CN104623692A - 治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-c5药物 - Google Patents

治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-c5药物 Download PDF

Info

Publication number
CN104623692A
CN104623692A CN201510087938.6A CN201510087938A CN104623692A CN 104623692 A CN104623692 A CN 104623692A CN 201510087938 A CN201510087938 A CN 201510087938A CN 104623692 A CN104623692 A CN 104623692A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fit
serial number
complement
sequence
aptamer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510087938.6A
Other languages
English (en)
Inventor
D·爱泼斯坦
J·C·库尔兹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Archemix Corp
Original Assignee
Archemix Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Archemix Corp filed Critical Archemix Corp
Publication of CN104623692A publication Critical patent/CN104623692A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

通过施用有效剂量的药物抑制主体中补体成分以治疗补体-介导的眼部失调的方法，其中选择的实施方案中，所述的药物是一种抗-补体适体，优选实施方案中，是一种抗-C5适体。

Description

治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-C5药物
本申请是2007年3月8日递交的申请号为200780016834.X，发明名称为“治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-C5药物”的分案申请。
相关申请
本专利申请要求2006年3月8日递交的美国临时专利申请系列号60/780905号和2006年9月29日递交的美国临时专利申请系列号60/848274号的优先权，上述专利通过引证在此全部并入本文。
发明领域
本发明通常涉及核酸领域，更特别地为可以结合补体系统的蛋白质的适体，用于补体-相关眼，心，炎症，哮喘，和自身免疫失调，缺血再灌注损伤和/或其他C5介导的补体活性相关的疾病或失调的治疗和诊断。优选实施方案中，本发明更特定涉及治疗和诊断眼部失调的方法和材料，包括但不局限于，治疗和诊断C5介导的失调如C5介导的眼部失调。本发明进一步涉及施用可以结合包括C5蛋白的补体系统蛋白的适体的材料和方法。
发明背景
定义的适体是一种分离的核酸分子，其通过不同于Watson-Crick碱基对的交互作用以高特异性和亲和性结合一些目标，如一种蛋白质。虽然适体是核酸分子，在适体和其他核酸分子如基因和mRNA之间仍有基本的不同。后者中，核酸结构通过其线性碱基序列编码信息，该序列对于信息存储功能是重要的。与之相反的，适体的功能，其基于与目标分子的特定结合，不依赖于保守的线性碱基序列，而更关注特定的二级/和三级结构。适体是非-编码序列。适体的任何潜在编码能力完全是巧合，并在合体与其同源目标的结合中是无作用的。这样，结合相同目标，甚至目标上的相同位点的适体，可以具有相同的碱基序列，更多情况下是不同的。
适体也与自然产生的结合特定蛋白质的核酸序列不同。这些后者序列是整合在生物体基因组中的自然发生的序列，其与涉及自然核酸的转录，翻译和转运的蛋白质的特定亚基结合，例如，核酸结合蛋白。另一方面，适体是短小的，分离的，非自然产生的核酸分子。虽然适体具有与结合核酸的蛋白结合的特征，许多情况下这些适体具有较少的或没有与可被自然核酸结合蛋白识别的序列一致的序列。更重要的，适体事实上可以结合任何蛋白质(不仅仅是核酸结合蛋白)以及包括小分子，碳水化合物，多肽等的任何针对的目标。对于大多数目标，甚至蛋白质，并不存在其结合的自然产生的核酸序列；对于那些具有此序列的目标，例如，核酸结合蛋白，这些序列与适体不同，与高亲和力适体相比，其在自然状态的结合亲和力相对较低。
适体，与噬菌体显示或抗体所产生的多肽类似，可以特异结合选定的目标并调整目标活性或结合力，例如，通过结合适体可以阻抑其目标功能的能力。在抗体存在时，特定结合目标的功能特性是一种固有特性。在抗体存在时，虽然技术人员可以不知道一种适体对于一个目标的精确结构特性，技术人员知道在缺失精确结构定义的情况下怎样鉴定，制备和使用这些分子。
适体也与小分子治疗剂类似，其单一结构的改变，似乎非常微小，也可以极大影响(数个级别或量级)适体的结合和/或其他活性。另一方面，一些结构改变将少有或没有效果。这些结果来自于适体结构的二级/三级的重要性。换而言之，适体是一种具有固定构造的三维结构，提供与其给定目标结合的化学结合力。因此：(1)一些区域或特定序列对于(a)结合目标的特定点，和/或(b)定位分子与目标的结合的序列是必需的；(2)一些区域或特定序列具有变异范围，例如，核苷X必须是嘧啶，或核苷Y必须是嘌呤，或核苷X和Y必须互补；和(3)一些区域或特定序列可以是任意的，其可以是充分的间隔元素，例如，其可以使任何给定长度的核苷链或甚至非-核苷间隔，如PEG分子。
任意寡核苷酸序列集合的体外选择试验发现，产生的适体针对超过130种蛋白质，包括生长因子，转录因子，酶，免疫球蛋白，和受体。典型的适体为10-15kDa大小(20-45个核苷)，以微毫摩尔至亚-微毫摩尔亲和力结合其目标，并区分紧密相关的目标(例如，适体可以典型地不与来自同一基因家族的蛋白质结合)。一系列的结构研究已经显示适体可以使用相同的集合交互型(例如，氢键，静电互补，疏水作用，空间排阻)驱动抗体-抗原复合物的亲和力和特异性。
适体具有许多期望的用于治疗和诊断的特性，包括高特异性和亲和力，生物功效，和良好的药代动力学特性。此外，其提供了优于抗体和其他蛋白生物制剂的特定竞争优势，例如：
1)速度和控制。适体完全由体外方法制备，可以进行提前量的快速准备，包括治疗提前量。体外选择使得适体的特异性和亲和力是高度受控的并制备引导，包括针对毒素和非-免疫原目标的引导。
2)毒性和免疫原性。适体作为一种类型，具有显著的治疗可接受毒性并缺少免疫原性。然而许多单克隆抗体的效果可被其抗体自身的免疫反应限制，而激发适体的抗体是非常困难的，主要因为适体不能通过MHC被T-细胞表达，而免疫应答通常被驯化为对核酸片段无识别。
3)给药。许多目前提供的抗体治疗剂通过静脉灌输给药(通常超过2-4小时)，而适体可以通过皮下注射给药(适体通过皮下给药的生物利用率在猴子试验研究中＞80％(Tucker等，J.Chromatography B.732：203-212，1999))。此区别主要由于治疗性mAbs相当低的可溶性从而需要的体积较大。具有良好溶解性(＞150mg/mL)和相对更低的分子量(适体：10-50kDa；抗体：150kDa)，适体的周使用剂量可以以小于0.5mL的体积注射输送。此外，另一个适体-基础的治疗或预防优点为，适体的较小体积可以使其渗透入紧缩构想区域，而抗体或抗体片段无法渗透入。
4)可度量性和价格。治疗适体是化学合成的因此可以容易地根据生产需求度量。而对生产的度量的困难性限制了一些生物制剂的实用性，并且高-通量蛋白质制备设备的费用也是巨大的，而一个高-通量寡核苷酸合成系统的产量至少为100kg/年，并且只需要相对适度的初始投资。目前千克级的适体合成的费用估计为500美元/克，与高度优化的抗体具有可比性。研究过程中的不断进步可以预计在5年内费用将降低至低于100美元/克。
5)稳定性。治疗性适体是化学稳健的。其在暴露于各种因子如热和变性剂时能固有地保持活性，并且以冻干粉末在室温下能保存相当长时间(＞1年)。相反，抗体必须冰冻保存。
补体系统。补体系统包括一组至少为20-30胞质和膜蛋白，其在受调控的级联系统中共同作用以攻击细胞外的病原体形式(例如，细菌)。补体系统包括三个不同的酶活性级联，经典，凝集素和选择性路径(图1)，其集合了C5的活性并产生已知为膜攻击途径的非-酶途径。
第一种酶活性级联，其已知为经典途径，包括几种成分，C1，C4，C2，C3和C5(以途径中的顺序排列)。随着第一种补体成分(C1)通过免疫和非-免疫活性因子而结合和激活，补体系统的经典途径的开始发生。C1包括一个C1q，C1r和C1s的钙-依赖复合物，并且通过结合C1q成分而激活。C1q包括六个相同的亚基，并且每个亚基包括三条链(A，B和C链)。每个链具有一个连接胶原质-类似物尾部的球状头部。抗原-抗体复合物对于C1q的结合和激活发生在C1q的头部区域。大量的非-抗体C1q激活物质，包括蛋白质，脂质和核酸，通过胶原-类似颈部区域的独特位点结合和激活C1q。通过C1q的补体激活剂的分子识别引发了构象改变，刺激酶原C1r自身激活，其反过来促进C1s的蛋白水解。Cs随后催化补体成分C4和C2的活性，形成具C3转化酶功能的C4bC2a复合物。
第二个已知为凝集素途径酶活化级联，除了MBL/MASP-2复合物取代C1之外，都与第一个类似。甘露聚糖-结合凝集素(MBL)直接识别细菌表面的含有甘露糖的多糖，并在结构和功能上与C1的成分C1q同源。MBL与激活剂的结合引导了MBL-相关蛋白酶2(MASP-2)的活性。MASP-2，反过来以C1s功能同源的方式激活C4和C2，引导C3转化酶的形成。
第三种酶活性级联，已知为选择性途径，是一种快速的，抗体-不依赖的补体系统激活和方法途径。选择性途径包括几种成分，C3，因子B，和因子D(以途径中的顺序排列)。选择性途径的激活发生于C3b，一种C3的水解裂解形式，与活性表面如细菌的结合时。因子B随后与C3b结合，并被因子D切割形成C3转化酶C3bBb。当产生和沉积额外的C3b时发生C3转化酶活性的放大。阳性调节蛋白备解素(P)的结合进一步促进放大反应，其提高活化转化酶的降解稳定性，使半衰期从1-2分钟延长至18分钟。
