BR112019016490A2 - anticorpo humanizado para tratar ou prevenir distúrbios cognitivos, processo para produzir o mesmo e agente para tratar ou prevenir distúrbios cognitivos com o uso do mesmo - Google Patents

Abstract

a invenção fornece métodos para uso e composições de anticorpos humanizados que ligam a proteína tau que é fosforilada na serina na posição 413.

Description

ANTICORPO HUMANIZADO PARA TRATAR OU PREVENIR DISTÚRBIOS COGNITIVOS, PROCESSO PARA PRODUZIR O MESMO E AGENTE PARA TRATAR OU PREVENIR DISTÚRBIOS COGNITIVOS COM O USO DO MESMO

I. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido JP n² 2017-035594, depositado em 27 de fevereiro de 2017, cujo conteúdo está expressamente incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

II. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e está assim incorporada a título de referência, em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 27 de fevereiro de 2018, é nomeada 063785-06-5002-WG-SeqLstg-_ST25.txt e tem 323.584 bytes de tamanho.

III. CAMPO DA TÉCNICA [003] A presente invenção se refere a um anticorpo humanizado para uso no tratamento terapêutico ou profilático de distúrbios cognitivos, um processo para produzir o anticorpo humanizado, um agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos usando o anticorpo, e métodos para tratamento ou prevenção de distúrbios cognitivos usando os agentes terapêuticos divulgados na presente invenção. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um anticorpo humanizado anti-tau fosforilada inovador que tem efeito excelente de melhoramento da função cognitiva, um processo para produzir o anticorpo humanizado, um agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos que contêm o anticorpo humanizado, e métodos para tratamento ou prevenção de distúrbios cognitivos usando o anticorpo humanizado anti-tau fosforilada .

IV. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [004] Um distúrbio cognitivo, ou demência, é uma condição em que a

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2/132 inteligência desenvolvida se deteriora devido a alguma causa adquirida, resultando em um obstáculo para a adaptação social. Os distúrbios cognitivos são classificados como doenças neurodegenerativas, doenças cognitivas vasculares, doenças priônicas, doenças infecciosas, doenças metabólicas/endócrinas, trauma e doenças cirúrgicas cerebrais, e doenças tóxicas (consultar Toshifumi Kishimoto & Shigeki Takahashi (Edit.), STEP Series Seishinka (documento japonês), 2^a edição, Kaibashobo, 2008, páginas 103-104). Existem cerca de 2,1 milhões de pacientes com demência no Japão em 2010, com uma taxa de prevalência de morbidade de cerca de 8 a 10%, ou até mais de 10%, entre os idosos acima de 65 anos de idade, e isto tem sido reconhecido como um problema grave na sociedade envelhecida mundial (Takashi Asada, Igaku no Ayumi (documento japonês), volume suplementar, Cognitive disorders, Ishiyaku Publishing, 2011, páginas 5-10). Os dados sobre doenças subjacentes de distúrbios cognitivos indicam que a maior parte são doenças neurodegenerativas como doença de Alzheimer (AD) e degeneração lobar frontotemporal (FTLD), com cerca de 35% sendo AD, cerca de 15% sendo uma combinação de AD e doença cerebrovascular, e 5% sendo FTLD (Id.) Os distúrbios cognitivos associados a doenças neurodegenerativas são caracterizados por início insidioso de comprometimento da memória e/ou mudanças de personalidade que progride ao longo de um período de pelo menos seis meses ou mais. Os processos neurodegenerativos se correlacionam fortemente com o grau de comprometimento da função cognitiva, e uma característica consistente envolvida no mesmo é a presença de emaranhados neurofibrilares (NFT) (Alistair Burns et al. (Edit.), Dementia, 3^a Edição, 2005, CRC Press, páginas 408-464).

[005] A proteína tau é uma proteína codificada pelo gene MAPT, que está situado no cromossomo 17 (17q21) no genoma humano. A proteína tau é uma das proteínas de ligação de microtúbulo abundantemente expressa no sistema

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3/132 nervoso central. A tau foi constatada como sendo uma proteína constituinte principal nos filamentos helicoidais pareados e filamentos retos que formam NFT em AD, uma das doenças neurodegenerativas mais proeminentes, e seu acúmulo intracelular foi demonstrado em uma variedade de condições neuropatológicas.

[006] Tau foi primeiramente implicada em doenças neurodegenerativas com base na relação entre mutações no gene MAPT e acúmulo de tau em demência frontotemporal ligada ao cromossomo 17 com Parkinsonismo (FTDP17). Mais de 40 mutações de gene no gene MAPT foram relatadas em relação a FTDP-17 (Tetsuaki Arai, Shinkei Naika (documento japonês), Vol.72, número especial, (Sup.6), 2010, páginas 46-51). Estas mutações de gene são sugeridas como alterando as proporções de isoformas de tau ou alterando a estrutura e alterando a interação entre tau mutante e microtúbulos, contribuindo, assim, para o desenvolvimento de patologia. Entretanto, diferente de doenças neurodegenerativas familiares, as mutações em MAPT são raramente observadas em doenças neurodegenerativas esporádicas como AD. Além disso, a tau acumulada em doenças neurodegenerativas é caracterizada por ser altamente modificada via fosforilação. Ademais, em pacientes que exibem deficiência cognitiva ligeira (MCI), uma correlação é observada entre o nível de tau fosforilada no fluido espinhal e o grau de atrofia pituitária, sugerindo a tau fosforilada como um biomarcador altamente confiável para neurodegeneração em pacientes com taupatia (Wendy Noble et al., Expert Opinion on Drug Discovery, 2011, Vol.6, n² 8, páginas 797-810). Com base nestas constatações, foram feitas tentativas para desenvolver um tratamento usando inibidores contra quinases, que são enzimas envolvidas na fosforilação, e particularmente contra GSK-3 beta, para inibir a fosforilação excessiva de tau (Id). Entretanto, existe uma preocupação sobre possíveis efeitos colaterais, uma vez que quinases

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4/132 como GSK-3 beta são implicadas não apenas em condições patológicas, mas também em controles de função em processos fisiológicos normais. De fato, alguns locais em que tau é fosforilada por GSK-3 beta coincidem com locais de fosforilação de tau visto em cérebros humanos normais e fetais (Burnes, et. al., supra) sugerindo a possibilidade que esta estratégia pode afetar a função de tau normal.

[007] Embora se acredite que a tau extracelular se origina do vazamento de células de nervo degeneradas como consequência da morte celular, estudos recentes têm sugerido que após a fosforilação intracelular excessiva, a tau é processada e, então, ativamente secretada para fora da célula. Acredita-se que a tau fosforilada secretada da célula seja desfosforilada em certos sítios de fosforilação e subsequentemente agem em receptores de muscarina Ml e M3 de células circundantes, resultando, assim, em diversos efeitos como promoção da fosforilação de tau intracelular e contribuição para morte celular (Miguel Diaz-Hernandes et al., Journal of Biological Chemistry, 2010, Vol. 285, n² 42, páginas 32539-32548 e Venessa Plouffe et al., PLoS ONE, 2012, Vol.7, página 36873). Os experimentos relacionados à imunoterapia para taupatias usando proteína tau como o alvo foram relatados, como tentativas dirigidas à execução de ação específica contra tau (consulta Noble, supra, Kishimoto, supra, Asada, supra e Burns, supra).

[008] Os maiores sintomas em distúrbios cognitivos humanos são comprometimento da memória e comprometimento da função cognitiva, que é especialmente importante dado o papel da função cognitiva em desempenho, comunicação e julgamento à base de memória. A função motora, por outro lado, embora seja um sintoma encontrado em demência frontotemporal ligada ao cromossomo 17 com Parkinsonismo (FTDP-17) e doença de Alzheimer em estágio terminal, não é necessariamente um sintoma maior exibido em

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5/132 distúrbios cognitivos. Portanto, o problema principal a ser considerado para o tratamento de distúrbios cognitivos é o melhoramento de funções cognitivas. Entretanto, existem atualmente modelos de animal adequados para testar comprometimento da função cognitiva associada à taupatia que permitiríam a identificação de um agente terapêutico ou profilático para tratar distúrbios cognitivos. Além disso, não existe tal agente que exiba efeitos específicos e superiores contra distúrbios cognitivos.

[009] Em vista das aplicações terapêuticas e profiláticas contra distúrbios cognitivos em sujeitos humanos, existe uma demanda por um anticorpo humanizado anti-tau fosforilada que não apenas tem alta afinidade de ligação com tau fosforilada, mas também exibe antigenicidade reduzida para o corpo humano.

V. SUMÁRIO DA INVENÇÃO [010] Neste contexto, entre um número grande de sítios fosforilados na proteína tau que podem se submeter à fosforilação anormal nas condições de doença de Alzheimer, os presentes inventores focalizaram no sítio fosforilado do resíduo de serina na posição 413 (Ser413), e tiveram êxito na produção de um anticorpo de coelho policlonal e um anticorpo de camundongo monoclonal que são específicos para a tau fosforilada em Ser413. Os presentes inventores também administraram os anticorpos de camundongo monoclonais a camundongos de modelo de distúrbios cognitivos que mostraram expressão anormal de proteínas tau fosforiladas, e confirmaram que o melhoramento em funções cognitivas foi observado (WO2013/180238A).

[011] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece proteínas, como anticorpos, que incluem uma porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente à proteína Tau que é fosforilada no resíduo de serina 413 (pS413-Tau). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece ácidos

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6/132 nucleicos que codificam as proteínas. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece células que incluem tais ácidos nucleicos que codificam as proteínas. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para tratar uma taupatia (por exemplo, doença de Alzheimer) mediante a administração das proteínas, ácidos nucleicos, ou células divulgadas na presente invenção a um paciente que necessita do mesmo.

[012] Consequentemente, em alguns aspectos, a invenção fornece um anticorpo humanizado ou um fragmento ou derivado do mesmo, que causa uma reação de antígeno-anticorpo com uma proteína tau ou um peptídeo tau fosforilado pelo menos em um resíduo de aminoácido que corresponde a Ser413 da SEQ ID NO: 1. Em alguns casos, o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo tem uma constante de dissociação de equilíbrio de 1,86 x IO'⁸ M ou menos para a proteína tau ou peptídeo tau.

[013] Em aspectos adicionais, o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo tem uma afinidade seletiva melhorada com a proteína tau fosforilada (ou peptídeo tau, por exemplo, SEQ ID NO:8) em comparação com uma proteína tau não fosforilada (ou peptídeo tau, por exemplo, SEQ ID NO:69).

[014] Em um aspecto adicional, o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo descrito na presente invenção tem uma capacidade melhorada de entrar no cérebro quando administrado no sangue.

[015] Em um aspecto adicional, o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo compreende CDRs conforme exposto a seguir: uma sequência de CDR-H1, uma sequência de aminoácidos que tem 80% ou mais de homologia com a sequência 1M; como uma sequência de CDR-H2, uma sequência de aminoácidos que tem 84% ou mais de homologia com a sequência 2M ou 2H1; como uma sequência de CDR-H3, uma sequência de aminoácidos que tem 80% ou mais de homologia com a sequência 3M; como uma sequência

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7/132 de CDR-L1, uma sequência de aminoácidos que tem 87% ou mais de homologia com a sequência 4L1 ou 4M; como uma sequência de CDR-L2, uma sequência de aminoácidos que tem 85% ou mais de homologia com a sequência 5M; e como uma sequência de CDR-L3, uma sequência de aminoácidos que tem 77% ou mais de homologia com a sequência 6M.

[016] Em um aspecto adicional, o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo compreende CDRs conforme exposto a seguir: como uma sequência de CDR-H1, a sequência de aminoácidos da sequência 1M; como uma sequência de CDR-H2, a sequência de aminoácidos da sequência 2H1 ou uma sequência de aminoácidos se difere da sequência 2H1 pelo fato de que Ala na posição 15 é substituída por Asp; como uma sequência de CDR-H3, a sequência de aminoácidos da sequência 3M; como uma sequência de CDR-L1, a sequência de aminoácidos da sequência 4L1 ou uma sequência de aminoácidos que se difere da sequência 4L1 pelo fato de que Ser na posição 5 é substituída por Asn; como uma sequência de CDR-L2, a sequência de aminoácidos da sequência 5M; e como uma sequência de CDR-L3, a sequência de aminoácidos da sequência 6M.

[017] Em um aspecto adicional, o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo tem CDRs conforme exposto a seguir: (1) como uma sequência de CDR-H1, a sequência de aminoácidos de 1M; como uma sequência de CDR-H2, a sequência de aminoácidos de 2H1; como uma sequência de CDRH3, a sequência de aminoácidos de 3M; como uma sequência de CDR-L1, a sequência de aminoácidos de 4L1; como uma sequência de CDR-L2, a sequência de aminoácidos de 5M; e como uma sequência de CDR-L3, a sequência de aminoácidos de 6M, ou (2) como uma sequência de CDR-H1, a sequência de

aminoácidos	de	1M;	como	uma	sequência	de	CDR-H2,	a	sequência	de
aminoácidos	de	2H1;	como	uma	sequência	de	CDR-H3,	a	sequência	de
aminoácidos	de	3M;	como	uma	sequência	de	CDR-L1,	a	sequência	de

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aminoácidos	de	4M;	como	uma	sequência	de	CDR-L2,	a	sequência	de
aminoácidos	de	5M;	e como uma sequência	de	CDR-L3,	a	sequência	de
aminoácidos de 6M, ou (3) como uma sequência de CDR-H1, a sequência	de
aminoácidos	de	1M;	como	uma	sequência	de	CDR-H2,	a	sequência	de
aminoácidos	de	2M;	como	uma	sequência	de	CDR-H3,	a	sequência	de
aminoácidos	de	3M;	como	uma	sequência	de	CDR-L1,	a	sequência	de
aminoácidos	de	4M;	como	uma	sequência	de	CDR-L2,	a	sequência	de
aminoácidos	de	5M;	e como uma sequência	de	CDR-L3,	a	sequência	de

aminoácidos de 6M.

[018] Em aspectos adicionais, o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo compreende: como uma região variável de cadeia pesada, uma sequência de aminoácidos que tem 90% ou mais de homologia com uma sequência selecionada a partir das sequências VH11, VH12, VH47, VH61, VH62, VH64 e VH65; e como uma região variável de cadeia leve, uma sequência de aminoácidos que tem 90% ou mais de homologia com uma sequência selecionada a partir das sequências VL15, VL36, VL46, VL47, VL48 e VL50.

[019] Em um aspecto adicional, o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo compreende: como uma região variável de cadeia pesada, a sequência de aminoácidos da sequência VH65 ou uma sequência de aminoácidos que se difere da sequência VH65 pelo fato de que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em uma substituição de Ala por Thr na posição 28 (numeração de Kabat: H28), em uma substituição de Asn por Ser na posição 30 (numeração de Kabat: H30), em uma substituição de Vai por Gly na posição 49 (numeração de Kabat: H49), em uma substituição de Ala por Asp na posição 64 (numeração de Kabat: H61) e em uma substituição de Gin por Lys na posição 78 (numeração de Kabat: H75); e como uma região variável de cadeia leve, a sequência de aminoácidos da sequência VL47 ou uma

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9/132 sequência de aminoácidos que se difere da sequência VL47 pelo fato de que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em uma substituição de Asp por Glu na posição 17 (numeração de Kabat: L17), em uma substituição de Ser por Asn na posição 28 (numeração de Kabat: L27A), em uma substituição de Gin por Leu na posição 42 (numeração de Kabat: L37), em uma substituição de Gin por Arg na posição 50 (numeração de Kabat: L45) e em uma substituição de Arg por Leu na posição 51 (numeração de Kabat: L46).

[020] Em um aspecto adicional, o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo compreende qualquer uma das seguintes combinações de sequência: (a) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL15 como uma região variável de cadeia leve; (b) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL36 como uma região variável de cadeia leve; (c) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL46 como uma região variável de cadeia leve; (d) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL47 como uma região variável de cadeia leve; (e) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 como uma região variável de cadeia leve; (f) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL50 como uma região variável de cadeia leve; (g) sequência VH12 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 como uma região variável de cadeia leve; (h) sequência VH47 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 como uma região variável de cadeia leve; (i) sequência VH61 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 como uma região variável de cadeia leve; (j) sequência VH62 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 como uma região variável de cadeia leve; (k) sequência VH64 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL47 como uma região

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10/132 variável de cadeia leve; (I) sequência VH64 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 e (m) sequência VH65 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL47.

[021] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um agente para tratar ou prevenir demência, que compreende o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo, conforme descrito na presente invenção.

[022] Em um aspecto adicional, a invenção fornece métodos e agentes para tratar ou prevenir demência ou uma taupatia, incluindo doença de Alzheimer, degeneração corticobasal, paralisia supranuclear progressiva, doença de Pick, demência por grãos argirofílicos (doença por grãos argirofílicos), taupatia de sistema múltiplo com demência pré-senil (MSTD), demência frontotemporal e Parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), demência com emaranhados neurofibrilares, emaranhado neurofibrilar difuso com calcificação (DNTC), taupatia de substância branca com inclusões gliais globulares (WMTGGI) ou degeneração lobar frontotemporal com patologia de tau (FTLD-tau).

[023] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo, conforme descrito na presente invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[024] Em um aspecto adicional, a invenção fornece anticorpos anti-pSer413 tau que compreendem: a) um domínio variável pesado que compreende uma vhCDRl que compreende SEQ ID NO:86, uma vhCDR2 que compreende SEQ ID NO:115 e uma vhCDR3 que compreende SEQ ID NO:88; e b) um domínio variável leve que compreende um conjunto de vICDRs selecionado a partir do grupo que consiste em: i) uma vICDRl que compreende SEQ ID NQ:102, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; ii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO:91, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID

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NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; iii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO:92, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; iv) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO:93, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82: e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; v) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO:94, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; vi) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO:95, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; vii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO:96, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; viii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO:97, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; ix) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO:98, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; x) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO:99, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; xi) uma vICDRl que compreende SEQ ID NQ:100, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83; e xii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO:101, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO:82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO:83. Em alguns casos, ο anticorpo tem uma razão entre a ligação de anticorpo ao peptídeo fosforilado da SEQ ID NO:8 e a ligação de anticorpo ao peptídeo não fosforilado da SEQ ID NO:69 de pelo menos cerca de 40.

[025] Em aspectos adicionais, a invenção fornece anticorpos anti-pSer413 tau que compreende: a) um domínio variável pesado selecionado a partir de SEQ ID NO:116 e SEQ ID NO:117; e b) um domínio variável leve selecionado a partir de SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID

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N0:112, SEQ ID N0:113 e SEQ ID N0:114. Em alguns casos, o anticorpo tem uma razão entre a ligação de anticorpo ao peptídeo fosforilado da SEQ ID N0:8 e a ligação de anticorpo ao peptídeo não fosforilado da SEQ ID NO:69 de pelo menos cerca de 40.

[026] Em um aspecto adicional, os anticorpos da invenção compreendem um domínio constante pesado selecionado a partir de SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NQ:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142 e SEQ ID NO:144.

[027] Em um aspecto adicional, os anticorpos da invenção compreendem um domínio constante leve selecionado a partir de SEQ ID NO:79 e SEQ ID NQ:80.

[028] Em um aspecto adicional, os anticorpos da invenção compreendem um domínio variável pesado selecionado a partir de SEQ ID NO:116 e SEQ ID NO:117.

[029] Em um aspecto adicional, os anticorpos da invenção compreendem um domínio variável leve selecionado a partir de SEQ ID NQ:103, SEQ ID NQ:104, SEQ ID NQ:105, SEQ ID NQ:106, SEQ ID NQ:107, SEQ ID NQ:108, SEQ ID NQ:109, SEQ ID NQ:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113 e SEQ ID NO:114.

[030] Em um aspecto adicional, os anticorpos compreendem cadeias leve e pesada selecionadas a partir dos pares LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:144; LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:145; LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:146;

LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:147; LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:148;

LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:149; LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NQ:150;

LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:151; LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:152;

LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:153; LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:154;

LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:155; LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:156;

LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:157; LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:158;

LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:159; LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NQ:160;

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LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID N0:161; LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID N0:144;

LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:145; LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:146;

LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:147; LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:148;

LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:149; LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NQ:150;

LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID N0:151; LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:152;

LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:153; LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:154;

LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:155; LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:156;

LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:157; LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:158;

LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:159; LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NQ:160 e LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID N0:161.

[031] Em um aspecto adicional, o anticorpo da invenção tem uma cadeia leve que compreende ou consiste em SEQ ID NO:184 e uma cadeia pesada que compreende ou consiste em SEQ ID NO:144.

[032] Em um aspecto adicional, o anticorpo da invenção tem uma cadeia leve que compreende ou consiste em SEQ ID NO:184 e uma cadeia pesada que compreende ou consiste em SEQ ID NO:152.

[033] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições de ácido nucleico que compreendem: a) um primeiro ácido nucleico que codifica uma cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:169, SEQ ID NQ:170, SEQ ID NO:171, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:179, SEQ ID NQ:180, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:184 e SEQ ID NO:185; e b) um segundo ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NO:144; SEQ ID NO:145; SEQ ID NO:146; SEQ ID NO:147; SEQ ID NO:148; SEQ ID NO:149; SEQ ID NQ:150; SEQ ID NO:151; SEQ ID NO:152; SEQ ID NO:153; SEQ ID NO:154; SEQ ID NO:155; SEQ ID

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NO:156; SEQ ID NO:157; SEQ ID NO:158; SEQ ID NO:159; SEQ ID NQ:160 e SEQ ID N0:161.

[034] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições de vetor de expressão que compreendem um primeiro e um segundo ácido nucleico, em que o primeiro ácido nucleico está contido em um primeiro vetor de expressão e o segundo ácido nucleico está contido em um segundo vetor de expressão.

[035] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composição de vetor de expressão em que o primeiro ácido nucleico e o segundo ácido nucleico estão contidos em um único vetor de expressão.

[036] Em um aspecto adicional, a invenção fornece células hospedeiras que compreendem a composição de vetor de expressão, e métodos para fabricar um anticorpo anti-pSer413 tau que compreende cultivar a célula hospedeira sob condições em que o referido anticorpo é expresso e recuperar o referido anticorpo.

[037] Em um aspecto adicional, a invenção fornece métodos para tratar uma taupatia em um sujeito que compreende administrar os anticorpos da invenção.

VI. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [038] A invenção pode ser mais bem compreendida a partir da seguinte descrição detalhada quando lida em conjunto com os desenhos anexos. Estão incluídas nos desenhos as seguintes figuras:

[039] A Figura IA e a Figura 1B mostram coletivamente um alinhamento de diversas isoformas humanas de proteína Tau, preparado usando ClustaIW.

[040] A Figura 2A mostra um alinhamento de sequências de região variável de cadeia leve, destacando sequências de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, de acordo com o sistema de numeração de Kabat, de várias proteínas de ligação antipS413-Tau, de acordo com algumas modalidades da invenção.

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15/132 [041] A Figura 2B mostra um alinhamento de sequências de região variável de cadeia pesada, destacando sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, de acordo com o sistema de numeração de Kabat, de várias proteínas de ligação anti-pS413-Tau, de acordo com algumas modalidades da invenção.

[042] A Figura 3 ilustra a afinidade de ligação seletiva de vários anticorpos anti-pS413-Tau para peptídeo fosforilado PD17P, em relação ao peptídeo não fosforilado PD17, de acordo com algumas modalidades da invenção.

[043] A Figura 4 ilustra a afinidade de ligação de vários anticorpos antipS413-Tau para Tau fosforilada em homogenato de cérebro a partir de um paciente de Alzheimer, de acordo com algumas modalidades da invenção.

[044] A Figura 5A e a Figura 5B mostram farmacocinética de variantes de anticorpo humanizado em plasma de camundongo ao longo do tempo. A Figura 5A demonstra que cinco variantes de anticorpo humanizado iniciais 2, 5, 6, 9 e 10 exibiram eliminação rápida do plasma de camundongo. A Figura 5B demonstra que três variantes de anticorpo humanizado desenvolvidas posteriormente L15H11, L46H11 e L47H65 exibiram perfis farmacocinéticos comparáveis ao anticorpo quimérico.

[045] A Figura 6A e a Figura 6B mostram variantes de anticorpo humanizado diferentes que têm migração intracerebral diferente. A Figura 6A mostra concentração de diversos anticorpos humanizados em homogenato de cérebro. A Figura 6B mostra a razão entre o nível de anticorpos humanizados representativos no cérebro e o nível dos anticorpos correspondentes no plasma.

[046] A Figura 7A e a Figura 7B mostram o alinhamento de sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve (Figura 7A) e da região variável de cadeia pesada (Figura 7B) de variantes de anticorpo humanizado representativos com o anticorpo de camundongo parental.

[047] As Figuras 8A a Figura 8D demonstram que o anticorpo de

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16/132 camundongo parental (Figuras 8A e 8B) e o anticorpo quimérico (Figuras 8C e 8D) se ligam a um peptídeo fosforilado (Figuras 8A e 8C) mas não à contraparte não fosforilada (Figuras 8B e 8D).

[048] As Figuras 9A a Figura 9C mostram a ligação de variantes de anticorpo humanizado representativas ao peptídeo pS413.

[049] As Figuras 10A a Figura 10E mostram características de ligação comparáveis do anticorpo de camundongo parental (Figura 10A), do anticorpo quimérico (Figura 10B), e variantes de anticorpo humanizado selecionadas (Figuras 10C-10E) à proteína Tau fosforilada em S413 em homogenatos de cérebro de pacientes com doença de Alzheimer.

[050] As Figuras 11A a Figura 11E mostram as regiões variável leve e variável pesada de alguns anticorpos humanizados anti-proteína pSer413 tau da invenção.

[051] A Figura 12 mostra vários domínios constantes de IgG humana diferentes que encontram uso em combinações das cadeias variável leve e variável pesada de anticorpos anti-pSer413 tau. lgGl_humana é o domínio constante (CHl-dobradiça-CH2-CH3) de IgGl do tipo selvagem humana. lgGl_humana_L234A_L235A é o domínio constante (CHl-dobradiça-CH2CH3) de IgGl do tipo selvagem humana com duas substituições de aminoácido, L234A e L235A (às vezes denominada como mutações LALA) que reduzem/neutralizam a função efetora. lgGl_humana_L234A_L235A_D265S é o domínio constante (CHl-dobradiça-CH2-CH3) de IgGl do tipo selvagem humana com três substituições de aminoácido, L234A, L235A e D265S que reduzem/neutralizam a função efetora. lgGl_humana_YTE_ ou lgGl_humana_YTE (M252YS254TT256E) é o domínio constante (CH1dobradiça-CH2-CH3) de IgGl do tipo selvagem humana com três substituições de aminoácido, M252Y, S254T, T256E que aumentam a meia-vida do anticorpo

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17/132 em soro. lgGl_humana_N297A_ é o domínio constante (CHl-dobradiça-CH2CH3) de IgGl do tipo selvagem humana com a substituição de aminoácido N297A, que elimina um sítio de glicosilação e reduz/neutraliza a função efetora. lgGl_humana_N297Q_ é o domínio constante (CHl-dobradiça-CH2-CH3) de IgGl do tipo selvagem humana com a substituição de aminoácido N297Q, que elimina um sítio de glicosilação e reduz/neutraliza a função efetora. _lgG2_humana _ é o domínio constante (CHl-dobradiça-CH2-CH3) de lgG2 do tipo selvagem humana. _lgG4_humana é o domínio constante (CH1dobradiça-CH2-CH3) de lgG4 do tipo selvagem humana. lgG4_humana_S228P_ é o domínio constante (CHl-dobradiça-CH2-CH3) de lgG4 do tipo selvagem humana com uma substituição de aminoácido S228P para impedir a comutação de braço.

[052] A Figura 13 mostra cadeias pesadas de comprimento total para as regiões variáveis Hll e H65 em conjunto com as cadeias principais da Figura 12. Uma barra diagonal (/) indica a junção dos domínios constante e variável, e as CDRs são sublinhadas.

[053] A Figura 14 mostra as cadeias leves de comprimento total para 12 domínios leves variáveis diferentes com os domínios constantes leves humanos kappa ou lambda. Uma barra diagonal (/) indica a junção dos domínios constante e variável, e as CDRs são sublinhadas.

[054] A Figura 15 representa uma matriz de combinações possíveis de cadeias leve e pesada da invenção. Um A na caixa indica que o domínio constante pesado lgGl_humana_ é usado. Um B na caixa indica que o domínio constante pesado lgGl_humana_L234A_L235A é usado. Um C na caixa indica que o domínio constante pesado lgGl_humana_ L234AL235AD265S é usado. Um D na caixa significa que o domínio constante pesado lgGl_humana_YTE_ é usado. Um E na caixa indica que o

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18/132 domínio constante pesado lgGl_humana_N297A_ é usado. Um F na caixa significa que o domínio constante pesado lgGl_humana_N297Q_ é usado. Um G na caixa significa que o domínio constante pesado _lgG2_humana é usado. Um H na caixa significa que o domínio constante pesado _lgG4_humana é usado. Um \ na caixa significa que o domínio constante pesado lgG4_humana S228P é usado. Um J na caixa significa que um domínio constante de IgG 1 humana com a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácido é usado.

VII. DESCRIÇÃO DETALHADA

A. Visão geral [055] A presente invenção fornece anticorpos que incluem uma porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente à proteína Tau que é fosforilada no resíduo de serina 413 (pSer413-Tau). Também são fornecidos ácidos nucleicos que codificam as proteínas, e células que incluem tais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, os métodos e composições fornecidos são usados no tratamento de taupatias (por exemplo, doença de Alzheimer).

