA-PBS稀释10倍，并以50μL/孔加入到固定有PD17(P)的平板中，使反应在室温下进行2个小时。然后用TBS-T(TBS，0.05％Tween 20)洗涤平板。随后，将用0.1％脱脂牛奶-3％BSA-PBS稀释2000倍的碱性磷酸酶标记的抗人IgG(H+L)多克隆抗体(Sigma-Aldrich Co.LLC.，目录号SAB3701337:1mg)溶液以50μL/孔加入到平板中，使反应在室温下进行1小时。在用TBS-T洗涤平板后，以100μL/孔加入pNPP(Sigma-Aldrich Co.LLC.，目录号P7998:100mL)作为显色底物，然后在室温下孵育1小时。然后在405nm的测量波长和550nm的参照波长处用板读数器测量吸光度。基于标准样品的测量结果制备校准曲线，并使用校准曲线测定每个脑匀浆样品中的抗体水平，并将其评估为脑中的抗体水平。
另外，以与实施例6中相同的方式，使用在剖腹手术之前收集的血液测定血浆中的抗体水平，并计算脑中抗体水平与血浆中抗体水平的比率。
图6B是显示脑中每种抗体的水平与血浆中相应抗体的水平的比率的图。与嵌合抗体Ta1505和已知的人源化抗体IPN007、MAb3221和苏兰珠单抗相比，人源化抗体L15H11、L46H11和L47H65的脑中抗体浓度与血浆中抗体浓度的比率高。结果表明这些人源化抗体具有高的至脑的迁移。
实施例8:选择性人源化抗体的进一步开发
将进一步的突变引入VL46的CDR1序列以消除脱酰胺热点和/或将CDR序列恢复为亲本小鼠序列。表11概述了引入VL46CDR1的突变。
表11.在VL46CDR1中引入的突变
另外，在新生成的人源化抗体变体中测试了包括具有S228P突变的IgG1和IgG4的不同IgG同种型。表12概述了新产生的人源化抗体变体以及亲本小鼠抗体和嵌合抗体的轻链和重链。
表12.特定抗体的轻链和重链
小鼠x[MAPT_H]mAb(Ta1505)IgG2a/κ(HY) msIgG2a
小鼠人嵌合体x[MAPT_H]mAb(Ta1505)IgG1/κ(CX) 嵌合体IgG1
小鼠人嵌合体x[MAPT_H]mAb(Ta1505)IgG4 S228P/κ(CX) 嵌合体IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505VL46/VH11)IgG1/κ(CX) hu VL46/VH11 IgG1
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505 VL46/VH11)IgG4 S228P/κ(CX) hu VL46/VH11 IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_G34A/VH11)IgG1/κ(CX) hu VL46/VH11 G34A IgG1
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_G34A/VH11)IgG4 S228P/κ(CX) hu VL46/VH11 G34A IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_G34S/VH11)IgG4 5228P/κ(CX) hu VL46/VH11 G34S IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_G34T/VH11)IgG4 S228P/κ(CX) hu VL46/VH11 G34r IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_N33Q/VH11)IgG4 S228P/κ(CX) hu VL46/VH11 N33Q IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_N33Q_G34A/VH11)IgG4 S228P/κ(CX) hu VL46/VH11 N33Q G34A IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_N33D/VH11)IgG4 S228P/κ(CX) hu VL46/VH11 N33D IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_N33S/VH11)IgG4 S228P/κ(CX) hu VL46/VH11 N33S IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_N33T/VH11)IgG45228P/κ(CX) hu VL46/VH11 N33T IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46/VH11A64D)IgG4 S228P/κ(CX) hu VL46/VH11A64D IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46 S28N/VH11)IgG4 S228P/κ(CX) hu VL46/VH11 S28N IgG4
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505VL47/VH65)IgG1/κ(CX) hu VL47/VH65 IgG1
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_G34A_S28N/VH11)IgG1/κ(CX) hu VL46/VH11 G34A S28N IgG1
人源化x[MAPT_H]mAb(Ta1505-VL46_G34A_S28N/VH11)IgG4 S228P/κ(CX) hu VL46/VH11 G34A S28N IgG4
H.实施例9：新产生的人源化抗体变体的BiacoreTM结合分析
使用BiacoreTM T200和4000生物传感器(GE Healthcare，Chicago，IL)测量新产生的人源化抗体变体的结合亲和力。除非下文中另外指出，否则将以下运行缓冲液：10mMHEPES (GE Healthcare，BR100671)、150mM NaCl(GE Healthcare，BR100671)、0.05％v/v表面活性剂P20(GE Healthcare，BR100671)、2mM DTT(Sigma，10708984001，St.Louis，MO)和1mM EDTA(GE Healthcare，28995043)用于固定、样品稀释和数据收集。
固定的蛋白质是指固定在芯片上的重组人磷酸化Tau蛋白；固定的1xP肽是指固定在芯片上的磷酸化肽(TSPRHLSNVS(pS)TGSIDMVDSPC，SEQ ID NO：75)。这两种方法都要对亲合力成分进行亲和力测量。4xP肽分析物使抗体被捕获在芯片上，而4x磷酸化肽(GAEIVYK(pS)PVVSGDT(pS)PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD(pS)PQLATLADEVSASLAKQGL，SEQ ID No：78)将抗体捕获在溶液中。
使用Series S传感器芯片NTA(GE Healthcare，Br100034)测量抗体与固定的磷酸化Tau蛋白的结合。用于固定的运行缓冲液是10mM HEPES,150mM NaCl2,0.05％v/v表面活性剂P20,pH 7.4(GE Healthcare,BR100671)，流速为10μL//分钟。注入350mM EDTA 1分钟以清洁芯片，然后注入0.5mM NiCl2(GE Healthcare,NTA Reagent试剂盒)2分钟以制备捕获his标记的蛋白质的芯片。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare,Br100633)，按照制造商的说明活化芯片，然后注入300nM磷酸化Tau蛋白(80AWB)直至所需量的蛋白质已被固定。用来自胺偶联试剂盒的乙醇胺封闭芯片。每个实验使用多个水平的固定的磷酸化Tau蛋白。最低水平从54个共振单位(RU)至452RU不等，最高水平从463RU到1020RU不等。为了测量Ta1505抗体与固定的磷酸化Tau蛋白结合的亲和力，制备每种抗体的五元3倍稀释系列，得到0.37nM至30nM的浓度。将每个浓度和几个缓冲液空白以45μl/分钟的流速注入3分钟。监测抗体的解离15分钟，然后通过注射100mM CAPS(Sigma,C6070),1M KCl(Sigma,P9541),1mMEDTA,2mM DTT,pH 10.5 30秒至1分钟来再生表面。
使用Series S传感器芯片CM3(GE Healthcare,BR100536)测量抗体与固定的磷酸化Tau肽的结合。使用胺偶联试剂盒活化芯片，然后注入30μg/mL的10mM乙酸钠(pH 5.0)中的磷酸化Tau肽(SEQ ID NO:75)直至51RU被固定。用乙醇胺封闭芯片。使用非磷酸化Tau肽(TSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPC,SEQ ID NO:77)类似地制备阴性对照参照表面。为了测量Ta1505抗体与固定的磷酸化Tau肽结合的亲和力，制备每种抗体的五元3倍稀释系列，得到0.37nM至30nM的浓度。将每个浓度和几个缓冲液空白以45μL/分钟的流速注入3分钟。监测抗体的解离15分钟。通过注入100mM盐酸(Fisher Scientific,SA56-1,Waltham,MA)30秒再生表面。
使用Series S传感器芯片CM5(GE Healthcare,29149603)测量磷酸化Tau肽与固定的抗体的结合。使用胺偶联试剂盒活化芯片，然后注入1至3μg/ml的10mM乙酸钠pH 5.0(Ge Healthcare,Br100351)中的抗体直至280至9100Ru的抗体被固定。用乙醇胺封闭芯片。为了测量磷酸化Tau肽(SEQ ID NO:78)与固定的Ta1505抗体结合的亲和力，制备所述肽的六元2.5倍稀释系列，得到5.1nM至500nM的浓度。将样品和几个缓冲液空白以30至50μL/分钟注入3分钟，监测解离15分钟。通过注入20mM乙酸钠(pH 4.5)(未调节的，或用盐酸将pH调节至3.5)30秒再生表面。
使用BiacoreTM T200评估软件2.0版或BiacoreTM 4000评估软件1.1版(GEHealthcare)处理和拟合数据。通过从阴性对照流通池中减去响应并从缓冲液注射中减去响应或从两次缓冲液注射中减去平均响应来“双参照”数据。然后将数据与“1:1结合”模型拟合以测定结合速率常数ka(M-1s-1，其中“M”等同于摩尔，“s”等同于秒)和解离速率常数kd(s-1)。这些速率常数用于计算平衡解离常数，KD(M)＝kd/ka。表13概述了与亲本小鼠抗体和嵌合抗体的KD值相比较的新产生的人源化抗体变体的KD值。