这样，所有三个途径都产生裂解因子C3为C3a和C3b的C3转化酶。这时，C3转化酶(经典/凝集素和选择性)进一步装配为C5转化酶(C4b2a3b和C3b3bBb)。这些复合物随后裂解补体成分C5为两种成分：C5a多肽(9kDa)和C5b多肽(170kDa)。C5a多肽结合7重跨膜G-蛋白结合受体，其最初与白细胞相关，并且目前已知在多种组织中表达，包括肝细胞和神经细胞。C5a分子是人补体系统最初的趋化成分，并可以引发多种生物应答，包括白细胞趋化性，平滑肌收缩，细胞内信号传导途径的激活，嗜中性粒细胞-内皮细胞附着，细胞因子和脂质调节释放和氧化剂形成。
【第18段】更大的C5b片段继而与随后的补体级联，C6，C7，C8和C9结合形成C5b-9膜攻击复合物(“MAC”)。C5b-9MAC可以直接裂解红血球，并在更大程度上，其对白细胞裂解并损害组织，如肌肉，上皮和内皮细胞。亚溶破剂量中，MAC可以刺激上调分子的附着，细胞内钙的释放和细胞因子的释放。此外，C5b-9MAC可以刺激内皮细胞和血小板细胞而不导致细胞裂解。C5a和C5b-9MAC的非-裂解效应有时非常相似。
虽然补体系统在维持健康中具有非常重要的作用，但其也具有导致或引发疾病的潜在可能。例如，补体系统已经在冠状动脉搭桥术(“CABG”)手术，众多肾脏，风湿，神经，皮肤病，血液病，动脉/肺，过敏，感染，和生物适应性/休克疾病和/或情况中表现出其副作用。补体系统不是疾病的唯一导致因素，但其可能是导致疾病的几种因素之一。
目前，数据显示在眼疾中也包括补体。此外，拥有新的补体系统抑制剂有助于补体-相关眼疾的治疗和诊断。
附图说明
图1是描述补体系统的经典和选择性途径的示意图。
图2是描述从寡核苷酸随机序列集合中进行体外适体选择(SELEXTM)方法的示意图。
图3A是描述抗-C5适体的核酸序列和二级结构(序列号：1)的示意图，其中带下划线的残基是2′-H嘧啶残基或2′-氟嘧啶残基，加框的残基是2′-氟嘧啶残基或2′-OMe嘧啶残基，以箭头(→)表示的残基表示必须含有2′-氟修饰的残基。
图3B是描述ARC330抗-C5适体的核酸序列和二级结构(序列号：2)的示意图，其中带圈的残基是2′-H残基，嘧啶残基是2′-氟替换的，主要的嘌呤残基是2′-OMe替换，除了突出显示的三个2′-OH嘌呤残基。
图3C是描述ARC186抗-C5适体的核酸序列和二级结构(序列号：4)的示意图，其中所有21个嘧啶残基具有2′-氟修饰，主要的嘌呤(14个残基)具有2′-OMe修饰，除了突出显示的三个2′-OH嘌呤残基。
图4是40kD分支PEG(1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4′-丁唑酰胺)的示意图。
图5是接触适体5′末端的40kD分支PEG(1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4′-丁唑酰胺)的示意图。
图6描述各种合成高分子量PEG-核酸共轭物的方法示意图。
图7A是PEG化抗-C5适体(ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)，和ARC187(序列号：5))，相对于非-PEG化抗-C5适体(ARC186(序列号：4))的剂量依赖的溶血抑制作用；图7B是图7A中描述的在溶血试验中使用的适体的IC50值表；图7C是比较PEG化抗-C5适体ARC187(序列号：5)，ARC1537(序列号：65)，ARC1730(序列号：66)，和ARC1905(序列号：67)的剂量依赖的溶血抑制作用；图7D是图7A中描述的在溶血试验中使用的适体的IC50值表。
图8是猕猴血清补体相对于人类血清补体中抗-C5适体，ARC658(序列号：62)的溶血抑制百分率示意图。
图9是37度和室温(23度)孵育15分钟时ARC186(序列号：4)结合纯化C5蛋白的示意图。
图10是37度和室温(23度)孵育4小时时ARC186(序列号：4)结合纯化C5蛋白的示意图。
图11是C5-ARC186复合物在23度时的分解时间过程示意图。
图12是C5-ARC186复合物在23度时形成的平衡时间过程示意图。
图13是C5蛋白相对于补体级联中的上游和下游蛋白成分与ARC186(序列号：4)的结合示意图。
图14是存在未标记竞争物ARC186(序列号：4)，ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)或ARC187(序列号：5)时，放射标记的ARC186(序列号：4)结合C5的百分率示意图。
图15是描述以不同浓度的ARC186(序列号：4)适体，25度和37度孵育5小时，血液样本中C5b补体蛋白的产生数量示意图。
图16是描述未稀释人类血清，柠檬酸处理人全血和猕猴血清中，存在酵母聚糖时ARC187(序列号：5)的补体抑制百分率。
图17是显示实施例1D管状回环模型中ARC658(序列号：62)对于补体活性(C5a)的完全抑制。
图18是描述第10轮C5选择集合的分离常数示意图。通过将数字带入等式：分离片段结合＝增幅×Kd/(Kd+[C5])，评估分离常数(KdS)。“ARC520”(序列号：70)指天然未选择的dRmY集合，“+”指存在竞争物(0.1mg/ml tRNA，0.1mg/ml鲑精DNA)。
图19是描述C5克隆分离常数曲线的示意图。通过将数字带入等式：片段RNA结合＝增幅×Kd/(Kd+[C5])，评估分离常数(KdS)。
图20是描述不同浓度的抗C5适体克隆ARC913(序列号：75)对比于ARC186(序列号：4)对于溶血活性的抑制效应IC5 0曲线。
图21是ARC187(序列号：5)的结构示意图。
图22是ARC1905(序列号：67)的结构示意图。
图23是描述第一个分离灌注心脏研究的试验设计大纲表。
图24是描述暴露于人血浆(A)的分离心脏左心房(LV)心房内压力的压力轨迹与暴露于对照适体溶液(B)的LVP压力轨迹比较示意图。
图25是分离心脏暴露于等摩尔，10×和50×适体/C5溶液(正常的，未稀释的人血浆中C5的估计浓度约为500nm)时，左心房(LV)心室内压力轨迹比较示意图。
图26是分离小鼠心脏暴露于人血浆和不同的血浆/适体溶液的每分钟心跳(bpm)心律改变比较示意图。
图27是分离小鼠心脏暴露于含有0-1×摩尔比值ARC186(序列号：4)(失效心脏)，或10-50×摩尔比值(C5适体保护心脏)前后的心脏重量改变比较示意图。
图28是灌注分离小鼠心脏中，含有不同浓度适体的人血浆的相关C5a产生比较示意图。相关C5a浓度以吸收单位(Abs)注释，其中更高的读数表示存在更高水平的C5a。
图29是灌注分离小鼠心脏中，含有不同浓度适体的人血浆的相关可溶性C5b-9产生比较示意图。
图30是小鼠心脏流出物中ARC186(序列号：4)对于C3裂解效应的示意图。
图31是分离灌注心脏研究中免疫组化染色结果示意表。
图32是显示人血清和灵长类血清中，保护心脏不受C5b-介导损害的所需ARC658(序列号：62)的摩尔比率图标。
图33是显示大鼠和猕猴血浆中，作为孵育时间函数的全长ARC186剩余百分数的对数-线性图。
图34是显示实施例5中描述的以Sprague-Dawley率表示的药代动力学研究试验设计示意图。
图35是ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)或ARC187(序列号：5)相对于Sprague-Dawley率中时间的平均血浆浓度示意图。
图36是大鼠经静脉施用适体后，各时间的ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)或ARC187(序列号：5)平均血浆浓度示意图。
图37是显示图35和图36描述的浓度相对于时间数据的非间隔分析示意图。
图38A是描述小鼠中ARC187(序列号：5)和ARC1905(序列号：67)的药代动力学研究设计图。图38B是描述CD-1小鼠中ARC187(序列号：5)和ARC1905(序列号：67)的药代动力学研究设计图；图38C是显示图38B描述的浓度相对于时间数据的非间隔分析表。
图39是显示静脉内给药后小鼠心脏组织中所列适体的测定结果表。
图40是显示实施例5E中描述的动物研究1的试验设计表。
图41是显示对猕猴静脉内推注施用适体后相对于时间的适体血浆浓度表。
图42是研究1中对猕猴静脉内给药后ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)的药代动力学参数表。
图43(a)和43(c)是描述猕猴静脉内施用抗-C5适体ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)后各时间sC5b-9和C5a的血浆浓度示意图；图43(b)和43(d)是描述sC5b-9和C5a的血浆浓度相对于抗-C5适体ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)浓度的示意图。
图44是显示实施例5F中描述的研究2试验设计表。
图45是描述猕猴静脉内施用ARC658(序列号：62)或ARC187(序列号：5)后不同时间点平均适体血浆浓度示意图。
图46是显示你后静脉内推注施用适体后浓度相对于时间的两个房室分析表。
图47是描述猕猴血浆中存在酵母聚糖时C5b-9浓度相对于ARC187(序列号：5)和ARC658(序列号：62)浓度的示意图。
图48是描述猕猴血浆中存在酵母聚糖时C5a浓度相对于ARC187(序列号：5)和ARC658(序列号：62)浓度的示意图。
图49是描述猕猴静脉内推注给药时和之后ARC187(序列号：5)的PK-PD研究表。
图50是描述猕猴静脉内推注给药后ARC187(序列号：5)的药代动力学参数表。
图51是描述猕猴静脉内推注给药后ARC187(序列号：5)的计算和实际测定的药代动力学参数示意图。
图52是描述猕猴静脉内推注给药后剩余活性ARC187(序列号：5)的血浆浓度水平示意图。
图53是CABG手术中预测的抗-C5适体人用需要剂量表。
图54是以凝血时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)测定的显示ARC187(序列号：5)没有体外相对凝血效应的示意图。
图55是显示ARC187(序列号：5)对于肝素的抗-凝血活性，和鱼精蛋白促凝集活性的体外效应表。