[056] O gene MAPT que codifica tau tem sido identificado como consistindo em 13 éxons dispostos no genoma, que podem ser expressos como múltiplas isoformas de proteína diferentes via splicing alternativo (consultar Arai, supra). A proteína tau compreende um domínio ácido N-terminal que contém 0 a 2 sequências repetitivas (N) de 29 aminoácidos dependendo de splicing alternativo de éxon 2 e éxon 3 (N0-N2), um domínio intermediário rico em prolina, e um domínio de ligação de microtúbulo C-terminal (codificado por éxons 9 a 12) que contém 3 (3R) ou 4 (4R) sequências repetitivas (R) que contribuem para a ligação de microtúbulo (Burns, supra e Arai, supra). Portanto, a tau humana tem seis isoformas representativas: 3R0N (352 aminoácidos), 3R1N (381 aminoácidos), 3R2N (410 aminoácidos), 4R0N (383 aminoácidos),

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4R1N (412 aminoácidos), e 4R2N (441 aminoácidos), dependendo do número de sequências repetitivas de 29 aminoácidos (N) e sequências repetitivas de ligação de microtúbulo (R) que as mesmas contêm. Dentre estas isoformas, apenas 3R0N está presente no cérebro embrionário, enquanto todas as seis isoformas estão presentes no cérebro humano adulto, com 4R sendo mais abundante (Burns, supra). A diferença entre as isoformas 3R e 4R resulta de se o éxon 10 é removido via splicing alternativo (3R) ou está presente (4R). A fim de identificar de forma inequívoca a posição de um resíduo de aminoácido em qualquer uma destas isoformas de tau, os números de aminoácido (1 a 441) da isoforma mais longa, isto é, 4R2N (definida em SEQ ID NO:1), são usados como uma referência. Por exemplo, Ser413 se refere ao resíduo de serina na 413^a posição de aminoácido em 4R2N (definida em SEQ ID NO:1), que corresponde à serina na 384^a em 4R1N (definida em SEQ ID NO:2), na 355^a em 4R0N (definida em SEQ ID NO:3), na 382^a em 3R2N (definida em SEQ ID NO:4), na 353^a em 3R1N (definida em SEQ ID NO:5) e na 324^a em 3R0N (definida em SEQ ID NO:6).

[057] Tau tem um resíduo de aminoácido fosforilado na posição que corresponde ao resíduo de serina na posição 413 (Ser413, quando fosforilada é denominado na presente invenção como pSer413) da sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:1 (e, desta forma, a proteína tau fosforilada em Ser413 é pSer413 tau ou pSer413-tau) que é um sítio especificamente fosforilado em AD. Conforme mostrado anteriormente no documento n² WO 2013/180238, a administração de anticorpos que participam de reações de antígeno-anticorpo específicas com PSer413-tau para camundongos transgênicos que desenvolvem comprometimento da função cognitiva durante o amadurecimento, resultou na restauração de funções cognitivas para quase o mesmo nível que aquele do grupo de controle. De modo interessante, a administração de concentração similar de um anticorpo monoclonal contra uma

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20/132 proteína tau que tem um resíduo de aminoácido fosforilado na posição que corresponde a Ser396 da sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:1, que tem uma afinidade mais forte com um antígeno equivalente do que o anticorpo acima, não resultou em melhoramento suficiente em funções cognitivas. Uma vez que não existem informações específicas sobre uma região que inclui o resíduo de aminoácido na posição que corresponde a Ser413 da sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:1 em relação à estrutura e funções de tau, foi um resultado totalmente inesperado que o anticorpo que se liga com esta região tivesse tal efeito forte de melhoramento da função cognitiva.

[058] Consequentemente, a presente invenção é dirigida a anticorpos antipSer413 tau otimizados e humanizados úteis como um agente terapêutico ou profilático para tratar distúrbios cognitivos como taupatia em um sujeito humano.

[059] O anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção exibe alta afinidade de ligação com tau fosforilada, enquanto tem antigenicidade significativamente reduzida para o corpo humano, e pode ser usado de modo eficaz como um agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos como taupatia em um sujeito humano. Adicionalmente, as modificações de aminoácido dentro das CDRs em comparação com as CDRs murinas reduzem a desamidação levando à estabilidade aumentada; consultar Exemplos 8, 9 e 10.

B. Definições [060] Como usado na presente invenção, cada um dos seguintes termos tem o significado associado ao mesmo nesta seção.

[061] Os artigos um e uma são usados na presente invenção para se referir a um ou a mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do

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21/132 artigo. A título de exemplo, um elemento significa um elemento ou mais de um elemento.

[062] Cerca de, conforme usado na presente invenção quando se refere a um valor mensurável como uma quantidade, uma duração temporal e similares, se destina a abranger variações de ±20% ou ±10%, mais preferencialmente, ±5%, até mais preferencialmente ±1%, e ainda mais preferencialmente ±0,1% do valor especificado, à medida que tais variações são adequadas para realizar os métodos divulgados.

[063] Por neutralização aqui entende-se uma diminuição ou eliminação da atividade. Assim, por exemplo, neutralização de ligação de FcyR significa que a variante de aminoácidos de região Fc tem menos do que 50% de ligação de partida em comparação com uma região Fc que não contém a variante específica, com menos que 70-80-90-95-98% de perda de atividade sendo preferencial, e de um modo geral, com a atividade sendo abaixo do nível de ligação detectável em um ensaio de Biacore.

[064] Por ADCC ou citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo, como usado nesta invenção, significa a reação mediada por células em que células citotóxicas não específicas que expressam FcyRs reconhecem o anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo. ADCC se correlaciona com a ligação a FcyRllla; aumento de ligação a FcyRllla leva a um aumento na atividade de ADCC. Conforme é discutido na presente invenção, muitas modalidades da invenção realizam a ablação da atividade de ADCC integralmente.

[065] O termo ADCP ou fagocitose mediada por células dependente de anticorpo, como usado nesta invenção, significa a reação mediada por células em que células citotóxicas não específicas que expressam FcyRs reconhecem o anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causam a fagocitose

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22/132 da célula alvo.

[066] O termo domínio de ligação de antígeno ou ABD na presente invenção significa um conjunto de seis regiões determinantes de complementaridade CDRs (Complementary Determining Regions) (Regiões Determinantes de Complementaridade) que, quando presentes como parte de uma sequência de polipeptídeos, se liga especificamente a um antígeno alvo, conforme discutido na presente invenção. Desta forma, um domínio de ligação de antígeno liga um antígeno alvo conforme descrito na presente invenção. Conforme é conhecido na técnica, estas CDRs estão, em geral, presentes como um primeiro conjunto de CDRs pesadas variáveis (vhCDRs ou VhCDRs ou CDR-HC) e um segundo conjunto de CDRs leves variáveis (vICDRs ou VlCDRs ou CDR-LC), sendo que cada um compreende três CDRs: vhCDRl, vhCDR2, vhCDR3 para a cadeia pesada e vICDRl, vlCDR2 e vlCDR3 para a cadeia leve. As CDRs estão presentes nos domínios leves variáveis e pesados variáveis, respectivamente, e em conjunto formam uma região Fv. Desta forma, em alguns casos, as seis CDRs do domínio de ligação de antígeno são contribuídas por uma cadeia variável leve e variável pesada. Em um formato Fab, o conjunto de 6 CDRs é contribuído por duas sequências de polipeptídeos diferentes, o domínio variável pesado (vh ou Vh; que contém a vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3) e o domínio variável leve (vl ou Vl; que contém a vICDRl, vlCDR2 e vlCDR3), com o C-terminal do domínio vh sendo fixado ao N-terminal do domínio CHI da cadeia pesada e o C-terminal do domínio vl sendo fixado ao N-terminal do domínio constante leve (e formando, assim, a cadeia leve). Em um formato scFv, os domínios vh e vl são fixados de modo covalente, em geral, através do uso de um ligante, conforme descrito na presente invenção, em uma única sequência de polipeptídeos, que pode ser (começando do N-terminal) vh-ligante-vl ou vl-ligante-vh, com o primeiro sendo, em geral, preferencial (incluindo ligantes de domínio opcionais em cada lado,

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23/132 dependendo do formato usado). Conforme é compreendido na técnica, as CDRs são separadas por regiões framework em cada um dos domínios leves variáveis e pesados variáveis: para o domínio variável leve, estas são FRl-vlCDRl-FR2vlCDR2-FR3-vlCDR3-FR4, e para o domínio variável pesado, estas são FR1vhCDRl-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR4, com as regiões framework que mostram alta identidade com sequências da linhagem germinativa humana. Os domínios de ligação de antígeno da invenção incluem Fab, Fv e scFv.

[067] O termo modificação na presente invenção se refere a uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácido em uma sequência de polipeptídeos ou uma alteração para uma porção quimicamente ligada a uma proteína. Por exemplo, uma modificação pode ser um carboidrato alterado ou estrutura PEG fixada a uma proteína. O termo modificação de aminoácidos na presente invenção se refere a uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácido em uma sequência de polipeptídeos. Para maior clareza, a menos que indicado de outra maneira, a modificação de aminoácidos é sempre para um aminoácido codificado por DNA, por exemplo, os 20 aminoácidos que têm códons no DNA e RNA.

[068] O termo substituição de aminoácido ou substituição na presente invenção se refere à substituição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de polipeptídeos parental por um aminoácido diferente. Em particular, em algumas modalidades, a substituição é para um aminoácido que é de ocorrência não natural na posição particular, de ocorrência não natural dentro do organismo ou em qualquer organismo. Por exemplo, a substituição M252Y se refere a um polipeptídeo variante, neste caso, uma variante Fc, em que a metionina na posição 252 é substituída por tirosina. Para maior clareza, uma proteína que foi manipulada para alterar a sequência de codificação de ácido nucleico, mas não alterar o aminoácido inicial (por exemplo, trocando CGG

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24/132 (codificando arginina) para CGA (ainda codificando arginina) para aumentar os níveis de expressão do organismo hospedeiro) não é uma substituição de aminoácido; isto é, não obstante a criação de um novo gene que codifica a mesma proteína, se a proteína tiver o mesmo aminoácido na posição particular com o qual começou, não é uma substituição de aminoácido.

[069] O termo proteína variante, variante de proteína ou variante, como usado nesta invenção, se refere a uma proteína que se difere daquela de uma proteína parental em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. A variante de proteína pode se referir à própria proteína, uma composição que compreende a proteína ou a sequência de aminoácidos que codifica a mesma. De preferência, a variante de proteína tem pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com a proteína parental, por exemplo, de cerca de um a cerca de setenta modificações de aminoácido e, de preferência, de cerca de um a cerca de cinco modificações de aminoácido em comparação com o parental. Conforme descrito abaixo, em algumas modalidades, o polipeptídeo parental, por exemplo, um polipeptídeo parental Fc, é uma sequência do tipo selvagem humana, como a região Fc de IgGl, lgG2, lgG3 ou lgG4. A sequência de variante de proteína na presente invenção irá possuir, de preferência, pelo menos cerca de 80% de identidade com uma sequência de proteína parental, e com máxima preferência, pelo menos cerca de 90% de identidade, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95%-98%-99% de identidade. A proteína variante pode se referir à própria proteína variante, composições que compreendem a variante de proteína ou à sequência de DNA que codifica a mesma.

[070] Consequentemente, o termo variante de anticorpo ou anticorpo variante, como usado na presente invenção, se refere a um anticorpo que se difere de um anticorpo parental, em virtude de pelo menos uma modificação de

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25/132 aminoácido, variante de IgG ou IgG variante, como usado na presente invenção, se refere a um anticorpo que se difere de uma IgG parental (mais uma vez, em muitos casos, a partir de uma sequência de IgG humana), em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, e variante da imunoglobulina ou imunoglobulina variante, como usado na presente invenção, se refere a uma sequência de imunoglobulinas que se difere daquela de uma sequência de imunoglobulinas parental em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Variante de Fc ou Fc variante, como usado na presente invenção, significa uma proteína que compreende uma modificação de aminoácido em um domínio Fc. As variantes de Fc da presente invenção são definidas de acordo com as modificações de aminoácidos que as compõem. Desta forma, por exemplo, M252Y ou 252Y é uma variante Fc com a tirosina de substituição na posição 252 em relação ao polipeptídeo Fc parental, em que a numeração é de acordo com o índice EU. De modo semelhante, M252Y/S254T/T256E define uma variante Fc com as substituições M252Y, S254T e T256E em relação ao polipeptídeo Fc parental. A identidade do aminoácido WT pode ser não especificada, em tal caso, a variante mencionada anteriormente é denominada de 252Y/254T/256E. É observado que a ordem em que as substituições são fornecidas é arbitrária, ou seja, por exemplo, 252Y/254T/256E é a mesma variante Fc que 254T/252Y/256E, e assim por diante. Para todas as posições discutidas na presente invenção que se referem a anticorpos, exceto onde observado em contrário, a numeração de posição de aminoácido é de acordo com Kabat para a numeração de domínio variável e é de acordo com o índice EU para os domínios constantes, incluindo o domínio Fc. O índice EU ou índice EU como em Kabat ou esquema de numeração EU se refere à numeração do anticorpo EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sei USA 63:78-85, aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade). A modificação pode ser

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26/132 uma adição, deleção ou substituição. As substituições podem incluir aminoácidos de ocorrência natural e, em alguns casos, aminoácidos sintéticos.

[071] Como usado na presente invenção, proteína se refere aqui a pelo menos dois aminoácidos ligados de forma covalente, que inclui proteínas, polipeptídeos, oligopeptídeos e peptídeos. O grupo peptidila pode compreender aminoácidos de ocorrência natural e ligações peptídicas.

[072] O termo Fab ou região Fab, como usado na presente invenção, significa o polipeptídeo que compreende os domínios de imunoglobulina VH, CHI, VL e CL. Fab pode se referir a esta região em isolamento, ou esta região no contexto de um anticorpo de comprimento completo, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão Fab.

[073] O termo Fv ou fragmento de Fv ou região Fv, como usado na presente invenção, significa um polipeptídeo que compreende os domínios VL e VH de um único domínio de ligação de antígeno (ABD). Conforme será observado por aqueles versados na técnica, estes serão, em geral, compostos de duas cadeias, ou podem ser combinados (em geral, com um ligante conforme discutido na presente invenção) para formar um scFv.

[074] O termo aminoácido e identidade de aminoácido, como usado na presente invenção, significa um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural que são codificados por DNA e RNA.

[075] O termo função efetora, como usado na presente invenção, significa um evento bioquímico que resulta da interação de uma região Fc de anticorpo com um ligante ou receptor Fc. As funções efetoras incluem, porém sem limitação, a ADCC, ADCP e CDC.

[076] O termo receptor gama Fc, FcyR ou FcgamaR, como usado na presente invenção, significa qualquer membro da família de proteínas que se liga à região Fc de anticorpo IgG e é codificado por um gene FcyR. Nos seres humanos

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27/132 esta família inclui, porém sem limitação, FcyRI (CD64), incluindo isoformas FcyRla, FcyRIb e FcyRIc; FcyRII (CD32), incluindo isoformas FcyRlla (incluindo alótipos H131 e R131), FcyRllb (incluindo FcyRllb-Ι e FcyRllb-2) e FcyRllc; e FcyRIII (CD16), incluindo isoformas FcyRllla (incluindo os alótipos V158 e F158) e FcyRlllb (incluindo os alótipos FcyRllb-ΝΑΙ e FcyRllb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, inteiramente incorporada por referência), bem como quaisquer FcyRs humanos desconhecidos ou isoformas ou alótipos FcyR. Em alguns casos, conforme descrito na presente invenção, a ligação a um ou mais receptores FcyR é reduzida ou neutralizada. Por exemplo, a redução da ligação a FcyRllla reduz ADCC, e em alguns casos, a redução de ligação a FcyRllla e FcyRllb é desejada.

[077] O termo FcRn ou receptor Fc neonatal, como usado na presente invenção, significa uma proteína que se liga à região Fc de anticorpo IgG e é codificada, pelo menos em parte, por um gene FcRn. O FcyRn pode ser de qualquer organismo, incluindo, porém sem limitação, seres humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. Como é conhecido na técnica, a proteína FcRn funcional compreende dois polipeptídeos, muitas vezes denominados como cadeia pesada e cadeia leve. A cadeia leve é beta-2microglobulina e a cadeia pesada é codificada pelo gene FcRn. A menos que de outro modo observado nesta invenção, FcRn ou uma proteína FcRn se refere ao complexo de cadeia pesada FcRn com beta-2-microglobulina.

[078] O termo polipeptídeo parental, como usado nesta invenção, significa um polipeptídeo inicial que é subsequentemente modificado para gerar uma variante. O polipeptídeo parental pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural, uma variante ou uma versão manipulada de um polipeptídeo de ocorrência natural. O polipeptídeo parental pode se referir ao próprio polipeptídeo, composições que compreendem o polipeptídeo parental ou a

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28/132 sequência de aminoácidos que codifica o mesmo. Consequentemente, o termo imunoglobulina parental, como usado nesta invenção, significa um polipeptídeo de imunoglobulina não modificado que é modificado para gerar uma variante, e o termo anticorpo parental, como usado nesta invenção, significa um anticorpo não modificado que é modificado para gerar um anticorpo variante. Deve ser observado que anticorpo parental inclui anticorpos conhecidos comerciais, produzidos de forma recombinante, conforme descrito abaixo.

[079] O termo região constante pesada na presente invenção significa a porção CHl-dobradiça-CH2-CH3 de um anticorpo, em geral, de IgGl, lgG2 ou lgG4 humana.

[080] O termo antígeno alvo, como usado nesta invenção, significa a molécula que é ligada especificamente pela região variável de um determinado anticorpo. No presente caso, o antígeno alvo é uma proteína tau que é fosforilada na posição Ser413 (pSer413-tau).

[081] O termo célula alvo, como usado nesta invenção, significa uma célula que expressa um antígeno alvo.

[082] O termo região variável, como usado nesta invenção, significa a região de uma imunoglobulina que compreende um ou mais domínios Ig substancialmente codificados por qualquer um dentre os genes V.kappa., V.lamda. e/ou VH que compõem os loci genéticos de imunoglobulina de cadeia pesada, kappa e lambda, respectivamente.

[083] O termo tipo selvagem ou WT na presente invenção se refere a uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que é encontrada na natureza, incluindo as variações alélicas. Uma proteína WT tem uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que não tenha sido intencionalmente modificada.

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29/132 [084] O termo proteína tau usado na presente invenção significa qualquer uma dentre as seis isoformas de proteína tau humana que tem as sequências de aminoácidos definidas em SEQ ID NOS:1 a 6, isto é, 4R2N (definida em SEQ ID NO:1), 4R1N (definida em SEQ ID NO:2), 4R0N (definida em SEQ ID NO:3), 3R2N (definida em SEQ ID NO:4), 3R1N (definida em SEQ ID NO:5) e 3R0N (definida em SEQ ID NO:6), bem como variantes de gene das mesmas. Conforme explicado na seção FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO acima, mais de 40 mutações foram implicadas com FTDP-17, que é uma doença neurodegenerativa familiar relacionada a distúrbios cognitivos. Entretanto, os sítios de mutações em uma proteína tau não devem ser limitados àqueles implicados com FTDP-17. O número de mutações de aminoácidos introduzidas nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS:1 a 6 não deve ser limitado, mas pode ser de 1 a 50, particularmente 1 a 30, mais particularmente 1 a 10. Entretanto, o resíduo de aminoácido que corresponde à sequência de aminoácidos definida no resíduo de serina na posição 413 da SEQ ID NO:1 (Ser413) deve ser, de preferência, conservado. A proteína tau, de acordo com a presente invenção, também abrange proteínas que têm similaridades ou identidades de 80% ou mais com a sequência de aminoácidos de proteína tau humana definida em SEQ ID NO:1 de acordo com o método BLAST (com condições padrão de PBLAST fornecido por NCBI) e suas isoformas. Tais proteínas tau incluem tau derivada de espécies não humanas como chimpanzés, macacos, cavalos, porcos, cães, camundongos, coelhos e ratos. É possível produzir um agente terapêutico ou profilático direcionado para tau derivada de tal animal não humano com a finalidade de melhorar a função cognitiva do animal alvo.

[085] O termo peptídeo tau usado na presente invenção significa um peptídeo que inclui uma parte da sequência de aminoácidos de uma proteína tau. A posição e comprimento da sequência de aminoácidos do peptídeo tau

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30/132 derivada de uma proteína tau não devem ser limitados, mas devem conter, de preferência, por exemplo, uma série de pelo menos três aminoácidos consecutivos, particularmente pelo menos cinco aminoácidos consecutivos, mais particularmente, pelo menos oito aminoácidos consecutivos, derivados do resíduo de aminoácidos que corresponde a números de aminoácido 410 a 421 da SEQ ID NO:1, pelo menos incluindo o aminoácido que corresponde a Ser413. O comprimento do peptídeo tau também não deve ser limitado, mas deve ter, de preferência, um comprimento de aminoácido de quatro ou mais, particularmente, seis ou mais, mais particularmente oito ou mais.

[086] O termo tau usado na presente invenção significa uma proteína tau ou um peptídeo tau coletivamente.

[087] O termo anti-proteína pSer413 tau significa um anticorpo, conforme descrito na presente invenção, que preferencialmente se liga a uma proteína tau que é fosforilada na serina na posição 413 em comparação com a ligação de uma proteína tau que não é fosforilada na serina na posição 413. A proteína tau fosforilada em Ser413 pode ser humana e/ou murina.

[088] O termo posição, como usado nesta invenção, significa um local na sequência de uma proteína. As posições podem ser numeradas sequencialmente, ou de acordo com um formato estabelecido, por exemplo, o índice EU para a numeração de anticorpos.

[089] O termo resíduo, como usado nesta invenção, significa uma posição em uma proteína e a sua identidade de aminoácido associada. Por exemplo, a Asparagina 297 (também denominada de Asn297 ou N297) é um resíduo na posição 297 na IgGl de anticorpo humano.

[090] No contexto da presente invenção, a posição de um resíduo de aminoácido em uma proteína tau ou em um peptídeo tau é indicada por um número de aminoácido, que é identificado com base na sequência de

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31/132 aminoácidos definida em SEQ ID NO:1 para clarificação. Por exemplo, o resíduo de aminoácido que corresponde a Ser413 da SEQ ID NO:1 significa o resíduo de serina na posição 413 da SEQ ID NO:1 (4R2N), posição 384 da SEQ ID NO:2 (4R1N), posição 355 da SEQ ID NO:3 (4R0N), posição 382 da SEQ ID NO:4 (3R2N), posição 353 da SEQ ID NO:5 (3R1N) ou posição 324 da SEQ ID NO:6 (3R0N). A correspondência das posições de resíduos de aminoácido entre isoformas de tau é mostrada na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Isoformas de proteína tau humana

Isoforma	4R2N	4R1N	4R0N	3R2N	3R1N	3R0N
Sequência	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID	SEQ ID
NO:1	NO:2	NO:3	NO:4	NO:5	NO:6
Resíduo de aminoácido	Número de aminoácido
Asn	410	381	352	379	350	321
Vai	411	382	353	380	351	322
Ser	412	383	354	381	352	323
Ser	413	384	355	382	353	324
Thr	414	385	356	383	354	325
Gly	415	386	357	384	355	326
Ser	416	387	358	385	356	327
He	417	388	359	386	357	328
Asp	418	389	360	387	358	329
Met	419	390	361	388	359	330
Vai	420	391	362	389	360	331
Asp	421	392	363	390	361	332

[091] Embora a Tabela 1 mostre as posições de resíduos de aminoácido destas isoformas que correspondem a posições 410 a 421 da sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:1, a correspondência das posições de resíduos de aminoácido em outras regiões podem ser facilmente reconhecidas

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32/132 com base, por exemplo, nas Figuras IA e 1B. Um versado na técnica teria capacidade para determinar posições correspondentes de aminoácidos em isoformas ou homólogos usando alinhamento de sequências em pares como o método de Needleman-Wunsch ou método de Smith-Waterman, ou alinhamento de sequência múltipla como método ClustalW ou método PRRP. Como um exemplo da análise de posições correspondentes, as Figuras IA e 1B mostram um alinhamento das sequências de aminoácidos das seis isoformas humanas (indicadas com um código de letra) com base em ClustalW. Estas figuras indicam que a estrutura que circunda o resíduo de aminoácido que corresponde a Ser413 da sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:1 é conservada entre as seis isoformas.

[092] Os anticorpos da presente invenção são geralmente isolados ou recombinantes. Isolado, quando usado para descrever os diversos polipeptídeos divulgados nesta invenção, significa um polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de uma cultura de células ou célula a partir da qual o mesmo foi expresso. Normalmente, um polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação. Um anticorpo isolado se refere a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas. Recombinante significa que os anticorpos são gerados usando técnicas de ácido nucleico recombinante em células hospedeiras exógenas.

[093] A porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos em relação a uma sequência de proteínas é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência específica (parental), após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a máxima identidade de porcentagem de sequência e não considerando quaisquer

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33/132 substituições conservativas como parte da identidade de sequências. O alinhamento para propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de vários modos que estão dentro da perícia na técnica, por exemplo, usando o programa de computador publicamente disponível como BLAST, BLAST-2, ALIGN ou o programa Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica conseguem determinar parâmetros apropriados para medição do alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparadas. Um programa particular é o programa ALIGN-2 descrito nos parágrafos [0279] a [0280] a publicação n² US 20160244525, aqui incorporada a título de referência. Um outro alinhamento aproximado para sequências de ácidos nucleicos é fornecido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482489 (1981). Este algoritmo pode ser aplicado a sequências de aminoácidos usando a matriz de pontuação desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 sup. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EUA, e normalizado por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986).

[094] Um exemplo de uma implantação deste algoritmo para determinar a porcentagem de identidade de uma sequência é fornecido pelo Genetics Computer Group (Madison, Wl) na aplicação de utilidade BestFit. Os parâmetros padrão para este método são descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Versão 8 (1995) (disponível junto à Genetics Computer Group, Madison, Wl). Um outro método para estabelecer a porcentagem de identidade no contexto da presente invenção é usar o pacote de programas MPSRCH com direitos autorais da Universidade de Edimburgo, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuído por

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IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir deste conjunto de pacotes, ο algoritmo Smith-Waterman pode ser empregado em que os parâmetros padrão são usados para a tabela de pontuação (por exemplo, penalidade de abertura de lacuna de 12, penalidade de extensão de lacuna de um e uma lacuna de seis). A partir dos dados gerados, o valor de Correspondência reflete a identidade de sequência. Outros programas adequados para calcular a porcentagem de identidade ou similaridade entre sequências são, em geral, conhecidos na técnica, por exemplo, um outro programa de alinhamento é BLAST, usado com parâmetros padrão. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados usando os seguintes parâmetros padrão: código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificado por = HIGH SCORE; Bancos de dados = não redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS traduções + proteína Swiss + Spupdate + PIR. Os detalhes destes programas podem ser encontrados no endereço na Internet localizado colocando-se http:// na frente de blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

[095] O grau de identidade entre uma sequência de aminoácidos da presente invenção (sequência da invenção) e a sequência de aminoácidos parental é calculado como o número de correspondências exatas em um alinhamento de duas sequências, dividido pelo comprimento da sequência da invenção ou pelo comprimento da sequência parental, o que for mais curto. O resultado é expresso em porcentagem de identidade.

[096] Em algumas modalidades, duas ou mais sequências de aminoácidos são pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% idênticas. Em algumas modalidades, duas ou mais sequências de aminoácidos são pelo menos 95%, 97%, 98%, 99% ou até 100% idênticas.

[097] Ligação específica ou se liga especificamente a ou é específico

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35/132 para um antígeno particular ou um epítopo significa a ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, por meio da determinação da ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada por competição com uma molécula de controle que é similar ao alvo.

[098] O termo K_assoc ou K_a, como usado na presente invenção, é destinado a se referir à taxa de associação de uma interação particular de anticorpo-antígeno, enquanto que o termo Kdis ou Kd, como usado na presente invenção, é destinado a se referir à taxa de dissociação de uma interação particular de anticorpo-antígeno. O termo Kd, como usado na presente invenção, é destinado a se referir à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão entre Kd e K_a (isto é, Kd/K_a) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de Kd para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Em algumas modalidades, o método para determinar o Kd de um anticorpo é usando a ressonância de plásmon de superfície, por exemplo, usando um sistema de biossensor como um sistema BIACORE®. Em certas modalidades, o valor de Kd é medido com uma proteína Tau fosforilada. Em algumas modalidades, o valor de Kd é medido com um peptídeo fosforilado. Em algumas modalidades, o valor de Kd é medido com o antígeno (por exemplo, a proteína Tau fosforilada ou o peptídeo fosforilado) imobilizado. Em outras modalidades, o valor de Kd é medido com o anticorpo (por exemplo, anticorpo de camundongo parental, anticorpo quimérico ou variantes de anticorpo humanizado) imobilizado. Em ainda outras modalidades, o valor de Kd é medido com uma proteína Tau fosforilada como o analito. Em mais outras modalidades, o valor de KD é medido

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36/132 com um peptideo fosforilado como o analito. Em certas modalidades, o valor de KD é medido em um modo de ligação bivalente. Em outras modalidades, o valor de KD é medido em um modo de ligação monovalente.

[099] Uma doença inclui um estado de saúde de um animal, incluindo um ser humano, em que o animal não pode manter a homeostase, e em que se a doença não for melhorada, então, a saúde do animal continua a se deteriorar.

[0100] Em contrapartida, um distúrbio em um animal, incluindo um ser humano, inclui um estado de saúde em que o animal tem capacidade para manter a homeostase, mas em que o estado de saúde do animal é menos favorável que seria na ausência do distúrbio. Se não tratado, um distúrbio não necessariamente causa uma diminuição adicional no estado de saúde do animal.