表13.抗体对磷酸化Tau蛋白或肽的KD(nM)值
I.实施例10:亲本小鼠抗体、嵌合抗体和一些人源化抗体变体的ELISA结合分析
通过ELISA分析亲本小鼠抗体、嵌合抗体和新产生的人源化抗体变体与磷酸化肽(PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD，SEQ ID NO:79)和相应的非磷酸化肽(PRHLSNVSTGSIDMVD，SEQ IDNO:80)的结合。
将50微升的1μg/ml的PBS中的磷酸化或非磷酸化肽加入ELISA板的每个孔中，并将平板在4℃下孵育过夜。第二天，将平板洗涤3次并在4℃下用200μL的superblock封闭过夜。在第三天，将板洗涤3次。然后将50μL的在ELISA缓冲液中以1:3连续稀释(始于10μg/mL)的抗体加入到平板的每个孔中，在室温下孵育1小时，然后洗涤3次。加入50微升的山羊抗小鼠-HRP(Southern Biotech,1030-05)的1:3000稀释物以用于测量亲本小鼠抗体。加入50微升的山羊抗小鼠-HRP(Southern Biotech,109-036-098)的1:3000稀释物以用于测量嵌合抗体和人源化抗体。将ELISA板在室温下孵育45分钟，洗涤3次，然后在室温下用ABTS显色5分钟。此后，使用读板器测量405nm处的吸光度。
图8A和图8B显示通过杂交瘤或重组方法产生的亲本抗体与磷酸化肽(图8A)结合但不与非磷酸化肽(图8B)结合。类似地，嵌合抗体(具有IgG1或IgG4主链)与磷酸化肽(图8C)结合但不与非磷酸化肽(图8D)结合。
图9A-9C表明大多数新产生的人源化抗体变体以与嵌合IgG4抗体相当的亲和力与磷酸化肽结合，而少数变体丧失对磷酸化肽的结合亲和力。特别地，在图9B中，huVL46/VH11_N33D_IgG4变体(其模拟氨基酸N33至D的完全脱酰胺)极大地降低了与磷酸化肽的结合，表明完全脱酰胺的抗体将显著丧失其对磷酸化Tau蛋白的结合亲和力。因此，必须减少人源化抗体变体中N33处的脱酰胺作用。
XV.实施例11:阿尔茨海默病患者脑匀浆中新产生的人源化抗体变体的抗原结合分析
评估亲本小鼠抗体、嵌合抗体和选定的人源化抗体变体在液相中与源自阿尔茨海默病(AD)患者临床样品的Ser413磷酸化Tau蛋白(pSer413-Tau)的结合效力。
如图10A-10E中所述，通过在将AD脑样品分别与浓度递增的对照人IgG(Sigma，目录号I2511)和选定的抗体变体孵育后使用小鼠生物素化的Ta1505IgG2a抗体检测的总抗原结合与游离抗原结合之间的差异来测定pSer413-Tau上的抗体占据率。
利用相同的小鼠生物素化的Ta1505IgG2a抗体的检测允许直接比较抗体变体之间的结合效力。使用N-羟基琥珀酰亚胺-LC-生物素(NHS-LC-生物素)(Thermo FisherScientific K.K.)将小鼠Ta1505IgG2a抗体生物素化，然后用PBS透析。
将来自AD患者脑的冷冻前额叶皮层组织(100mg)加入到1mL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Fisher Scientific，目录号1861281)的TBS-I(Tris缓冲盐水，目录号BP2471-1，Thermo Fisher Scientific)中，并使用Qiagen Tissue Lyzer II在冰水中进行裂解。将匀浆的样品在Beckman Coulter Optima Max-XP超速离心机中于4℃下以27,000g(TLA-55转子)离心20分钟，然后收集上清液并在4℃下于Beckman Coulter OptimaMax-XP超速离心机中以150,000×g(TLA-55转子)再离心20分钟，得到称为P2级分的沉淀。通过超声处理将P2级分重新悬浮在匀浆缓冲液TBS-I中。使用PierceTM BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,目录号23225)按照制造商的说明测定P2级分的蛋白质浓度。将蛋白质浓度调节至4μg/mL。
将pTau(pT181)试剂盒(Fijirebio Inc.，目录号81581)作为用于Ser413磷酸化tau蛋白(pSer413-Tau)的ELISA系统，但试剂盒中包含的生物素化抗体(标记为CONJ1)用上面产生的生物素化小鼠Ta1505IgG2a抗体替换。
将亲本小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体变体或对照人IgG在样品稀释缓冲液(由试剂盒提供)中从原液稀释至200nM。然后将抗体溶液连续稀释，并与预先在测定板中以1/1000稀释的AD脑P2级分一起在室温下孵育4小时。然后将抗体-抗原混合物与稀释的生物素化抗体小鼠Ta1505IgG2a(1/10于CONJ DIL 1中，由试剂盒提供)一起加入到固定有HT7抗体的MT平板(包含在试剂盒中)中。将所得样品混合并在4℃下孵育过夜。第二天，洗涤平板，并将HRP标记的链霉抗生物素蛋白(作为CONJ2包含在试剂盒中)加入到平板中，然后孵育1小时。洗涤后，加入显色试剂TMB，然后在室温下在遮光下孵育30分钟。然后用反应终止溶液(作为STOP溶液包含在试剂盒中)终止反应，并测量450nm波长处的吸光度。
图10A-10E中举例说明的浓度-响应曲线的非线性分析允许测定AD脑匀浆中TaupSer413的50％占据所需的每种抗体的浓度，以及每种抗体的最大占据水平百分比。图10A-10E表明对于亲本小鼠抗体、嵌合抗体和AD患者脑匀浆中选定的人源化抗体变体的可比较的结合特征，包括pSer413Tau抗原的体外占据水平和最大结合。
XVI.实施例12:新产生的人源化抗体变体的稳定性和纯度分析
通过测量(通过纳米-DSF)熔化温度(Tm1)和聚集温度(Tagg)来测定各种抗体的稳定性。通过SEC和非还原毛细管SDS(NR-cSDS)测量每种抗体的纯度。
Tm和Tagg的测定：使用由PR.ThermControl v2.0.4软件控制的Prometheus NT.48差示扫描荧光计(Nanotemper Technologies)，通过纳米DSF测定Tm和Tagg。激发功率为40％，并且使温度以1℃/分钟的速率从20℃升高至95℃。自动测量Tm和Tagg。通过在20mM乙酸钠(pH 5.5)的缓冲液中稀释至1mg/mL制备样品，并通过毛细管作用将其吸入Prometheus玻璃毛细管(PR-L002)中。
通过SEC确定纯度：在ACQUITY UPLC H-Class系统上进行SEC。所用柱是来自Waters(Milford,MA)的ACQUITY UPLC Protein BEH SEC柱(产品编号186005225,1.7μm,200A,4.6mm x150mm)。柱温为25℃，使用0.5mL/分钟的系统流速注入10μL的1mg/mL的样品。流动相为100mM磷酸钠，200mM氯化钠和0.02％叠氮化钠，pH 7.0。在214nm和280nm处定量数据，并使用Empower 3软件分析所述数据。以10μg注入来自Waters(Milford,MA)的BEH200SEC蛋白质标准混合物(产品编号186006518)，并测量USP分辨率、理论板数和拖尾。
通过NR-cSDS测定纯度：为了通过NR-cSDS评估纯度，将5μL1mg/mL的每种样品在96孔板中与35μL含有50mM碘乙酰胺的上样缓冲液(HT蛋白质表达样品缓冲液(PerkinElmer))混合。将平板在70℃下孵育20分钟，并向每个孔中加入75μL水。使用HT蛋白质表达芯片(Perkin Elmer)在LabChip GXII系统(Perkin Elmer)上分析每个样品。通过测量样品随时间推移的荧光来收集电泳图谱，并使用LabChip GX软件V4.1.1619.0 SP1(PerkinElmer)进行积分。
表14概述了测试抗体的稳定性和纯度。
表14.各种抗体的稳定性和纯度
与亲本小鼠抗体或嵌合抗体相比，所有新产生的人源化抗体变体保持或提高了稳定性和纯度。原始人源化变体huVL47/VH65_IgG1之一清晰地显示为具有如通过Tm1/Tagg测量的降低的稳定性。
XVII.实施例13:新产生的人源化抗体变体的脱酰胺分析
测定各种抗体的轻链CDR1中氨基酸N33的脱酰胺水平。测试应激条件，诸如50℃或pH 10下的孵育。进行4℃下的孵育(作为对照)。
4℃和50℃下的孵育：将在20mM乙酸钠(pH 5.5)中以2mg/ml配制的样品在温控稳定室中在50℃下保持一周。出于比较目的，将样品保持在4℃以用作4℃的对照。
pH 10的孵育：使用0.5M NaOH将在20mM乙酸钠(pH 5.5)中以2mg/mL配制的样品调节至pH 10，并在温控稳定室中在25℃下保持一周。然后，使用Zeba Spin脱盐柱(7K MWCO,Thermo Fisher 2mL,89890)将样品交换到20mM乙酸钠(pH 5.5)缓冲液中。
通过肽图分析进行的脱酰胺分析：对于通过质谱法进行的肽图分析，将100μg的每种样品用30μL 8M胍/1M Tris盐酸盐溶液(15:1)变性，用2μL 1M DTT在60℃下还原30分钟，并用5μL 1M碘乙酰胺在黑暗中进行烷基化，持续45分钟。在消化之前，使用7000道尔顿的分子量截断值的ZEBA盒(ZEBA cartridges)将样品缓冲液交换至50mM碳酸氢铵中。将样品分到不同的管中并用2μg胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在37℃下平行消化2小时。通过向每个样品中加入3μL的5M盐酸盐来淬灭消化。将2μL样品注入到保持在40℃的Peptide BEH-C18-1x50mm Waters UPLC柱(产品编号186005592)上。使用在50分钟内从2％至36％的乙腈(于0.1％甲酸中)的线性梯度在Dionex/QE plus MS中获得数据。使用PEAKS DB(Bioinformatics Solutions Inc.)(用于数据库搜索)以及PepFinder(Thermo FisherScientific)和人工验证(用于百分比变化评估)分析样品。表15概述了测试抗体的轻链CDR1中氨基酸N33的脱酰胺百分比。
表15.不同条件下轻链CDR1中N33的脱酰胺百分比
与亲本小鼠抗体和原始人源化变体(VL46/VH11)IgG1或IgG4抗体相比，新产生的人源化抗体变体表现出轻链CDR1中N33的脱酰胺水平显著降低。
序列表
<110> 江口藤原浩(EGUCHI, Hiroshi)
村上隆(MURAKAMI, Takashi)
井木直子(NAMIKI, Naoko)
田野仓阿基拉(TANOKURA, Akira)
珍妮·E·贝克(BAKER, Jeanne E.)