图56是显示ARC187(序列号：5)不影响肝素体内抗凝血的示意图。
图57是以酵母聚糖补体活性抑制测定的，肝素和鱼精蛋白对于ARC187(序列号：5)抗-补体功能无效应的示意图。
图58是显示存在人血清时作为抗-C5适体ARC1905(序列号：67)或ARC672(序列号：63)的函数的绵羊红细胞溶血抑制百分数的示意图。
图59A是存在人，猕猴和大鼠血清时ARC1905(序列号：67)的溶血抑制百分数示意图；图59B是存在人，猕猴和大鼠血清时，ARC1905，一种抗-C5适体，或ARC127，一种不结合C5的非相关适体(阴性对照)的补体活性抑制IC50值表。
图60是在竞争结合试验中，作为未标记的竞争物ARC1905(序列号：67)或ARC672(序列号：63)(水平轴)浓度的函数，放射标记ARC186(序列号：4)(纵轴)的抑制IC50值示意图。
图61是竞争结合试验中，37度和25度时，作为未标记的竞争物ARC1905(序列号：67)(水平轴)浓度的函数，放射标记ARC186(序列号：4)(纵轴)的抑制IC50值示意图。
图62是描述人C5a(hC5a)和猕猴C5a(hC5a eq)的标准曲线示意图。
图63是描述以酵母聚糖-介导的补体活性试验测定的，人和猕猴血清中ARC1905(序列号：67)C5活性抑制IC50，IC90，和IC99值表。
图64是描述以酵母聚糖-介导的补体活性试验测定的，作为人和猕猴血清中ARC1905(序列号：67)函数的C5a产生的抑制百分率。
图65是描述以酵母聚糖-介导的补体活性试验测定的，人和猕猴血清中ARC1905(序列号：67)对C3a生成的效应示意图。
图66是以补体活性回环模型测定的，来源于5未志愿者的人血清中ARC1905(序列号：67)补体活性抑制平均IC50，IC90，和IC99值表。
图67是补体活性回环模型中，作为ARC1905，一种抗-C5适体，或ARC127，一种不结合C5的非相关适体(阴性对照)浓度的函数，C5a和C3a产生的抑制百分率示意图。
发明内容
本发明提供了治疗，预防和/或稳定补体-相关的眼部疾病(这里指眼部失调)的材料和方法。
本发明的一些实施方案中，抗-补体适体调节补体成分或其变体的功能。特定优选实施方案中，一种抗-补体适体抑制或减弱补体成分或其变体的功能，优选地，在体内，特别是脊椎动物中，特别是哺乳动物中，更合适地在人体内。本发明的一些实施方案中，例如，当C2，C3，C4，C5和/或因子B是补体目标，适体的功能调整，更适宜地为抑制，是通过蛋白裂解完成的。本发明的一些实施方案中，例如，当C2b，C5b，C5，C7，C8，C9，因子B和/或备解素是补体目标时，适体的功能的调整，更适宜地为抑制，是通过活性补体成分的聚集，如转化酶或膜攻击复合物完成的。本发明的一些实施方案中，例如，当C3b，因子D，C1(包括C1r和/或C1s)和/或甘露糖相关丝氨酸蛋白酶(“MASP”)是补体目标时，适体的功能调整，更适宜的为抑制，是通过酶活性。本发明的一些实施方案中，例如当C3a，C5a，C3a受体或C5a受体是补体目标时，适体的功能调整，更适宜的为抑制，是通过配体/受体结合。
一个实施方案中，提供了稳定，治疗和/或预防C5a，C5a和/或C5b-9介导的眼部失调的方法，该方法包括对需要的主体施用稳定，治疗和/或预防眼部失调的有效数量的抗-C5药物步骤。一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或预防的眼部失调是眼部新血管生成失调。一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或预防的眼部失调是糖尿病视网膜病变或黄斑变性，特别是年龄-相关黄斑变性(″AMD″)。一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或预防的AMD是渗出性AMD。一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或预防的AMD是非渗出性AMD。
一些实施方案中，提供了稳定，治疗和/或预防补体介导的的眼部失调的方法，该方法包括对需要的主体施用有效数量的抗-C5补体适体步骤。一些实施方案中，抗-补体适体的治疗有效数量是稳定，治疗和/或预防眼部失调的有效数量。本发明的一些实施方案中，主体是一种脊椎动物，一些实施方案中是一种哺乳动物，一些实施方案中是人类。一些实施方案中，稳定，治疗和/或预防的补体-介导的眼部失调是畸形或慢性炎症和/或面积介导的眼部失调。一些实施方案中，稳定，治疗和/或预防的补体-介导的眼部失调是从以下组中选择的：炎症结膜炎，包括巨乳头状结膜炎，黄斑水肿，葡萄膜炎，眼内炎，巩膜炎，角膜溃疡，干眼症，青光眼，萎缩性视网膜病，角膜移植排斥，眼内手术相关并发症如眼内晶状体移植和白内障手术相关炎症，Bchcet′s病，Stargardt病，免疫符合脉管炎，Fuch′s病，Vogt-Koyanagi-Harada病，视网膜下纤维化，角膜炎，玻璃体视网膜炎症，眼部寄生虫感染/转移，视网膜色素变性，巨细胞病毒性视网膜炎和脉络膜炎。一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或预防的眼部失调是黄斑变性，特别是年龄-相关黄斑变性(“AMD”)。一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或预防的眼部失调是是非-渗出性(“干燥”和/或“萎缩”)型AMD。一些实施方案中，所稳定，治疗和/或预防的眼部失调是一种眼部新生血管失调，如糖尿病视网膜病变或渗出性(“湿”)型AMD。
一些实施方案中，提供了稳定C5，C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对需要的主体施用稳定C5，C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调的有效数量的抗-C5药物。一些实施方案中，施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视觉精度与抗-C5药物治疗过程中主体的视觉精度水平相比，维持至少相同的水平。一些实施方案中，施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视网膜血管密度与治疗过程中的主体相比，维持大约相同的水平。
一些实施方案中，提供了稳定补体-介导的眼部新生血管失调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对需要的主体施用稳定补体-介导的眼部新生血管失调的有效数量的抗-补体适体。一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使主体的视觉精度与抗-补体适体治疗过程中主体的视觉精度水平相比，维持至少相同的水平。一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使主体的视网膜血管密度与适体治疗过程中的主体相比，维持大约相同的水平。一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使以主体中新生血管-相关的出血，流液聚集，视网膜分离和/或疤痕形成的水平与抗-补体适体治疗过程中主体的新生血管-相关的出血，流液聚集，视网膜分离和/或疤痕形成的水平相比保持稳定或维持。
一些实施方案中，提供了治疗C5，C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对需要的主体施用减少C5，C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调症状的有效数量的抗-C5药物。一些实施方案中，施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视觉精度与抗-C5药物治疗过程中主体的视觉精度水平相比有所提高。一些实施方案中，施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视网膜血管密度与治疗过程中的主体相比有所减少。
一些实施方案中，提供了治疗补体-介导的眼部新生血管失调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对需要的主体施用减少补体-介导的眼部新生血管失调症状的有效数量的抗-补体适体。一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使主体的视觉精度与抗-补体适体治疗过程中主体的视觉精度水平相比有所提高。一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使主体的视网膜血管密度与治疗过程中的主体相比有所减少。一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使以主体中新生血管-相关的出血，流液聚集，视网膜分离和/或疤痕形成的水平与抗-补体适体治疗过程中主体的新生血管-相关的出血，流液聚集，视网膜分离和/或疤痕形成的水平相比有所减少。
一些实施方案中，提高了预防临床补体-介导的眼部新生血管失调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对需要的主体施用减少补体-介导的眼部新生血管失调临床症状的有效数量的抗-补体适体。一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体以预防主体的视觉精度临床损害。一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体以预防主体中临床眼部新生血管失调相关的视网膜血管密度水平。一些实施方案中，主体具发生眼部新生血管失调的危险。一些实施方案中，方法进一步包括在施用抗-补体适体之前，对具有补体-相关眼部新生血管失调危险的主体进行诊断。一些实施方案中，诊断步骤包括测定主体玻璃疣和/或视网膜色素改变和测定视觉精度无临床减弱。一些实施方案中，诊断步骤包括测定主体中与野生型因子H相关的变体因子H。Ripoche等(1998)报导了野生型因子H的氨基酸序列，人补体因子H的全氨基酸序列，Biochem.j.249，593-602。一些实施方案中，当提供了稳定，治疗和/或预防主体的补体-介导的新生血管眼部失调，特别是糖尿病视网膜病的方法时，抗-补体适体的给药途径是眼部或眼周给药。