[0101] Os termos tratamento, tratando, tratar e similares, se referem à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir de forma completa ou parcial uma doença ou sintoma da mesma ou reduzir a probabilidade de uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. Tratamento, como usado na presente invenção, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em um ser humano, e inclui: (a) impedir que a doença ocorra em um sujeito que pode ser predisposto à doença, mas que ainda não foi diagnosticado como tendo a mesma; (b) inibir a doença, isto é, impedir seu desenvolvimento ou progressão; e (c) aliviar a doença, isto é, causar a regressão da doença e/ou aliviar um ou mais sintomas da doença. Tratamento também se destina a abranger a distribuição de um agente a fim de fornecer um efeito farmacológico, mesmo na ausência de uma condição ou afecção. Por exemplo, tratamento abrange a distribuição de uma composição que pode elicitar uma resposta imunológica ou conferir imunidade na ausência de uma

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37/132 condição de doença, por exemplo, no caso de uma vacina.

[0102] Como usado na presente invenção, o termo mamífero se refere a qualquer mamífero, incluindo, porém sem limitação, mamíferos da ordem Rodentia, como camundongos e hamsters, e mamíferos da ordem Logomorpha, como coelhos. Em algumas modalidades, os mamíferos são da ordem Carnivora, incluindo felinos (gatos) e caninos (cães). Em algumas modalidades, os mamíferos são da ordem Artiodactyla, incluindo bovinos (vacas) e suínos (porcos) ou da ordem Perssodactyla, incluindo equinos (cavalos). É da máxima preferência que os mamíferos sejam da ordem Primates, Ceboids ou Simoids (macacos) ou da ordem Anthropoids (seres humanos e primatas). Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.

[0103] O termo regressão, bem como palavras decorrentes do mesmo, como usado na presente invenção, não necessariamente implicam 100% de regressão ou regressão completa. De preferência, existem graus variados de regressão dentre os quais um versado na técnica reconhece como tendo um benefício potencial ou efeito terapêutico. Sobre este assunto, os métodos divulgados podem fornecer qualquer quantidade de qualquer nível de regressão de uma taupatia em um mamífero. Adicionalmente, a regressão fornecida pelo método da invenção pode incluir a regressão de uma ou mais condições ou sintomas da doença, por exemplo, uma taupatia. Além disso, para os propósitos na presente invenção, regressão pode abranger o atraso do início da doença, atraso do início de um sintoma e/ou atraso do início de uma afecção da mesma. Em relação a distúrbios e doenças progressivas, regressão pode abranger a desaceleração da progressão da doença ou distúrbio, desaceleração da progressão de um sintoma da doença ou distúrbio e/ou desaceleração da progressão de uma afecção da mesma.

[0104] Uma quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz

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38/132 de uma composição inclui aquela quantidade da composição que é suficiente para fornecer um efeito benéfico para o sujeito ao qual a composição é administrada. Uma quantidade eficaz de um veículo de distribuição inclui aquela quantidade suficiente para ligar ou distribuir de modo eficaz uma composição.

[0105] O termo indivíduo ou hospedeiro ou sujeito ou paciente se refere a qualquer sujeito mamífero para qual o diagnóstico, tratamento ou terapia é desejada, particularmente seres humanos. Outros sujeitos podem incluir gado, cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos e assim por diante.

[0106] O termo em combinação com, como usado na presente invenção, se refere a usos em que, por exemplo, uma primeira terapia é administrada durante todo o curso de administração de uma segunda terapia; em que a primeira terapia é administrada durante um período de tempo que sobrepõe a administração da segunda terapia, por exemplo, em que a administração da primeira terapia começa antes da administração da segunda terapia e a administração da primeira terapia termina antes de a administração da segunda terapia terminar; em que a administração da segunda terapia começa antes da administração da primeira terapia e a administração da segunda terapia termina antes de a administração da primeira terapia terminar; em que a administração da primeira terapia começa antes de a administração da segunda terapia começar e a administração da segunda terapia termina antes de a administração da primeira terapia terminar; em que a administração da segunda terapia começa antes de a administração da primeira terapia começar e a administração da primeira terapia termina antes de a administração da segunda terapia terminar. Como tal, em combinação também pode se referir ao regime que envolve a administração de duas ou mais terapias. Em combinação com, como

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39/132 usado na presente invenção, também se refere à administração de duas ou mais terapias que podem ser administradas em formulações iguais ou diferentes, por vias iguais ou diferentes e no tipo de forma de dosagem igual ou diferente.

[0107] Codificação inclui a propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como modelos para síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos que têm uma sequência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas que resultam da mesma. Desta forma, um gene codifica uma proteína se, por exemplo, a transcrição de tradução de mRNA que corresponde àquele gene produzir a proteína em uma célula ou noutro sistema biológico. Tanto a fita de codificação, cuja sequência de nucleotídeos é idêntica à sequência de mRNA e é normalmente fornecida em listagens de sequências, como a fita de não codificação, usada como o modelo para a transcrição de um gene ou cDNA, podem ser denominadas como codificando a proteína ou outro produto daquele gene ou cDNA.

[0108] O termo ácido nucleico inclui moléculas de RNA ou DNA que têm mais de um nucleotídeo em qualquer forma incluindo polinucleotídeo, oligonucleotídeo, de fita simples ou fita dupla. O termo sequência de nucleotídeos inclui a ordenação de nucleotídeos em um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo em uma forma de fita simples de ácido nucleico.

[0109] O termo construto de ácido nucleico se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que foram construídos para compreender uma ou mais unidades funcionais não encontradas juntas na natureza. Os exemplos incluem moléculas de DNA extracromossômico, de fita dupla, linear, circular (plasmídeos), cosmídeos (plasmídeos que contêm sequências COS do fago lambda), genomas virais incluindo sequências de ácidos nucleicos não nativas e

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40/132 similares.

[0110] O termo operacionalmente ligado, como usado na presente invenção, inclui um polinucleotídeo em relação funcional com um segundo polinucleotídeo, por exemplo, uma porção de ácido nucleico de fita simples ou fita dupla que compreende os dois polinucleotídeos dispostos dentro da porção de ácido nucleico de tal maneira que pelo menos um dentre os dois polinucleotídeos tenha capacidade para exercer um efeito fisiológico por meio do qual é caracterizado, em relação ao outro. A título de exemplo, um promotor operacionalmente ligado à região de codificação de um gene tem capacidade para promover a transcrição da região de codificação. A ordem especificada mediante a indicação de ligação operacional não é importante. Por exemplo, as frases: o promotor é operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos e a sequência de nucleotídeos é operacionalmente ligado ao promotor são usadas de forma intercambiavel na presente invenção e são consideradas equivalentes. Em alguns casos, quando o ácido nucleico que codifica a proteína desejada compreende ainda uma sequência promotora/reguladora, a sequência promotora/reguladora é posicionada na extremidade 5' da sequência de codificação de proteína desejada de modo que acione a expressão da proteína desejada em uma célula.

[0111] Os termos oligonucleotídeo, polinucleotídeo e molécula de ácido nucleico, usados de forma intercambiável na presente invenção, se referem a formas poliméricas de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Desta forma, este termo inclui, porém sem limitação, RNA ou DNA de fita simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero que compreende bases de pirimidina e purina ou outras bases de nucleotídeo naturais, química ou bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivadas. A cadeia principal do

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41/132 polinucleotídeo pode compreender açúcares e grupos fosfato (conforme pode ser tipicamente encontrado em RNA ou DNA), ou grupos fosfatos ou açúcar substituídos ou modificados.

[0112] O termo recombinante, conforme aplicado a um polinucleotídeo, significa que o polinucleotídeo é o produto de diversas combinações de etapas de clonagem, restrição ou ligação, e outros procedimentos que resultam em um construto distinto e/ou diferente de um polinucleotídeo encontrado na natureza. Os termos incluem, respectivamente, réplicas do construto de polinucleotídeo original e progênie do construto de vírus original.

[0113] O termo promotor, como usado na presente invenção inclui uma sequência de DNA operacionalmente ligada a uma sequência de ácidos nucleicos a ser transcrita como uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma molécula desejada. Um promotor é, em geral, posicionado a montante de uma sequência de ácidos nucleicos a ser transcrita e fornece um sítio para ligação específica por polimerase de RNA e outros fatores de transcrição.

[0114] Um vetor é capaz de transferir sequências de genes para célulasalvo. Tipicamente, construto de vetor, vetor de expressão e vetor de transferência de gene significam qualquer construto de ácido nucleico capaz de direcionar a expressão de um gene de interesse e que pode transferir sequências de genes para células-alvo, que pode ser realizado por integração genômica de todo ou uma porção do vetor, ou manutenção transitória ou hereditária do vetor como um elemento extracromossômico. Desta forma, o termo inclui veículos de expressão e clonagem, bem como vetores de integração.

[0115] O termo elemento regulador, como usado na presente invenção, inclui uma sequência de nucleotídeos que controla algum aspecto da expressão de sequências de ácidos nucleicos. Os exemplos de elementos reguladores incluem de forma ilustrativa um intensificador, um sítio de entrada de ribossoma

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42/132 interno (IRES), um íntron, uma origem de replicação, um sinal de poliadenilação (pA), um promotor, um intensificador, uma sequência de terminação de transcrição e um domínio regulador a montante, que contribuem para a replicação, transcrição e/ou processamento pós-transcrição de uma sequência de ácidos nucleicos. Em casos, os elementos reguladores também podem incluir elementos de DNA c/s-reguladores, bem como elementos transponíveis (TEs). Aqueles de habilidade comum na técnica são capazes de selecionar e usar estes e outros elementos reguladores em um construto de expressão com não mais que experimentação de rotina. Os construtos de expressão podem ser gerados usando uma abordagem recombinante genética ou usando sinteticamente metodologia bem conhecida.

[0116] Um elemento de controle ou sequência de controle é uma sequência de nucleotídeos envolvida em uma interação de moléculas que contribuem para a regulação funcional de um polinucleotídeo, incluindo replicação, duplicação, transcrição, splicing, tradução ou degradação do polinucleotídeo. A regulação pode afetar a frequência, velocidade ou especificidade do processo e pode ser de natureza intensificadora ou inibidora. Os elementos de controle conhecidos na técnica incluem, por exemplo, sequências reguladoras transcricionais como promotores e intensificadores. Um promotor é uma região de DNA capaz de, sob certas condições, de ligar RNA polimerase e iniciar a transcrição de uma região de codificação normalmente situada a jusante (na direção 3') do promotor.

[0117] A declaração que um resíduo de aminoácido é fosforilado, usada na presente invenção, significa que um grupo fosfato é ligado por éster à cadeia lateral do resíduo de aminoácido. Os resíduos de aminoácido típicos que podem ser fosforilados incluem serina (Ser), treonina (Thr) e tirosina (Tyr).

VIII. ANTICORPOS

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43/132 [0118] A presente invenção é dirigida a anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno que ligam proteína tau humana que foi fosforilada na posição 413.

[0119] As unidades estruturais de anticorpos tradicionais compreendem, tipicamente, um tetrâmero. Cada tetrâmero é tipicamente composto por dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, sendo que cada par tem uma cadeia leve (que tem tipicamente um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada (que tem tipicamente um peso molecular de cerca de 50 a 70 kDa). As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kappa e lambda. A presente invenção é dirigida a anticorpos que, em geral, têm por base a classe de IgG, que tem várias subclasses, incluindo, porém sem limitação, IgGl, lgG2, lgG3 e lgG4. Em geral, IgGl, lgG2 e lgG4 são usadas com mais frequência que lgG3. Deve ser observado que IgGl tem alotipos diferentes com polimorfismos em 356 (D ou E) e 358 (L ou M). As sequências representadas na presente invenção usam o alotipo 356D/358L, entretanto, o outro alotipo está incluído na presente invenção. Ou seja, qualquer sequência inclusive de um domínio Fc de IgGl incluída na presente invenção pode ter 356E/358M substituindo o alotipo 356D/358L.

[0120] Conforme será observado por aqueles versados na técnica, a numeração exata e colocação das CDRs pode ser diferente entre sistemas de numeração diferentes. Entretanto, deve ser compreendido que a revelação de uma sequência variável pesada e/ou variável leve inclui a revelação das CDRs (inerentes) associadas. Consequentemente, a revelação de cada região variável pesada é uma revelação das vhCDRs (por exemplo, vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3) e a revelação de cada região variável leve é uma revelação das vICDRs (por exemplo, vICDRl, vlCDR2 e vlCDR3).

[0121] Os métodos para identificar a sequência de cada uma dentre CDRHl, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um anticorpo incluem: O

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44/132 método Kabat (Kabat et al., The Journal of Immunology, 1991, Vol.147, n² 5, páginas 1709-1719) e método Chothia (Al-Lazikani et al., Journal of Molecular Biology, 1997, Vol.273, n² 4, páginas 927-948). Estes métodos estão dentro do conhecimento comum da técnica para versados na técnica, sendo que os resumos dos mesmos estão disponíveis, por exemplo, no site da web de Dr. Andrew C.R. Martin's Group (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

[0122] Uma comparação útil de numeração de CDR é conforme a seguir, consultar Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003):

TABELA 1

	Kabat+ Chothia	IMGT	Kabat	AbM	Chothia	Contato
vhCDRl	26-35	27-38	31-35	26-35	26-32	30-35
vhCDR2	50-65	56-65	50-65	50-58	52-56	47-58
vhCDR3	95-102	105-117	95-102	95-102	95-102	93-101
vICDRl	24-34	27-38	24-34	24-34	24-34	30-36
vlCDR2	50-56	56-65	50-56	50-56	50-56	46-55
vlCDR3	89-97	105-117	89-97	89-97	89-97	89-96

[0123] Ao longo do relatório descritivo, o sistema de numeração de Kabat é, em geral, usado mediante a referência a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, os resíduos 1 a 107 da região variável de cadeia leve e resíduos 1 a 113 da região variável de cadeia pesada) e o sistema de numeração EU para regiões constantes como regiões Fc (por exemplo, Kabat et al., supra (1991)).

[0124] A presente invenção fornece vários conjuntos de CDR diferentes. Nesse caso, um conjunto de CDR completo compreende as três CDRs leves variáveis e as três CDRs pesadas variáveis, por exemplo, uma vICDRl, vlCDR2, vlCDR3, vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3. Estas podem fazer parte de um domínio variável pesado ou variável leve maior, respectivamente. Além disso, como

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45/132 descrito de forma mais completa na presente invenção, os domínios pesados variáveis e leves variáveis podem ser em cadeias de polipeptídeo separadas, quando uma cadeia leve e pesada é usada (por exemplo, quando Fabs são usados) ou em uma única cadeia de polipeptídeo no caso de sequências de scFv.

[0125] As CDRs contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno, ou mais especificamente, sítio de ligação de epítopo de anticorpos. Epítopo se refere a um determinante que interage com um sítio de ligação de antígeno específico, na região variável de uma molécula de anticorpo conhecido como um parátopo. Os epítopos são agrupamentos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e, normalmente, têm características estruturais específicas, bem como características de carga específicas. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo.

[0126] No presente caso, o epítopo compreende não apenas os resíduos de aminoácido diretamente envolvidos na ligação dos anticorpos da invenção, mas também a fosforilação em Ser413.

[0127] A porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante essencialmente responsável pela função efetora. Kabat et al. coletou numerosas sequências primárias das regiões variáveis de cadeias pesadas e cadeias leves. Com base no grau de conservação das sequências, classificaram sequências primárias individuais na CDR e no framework e fizeram uma lista dos mesmos (consultar SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, edição, publicação NIH, n² 91-3242, E.A. Kabat et al., inteiramente incorporado por referência).

[0128] Na subclasse de IgG de imunoglobulinas, existem vários domínios de imunoglobulina na cadeia pesada. O termo domínio de imunoglobulina (lg) na presente invenção se refere a uma região de uma imunoglobulina que tem uma estrutura terciária distinta. De interesse na presente invenção são os domínios

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46/132 de cadeia pesada, incluindo, os domínios constantes pesados (CH) e os domínios de dobradiça. No contexto de anticorpos IgG, os isotipos IgG têm, cada um, três regiões CH. Consequentemente, os domínios CH no contexto de IgG são os seguintes: CHI se refere a posições 118 a 220 de acordo com o índice EU como em Kabat. CH 2 se refere a posições 237 a 340 de acordo com o índice EU como em Kabat, e CH3 se refere a posições 341 a 447 de acordo com o índice EU como em Kabat.

[0129] Outro tipo de domínio Ig da cadeia pesada é a região de dobradiça. O termo dobradiça ou região de dobradiça ou região de dobradiça do anticorpo ou região de dobradiça da imunoglobulina, nesta invenção, se refere ao polipeptídeo flexível que compreende os aminoácidos entre o primeiro e o segundo domínios constantes de um anticorpo. Estruturalmente, o domínio CHI de IgG termina na posição EU 220, e o domínio CH2 de IgG começa na posição 237 de EU de resíduo. Desta forma, para IgG a dobradiça de anticorpo é aqui definida para incluir posições 221 (D221 em IgGl) a 236 (G236 em IgGl), em que a numeração é de acordo com o índice EU como em Kabat. Em algumas modalidades, por exemplo, no contexto de uma região Fc, a dobradiça inferior está incluída, com a dobradiça inferior geralmente se referindo a posições 226 ou 230. Conforme observado na presente invenção, as variantes de pl podem ser feitas na região de dobradiça também.

[0130] A cadeia leve compreende geralmente dois domínios, o domínio variável leve (que contém as CDRs de cadeia leve e, juntamente com os domínios pesados variáveis formando a região Fv), e uma região constante de cadeia leve (muitas vezes denominada de CL ou Ck).

[0131] Outra região de interesse para substituições adicionais, descrito abaixo, é a região Fc.

[0132] Desta forma, a presente invenção fornece diferentes domínios de

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47/132 anticorpos. Conforme descrito na presente invenção e conhecido na técnica, os anticorpos da invenção compreendem domínios diferentes dentro das cadeias leve e pesada, que também podem ser sobrepostos. Estes domínios incluem, porém sem limitação, o domínio Fc, o domínio CHI, o domínio CH2, o domínio CH3, o domínio de dobradiça, o domínio constante pesado (domínio CH1dobradiça-Fc ou CHl-dobradiça-CH2-CH3), o domínio variável pesado, o domínio variável leve, o domínio constante leve, domínios FAb e domínios scFv.

[0133] Desta forma, o domínio Fc inclui o domínio -CH2-CH3 e opcionalmente um domínio de dobradiça. A cadeia pesada compreende um domínio variável pesado e um domínio constante, que inclui um domínio CH1dobradiça-Fc que compreende um CH2-CH3. A cadeia leve compreende uma cadeia variável leve e o domínio constante leve. Um scFv compreende uma cadeia variável pesada, um ligante de scFv e um domínio variável leve. Algumas modalidades da invenção compreendem pelo menos um domínio scFv, que, embora de ocorrência não natural, em geral, inclui um domínio variável pesado e um domínio variável leve, ligados juntos por um ligante de scFv. Conforme descrito na presente invenção, embora o domínio scFv seja, em geral, do N- a Cterminal orientado como vh-ligante de scFv-vl, isto pode ser invertido para qualquer um dos domínios scFv (ou aqueles construídos usando sequências vh e vl de Fabs), a vl-ligante de scFv-vh.

[0134] Conforme mostrado na presente invenção, existem vários ligantes de scFv adequados que podem ser usados, incluindo ligações de peptídeo tradicionais, geradas por meio de técnicas recombinantes. O peptídeo ligante pode predominantemente incluir os seguintes resíduos de aminoácidos: Gly, Ser, Ala ou Thr. O peptídeo ligante deve ter um comprimento que seja adequado para ligar duas moléculas de tal forma que assumam a conformação correta uma em relação à outra, de modo que retenham a atividade desejada. Em uma

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48/132 modalidade, o ligante tem de cerca de 1 a 50 aminoácidos de comprimento, de preferência, cerca de 1 a 30 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, podem ser usados ligantes de 1 a 20 aminoácidos de comprimento, com cerca de 5 a cerca de 10 aminoácidos encontrando uso em algumas modalidades. Os ligantes úteis incluem polímeros de glicina-serina, incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n, e (GGGS)n, onde n é um número inteiro de pelo menos um (e geralmente de 3 a 4), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alaninaserina e outros ligantes flexíveis. Alternativamente, uma variedade de polímeros não proteicos, incluindo, porém sem limitação, polietilenoglicol (PEG), polipropilenoglicol , polioxialquilenos ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol, pode encontrar uso como ligantes.

[0135] Outras sequências de ligantes podem incluir qualquer sequência de qualquer comprimento de domínio CL/CH1, mas nem todos os resíduos de domínio CL/CH1; por exemplo, os primeiros 5 a 12 resíduos de aminoácidos dos domínios CL/CH1. Os ligantes podem ser derivados de cadeia leve de imunoglobulina, por exemplo, Ck ou CÀ. Os ligantes podem ser derivados de cadeias pesadas de imunoglobulina de qualquer isotipo, incluindo, por exemplo, Cyl, Cy2, Cy3, Cy4, Cocl, Coc2, Có, Cs e Cp. As sequências de ligantes podem também ser derivadas a partir de outras proteínas, como proteínas de tipo Ig (por exemplo, TCR, FcR, KIR), sequências derivadas de região de dobradiça e outras sequências naturais de outras proteínas.

[0136] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de domínio, usado para ligar quaisquer dois domínios juntos como descrito na presente invenção. Embora qualquer ligante adequado possa ser usado, muitas modalidades usam um polímero de glicina-serina, incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n e (GGGS)n, em que n é um número inteiro de pelo menos um (e geralmente de 3 a 4 a 5), bem como qualquer sequência de peptídeos que

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49/132 permita a fixação recombinante dos dois domínios com flexibilidade e comprimento suficiente para permitir que cada domínio retenha sua função biológica.

A. Anticorpos Humanizados e Quiméricos [0137] Em algumas modalidades, os anticorpos na presente invenção podem ser derivados de uma mistura de espécies diferentes, por exemplo, um anticorpo quimérico e/ou um anticorpo humanizado. Em geral, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados se referem a anticorpos que combinam regiões de mais de uma espécie. Por exemplo, os anticorpos quiméricos tradicionalmente compreendem a região variável (ou regiões variáveis) de um camundongo (ou rato, em alguns casos) e a região constante (ou regiões constantes) de um ser humano. Anticorpos humanizados se referem, em geral, a anticorpos não humanos que tiveram as regiões framework de domínio variável trocadas por sequências encontradas em anticorpos humanos. De modo geral, em um anticorpo humanizado, o anticorpo inteiro, exceto as CDRs, é codificado por um polinucleotídeo de origem humana ou é idêntico a tal anticorpo, exceto no interior de suas CDRs. As CDRs, algumas ou todas sendo codificadas por ácidos nucleicos que se originam em um organismo não humano, são enxertadas no esqueleto de folha beta de uma região variável de anticorpo humano, cuja especificidade é determinada pelas CDRs enxertadas. A criação destes anticorpos é descrita em, por exemplo, WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536, todos inteiramente incorporadas por referência. Retromutação de resíduos de framework aceitadores selecionados para os resíduos doadores correspondentes é muitas vezes necessária para recuperar a afinidade que é perdida no construto enxertado inicial (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213,

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50/132 todos inteiramente incorporados a título de referência). O anticorpo humanizado, em condições ideais, também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana e, desta forma, tipicamente compreenderá uma região Fc humana. Os anticorpos humanizados também podem ser gerados usando camundongos com um sistema imunológico geneticamente modificado. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654, inteiramente incorporadas por referência. Uma variedade de técnicas e métodos para a humanização e remodelação de anticorpos não humanos é conhecida na técnica (consultar Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (EUA) e as referências aqui citadas, todas incorporadas em sua totalidade por referência). Os métodos de humanização incluem, porém sem limitação, métodos descritos em Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332: 323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11: 321-8, todos inteiramente incorporadas por referência. A humanização ou outros métodos para reduzir a imunogenicidade de regiões variáveis de anticorpo não humano podem incluir métodos de ressurgimento, como descrito, por exemplo, em Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973, inteiramente incorporadas por referência.

[0138] Em certas modalidades, os anticorpos da invenção compreendem uma região variável de cadeia pesada a partir de um gene de imunoglobulina de cadeia pesada de linhagem germinativa particular e/ou uma região variável de

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51/132 cadeia leve de um gene de imunoglobulina de cadeia leve de linhagem germinativa particular. Por exemplo, tais anticorpos podem compreender ou consistir em um anticorpo humano que compreende regiões variáveis de cadeia leve ou pesada que são o produto de ou derivadas de uma sequência de linhagem germinativa particular. Um anticorpo humano que é o produto de ou derivado de uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana pode ser identificado como tal mediante a comparação entre a sequência de aminoácidos do anticorpo humano e as sequências de aminoácidos de imunoglobulinas de linhagem germinativa humana e a seleção da sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana que está mais próxima em sequência (isto é, % de identidade maior) à sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é o produto de ou derivado de uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana particular pode conter diferenças de aminoácido em comparação com a sequência de linhagem germinativa, devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutação sítio-dirigida. Entretanto, um anticorpo humanizado tipicamente é pelo menos 80% idêntico em sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo como sendo derivado de sequências humanas quando comparado às sequências de aminoácidos de imunoglobulina de linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências de linhagem germinativa murina). Em certos casos, um anticorpo humanizado pode ser pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99%, ou até pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo humanizado derivado de uma sequência de linhagem germinativa

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52/132 humana particular exibirá não mais que 10 a 20 diferenças de aminoácido da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humanizado pode exibir não mais que 5, ou até não mais que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.

[0139] Em uma modalidade, o anticorpo parental foi maturado por afinidade, conforme é conhecido na técnica. Os métodos à base de estrutura podem ser empregados para humanização e maturação por afinidade, por exemplo, conforme descrito na patente US n² 7.657.380. Os métodos à base de seleção podem ser empregados para humanizar e/ou maturar por afinidade as regiões variáveis do anticorpo, incluindo, porém sem limitação, métodos descritos em Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 2261122618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16 (10): 753-759, todos inteiramente incorporadas por referência. Outros métodos de humanização podem envolver a enxertia de apenas partes das CDRs, incluindo, porém sem limitação, métodos descritos em Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169: 3076-3084, todos inteiramente incorporadas por referência.

[0140] O termo anticorpo é usado no sentido mais amplo e inclui, por exemplo, uma imunoglobulina intacta ou uma porção de ligação de antígeno. As porções de ligação de antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por divagem química ou enzimática de anticorpos intactos. Desta forma, o termo anticorpo inclui anticorpos tetraméricos tradicionais de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, bem como fragmentos de ligação de antígeno como Fv, Fab e scFvs. Em alguns casos, a invenção fornece anticorpos

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53/132 biespecíficos que incluem pelo menos um domínio de ligação de antígeno conforme descrito na presente invenção.

[0141] O anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção deve exibir, de preferência, cinética de plasma melhorada. O melhoramento em cinética de plasma de um anticorpo humanizado na presente invenção significa que um parâmetro que representa a cinética do anticorpo humanizado em plasma é alterado em comparação com um anticorpo não humanizado que corresponde ao anticorpo humanizado. Os exemplos de parâmetros que representam a cinética de plasma incluem: meia-vida plasmática, tempo de retenção média em plasma e depuração de plasma. Tal parâmetro que é alterado significa que o parâmetro é aumentado ou diminuído. O anticorpo não humanizado que corresponde ao anticorpo humanizado significa um anticorpo não humanizado usado como uma base para produzir o anticorpo humanizado, por exemplo, um anticorpo de camundongo ou um anticorpo quimérico.

[0142] O termo anticorpo quimérico se refere a um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais outros anticorpos. Um anticorpo com enxerto de CDR é um anticorpo que compreende uma ou mais CDRs derivadas de um anticorpo de um isotipo ou espécie particular e 3 framework de um outro anticorpo do isotipo ou espécie igual ou diferente.

IX. COMPOSIÇÕES [0143] A presente invenção fornece vários domínios de ligação de antígeno diferentes (em geral, incorporados em anticorpos) que se ligam à proteína tau humana que é fosforilada em Ser413 (pSer413), em uma reação de antígenoanticorpo.

[0144] . A reação de antígeno-anticorpo é medida pela afinidade de um

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54/132 anticorpo a uma proteína Tau fosforilada ou um peptídeo Tau fosforilado, isto é, constante de dissociação de equilíbrio (Kd). Em certas modalidades, o valor de Kd é medido com uma proteína Tau fosforilada. Em algumas modalidades, o valor de Kd é medido com um peptídeo Tau fosforilado. Em uma modalidade, o peptídeo Tau fosforilado é fosforilado em apenas um resíduo (por exemplo, SEQ ID NO:75). Em uma outra modalidade, o peptídeo fosforilado é fosforilado em múltiplos resíduos (por exemplo, SEQ ID NO:76 ou SEQ ID NO:78). Em algumas modalidades, o valor de Kd é medido com o antígeno (por exemplo, a proteína Tau fosforilada ou o peptídeo Tau fosforilado) imobilizado, em tais casos, a medição de afinidade inclui um componente de avidez, isto é, em um modo de ligação bivalente. Em outras modalidades, o valor de Kd é medido com o anticorpo (por exemplo, o anticorpo parental de camundongo, o anticorpo quimérico ou as variantes de anticorpo humanizado) imobilizado, em tal caso, a medição de afinidade não inclui um componente de avidez, isto é, em um modo de ligação monovalente. Em ainda outras modalidades, o valor de Kd é medido com o anticorpo imobilizado e com a proteína Tau fosforilada como o analito. Em mais outras modalidades, o valor de Kd é medido com o anticorpo imobilizado e com o peptídeo fosforilado como o analito. Em certas modalidades, o valor de Kd é medido em um modo de ligação bivalente. Em outras modalidades, o valor de Kd é medido em um modo de ligação monovalente.