索菲·帕尔芒捷贝特(PARMENTIER BATTEUR, Sophie)
安杰拉·玛丽·雅布隆斯基(JABLONSKI, Angela Marie)
丹尼尔·斯蒂芬·马拉绍柯(MALASHOCK, Daniel Stephen)
卡尔·美斯高夫斯基(MIECZKOWSKI, Carl)
格帕兰（拉古）·洛格纳汗((RAGHUNATHAN, Gopalan (Raghu))
<120> 用于治疗或预防认知障碍的人源化抗体、其生产方法以及使用其用于治疗或预防认识障碍的剂
<130> 063785-06-5002-WO和5002-US
<140> 随同提交
<141> 2018-02-27
<150> JP 2017-035594
<151> 2017-02-27
<160> 185
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 [4R2N Tau] [氨基酸]
<211> 441
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 2 [4R1N Tau] [氨基酸]
<211> 412
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
65 70 75 80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
85 90 95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
130 135 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
180 185 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
195 200 205
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
210 215 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser
245 250 255
Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys
275 280 285
Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly
290 295 300
Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
305 310 315 320
Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly
325 330 335
Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn
340 345 350
Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
355 360 365
Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser
370 375 380
Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala
385 390 395 400
Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
405 410
<210> 3 [4R0N Tau] [氨基酸]
<211> 383
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
35 40 45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
50 55 60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
100 105 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
115 120 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
165 170 175
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
180 185 190
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu
195 200 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu
210 215 220
Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys
225 230 235 240
His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp
245 250 255
Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His
260 265 270
Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe
275 280 285
Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His
290 295 300
Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr
325 330 335
Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn
340 345 350
Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala
355 360 365
Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
370 375 380
<210> 4 [3R2N Tau] [氨基酸]
<211> 410
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln
305 310 315 320
Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly
325 330 335
Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys
340 345 350
Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val
355 360 365
Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly
370 375 380
Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu
385 390 395 400
Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
405 410
<210> 5 [3R1N Tau] [氨基酸]
<211> 381
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
65 70 75 80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
85 90 95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
130 135 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
180 185 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
195 200 205
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
210 215 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser
245 250 255
Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro
260 265 270
Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp
275 280 285
Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro
290 295 300
Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu
305 310 315 320
Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser
325 330 335
Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser
340 345 350
Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu
355 360 365
Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
370 375 380
<210> 6 [3R0N Tau] [氨基酸]
<211> 352
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
35 40 45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
50 55 60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
100 105 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
115 120 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
165 170 175
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
180 185 190
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu
195 200 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
210 215 220
Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
225 230 235 240
His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
245 250 255
Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr
260 265 270
His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr
275 280 285
Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val
290 295 300
Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser
305 310 315 320
Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu
325 330 335
Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
340 345 350
<210> 7 [pS412/pS413] [氨基酸]
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化Tau肽pS412/pS413的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 磷酸化
<400> 7
Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val
1 5 10 15
Asp
<210> 8 [pS413] [氨基酸]
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化Tau肽pS413的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 磷酸化
<400> 8
Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val
1 5 10 15
Asp
<210> 9 [pS409/pS412/pS413] [氨基酸]
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化Tau肽pS408/pS412/pS413的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 磷酸化
<400> 9
Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val
1 5 10 15
Asp
<210> 10 [CDR-H1: 1M] [氨基酸]
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 10
Ser Phe Ala Leu Asn
1 5
<210> 11 [CDR-H2: 2M] [氨基酸]
<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 11
His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 12 [CDR-H2: 2H1] [氨基酸]
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工CDR-H2: 2H1的氨基酸序列的描述
<400> 12
His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 13 [CDR-H3: 3M] [氨基酸]
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 13
Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 14 [CDR-L1: 4L1] [氨基酸]
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工CDR-L1: 4L1的氨基酸序列的描述
<400> 14
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 15 [CDR-L1: 4M] [氨基酸]
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 15
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 16 [CDR-L2: 5M] [氨基酸]
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 16
Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 17 [CDR-L3: 6M] [氨基酸]
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 17
Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 18 [VH11] [氨基酸]
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH11可变区的氨基酸序列的描述
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19 [VH11] [DNA]
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH11可变区的DNA序列的描述
<400> 19
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc caggaggctc cctgcgcctg 60
agctgcgccg cttctggctt cacattttcc agctttgccc tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggcaagg gactggagtg ggtgggccat atccggagca agaccaacaa ttacgctaca 180
ttctatgccg cttctgtgaa ggacaggttc accgtgtcca gggacgatag ccagaacaca 240
gcctacctgc agatgaactc cctgaagacc gaggacaccg ctacatacta ttgcgtgagg 300
cggggcccta gggattcctg gttcggctat tggggccagg gtaccctggt gacagtgtct 360
tcc 363
<210> 20 [VH12] [氨基酸]
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH12可变区的氨基酸序列的描述
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21 [VH12] [DNA]
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH12可变区的DNA序列的描述
<400> 21
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc caggaggctc cctgcgcctg 60
agctgcgccg cttctggctt cgcttttaat agctttgccc tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggcaagg gactggagtg ggtgggccat atccggagca agaccaacaa ttacgctaca 180
ttctatgccg actctgtgaa ggataggttc accgtgtcca gggacgatag caagaacaca 240
gcctacctgc agatgaactc cctgaagacc gaggacaccg ctacatacta ttgcgtgagg 300
cggggcccta gggattcctg gttcggctat tggggccagg gtaccctggt gacagtgtct 360
tcc 363
<210> 22 [VH47] [氨基酸]
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH47可变区的氨基酸序列的描述
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23 [VH47] [DNA]
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH47可变区的DNA序列的描述
<400> 23
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc caggaggctc cctgcgcctg 60
agctgcgccg cttctggctt cgcttttaat agctttgccc tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggcaagg gactggagtg ggtgggccat atccggagca agaccaacaa ttacgctaca 180
ttctatgccg cttctgtgaa ggacaggttc accgtgtcca gggacgatag ccagaacaca 240
gcctacctgc agatgaactc cctgaagacc gaggacaccg ctacatacta ttgcgtgagg 300
cggggcccta gggattcctg gttcggctat tggggccagg gtaccctggt gacagtgtct 360
tcc 363
<210> 24 [VH61] [氨基酸]
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH61可变区的氨基酸序列的描述
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Val His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25 [VH61] [DNA]
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH61可变区的DNA序列的描述
<400> 25
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc caggaggctc cctgcgcctg 60
agctgcgccg cttctggctt cacatttaat agctttgccc tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggcaagg gactggagtg ggtggtgcat atccggagca agaccaacaa ttacgctaca 180
ttctatgccg actctgtgaa ggataggttc accgtgtcca gggacgatag caagaacaca 240
gcctacctgc agatgaactc cctgaagacc gaggacaccg ctacatacta ttgcgtgagg 300
cggggcccta gggattcctg gttcggctat tggggccagg gtaccctggt gacagtgtct 360
tcc 363
<210> 26 [VH62] [氨基酸]
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH62可变区的氨基酸序列的描述
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Val His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27 [VH62] [DNA]
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH62可变区的DNA序列的描述
<400> 27
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc caggaggctc cctgcgcctg 60
agctgcgccg cttctggctt cgcttttaat agctttgccc tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggcaagg gactggagtg ggtggtgcat atccggagca agaccaacaa ttacgctaca 180
ttctatgccg actctgtgaa ggataggttc accgtgtcca gggacgatag caagaacaca 240
gcctacctgc agatgaactc cctgaagacc gaggacaccg ctacatacta ttgcgtgagg 300
cggggcccta gggattcctg gttcggctat tggggccagg gtaccctggt gacagtgtct 360
tcc 363