一些实施方案中，提供了包括对主体施用抗-C5药物预防主体临床C5，C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调，特别是渗出型AMD或糖尿病视网膜病的方法，该方法包括了对主体施用有效数量的抗-C5药物步骤，以预防C5，C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调临床症状。一些实施方案中，施用有效数量的抗-C5药物以预防主体视觉精度的临床损失。一些实施方案中，施用有效数量的抗-C5药物以预防主体中临床眼部新生血管疾病相关的视网膜血管密度水平。一些实施方案中，主体处于发生眼部新生血管化失调的危险中。一些实施方案中，该方法进一步包括在施用抗-C5药物前对具发生C5，C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调的主体进行鉴定。一些实施方案中，鉴定步骤包括测定主体中玻璃疣的存在和测定视觉精度无临床损失。一些实施方案中，鉴定步骤包括测定主体中补体因子H的变体。
上述方法的一些实施方案中，方法额外包括对主体施用抗-VEGF药物的步骤，特别是从包括以下物质的组中选择的VEGF药物：核酸分子，适体，反义分子，RNAi分子，蛋白质，多肽，环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。
上述方法的一些实施方案中，方法额外包括对主体施用抗-PDGF药物的步骤，特别是从包括以下物质的组中选择的PDGF药物：核酸分子，适体，反义分子，RNAi分子，蛋白质，多肽，环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。
上述方法的一些实施方案中，方法额外包括对主体施用抗-血管药物的步骤。一些实施方案中，抗-血管药物是卟啉派生物。卟啉派生物的一些实施方案中，是用于注射的verteporfin(VisudNovartis药物公司，East Hanover，NJ)。一些实施方案中，该方法进一步包括以激光激活卟啉派生物的方法。
一个实施方案中，提供了稳定，治疗和/或预防C5，C5a和/或C5b-9介导的非-渗出性AMD的方法，包括对需要的主体施用有效数量的抗-C5药物以稳定，治疗和/预防非-渗出性AMD。一个实施方案中，当非-渗出性AMD被稳定时，施用有效数量的抗-C5药物，以维持与施用抗-C5药物过程中主体的玻璃疣水平相比大约相同的玻璃疣水平。一个实施方案中，当非-渗出性AMD被稳定时，施用有效数量的抗-C5药物，以维持与施用抗-C5药物过程中主体的视觉精度水平相比大约相同的视觉精度水平。一个实施方案中，当治疗非-渗出性AMD时，施用有效数量的抗-C5药物，使其玻璃疣水平与施用抗-C5药物过程中主体的玻璃疣水平相比有所减少。一个实施方案中，当治疗非-渗出性AMD时，施用有效数量的抗-C5药物，使其视觉精度水平与施用抗-C5药物过程中主体的视觉精度水平相比有所增高。一个实施方案中，当预防非-渗出性AMD时，方法包括对需要的主体施用有效数量的抗-C5药物以预防C5，C5a和/或C5b-9介导的非-渗出性AMD的临床症状。一些实施方案中，施用有效数量的抗-C5药物以预防主体中视觉精度的临床损失。一些实施方案中，施用有效数量的抗-C5药物以预防玻璃疣的临床水平聚集。一些实施方案中，主体具发生非-渗出性AMD的危险。一些实施方案中，方法进一步包括在施用抗-C5药物前对具发生C5，C5a和/或C5b-9介导的非-渗出性AMD危险的主体进行鉴定。一些实施方案中，鉴定步骤包括测定主体中玻璃疣的存在和测定视觉精度无临床损失。一些实施方案中，鉴定步骤包括测定主体中补体因子H的变体。
上述方法的一些实施方案中，抗C5-药物是从包括以下物质的组中选择的：核酸分子，适体，反义分子，RNAi分子，蛋白质，多肽，环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。特定实施方案中，抗C5-药物是一种C5特异性适体，更特别的是从包括序列号1-67，75-81和88-98的组中选择的C5特异适体。优选实施方案中，上述方法中施用的C5特异适体是从包括ARC187(序列号：5)和ARCD1905(序列号：67)的组中选择的。
上述方法的一些实施方案中，抗-C5药物通过眼部给药输送，特别通过玻璃体内给药。上述方法的一些实施方案中，抗-VEGF药物，抗-PDGF药物和/或抗-血管生成药物通过眼部给药输送。上述方法的一些实施方案中，施用的抗-C5药物，抗-VEGF药物，抗-PDGF药物和/或抗-血管生成药物是一种前体药物。上述方法的一些实施方案中，主体是人类。
上述方法中使用的术语“抗-C5药物施用过程中”包括抗-C5药物施用前对怀疑的症状进行临床检测的时间。
一个实施方案中，提供了稳定，治疗和/或预防补体介导的非-渗出性AMD的方法，包括对需要的主体施用治疗有效数量的抗-补体适体。稳定非-渗出性AMD的一个实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使其玻璃疣水平(例如，大小，数量，面积和/或形态)维持与抗-补体适体给药过程中的玻璃疣水平相同。非-渗出性AMD被稳定的一个实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，以稳定地理性萎缩的发展，包括视网膜色素上皮细胞，感光受体和/或脉络毛细管的萎缩，以维持与抗-补体适体施用过程中主体水平相同的地理性萎缩水平。稳定非-渗出性AMD的一个实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使其的主体视觉精度水平维持与抗-补体适体施用过程中主体的视觉精度水平相同。
治疗非-渗出性AMD的一个实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，以使玻璃疣的水平，特别是大的，柔软的玻璃疣相比于施用抗-补体适体的过程中主体玻璃疣水平有所减少。治疗非-渗出性AMD的一个实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，以使主体的视觉精度与施用抗-补体适体的过程中主体的视觉精度相比有所提高。
一个实施方案中，提供了预防非-渗出性AMD的方法，包括对需要的主体施用有效数量的抗-补体适体以预防补体-介导的非-渗出性AMD临床症状。一个实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，以预防主体的视觉精度临床损失。一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，以防止临床水平的玻璃疣聚集，特别是大的，柔软玻璃疣。一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，以预防临床水平的地理性萎缩。一些实施方案中，对具有非-渗出性AMD的主体施用有效数量的抗-补体适体，以防止主体中渗出性AMD的发展。依稀实施方案中，对具有年龄-相关黄斑变性的主体(以玻璃疣的存在，视网膜色素改变和/或小区域的萎缩为特征)施用有效数量的抗-补体适体，以防止主体的渗出性AMD的发展或临床水平的地理性萎缩。
一些实施方案中，主体具有发生非-渗出性AMD的危险。一些实施方案中，方法进一步包括在施用抗-补体适体之前对具发生补体-介导的非-渗出性AMD的主体进行鉴定。一些实施方案中，鉴定步骤包括测定主体中玻璃疣的存在，特别是大的，柔软玻璃疣，视网膜色素改变和/或萎缩区域和测定无视觉精度临床损失。一些实施方案中，鉴定步骤包括测定主体中野生型补体因子H的变体。
上述方法的一些实施方案中，抗-补体适体抑制从以下组中选择的补体目标：经典补体途径成分，选择性补体途径成分和血凝途径成分。一些实施方案中，抗-补体适体以膜攻击途径抑制补体目标。一些实施方案中，抗-补体适体抑制从以下组中选择的补体目标：C1，C1q，C1r，C1s，C2，C3，C3a，C3a受体，C4，C5，C5a，C5a受体，C5b，C6，C7，C8，C9，因子B，因子D，备解素，甘露糖结合血凝素(这里为“MBL”)，MBL相关丝氨酸蛋白酶1(“MASP 1”)和MBL相关丝氨酸蛋白酶2(“MASP 2”)。一些实施方案中，抗-补体适体不是一种从以下组中选择的对补体目标具有高亲和力和特异性的适体：C3a，C3a受体，C5a，和C5a受体。一些实施方案中，抗-补体适体不是一种从以下组中选择的对补体目标具有高亲和力和特异性的适体：因子B和因子D。
上述方法的一些实施方案中，通过眼内给药，特别是通过晶状体内或眼-周给药输送抗-补体适体。一些实施方案中，对主体施用的抗-补体适体包括在存储形式中。
这里使用的术语“抗-补体适体给药过程中”包括对所怀疑的症状进行临床测定或评估的时间，其中测定或评估的时间从抗-补体适体给药前至抗-补体适体给药时和之后短时间内，例如，给药12小时后，24小时后，或48小时后。
一些实施方案中，提供了包括治疗有效数量抗-补体适体的眼部药物组合物，例如，可稳定，治疗和/或预防补体-介导的眼部失调的有效数量。本发明的药物组合物可以包括一种药物可接受载体或稀释剂。该方面，本发明提供了抑制眼部补体目标体内功能，特别是人体内的，包括治疗有效数量适体的药物组合物，或其盐和一种药物可接受载体或稀释剂。一些实施方案中，眼部药物成分包括一种储存形式。
一种实施方案中，上述方法中使用的抗-补体适体是一种抑制体内C5，特别是人体内C5的适体。特定实施方案中，提供了上述方法中使用的与PEG配基结合的ARC186(序列号：4)抗-C5适体或包括核酸序列ARC186(序列号：4)的适体。特定实施方案中，ARC186适体/PEG共价物与包括序列号：4序列但缺失PEG配基的适体具有基本上相同的C5补体蛋白结合亲和力。这里使用的基本上相同的结合亲和力指以斑点印迹分析测定的分离常数不超过2至10倍差异，跟合适地为不超过2至5倍差异。一些实施方案中分离常数以下述实施例1A中描述的竞争斑点印迹分析测定。一些实施方案中，聚乙二醇配基的包括大于10kDa的分子量，特别是大于20kDa的分子量，更特别的是大于30kDa的分子量和大于40kDa的分子量。一些实施方案中，PEG配基与ARC186(序列号：4)的5’末端结合。一些实施方案中，以实施例5E中描述的两室模型测定的适体/PEG共价物的灵长类中的半衰期，合适地为终端半衰期，至少为15小时，合适地为24小时，更合适地为至少48小时。一些实施方案中，适体/PEG共价物的两室模型半衰期，在大鼠中至少为10小时，更合适地为15小时。一些实施方案中，结合ARC186(序列号：4)5’末端的PEG是一种40kDa PEG。特定的实施方案中40kDa PEG是一种分支PEG。一些实施方案中该分支40kDa PEG是1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4′-丁唑酰胺)。其他实施方案中分支40kDa PEG是2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰。