[0145] Desta forma, em certas modalidades, o valor de Kd é de 5xl0‘⁸ M ou menos; em algumas modalidades, o valor de Kd é de 5χ10'⁹ M ou menos; em outras modalidades, o valor de Kd é de 5xlO¹⁰ M ou menos; em ainda outras modalidades, o valor de Kd é de 1,86χ10'⁸ M ou menos; em mais outras modalidades, o valor de Kd é de 2χ10'⁹ M ou menos; em ainda outras modalidades, o valor de Kd é de 2xlO¹⁰ M ou menos. Em uma modalidade

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55/132 específica, o anticorpo divulgado na presente invenção se liga a uma proteína Tau fosforilada ou um peptídeo Tau fosforilado com um Kd de 5χ10'⁸ M ou menos, medido com o anticorpo imobilizado e a proteína tau fosforilada ou peptídeo tau fosforilado como um analito. Em uma outra modalidade específica, o anticorpo divulgado na presente invenção se liga a uma proteína Tau fosforilada ou um peptídeo Tau fosforilado com um Kd de 5χ10'⁹ M ou menos, medido com a proteína Tau fosforilada ou o peptídeo Tau fosforilado imobilizado e o anticorpo como um analito. Em mais outra modalidade específica, o anticorpo divulgado na presente invenção se liga a uma proteína Tau fosforilada ou um peptídeo Tau fosforilado com um Kd de 2χ10'⁹ M ou menos, medido com a proteína Tau fosforilada ou o peptídeo Tau fosforilado imobilizado e o anticorpo como um analito. Em uma outra modalidade específica, o anticorpo divulgado na presente invenção se liga a uma proteína Tau fosforilada ou um peptídeo Tau fosforilado com um Kd de 5xlO¹⁰ M ou menos, medido com a proteína Tau fosforilada ou o peptídeo Tau fosforilado imobilizado e o anticorpo como um analito. Em uma outra modalidade específica, o anticorpo divulgado na presente invenção se liga a uma proteína Tau fosforilada ou um peptídeo Tau fosforilado com um Kd de 2xlO¹⁰ M ou menos, medido com a proteína Tau fosforilada ou o peptídeo Tau fosforilado imobilizado e o anticorpo como um analito.

[0146] Adicionalmente, conforme descrito na presente invenção, os anticorpos da invenção se ligam, de preferência, a peptídeos ou proteínas tau que são fosforilados na posição S413 em relação a proteínas ou peptídeos que não contêm um fosfato na posição 413.

[0147] O anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção é um anticorpo que pode causar uma reação de antígenoanticorpo com a proteína tau fosforilada ou peptídeo tau fosforilado de acordo

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56/132 com a presente invenção.

[0148] As proteínas tau fosforiladas e peptideos tau com os quais o anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção podem causar a reação de antígeno-anticorpo são aqueles que fosforilaram em um resíduo de aminoácido que é fosforilado especificamente em doenças neurodegenerativas como AD. Especificamente, tais proteínas tau e peptídeos tau são fosforilados pelo menos no resíduo de serina na posição 413 da sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:1 (Ser413), e também podem ser fosforilado em um ou mais resíduos de aminoácido que correspondem a números de aminoácidos 410 a 421, isto é, em um ou mais resíduos de aminoácidos que correspondem ao resíduo de serina na posição 412 (Ser412), ao resíduo de treonina na posição 414 (Thr414) e ao resíduo de serina na posição 416 (Ser416) da sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:1. Tipicamente, tais peptídeos fosforilados incluem, embora não limitados: pSer412/pSer413(Cys-), que tem a sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:7; pSer413(Cys-), que tem a sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:8 e pSer409/pSer412/pSer413(Cys-), que tem a sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:9.

[0149] O peptídeo tau fosforilado de acordo com a presente invenção pode ser usado na produção do anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção, ou como um antígeno para estudo de reatividade.

[0150] O peptídeo tau fosforilado de acordo com a presente invenção pode ser produzido por um versado na técnica usando métodos de síntese ou métodos de engenharia genética adequados. Os exemplos de métodos para produzir o peptídeo fosforilado via síntese incluem método Boc (Wakamiya T., Chemistry Letters, Vol.22, página 1401, 1993), método Fmoc (Perich, J. W., International Journal of Peptide and Protein Research, Vol.40, páginas 134-140, 1992), e

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JP3587390B e WO2013/180238, embora um versado na técnica possa empregar qualquer outro método conforme for adequado. Os exemplos de métodos para produzir o peptídeo fosforilado via engenharia genética incluem um método em que um material genético (DNA ou RNA) que tem uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptído a ser produzido ou um precursor do mesmo é preparado e, após etapas opcionais como introdução em um vetor de expressão e adição de uma sequência promotora, introduzido em um hospedeiro adequado para expressão ou submetido a um sistema de síntese de proteína isento de célula. Neste caso, o peptídeo pode ser fosforilado em um sítio desejado causando a reação de fosforilação no hospedeiro por meio de enzimas como quinases, que podem ser inerentes ao hospedeiro ou provocadas a expressarem via engenharia genética, ou recuperando o peptídeo alvo a partir do hospedeiro e, então, causando a reação de fosforilação usando enzimas como quinases. No último caso, a reação de fosforilação pode ser causada in vitro submetendo o peptídeo alvo a uma enzima que é conhecida por desempenhar uma função na reação de fosforilação de tau, como glicogênio sintase quinase 3 (GSK3) ou proteína quinase dependente de ciclina 5 (CDK5). Dentre os peptídeos fosforilados no hospedeiro ou in vitro de acordo com os métodos acima, os peptídeos fosforilados em um resíduo de aminoácido desejado podem ser recuperados, por exemplo, mediante a seleção daqueles que se ligam especificamente ao anticorpo anti-tau fosforilada mencionado acima via reação de anticorpo-antígeno.

[0151] O peptídeo tau fosforilado de acordo com a presente invenção pode ser modificado em sua sequência N-terminal e/ou sequência C-terminal com uma substância que tem outras funções adequadas para os propósitos desejados. Por exemplo, o peptídeo tau fosforilado de acordo com a presente invenção pode ser adicionado em seu N-terminal e/ou C-terminal com, por

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58/132 exemplo, resíduo de metionina, grupo acetila ou ácido piroglutâmico, ou modificado em seu N-terminal e/ou C-terminal com, por exemplo, material fluorescente. Alternativamente, o N-terminal e/ou C-terminal do peptídeo tau fosforilado de acordo com a presente invenção pode ser modificado com, por exemplo, um peptídeo ou uma proteína. Os exemplos de peptídeos utilizáveis para tal modificação incluem sequências de etiqueta adequadas (tipicamente etiqueta de histidina ou etiqueta FLAG), peptídeos que têm sequências de aminoácidos que podem ser reconhecidas por um receptor de célula T (TCR) ou um complexo principal de histocompatibilidade (MHC), proteínas derivadas de vírus ou bactérias ou peptídeos que têm sequências derivadas de tais proteínas. Além disso, o peptídeo tau fosforilado de acordo com a presente invenção inclui aqueles que têm pelo menos um resíduo de aminoácido diferente dos resíduos N-terminal e C-terminal modificados com qualquer outro composto ou peptídeo. Um versado na técnica teria capacidade para realizar tal modificação para um peptídeo tau fosforilado usando qualquer método conhecido, como aqueles descritos em Hermanson et al., Bioconjugate Techniques, (US), Academic Press, 1996.

[0152] Um versado na técnica teria capacidade para realizar a medição de uma reação de antígeno-anticorpo mediante a seleção de um ensaio de ligação adequado em um sistema de uma fase sólida ou fase líquida. Os exemplos de tais ensaios incluem, embora não limitados a: ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), imunoensaio de enzima (EIA), ressonância de plásmon de superfície (SPR), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) e transferência de energia de ressonância de luminescência (LRET). A medição de afinidade de ligação de antígeno-anticorpo pode ser realizada, por exemplo, identificando um anticorpo e/ou um antígeno com, por exemplo, uma enzima, um material fluorescente, um material luminescente ou radioisotopo, e

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59/132 detectando a reação de antígeno-anticorpo usando um método adequado para medir as propriedades físicas e/ou químicas características do marcador usado.

[0153] O anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção deve ter, de preferência, uma afinidade de ligação seletiva melhorada com uma proteína tau ou peptídeo tau fosforilado em relação a sua afinidade de ligação com uma proteína tau ou peptídeo tau não fosforilado. O melhoramento na afinidade de ligação seletiva de um anticorpo com uma proteína tau ou peptídeo tau fosforilado neste contexto significa que a razão entre a afinidade de ligação do anticorpo com a proteína tau ou peptídeo tau fosforilado e sua afinidade de ligação com a proteína tau ou peptídeo tau não fosforilado correspondente é aumentada. Tal afinidade de ligação seletiva pode ser analisada, por exemplo, usando uma placa sobre a qual a proteína tau ou peptídeo tau fosforilado foi imobilizado e uma placa sobre a qual a proteína tau ou peptídeo tau não fosforilado correspondente foi imobilizado, medindo a afinidade de ligação do anticorpo com cada uma destas proteínas ou peptídeos por meio, por exemplo, de ELISA (por exemplo, como um valor OD de absorvância de comprimento de onda de emissão), e dividindo o valor da afinidade de ligação (por exemplo, valor OD de absorvância) obtido para proteína tau ou peptídeo tau fosforilado pelo valor obtido para a proteína tau ou peptídeo tau não fosforilado correspondente. As condições específicas para ELISA podem ser aquelas descritas na seção de Exemplos abaixo.

[0154] O anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção deve ter, de preferência, uma razão entre a afinidade de ligação seletiva com a proteína tau ou peptídeo tau fosforilado e a afinidade de ligação para a proteína tau ou peptídeo tau não fosforilado de pelo menos cerca de 40 ou mais, particularmente pelo menos cerca de 50 ou mais, mais particularmente pelo menos cerca de 60 ou mais, desde que a afinidade de

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60/132 ligação seletiva seja obtida de acordo com o método descrito no Exemplo 2, abaixo. Em uma modalidade, a razão é calculada mediante a comparação entre a afinidade de ligação dos anticorpos anti-pSer413 tau com um peptídeo fosforilado como SEQ ID NO:8 e a afinidade de ligação com o peptídeo não fosforilado da SEQ ID NO:69.

[0155] O anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção deve exibir, de preferência, uma capacidade melhorada para entrar no cérebro quando administrado no sangue. O melhoramento na capacidade de um anticorpo para entrar no cérebro quando administrado no sangue neste contexto significa que, quando o anticorpo é administrado no sangue de um ser humano ou qualquer outro mamífero (por exemplo, um camundongo ou um rato), a razão entre a concentração de anticorpo no cérebro e a concentração de anticorpo no plasma é aumentada. Uma capacidade do anticorpo para entrar no cérebro pode ser analisada, por exemplo, administrando o anticorpo a um animal (por exemplo, um camundongo ou um rato) via sangue e, após um período predeterminado (por exemplo, uma semana), coletando o sangue e preparando homogenato de cérebro, medindo a concentração de anticorpo em cada uma dentre a amostra de plasma obtida e a amostra de homogenato de cérebro obtida usando um método conhecido (por exemplo, ELISA sanduíche usando uma anticorpo policlonal anti-humano), e dividindo a concentração de anticorpo no cérebro pela concentração de anticorpo no plasma. As condições específicas para ELISA podem ser aquelas descritas na seção de Exemplos abaixo. Sabe-se que a concentração de um anticorpo que entra no cérebro é, em geral, de cerca de 0,1 a 0,3% daquela no plasma.

[0156] O anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção deve ter, de preferência, uma razão entre a concentração de

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61/132 anticorpo no cérebro e a concentração de anticorpo no plasma de 0,30% ou mais, particularmente 0,35% ou mais, mais particularmente 0,40% ou mais, até mais particularmente 0,45% ou mais, desde que a razão seja obtida de acordo com o método descrito na seção [7] Exemplo 7: Análise de migração intracerebral dos Exemplos abaixo.

A. Domínios de Ligação de Antígeno da Invenção [0157] A invenção fornece domínios de ligação de antígeno que se ligam à proteína pSer413 tau humana, preferencialmente, em relação a ligação a proteínas tau que não são fosforiladas em Ser413, conforme descrito na presente invenção.

[0158] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:91, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0159] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:92, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0160] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:93, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0161] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:94, uma vlCDR2

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62/132 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID N0:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0162] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:95, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0163] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:96, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0164] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:97, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0165] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:98, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0166] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:99, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem

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SEQ ID NO:88.

[0167] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NQ:100, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0168] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:101, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0169] Em uma modalidade, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno que compreendem uma vICDRl que tem SEQ ID NO:102, uma vlCDR2 que tem SEQ ID NO:82; uma vlCDR3 que tem SEQ ID NO:83; uma vhCDRl que tem SEQ ID NO:86; uma vhCDR2 que tem SEQ ID NO:115; e uma vhCDR3 que tem SEQ ID NO:88.

[0170] A invenção fornece domínios de ligação de antígeno à proteína pSer413 tau humana. Conforme mostrado nos exemplos, vários domínios leves variáveis e pesados variáveis humanizados são fornecidos, que podem ser combinados em qualquer combinação, e podem ser adicionados a domínios constantes de IgG humana em qualquer combinação.

[0171] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46 (SEQ ID NO:84) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VHll (SEQ ID NO:116) para formar um domínio Fv que liga pSer413 tau. Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

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64/132 [0172] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46 (SEQ ID NO:84) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0173] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL47 (SEQ ID NQ:104) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VHll (SEQ ID NO:116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0174] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL47 (SEQ ID NQ:104) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0175] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_G34A (SEQ ID NQ:105) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH 11 (SEQ ID NO:116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0176] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_G34A (SEQ ID NQ:105) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0177] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_G34S (SEQ ID NQ:106) é combinado com o domínio variável pesadoTal505-VHll (SEQ

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ID N0116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0178] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_G34S (SEQ ID NQ:106) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0179] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_G34T (SEQ ID NQ:107) é combinado com o domínio variável pesadoTal505-VHll (SEQ ID NO:116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0180] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_G34T (SEQ ID NQ:107) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0181] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_N33Q (SEQ ID NQ:108) é combinado com o domínio variável pesadoTal505-VHll (SEQ ID NO:116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0182] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_N33Q (SEQ ID NQ:108) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126

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66/132 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0183] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505VL46 N33Q G34A (SEQ ID NQ:109) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VHll (SEQ ID NO:116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0184] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505VL46 N33Q G34A (SEQ ID NQ:109) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0185] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_N33D (SEQ ID NQ:110) é combinado com o domínio variável pesadoTal505-VHll (SEQ ID NO:116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0186] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_N33D (SEQ ID NQ:110) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0187] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_N33S (SEQ ID NO:111) é combinado com o domínio variável pesadoTal505-VHll (SEQ ID NO:116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0188] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_N33S

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67/132 (SEQ ID NO:111) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0189] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_N33T (SEQ ID NO:112) é combinado com o domínio variável pesadoTal505-VHll (SEQ ID NO:116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0190] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_N33T (SEQ ID NO:112) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0191] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_S28N (SEQ ID NO:113) é combinado com o domínio variável pesadoTal505-VHll (SEQ ID NO:116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0192] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505-VL46_S28N (SEQ ID NO:113) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0193] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505VL46 G34A S28N (SEQ ID NO:114) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VHll (SEQ ID NO:116). Nesta modalidade, o domínio constante pesado

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68/132 humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0194] Em uma modalidade, o domínio variável leve Tal505VL46 G34A S28N (SEQ ID NO:114) é combinado com o domínio variável pesado Tal505-VH65 (SEQ ID NO:117). Nesta modalidade, o domínio constante pesado humano é selecionado a partir de SEQ ID NO:sll8, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 e 126 e o domínio constante kappa leve humano, SEQ ID NO:52.

[0195] O anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção também deve ter, de preferência, uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve que têm sequências de aminoácidos específicas, especificamente conforme mencionado abaixo.

[0196] Como uma região variável de cadeia pesada, o anticorpo da presente invenção deve incluir, de preferência, uma sequência de aminoácidos que tem 80% ou mais, particularmente 85% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, até mais particularmente 95% ou mais, ainda mais particularmente 100%, de identidade com uma sequência selecionada a partir da sequência VH11 (definida em SEQ ID NO:18), sequência VH12 (definida em SEQ ID NQ:20), sequência VH47 (definida em SEQ ID NO:22), sequência VH61 (definida em SEQ ID NO:24), sequência VH62 (definida em SEQ ID NO:26), sequência VH64 (definida em SEQ ID NO:28) e sequência VH65 (definida em SEQ ID NQ:30). Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção poderia incluir, como uma região variável de cadeia pesada, a sequência de aminoácidos da sequência VH65, ou uma sequência de aminoácidos derivada da sequência VH65 por meio de uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em: substituição de Ala na posição 28 (Kabat η²: H28) por Thr; substituição de Asn na posição 30 (Kabat η²: H30) por Ser; substituição de Vai na posição 49 (Kabat n²: H49) por Gly; substituição de Ala na posição 64 (Kabat η²: H61) por Asp; e

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69/132 substituição de Gin na posição 78 (Kabat n°: H75) por Lys.

[0197] Como uma região variável de cadeia leve, o anticorpo da presente invenção deve incluir, de preferência, uma sequência de aminoácidos que tem 80% ou mais, particularmente 85% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, até mais particularmente 95% ou mais, ainda mais particularmente 100%, de identidade com uma sequência selecionado a partir da sequência VL15 (definida em SEQ ID NO:32), sequência VL36 (definida em SEQ ID NO:34), sequência VL46 (definida em SEQ ID NO:36), sequência VL47 (definida em SEQ ID NO:38), sequência VL48 (definida em SEQ ID NO:40) e sequência VL50 (definida em SEQ ID NO:42). Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção poderia incluir, como uma região variável de cadeia leve, a sequência de aminoácidos da sequência VL47, ou uma sequência de aminoácidos derivada da sequência VL47 por meio de uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em: substituição de Asp na posição 17 (Kabat n²: L17) por Glu; substituição de Ser na posição 28 (Kabat n²: L27A) por Asn; substituição de Gin na posição 42 (Kabat n²: L37) por Leu; substituição de Gin na posição 50 (Kabat n²: L45) por Arg; e substituição de Arg na posição 51 (Kabat n²: L46) por Leu.

[0198] Em uma outra modalidade, o anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção poderia incluir qualquer combinação selecionada a partir de:

(1) sequência VH11 (SEQ ID NO:116) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL15 (SEQ ID NO:32) como uma região variável de cadeia leve;

(2) sequência VH11 (SEQ ID NO:116) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL36 (SEQ ID NO:34) como uma região variável de cadeia leve;

(3) sequência VH11 (SEQ ID NO:116) como uma região variável de cadeia

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70/132 pesada e sequência VL46 (SEQ ID NO:36) como uma região variável de cadeia leve;

(4) sequência VH11 (SEQ ID NO:116) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL47 (SEQ ID NO:38) como uma região variável de cadeia leve;

(5) sequência VH11 (SEQ ID NO:116) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 (SEQ ID NO:40) como uma região variável de cadeia leve;

(6) sequência VH11 (SEQ ID NO:116) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL50 (SEQ ID NO:42) como uma região variável de cadeia leve;

(7) sequência VH12 (SEQ ID NO:20) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 (SEQ ID NO:40) como uma região variável de cadeia leve;

(8) sequência VH47 (SEQ ID NO:22) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 (SEQ ID NO:40_) como uma região variável de cadeia leve;

(9) sequência VH61 (SEQ ID NO:24) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 (SEQ ID NO:40) como uma região variável de cadeia leve;

(10) sequência VH62 (SEQ ID NO:26) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 (SEQ ID NO:40) como uma região variável de cadeia leve;

(11) sequência VH64 (SEQ ID NO:28) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL47 (SEQ ID NO:38) como uma região variável de cadeia leve;

(12) sequência VH64 (SEQ ID NO:28) como uma região variável de cadeia

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71/132 pesada e sequência VL48 (SEQ ID NO:40) como uma região variável de cadeia leve;

(13) sequência VH65 (SEQ ID NO:117) como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL47 (SEQ ID NO:37) como uma região variável de cadeia leve;

[0199] Mediante a seleção de sequências de aminoácidos de CDRs e/ou regiões variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve dentre aquelas mencionadas acima e a combinação das mesmas com sequências de aminoácidos de regiões framework e/ou regiões constantes de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humano, conforme adequado, um versado na técnica terá capacidade para projetar um anticorpo humanizado antitau fosforilada de acordo com a presente invenção. As sequências de aminoácidos de regiões framework e/ou regiões constantes de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humano podem ser selecionadas a partir, por exemplo, daquelas de subtipos de IgG, IgA, IgM, IgE e IgD humana ou variantes dos mesmos.

B. Anticorpos anti-pser413 tau Específicos [0200] A invenção fornece vários anticorpos específicos que compreendem um par de sequências, uma cadeia pesada e uma cadeia leve conforme exposto a seguir:

mAb-aPTl: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:144 mAb-aPT2: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:145 mAb-aPT3: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:146 mAb-aPT4: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:147 mAb-aPT5: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:148 mAb-aPT6: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:149 mAb-aPT7: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:150

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72/132 mAb-aPT8: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID N0:151 mAb-aPT9: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:152 mAb-aPTIO: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:153 mAb-aPTll: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:154 mAb-aPT12: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:155 mAb-aPT13: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:156 mAb-aPT14: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:157 mAb-aPT15: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:158 mAb-aPT16: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:159 mAb-aPT17: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NQ:160 mAb-aPT18: LC SEQ ID NO:184 e HC SEQ ID NO:161 mAb-aPT19: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:144 mAb-aPT20: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:145 mAb-aPT21: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:146 mAb-aPT22: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:147 mAb-aPT23: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:148 mAb-aPT24: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:149 mAb-aPT25: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NQ:150 mAb-aPT26: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:151 mAb-aPT27: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:152 mAb-aPT28: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:153 mAb-aPT29: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:154 mAb-aPT30: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:155 mAb-aPT31: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:156 mAb-aPT32: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:157 mAb-aPT33: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:158 mAb-aPT34: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NO:159

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73/132 mAb-aPT35: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID NQ:160 mAb-aPT36: LC SEQ ID NO:185 e HC SEQ ID N0:161

C. Anticorpos que Competem por Ligação [0201] Além dos domínios de ligação a antígeno e anticorpos que contêm os mesmos que se ligam à proteína tau humana que é fosforilada na posição 413 (pSer413), a invenção fornece anticorpos que competem por ligação com os anticorpos citados na presente invenção.

[0202] Um anticorpo humanizado que causa a ligação competitiva a pSer413 tau com o anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção também está incluído no escopo da presente invenção. O termo ligação competitiva usado na presente invenção significa que, quando existem dois ou mais anticorpos monoclonais juntamente com um antígeno, a ligação de um dos anticorpos ao antígeno é inibida pela ligação do outro anticorpo ao antígeno. A ligação competitiva pode ser normalmente medida, por exemplo, mediante a adição, a uma quantidade constante (concentração) de um anticorpo monoclonal, de um outro anticorpo monoclonal com variação da quantidade (concentração) do mesmo, e determinação da quantidade (concentração) do último anticorpo monoclonal no qual a quantidade de ligação do primeiro anticorpo monoclonal, que existe na quantidade constante, é diminuída. O grau de inibição do mesmo pode ser expresso na unidade de IC50 ou Ki. O anticorpo humanizado que causa a ligação competitiva com o anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção significa um anticorpo que tem um IC50 de 1 μΜ ou menos, particularmente 100 nM ou menos, mais particularmente 10 nM ou menos, quando medida uma ligação de antígeno-anticorpo usando o anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção a 10 nM.

[0203] Podem ser feitos estudos de ligação competitiva conforme é

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74/132 conhecido na técnica, em geral, usando ensaios de ligação SPR/Biacore® ou Octet®, bem como ELISA e ensaios à base de célula.

[0204] Em algumas modalidades, os domínios leves variáveis e pesados variáveis dos anticorpos de ligação competitiva têm pelo menos 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com pelo menos uma das regiões variáveis descritas na presente invenção, e nos domínios constantes, têm pelo menos 99 ou 100% de identidade com uma sequência de IgG humana descrita na Figura 13.

D. Substituições de Aminoácido [0205] Além das sequências descritas na presente invenção, a invenção fornece domínios de ligação de antígeno e anticorpos que contêm os mesmos que podem ter uma ou mais substituições de aminoácido em comparação com a sequência inicial parental.

[0206] Desta forma, por exemplo, para todos os domínios leves e pesados variáveis listados na presente invenção, podem ser feitas variantes adicionais. Conforme descrito na presente invenção, em algumas modalidades, o conjunto de 6 CDRs pode ter de 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 modificações de aminoácido (com substituições de aminoácido encontrando uso particular). Nestas modalidades, em geral, uma única CDR tem não mais que 1 ou 2 substituições de aminoácido, e as sequências mutadas retêm ligação à proteína pSer413 tau. Entretanto, quando as variantes de aminoácido são produzidas para as CDRs das sequências descritas na presente invenção, as CDRs resultantes não são para as CDRs murinas descritas no documento n² PCT/JP13/65090 e mostradas na SEQ ID NOs:81, 82 e 83 (CDRs leves variáveis) e SEQ ID NOs:86, 87 e 88 (CDRs pesadas variáveis).

[0207] Em alguns casos, podem ser feitas alterações na região (ou regiões) framework dos domínios pesados e/ou leves variáveis. Nesta modalidade, as variantes preferenciais nas regiões framework (por exemplo, excluindo as CDRs)

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75/132 retêm pelo menos cerca de 80, 85, 90 ou 95% de identidade com uma sequência de linhagem germinativa humana. Desta forma, por exemplo, as CDRs idênticas, conforme descrito na presente invenção, podem ser combinadas com sequências de framework diferentes a partir de sequências de linhagem germinativa humana, contanto que as regiões framework retenham pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com uma sequência de linhagem germinativa humana.

[0208] Em algumas modalidades, para as cadeias leves humanizadas descritas na presente invenção, a linhagem germinativa de cadeia leve humana mais próxima é IGKV2-30 que tem uma identidade de 81% com as sequências na presente invenção. Desta forma, as variantes adicionais podem ser feitas em regiões framework leves, contanto que a identidade seja pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com IGKV2-30.

[0209] Para as cadeias pesadas humanizadas na presente invenção, a linhagem germinativa humana mais próxima para cadeia pesada é IGHV3-73 que tem uma identidade de 85% com as sequências na presente invenção. Desta forma, as variantes adicionais podem ser feitas em regiões framework leves, contanto que a identidade seja pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com IGHV3-73.

[0210] Alternativamente, as CDRs podem ter modificações de aminoácido (por exemplo, de 1, 2, 3,4 ou 5 modificações de aminoácido no conjunto de CDRs (isto é, as CDRs podem ser modificadas contanto que o número total de alterações no conjunto de 6 CDRs seja menor que 6 modificações de aminoácido, com qualquer combinação de CDRs sendo alterada; por exemplo, pode existir uma alteração em vICDRl, duas em vhCDR2, nenhuma em vhCDR3, etc.)), bem como ter alterações de região framework, contanto que as regiões framework retenham pelo menos 80, 85 ou 90% de identidade com uma sequência de

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76/132 linhagem germinativa humana, e as CDRs resultantes não sejam para as CDRs murinas descritas no documento n² PCT/JP13/65090 e mostradas na SEQ ID NOs:81, 82 e 83 (CDRs leves variáveis) e SEQ ID NOs:86, 87 e 88 (CDRs pesadas variáveis).

[0211] Em geral, a porcentagem de identidade para comparação entre anticorpos anti-pSer413 tau é de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, com pelo menos cerca de 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade sendo preferencial. A porcentagem de identidade pode ser ao longo de toda a sequência de aminoácidos, por exemplo, toda a cadeia leve ou pesada ou ao longo de uma porção das cadeias. Por exemplo, estão incluídos na definição dos anticorpos anti-pSer413 tau da invenção aqueles que compartilham identidade ao longo de toda a região variável (por exemplo, em que a identidade é 95 ou 98% idêntica ao longo das regiões variáveis), ou ao longo de toda a região constante.

X. ÁCIDOS NUCLEICOS DA INVENÇÃO [0212] As composições de ácido nucleico que codificam os anticorpos antipSer413 tau da invenção também são fornecidas, bem como vetores de expressão que contêm os ácidos nucleicos e células hospedeiras transformadas com as composições de ácido nucleico e/ou vetor de expressão. Conforme será observado por aqueles versados na técnica, as sequências de proteínas representadas na presente invenção podem ser codificadas por qualquer número de sequências de ácidos nucleicos possíveis, devido à degenerescência do código genético.

[0213] Desta forma, a invenção fornece adicionalmente composições de ácido nucleico que codificam os domínios de ligação de antígeno e anticorpos que contêm os mesmos. Conforme será observado por aqueles versados na técnica, no caso de domínios de ligação de antígeno, as composições de ácido

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77/132 nucleico incluem, em geral, um primeiro ácido nucleico que codifica o domínio variável pesado e um segundo ácido nucleico que codifica o domínio variável leve. No caso de scFvs, um único ácido nucleico que codifica o domínio variável leve e variável pesado, separado por um ligante proteináceo, pode ser feito. No caso de anticorpos tradicionais, as composições de ácido nucleico incluem, em geral, um primeiro ácido nucleico que codifica a cadeia pesada e um segundo ácido nucleico que codifica a cadeia leve, que irá, mediante a expressão em uma célula, espontaneamente montar no formato tetramérico tradicional de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves.