<210> 28 [VH64] [氨基酸]
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH64可变区的氨基酸序列的描述
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Val His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29 [VH64] [DNA]
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH64可变区的DNA序列的描述
<400> 29
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc caggaggctc cctgcgcctg 60
agctgcgccg cttctggctt cacatttaat agctttgccc tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggcaagg gactggagtg ggtggtgcat atccggagca agaccaacaa ttacgctaca 180
ttctatgccg cttctgtgaa ggacaggttc accgtgtcca gggacgatag ccagaacaca 240
gcctacctgc agatgaactc cctgaagacc gaggacaccg ctacatacta ttgcgtgagg 300
cggggcccta gggattcctg gttcggctat tggggccagg gtaccctggt gacagtgtct 360
tcc 363
<210> 30 [VH65] [氨基酸]
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工H65可变区的氨基酸序列的描述
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Val His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31 [VH65] [DNA]
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VH65可变区的DNA序列的描述
<400> 31
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc caggaggctc cctgcgcctg 60
agctgcgccg cttctggctt cgcttttaat agctttgccc tgaactgggt gaggcaggct 120
cctggcaagg gactggagtg ggtggtgcat atccggagca agaccaacaa ttacgctaca 180
ttctatgccg cttctgtgaa ggacaggttc accgtgtcca gggacgatag ccagaacaca 240
gcctacctgc agatgaactc cctgaagacc gaggacaccg ctacatacta ttgcgtgagg 300
cggggcccta gggattcctg gttcggctat tggggccagg gtaccctggt gacagtgtct 360
tcc 363
<210> 32 [VL15] [氨基酸]
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL15可变区的氨基酸序列的描述
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33 [VL15] [DNA]
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL15可变区的DNA序列的描述
<400> 33
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcctgtga cactgggaga gccagcctct 60
atcagctgcc ggagcagcca gagcatcgtg cactccaacg gcaataccta cctggagtgg 120
tatcagcaga agccaggaca gagcccccgg ctgctgatct acacagtgtc taaccggttc 180
agcggcgtgc ctgacagatt ttccggctct ggcagcggca ccgatttcac actgaagatc 240
tcccgggtgg aggcagagga tctgggcgtg tactattgtt tccagggctc tcacctgcca 300
ctgacctttg gcggcggtac caaggtggag atcaag 336
<210> 34 [VL36] [氨基酸]
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL36可变区的氨基酸序列的描述
<400> 34
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 35 [VL36] [DNA]
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL36可变区的DNA序列的描述
<400> 35
gatatcgtga tgacacagtc tccactgtcc ctgccagtga ccctgggaga tccagcttcc 60
atcagctgcc gctccagcca gagcatcgtg cattctaacg gcaataccta cctggagtgg 120
tatcagcaga agcctggcca gtccccacag ctgctgatct acacagtgtc caacaggttc 180
agcggcgtgc ccgaccggtt ttctggctcc ggcagcggca ccgatttcac actgaagatc 240
tctagggtgg aggccgagga cctgggcgtg tactattgct tccagggctc ccacctgcca 300
ctgacctttg gcggcggtac caaggtggag atcaag 336
<210> 36 [VL46] [氨基酸]
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL46可变区的氨基酸序列的描述
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37 [VL46] [DNA]
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL46可变区的DNA序列的描述
<400> 37
gatatcgtga tgacacagtc tccactgtcc ctgccagtga ccctgggaga accagcttcc 60
atcagctgcc gctccagcca gagcatcgtg cattctaacg gcaataccta cctggagtgg 120
tatctgcaga agcctggcca gtccccacag ctgctgatct acacagtgtc caacaggttc 180
agcggcgtgc ccgaccggtt ttctggctcc ggcagcggca ccgatttcac actgaagatc 240
tctagggtgg aggccgagga cctgggcgtg tactattgct tccagggctc ccacctgcca 300
ctgacctttg gcggcggtac caaggtggag atcaag 336
<210> 38 [VL47] [氨基酸]
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL47可变区的氨基酸序列的描述
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 39 [VL47] [DNA]
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL47可变区的DNA序列的描述
<400> 39
gatatcgtga tgacacagtc tccactgtcc ctgccagtga ccctgggaga tccagcttcc 60
atcagctgcc gctccagcca gagcatcgtg cattctaacg gcaataccta cctggagtgg 120
tatcagcaga agcctggcca gtccccacag cggctgatct acacagtgtc caacaggttc 180
agcggcgtgc ccgaccggtt ttctggctcc ggcagcggca ccgatttcac actgaagatc 240
tctagggtgg aggccgagga cctgggcgtg tactattgct tccagggctc ccacctgcca 300
ctgacctttg gcggcggtac caaggtggag atcaag 336
<210> 40 [VL48] [氨基酸]
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL48可变的氨基酸序列的描述
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 41 [VL48] [DNA]
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL48可变区的DNA序列的描述
<400> 41
gatatcgtga tgacacagtc tccactgtcc ctgccagtga ccctgggaga tccagcttcc 60
atcagctgcc gctccagcca gaacatcgtg cattctaacg gcaataccta cctggagtgg 120
tatcagcaga agcctggcca gtccccacag ctgctgatct acacagtgtc caacaggttc 180
agcggcgtgc ccgaccggtt ttctggctcc ggcagcggca ccgatttcac actgaagatc 240
tctagggtgg aggccgagga cctgggcgtg tactattgct tccagggctc ccacctgcca 300
ctgacctttg gcggcggtac caaggtggag atcaag 336
<210> 42 [VL50] [氨基酸]
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL50可变的氨基酸序列的描述
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 43 [VL50] [DNA]
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工VL50可变区的DNA序列的描述
<400> 43
gatatcgtga tgacacagtc tccactgtcc ctgccagtga ccctgggaga tccagcttcc 60
atcagctgcc gctccagcca gaacatcgtg cattctaacg gcaataccta cctggagtgg 120
tatcagcaga agcctggcca gtccccaagg ctgctgatct acacagtgtc caacaggttc 180
agcggcgtgc ccgaccggtt ttctggctcc ggcagcggca ccgatttcac actgaagatc 240
tctagggtgg aggccgagga cctgggcgtg tactattgct tccagggctc ccacctgcca 300
ctgacctttg gcggcggtac caaggtggag atcaag 336
<210> 44 [Ta1505: 轻链] [氨基酸]
<211> 238
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 44
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Gly
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 45 [Ta1505: 轻链] [DNA]
<211> 717
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 45
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgggtc cagcagtgat 60
attttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagaa cattgttcat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180
ctgcagaagc caggccagtc tccaaaggtc ctgatataca cagtttccaa ccgattttct 240
ggggtccccg acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc agggttcaca tcttccgctc 360
acgttcggtg gtgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420
atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480
aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540
aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600
agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660
actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717
<210> 46 [Ta1505: 重链] [氨基酸]
<211> 474
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 46
Met Thr Leu Asn Arg Leu Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val
1 5 10 15
Phe Tyr Gln Gly Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
35 40 45
Gly Phe Ala Phe Asn Ser Phe Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val Val His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn
65 70 75 80
Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser
85 90 95
Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys
100 105 110
Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp
115 120 125
Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135 140
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
145 150 155 160
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
195 200 205
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
210 215 220
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
290 295 300
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
305 310 315 320
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
325 330 335
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
340 345 350
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
355 360 365
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
385 390 395 400
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
420 425 430
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
435 440 445
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
450 455 460
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
465 470
<210> 47 [Ta1505: 重链] [DNA]
<211> 1425
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 47
atgacattga acaggctgtt ggggctgaag tgggttttct ttgttgtttt ttatcaaggt 60
gtgcattgtg aggtgcagct tgttgagtct ggtggaggat tggtgcagcc taaagggtca 120
ttgaaactct catgtgcagc ctctggattc gccttcaatt ccttcgccct gaactgggtc 180
cgccaggctc caggaaagtc tttggagtgg gttgttcaca taagaagtaa aactaataat 240
tatgcaacgt tttatgccga ttcagtgaaa gacagattca ccgtctccag agatgattca 300
caaagcatgg tctatctgca aatgaacaac ttgaaaactg aagacacagg catatattac 360
tgtgtgagac ggggaccacg agattcctgg tttggttact ggggccaagg gactctggtc 420
actgtctctg cagccaaaac aacagcccca tcggtctatc cactggcccc tgtgtgtgga 480
gatacaactg gctcctcggt gactctagga tgcctggtca agggttattt ccctgagcca 540
gtgaccttga cctggaactc tggatccctg tccagtggtg tgcacacctt cccagctgtc 600
ctgcagtctg acctctacac cctcagcagc tcagtgactg taacctcgag cacctggccc 660
agccagtcca tcacctgcaa tgtggcccac ccggcaagca gcaccaaggt ggacaagaaa 720
attgagccca gagggcccac aatcaagccc tgtcctccat gcaaatgccc agcacctaac 780
ctcttgggtg gaccatccgt cttcatcttc cctccaaaga tcaaggatgt actcatgatc 840
tccctgagcc ccatagtcac atgtgtggtg gtggatgtga gcgaggatga cccagatgtc 900
cagatcagct ggtttgtgaa caacgtggaa gtacacacag ctcagacaca aacccataga 960
gaggattaca acagtactct ccgggtggtc agtgccctcc ccatccagca ccaggactgg 1020
atgagtggca aggagttcaa atgcaaggtc aacaacaaag acctcccagc gcccatcgag 1080
agaaccatct caaaacccaa agggtcagta agagctccac aggtatatgt cttgcctcca 1140
ccagaagaag agatgactaa gaaacaggtc actctgacct gcatggtcac agacttcatg 1200
cctgaagaca tttacgtgga gtggaccaac aacgggaaaa cagagctaaa ctacaagaac 1260
actgaaccag tcctggactc tgatggttct tacttcatgt acagcaagct gagagtggaa 1320
aagaagaact gggtggaaag aaatagctac tcctgttcag tggtccacga gggtctgcac 1380
aatcaccaca cgactaagag cttctcccgg actccgggta aatga 1425
<210> 48 [嵌合：轻链] [氨基酸]
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工小鼠/人嵌合抗体的轻链的氨基酸序列的描述
<400> 48
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 49 [嵌合：轻链] [DNA]
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工小鼠/人嵌合抗体的轻链的DNA序列的描述
<400> 49
gatatcctga tgacccagac accactgtct ctgcccgtgt ccctgggcga ccaggcttcc 60
atcagctgcc gctccagcca gaacatcgtg cattccaacg gcaataccta cctggagtgg 120
tatctgcaga agcctggcca gagcccaaag gtgctgatct acacagtgag caataggttc 180
tctggcgtgc ccgaccggtt ttctggctcc ggcagcggca ccgatttcac actgaagatc 240
tctagggtgg aggccgagga tctgggcgtg tactattgct tccagggctc ccacctgcca 300
ctgacctttg gcggcggcac aaagctggag ctgaagagga ccgtggctgc tcctagcgtg 360
ttcatctttc ccccttctga cgagcagctg aagtccggca cagcctccgt ggtgtgcctg 420
ctgaacaact tctacccaag agaggccaag gtgcagtgga aggtggataa cgctctgcag 480
tctggcaatt cccaggagag cgtgaccgag caggactcta aggattccac atatagcctg 540
tcttccaccc tgacactgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta tgcttgcgag 600
gtgacccatc agggcctgag ctctcccgtg acaaagtctt ttaaccgcgg cgagtgttga 660
<210> 50 [嵌合：重链] [氨基酸]
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工小鼠/人嵌合抗体的重链的氨基酸序列的描述