在分支40kDa PEG是1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4′-丁唑酰胺)的实施方案中，提供了具有以下结构式的适体：
其中，
～～～～～～表示一种连接物
适体＝
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(序列号：4)，
其中fC和fU＝2′-氟核苷，mG和mA＝2′-OME核苷，其他核苷是2′-OH，3T表示反向胸腺嘧啶脱氧核苷。
在分支40kDa PEG是2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰的实施方案中，提供了具有以下结构式的适体：
其中
～～～～～～表示一种连接物
适体＝
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(序列号：4)，
其中fC和fU＝2′-氟核苷，mG和mA＝2′-OME核苷，其他核苷是2′-OH，3T表示反向胸腺嘧啶脱氧核苷。
本发明的一些实施方案中连接物是一种烷基连接物。特定实施方案中，烷基连接物包括2至18个连续CH2基团。合适的实施方案中，烷基连接物包括2至12个连续CH2基团。特别合适的实施方案中烷基连接物包括3至6个连续CH2基团。
特别实施方案中，适体ARC187(序列号：5)具有以下结构式：
其中适体＝
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmHmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(序列号：4)，
其中fC和fU＝2′-氟核苷，mG和mA＝2′-OME核苷，其他核苷是2′-OH，3T表示反向胸腺嘧啶脱氧核苷。
适体的另一实施方案中，ARC1905(序列号：67)具有以下结构式：
其中适体＝
fCmGfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(序列号：4)
其中fC和fU＝2′-氟核苷，mG和mA＝2′-OME核苷，其他核苷是2′-OH，3T表示反向胸腺嘧啶脱氧核苷。
一个实施方案中，提供了包括有效数量的ARC186(序列号：4)，ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)或其盐类的眼部药物组合物，以在主体中治疗，稳定和/或预防补体-介导的眼部失调。本发明的药物组合物可以包括一种药物可接受载体或稀释剂。本方面，发明提供了一种包括治疗有效数量适体的药物组合物或其盐类和药物可接受载体或稀释剂，抑制C5补体蛋白体内裂解。本发明的该方面，提供了体内治疗，稳定和/或预防眼部疾病的ARC186(序列号：4)，ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)药物组合物。本发明的该方面，也提供了用于制备体内治疗，稳定和/或预防眼部疾病药物组合物的ARC186(序列号：4)，ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)。
另一实施方案中，提供了包括治疗有效数量抗-C5适体的眼部药物组合物，其包括从以下组中选择的核酸序列：序列号：1至69，75，76，81，91，95和96，用于制备补体-介导药物治疗方案使用的药物组合物。该方面，本发明提供了抑制C5补体蛋白体内裂解的包括治疗有效数量适体的药物组合物或其盐类，和药物可接受载体或稀释剂。
另一实施方案中，本发明提供了药物组合物。一个实施方案中，提供了包括治疗有效数量的ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)或其盐类的药物组合物。本发明的药物组合物可以包括药物可接受载体或稀释剂。该方面，发明提供了包括抑制C5补体蛋白体内裂解的包括治疗有效数量适体的药物组合了物或其盐类，和药物可接受载体或稀释剂。发明的该方面，提供用于治疗，预防或改善体内疾病的ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)药物组合物。发明的该方面也提供了用于制备药物组合物的ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)。
发明的另一方面，提供了治疗的方法。一个实施方案中，本发明的方法提供了治疗，预防或改善C5补体蛋白，和/或其派生物C5a和C5b-9介导的疾病，该方法包括对脊椎动物施用包括ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)的药物组合物。一些实施方案中，该方法包括对哺乳动物施用本发明的药物组合物。一些实施方案中，哺乳动物是人类。
一些实施方案中，由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病是急性萎缩性疾病(心肌梗死，中风，萎缩性/再灌注损伤)；急性炎症疾病(感染疾病，败血病，中风，急性/过急性移植排斥)、慢性炎症和/或免疫-介导疾病，包括糖尿病视网膜病，黄斑变性，包括渗出性和非-渗出性AMD，并也包括过敏，哮喘，风湿性关节炎，和其他风湿性疾病，多发性硬化和其他神经疾病，牛皮癣和其他皮肤病疾病，重症肌无力，系统性红斑狼疮(SLE))；和亚急性/慢性炎症，和/或免疫-介导疾病(包括移植排斥，血管球性肾炎和其他肾脏疾病和眼部疾病)。一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括偷袭或循环相关的补体激活，其中血液经过合成管子和/或异体材料。一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括CABG手术相关的心肌损伤，球囊血管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌损伤。一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的失调包括CABG手术相关的心肌损伤，球囊血管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌损伤，CABG手术相关的补体蛋白介导的并发症，经皮冠状动脉介入治疗相关的补体蛋白介导的并发症，阵发性夜间血尿证，急性移植排斥，过急性移植排斥，亚急性移植排斥，和慢性移植排斥。一些实施方案中所治疗的C5补体蛋白C5a和/或C5b-9介导的疾病是CABG手术相关的并发症。特定实施方案中，治疗的疾病是CABG手术相关的心肌损伤。本发明治疗方法的一个特别实施方案中，其症状被减弱，稳定和/或预防的疾病是一种眼部失调，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD。
一些实施方案中，本发明的方法包括施用ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)的药物组合物以获得比内源性C5补体蛋白高5至10倍的适体血浆浓度。一些实施方案中，施用药物ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)适体组合物以获得比内源性C5补体蛋白高0.75至约5倍，0.75至3倍，和1.5倍至约2倍于内源性C5补体蛋白的适体血浆浓度，而其他实施方案中施用适体组合物以获得与内源性补体蛋白相等的血浆浓度。一些实施方案中，施用包括ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)的药物组合物以获得约5μM，约4μM，约3μM，约2μM，约1.5μM，约1μM或约500nM的适体血浆浓度。
任何给药的途径，过程，和速度都可以使用，以有效获得本发明的适体血浆浓度。一些实施方案中，药物组合物通过静脉内给药。一些实施方案中，药物组合物通过推注和/或通过连续灌注给药。
治疗，预防和/或改善CABG手术相关的并发症，特别是CABG手术相关的心肌损伤的特别实施方案中，方法包括在手术前施用药物组合物并连续给药至少24小时，一些实施方案中为48小时或，一些实施方案中为72小时。本发明的特别实施方案中，在静脉灌注较低剂量适体之前，同时或之后通过静脉内推注约0.75至1.25，合适地为1mg适体每kg病人的适体，以获得约两倍于内源性补体蛋白浓度的血浆适体浓度，其中mg剂量不包括共价PEG的重量。一些实施方案中，较低剂量将以0.001至0.005mg/kg/min的速度灌注，其中mg剂量不包括共价PEG重量。一个特别实施方案中，较低剂量将以0.0013mg/kg/min的速度灌注。本发明方面的其他实施方案中，其中适体/共价物包括充分长的半衰期，适体药物组合物可以每天通过静脉内推注一次或两次给药。
本发明的另一方面，提供了诊断方法。一个实施方案中，诊断方法包括将ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)与怀疑包括C5补体蛋白或其变体的组合物接触，并测定C5补体蛋白质或其变体的存在或缺失。一些实施方案中补体蛋白或变体是属于脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别是人类。本发明提供了用于体外或体内诊断的ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)组合物。