[0214] Conforme é conhecido na técnica, os ácidos nucleicos que codificam os componentes da invenção podem ser incorporados em vetores de expressão conforme é conhecido na técnica, e dependendo das células hospedeiras, usados para produzir os anticorpos heterodiméricos da invenção. Conforme será observado por aqueles versados na técnica, estes dois ácidos nucleicos podem ser incorporados em um único vetor de expressão ou em dois vetores de expressão diferentes. Em geral, os ácidos nucleicos são ligados de modo operacional a qualquer número de elementos reguladores (promotores, origem de replicação, marcadores selecionáveis, sítios de ligação ribossômicos, indutores, etc.). Os vetores de expressão podem ser vetores extracromossômicos ou integrantes.

[0215] Os ácidos nucleicos e/ou vetores de expressão da invenção são, então, transformados em qualquer número de tipos diferentes de células hospedeiras conforme é bem conhecido na técnica, incluindo células de mamífero, bacterianas, de levedura, inseto e/ou fúngicas, com as células mamíferas (por exemplo, células CHO), encontrando uso em muitas modalidades.

[0216] Os anticorpos da invenção são produzidos por meio da cultura de

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78/132 células hospedeiras que compreendem o vetor (ou vetores) de expressão conforme é bem conhecido na técnica. Uma vez produzido, as etapas de purificação de anticorpo tradicionais são feitas.

XI. ENSAIOS BIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS [0217] Os anticorpos anti-pSer413 tau da invenção podem ser analisados acerca de eficácia de várias maneiras. Como um assunto preliminar, os anticorpos podem ser testados acerca da ligação à proteína tau humana ou peptídeos que são fosforilados na posição S413 usando técnicas conhecidas na técnica como técnicas ELISA (consultar, por exemplo, o Exemplo 2(1)), Octet, Biacore ou FACS, em que a ligação a peptídeos fosforilados (por exemplo, SEQ ID NO:8) é comparada à ligação a peptídeos não fosforilados (por exemplo, SEQ ID NO:69) conforme descrito na presente invenção.

[0218] Em algumas modalidades, as eficácias de ligação dos anticorpos divulgados na presente invenção são medidas por ensaio Biacore. Em certas modalidades, o valor de Kd é medido com uma proteína Tau fosforilada. Em algumas modalidades, o valor de Kd é medido com um peptídeo Tau fosforilado. Em uma modalidade, o peptídeo Tau fosforilado é fosforilado em apenas um resíduo (por exemplo, SEQ ID NO:75). Em uma outra modalidade, o peptídeo fosforilado é fosforilado em múltiplos resíduos (por exemplo, SEQ ID NO:76 ou SEQ ID NO:78). Em algumas modalidades, o valor de Kd é medido com o antígeno (por exemplo, a proteína Tau fosforilada ou o peptídeo Tau fosforilado) imobilizado, em tais casos, a medição de afinidade inclui um componente de avidez, isto é, em um modo de ligação bivalente. Em outras modalidades, o valor de Kd é medido com o anticorpo (por exemplo, o anticorpo parental de camundongo, o anticorpo quimérico ou as variantes de anticorpo humanizado) imobilizado, em tal caso, a medição de afinidade não inclui um componente de avidez, isto é, em um modo de ligação monovalente. Em ainda outras

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79/132 modalidades, o valor de Kd é medido com o anticorpo imobilizado e com a proteína Tau fosforilada como o analito. Em mais outras modalidades, o valor de Kd é medido com o anticorpo imobilizado e com o peptídeo fosforilado como o analito. Em certas modalidades, o valor de Kd é medido em um modo de ligação bivalente. Em outras modalidades, o valor de Kd é medido em um modo de ligação monovalente.

[0219] Além disso, os anticorpos anti-pSer413 tau da invenção também podem ser analisados acerca de afinidades de ligação em homogenatos de cérebro de AD humano, bem como analisados em estudos de neutralização de sementes de tau derivadas de AD em um ensaio de agregação HEC293 Tau P301L e/ou em modelos de espalhamento e semeadura de tau derivada de AD usando neurônios iPSC humanos em câmaras microfluídicas.

[0220] Adicionalmente, os anticorpos anti-pSer413 tau da invenção também podem ser usados em ensaios imuno-histoquímicos de amostras de cérebro de paciente de AD.

[0221] Adicionalmente, os anticorpos anti-pSer413 tau da invenção podem ser analisados acerca da eficácia em modelos de animal de distúrbios cognitivos incluindo doença de Alzeheimer (AD). Os animais para pesquisa sobre agentes terapêuticos ou profiláticos para distúrbios cognitivos da invenção incluem modelos de animal para distúrbios cognitivos, especificamente modelos de animal de taupatias. Os modelos de animal para taupatias são animais que expressão tau do tipo normal ou mutante no cérebro, e particularmente modelos de animal que exibem comprometimento em função cognitiva. Tais animais que expressam tau do tipo normal ou mutante no cérebro podem ser preparados por engenharia genética, um exemplo típico sendo os camundongos transgênicos (camundongos Tg). Os modelos de animal como camundongos Tg que expressam tau mutante são úteis como modelos de taupatias familiares

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80/132 genéticas, mas para exame do efeito de um agente terapêutico ou agente profilático para taupatias esporádicas que constituem a maior parte dos casos entre seres humanos, de preferência, um efeito é exibido em camundongos Tg que expressam tau do tipo normal. São mais adequados como camundongos Tg que expressam tau do tipo normal os camundongos preparados nos exemplos de produção da presente invenção, mas também podem ser usados os camundongos Tg relatados por Kambe et al. (Neurobiology of Disease, Vol.42, p.404-414, 2011) e Kimura et al. (The EMBO J. vol.26. P.5143-5152, 2007), ambos dos quais estão incorporados ao presente documento a título de referência, em sua totalidade, e especificamente para a criação e uso de camundongos transgênicos. Entretanto, embora o comprometimento de função cognitiva seja visto nos camundongos de Kambe et al. e Kimura et al., o mesmo aparece após 14 meses de idade e 20 meses de idade, respectivamente, e, portanto, o início é bem na senescência e efeitos de envelhecimento também podem ser fatores contribuintes, embora os efeitos e trabalho da criação a longo prazo também sejam problemas.

[0222] O método preferencial de examinar o efeito de um agente terapêutico ou agente profilático para distúrbios cognitivos de acordo com a invenção em um modelo de animal é um método para testar a função cognitiva, como um teste de aprendizagem por memória. Tal método pode ser um teste de labirinto aquático de Morris, um teste de aprendizagem por etapas ou um teste de reconhecimento de objeto novo, mas, de preferência, é uma combinação de testes de medição comportamental como um teste de campo aberto, a fim de levar em conta as condições de quantidade de comportamento e ansiedade de animal.

[0223] Como métodos para examinar o efeito de um agente terapêutico ou agente profilático para distúrbios cognitivos de acordo com a invenção, é

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81/132 possível usar métodos para examinar os níveis de proteína tau ou tau fosforilada em tecido cerebral, durante a administração a um modelo de animal do distúrbio cognitivo. Em AD e outras doenças neurodegenerativas, os níveis de expressão de proteína tau ou tau fosforilada anormal aumentada estão associados à patologia (Khalid Iqbal et al., Curr. Alzheimer Res., Vol.7, p654-664, 2010). É fato bem conhecido também que a redução da expressão de tau e níveis de tau fosforilada anormais em alguns animais de modelo patológico leva ao melhoramento em função cognitiva e função motora (K. Santa Cruz et al., Science, 30, Vol.9, páginas 476-481, 2005; Sylvie Le Corre et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol.103, páginas 9673-9678, 2006). Como um método para examinar alternações em proteína tau ou tau fosforilada, isto pode ser realizado por um método como Western blotting usando um homogenato de tecido cerebral, conforme descrito nos Exemplos, mas um versado na técnica pode selecionar um outro método adequado como ELISA (Xiyun Chai et al., J. Biol. Chem., Vol.286, páginas 34457-34467, 2011) ou um método imuno-histoquímico (David J. Irwin et al., BRAIN, Vol.135, páginas 807-818, 2012).

XII. FORMULAÇÕES [0224] As formulações dos anticorpos usados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento por meio da mistura de um anticorpo que tem o grau de pureza desejado com estabilizantes, excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (conforme descrito, em geral, em Remington's Pharmaceutical Sciences 16^a edição, Osol, A. Ed. [1980]), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.

[0225] O agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos de acordo com a presente invenção pode ser formulado sob a forma de uma composição farmacêutica que contém, além do anticorpo humanizado anti-tau fosforilada de acordo com a presente invenção, um carreador

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82/132 farmaceuticamente aceitável e/ou outros excipientes. A formulação usando um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou outros excipientes pode ser realizada usando o método descrito em, por exemplo, University of the Sciences in Philadelphia, Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 20^a edição, Lippincott Williams & Wilkins, 2000. Tal agente terapêutico ou profilático pode ser fornecido como uma formulação líquida preparada por meio de dissolução, suspensão ou emulsificação dos ingredientes em meio aquoso estéril ou meio oleoso, ou como uma formulação liofilizada do mesmo. Um meio ou solvente para preparar tal formulação pode ser um meio aquoso, os exemplos do qual incluem água destilada para injeção e solução salina fisiológica, que pode ser opcionalmente usada com a adição de um agente osmorregulação (por exemplo, D-glicose, D-sorbitol, D-manitol e cloreto de sódio) e/ou em combinação com um auxiliar de dissolução adequado como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol ou polietilenoglicol) ou um tensoativo não iônico (por exemplo, polissorbato 80 ou óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 50). Tal formulação também pode ser preparada com um meio oleoso ou solvente, os exemplos do qual incluem óleo de gergelim e óleo de soja, que pode ser opcionalmente usado em combinação com um auxiliar de dissolução como benzoato de benzila e álcool benzílico. Tais fármacos líquidos podem ser muitas vezes preparados usando aditivos adequados como agentes tamponantes (por exemplo, agentes tamponantes de fosfato e agentes tamponantes de acetato), agentes suavizantes (por exemplo, cloreto de benzalcônio e cloridrato de procaína), estabilizantes (por exemplo, albumina sérica humana e polietilenoglicol), conservantes (por exemplo, ácido ascórbico, ácido eritórbico e seus sais), agentes corantes (por exemplo, β-caroteno de clorofila de cobre, Vermelho n² 2 e Azul η² 1), agentes antissépticos (por exemplo, ésteres de ácido paraoxibenzoico, fenol, cloreto de benzetônio e

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83/132 cloreto de benzalcônio), espessantes (por exemplo, hidróxipropil celulose, carboximetil celulose e seus sais), estabilizantes (por exemplo, manitol e sorbitol de albumina sérica humana) e corretores de odor (por exemplo, mentol e aromas cítricos). Formas diferentes de agentes terapêuticos ou profiláticos incluem formulações sólidas como pós, comprimidos, grânulos, cápsulas, pílulas, supositórios e pastilhas. Para uma formulação sólida a ser administrada em forma oral, podem ser usados aditivos, como excipientes (por exemplo, celulose cristalina, lactose e amido), lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio e talco), aglutinantes (hidróxipropil celulose, hidróxipropil metil celulose, macrogol e semelhantes), e desintegrantes (por exemplo, amido e carboximetil celulose cálcica). Se necessário, os aditivos, como agentes antissépticos (por exemplo, álcool benzílico, clorobutanol, paraoxibenzoato de metila e paraoxibenzoato de propila), antioxidantes, agentes corantes, adoçantes e semelhantes podem ser usados. Outras formas alternativas incluem agentes terapêuticos ou agente profilático para aplicação em membranas mucosas, como formulações que contêm frequentemente aditivos, como adesivos sensíveis à pressão, intensificadores sensíveis à pressão, reguladores de viscosidade, agentes espessantes e semelhantes (por exemplo, mucina, ágar, gelatina, pectina, carrageenana, alginato de sódio, goma laca, goma xantana, goma de tragacanto, goma arábica, quitosana, pululano, amido ceroso, sucralfato, celulose e seus derivados (como hidróxipropil metil celulose), ésteres de ácido graxo de poliglicerol, copolímeros de ácido acrílico-(met)acrilato de alquila, ou seus sais e ésteres de ácido graxo de poliglicerol), primariamente com o propósito de conferir adsorção mucosal ou propriedades de retenção. Entretanto, a forma, solvente e aditivos para o agente terapêutico ou profilático a ser administrado ao corpo não são limitados a estes, e a seleção apropriada pode ser feita por uma pessoa versada na técnica.

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84/132 [0226] O agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos de acordo com a presente invenção pode conter, além do anticorpo tau antifosforilado humanizado de acordo com a presente invenção, outros fármacos conhecidos que têm o efeito de tratar ou prevenir distúrbios cognitivos, e em particular, fármacos que têm o efeito de inibir a progressão de distúrbios cognitivos. Alternativamente, o agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos de acordo com a presente invenção que contém o anticorpo tau antifosforilado humanizado de acordo com a presente invenção pode ser combinado com outro agente terapêutico ou profilático que contém um fármaco conhecido que tem o efeito de tratar ou prevenir distúrbios cognitivos, e em particular um fármaco que tem o efeito de inibir a progressão de distúrbios cognitivos, para serem feitos na forma de um kit. Os ingredientes que têm os efeitos para inibir a progressão de distúrbios cognitivos incluem, mas sem limitação, Donepezil, Galantamina, Memantina, e Rivastigmina. A dosagem do ingrediente que tem o efeito de inibir a progressão de distúrbios cognitivos e a dosagem do agente terapêutico ou profilático que contém o ingrediente que tem o efeito de inibir a progressão de distúrbios cognitivos pode estar dentro do escopo de dosagens usado para terapia normal, mas pode ser aumentado ou diminuído dependendo das afecções.

[0227] Embora os presentes inventores tenham indicado resultados experimentais, no documento n² WO2013/180238A (Documento de Patente 4), o qual demonstra que o anticorpo exibe um efeito de fármaco atuando-se no cérebro através da barreia sanguínea do cérebro até mesmo quando administrado perifericamente por administração intraperitoneal, também é possível preparar uma formulação que fornece de modo eficaz o anticorpo tau anti-fosforilado humanizado de acordo com a presente invenção, que é contido no agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos de acordo com a

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85/132 presente invenção, ao tecido do cérebro. Tais formulações também são abrangidas pelo agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos de acordo com a invenção. Os métodos para fornecer anticorpos ou peptídeos de modo eficaz para o tecido do cérebro através da barreira sangue-cérebro são conhecidos, como métodos para adicionar substâncias-alvo ou métodos para encapsular em lipossomos ou nanopartículas. As substâncias a serem usadas para direcionar incluem aquelas que são submetidas à mudança total ou parcial em características de carga por ligação com anticorpo, ou peptídeos, proteínas ou outros compostos que têm uma propriedade de ligação com um receptor ou transportador específico. Exemplos de peptídeos, proteínas ou outros compostos que têm uma propriedade de ligação com um receptor específico ou proteína de membrana incluem ligantes que ligam-se a ligantes de receptor ou proteínas de membrana, e seus análogos, e anticorpos, compostos agonistas/compostos antagonistas/moduladores alostéricos que ligam-se a ligantes de receptor ou proteínas de membrana, e seus compostos análogos. Os exemplos de ligantes de receptor ou proteínas de membrana como alvos para um peptídeo, proteína ou outro composto que tem a propriedade de ligação a um receptor específico ou transportador incluem receptor de transferina (TfR), receptor de insulina (IR), receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), proteína relacionada ao receptor LDL (LRP) e receptor de toxina de diphtheria (HB-EGF), sem limitação particular aos mesmos (Angela R. Jones et al., Pharm. Res., 2007, Volume 24, n² 9, páginas 1759 a 1771). Uma substância para direcionamento pode ser quimicamente adicionada ao anticorpo a ser usado para o agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos de acordo com a invenção, em que o método é um que pode ser apropriadamente executado por uma pessoa versada na técnica com referência a um método, como descrito em, por exemplo, Hermanson et al., Bioconjugate techniques,

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USA, Academic Press, 1996. A substância para direcionamento também pode ser ligada a lipossomos ou nanopartículas que encapsulam o anticorpo ou peptídeo (Sonu Bhaskar et al., Particle and Fibre Toxicology, 2010, 7:3). Além disto, quando a substância para direcionamento é um peptídeo ou proteína, o mesmo pode ser produzido como uma proteína de fusão apropriada por uma pessoa versada na técnica com o uso de técnicas de manipulação genética, por produção de um peptídeo de fusão por síntese química de peptídeo, ou por combinação de um ácido nucleico qu ecompreende uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos do peptídeo ou proteína com um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos para o anticorpo ou peptídeo a ser usado.

[0228] O agente terapêutico ou profilático de acordo com a presente invenção pode ser administrado a um paciente que necessita do mesmo oralmente ou de modo parentérico, com o propósito de melhorar os sintomas. Para administração oral, uma forma de dosagem, como grânulos, pó, comprimidos, cápsulas, fármaco líquido, xarope, emulsão, agente de suspensão ou elixir pode ser selecionada. Para administração parenteral, um agente transnasal pode ser preparado, e um fármaco líquido, suspensão ou formulação sólida pode ser selecionado. Uma injeção pode ser preparada como uma forma diferente de administração parenteral, em que a injeção é selecionada como injeção subcutânea, injeção intravenosa, infusão, injeção intramuscular, injeção intracerebroventricular ou injeção intraperitoneal. Outras formulações usadas para administração parenteral incluem supositórios, agentes sublinguais, agentes percutâneos e agentes de administração transmucosal diferentes de agentes transnasais. Além disto, a administração local intravascular é possível por um modo de adição ou revestimento em um stent ou obturador intravascular.

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87/132 [0229] A dose para um agente para tratamento ou prevenção de acordo com a invenção diferirá dependendo da idade do paciente, gênero, peso corporal e sintomas, o efeito terapêutico, o método de administração, o tempo de tratamento, ou os tipos de ingredientes ativos na composição médica, mas normalmente pode ser administrada na faixa de 0,1 mg a 1 g e preferencialmente na faixa de 0,5 mg a 200 mg de composto ativo por administração para adultos. Entretanto, visto que a dose variará dependendo da variedade de afecções, as doses mais baixas do que aquelas mencionadas acima podem ser suficientes, ou doses que excedem estas faixas podem ser necessárias. O agente para tratamento ou prevenção de acordo com a invenção pode exibir um efeito dentro de um período de administração curto.

XIII. ADMINISTRAÇÃO DE ANTICORPOS [0230] Uma vez feitos, os anticorpos da invenção encontraram uso no tratamento de distúrbios cognitivos, como taupatias. Conforme discutido na presente invenção, o acúmulo intracelular de proteína tau foi demonstrado em uma variedade de afecções neuropatológicas. As doenças causadas por tal acúmulo intracelular de tau são coletivamente denominadas como taupatias (consultar Arai, supra, aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade, e para os distúrbios destacados no mesmo). Taupatias incluem doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer (AD), degeneração corticobasal (CBD) ou síndrome corticobasal (CBS), paralisia supranuclear progressiva, doença de Pick, demência com grãos argirofílicos (doença de grãos argirofílicos), taupatia sistêmica múltipla com demência (MSTD), demência frontotemporal ligada em cromossomo 17 com Parkinsonismo (FTDP-17), demência de enovelamento neurofribrilar, enovelamentos neurofibrilares difusos com calcificação (DNTC), taupatia de substância branca com inclusões gliais globulares (WMT-GGI), degeneração lobular frontotemporal com inclusões

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88/132 positivas tau (FTLD-tau). As taupatias incluem doenças não neurodegenerativas incluindo: doenças infecciosas, como sequela de encefalite de Economo e panencefalite esclerosante subaguda; e afecções induzidas por trauma, como encefalopatia do boxeador.

[0231] Os distúrbios cognitivos são definidos como um tipo de prejuízo intelectual que envolve um estado que, uma vez desenvolvido ou adquirido, a função intelectual declina (New Psychiatry (Nankodo's Essential Well-Advanced Series) (Livro japonês), editado por Kunitoshi Kamijima e Shin-ichi Niwa, Nankodo Co., Ltd., 2008, páginas 69-70), mas são considerados em um sentido amplo como doenças que exibem prejuízo intelectual e/ou prejuízo de memória. No diagnóstico de doenças neurodegenerativas, como AD, a possibilidade de afecção ser neudegenerativa é determinada por, por exemplo, analisar a possibilidade de enovelamento neurofibrilar (NFT) existir por meio de análise histológica após a morte, enquanto os médicos diagnosticam distúrbios cognitivos, especialmente como doenças neurodegenerativas, usando-se vários meios, por exemplo: examinações neuropsicológicas por meio de consultas, como a escala de demência de Hasegawa para examinação de estado revisado (HDS-R) e minimental (MMSE); examinações neuropsicológicas por meio de observações, coo classificação de demência clínica (CDR) ou adaptação de avaliação funcional (FAST); examinações bioquímicas com base, por exemplo, no aumento nos níveis de tau e tau fosforilado ou aumento no nível de Αβ em fluido cerebrospinal; e inspeção de imagens com base em informações obtidas por meio de, por exemplo, CT de cabeça, MRI de cabeça, SPECT ou PET. O agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos de acordo com a presente invenção é administrado a um paciente cujo médico o diagnosticou como com um distúrbio cognitivo, e tem o efeito de melhorar a afecção do paciente em comparação com o estado antes da administração, controlar a progressão da

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89/132 afecção por meio da administração, ou manter a afecção em, ou receber a afecção para, o estado antes da administração, com base em pelo menos um dos índices de diagnóstico para doença degenerativa.

[0232] O agente terapêutico ou profilático para distúrbios cognitivos de acordo com a presente invenção também pode ter o efeito de melhorar a função cognitiva, ou inibir um declínio em função cognitiva, ou manter função cognitiva em um animal humano ou não humano. Exemplos de tais animais não humanos devem ser preferencialmente aqueles que expressam tau que têm alta homologia com tau humano, e incluem, embora sem limitação: chimpanzé, macaco, cavalo, porco, cão, camundongo, coelho, rato e gato.

XIV. EXEMPLOS

A. Exemplo 1: Produção de Anticorpo

1. Anticorpo de camundongo (anticorpo parental) [0233] O anticorpo de camundongo Tal505 foi usado como um anticorpo parental de um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado. Os detalhes de anticorpo de camundongo Tal505 são descritos nos exemplos da Publicação Internacional N² WO2013/180238A. A sequência de aminoácidos da cadeia leve (cadeia L) de anticorpo de camundongo Tal505 é definida na SEQ ID NO: 44, e a sequência de nucleotídeo que codifica é definida na SEQ ID NO: 45. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada (cadeia H) de anticorpo de camundongo Tal505 é definida na SEQ ID NO: 46, e a sequência de nucleotídeo que codifica é definida na SEQ ID NO: 47.

2. Anticorpo quimérico [0234] O anticorpo quimérico foi produzido combinando-se as regiões variáveis da cadeia leve (cadeia L) e da cadeia pesada (cadeia H) de anticorpo de camundongo Tal505 com, respectivamente, as regiões constantes da cadeia L e da cadeia H de imunoglobulina humana (Ig) G1(k). A sequência de aminoácidos

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90/132 da cadeia leve (cadeia L) do anticorpo quimérico é definida na SEQ ID NO: 48, e a sequência de nucleotídeo que codifica é definida na SEQ ID NO: 49. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo quimérico é definida na SEQ ID NO: 50, e a sequência de nucleotídeo que codifica é definida na SEQ ID NO: 51. Ao longo do relatório descritivo, este anticorpo quimérico é denominado como o anticorpo quimérico ou anticorpo quimérico Tal505.

3. Anticorpo humanizado

A. Projeto de VL e VH [0235] As sequências primárias que têm alta homologia foram selecionadas a partir da linhagem germinativa humana, e a humanização foi executada pela região determinante de complementaridade (CDR) que enxerta para projetar uma variedade de anticorpos humanizados.

[0236] Em detalhes, frameworks humanos que têm alta homologia foram selecionados a partir de um banco de dados; a região CDR de anticorpo de camundongo Tal505 foi inserida em cada um dos frameworks; e substituições de aminoácido foram executadas para, por exemplo, reduzir a imunogenicidade enquanto mantêm a atividade. As sequências de aminoácidos de várias regiões variáveis de cadeia leve (VLs) e regiões variáveis de cadeia pesada (VHs) foram assim projetadas. Os números de SEQ ID das sequências de aminoácidos de VLs e os Números de SEQ ID das sequências de nucleotídeo de genes que codificam as mesmas são mostrados na Tabela 2A, e os Números de SEQ ID das sequências de aminoácidos de VHs e as sequências de nucleotídeo de genes que codificam os mesmos são mostrados na Tabela 2B. Os alinhamentos das sequências de aminoácidos de VLs e VHs são mostrados na Figura 2A e na Figura 2B, respectivamente.

Tabela 2A: Região variável de cadeia leve (VL)

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Codinome	Sequência de aminoácidos	Sequência de nucleotídeos
VL15	SEQ ID NO: 32	SEQ ID NO: 33
VL36	SEQ ID NO: 34	SEQ ID NO: 35
VL46	SEQ ID NO: 36	SEQ ID NO: 37
VL47	SEQ ID NO: 38	SEQ ID NO: 39
VL48	SEQ ID NO: 40	SEQ ID NO: 41
VL50	SEQ ID NO: 42	SEQ ID NO: 43

Tabela 2B: Região variável de cadeia pesada (VH)

Codinome	Sequência de aminoácidos	Sequência de nucleotídeos
VH11	SEQ ID NO: 18	SEQ ID NO: 19
VH12	SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 21
VH47	SEQ ID NO: 22	SEQ ID NO: 23
VH61	SEQ ID NO: 24	SEQ ID NO: 25
VH62	SEQ ID NO: 26	SEQ ID NO: 27
VH64	SEQ ID NO: 28	SEQ ID NO: 29
VH65	SEQ ID NO: 30	SEQ ID NO: 31

b. Seleção de combinação de VL e VH com base no escore de imunidade [0237] As VLs e VHs projetadas pelo procedimento descrito acima foram combinadas arbitrariamente, e o escore de imunogenicidade (escore de DRB1) de cada combinação foi calculado por programa de ensaio in vitro Epibase (Lonza). As combinações de VL e VH a serem usadas nos experimentos subsequentes foram selecionadas a partir das combinações que mostram baixa imunogenicidade com escores de imunogenicidade iguais a ou mais baixos do que um valor predeterminado (escore de DRB1: 1500). As combinações selecionadas de VL e VH são mostradas na Tabela 3A, e os escores de imunogenicidade (escores de DRB1) destas combinações são mostradas na Tabela 3B.

Tabela 3A: combinações selecionadas de VL e VH

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	Região variável de cadeia pesada (VH)
Hll	H12	H47	H61	H62	H64	H65
Região variável de cadeia leve (VL)	L15	L15H11
L36	L36H11
L46	L46H11
L47	L47H11					L47H64	L47H65
L48	L48H11	L48H12	L48H47	L48H61	L48H62	L48H64
L50	L50H11

Tabela 3B: Escore de imunogenicidade (escore DRB1)

	Região variável de cadeia pesada (VH)
Hll	H12	H47	H61	H62	H64	H65
Região variável de cadeia leve (VL)	L15	1495
L36	1437
L46	1463
L47	1333					1382	1426
L48	1417	1352	1433	1383	1433	1466
L50	1475

c. Cultura de expressão e purificação do anticorpo humanizado [0238] Para cada combinação de VL e VH selecionada pelo procedimento descrito acima, os genes que codificam as sequências de aminoácidos da VL e da VH foram preparados. O gene VLfoi fundido no quadro com um gene de região constante de cadeia L (CL) kappa de imunoglobulina humana (a sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeo dos mesmos são definidas na SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 53, respectivamente) e o gene VH foi fundido no quadro com um gene de região constante de cadeia H (CH) gamma-1 de imunoglobulina humana (a sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeo dos mesmos são definidas na SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55, respectivamente), de modo que nenhuma mutação ou defeito deva ocorrer em cada sítio de ligação. As

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93/132 extremidades 5' do gene VL e do gene VH foram fundidas no quadro a, respectivamente, uma sequência-sinal derivada do gene de cadeia L kappa de imunoglobulina humana (a sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeo da mesma são definidas na SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57, respectivamente) e uma sequência-sinal derivada do gene de cadeia H gamma1 de imunoglobulina humana (a sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeo da mesma são definidas na SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 59, respectivamente), de modo que nenhuma mutação ou defeito deva ocorrer em cada sítio de ligação.

[0239] Os construtos de ácido nucleico que codificam, respectivamente, as cadeias L e H fundidas com sequência-sinal projetadas pelo procedimento descrito acima foram incorporadas, cada uma, em um vetor de expressão para expressão de célula animal, e então, cultivadas usando ExpiCHO (fabricado por Thermo Fisher Scientific K.K.) de acordo com o protocolo padrão para expressar anticorpos. Cada cultura foi clarificada por centrifugação, e o sobrenadante de cultura resultante foi aplicado a uma coluna de afinidade de proteína A para purificar o anticorpo humanizado. A fração eluída com uma solução ácida que tem um pH de 2,8 a 3,5 foi rapidamente neutralizada, concentrada, e aplicada a uma coluna de filtração de gel para remover o agregado. O tampão foi mudado para solução salina tamponada com fosfato (PBS) para coletar a fração principal, a qual foi diluída com um solvente em uma concentração apropriada e, então, usada nos testes a seguir.

[0240] Nas descrições a seguir, cada anticorpo humanizado produzido pelo procedimento descrito acima pode ser abreviado usando uma combinação dos codinomes de sua VL e VH. Por exemplo, um anticorpo humanizado produzido usando L15 como a VL e Hll como a VH é denominado como L15H11.