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Val His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 51 [嵌合：重链] [DNA]
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工小鼠/人嵌合抗体的重链的DNA序列的描述
<400> 51
gaagtccagc tggtcgagtc cggggggggc ctggtgcagc ccaagggctc cctgaagctg 60
agctgcgccg cttctggctt cgcctttaac agcttcgctc tgaattgggt gaggcaggcc 120
cctggcaagt ctctggagtg ggtggtgcac atccggtcca agaccaacaa ttacgccaca 180
ttctatgctg acagcgtgaa ggataggttc accgtgtcca gggacgattc ccagagcatg 240
gtgtacctgc agatgaacaa tctgaagacc gaggacacag gcatctacta ttgcgtgagg 300
cggggcccta gagattcttg gttcggctat tggggacagg gcaccctggt gacagtgtcc 360
gccgcctcca ccaagggacc atccgtgttt ccactggctc cctccagcaa gtctacctcc 420
ggaggcacag ccgctctggg atgtctggtg aaggactact tcccagagcc cgtgacagtg 480
tcttggaact ccggcgccct gacctccgga gtgcatacat ttccagctgt gctgcagtct 540
tccggcctgt acagcctgag ctctgtggtg accgtgccct ccagctctct gggcacccag 600
acatatatct gcaacgtgaa tcacaagcca tccaatacaa aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gtgataagac ccatacatgc cccccttgtc ctgctccaga gctgctggga 720
ggaccatccg tgttcctgtt tccacccaag cctaaggaca ccctgatgat ctctcgcacc 780
cccgaggtga catgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accccgaggt gaagtttaac 840
tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gctaagacca agccaaggga ggagcagtac 900
aactccacct atcgggtggt gagcgtgctg acagtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaggagtata agtgcaaggt gagcaataag gccctgcccg ctcctatcga gaagaccatc 1020
tctaaggcca agggccagcc tagagagcca caggtgtaca cactgcctcc aagccgcgac 1080
gagctgacca agaaccaggt gtctctgaca tgtctggtga agggcttcta tccttccgat 1140
atcgctgtgg agtgggagag caatggccag ccagagaaca attacaagac cacaccccct 1200
gtgctggaca gcgatggctc tttctttctg tattctaagc tgaccgtgga taagtccagg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgttct gtgatgcacg aagccctgca caatcattac 1320
acccagaaga gcctgagcct gtcacctggt tga 1353
<210> 52 [人Ig κ: CL] [氨基酸]
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 53 [人Ig κ: CL] [DNA]
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
cggaccgtgg ccgctccttc cgtgttcatc tttcccccta gcgacgagca gctgaagtct 60
ggcacagcta gcgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag 120
tggaaggtgg acaatgccct gcagagcggc aacagccagg aaagcgtgac cgagcaggac 180
agcaaggact ccacctacag cctgagcagc accctgacac tgagcaaggc cgactacgag 240
aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc caccagggcc tgtctagccc cgtgaccaag 300
agcttcaacc ggggcgagtg c 321
<210> 54 [人Ig γ1: CH] [氨基酸]
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 55 [人Ig γ1: CH] [DNA]
<211> 987
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
gctagcacca agggcccatc cgtgtttcca ctggctccca gctctaagag cacctctgga 60
ggcacagccg ctctgggatg tctggtgaag gattacttcc cagagcccgt gacagtgtct 120
tggaactccg gcgccctgac ctccggagtg cacacatttc cagctgtgct gcagtccagc 180
ggcctgtaca gcctgtcttc cgtggtgacc gtgcccagct cttccctggg cacccagaca 240
tatatctgca acgtgaatca caagccatcc aatacaaagg tggacaagaa ggtggagccc 300
aagagctgtg ataagaccca tacatgcccc ccttgtcctg ctccagagct gctgggagga 360
ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaggacaccc tgatgatctc tcggaccccc 420
gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa gtttaactgg 480
tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgct aagaccaagc caagggagga gcagtacaat 540
tccacctatc gggtggtgag cgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 600
gagtataagt gcaaggtgag caataaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatctct 660
aaggccaagg gccagcctag agagccacag gtgtacacac tgcctccatc ccgcgacgag 720
ctgaccaaga accaggtgag cctgacatgt ctggtgaagg gcttctatcc tagcgatatc 780
gctgtggagt gggagtctaa tggccagcca gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 840
ctggacagcg atggctcttt ctttctgtat tctaagctga ccgtggataa gtccaggtgg 900
cagcagggca acgtgttttc ctgtagcgtg atgcatgagg ctctgcacaa tcattacaca 960
cagaagtctc tgtccctgag ccctggc 987
<210> 56 [人Ig κ: 信号肽] [氨基酸]
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Ser Gly Ala Arg Cys
20
<210> 57 [人Ig κ: 信号肽] [DNA]
<211> 66
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
atggacatga gggtccctgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct ctcaggtgcc 60
agatgt 66
<210> 58 [人Ig γ1: 信号肽] [氨基酸]
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 59 [人Ig γ1: 信号肽] [DNA]
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
atggagttgg gactgagctg gattttcctt ttggctattt taaaaggtgt ccagtgt 57
<210> 60 [S413, Non P] [氨基酸]
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工肽S413的氨基酸序列的描述
<400> 60
Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val
1 5 10 15
Asp
<210> 61 [pS46] [氨基酸]
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化 肽pS46的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 磷酸化
<400> 61
Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln Thr
1 5
<210> 62 [pS199] [氨基酸]
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化肽pS199的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 磷酸化
<400> 62
Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Cys
1 5 10
<210> 63 [pS202] [氨基酸]
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化肽pS202的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 磷酸化
<400> 63
Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Cys
1 5 10
<210> 64 [pT212/pS214] [氨基酸]
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化肽pT212/pS214的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 磷酸化
<400> 64
Gly Cys Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
20 25
<210> 65 [pT217] [氨基酸]
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化肽pT217 的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 磷酸化
<400> 65
Gly Cys Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr
1 5 10 15
Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val
20 25
<210> 66 [pT231] [氨基酸]
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化肽pT231的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 磷酸化
<400> 66
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
1 5 10
<210> 67 [pS396/pS400/pS404] [氨基酸]
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化肽pS396/pS400/pS404的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> 磷酸化
<400> 67
Gly Cys Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile
1 5 10 15
Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu
20 25 30
<210> 68 [pS412] [氨基酸]
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化肽pS412的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 磷酸化
<400> 68
Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Cys
1 5
<210> 69 [S413] [氨基酸]
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工肽S413的氨基酸序列的描述
<400> 69
Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val
1 5 10 15
Asp
<210> 70 [4R2N Tau-His6] [氨基酸]
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工肽4R2N Tau-His6的氨基酸序列的描述
<400> 70
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu His His His His His His
435 440 445
<210> 71 [4R2N Tau-His6] [DNA]
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工DNA 4R2N Tau-His6的DNA序列的描述
<400> 71
atggctgagc cccgccagga gttcgaagtg atggaagatc acgctgggac gtacgggttg 60
ggggacagga aagatcaggg gggctacacc atgcaccaag accaagaggg tgacacggac 120
gctggcctga aagaatctcc cctgcagacc cccactgagg acggatctga ggaaccgggc 180
tctgaaacct ctgatgctaa gagcactcca acagcggaag atgtgacagc acccttagtg 240
gatgagggag ctcccggcaa gcaggctgcc gcgcagcccc acacggagat cccagaagga 300
accacagctg aagaagcagg cattggagac acccccagcc tggaagacga agctgctggt 360
cacgtgaccc aagctcgcat ggtcagtaaa agcaaagacg ggactggaag cgatgacaaa 420
aaagccaagg gggctgatgg taaaacgaag atcgccacac cgcggggagc agcccctcca 480
ggccagaagg gccaggccaa cgccaccagg attccagcaa aaaccccgcc cgctccaaag 540
acaccaccca gctctggtga acctccaaaa tcaggggatc gcagcggcta cagcagcccc 600
ggctccccag gcactcccgg cagccgctcc cgcaccccgt cccttccaac cccacccacc 660
cgggagccca agaaggtggc agtggtccgt actccaccca agtcgccgtc ttccgccaag 720
agccgcctgc agacagcccc cgtgcccatg ccagacctga agaatgtcaa gtccaagatc 780
ggctccactg agaacctgaa gcaccagccg ggaggcggga aggtgcagat aattaataag 840
aagctggatc ttagcaacgt ccagtccaag tgtggctcaa aggataatat caaacacgtc 900
ccgggaggcg gcagtgtgca aatagtctac aaaccagttg acctgagcaa ggtgacctcc 960
aagtgtggct cattaggcaa catccatcat aaaccaggag gtggccaggt ggaagtaaaa 1020
tctgagaagc ttgacttcaa ggacagagtc cagtcgaaga ttgggtccct ggacaatatc 1080
acccacgtcc ctggcggagg aaataaaaag attgaaaccc acaagctgac cttccgcgag 1140
aacgccaaag ccaagacaga ccacggggcg gagatcgtgt acaagtcgcc agtggtgtct 1200
ggggacacgt ctccacggca tctcagcaat gtctcctcca ccggcagcat cgacatggta 1260
gactcgcccc agctcgccac gctagctgac gaggtgtctg cctccctggc caagcagggt 1320
ttgcatcacc accaccacca ctga 1344
<210> 72 [GSK3 β] [氨基酸]
<211> 433
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala Glu Ser Cys Lys Pro
1 5 10 15
Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys Val Ser Arg Asp Lys
20 25 30
Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro
35 40 45
Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn
50 55 60
Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu
65 70 75 80
Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp Lys Arg Phe Lys Asn Arg
85 90 95
Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu
100 105 110
Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu
115 120 125
Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg
130 135 140
His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu
145 150 155 160
Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly
165 170 175
Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp
180 185 190
Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val
195 200 205
Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala
210 215 220
Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val
225 230 235 240
Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile
245 250 255
Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val
260 265 270
Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr
275 280 285
Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Asp
290 295 300
Ser Ser Gly Thr Gly His Phe Thr Ser Gly Val Arg Val Phe Arg Pro
305 310 315 320
Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu Leu Glu Tyr
325 330 335
Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala His Ser Phe
340 345 350
Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn Gly Arg Asp
355 360 365
Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser Ser Asn Pro
370 375 380
Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile Gln Ala Ala
385 390 395 400
Ala Ser Thr Pro Thr Asn Ala Thr Ala Ala Ser Asp Ala Asn Thr Gly
405 410 415
Asp Arg Gly Gln Thr Asn Asn Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Asn Ser
420 425 430
Thr
<210> 73 [GSK3 β] [DNA]
<211> 1302
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
atgtcagggc ggcccagaac cacctccttt gcggagagct gcaagccggt gcagcagcct 60