本发明的另一方面，提供了包括从下列组中选择核苷序列的适体：ARC330(序列号；2)，ARC188-189，ARC250，ARC296-297，ARC331-334，ARC411-440，ARC457-459，ARC473，ARC522-525，ARC532，ARC543-544，ARC550-554，ARC657-658，ARC672，ARC706，ARC1537，和ARC1730(序列号：6至序列号：66)。另一实施方案中，提供了用于制备药物组合物的ARC330(序列号；2)，ARC188-189，ARC250，ARC296-297，ARC331-334，ARC411-440，ARC457-459，ARC473，ARC522-525，ARC532，ARC543-544，ARC550-554，ARC657-658，ARC672，ARC706，ARC1537，和ARC1730(序列号：6至序列号：66)中的任一种。在此方面，本发明提供了包括抑制C5补体蛋白体内裂解的治疗有效数量的适体或其盐类和一种药物可接受载体或稀释剂。
特别实施方案中，提供了包括序列号：1的核苷序列的适体。特别实施方案中，提供了从序列号：61，序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择核苷序列的适体。一些实施方案中，当适体包括从序列号：61，序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择的核苷序列时，该适体对C5补体蛋白的结合亲和力与包括序列号：4但缺少PEG配基的适体充分相同。
特别实施方案中，当适体包括从序列号：61，序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择的核苷序列时，以实施例5E中的两室模型测定的半衰期，特别是终端半衰期，在灵长类中至少为16，合适地为30小时。一些实施方案中，当适体包括从序列号：61，序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择的核苷序列时，以实施例5E中的两室模型测定的半衰期，特别是终端半衰期，在大鼠中至少为1个半小时，合适地为至少7个小时。
本发明该方面的一些实施方案中，当适体包括从序列号：61，序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择的核苷序列时，适体如下以带有5′连接物形式合成：H2N～～～5′适体3′，其中～～～表示连接物。一些实施方案中该连接物是烷基连接物：H2N-(CH2)n-5′适体3′，其中n＝2至18，合适地n＝2-12，更合适地n＝3至6，更合适地n＝6，并且适体fCmGfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(序列号：4)
其中fC和fU＝2′-氟核苷，mG和mA＝2′-OME核苷，其他核苷是2′-OH，3T表示反向胸腺嘧啶脱氧核苷。最后的氨基-修饰适体可以与从包括10kDa PEG，20kDa PEG，30kDaPEG和40kDa PEG线性PEG的组中选择的PEG配基结合。一些实施方案中，提供了治疗有效数量适体或其盐类的药物组合物，其包括从序列号：1，序列号：2和序列号6至序列号：66的组中选择的核苷序列，特别是从序列号：61，序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择的核苷序列。本发明的药物组合物可以包括药物可接受载体或稀释剂。本发明的该方面，提供了用于治疗，预防或改善体内疾病的药物组合物，其包括从序列号：2和序列号6至序列号：66中选择核苷序列的适体，特别是从序列号：61，序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择的。
另一实施方案中，提供了治疗，预防或改善C5补体蛋白介导的疾病的方法，包括对脊椎动物施用包括一种适体或其盐类的药物组合物，其中适体包括从：序列号2和序列号：6至序列号：66的组中选择的核酸序列，特别是序列号：61，序列号：62，和序列号：64至66。本发明的一些实施方案中，方法包括对哺乳动物，合适地为人类施用本发明的药物组合物。
一些实施方案中，治疗的C5补体蛋白，C5a和/或C5b-9-介导的疾病是急性萎缩性疾病(心肌梗死，中风，萎缩性/再灌注损伤)；急性炎症疾病(感染疾病，败血病，中风，急性/过急性移植排斥)、慢性炎症和/或免疫-介导疾病，包括糖尿病视网膜病，黄斑变性，包括渗出性和非-渗出性AMD，并也包括过敏，哮喘，风湿性关节炎，和其他风湿性疾病，多发性硬化和其他神经疾病，牛皮癣和其他皮肤病疾病，重症肌无力，系统性红斑狼疮(SLE))；和亚急性/慢性炎症，和/或免疫-介导疾病(包括移植排斥，血管球性肾炎和其他肾脏疾病和眼部疾病。一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括偷袭或循环相关的补体激活，其中血液经过合成管子和/或异体材料。一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括CABG手术相关的心肌损伤，球囊血管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌损伤。一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的失调包括CABG手术相关的心肌损伤，球囊血管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌损伤，CABG手术相关的补体蛋白介导的并发症，经皮冠状动脉介入治疗相关的补体蛋白介导的并发症，阵发性夜间血尿证，急性移植排斥，过急性移植排斥，亚急性移植排斥，和慢性移植排斥。一些实施方案中所治疗的C5补体蛋白C5a和/或C5b-9介导的疾病是CABG手术相关的并发症。特定实施方案中，治疗的疾病是CABG手术相关的心肌损伤。本发明治疗方法的一个特别实施方案中，其症状被减弱，稳定和/或预防的疾病是一种眼部失调，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD。
一些实施方案中，本发明的方法包括对主体施用包括一种适体的药物组合物，其包括从序列号：2，序列号：6至序列号：66中选择的核酸序列，特别是序列号：61，序列号：62，和序列号：64至序列号：66，使主体的适体血浆浓度为内源性C5补体蛋白浓度的0.5至10倍。一些实施方案中，施用药物适体组合物以获得比内源性C5补体蛋白高0.75至约5倍，0.75至3倍，和1.5倍至约2倍于内源性C5补体蛋白的适体血浆浓度，而其他实施方案中施用适体组合物以获得与内源性补体蛋白相等的血浆浓度。一些实施方案中，施用本发明的药物组合物以获得约5μM，约4μM，约3μM，约2μM，约1.5μM，约1μM或约500nM的适体血浆浓度。
可以使用任何有效获得本发明适体浓度的给药途径，过程，和速度。一些实施方案中，药物组合物通过静脉内给药。一些实施方案中，药物组合物通过推注和/或连续灌注给药。
在治疗，预防和/改善CABG手术相关的并发症，特别是CABG手术相关的心肌损伤的特别实施方案中，本发明包括在手术前和之后至少24小时连续使用药物组合物，一些实施方案中为48小时或在一些实施方案中为72小时。本发明的特定实施方案中，所期望的适体血浆浓度，例如，在一些实施方案中为内源性补体蛋白浓度的两倍，是对所治疗的病人静脉内灌注低剂量适体之前，同时，或之后，通过静脉内推注给药而获得的。本发明的另一实施方案中，当适体/共价物包括充分长的半衰期时，适体药物组合物可以通过静脉内推注每天给药1至2次。
本发明的另一实施方案中提供了诊断方法。一个实施方案中，诊断方法包括将组合物与一种适体接触，其包括序列号：2和序列号：6至序列号66的核酸序列，特别是序列号：61，序列号：62，和序列号：64至序列号：66，并测定组合物中C5补体蛋白或其变体的存在或缺失。一些实施方案中，补体蛋白或变体是脊椎动物的，特别是哺乳动物的，更特别是人类的。本发明提供的适体组合物具有包括从序列号：2和序列号6至序列号66中选择的核酸序列的适体，用于体外或体内诊断。目前的发明中，提供了包括从序列号：2和序列号6至序列号66中选择的核酸序列的适体，用于制备药物组合物。
本发明的另一方面，提供了包括一种核酸序列的适体，其与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中选择的序列具有80％一致性。一些实施方案中，提供了包括一种核酸序列的适体，其与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中选择的任意序列的唯一区域具有80％一致性。另一实施方案中，提供了包括一种核酸序列的适体，其与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中选择的序列具有90％一致性。一种特别实施方案中，提供了包括一种核酸序列的适体，其与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中选择的任意序列的唯一区域具有90％一致性。而在另一实施方案中，提供了包括一种核酸序列的适体，其中的40个连续核苷与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中任意选择的序列中的40个连续核苷一致。另一实施方案中，提供了包括一种核酸序列的适体，其中的30个连续核苷与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中任意选择的序列中的30个连续核苷一致。而另一实施方案中，提供了包括一种核酸序列的特异结合C5补体蛋白的适体，其中的10个连续核苷与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中任意选择的序列中的10个连续核苷一致。一种合适的实施方案中，提供了包括一个核苷序列的适体，其与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中任意选择的序列一致。
一些实施方案中，上述的本发明的适体可以进一步包括下列组中选择的化学修饰：糖基位置的化学替换；磷酸位置的化学替换；核酸序列的碱基位置的划足额替换。一些实施方案中，修饰是从以下组中选择的：修饰核苷的整合；3′加帽子，与高分子量非-免疫原化合物的共价结合；亲脂化合物的共价结合；磷酸骨架的修饰。
本发明的特别实施方案中，适体调整C5补体蛋白或其变体的功能。特别合适的实施方案中，适体抑制C5补体蛋白或其变体的功能，特别是在体内，更特别是在人体内。本发明的一个实施方案中，适体的功能调整，合适地为抑制，是对C5补体蛋白的裂解。