[0241] Nos testes a seguir, 3% de BSA/PBS foi usado como um solvente para

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94/132 ajustar a concentração de um anticorpo, sem ser especificado de outro modo.

B. Exemplo 2: Análise de ELISA de afinidade de ligação de peptídeo de antígeno

1. Análise de ELISA de afinidade de ligação com peptídeo de antígeno [0242] Alguns dos anticorpos humanizados que têm combinações de VL e VH mostrados na Tabela 3A foram analisados para a afinidade de ligação com um peptídeo de antígeno por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).

[0243] Um peptídeo tau não fosforilado PD17(Ser413) e um peptídeo tau fosforilado PD17P(pSer413), em que Ser413 foi fosforilada, foram, cada um, diluídos com PBS resfriado a 1 pg/mL, e as soluções resultantes foram, cada uma, dispensadas em uma placa a 50 pL/poço e permitiu-se que repousassem a 4°C de um dia para o outro. A solução foi removida, e um tampão de bloqueio (3% de albumina de soro bovino (BSA)-PBS) foi, então, dispensado a 270 pL/poço, e permitiu-se que a placa repousasse a 4°C de um dia para o outro. Após a solução ser removida, uma solução de anticorpo foi diluída em uma maneira em etapas com 3% de BSA-PBS que foi, então, adicionada à placa a 50 pL/poço para permitir uma reação à temperatura ambiente por 90 minutos. As sequências de aminoácidos de peptídeo tau PD17(Ser413) não fosforilado e peptídeo tau PD17P(pSer413) fosforilado são definidas na SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

[0244] Cada poço foi lavado com solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBS-T), que contém 0,05% de Tween 20. Um marcador de fosfatase alcalina de IgG anti-humana de cabra (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) diluído em 2000 vezes com um tampão de diluição (3% de BSA-PBS) foi adicionado à placa a 50 pL/poço para permitir uma reação à temperatura ambiente por 60 minutos. Após a lavagem com TBS-T, uma solução cromogênica (solução de p-nitrofenilfosfato 1 mg/mL (pNPP)) foi adicionada à placa a 100

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95/132 μί/poço para desenvolvimento de cor por 40 minutos. A absorbância (valor de densidade óptica (OD)) foi medida em um comprimento de onda de 405 nm.

[0245] A reatividade foi avaliada determinando-se a razão entre o valor de OD de cada anticorpo e o valor de OD de anticorpo quimérico 0,25 nM, e classificando-se a razão resultante na escala de três pontos a seguir:

+: reatividade suficiente (0,6 < razão de OD), ±: reatividade muito leve (0,15 < razão de OD < 0,6), e

-: nenhuma reatividade (razão de OD < 0,15).

[0246] A Tabela 4A mostra os resultados de avaliação da reatividade dos anticorpos com peptídeo tau PD17P fosforilado. A Tabela 4B mostra os resultados de avaliação da reatividade dos anticorpos com peptídeo tau PD17 não fosforilado. Em comparação com o anticorpo quimérico, todos os anticorpos humanizados exibiram reatividade maior com peptídeo tau PD17P fosforilado, mas reatividade menor com peptídeo tau PD17 não fosforilado. Estes resultados demonstram que os anticorpos humanizados têm reatividade seletiva com o peptídeo tau fosforilado.

Tabela 4A: Análise de ELISA de reatividade com peptídeo fosforilado PD17P

	Região variável de cadeia pesada (VH)
VH11	VH12	VH47	VH61	VH62	VH64	VH65
Região variável de cadeia leve (VL)	VL15	+
VL36	+
VL46	+
VL47							+
VL48	+	+	+	+	+	+
VL50	+

Tabela 4B: Análise de ELISA de reatividade com peptídeo não fosforilado

PD17

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	Região variável de cadeia pesada (VH)
VH11	VH12	VH47	H61	VH62	VH64	VH65
Região variável de cadeia leve (VL)	VL15	-
VL36	-
VL46	-
VL47							-
VL48	-	-	-	-	-	-
VL50	-

2. Análise de ELISA de afinidade de ligação seletiva com peptídeo tau fosforilado [0247] Alguns dos anticorpos humanizados que têm combinações de VL e VH mostrados na Tabela 3A foram analisados pela afinidade de ligação seletiva dos anticorpos humanizados anti-tau com um peptídeo tau fosforilado por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), usando anticorpo quimérico Tal505 como um anticorpo de referência.

[0248] Uma solução que contém 1 pg/mL de peptídeo não fosforilado PD17 ou peptídeo fosforilado PD17P foi dispensada em uma placa a 50 pL/poço, e permitiu-se que repousasse a 4°C de um dia para o outro. Após a solução ser removida, um tampão de bloqueio (3% de albumina de soro bovino (BSA)-PBS) foi dispensado a 270 pL/poço, e permitiu-se que a placa repousasse a 4°C de um dia para o outro, para assim produzir placas nas quais o peptídeo não fosforilado PD17 ou peptídeo fosforilado PD17P foi imobilizado em cada placa.

[0249] Uma série de cinco concentrações de cada anticorpo foi preparada por diluição seriada de 4 vezes, que começa a partir de uma concentração inicial de 0,6 pg/mL (4 nM). Cada solução foi adicionada a um poço nas placas a 50 pl/poço para permitir uma reação à temperatura ambiente por uma hora. Após o processo de lavagem, um marcador de fosfatase alcalina de IgG anti-humana de cabra (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) foi diluído em 2000 vezes, e

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97/132 então, adicionado a cada poço a 50 pL/poço para permitir adicionalmente a reação por uma hora.

[0250] Após o processo de lavagem, a solução de p-nitrofenilfosfato 1 mg/mL (pNPP) foi adicionada a cada poço a 100 pL/poço para permitir uma reação por 20 minutos. A absorbância (OD) foi medida a um comprimento de onda de 405 nm.

[0251] Os dados da absorbância OD nas respectivas concentrações de cada anticorpo preparado foram analisados com o programa SoftMax Pro Versão 6.5 (Molecular Devices Corporation) para determinar os valores numéricos seguintes A a D, os quais foram atribuídos à curva de regressão logística de quatro parâmetros mostrada abaixo:

A-D

(Equação I) em que x representa a concentração do anticorpo, e y representa a absorbância (valor de OD).

[0252] O valor de OD de absorbância do peptídeo não fosforilado PD17 a uma concentração de 1 nM foi inserido na expressão para calcular a concentração x de cada anticorpo que corresponde ao valor de OD. Visto que a concentração de PD17 foi 1 nM, o fator de escala da afinidade de ligação para o peptídeo tau PD17P fosforilado com base na afinidade de ligação para PD17 para cada peptídeo foi calculado por 1/x, e usado como um indicador de afinidade de ligação seletiva a um peptídeo tau fosforilado.

[0253] Os resultados são mostrados no gráfico da Figura 3. A afinidade de ligação de anticorpo quimérico Tal505 ao peptídeo tau fosforilado PD17P foi 30 vezes mais forte do que aquela do peptídeo não fosforilado PD17. Em contraste, a afinidade de ligação seletiva em anticorpos humanizados exibiu alta

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98/132 seletividade com um fator de escala de 40 a 210 vezes. Os resultados demonstram que os anticorpos humanizados têm afinidade de ligação específica com o peptídeo fosforilado.

3. Análise de ELISA de afinidade de ligação seletiva com sítio de fosforilação Ser413 usando peptídeo tau fosforilado [0254] Os anticorpos humanizados que têm combinações de VL e VH mostradas na Tabela 3A foram analisados, cada um, por sua capacidade para ligarem-se seletivamente ao sítio de fosforilação de Ser413 entre os sítios de fosforilação principais da proteína, por meio de ELISA usando uma variedade de peptídeos fosforilados.

[0255] Doze peptídeos fosforilados foram usados conforme mostrado na Tabela 5. A coluna nomeada Epítopo indica o sítio fosforilado (ou sítios fosforilados) de proteína tau do tipo 4R2N (por exemplo, pS46 no Peptídeo n² 1 indica que o sítio de Ser46 é epítopo fosforilado, e descrições de múltiplos epítopos indicam que um peptídeo tem dois ou três sítios fosforilados), com a exceção daquele de Peptídeo n² 12 ter um epítopo incluindo sítio de Ser413, mas não ser fosforilado (PD17).

Tabela 5: Peptídeo para análise de ligação específica a sítio de fosforilação de Ser413 de proteína tau

N2 de Peptídeo	Epítopo	Sequência de aminoácidos (código de uma letra)	SEQ ID NO:
1	pS46	H-GLKE(pS)PLQT-OH	61
2	pS199	H-SGYS(pS)PGSPGC-OH	62
3	pS202	H-SSPG(pS)PGTPC-OH	63
4	pT212/ pS214	H-GCGSPGTPGSRSR(pT)P(pS)LPTPPTREPK-OH	64
5	pT217	H-GC-GSRSRTPSLP(pT)PPTREPKKVAVV-OH	65
6	pT231	H-KVAVVR(pT)PPKSPS-OH	66

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N2 de Peptídeo	Epítopo	Sequência de aminoácidos (código de uma letra)	SEQ ID NO:
7	pS396/ pS400 /pS404	H-GC-RENAKAKTDHGAEIVYK(pS)PVV(pS)GDT (pS)PRHL-OH	67
8	pS412	H-NV(pS)STGSC-OH	68
9	pS412/ pS413	H-PRHLSNV(pS)(pS)TGSIDMVD-OH	7
10	pS413	H-PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD-OH (PD17P)	8
11	pS409/ pS412 /pS413	H-PRHL(pS)NV(pS)(pS)TGSIDMVD-OH	9
12	S413	H-PRHLSNVSSTGSIDMVD-OH (PD17)	69

[0256] Os doze peptídeos mostrados na Tabela 5, isto é, Peptídeos n^? 1 a 12, ou conjugados destes peptídeos com albumina de soro bovino (BSA) ou hemocianina de lapa californiana (KLH), foram diluídos, cada um, com PBS resfriado a 4°C A 1 pg/mL, e a solução resultante foi dispensada a uma placa a 50 pL/poço e permitiu-se que repousasse a 4°C de um dia para o outro. A solução foi removida, e um tampão de bloqueio (3% de BSA-PBS) foi, então, dispensado a 270 pL/poço, e permitiu-se que a placa repousasse a 4°C de um dia para o outro. Após a solução ser removida, o anticorpo purificado foi diluído com 3% de BSA-PBS a 150 ng/mL, e então, adicionado à placa a 50 pL/poço para permitir uma reação à temperatura ambiente por 90 minutos. Cada poço foi lavado com solução salina tamponada com Tris (TBS-T) que contém 0,05% de Tween 20. Um marcador de fosfatase alcalina (H+L) de IgG anti-humana de cabra (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) diluída em 2000 vezes com um tampão de diluição (3% de BSA-PBS) foi adicionado à placa a 50 pL/poço para permitir uma reação à temperatura ambiente por 60 minutos. Após a lavagem com TBS-T, uma solução cromogênica (solução de pNPP 1 mg/mL) foi adicionada à placa a 100 pL/poço para desenvolvimento de cor por 40 minutos. A absorbância (valor de OD) foi

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100/132 medida a um comprimento de onda de medição de 405 nm e um comprimento de onda de referência de 550 nm.

[0257] A reatividade foi avaliada na escala de três pontos a seguir:

+: reatividade suficiente (1,0 < valor de OD), ±: reatividade muito leve (0,5 < valor de OD < 1,0), e nenhuma reatividade (valor de OD < 0,5).

[0258] Os resultados são mostrados na Tabela 6. Todos os anticorpos humanizados mostram afinidade de ligação forte com apenas Peptídeo n² 9 (pSer412/pSer413: PRHLSNV(pS)(pS)TGSIDMVD), Peptídeo n^ 10 (pSer413: PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD), e Peptídeo n^ 11 (pSer409/pSer412/pSer413: PRHL(pS)NV(pS)(pS)TGSIDMVD), mas não ligaram-se aos outros peptídeos, cujo sítio que corresponde a Ser413 de proteína tau não foi fosforilada. O padrão e a força da ligação foram substancialmente iguais àquelas da quimera (anticorpo quimérico Tal505). Estes resultados indicam que os anticorpos humanizados têm afinidade de ligação específica à proteína tau que tem um sítio de Ser413 fosforilado.

Tabela 6: Resultados de análise de ELISA de reatividade com vários peptídeos tau fosforilados

Anticorpo	N2 de Peptídeo na Tabela 5
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Quimera	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L15H11	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L36H11	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L46H11	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L47H11	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L48H11	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L50H11	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L48H12	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-

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Anticorpo	N2 de Peptídeo na Tabela 5
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
L48H47	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L48H61	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L48H62	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L47H64	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L48H64	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-
L47H65	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-

C. Exemplo 3: Análise de ELISA de afinidade de ligação à proteína de antígeno [0259] Alguns dos anticorpos humanizados que têm combinações de VL e VH mostrados na Tabela 3A foram analisados para a afinidade de ligação com uma proteína de antígeno por ELISA.

[0260] A fim de preparar uma proteína tau fosforilada pTau, a proteína tau 4R2N foi expressada em células de inseto usando um sistema de baculovírus. Além disso, a fim de preparar uma proteína tau hpTau hiperfosforilada, um baculovírus recombinante com capacidade para expressar simultaneamente uma proteína tau e GSK33 foi produzido.

[0261] Na produção de um baculovírus recombinante, os vetores pFastBacl e pFastBac Dual foram usados. Para a proteína tau fosforilada pTau, um cDNA que codifica proteína tau 4R2N que tem um terminal C com etiqueta de His foi inserido em pFastBacl. Para a proteína tau hiperfosforilada hpTau, um cDNA que codifica a proteína tau 4R2N que tem um terminal C com etiqueta de His e um cDNA que codifica GSK33 foram inseridos em pFastBac Dual. A sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeo de proteína tau 4R2N com etiqueta de His são definidas nas SEQ ID NOs: 70 e 71, respectivamente. A sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeo de GSK33 são definidas nas SEQ ID NOs: 72 e 73, respectivamente.

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102/132 [0262] Os vetores resultantes foram introduzidos, cada um, na linhagem celular Sf9 por lipofecção, e as células foram cultivadas para preparar baculovírus recombinantes. Os baculovírus recombinantes resultantes foram, então, usados para infectar a linhagem celular Sf9 ou Tn5, para assim expressar a proteína tau fosforilada (pTau) e a proteína tau hiperfosforilada (hpTau).

[0263] As células que expressam a proteína desejável foram coletadas, e submetidas à sonicação e centrifugação para obter um lisado de célula, o qual foi, então, aplicado a uma coluna Ni-NTA para purificar a proteína tau. A concentração da proteína tau purificada foi determinada por ensaio de ácido bicinconínico (BCA), usando albumina de soro bovino (BSA) como uma amostra padrão.

[0264] A proteína tau hiperfosforilada resultante (hpTau) e a proteína tau fosforilada (pTau) foram diluídas com PBS resfriado a 1 pg/mL, e as soluções diluídas foram dispensadas a uma placa a 50 pL/poço e permitiu-se que repousassem a 4°C de um dia para o outro. Após as soluções serem removidas, um tampão de bloqueio (3% de BSA-PBS) foi, então, dispensado a 270 pL/poço, e permitiu-se que a placa repousasse a 4°C de um dia para o outro. Após a remoção da solução tampão, uma série de soluções de anticorpos preparada por meio de diluição seriada com 3% de BSA-PBS foi adicionada à placa a 50 pL/poço para permitir uma reação à temperatura ambiente por 90 minutos.

[0265] Os poços foram, então, lavados com solução salina tamponada com Tris (TBS-T) que contém 0,05% de Tween 20. Um marcador de fosfatase alcalina de IgG anti-humana de cabra (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) diluído em 2000 vezes com um tampão de diluição (3% de BSA-PBS) foi adicionado à placa a 50 pL/poço para permitir uma reação à temperatura ambiente por 60 minutos. Após a lavagem com TBS-T, uma solução cromogênica (solução de pNPP 1 mg/mL) foi adicionada à placa a 100 pL/poço para desenvolvimento de cor por

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103/132 minutos. A absorbância (valor de OD) foi medida a um comprimento de onda de 405 nm.

[0266] A reatividade foi avaliada determinando-se a razão entre o valor de OD de cada anticorpo e o valor de OD de anticorpo quimérico 0,25 nM, e classificando-se a razão resultante na escala de três pontos a seguir:

+: reatividade suficiente (0,6 < razão de OD), ±: reatividade muito leve (0,15 < razão de OD < 0,6), e

-: nenhuma reatividade (razão de OD < 0,15).

[0267] A Tabela 7A mostra os resultados da reatividade avaliada dos anticorpos humanizados com proteína tau hiperfosforilada hpTau. A Tabela 7B mostra os resultados da reatividade avaliada dos anticorpos humanizados com proteína tau fosforilada pTau. Os resultados demonstram que todos os anticorpos humanizados têm alta reatividade tanto com proteína tau hiperfosforilada hpTau quanto com proteína tau fosforilada pTau, em comparação com aquela do anticorpo quimérico.

Tabela 7A: Resultado de análise de ELISA de reatividade com proteína tau hiperfosforilada hpTau

	VH11	VH12	VH47
VL15	+
VL36	+
VL46	+
VL47
VL48	+	+	+
VL50	+

VH61	VH62	VH64	VH65
			+
+	+	+

Tabela 7B: Resultado de análise de ELISA de reatividade com proteína tau fosforilada pTau

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	VH11	VH12	VH47	VH61	VH62	VH64	VH65
VL15	+
VL36	+
VL46	+
VL47							+
VL48	+	±	+	+	+	+
VL50	+

D. Exemplo 4: Análise de afinidade de ligação por SPR [0268] Alguns dos anticorpos humanizados que têm combinações de VL e VH mostradas na Tabela 3A foram submetidos à análise de afinidade de ligação por ressonância de plásmon de superfície (SPR) usando anticorpo quimérico Tal505 como um anticorpo de referência.

[0269] A proteína tau hiperfosforilada 4R2N (hpTau: consultar o Exemplo 3) foi usada como uma proteína de antígeno, e uma proteína tau não fosforilada produzida por Escherichia coli (Tau: proteína tau não fosforilada com etiqueta de His 4R0N: ATGen Co. Ltd., n² ATGP0795) foi usado como um controle negativo. Os peptídeos de antígeno usados foram um peptídeo tau monofosforilado (lxP), em que apenas Ser413 foi fosforilada, e um peptídeo tau trifosforilado (3xP), em que Ser409 e Ser412 foram adicionalmente fosforiladas além de Ser413. As sequências de aminoácidos destes peptídeos são mostradas na Tabela 8. Um peptídeo de controle negativo usado foi um peptídeo tau não fosforilado (Não P), cuja sequência de aminoácidos também é mostrada na Tabela 8. A sequência de aminoácidos da proteína tau não fosforilada com etiqueta de His 4R0N é definida na SEQ ID NO: 74. As sequências de aminoácidos do peptídeo tau monofosforilado lxP, o peptídeo tau trifosforilado 3xP, e o peptídeo tau não fosforilado Não P são definidos nas SEQ ID NOs: 75, 76, e 77, respectivamente.

Tabela 8: Peptídeo de antígeno usado em SPR

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Codinome	Sequência de aminoácidos (código de uma letra)	SEQ ID NO:
lxP	TSPRHLSNVS(pS)TGSIDMVDSPC	75
3xP	TSPRHL(pS)NV(pS)(pS)TGSIDMVDSPC	76
Não P	TSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPC	77

[0270] As afinidades de ligação da proteína tau hiperfosforilada 4R2N (hpTau), proteína tau não fosforilada 4R0N, peptídeo tau monofosforilado lxP, peptídeo tau trifosforilado 3xP, e peptídeo tau não fosforilado Não P com cada anticorpo foram medidas com um sistema SPR Biacore T200 (GE Healthcare Japan), de acordo com o manual de instruções para avaliação anexo ao sistema.

[0271] A afinidade de ligação foi medida por um método incluindo: preparar um chip de sensor de NTA (incluindo uma camada de carboximetil dextrano à qual o ácido nitrilotriacético (NTA) já foi imobilizado: código n² BR1005-32); imobilizando cada um dos peptídeos mencionados acima fundidos com etiqueta de His e cada um dos peptídeos de antígeno mostrados na Tabela 8 no chip de sensor por ligações covalentes através de uma reação de acoplagem de amina usando um kit de acoplagem de amina(GE Healthcare Japan, código n² BR-1006-33); e medir a cinética de anticorpos para os peptídeos e proteínas imobilizadas.

[0272] As proteínas hpTau ou Tau com etiqueta de His foram imobilizadas, cada um, em um chip de sensor usando um tampão HBS-N (código n² BR-100369) como a solução de reação de imobilização e permitindo-se que uma solução de cloreto de níquel reaja com o chip de sensor NTA para ligar Ni a NTA. Subsequentemente, o chip de sensor foi ativado com uma solução misturada de cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (cloridrato de 1etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida: EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS). Uma solução de cada uma das proteínas com etiqueta de His, ajustada a uma concentração de 100 a 500 ng/mL com um tampão ácido 4-(2-hidroxietil)-l

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106/132 piperazinaetanossulfônico (HEPES) (HEPES 0,01 M, KCI150 mM, DTT2 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2), foi aplicado ao chip de sensor, pela qual a proteína foi imobilizada no chip de sensor através das ligações covalentes com o Ni-NTA. O NHS ativo restante foi bloqueado com etanolamina, e íons Ni foram removidos com uma solução de EDTA (acoplamento de amina de afinidade de Ni: consultar Publicação Internacional n² W02005/022156). Os peptídeos de antígeno (lxP, 3xP, e Não P) foram, cada um, imobilizados em um chip de sensor ativando-se o chip de sensor de NTA com uma solução misturada de cloridrato de N-etil-N'-(3dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS), e então, aplicar uma solução do peptídeo de antígeno diluído com um tampão de acetato de sódio 10 mM (pH: 4 a 4,5) a 1 a 10 μΜ para o chip de sensor, pelo qual o peptídeo foi covalentemente ligado ao chip de sensor. A NHS ativa restante foi bloqueada com etanolamina. Desse modo, os chips de sensor imobilizados respectivamente com as proteínas e peptídeos mencionados acima foram produzidos.

[0273] Um tampão de CAPS (pH 10,5) foi aplicado a estes chips de sensor a 37°C para estabilizar as superfícies imobilizadas por proteína ou peptídeo dos chips de sensor. A solução de cada anticorpo, preparada com um tampão de HEPES (pH 7,2) como uma solução de reação de ligação específica, foi aplicada à superfície de chip de sensor em concentrações na faixa de 0,2 a 1 nM (em torno da constante de dissociação de ligação estimada [KD]) por 150 segundos (uniforme na mesma avaliação) para uma reação, e a cinética de ligação foram medidas. Os dados resultantes foram analisados usando o programa de análise Biacore (Software de Avaliação Biacore T200 Evaluation, Versão 3.0).

[0274] A cinética de ligação de cada anticorpo foi corrigida subtraindo-se a cinética de ligação da proteína não fosforilada 4R0N ao chip de sensor como um controle negativo da cinética de ligação da proteína de antígeno 4R2N (hpTau)

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107/132 para o chip de sensor. A cinética de ligação de cada peptídeo de antígeno foi corrigida subtraindo-se a cinética de ligação do peptídeo não fosforilado Não P para o chip de sensor como um controle negativo da cinética de ligação de cada um dos peptídeos de antígeno lxP e 3xP. Nenhuma ligação de cada anticorpo à proteína tau não fosforilada 4R0N ou ao peptídeo não fosforilado Não P foi observada na faixa de concentrações de amostra submetidas à medição.

[0275] A Tabela 9A mostra as atividades de ligação de anticorpos humanizados para a proteína tau fosforilada 4R2N (hpTau). A Tabela 9B mostra os resultados de atividades de ligação de anticorpos humanizados para o peptídeo tau monofosforilado lxP e o peptídeo tau trifosforilado 3xP. Os resultados demonstram que cada anticorpo humanizado exibiu alta atividade de ligação a todos dentre a proteína tau hiperfosforilada hpTau, peptídeo tau monofosforilado lxP, e peptídeo tau trifosforilado 3xP.

Tabela 9A: Atividade de ligação de anticorpos humanizados à proteína tau fosforilada (hpTau) (modelo de ligação 1:1)

Amostra	hpTau KD(M)
Quimera	l,70E-10
L15H11	l,50E-10
L36H11	l,40E-10
L46H11	l,30E-10
L47H11	l,80E-10
L48H12	l,60E-10
L48H47	l,40E-10
L48H64	l,00E-10
L47H65	l,50E-10
L48H11	l,40E-10
L48H61	l,70E-10

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108/132

Amostra	hpTau KD(M)
L48H62	l,30E-10
L50H11	l,50E-10

Tabela 9B: Atividade de ligação de anticorpos humanizados a peptídeos fosforilados (lxp, 3xp) (modelo de ligação 1:1)

Amostra	lxP KD(M)	3xP KD(M)
Quimera	4,60E-ll	2,20E-ll
L15H11	3,90E-ll	l,90E-ll
L36H11	4,70E-ll	l,90E-ll
L46H11	4,80E-ll	l,70E-ll
L47H11	6,20E-ll	2,20E-ll
L48H12	6,50E-ll	2,70E-ll
L48H47	5,80E-ll	2,20E-ll
L48H64	5,00E-ll	l,50E-ll
L47H65	5,40E-ll	l,90E-ll
L48H11	6,00E-ll	2,00E-ll
L48H61	l,80E-10	2,40E-ll
L48H62	5,20E-ll	2,00E-ll
L50H11	4,80E-ll	l,90E-ll

E. Exemplo 5: Análise de afinidade de ligação de pser413-Tau em homogenato de cérebro de paciente com AD [0276] Dentre os anticorpos humanizados que têm combinações de VL e VH mostrados na Tabela 3A, L15H11, L46H11, e L47H65 foram avaliados por afinidade de ligação à proteína tau fosforilada de Ser413 (pSer413-Tau) derivada de uma amostra clínica de paciente com doença de Alzheimer (AD) em uma fase líquida, usando um anticorpo de camundongo Tal505 e um anticorpo quimérico como anticorpos de referência.

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109/132 [0277] Os anticorpos humanizados, anticorpo de camundongo, e anticorpo quimérico foram, cada um, biotinilados usando N-hidroxisuccinimida-LC-biotina (NHS-LC-biotina) (Thermo Fisher Scientific K.K.), seguida por diálise com PBS.

[0278] O tecido do hipocampo congelado (160 mg) do cérebro de um paciente com AD em estágio de Braak V/VI foi adicionado a 0,8 mL de TBS-I (solução salina tamponada com Tris, coquetel inibidor de protease, coquetel inibidor de fosfatase) e sonicado em água com gelo. A solução sonicada foi centrifugada a 3000xg a 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi coletado e adicionalmente ultracentrifugado a lOOOOOxg a 4°C por 15 minutos para obter um homogenato de cérebro. O kit (Fijirebio Inc.) de pTau Innotest (pT181) foi usado como um sistema ELISA de proteína tau fosforilada de Ser413 (pSer413Tau), mas o anticorpo biotinilado incluído no kit (identificado como C0NJ1) foi substituído pelos anticorpos biotinilados produzidos acima.

[0279] Cada um dos anticorpos biotinilados produzidos acima foram feitos em uma solução em uma concentração de 0,1 nM, e adicionados a uma placa MT imobilizada de anticorpo HT7 (incluída no kit), juntamente com a diluição de 1000 vezes do homogenato de cérebro. A amostra resultante foi misturada e incubada a 4°C de um dia para o outro. No dia seguinte, a placa foi lavada, e uma estreptavidina identificada com HRP (incluído no kit como CONJ2) foi adicionada à placa, seguida por incubação por uma hora. Após a lavagem, um reagente de cor TMB foi adicionado, seguido por incubação sob proteção de luz à temperatura ambiente por 30 minutos. A reação foi, então, interrompida com uma solução terminadora de reação (incluído no kit como solução STOP), e a absorbância em um comprimento de onda de 450 nm foi medida.

[0280] Os resultados são mostrados na Figura 4. Conforme mostrado no gráfico da Figura 4, os anticorpos humanizados L15H11, L46H11, e L47H65 exibiram uma alta afinidade de ligação com a proteína tau fosforilada de Ser413

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110/132 (pSer413-Tau) derivada do paciente com amostra clínica de AD.

F. Exemplo 6: Teste para cinética em sangue [0281] Cinco variantes de anticorpo humanizado iniciais foram testados para farmacocinética em camundongos normais, em comparação com um anticorpo comercialmente disponível Herceptina (Genentech, San Francisco do sul, CA) e o anticorpo Tal505 quimérico. A cadeia leve e a cadeia pesada de cada variante de anticorpo humanizado são resumidas na Tabela 10 abaixo.

Tabela 10. A cadeia leve e a cadeia pesada de algumas variantes de anticorpo humanizado iniciais

Anticorpo	LC	HC
Variante 2	LI (SEQ ID NO:130)	H2 (SEQ ID NO:134)
Variante 5	L2 (SEQ ID NO:131)	Hl (SEQ ID NO:133)
Variante 6	L2 (SEQ ID NO:131)	H2 (SEQ ID NO:134)
Variante 9	L3 (SEQ ID NO:132)	Hl (SEQ ID NO:133)
Variante 10	L3 (SEQ ID NO:132)	H2 (SEQ ID NO:134)

[0282] Os anticorpos foram injetados de modo intraperitoneal a uma dose de 10 mg/kg em camundongos C57BL/6J machos de 11 semanas de idade (Charles River Laboratories Japan, Inc.). O plasma foi obtido a partir do sangue coletado 1, 3, 8, 24, e 72 horas após a dose. O tamanho de amostra foi 2 animais por anticorpo.