tcagcttttg gcagcatgaa agttagcaga gacaaggacg gcagcaaggt gacaacagtg 120
gtggcaactc ctgggcaggg tccagacagg ccacaagaag tcagctatac agacactaaa 180
gtgattggaa atggatcatt tggtgtggta tatcaagcca aactttgtga ttcaggagaa 240
ctggtcgcca tcaagaaagt attgcaggac aagagattta agaatcgaga gctccagatc 300
atgagaaagc tagatcactg taacatagtc cgattgcgtt atttcttcta ctccagtggt 360
gagaagaaag atgaggtcta tcttaatctg gtgctggact atgttccgga aacagtatac 420
agagttgcca gacactatag tcgagccaaa cagacgctcc ctgtgattta tgtcaagttg 480
tatatgtatc agctgttccg aagtttagcc tatatccatt cctttggaat ctgccatcgg 540
gatattaaac cgcagaacct cttgttggat cctgatactg ctgtattaaa actctgtgac 600
tttggaagtg caaagcagct ggtccgagga gaacccaatg tttcgtatat ctgttctcgg 660
tactataggg caccagagtt gatctttgga gccactgatt atacctctag tatagatgta 720
tggtctgctg gctgtgtgtt ggctgagctg ttactaggac aaccaatatt tccaggggat 780
agtggtgtgg atcagttggt agaaataatc aaggtcctgg gaactccaac aagggagcaa 840
atcagagaaa tgaacccaaa ctacacagaa tttaaattcc ctcaaattaa ggcacatcct 900
tggactaagg attcgtcagg aacaggacat ttcacctcag gagtgcgggt cttccgaccc 960
cgaactccac cggaggcaat tgcactgtgt agccgtctgc tggagtatac accaactgcc 1020
cgactaacac cactggaagc ttgtgcacat tcattttttg atgaattacg ggacccaaat 1080
gtcaaactac caaatgggcg agacacacct gcactcttca acttcaccac tcaagaactg 1140
tcaagtaatc cacctctggc taccatcctt attcctcctc atgctcggat tcaagcagct 1200
gcttcaaccc ccacaaatgc cacagcagcg tcagatgcta atactggaga ccgtggacag 1260
accaataatg ctgcttctgc atcagcttcc aactccacct ga 1302
<210> 74 [His6-Tau 4R0N] [氨基酸]
<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工Tau肽4R0N的氨基酸序列的描述
<400> 74
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu
20 25 30
Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly
35 40 45
Tyr Thr Met His Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys
50 55 60
Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly
85 90 95
Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys
100 105 110
Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala
115 120 125
Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro
130 135 140
Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser
145 150 155 160
Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser
165 170 175
Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg
180 185 190
Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala
195 200 205
Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser
210 215 220
Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile
225 230 235 240
Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys
245 250 255
Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr
260 265 270
Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly
275 280 285
Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu
290 295 300
Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp
305 310 315 320
Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His
325 330 335
Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala
340 345 350
Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg
355 360 365
His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser
370 375 380
Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys
385 390 395 400
Gln Gly Leu
<210> 75 [1xP] [氨基酸]
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化肽1xP的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 磷酸化
<400> 75
Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp
1 5 10 15
Met Val Asp Ser Pro Cys
20
<210> 76 [3xP] [氨基酸]
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工磷酸化肽3xP的氨基酸序列的描述
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 磷酸化
<400> 76
Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp
1 5 10 15
Met Val Asp Ser Pro Cys
20
<210> 77 [Non P] [氨基酸]
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工肽Non P的氨基酸序列的描述
<400> 77
Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp
1 5 10 15
Met Val Asp Ser Pro Cys
20
<210> 78
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 4x磷酸化肽
<400> 78
Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Pro Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr
1 5 10 15
Pro Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Pro Ser Thr Gly Ser Ile
20 25 30
Asp Met Val Asp Pro Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
35 40 45
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
50 55
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人κ轻恒定区
<400> 79
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 80
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人λ轻恒定区
<400> 80
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL00-小鼠, VL-CDR1
<400> 81
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL00-小鼠, VL-CDR2
<400> 82
Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL00-小鼠, VL-CDR3
<400> 83
Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 84
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL00-小鼠, VL
<400> 84
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 85
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL00-小鼠, 轻链
<400> 85
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL00-小鼠, VH-CDR1
<400> 86
Ser Phe Ala Leu Asn
1 5
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL00-小鼠, VH-CDR2
<400> 87
His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL00-小鼠, VH-CDR3
<400> 88
Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 89
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL00-小鼠, VH
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Val His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 90
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL00-小鼠, 重链
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Val His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
355 360 365
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
370 375 380
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
405 410 415
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
420 425 430
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46, VL-CDR1
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Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 92
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL47, VL-CDR1
<400> 92
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_G34A, VL-CDR1
<400> 93
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Ser Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 95
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Thr Asn Thr Tyr Leu Glu
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_N33Q_G34A, VL-CDR1
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Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Gln Ala Asn Thr Tyr Leu Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_N33D, VL-CDR1
<400> 98
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 99
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_N33S, VL-CDR1
<400> 99
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 100
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_N33T, VL-CDR1
<400> 100
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 101
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_G34A_S28N, VL-CDR1
<400> 102
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 103
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46, VL
<400> 103
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 104
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL47, VL
<400> 104
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 105
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_G34A, VL
<400> 105
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 106
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_G34S, VL
<400> 106
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Ser Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 107
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_G34T, VL
<400> 107
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Thr Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 108
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_N33Q, VL
<400> 108
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 109
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_N33Q_G34A, VL
<400> 109
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Gln Ala Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 110
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_N33D, VL
<400> 110
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 111
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_N33S, VL
<400> 111
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 112
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_N33T, VL
<400> 112
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 113
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_S28N, VL
<400> 113
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 114
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VL46_G34A_S28N, VL
<400> 114
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 115
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VH11或Ta1505-VH65, VH-CDR2
<400> 115
His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 116
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VH11, VH
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 117
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ta1505-VH65, VH
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Val His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_P01857, 主链
<400> 118
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 119
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_P01857_L234A_L235A, 主链
<400> 119
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1 5 10 15
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35 40 45
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 120
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_P01857_ L234A_L235A_D265S, 主链
<400> 120
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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100 105 110
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
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290 295 300
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 121
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_P01857_YTE, 主链
<400> 121
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 122
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_P01857_N297A, 主链
<400> 122
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 123
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_P01857_N297Q, 主链
<400> 123
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 124
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG2_P01859, 主链
<400> 124
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 125
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG4_P01861, 主链
<400> 125
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 126
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG4_P01861_S228P, 主链