另一方面的一些实施方案中，本发明提供了抑制C5补体蛋白体内裂解的包括治疗有效数量适体或其盐类的药物组合物和一种药物可接受载体或稀释剂。
一些实施方案中，提供了一种包括治疗有效数量的药物组合物或其盐类，其与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中选择的序列具有80％，合适地为90％的一致性。一些实施方案中，提供了一种包括治疗有效数量的药物组合物或其盐类，其与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中选择的任意序列的唯一区域具有80％，合适地为90％的一致性。其他实施方案中，提供了包括一种治疗有效数量适体的药物组合物，其中的40，30或10个连续核苷与序列号：75至81，序列号：83，和序列号88至98中选择的核苷序列的40，30或10个连续核苷一致。进发明的药物组合物也可以包括一种药物可接受载体或稀释剂。本发明的该方面提供了用于治疗，预防或改善体内疾病的药物组合物，其中该药物组合物包括的适体或其盐类具有从序列号：3至4，序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98中选择的核苷序列。本方面，提供了用于制备药物组合物的具有从序列号：3至4，序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98中选择的核苷序列的适体。本方面，本发明提供了包括一种治疗有效数量的适体或其盐类的药物组合物，其可抑制C5补体蛋白的体内裂解，及一种药物可接受载体或稀释剂。
一些实施方案中，治疗的C5补体蛋白，C5a和/或C5b-9-介导的疾病是急性萎缩性疾病(心肌梗死，中风，萎缩性/再灌注损伤)；急性炎症疾病(感染疾病，败血病，中风，急性/过急性移植排斥)、慢性炎症和/或免疫-介导疾病，包括糖尿病视网膜病，黄斑变性，包括渗出性和非-渗出性AMD，并也包括过敏，哮喘，风湿性关节炎，和其他风湿性疾病，多发性硬化和其他神经疾病，牛皮癣和其他皮肤病疾病，重症肌无力，系统性红斑狼疮(SLE))；和亚急性/慢性炎症，和/或免疫-介导疾病(包括移植排斥，血管球性肾炎和其他肾脏疾病和眼部疾病。一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括偷袭或循环相关的补体激活，其中血液经过合成管子和/或异体材料。一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括CABG手术相关的心肌损伤，球囊血管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌损伤。一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的失调包括CABG手术相关的心肌损伤，球囊血管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌损伤，CABG手术相关的补体蛋白介导的并发症，经皮冠状动脉介入治疗相关的补体蛋白介导的并发症，阵发性夜间血尿证，急性移植排斥，过急性移植排斥，亚急性移植排斥，和慢性移植排斥。一些实施方案中所治疗的C5补体蛋白C5a和/或C5b-9介导的疾病是CABG手术相关的并发症。特定实施方案中，治疗的疾病是CABG手术相关的心肌损伤。本发明治疗方法的一个特别实施方案中，其症状被减弱，稳定和/或预防的疾病是一种眼部失调，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD。
一些实施方案中，本发明的方法包括对主体施用包括一种适体的药物组合物，其包括从序列号：3至4，序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98中选择的核酸序列，特别是序列号：61，序列号：62，和序列号：64至序列号：66，使主体的适体血浆浓度为内源性C5补体蛋白浓度的0.5至10倍。一些实施方案中，施用药物适体组合物以获得比内源性C5补体蛋白高0.75至约5倍，0.75至3倍，和1.5倍至约2倍于内源性C5补体蛋白的适体血浆浓度，而其他实施方案中施用适体组合物以获得与内源性补体蛋白相等的血浆浓度。一些实施方案中，施用本发明的药物组合物以获得约5μM，约4μM，约3μM，约2μM，约1.5μM，约1μM或约500nM的适体血浆浓度。
可以使用任何有效获得本发明适体浓度的给药途径，过程，和速度。一些实施方案中，药物组合物通过静脉内给药。一些实施方案中，药物组合物通过推注和/或连续灌注给药。
在治疗，预防和/改善CABG手术相关的并发症，特别是CABG手术相关的心肌损伤的特别实施方案中，本发明包括在手术前和之后至少24小时连续使用药物组合物，一些实施方案中为48小时或在一些实施方案中为72小时。本发明的特定实施方案中，所期望的适体血浆浓度，例如，在一些实施方案中为内源性补体蛋白浓度的两倍，是对所治疗的病人静脉内灌注低剂量适体之前，同时，或之后，通过静脉内推注给药而获得的。本发明的另一实施方案中，当适体/共价物包括充分长的半衰期时，适体药物组合物可以通过静脉内推注每天给药1至2次。
本发明的另一实施方案中提供了诊断方法。一个实施方案中，诊断方法包括将怀疑暴扣C5补体蛋白或其变体的组合物与一种适体接触，其包括序列号：75至81，序列号：83和序列号88至98的核酸序列，并测定组合物中C5补体蛋白或其变体的存在或缺失。一些实施方案中，补体蛋白或变体是脊椎动物的，特别是哺乳动物的，更特别是人类的。本发明提供的适体组合物具有包括从序列号：75至81，序列号：83和序列号88至98中选择的核酸序列的适体，用于体外或体内诊断。
一些实施方案中，提供了包括一种核苷序列的适体，其本质上由从序列号：68和69中选择的核苷序列组成。一些实施方案中，提供了包括一种核苷序列的适体，其由从序列号：68和69中选择的核苷序列组成。本发明的一些实施方案中，适体可以用于诊断方法。
一个实施方案中，本发明的一种方法直接治疗，稳定和/或预防补体-介导的眼部失调，该方法包括对需要的主体使用治疗有效数量的抗-补体适体的步骤。一个实施方案中，所治疗的眼部失调是黄斑变性。一个实施方案中，所治疗的眼部失调是一种眼部新血管生成失调。
具体实施方式
本发明的一个或多种实施方案中细节在以下的描述中进行说明。虽然任何与这里描述相似或相等的方法和材料可以用于本发明的实践或试验，但更合适的方法和材料正被描述。本发明的其他特征，对象和优点在这里的描述中是显而易见的。在说明中，单数形式也可以包括复数，除非上下文中另有明确规定。除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语具有被本发明所属的领域中的普通技术人员所通常理解的相同意义。如有冲突，本说明将受控。
抗-C5药物和眼部失调
目前的数据显示年龄相关黄斑变性(AMD)仍是一种补体活性参与作用的炎症介导的疾病。年龄-相关黄斑变性(“AMD”)是一种慢性和进程性眼病，并且其是美国，欧洲，和日本导致无法挽回的视觉损害的引导性原因。AMD以视网膜中心区域黄斑的进程性恶化。进程性AMD的最明显的指标物是玻璃疣的出现，在视网膜下具有黄-白沉积物，其是来源于视网膜细胞新陈代谢废物的斑块。玻璃疣的出现是两种形式AMD：渗出性(“湿”)和非-渗出性(“干”)的重要组成。当新血管在视网膜下生长并通过已知为Bruch′s膜的膜结构侵染视网膜时发生湿型AMD。此异常血管生长通常指血管生成或(脉络膜)新血管生成。这些新血管容易破裂并经常出血并渗出液体至黄斑，结果有时会造成突然和通常严重的视觉损害。虽然新的治疗(例如，LucentisTM)可以停止血管生成并逆转液体的聚集，甚至在少数病人中恢复视力，然而血管生成的损害经常导致视网膜细胞的结疤和/或损害而导致永久性的视觉损失。玻璃疣的发展通常超前于湿型AMD，其汇集并包括补体蛋白，包括补体因子H(CFH)。大量的，中等至大的玻璃疣与疾病后阶段发展巨大危险性相关，其以地理性萎缩和/或新血管生成为特征。大多数湿型AMD在疾病其被诊断出后数月至两年内在受影响的眼睛发生严重的视觉损失，虽然视觉损失也可以在数小时或数天内发生。干型AMD通常是更缓慢的，并在黄斑光-敏感细胞中发生缓慢萎缩，使受影响的眼睛中心视力发生缓慢模糊。玻璃疣的形成和聚集，有时是视网膜的恶化，导致视觉损失的加速，虽然不伴随异常的血管生成和出血。
导致AMD-相关的视觉损失的损伤中观察到的玻璃疣和炎症细胞中具有补体成分和其他炎症介导物(Haines等(2005)Science 308：419-421)。AMD与补体调节途径中的遗传缺陷强烈相关(Haines等，2005)。编码补体因子H(CFH)基因的变体通过其对玻璃疣发展的影响，新血管生成的前体和AMD相关的视觉损失，似乎极大地或完全地导致增加AMD的危险(Edwards等，(2005)Science 308：421-424)。CFH的初始功能是通过结合并失活C3b或刺激因子Bb从C3b分离，下调选择性级联转化酶的活性。(Hageman等(2005)PNAS 102(2)：7227-7232)。目前的基因数据显示湿型-AMD玻璃疣病人具有50-70％的可能性才有CFH等位基因，导致强烈的补体干涉和AMD治疗的关联(Klein等(2005)Science 308：385-389)。一种抑制其活性的抗-C5适体，也可以在带有AMD相关的缺陷CFH基因的病人中起作用。同样地，一种抑制选择性级联目标，如因子B，因子D，和备解素，普通级联成分，特别是C3，和膜攻击复合物成分的适体，可以抑制活性，即使病人带有AMD相关的缺陷CFH基因。一些补体因子H(CFH)基因的单模标本已经经测定为与病人发展黄斑变性的危险性相关。特别是，在染色体1上补体因子H(CFH)402位氨基酸的酪氨酸-组氨酸改变造成与疾病易感强烈相关的CFH基因变体结果。序列的改变位于结合肝磷脂和C-反应蛋白CFH区域。先天带有此CFH基因变体的人更易发生AMD。CFH基因变体可能导致美国15000000黄斑变性病例中的一半。老年人中若带有CFH基因变体，其发生黄斑变性的可能性将增加2.5至5.5倍。