[0283] ELISA sanduíche com anticorpos policlonais de IgG anti-humana foi usado para determinar concentrações plasmáticas de anticorpo. Uma curva de calibração foi plotada por diluição seriada de cada anticorpo com plasma de camundongo.

[0284] O plasma foi diluído por um fator de 1000 e a concentração de anticorpo foi medida.

[0285] Uma solução de PBS 1 pg/mL de anticorpos policlonais de IgG antihumana de cabra (Fc) foi pipetada em uma placa de 96 poços (MaxSorp (NUNC))

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111/132 e permitiu-se que repousasse a 4°C de um dia para o outro. Então, o bloqueio foi alcançado com 3% de BSA/PBS para preparar uma placa com anticorpos policlonais de IgG anti-humana de cabra imobilizada (Fc). O plasma de camundongo foi usado para diluir em série os anticorpos e obter a substância padrão. O plasma e a substância padrão foram diluídos com 3% de BSA/PBS e pipetados na placa com anticorpos policlonais de IgG anti-humana de cabra imobilizada (Fc) a 50 pL/poço. Permitiu-se que as misturas reagissem à temperatura ambiente por 1,5 horas, e a placa foi, então, lavada com TBS-T (TBS, 0,05% de Tween 20). Então, uma solução preparada diluindo-se anticorpos policlonais (Southern Biotech, n² de Cat 2087-04) de IgG anti-humana identificada com fosfatase alcalina (H+L) por um fator de 2000 com 3% de BSA/PBS foi pipetada a 50 pL/poço, e permitiu-se que a reação avançasse por 1 hora à temperatura ambiente. A seguir, a placa foi lavada com TBS-T, o reagente de coloração foi adicionado a 100 pL/poço, e a placa foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente. Após isso, um leitor de placa foi usado para medir a absorbância a 405 nm e 550 nm.

[0286] Uma curva de calibração foi plotada com substância padrão e usada para calcular as concentrações plasmáticas de anticorpo. Os resultados são mostrados na Figura 5A.

[0287] As variantes humanizadas iniciais testadas (Variante 2, 5, 6, 9, e 10) mostraram uma diminuição rápida de concentração plasmática em 8 horas após a administração, em comparação com o nível de Herceptina e o anticorpo quimérico, os quais permaneceram altos e estáveis até 3 dias após a injeção. Estes anticorpos humanizados iniciais apresentaram uma meia-vida mais curta e perfil de PK insatisfatório em comparação ao anticorpo quimérico, o que é provavelmente atribuível aos altos valores de pl destas variantes. A melhora adicional foi necessária para alcançar o PK do anticorpo quimérico.

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112/132 [0288] Dentre os anticorpos humanizados que têm combinações de VL e VH mostrados na Tabela 3A, L15H11, L46H11, e L47H65 foram submetidos a um teste por cinética no sangue. Os anticorpos de referência usados foram anticorpo quimérico Tal505 e anticorpos humanizados conhecidos usados em estudos de teste clínico para tratamento de AD, os quais foram produzidos por expressão recombinante com base nas informações de sequência de aminoácidos divulgadas nas informações de patente ou informações de banco de dados. Especificamente, o banco de dados do sistema de informações international ImMunoGeneTics (marca registrada) (IMGT) (http://www.imgt.org) foi referido para Solanezumab (anticorpo anti-A, Eli Lilly and Company); a sequência de aminoácidos de VH2Vk3 divulgada no documento n² W02014/200921 Al foi usada para IPN007 (anticorpo N-terminal anti-Tau, Bristol-Myers Squibb iPierian); e a sequência de aminoácidos de VH32VL21 divulgada no documento n² WO2015/091656A1 foi usada para MAb3221 (anticorpo anti-Tau-pS422, Roche Diagnostics K.K.).

[0289] Cada um dos anticorpos foi administrado de modo intraperitoneal a camundongos machos de 11 semanas de idade C57BL/6J (Charles River Laboratories Japan, Inc.) a uma concentração de 10 mg/kg cada um. O sangue foi extraído em 1, 3, 8, e 24 horas, e subsequentemente no 3² e 7- dias após a administração para coletar plasma. Cada anticorpo foi testado em triplicata (N = 3).

[0290] A concentração plasmática do anticorpo foi medida por ELISA sanduíche usando um anticorpo policlonal anti-humano. Especificamente, uma solução de PBS que contém 1 pg/mL de anticorpo policlonal (Southern Biotech) de IgG anti-humana de cabra (Fc) foi adicionada a uma placa de 96 poços (Max Sorp (NUNC)) para imobilização a 4°C de um dia para o outro, seguido por bloqueio com 3% de BSA-PBS para assim produzir uma placa imobilizada com

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113/132 anticorpo policlonal de IgG anti-humana de cabra (Fc).

[0291] Separadamente, uma série de amostras de anticorpo padrão de concentrações conhecidas foi preparada por diluição seriada de cada anticorpo com plasma tomado de um camundongo ao qual o anticorpo não foi administrado, e medido para preparação de uma curva de calibração.

[0292] As amostras de plasma e as amostras padrão a serem medidas foram diluídas, cada uma, por 10000 vezes, e adicionadas a uma placa imobilizada com anticorpo policlonal de IgG anti-humana de cabra (Fc) a 50 pL/poço para reação à temperatura ambiente por uma hora e 30 minutos, e a placa foi, então, lavada com TBS-T (solução salina tamponada com Tris, 0,05% de Tween 20). Subsequentemente, uma solução de anticorpo policlonal (Southern Biotech) de IgG anti-humana identificada com fosfatase alcalina (H+L) diluída por 2000 vezes com 3% de BSA-PBS foi adicionada à placa a 50 pL/poço para permitir uma reação à temperatura ambiente por uma hora. Após a lavagem com TBS-T, uma solução cromogênica (solução de pNPP 1 mg/mL) foi adicionada à placa a 100 pL/poço, seguida por incubação à temperatura ambiente por uma hora. A absorbância foi, então, medida com um leitor de placa a um comprimento de onda de medição de 405 nm e um comprimento de onda de referência de 550 nm. Uma curva de calibração foi preparada com base nos resultados de medição das amostras padrão, e a concentração de anticorpo em cada amostra de plasma foi calculada usando uma curva de calibração.

[0293] A Figura 5B é um gráfico que mostra mudanças em concentrações de anticorpos em plasma ao longo do tempo. Conforme óbvio a partir do gráfico, os anticorpos humanizados L15H11 (LC SEQ ID NO:32 HC SEQ ID NO:18), L46H11 (LC SEQ ID NO:36, HC SEQ ID NO:18), e L47H65 (LC SEQ ID NO:38, HC SEQ ID NQ:30) (todos usando IgGl humana (SEQ ID NO:135) e kappa humana (SEQ ID NO:79) mostraram substancialmente a mesma cinética no sangue que aquela do

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114/132 anticorpo quimérico Tal505. A cinética destes anticorpos humanizados L15H11, L46H11, e L47H65 no sangue foram comparáveis àquelas dos anticorpos humanizados conhecidos IPN007 e MAb3221, e significativamente superiores àquelas do anticorpo humanizado conhecido Solanezumab.

G. Exemplo 7: Análise de migração intracerebral [0294] Um estudo foi conduzido para analisar a concentração de cérebro das variantes humanizadas com farmacocinética de plasma.

[0295] O sangue foi coletado dos camundongos injetados com o anticorpo de camundongo parental, o anticorpo quimérico, ou as variantes de anticorpo humanizado (L15H11, L36H11, L46H11, L48H12, L48H47, L48H64, L47H65 ou L48H11) 1 semana após a injeção dos anticorpos. A seguir, os animais foram anestesiados com um coquetel anestésico 3, laparotomizados, e exsanguinados por meio da aorta abdominal. Então, o tecido de cérebro foi coletado. Este tecido de cérebro coletado foi dividido em hemisférios esquerdo e direito, congelado em gelo seco/etanol, e armazenado a -80°C. Cada hemisfério congelado foi pesado e transferido para um tubo de 2 mL. Então, 0,8 mL de TBS-I (Solução Salina Tamponada com Tris, coquetel inibidor de protease e coquetel inibidor de fosfatase) foram adicionados, e a mistura foi sonicada em água com gelo. A mistura sonicada foi centrifugada a 3000xg e 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi adicionalmente centrifugado a lOOOOOxg e 4°C por 15 minutos para obter um homogenato de cérebro.

[0296] Uma solução de PBS 10 pg/mL de anticorpos policlonais de IgG antihumana de cabra (Fc) foi pipetada em uma placa de 96 poços (MaxSorp (NUNC)) e permitiu-se que repousasse a 4°C de um dia para o outro. Então, o bloqueio foi alcançado com 3% de BSA/PBS para preparar uma placa com anticorpos policlonais de IgG anti-humana de cabra imobilizada (Fc). O homogenato de cérebro obtido a partir de camundongos não injetados com anticorpos foi usado

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115/132 para diluir em série os anticorpos e para obter a substância padrão.

[0297] Os homogenatos de cérebro e substância padrão foram diluídos por um fator de 10 e pipetados na placa com anticorpos policlonais de IgG antihumana de cabra imobilizada (Fc) a 50 pL/poço. Permitiu-se que as misturas reagissem à temperatura ambiente por 2 horas, e a placa foi, então, lavada com TBS-T (TBS, 0,025% de Tween 20). Então, uma solução preparada diluindo-se anticorpos policlonais (Sigma, n² de Cat SAB3701337-1MG) de IgG anti-humana identificada com fosfatase alcalina (H+L) por um fator de 2000 com 3% de BSA/PBS foi pipetada a 50 pL/poço, e permitiu-se que a reação avançasse por 1 hora à temperatura ambiente. A seguir, a placa foi lavada com TBS-T, o reagente de coloração pNPP (Sigma, n² de Cat P7998) foi adicionado a 100 pL/poço, e a placa foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente. Após isso, um leitor de placa foi usado para medir a absorbância a 405 nm e 550 nm.

[0298] Uma curva de calibração foi plotada com substância padrão e usada para calcular as concentrações de anticorpo no homogenato de cérebro. A concentração de anticorpo por peso de cérebro (volume de cérebro total) foi determinada e a razão da concentração plasmática foi calculada.

[0299] A Figura 6A demonstra que as variantes de anticorpo humanizado com farmacocinética satisfatória (por exemplo, L15H11, L46H11, e L47H65 de acordo com Figura 5B) tiveram concentração melhorada no cérebro.

[0300] A migração intracerebral de cada um dos anticorpos humanizados L15H11, L46H11, e L47H65 foi analisada, usando anticorpo quimérico Tal505 e anticorpos humanizados conhecidos Solanezumab, IPN007, e MAb3221, os quais foram usados em estudos de teste clínico para tratamento de AD, como anticorpos de referência.

[0301] Uma semana após a administração de cada anticorpo no Exemplo 6, o sangue foi extraído de camundongos, os quais foram, então, submetidos à

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116/132 laparatomia sob anestesia por três tipos de agentes anestésicos misturados. Após a morte a partir de exsanguinação da veia cava abdominal, o tecido de cérebro foi coletado. O tecido de cérebro coletado foi dividido em hemisférios esquerdo e direito, os quais foram congelados em etanol de gelo seco e armazenados a -80°C. Cada um dos hemisférios congelados foi pesado e transferido para um tubo de 2 mL, ao qual 0,8 mL de TBS-I (solução salina tamponada com Tris, coquetel inibidor de protease, e coquetel inibidor de fosfatase) foi adicionado. Cada hemisfério foi, então, sonicado em água com gelo. A solução sonicada foi centrifugada a 3000xg a 4°C por 10 minutos, e o sobrenadante foi coletado e adicionalmente ultracentrifugado a lOOOOOxg a 4°C por 15 minutos para obter um homogenato de cérebro.

[0302] O nível de anticorpo no homogenato de cérebro foi medido por ELISA de antígeno usando um anticorpo policlonal anti-humano. Especificamente, uma solução de PBS que contém 10 pg/mL de IgG anti-humana de cabra Fc foi adicionada a uma placa de 96 poços (Max Sorp (NUNC)) para imobilização a 4°C de um dia para o outro, seguida por bloqueio com 3% de BSAPBS para assim produzir uma placa imobilizada.

[0303] Separadamente, uma série de amostras padrão de anticorpo de concentrações conhecidas foi preparada por diluição seriada de cada anticorpo com um homogenato de cérebro coletado de um camundongo ao qual o anticorpo não foi administrado, e medido para preparação de uma curva de calibração.

[0304] Os homogenatos de cérebro e as amostras padrão a serem medidas foram diluídas, cada uma, por 10 vezes com 0,1% de leite desnatado-3% de BSAPBS, e adicionados à placa imobilizada com PD17(P) a 50 pL/poço para reação à temperatura ambiente por 2 horas. A placa foi, então, lavada com TBS-T (TBS, 0,05% de Tween 20). Subsequentemente, uma solução de anticorpo policlonal

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117/132 (Sigma-Aldrich Co. LLC., n² de Cat. SAB3701337: 1 mg) de IgG anti-humana identificada com fosfatase alcalina (H+L) diluída por 2000 vezes com 0,1% de leite desnatado-3% de BSA-PBSfoi adicionada à placa a 50 pL/poço para permitir uma reação à temperatura ambiente por uma hora. Após a lavagem da placa com TBS-T, pNPP (Sigma-Aldrich Co. LLC., n² de Cat P7998: 100 mL) foi adicionado como um substrato cromogênico em 100 pL/poço, seguido por incubação à temperatura ambiente por uma hora. A absorbância foi, então, medida com um leitor de placa a um comprimento de onda de medição de 405 nm e um comprimento de onda de referência de 550 nm. A curva de calibração foi preparada com base nos resultados de medição de amostras padrão, e o nível de anticorpo em cada amostra de homogenato de cérebro foi determinado usando a curva de calibração, e avaliada como o nível de anticorpo no cérebro.

[0305] Além disso, o nível de anticorpo em plasma foi determinado usando sangue coletado antes da laparotomia da mesma maneira que no Exemplo 6, e a razão entre o nível de anticorpo no cérebro e aquele no plasma foi calculada.

[0306] A Figura 6B é um gráfico que mostra a razão entre o nível de cada anticorpo no cérebro e o nível do anticorpo correspondente no plasma. As razões entre as concentrações de anticorpo no cérebro e as concentrações de anticorpo no plasma de anticorpos humanizados L15H11, L46H11 e L47H65 foram altas em comparação com aquelas de anticorpo quimérico Tal505 e anticorpos humanizados conhecidos IPN007, MAb3221 e Solanezumab. Os resultados indicam que estes anticorpos humanizados têm alta migração para o cérebro.

Exemplo 8: Desenvolvimento Adicional de Anticorpos Humanizados Seletivos [0307] As mutações adicionais foram introduzidas à sequência CDR1 de VL46 para remover um ponto de acesso de desamidação e/ou reverter a

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118/132 sequência de CDR para a sequência de camundongo parental. A Tabela 11 resume as mutações introduzidas na CDR1 de VL46.

Tabela 11. Mutações introduzidas em CDR1 de VL46

Mutação	Propósito
VL46 G34A (SEQ ID NO:105)	Remover desamidação
VL46 G34S (SEQ ID NO:106)	Remover desamidação
VL46 G34T (SEQ ID NO:107)	Remover desamidação
VL46 N33Q (SEQ ID NO:108)	Remover desamidação
VL46 N33Q G34A (SEQ ID NO:109)	Remover desamidação
VL46 N33D (SEQ ID NO:110)	Mimetizar desamidação completa
VL46 N33S (SEQ ID NO:111)	Remover desamidação
VL46 N33T (SEQ ID NO:112)	Remover desamidação
VL46_S28N (SEQ ID NO:113)	Reverter CDR1 de LC para camundongo
VL46 G34A S28N (SEQ ID NO:114)	Remover desamidação e reverter CDR1 de LC para camundongo

[0308] Além disso, isotipos de IgG diferentes incluindo IgGl e lgG4 com mutação S228P foram testados nas variantes de anticorpo humanizado recém geradas. A Tabela 12 resume a cadeia leve e a cadeia pesada das variantes de anticorpo humanizado recém geradas juntamente com o anticorpo de camundongo parental e o anticorpo quimérico.

Tabela 12. Cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos específicos

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Camundongo x [MAPT_H] mAb (Tal505) lgG2a / Kappa (HY)	ms lgG2a
Quimera Camundongo Humano χ [ΜΑΡΤ Η] mAb (Tal505) IgGl/ Kappa (CX)	IgG 1 quim.
Quimera Camundongo Humano χ [ΜΑΡΤ Η] mAb (Tal505) lgG4 S228P/ Kappa (CX)	lgG4 quim.
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505 VL46/ VH11) IgGl/ Kappa (CX)	hu VL46/VH11 IgGl
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505 VL46/ VH11) lgG4S228P/ Kappa (CX)	hu VL46/VH11 lgG4
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505-VL46_G34A / VH11) IgGl / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 G34A IgGl
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505-VL46_G34A / VH11) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 G34A lgG4
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505-VL46_G34S / VH11) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 G34S lgG4
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505-VL46_G34T/ VH11) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 G34T lgG4
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505-VL46_N33Q/ VH11) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 N33Q lgG4
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505- VL46 N33Q G34A / VH 11) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 N33Q G34A lgG4
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505-VL46_N33D/ VH11) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11N33D lgG4
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505-VL46_N33S / VH 11) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 N33S lgG4
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505-VL46_N33T/ VH11) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 N33T lgG4
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505-VL46/VH11 A64D) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 A64D lgG4
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505-VL46 S28N / VH11) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 S28N lgG4

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Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505 VL47/ VH65) IgGl/ Kappa (CX)	hu VL47/VH65 IgGl
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505VL46 G34A S28N / VH11) IgGl/ Kappa (CX)	hu VL46/VH11 G34A S28N IgGl
Humanizado x [MAPT_H] mAb (Tal505- VL46 G34A S28N / VH11) lgG4 S228P / Kappa (CX)	hu VL46/VH11 G34A S28N lgG4

H. Exemplo 9: Análise de ligação Biacore^tm das variantes de anticorpo humanizado recém geradas [0309] As afinidades de ligação das variantes de anticorpo humanizado recém geradas foram medidas usando biossensores Biacore™ T200 e 4000 (GE Healthcare, Chicago, IL). O tampão de execução a seguir: HEPES 10 mM (GE Healthcare, BR100671), NaCI 150 mM (GE Healthcare, BR100671), 0,05% v/v de Tensoativo P20 (GE Healthcare, BR100671), DTT2 mM (Sigma, 10708984001, St. Louis, MO), e EDTA 1 mM (GE Healthcare, 28995043), foi usado para imobilização, diluição de amostra e coleta de dados a menos que observado de outro modo abaixo.

[0310] A proteína imobilizada refere-se proteína Tau fosforilada imobilizada humana recombinante no chip; lxP peptídeo imobilizado refere-se ao peptídeo fosforilado (TSPRHLSNVS(pS)TGSIDMVDSPC, SEQ ID NO:75) imobilizado no chip. Ambos estes métodos têm um componente de avidez para a medição de afinidade. O analito de peptídeo 4xP tem o anticorpo capturado no chip e o peptídeo fosforilado 4x (GAEIVYK(pS)PVVSGDT(pS)PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD(pS)PQLATLADEVSASLAKQ GL, SEQ ID NO:78) em solução.

[0311] A ligação de anticorpo à proteína Tau fosforilada imobilizada foi medida usando Chips de Sensor NTA Série S (GE Healthcare, BR100034). O tampão de execução para a imobilização foi HEPES 10 mM, NaCh 150 mM, 0,05% v/v de Tensoativo P20, pH 7,4 (GE Healthcare, BR100671) e a taxa de fluxo foi 10

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121/132 pL/minuto. EDTA 350 mM foi injetado por 1 minuto para limpar o chip, seguido por uma injeção de 2 minutos de NiCb 0,5 mM (GE Healthcare, Kit de Reagente NTA) para preparar o chip para capturar proteína com etiqueta de His. O chip foi ativado de acordo com as instruções do fabricante usando um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare, BR100633), então, proteína Tau fosforilada 300 nM (80AWB) foi injetada até a quantidade desejável de proteína ter sido imobilizada. O chip foi bloqueado com etanolamina do kit de acoplamento de amina. Cada experimento usou múltiplos níveis de proteína Tau fosforilada imobilizada. O nível mais baixo variou de 54 unidades de ressonância (RU) a 452 RU, e o nível mais alto variou de 463 RU a 1020 RU. Para medir a afinidade de ligação de anticorpo Tal505 à proteína Tau fosforilada imobilizada, uma série de diluição de 3 vezes de 5 membros de cada anticorpo foi preparada, resultando em concentrações de 0,37 nM a 30 nM. Cada concentração e diversos brancos de tampão foram injetados por 3 minutos a uma taxa de fluxo de 45 pL/minuto. A dissociação do anticorpo foi monitorada por 15 minutos, então, a superfície foi regenerada com uma injeção de 30 segundos a 1 minuto de CAPS 100 mM (Sigma, C6070), KCI 1 M (Sigma, P9541), EDTA 1 mM, DTT 2 mM, pH 10,5.

[0312] A ligação de anticorpo ao peptídeo Tau fosforilado imobilizado foi medida usando um Chip de Sensor CM3 Série S (GE Healthcare, BR100536). O chip foi ativado usando um kit de acoplamento de amina, então, peptídeo Tau fosforilado 30 pg/mL (SEQ ID NO:75) em acetato de sódio 10 mM, o pH 5,0 foi injetado até 51 RU terem sido imobilizados. O chip foi bloqueado com etanolamina. Uma superfície de referência de controle negativo foi preparada de modo similar, usando peptídeo Tau não fosforilado (TSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPC, SEQ ID NO:77). Para medir a afinidade de ligação de anticorpo Tal505 ao peptídeo Tau fosforilado imobilizado, uma série de

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122/132 diluição de 3 vezes de 5 membros de cada anticorpo foi preparada, resultando em concentrações de 0,37 nM a 30 nM. Cada concentração e diversos brancos de tampão foram injetados por 3 minutos a uma taxa de fluxo de 45 pL/minuto. A dissociação do anticorpo foi monitorada por 15 minutos. A superfície foi regenerada com uma injeção de 30 segundos de ácido clorídrico 100 mM (Fisher Scientific, SA56-1, Waltham, MA).

[0313] A ligação de peptídeo Tau fosforilado ao anticorpo imobilizado foi medida usando Chips de Sensor CM5 Série S (GE Healthcare, 29149603). O chip foi ativado usando um kit de acoplamento de amina, então, anticorpo 1 a 3 pg/mL em acetato de sódio 10 mM, pH 5,0 (Ge Healthcare, BR100351) foi injetado até 280 a 9100 RU de anticorpo terem sido imobilizados. O chip foi bloqueado com etanolamina. Para medir a afinidade de ligação de peptídeo Tau fosforilado (SEQ ID NO:78) aos anticorpos Tal505 imobilizados, uma série de diluição de 2,5 vezes de 6 membros do peptídeo foi preparada, resultando em concentrações de 5,1 nM a 500 nM. As amostras e diversos brancos de tampão foram injetados a 30 a 50 pL/minuto por 3 minutos, e a dissociação foi monitorada por 15 minutos. A superfície foi regenerada com uma injeção de 30 segundos de acetato de sódio 20 mM, pH 4,5, não ajustada, ou com o pH ajustado a 3,5 com ácido clorídrico.

[0314] Os dados foram processados e ajustados usando Software de Avaliação Biacore™ T200 versão 2.0 ou Software de Avaliação Biacore™ 4000 versão 1.1 (GE Healthcare). Os dados foram referenciados duplamente subtraindo-se a resposta de uma célula de fluxo de controle negativo e subtraindo-se a resposta de uma injeção de tampão ou a resposta média de duas injeções de tampão. Os dados foram, então, ajustados com o modelo Ligação 1:1 para determinar a constante de taxa de associação, k_a (M^s-¹, em que M é igual a molar e s é igual a segundos) e a constante de taxa de dissociação, kd

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123/132 (s-¹). Estas constantes de taxa foram usadas para calcular a constante de dissociação de equilíbrio, Kd (M) = kd/k_a. A Tabela 13 resume os valores de Kd das variantes de anticorpo humanizado recém geradas em comparação com aquelas do anticorpo de camundongo parental e o anticorpo quimérico.

Tabela 13. Valores de Kd (nM) de Anticorpos para Proteína ou Peptídeo Tau

Fosforilado

	Proteína Imobilizada	Peptídeo lxP imobilizado	Analito de peptídeo 4xP
ms lgG2a	0,43	0,03	17,5
IgGl quim.	0,46	0,04	27,2
lgG4 quim.	0,58	0,06	28,5
hu VL46 (SEQ. ID NO:163)/ VH11 IgGl (SEQ ID NO:144)	0,46	0,06	24,3
hu VL46 (SEQ ID NO:163)/ VH11 lgG4 (SEQ ID NO:152)	0,70	0,09	39,3
hu VL46 G34A (SEQ ID NO:166)/ VH11 IgGl (SEQ ID NO:144)	0,28	ND	ND
hu VL46 G34A (SEQ ID NO:166) / VH11 lgG4 (SEQ ID NO:151)	0,52	0,09	36,2
hu VL46 G34S (SEQ ID NO:168) / VH11 lgG4(SEQID NO:151)	NB	NB	ND
hu VL46 G34T (SEQ ID NQ:170)/ VH11 lgG4(SEQID NO:151)	0,75	0,13	ND
hu VL46 N33Q (SEQ ID NO:172)/ VH11 lgG4( SEQ ID NO:151)	1,27	0,14	ND
hu VL46 N33Q G34A (SEQ ID NO:174)/VH11 lgG4 (SEQ ID NO:151)	3,40	0,31	ND
hu VL46 (SEQ ID NO:163)/ VH11 lgG4(SEQID NO:151)	NB	1,78	ND
hu VL46 N33S (SEQ ID NO:178)/	2,31	0,29	ND

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124/132

	Proteína Imobilizada	Peptídeo lxP imobilizado	Analito de peptídeo 4xP
VH11 lgG4 (SEQ ID NO:151)
hu VL46 N33T (SEQ ID NQ:180)/ VH11 lgG4 (SEQ ID NO:151)	1,31	0,18	ND
hu VL46 A64D / VH11 lgG4 (SEQ ID NO:151)	0,77	0,16	ND
hu VL46 S28N (SEQ ID NO:183)/ VH11 lgG4 (SEQ ID NO:151)	0,42	0,10	32,5
hu VL47 (SEQ ID NO:164)/ VH65 IgGl (SEQ ID NO:153)	0,45	0,06	ND
hu VL46G34A S28N (SEQ ID NO:184)/VH11 IgGl (SEQ ID NO: 144)	0,43	ND	ND
hu VL46G34A S28N (SEQ ID NO:184)/VH11 lgG4 (SEQ ID NO:151)	0,80	ND	ND

I. Exemplo 10: Análise de ligação de ELISA do anticorpo de camundongo parental, do anticorpo quimérico, e algumas variantes de anticorpo humanizado [0315] A ligação do anticorpo de camundongo parental, do anticorpo quimérico, e das variantes de anticorpo humanizado recém geradas a um peptídeo fosforilado (PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD, SEQ ID NO:79) e o peptídeo não fosforilado correspondente (PRHLSNVSTGSIDMVD, SEQ ID NQ:80) foi analisada por ELISA.

[0316] Cinquenta microlitros de peptídeo fosforilado ou não fosforilado 1 pg/mL em PBS foram adicionados a cada poço de placas de ELISA e as placas foram incubadas a 4°C de um dia para o outro. No próximo dia, as placas foram lavadas 3 vezes e bloqueadas com 200 pL de superbloqueio a 4°C de um dia para o outro. No terceiro dia, as placas foram lavadas 3 vezes. Então, 50 pL de anticorpos em diluição seriada 1:3 no tampão ELISA, que começa a 10 pg/mL,

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125/132 foram adicionados a cada poço da placa, incubados à temperatura ambiente por 1 hora, então, lavados 3 vezes. Cinquenta microlitros de diluição 1:3000 de anticamundongo-HRP de cabra (Southern Biotech, 1030-05) foram adicionados para medir o anticorpo de camundongo parental. Cinquenta microlitros de diluição 1:3000 de anti-humano-HRP de cabra (Jackson Immunologies, 109-036-098) foram adicionados para medir o anticorpo quimérico e anticorpos humanizados. As placas de ELISA foram incubadas à temperatura ambiente por 45 minutos, lavadas 3 vezes, então, desenvolvidas com ABTS à temperatura ambiente por 5 minutos. Após isso, um leitor de placa foi usado para medir a absorbância a 405 nm.

[0317] As Figuras 8A e 8B mostram que o anticorpo parental gerado por hibridoma ou método recombinante ligou-se ao peptídeo fosforilado (Figura 8A), mas não ao peptídeo não fosforilado (Figura 8B). De modo similar, os anticorpos quiméricos (com cadeia principal de IgGl ou lgG4) ligaram-se ao peptídeo fosforilado (Figura 8C), mas não ao peptídeo não fosforilado (Figura 8D).

[0318] As Figuras 9A a 9C demonstram que a maior parte das variantes de anticorpo humanizado recém geradas ligam-se ao peptídeo fosforilado com afinidade comparável ao anticorpo de lgG4 quimérica, enquanto algumas variantes perdem a afinidade de ligação ao peptídeo fosforilado. Particularmente, na Figura 9B, a variante huVL46/VHll_N33D_lgG4, que mimetiza a desamidação completa de aminoácido N33 a D, teve ligação vastamente reduzida ao peptídeo fosforilado, o que sugere que o anticorpo desamidado completamente perderia sua afinidade de ligação à proteína Tau fosforilada drasticamente. Desse modo, a redução de desamidação em N33 nas variantes de anticorpo humanizado é imperativa.