<400> 126
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 127
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hu VL46 / VH11 G34A S28N IgG1或hu VL46 / VH11 G34A S28N
IgG4-S228P, 轻链
<400> 127
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 128
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hu VL46 / VH11 G34A S28N IgG1, 重链
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 129
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hu VL46 / VH11 G34A S28N IgG4-S228P, 重链
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 130
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化变体轻链, L1
<400> 130
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 131
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化变体轻链, L2
<400> 131
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ser His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 132
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化变体轻链, L3
<400> 132
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ser His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 133
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化变体重链, H1
<400> 133
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 134
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化变体重链, H2
<400> 134
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 135
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IgG1 wt重恒定结构域
<400> 135
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 136
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_P01857_L234A_L235A重恒定结构域
<400> 136
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 137
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_ P01857_L234A_L235A_D265S重恒定结构域
<400> 137
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 138
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_YTE重恒定结构域
<400> 138
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 139
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_N297A重恒定结构域
<400> 139
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 140
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人_IgG1_N297Q重恒定结构域
<400> 140
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1 5 10 15
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20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 141
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人重恒定链野生型IgG2
<400> 141
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
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130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
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Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 142
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IgG4野生型重恒定链
<400> 142
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65 70 75 80
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
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305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 143
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IgG4 S228P重恒定结构域
<400> 143
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
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195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H11 HC IgG1
<400> 144
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 145
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H11 人_IgG1_L234A_L235A
<400> 145
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 146
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H11 人_IgG1_ L234A_L235A_D265S
<400> 146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ser Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 147
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H11 人_IgG1_YTE_(M252Y_S254T_T256E)
<400> 147
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
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Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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225 230 235 240
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275 280 285
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290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 148
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H11 人_IgG1_N297A
<400> 148
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Arg Gly Pro Arg Asp Ser Trp Phe Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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275 280 285
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Val His Ile Arg Ser Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala
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Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
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<211> 218
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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85 90 95
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165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL46_G34S κ
<400> 168
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 185
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL46_G34A_S28N λ
<400> 185
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
130 135 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种抗pSer413 tau抗体，其包含：
a)选自SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117的重可变结构域；以及
b)选自SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQID NO:113和SEQ ID NO:103的轻可变结构域。
2.一种抗pSer413 tau抗体，其包含：
a)选自SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117的重可变结构域；以及
b)选自SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQID NO:113和SEQ ID NO:103的轻可变结构域；其中所述抗体对SEQ ID NO:8的磷酸化肽的结合亲和力与所述抗体对SEQ ID NO:69的非磷酸化肽的结合亲和力的比率为至少约40。
3.根据任一前述权利要求所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:143的重恒定结构域。
4.根据任一前述权利要求所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:79和SEQ ID NO:80的轻恒定结构域。
5.根据任一前述权利要求所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述可变轻结构域具有SEQID NO:114，并且所述可变重结构域具有SEQ ID NO:116。
6.根据权利要求5所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述抗体的轻链具有SEQ ID NO:184，并且所述抗体的重链具有SEQ ID NO:144。
7.根据权利要求5所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述轻链具有SEQ ID NO:184，并且所述抗体的重链具有SEQ ID NO:152。
8.根据任一前述权利要求所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述重链和所述轻链选自以下对：LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:144；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:145；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:146；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:147；LC SEQID NO:184和HC SEQ ID NO:148；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:149；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:150；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:151；LC SEQ ID NO:184和HCSEQ ID NO:152；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:153；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ IDNO:154；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:155；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:156；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:157；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:158；LC SEQID NO:184和HC SEQ ID NO:159；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:160；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:161；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:144；LC SEQ ID NO:185和HCSEQ ID NO:145；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:146；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ IDNO:147；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:148；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:149；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:150；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:151；LC SEQID NO:185和HC SEQ ID NO:152；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:153；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:154；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:155；LC SEQ ID NO:185和HCSEQ ID NO:156；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:157；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ IDNO:158；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:159；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:160以及LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:161。
9.一种核酸组合物，其包含：
a)编码选自SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ IDNO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ IDNO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:185的轻链的第一核酸；以及
b)编码选自SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ IDNO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ IDNO:159、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161的重链的第二核酸。
10.一种表达载体组合物，其包含根据权利要求9所述的核酸组合物，其中所述第一核酸包含在第一表达载体中，并且所述第二核酸包含在第二表达载体中。
11.一种表达载体组合物，其包含根据权利要求9所述的核酸组合物，其中所述第一核酸和所述第二核酸包含在表达载体中。
12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求10或11的所述表达载体组合物。
13.一种制备抗pSer413 tau抗体的方法，所述方法包括在其中表达所述抗体的条件下培养根据权利要求12所述的宿主细胞并回收所述抗体。
14.一种治疗对象的tau蛋白病的方法，所述方法包括向所述对象施用根据权利要求1至8中任一项所述的抗pSer413 tau抗体。
15.一种抗pSer413 tau抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:86的vhCDR1、含有SEQ ID NO:115的vhCDR2和含有SEQ ID NO:88的vhCDR3；以及
b)轻链可变结构域，其包含选自由以下组成的组的一组vlCDR：
i)包含SEQ ID NO:102的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
ii)包含SEQ ID NO:91的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
iii)包含SEQ ID NO:92的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
iv)包含SEQ ID NO:93的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
v)包含SEQ ID NO:94的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
vi)包含SEQ ID NO:95的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
vii)包含SEQ ID NO:96的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
viii)包含SEQ ID NO:97的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
ix)包含SEQ ID NO:98的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
x)包含SEQ ID NO:99的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
xi)包含SEQ ID NO:100的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；以及
xii)包含SEQ ID NO:101的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3。
16.一种抗pSer413 tau抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:86的vhCDR1、含有SEQ ID NO:115的vhCDR2和含有SEQ ID NO:88的vhCDR3；以及
b)轻链可变结构域，其包含选自由以下组成的组的一组vlCDR：
i)包含SEQ ID NO:102的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
ii)包含SEQ ID NO:91的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
iii)包含SEQ ID NO:92的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
iv)包含SEQ ID NO:93的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
v)包含SEQ ID NO:94的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
vi)包含SEQ ID NO:95的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
vii)包含SEQ ID NO:96的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
viii)包含SEQ ID NO:97的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
ix)包含SEQ ID NO:98的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