XV. Exemplo 11: Análise de ligação de antígeno das variantes de anticorpo humanizado recém geradas em homogenatos de cérebro de pacientes com

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126/132 doença de Alzheimer [0319] O anticorpo de camundongo parental, o anticorpo quimérico, e variantes de anticorpo humanizado selecionadas foram avaliadas por sua potência de ligação à proteína Tau fosforilada de Ser413 (pSer413-Tau) derivada de amostras clínicas de paciente com doença de Alzheimer (AD) em uma fase líquida.

[0320] Conforme descrito nas Figuras 10A a 10E, a ocupação de anticorpo em pSer413-Tau foi determinada pela diferença entre a ligação de antígeno livre e total detectada usando anticorpo de lgG2a Tal505 biotinilado de camundongo após a incubação das amostras de cérebro com AD com concentração crescente de IgG humana de controle (Sigma, n² de Cat 12511) e variantes de anticorpo selecionadas, respectivamente.

[0321] A detecção com o mesmo anticorpo de lgG2a Tal505 biotinilado de camundongo permite uma comparação direta de potência de ligação entre os anticorpos variantes. O anticorpo de lgG2a Tal505 de camundongo foi biotinilado usando N-hidroxisuccinimida-LC-biotina (NHS-LC-biotina) (Thermo Fisher Scientific K.K.), seguido por diálise com PBS.

[0322] O tecido de córtex pré-frontal congelado (100 mg) do cérebro de um paciente com AD foi adicionado a 1 mL de TBS-I (solução salina tamponada com Tris, n² de Cat BP2471-1, Thermo Fisher Scientific) que contém uma protease e coquetel inibidor de fosfatase (Thermo Fisher Scientific, n² de Cat 1861281) e lisado em água com gelo usando Lisador de Tecido Qiagen II. A amostra homogeneizada foi centrifugada a 27000g (rotor TLA-55) a 4°C por 20 minutos em Ultracentrífuga Beckman Coulter Optima Max-XP, e o sobrenadante foi coletado e adicionalmente centrifugado a 150000xg (rotor TLA-55) a 4°C por 20 minutos em Ultracentrífuga Beckman Coulter Optima Max-XP para obter um pélete chamado fração P2. A fração P2 foi ressuspensa em tampão de

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127/132 homogeneização TBS-I por sonicação. A concentração de proteína da fração P2 foi determinada usando Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce™ (Thermo Fisher Scientific, n² de Cat 23225) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de proteína foi ajustada a 4 pg/mL.

[0323] 0 kit IN NOTEST pTau (pT181) (Fijirebio Inc., Cat#81581) foi usado como um sistema ELISA para proteína Tau fosforilada de Ser413 (pSer413-Tau), mas o anticorpo biotinilado incluído no kit (identificado como CONJ1) foi substituído pelo anticorpo de lgG2a Tal505 lgG2a de camundongo biotinilado conforme produzido acima.

[0324] O anticorpo de camundongo parental, o anticorpo quimérico, as variantes de anticorpo humanizado, ou o IgG humano de controle foram diluídos a 200 nM a partir de estoques em tampão de diluente de amostra (fornecido por kit INNOTESTj. As soluções de anticorpo foram, então, diluídas em série e incubadas com frações p2 de cérebro com AD anteriormente diluídas em 1/1000 em placa de ensaio por 4 horas à temperatura ambiente. A mistura de anticorpoantígeno foi, então, adicionado a uma placa MT imobilizada de anticorpo HT7 (incluído no kit), juntamente com lgG2a Tal505 de camundongo de anticorpo biotinilado diluído (1/10 em CONJ DIL 1, fornecido pelo kit INNOTEST j. A amostra resultante foi misturada e incubada a 4°C de um dia para o outro. No dia seguinte, a placa foi lavada, e uma estreptavidina identificada com HRP (incluído no kit as CONJ2) foi adicionada à placa, seguida por incubação por uma hora. Após a lavagem, um reagente de cor TMB foi adicionado, seguido por incubação sob proteção de luz à temperatura ambiente por 30 minutos. A reação foi, então, interrompida com uma solução terminadora de reação (incluído no kit como solução STOP), e a absorbância em um comprimento de onda de 450 nm foi medida.

[0325] A análise não linear da curva de concentração-resposta ilustrada nas

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Figuras 10A a 1OE permite a determinação da concentração de cada anticorpo necessário para 50% de ocupação de Tau pSer413 em homogenatos de cérebro com AD, assim como a porcentagem de nível de ocupação máximo para cada anticorpo. As Figuras 10A a 10E demonstram características de ligação comparáveis, incluindo o nível in vitro de ocupação e ligação máxima de antígeno Tau de pSer413, para o anticorpo de camundongo parental, o anticorpo quimérico, e variantes de anticorpo humanizado selecionadas em homogenatos de cérebro de pacientes com AD.

XVI. Exemplo 12: Análise de estabilidade e pureza das variantes de anticorpo humanizado recém geradas [0326] A estabilidade de vários anticorpos foi determinada medindo-se a temperatura de fusão (Tml) e temperatura de agregação (Tagg) por meio de nano-DSF. A pureza de cada anticorpo foi medida por SEC e SDS capilar não reduzido (NR-cSDS).

[0327] Determinação de Tm e Tagg: Tm e Tagg foram determinados por nano-DSF usando um Fluorímetro de Varredura Diferencial Prometheus NT.48 (Nanotemper Technologies) controlado pelo programa PR.ThermControl v2.0.4. A potência de excitação foi 40% e a temperatura foi aumentada de 20°C a 95°C em uma taxa de l°C/min. Tm e Tagg foram automaticamente medidos. As amostras foram preparadas diluindo-se a 1 mg/mL em acetato de sódio 20 mM, pH 5,5, tampão e extraídas por ação capilar em um tubo capilar de vidro Prometheus (PR-L002).

[0328] Determinação de pureza por SEC: SEC foi executado em um sistema de Classe H ACQUITY UPLC. A coluna usada foi uma coluna ACQUITY UPLC Protein BEH SEC (Parte n² 186005225, 1,7 pm, 200A, 4,6 mm xl50 mm) de Waters (Milford, MA). A temperatura de coluna foi 25°C e 10 μΙ_ de amostra a 1 mg/mL foram injetados usando uma taxa de fluxo de sistema de 0,5 mL/min. A fase

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129/132 móvel foi fosfato de sódio 100 mM, cloreto de sódio 200 mM, e 0,02 % de azida de sódio, pH 7,0. Os dados foram quantificados tanto em 214 quanto em 280 nm e analisados usando o programa Empower 3. Uma Mistura Padrão de Proteína BEH200 SEC (Parte n² 186006518) de Waters (Milford, MA) foi injetada em Resolução de 10 pg e USP, Placas Teóricas, e Cauda foram medidos.

[0329] Determinação de pureza por NR-cSDS: Para avaliar a pureza por NRcSDS, 5 pL de cada amostra a 1 mg/mL foram misturadas em uma placa de 96 poços com 35 pL de tampão de carregamento (Tampão de Amostra de Expressão de Proteína HT (Perkin Elmer)) que contém iodoacetamida 50 mM. A placa foi incubada a 70°C por 20 minutos e 75 pL de água foram adicionados a cada poço. Cada amostra foi analisada em um Sistema LabChip GXII (Perkin Elmer) usando um Chip de Expressão de Proteína HT (Perkin Elmer). Os eletroferogramas foram coletados medindo-se a fluorescência da amostra ao longo do tempo, e integrados usando o programa LabChip GX V4.1.1619.0 SP1 (Perkin Elmer).

A tabela 14 resume a estabilidade e a pureza dos anticorpos testados.

Tabela 14. Estabilidade e Pureza de Diversos Anticorpos

	Estabilidade	Pureza
	Tml	Tagg	% de pureza SEC	% de pureza NR-cSDS
ms lgG2a	65,0	ND	99,1	100
IgGl quim.	ND	ND	96,2	ND
lgG4 quim.	ND	ND	95,3	ND
hu VL46/VH11 IgGl	68,5	69,5	99,0	100
hu VL46/VH11 lgG4 (ref)	66,8	66,0	98,4	100
hu VL46/VH11 G34A IgGl	65,9	66,2	100	100
hu VL46/VH11	64,0	63,8	100	98,0

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130/132

	Estabilidade	Pureza
	Tml	Tagg	% de pureza SEC	% de pureza NR-cSDS
G34A lgG4
hu VL46/VH11 G34A lgG4	65,3	66,6	100	100
hu VL46/VH11 G34S lgG4	ND	ND	ND	100,0
hu VL46/VH11 G34T lgG4	65,8	66,5	ND	99,3
hu VL46/VH11 N33Q lgG4	65,2	67,1	99,6	100
hu VL46/VH11 N33QG34A lgG4	ND	ND	ND	100
hu VL46/VH11 N33D lgG4	ND	ND	ND	100
hu VL46/VH11 N33S lgG4	ND	ND	ND	99,8
hu VL46/VH11 N33T lgG4	ND	ND	ND	100
hu VL46/VH11 A64D lgG4	ND	ND	ND	100
hu VL46/VH11 S28N lgG4	68,1	67,8	99,6	100
hu VL47/VH65 IgGl	59,6	60,2	99,9	100
hu VL46/VH11 G34A S28N IgGl	65,5	66,7	100	97,0
hu VL46/VH11 G34A S28N lgG4	63,8	65,0	100	97,0

[0330] Todas as variantes de anticorpo humanizado recém geradas mantiveram ou melhoraram a estabilidade e a pureza em comparação com o anticorpo de camundongo parental ou os anticorpos quiméricos. Uma variante

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131/132 humanizada original huVL47/VH65 IgGl se destacou por ter estabilidade reduzida conforme medido por Tml/Tagg.

XVII. Exemplo 13: Análise de desamidação das variantes de anticorpo humanizado recém geradas [0331] O nível de desamidação de aminoácido N33 na CDR1 de cadeia leve de vários anticorpos foi determinado. Condições de estresse, como incubação a 50°C ou pH 10, foram testadas. Uma incubação a 4°C foi realizada como um controle.

[0332] Incubação a 4°C e 50°C: As amostras formuladas em acetato de sódio 20 mM, pH 5,5, a 2 mg/mL foram mantidas a 50°C em uma câmara de estabilidade de temperatura controlada por uma semana. As amostras foram mantidas a 4°C para o controle a 4°C com propósitos de comparação.

[0333] Incubação a pH 10: As amostras formuladas em acetato de sódio 20 mM, pH 5,5, a 2 mg/mL foram ajustadas a pH 10 usando NaOH 0,5 M e mantidas a 25°C por uma semana em uma câmara de estabilidade de temperatura controlada. Após isso, as amostras foram, então, trocadas em acetato de sódio 20 mM, pH 5,5, tampão usando colunas de dessalinização Zeba Spin (7K MWCO, Thermo Fisher 2 mL, 89890).

[0334] Análise de Desamidação por Mapeamento de Peptídeo: Para mapeamento de peptídeo por espectrometria de massa, 100 pg de cada amostra foram desnaturados com 30 pL de solução de guanidina 8 M/cloridrato de Tris 1 M (15:1), reduzidos com 2 pL de DTT 1 M por 30 minutos a 60°C e alquilados com 5 pL de iodoacetamida 1 M por 45 minutos no escuro. Antes da digestão, as amostras foram trocadas em tampão em bicarbonato de amônio 50 mM usando cartuchos ZEBA de corte de peso molecular de 7 kilo Dalton. As amostras foram divididas em tubos diferentes e digeridas em paralelo com 2 pg de tripsina e quimiotripsina por 2 horas a 37°C. A digestão foi bruscamente arrefecida pela

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132/132 adição de 3 μΙ_ de cloridrato 5 M para cada amostra. 2 μΙ_ de amostra foram injetados na coluna de UPLC Waters - Peptídeo BEH-C18 (Parte n² 186005592) mantidos a 40°C. Os dados foram adquiridos em um Dionex/QE mais MS usando um gradiente linear por 50 min de 2% a 36% de acetonitrila em 0,1% de ácido fórmico. As amostras foram analisadas usando PEAKS DB (Bioinformatics Solutions Inc.) para busca de banco de dados, assim como PepFinder (Thermo Fisher Scientific) e verificação manual para a porcentagem de avaliação de mudança. A Tabela 15 resume a porcentagem de desamidação de aminoácido N33 na CDR1 de cadeia leve dos anticorpos testados.

Tabela 15. Porcentagem de Desamidação de N33 em CDR1 de Cadeia Leve sob Várias Condições

	Controle 4°C	50°C	pH 10
ms lgG2a	41,1	36,9	31,7
hu VL46/VH11 IgGl	33,0	33,9	31,8
hu VL46/VH11 lgG4	32,0	31,0	37,9
hu VL46/VH11 G34A lgG4	<1%	ND	<1%
hu VL46/VH11 G34T lgG4	<1%	ND	<1%
hu VL46/VH11 N33Q lgG4	<1%	ND	<1%
hu VL46/VH11 G34A S28N IgGl	<1%	1,2	1%
hu VL46/VH11 G34A S28N lgG4	<1%	2,1	1%

[0335] Em comparação com o anticorpo de camundongo parental e o anticorpo IgG 1 ou lgG4 variante humanizado original (VL46 / VH11), as variantes de anticorpo humanizado geradas recentemente exibiram redução significativa no nível de desamidação de N33 na CDR1 de cadeia leve.

Claims (38)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo anti-pSer413 tau, caracterizado pelo fato de que compreende:

   a) um domínio variável pesado selecionado a partir da SEQ ID NO: 116 e SEQ ID NO: 117; e

   b) um domínio variável leve selecionado a partir da SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 103.
2. 2. Anticorpo anti-pSer413 tau, caracterizado pelo fato de que compreende:

   a) um domínio variável pesado selecionado a partir da SEQ ID NO: 116 e SEQ ID NO: 117; e

   b) um domínio variável leve selecionado a partir da SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 103; em que a razão da referida afinidade de ligação do anticorpo com o peptídeo fosforilado da SEQ ID NO: 8 à referida afinidade de ligação do anticorpo com o peptídeo não fosforilado da SEQ ID NO: 69 é pelo menos cerca de 40.
3. 3. Anticorpo anti-pSer413 tau de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende um domínio constante pesado selecionado a partir da SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 e SEQ ID NO: 143.
4. 4. Anticorpo anti-pSer413 tau de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende um domínio constante leve selecionado a partir da SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80.

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5. 5. Anticorpo anti-pSer413 tau de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido domínio leve variável tem SEQ ID NO: 114 e o referido domínio pesado variável tem SEQ ID NO: 116.
6. 6. Anticorpo anti-pSer413 tau de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve do referido anticorpo tem SEQ ID NO: 184 e a cadeia pesada do referido anticorpo tem SEQ ID NO: 144.
7. 7. Anticorpo anti-pSer413 tau de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida cadeia leve tem SEQ ID NO: 184 e a cadeia pesada do referido anticorpo tem SEQ ID NO: 152.
8. 8. Anticorpo anti-pSer413 tau de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo referida cadeia leve são selecionadas a SEQ ID NO: 144; LC SEQ ID NO: 184 e HC SEQ ID NO: 146; LC SEQ ID NO: 184 e HC SEQ ID NO: 148; LC SEQ ID NO: 184 e HC SEQ ID NO: 150; LC SEQ ID NO: 184 e HC SEQ ID NO: 152; LC SEQ ID NO: 184 e HC SEQ ID NO: 154; LC SEQ ID NO: 184 e HC SEQ ID NO: 156; LC SEQ ID NO: 184 e HC SEQ ID NO: 158; LC SEQ ID NO: 184 e HC SEQ ID NO: 160; LC SEQ ID NO: 184 e HC SEQ ID NO: 144; LC SEQ ID NO: 185 e HC SEQ ID NO: 146; LC SEQ ID NO: 185 e HC SEQ ID NO: 148; LC SEQ ID NO: 185 e HC SEQ ID NO: 150; LC SEQ ID NO: 185 e HC SEQ ID NO: 152; LC SEQ ID NO: 185 e HC fato de que a referida cadeia pesada e a partir dos pares LC SEQ ID NO: 184 e HC

   SEQ ID NO: 145; LC SEQ ID NO: 184 e HC

   SEQ ID NO: 147; LC SEQ ID NO: 184 e HC

   SEQ ID NO: 149; LC SEQ ID NO: 184 e HC

   SEQ ID NO: 151; LC SEQ ID NO: 184 e HC

   SEQ ID NO: 153; LC SEQ ID NO: 184 e HC

   SEQ ID NO: 155; LC SEQ ID NO: 184 e HC

   SEQ ID NO: 157; LC SEQ ID NO: 184 e HC

   SEQ ID NO: 159; LC SEQ ID NO: 184 e HC

   SEQ ID NO: 161; LC SEQ ID NO: 185 e HC

   SEQ ID NO: 145; LC SEQ ID NO: 185 e HC

   SEQ ID NO: 147; LC SEQ ID NO: 185 e HC

   SEQ ID NO: 149; LC SEQ ID NO: 185 e HC

   SEQ ID NO: 151; LC SEQ ID NO: 185 e HC

   SEQ ID NO: 153; LC SEQ ID NO: 185 e HC

   Petição 870190076753, de 08/08/2019, pág. 13/490

   3/13

   SEQ ID NO: 154; LC SEQ ID NO: 185 e HC SEQ ID NO: 155; LC SEQ ID NO: 185 eHC

   SEQ ID NO: 156; LC SEQ ID NO: 185 e HC SEQ ID NO: 157; LC SEQ ID NO: 185 eHC

   SEQ ID NO: 158; LC SEQ ID NO: 185 e HC SEQ ID NO: 159; LC SEQ ID NO: 185 eHC

   SEQ ID NO: 160 e LC SEQ ID NO: 185 e HC SEQ ID NO: 161.
9. 9. Composição de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende:

   a) um primeiro ácido nucleico que codifica uma cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184 e SEQ ID NO: 185; e

   b) um segundo ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 144; SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; SEQ ID NO: 147; SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 151; SEQ ID NO: 152; SEQ ID NO: 153; SEQ ID NO: 154; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 157; SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; SEQ ID NO: 160 e SEQ ID NO: 161.
10. 10. Composição de vetor de expressão, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de ácido nucleico definida na reivindicação 9, em que o referido primeiro ácido nucleico está contido em um primeiro vetor de expressão e o referido segundo ácido nucleico está contido em um segundo vetor de expressão.
11. 11. Composição de vetor de expressão, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de ácido nucleico definida na reivindicação 9, em que o referido primeiro ácido nucleico e o referido segundo ácido nucleico estão contidos em um vetor de expressão.

    Petição 870190076753, de 08/08/2019, pág. 14/490

    4/13
12. 12. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de vetor de expressão definida na reivindicação 10 ou 11.
13. 13. Método para a preparação de um anticorpo anti-pSer413 tau, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a referida célula hospedeira definida na reivindicação 12 sob condições em que o referido anticorpo é expresso e o referido anticorpo é recuperado.
14. 14. Uso do anticorpo anti-pSer413 tau definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar taupatia.
15. 15. Anticorpo anti-pSer413 tau, caracterizado pelo fato de que compreende:

    a) um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma vhCDRl que compreende SEQ ID NO: 86, uma vhCDR2 que compreende SEQ ID NO: 115 e uma vhCDR3 que compreende SEQ ID NO: 88; e

    b) um domínio variável de cadeia leve que compreende um conjunto de vICDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em:

    i) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 102, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    ii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 91, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    iii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 92, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    iv) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 93, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    v) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 94, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    vi) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 95, uma vlCDR2 que

    Petição 870190076753, de 08/08/2019, pág. 15/490

    5/13 compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    vii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 96, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    viii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 97, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    ix) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 98, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    x) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 99, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    xi) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 100, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83; e xii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 101, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83.
16. 16. Anticorpo anti-pSer413 tau, caracterizado pelo fato de que compreende:

    a) um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma vhCDRl que compreende SEQ ID NO: 86, uma vhCDR2 que compreende SEQ ID NO: 115 e uma vhCDR3 que compreende SEQ ID NO: 88; e

    b) um domínio variável de cadeia leve que compreende um conjunto de vICDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em:

    i) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 102, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    ii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 91, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    iii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 92, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    iv) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 93, uma vlCDR2 que

    Petição 870190076753, de 08/08/2019, pág. 16/490

    6/13 compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    v) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 94, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    vi) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 95, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    vii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 96, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    viii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 97, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    ix) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 98, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    x) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 99, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    xi) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 100, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83; e xii) uma vICDRl que compreende SEQ ID NO: 101, uma vlCDR2 que compreende SEQ ID NO: 82 e uma vlCDR3 que compreende SEQ ID NO: 83;

    em que a razão da referida afinidade de ligação do anticorpo com o peptídeo fosforilado da SEQ ID NO: 8 à referida afinidade de ligação do anticorpo com o peptídeo não fosforilado da SEQ ID NO: 69 é pelo menos cerca de 40.
17. 17. Anticorpo humanizado ou um fragmento ou derivado do mesmo, caracterizado pelo fato de que causa uma reação antígeno-anticorpo com uma proteína tau ou um peptídeo tau fosforilado pelo menos em um resíduo de aminoácido que corresponde a Ser413 da SEQ ID NO: 1.
18. 18. Anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que tem uma constante de dissociação de equilíbrio de 1,86 x IO'⁸ M ou inferior para a proteína tau ou

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    7/13 peptídeo tau.
19. 19. Anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade seletiva melhorada com a proteína tau fosforilada ou peptídeo tau em comparação com uma proteína tau não fosforilada ou peptídeo tau.
20. 20. Anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que tem uma capacidade melhorada para entrar no cérebro quando administrado no sangue.
21. 21. Anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende: como uma sequência de vhCDRl de região determinante de complementaridade variável pesada (vhCDR), uma sequência de aminoácidos que tem 80% ou mais de homologia com a sequência IM (SEQ ID NO: 10); como uma sequência de vhCDR2, uma sequência de aminoácidos que tem 84% ou mais de homologia com a sequência 2M (SEQ ID NO: 11) ou 2H1 (SEQ ID NO: 12); como uma sequência de vhCDR3, uma sequência de aminoácidos que tem 80% ou mais de homologia com a sequência 3M (SEQ ID NO: 13); como uma sequência de vICDRl, uma sequência de aminoácidos que tem 87% ou mais de homologia com a sequência 4L1 (SEQ ID NO: 14) ou 4M (SEQ ID NO: 15); como uma sequência de vlCDR2, uma sequência de aminoácidos que tem 85% ou mais de homologia com a sequência 5M (SEQ ID NO: 16); e como uma sequência de vlCDR3, uma sequência de aminoácidos que tem 77% ou mais de homologia com a sequência 6M (SEQ ID NO: 17).
22. 22. Anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende: como uma sequência de vhCDRl, a sequência de aminoácidos da

    Petição 870190076753, de 08/08/2019, pág. 18/490

    8/13 sequência IM (SEQ ID NO: 10); como uma sequência de vhCDR2, a sequência de aminoácidos da sequência 2H1 (SEQ ID NO: 12) ou uma sequência de aminoácidos difere da sequência 2H1 (SEQ ID NO: 12) em que Ala na posição 15 é substituída por Asp; como uma sequência de vhCDR3, a sequência de aminoácidos da sequência 3M (SEQ ID NO: 13); como uma sequência de vICDRl, a sequência de aminoácidos da sequência 4L1 (SEQ ID NO: 14) ou uma sequência de aminoácidos difere da sequência 4L1 (SEQ ID NO: 14) em que Ser na posição 5 é substituída por Asn; como uma sequência de vlCDR2, a sequência de aminoácidos da sequência 5M (SEQ ID NO: 16); e como uma sequência de vlCDR3, a sequência de aminoácidos da sequência 6M (SEQ ID NO: 17).
23. 23. Anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que compreende:

    (a) como uma sequência de vhCDRl, a sequência de aminoácidos de 1M (SEQ ID NO: 10);

    como uma sequência de vhCDR2, a sequência de aminoácidos de 2H1 (SEQ ID NO: 12);

    como uma sequência de vhCDR3, a sequência de aminoácidos de 3M (SEQ ID NO: 13);

    como uma sequência de vICDRl, a sequência de aminoácidos de 4L1 (SEQ ID NO: 14);

    como uma sequência de vlCDR2, a sequência de aminoácidos de 5M (SEQ ID NO: 16); e como uma sequência de vlCDR3, a sequência de aminoácidos de 6M (SEQ ID NO: 17), ou (b) como uma sequência de vhCDRl, a sequência de aminoácidos de 1M (SEQ ID NO: 10);

    como uma sequência de vhCDR2, a sequência de aminoácidos de 2H1 (SEQ

    Petição 870190076753, de 08/08/2019, pág. 19/490

    9/13

    ID NO: 12);

    como uma sequência de vhCDR3, a sequência de aminoácidos de 3M (SEQ ID NO: 13);

    como uma sequência de vICDRl, a sequência de aminoácidos de 4M (SEQ ID NO: 15);

    como uma sequência de vlCDR2, a sequência de aminoácidos de 5M (SEQ ID NO: 16); e como uma sequência de vlCDR3, a sequência de aminoácidos de 6M (SEQ ID NO: 17), ou (c) como uma sequência de vhCDRl, a sequência de aminoácidos de IM (SEQ ID NO: 10);

    como uma sequência de vhCDR2, a sequência de aminoácidos de 2M (SEQ ID NO: 11);

    como uma sequência de vhCDR3, a sequência de aminoácidos de 3M (SEQ ID NO: 13);

    como uma sequência de vICDRl, a sequência de aminoácidos de 4M (SEQ ID NO: 15);

    como uma sequência de vlCDR2, a sequência de aminoácidos de 5M (SEQ ID NO: 16); e como uma sequência de vlCDR3, a sequência de aminoácidos de 6M (SEQ ID NO: 17).
24. 24. Anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende:

    como uma região variável de cadeia pesada, uma sequência de aminoácidos que tem 90% ou mais de homologia com uma sequência selecionada a partir das sequências VH11, VH12, VH47, VH61, VH62, VH64, e VH65;

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    10/13 como uma região variável de cadeia leve, uma sequência de aminoácidos que tem 90% ou mais de homologia com uma sequência selecionada a partir das sequências VL15, VL36, VL46, VL47, VL48, e VL50.
25. 25. Anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende:

    como uma região variável de cadeia pesada, a sequência de aminoácidos da sequência VH65 ou uma sequência de aminoácidos que difere da sequência VH65 pelo fato de que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em:

    uma substituição de Ala porThr na posição 28 (numeração de Kabat: H28), uma substituição de Asn por Ser na posição 30 (numeração de Kabat: H30), uma substituição de Vai por Gly na posição 49 (numeração de Kabat: H49), uma substituição de Ala por Asp na posição 64 (numeração de Kabat: H61);

    e uma substituição de Gin por Lys na posição 78 (numeração de Kabat: H75); e como uma região variável de cadeia leve, a sequência de aminoácidos da sequência VL47 ou uma sequência de aminoácidos que difere da sequência VL47 pelo fato de que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em:

    uma substituição de Asp por Glu na posição 17 (numeração de Kabat: L17); uma substituição de Ser por Asn na posição 28 (numeração de Kabat: L27A); uma substituição de Gin por Leu na posição 42 (numeração de Kabat: L37); uma substituição de Gin por Arg na posição 50 (numeração de Kabat: L45);

    e uma substituição de Arg por Leu na posição 51 (numeração de Kabat: L46).

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    11/13
26. 26. Anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma das seguintes combinações de sequência:

    (a) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL15 como uma região variável de cadeia leve;

    (b) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL36 como uma região variável de cadeia leve;

    (c) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL46 como uma região variável de cadeia leve;

    (d) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL47 como uma região variável de cadeia leve;

    (e) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 como uma região variável de cadeia leve;

    (f) sequência VH11 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL50 como uma região variável de cadeia leve;

    (g) sequência VH12 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 como uma região variável de cadeia leve;

    (h) sequência VH47 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 como uma região variável de cadeia leve;

    (i) sequência VH61 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 como uma região variável de cadeia leve;

    (j) sequência VH62 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48 como uma região variável de cadeia leve;

    (k) sequência VH64 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL47 como uma região variável de cadeia leve;

    (l) sequência VH64 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL48, e

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    12/13 (m) sequência VH65 como uma região variável de cadeia pesada e sequência VL47.
27. 27. Agente para tratar ou prevenir demência, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 26.
28. 28. Agente para tratar ou prevenir demência de acordo com a reivindicação

    27, caracterizado pelo fato de que a demência é taupatia.
29. 29. Agente para tratar ou prevenir demência de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a taupatia é doença de Alzheimer, degeneração corticobasal, paralisia supranuclear progressiva, doença de Pick, demência por grãos argirofílicos (doença por grãos argirofílicos), taupatia de sistema múltiplo com demência pré-senil (MSTD), demência frontotemporal e parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), demência com emaranhados neurofibrilares, emaranhado neurofibrilar difuso com calcificação (DNTC), taupatia de substância branca com inclusões gliais globulares (WMTGGI) ou degeneração lobar frontotemporal com patologia de tau (FTLD-tau).
30. 30. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 26 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
31. 31. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína do anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 26.
32. 32. Vetor ou plasmídeo, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 31.
33. 33. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é transformada com a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 31 ou o vetor ou

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    13/13 plasmídeo definidos na reivindicação 32.
34. 34. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou uma célula eucariótica selecionada a partir de células de mamífero, células de inseto, células de levedura, e células vegetais.
35. 35. Método para a produção de anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira definida na reivindicação 33 ou 34 sob condições adequadas para a produção do anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo.
36. 36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar o anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo da célula hospedeira.
37. 37. Uso do anticorpo humanizado ou fragmento ou derivado do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 26, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar ou prevenir demência.
38. 38. Invenção de produto, processo, sistema ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no pedido de patente.