x)包含SEQ ID NO:99的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
xi)包含SEQ ID NO:100的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；以及
xii)包含SEQ ID NO:101的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
其中所述抗体对SEQ ID NO:8的所述磷酸化肽的结合亲和力与所述抗体对SEQ ID NO:69的所述非磷酸化肽的结合亲和力的比率为至少约40。
17.一种人源化抗体或其片段或衍生物，其引起与至少在对应于SEQ ID NO:1的Ser413的氨基酸残基上磷酸化的tau蛋白或tau肽的抗原-抗体反应。
18.根据权利要求17所述的人源化抗体或其片段或衍生物，其具有1.86×10-8M或更小的对于所述tau蛋白或tau肽的平衡解离常数。
19.根据权利要求17或18所述的人源化抗体或其片段或衍生物，与非磷酸化tau蛋白或tau肽相比，所述人源化抗体或其片段或衍生物与所述磷酸化tau蛋白或tau肽具有改善的选择性亲和力。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的人源化抗体或其片段或衍生物，其在施用于血液中时具有改善的进入脑的能力。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的人源化抗体或其片段或衍生物，其包含：与序列1M(SEQ ID NO:10)具有80％或更高同源性的氨基酸序列作为可变重互补决定区(vhCDR)vhCDR1序列；与序列2M(SEQ ID NO:11)或2H1(SEQ ID NO:12)具有84％或更高同源性的氨基酸序列作为vhCDR2序列；与序列3M(SEQ ID NO:13)具有80％或更高同源性的氨基酸序列作为vhCDR3序列；与序列4L1(SEQ ID NO:14)或4M(SEQ ID NO:15)具有87％或更高同源性的氨基酸序列作为vlCDR1序列；与序列5M(SEQ ID NO:16)具有85％或更高同源性的氨基酸序列作为vlCDR2序列；以及与序列6M(SEQ ID NO:17)具有77％或更高同源性的氨基酸序列作为vlCDR3序列。
22.根据权利要求17至20中任一项所述的人源化抗体或其片段或衍生物，其包含：序列1M(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列作为vhCDR1序列；序列2H1(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列或与序列2H1(SEQ ID NO:12)不同在于位置15处的Ala被Asp取代的氨基酸序列作为vhCDR2序列；序列3M(SEQ)ID NO:13)的氨基酸序列作为vhCDR3序列；序列4L1(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或与序列4L1(SEQ ID NO:14)不同在于位置5处的Ser被Asn取代的氨基酸序列作为vlCDR1序列；序列5M(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列作为vlCDR2序列；以及序列6M(SEQ IDNO:17)的氨基酸序列作为vlCDR3序列。
23.根据权利要求21或22所述的人源化抗体或其片段或衍生物，其包含：
(a)1M(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列作为vhCDR1序列；
2H1(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列作为vhCDR2序列；
3M(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列作为vhCDR3序列；
4L1(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列作为vlCDR1序列；
5M(SEQ ID NO:16)的氨基酸酸序列作为vlCDR2序列；以及
6M(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列为作为vlCDR3序列，或
(b)1M(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列作为vhCDR1序列；
2H1(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列作为vhCDR2序列；
3M(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列作为vhCDR3序列；
4M(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列作为vlCDR1序列；
5M(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列作为vlCDR2序列；以及
6M(SEQ ID NO:17)氨基酸序列作为vlCDR3序列，或
(c)1M(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列作为vhCDR1序列；
2M(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列作为vhCDR2序列；
3M(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列作为vhCDR3序列；
4M(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列作为vlCDR1序列；
5M(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列作为vlCDR2序列；以及
6M(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列作为vlCDR3序列。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的人源化抗体或其片段或衍生物，其包含：
与选自序列VH11、VH12、VH47、VH61、VH62、VH64和VH65的序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列作为重链可变区；以及
与选自序列VL15、VL36、VL46、VL47、VL48和VL50的序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列作为轻链可变区。
25.根据权利要求17至23中任一项所述的人源化抗体或其片段或衍生物，其包含：
序列VH65的氨基酸序列或与序列VH65不同在于包含选自由以下组成的组的一个或多个取代的氨基酸序列作为重链可变区：
位置28(Kabat编号：H28)处Thr对Ala的取代，
位置30(Kabat编号：H30)处Ser对Asn的取代，
位置49(Kabat编号：H49)处Gly对Val的取代，
位置64(Kabat编号：H61)处Asp对Ala的取代，和
位置78(Kabat编号：H75)处Lys对Gln的取代；以及
序列VL47的氨基酸序列或与序列VL47不同在于包含选自由以下组成的组的一个或多个取代的氨基酸序列作为轻链可变区：
位置17(Kabat编号：L17)处Glu对Asp的取代，
位置28(Kabat编号：L27A)处Asn对Ser的取代，
位置42(Kabat编号：L37)处Leu对Gln的取代，
位置50(Kabat编号：L45)处Arg对Gln的取代，和
位置51(Kabat编号：L46)处Leu对Arg的取代。
26.根据权利要求24或25所述的人源化抗体或其片段或衍生物，其包含以下序列组合中的任一种：
(a)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL15；
(b)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL36；
(c)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL46；
(d)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL47；
(e)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL48；
(f)作为重链可变区的序列VH11和作为轻链可变区的序列VL50；
(g)作为重链可变区的序列VH12和作为轻链可变区的序列VL48；
(h)作为重链可变区的序列VH47和作为轻链可变区的序列VL48；
(i)作为重链可变区的序列VH61和作为轻链可变区的序列VL48；
(j)作为重链可变区的序列VH62和作为轻链可变区的序列VL48；
(k)作为重链可变区的序列VH64和作为轻链可变区的序列VL47；
(l)作为重链可变区的序列VH64和序列VL48，以及
(m)作为重链可变区的序列VH65和序列VL47。
27.一种用于治疗或预防痴呆的剂，其包含根据权利要求17至26中任一项所述的人源化抗体或其片段或衍生物。
28.根据权利要求27所述的用于治疗或预防痴呆的剂，其中所述痴呆是tau蛋白病。
29.根据权利要求27所述的用于治疗或预防痴呆的剂，其中所述tau蛋白病是阿尔茨海默病、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、皮克病、嗜银颗粒性痴呆(嗜银颗粒病)、伴有早老性痴呆的多系统性tau蛋白病(MSTD)、与17号染色体相关的额颞叶痴呆及帕金森病(FTDP-17)、伴有神经原纤维缠结的痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结(DNTC)、伴有球状神经胶质包涵体的白质tau蛋白病(WMT-GGI)或具有tau病理学的额颞叶变性(FTLD-tau)。
30.一种药物组合物，其包含根据权利要求17至26中任一项所述的人源化抗体或其片段或衍生物和药学上可接受的载体。
31.一种核酸分子，其编码根据权利要求17至26中任一项所述的人源化抗体或其片段或衍生物的蛋白质。
32.一种载体或质粒，其包含根据权利要求31所述的核酸分子。
33.一种宿主细胞，其用根据权利要求31所述的核酸分子或根据权利要求32所述的载体或质粒转化。
34.根据权利要求33所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞或选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞的真核细胞。
35.一种用于产生根据权利要求17至26中任一项所述的人源化抗体或其片段或衍生物的方法，其包括在适于产生所述人源化抗体或其片段或衍生物的条件下培养根据权利要求33或34所述的宿主细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其还包括从所述宿主细胞中分离所述人源化抗体或其片段或衍生物。

Claims (16)

1.一种抗pSer413 tau抗体，其包含：
a)选自SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117的重可变结构域；以及
b)选自SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQID NO:113和SEQ ID NO:103的轻可变结构域。
2.一种抗pSer413 tau抗体，其包含：
a)选自SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117的重可变结构域；以及
b)选自SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQID NO:113和SEQ ID NO:103的轻可变结构域；其中所述抗体对SEQ ID NO:8的磷酸化肽的结合亲和力与所述抗体对SEQ ID NO:69的非磷酸化肽的结合亲和力的比率为至少约40。
3.根据任一前述权利要求所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:144的重恒定结构域。
4.根据任一前述权利要求所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:79和SEQ ID NO:80的轻恒定结构域。
5.根据任一前述权利要求所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述可变轻结构域具有SEQID NO:114，并且所述可变重结构域具有SEQ ID NO:116。
6.根据权利要求5所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述抗体的轻链具有SEQ ID NO:184，并且所述抗体的重链具有SEQ ID NO:144。
7.根据权利要求5所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述轻链具有SEQ ID NO:184，并且所述抗体的重链具有SEQ ID NO:152。
8.根据任一前述权利要求所述的抗pSer413 tau抗体，其中所述重链和所述轻链选自以下对：LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:144；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:145；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:146；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:147；LC SEQID NO:184和HC SEQ ID NO:148；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:149；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:150；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:151；LC SEQ ID NO:184和HCSEQ ID NO:152；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:153；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ IDNO:154；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:155；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:156；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:157；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:158；LC SEQID NO:184和HC SEQ ID NO:159；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:160；LC SEQ ID NO:184和HC SEQ ID NO:161；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:144；LC SEQ ID NO:185和HCSEQ ID NO:145；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:146；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ IDNO:147；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:148；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:149；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:150；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:151；LC SEQID NO:185和HC SEQ ID NO:152；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:153；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:154；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:155；LC SEQ ID NO:185和HCSEQ ID NO:156；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:157；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ IDNO:158；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:159；LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:160以及LC SEQ ID NO:185和HC SEQ ID NO:161。
9.一种核酸组合物，其包含：
a)编码选自SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ IDNO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ IDNO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:185的轻链的第一核酸；以及
b)编码选自SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ IDNO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ IDNO:159、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161的重链的第二核酸。
10.一种表达载体组合物，其包含根据权利要求9所述的核酸组合物，其中所述第一核酸包含在第一表达载体中，并且所述第二核酸包含在第二表达载体中。
11.一种表达载体组合物，其包含根据权利要求9所述的核酸组合物，其中所述第一核酸和所述第二核酸包含在表达载体中。
12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求10或11的所述表达载体组合物。
13.一种制备抗pSer413 tau抗体的方法，所述方法包括在其中表达所述抗体的条件下培养根据权利要求12所述的宿主细胞并回收所述抗体。
14.一种治疗对象的tau蛋白病的方法，所述方法包括向所述对象施用根据权利要求1至8中任一项所述的抗pSer413 tau抗体。
15.一种抗pSer413 tau抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:86的vhCDR1、含有SEQ ID NO:115的vhCDR2和含有SEQ ID NO:88的vhCDR3；以及
b)轻链可变结构域，其包含选自由以下组成的组的一组vlCDR：
i)包含SEQ ID NO:102的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
ii)包含SEQ ID NO:91的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
iii)包含SEQ ID NO:92的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
iv)包含SEQ ID NO:93的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
v)包含SEQ ID NO:94的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
vi)包含SEQ ID NO:95的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
vii)包含SEQ ID NO:96的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
viii)包含SEQ ID NO:97的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
ix)包含SEQ ID NO:98的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
x)包含SEQ ID NO:99的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
xi)包含SEQ ID NO:100的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；以及
xii)包含SEQ ID NO:101的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3。
16.一种抗pSer413 tau抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:86的vhCDR1、含有SEQ ID NO:115的vhCDR2和含有SEQ ID NO:88的vhCDR3；以及
b)轻链可变结构域，其包含选自由以下组成的组的一组vlCDR：
i)包含SEQ ID NO:102的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
ii)包含SEQ ID NO:91的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
iii)包含SEQ ID NO:92的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
iv)包含SEQ ID NO:93的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
v)包含SEQ ID NO:94的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
vi)包含SEQ ID NO:95的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
vii)包含SEQ ID NO:96的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
viii)包含SEQ ID NO:97的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
ix)包含SEQ ID NO:98的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
x)包含SEQ ID NO:99的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
xi)包含SEQ ID NO:100的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；以及
xii)包含SEQ ID NO:101的vlCDR1、包含SEQ ID NO:82的vlCDR2和包含SEQ ID NO:83的vlCDR3；
其中所述抗体对SEQ ID NO:8的所述磷酸化肽的结合亲和力与所述抗体对SEQ ID NO:69的所述非磷酸化肽的结合亲和力的比率为至少约40。
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