CFH基因在调节炎症途径(选择性补体途径)中起作用。此表面炎症在黄斑变性中也具有重要作用。炎症标记物C-反应蛋白(CRP)的血液水平已经发现可以促进黄斑变性的发展。(Science.2005年四月15日；308(5720)：419-21，Science.2005年四月15日；308(5720)：421-4，Science.2005年四月15日；308(5720)：385-9)。基于其在肝磷脂和因子H的CRP结合区域的定位位置，Y402H变体可以破坏蛋白聚糖和CRP介导的宿主细胞表面H因子的召集，排除了因子H对堆积细胞的C3b的下调能力。由于C5a和C5b-9未受控的释放，补体途径在宿主组织中的未受抑制的扩大导致视网膜中的炎症发生和血管生成。CFH阻止未受控的补体活性和炎症；因此CFH中的突变将加重炎症和其后果。通过减少黄斑变性中的过多补体(炎症途径)活性，我们也许可以减缓疾病的进程。此外，相对与目前，将来对基因变体的测定可以用于联合成像技术以更早鉴定产生高危AMD的个体。(JAMA.2005年4月20日；293(15)：18410)
补体活性已经涉及其他眼部疾病，如糖尿病视网膜病，并可能复合或起始血管损害(Zhang等，(2002)Diabetes51：3499)。增值性糖尿病视网膜病变(PDR)是一种由视网膜血管改变引起的糖尿病并发症。当视网膜中的血管受损害时，其可能渗血并变脆，出现刷子样分支和疤痕组织。这将使视网膜传输至大脑的图像出现污点或扭曲。据估计25％的I型糖尿病人将忍受糖尿病视网膜病变，并在5年后上升为60％，10-15年后为80％。该疾病以高血糖症，基底膜增厚，外周细胞丢失，微血管动脉瘤和视网膜前新生血管化为特征，其由于出血和视网膜牵连的脱离导致失明。非扩散性的糖尿病视网膜并以视网膜内微血管瘤，出血，新-纤维-层梗塞，硬性渗出和微血管畸形。黄斑水肿是视觉损害的主要机制。这是黄斑(视网膜中心区域)毛细管微血管瘤静脉渗漏的结果。渗漏可以加剧黄斑增厚，其与硬性渗出或囊样改变相关，并导致不同程度的中心视力损失。增值性糖尿病视网膜病变以视网膜新生血管化为特征。其根据视网膜新生血管的存在，位置，严重性和相关的出血活性进行分级。其与严重的视力损失相关。糖尿病视网膜病的病因可以归结于以下疾病阶段。循环问题导致视网膜区域缺血或萎缩。新生血管化导致新血管开始在玻璃体中生长以维持适当的氧水平。新生毛细血管的渗血和疤痕组织的形成产生对视网膜的牵引并导致小裂缝形成。流泪并随后在视网膜层下或之间出现流液和脱离。由于出血，浮肿和疤痕产生，病人视力出现模糊，漂移，闪光及突然失明。
低水平的恒定补体活性通常发生在非-糖尿病人眼中，其在非-糖尿病大鼠眼中以MAC的存在和补体调节蛋白为特征，表明补体的失调发生在糖尿病人中(Sohe等，(2000)IOVS 41：3492)。此外，已经在糖尿病人志愿者的视网膜血管中测定到C5b-9的沉积，而在非糖尿病人中则无(Zhang等)，在糖尿病视网膜中发现CD55和CD59的表达减少(Zhang等)，并且在糖尿病人尿中发现存在糖基化CD59(Acosta等，(2002)PNAS 97，5450-5455)。此外，已知补体和血管系统在类型I糖尿病中被激活。见，例如，Hansen，T.K.等，糖尿病，53：1570-1576(2004)。C5a通过免疫和补体系统激活内皮细胞。见，例如，Albrecht，E.A.等，Am J Pathology，164：849-859(2004)。血管系统在包括糖尿病视网膜病的眼部疾病中被激活。见，例如，Gert，V.B.等，Invest Opthalmol Vis Sci，43：1104-1108(2002)。补体系统在糖尿病视网膜病中也被激活。见，例如，Gert，V.B.等，Invest Opthalmol Vis Sci，43：1104-1108(2002)和Badouin，C等，Am J Opthalmol，105：383-388(1988)。
葡萄膜炎表示眼色素层的炎症，色素血管层(或膜)位于巩膜(纤维膜)和视网膜(视觉光敏感层)之间，以虹膜，纤毛体和脉络膜(滋养视网膜的血管和连接组织层)。由于眼色素层的解剖复杂性，葡萄膜炎分许多类型，并且由于眼色素层与眼部其他结构(例如，视网膜)的解剖关系，眼色素层通常与其他组织的炎症关联(例如，视网膜炎)。葡萄膜炎通常分为前葡萄膜炎(主要影响虹膜和相关的纤毛体，虹膜和角膜之间的前室和包含的流液)，中间葡萄膜炎(影响纤毛体后的睫状体平坦部和视网膜前“缘”)，或后葡萄膜炎(影响虹膜后的后室，其充满透明凝胶状玻璃质液体并与视网膜直接相连)。前葡萄膜炎是最常见的形式并通常与自身免疫疾病如风湿性关节炎相关。中间葡萄膜炎是较次常见的形式。后葡萄膜炎是最不常见的形式，可能通过系统感染引起(例如，病毒性，细菌性，真菌性，或毒素)或与自身免疫疾病相关。自身免疫葡萄膜炎的发生也可以不包括系统影响。葡萄膜炎也可以由外伤引起(例如，受伤，手术等)或未知原因(“先天性”)。不考虑病原学，任何影响葡萄膜的炎症都将造成葡萄膜炎。
眼部组织和液体通常含有多种补体成分，如葡萄膜组织中的因子B和C2，C4，C3，C5，C6，和C7(Brawman-Mintzer O，Invest Ophthalmol Vis Sci.1989年10月；30(10)：2240-4)，房水中的C1，C4，C3和C5(Mondino BJ，Arch Ophthalmol。1983年3月；101(3)：465-8)，和角膜中的C1，C4，C2，C3，C5，C6和C7(Mondino BJ，Arch Ophthalmol.1981年8月；99(8)：1430-3)。这些补体成分和相关的补体调节蛋白在眼部组织中被认为起重要的正常免疫保护作用。
补体活性在葡萄膜炎病原学中的一个重要作用已经由下列事实所表明：相对于视网膜血管炎病人(对照)，前葡萄膜炎病人的C4(C4B2)异型发生率升高(Wakefield D，Hum Immunol.1988年3月；21(4)：233-7)；先天葡萄膜炎并人中C3d和包括-补体的免疫复合物的血浆浓度升高(Vergani S，Br J Ophthalmol.1986年1月；70(1)：60-3)；系统炎症疾病和并发葡萄膜炎病人泪腺流液(泪液)补体-介导的溶血活性和C3和C4水平的升高；(Drozdova EA，Vestn Oftalmol.2004年7-8月；120(4)：24-6)；和在葡萄膜炎中作为最初事件的葡萄膜区域免疫复合物和补体的沉积(O′Connor GR，Trnas Ophthalmol SocU K，1981年9月；101(Pt3)(3)：297-300).补体活性已经包括在许多带有葡萄膜炎眼病的炎症和/或自身免疫疾病，包括Behcet′s疾病(Cuchacovich M，Clin Exp Rheumatol.2005年7-8月；23(4Suppl 38)：S27-34，Bardak Y，Ocul Immunol Inflamm.2004年3月；12(1)：53-8)，Fuch′s异色性虹膜睫状体炎(La Hey E，Am J Ophthalmol.1992年1月15；113(1)：75-80)，Vogt-Koyanagi-Harada疾病(Sakamoto T，Ophthalmol。1991年9月；109(9)：1270-4)，和亚视网膜纤维化和慢性葡萄膜炎(Palestine AG，Ophthalmology.1985年6月；92(6)：939-44)。
大量试验-引发葡萄膜炎动物模型已经显示补体活性是葡萄膜炎中重要病原因素(Jha P，Invest Ophthalmol Vis Sci.2006年3月；47(3)：1030-8，Kasp E，Clin Exp Immunol.1992年5月；88(2)：307-12)，并且该补体活性被补体调节蛋白紧密调节(Bardenstein DS，Immunology.2001年12月；104(4)：423-30，Sohn JH，Invest Ophthalmol Vis Sci.2000年10月；41(11)：3492-502)。这些补体-介导葡萄膜炎模型中，补体的损耗，如用眼镜蛇毒因子(CVF)处理或作为补体活性途径(C3)遗传损耗的重要因素，可以预防或显著减少诱导的葡萄膜炎的严重性。
共同地，数据显示补体成分和调节蛋白是眼部组织和葡萄膜的重要正常成分，补体活性是自身免疫葡萄膜炎试验模型中葡萄膜炎的成因，补体活性在人体中与葡萄膜炎相关。这样，一些实施方案中，本发明的方法中，在C5激活并产生C5a和C5b-9(MAC)之前，使用阻止选择性和经典补体活性途径的适体以减少葡萄膜炎的发生，持续事件和/或严重性。
青光眼指由于视觉神经和视网膜损害造成的视觉损失的一类疾病，通常与眼压升高(“IOP”)相关。开角型青光眼是最常见的形式，由于流体通道(例如，小梁网)的长期狭窄或闭塞导致水状体的形成而增加IOP。青光眼分为两种类型，开角和闭角型。原初开角型青光眼发展时较缓慢并无痛，通常伴随数年内的无感觉视觉损失。次生开角型青光眼由其他疾病引起(例如，葡萄膜炎或其他炎症疾病，糖尿病，肿瘤，白内障)，钝性损伤或特定药物如类固醇。闭角型青光眼(也指狭窄角型青光眼或畸形青光眼)是由于虹膜处的变化引起液体流的突然阻塞，导致IOP的突然增加引起的。闭角型青光眼的症状为包括眼部疼痛和恶心的视觉损失。在一些个体中发生的神经损伤不伴随IOP的增加；此类型的青光眼为常压(正常压力或低压力)青光眼。此类型青光眼中神经的损伤原因还未知。
补体在青光眼病原学中的作用已经被显示：1)大鼠青光眼模型中，IOP升高时伴随补体成分(C1q，C1r，C1s，C3)mRNAs的视网膜表达(Ahmed，F，Brown，KM，Stephan，DA，Morrison，JC，Johnson，EC，Tomarev，SI(2004)IOVS 45，1247-54)；2)猕猴青光眼模型中补体成分(C4，B，C1q，C3)mRNAs在视网膜中的表达增加(Miyahara，T，Kikuchi，T，Akimoto，M，Kurokawa，T，Shibuki，H.Yoshimura，N(2003)IOVS 44，4347-56)；3)小鼠和猕猴青光眼模型中视网膜胶质细胞内C1q mRNA和蛋白表达的增加(Stasi，K，Nagel，D，Yang，X，Wang，R，Ren，L，Podos，SM，Mittag，T，Danias，J(2006)IOVS 47，1024-29)；4)人体胶原细胞中C1q细胞的免疫组化染色(Stasi等，2006)。补体C1q在试验性绿内障小鼠中的表达显示与IOP的持续增加和对视网膜中心细胞的损伤进程相关(Stasi等，2006)。抗-补体适体的治疗，例如，一种抗-C5适体，可以对高或低-压力青光眼中的神经变性具保护作用。
相应地，本发明的一些实施方案提供了治疗补体介导的眼部疾病的抗-C5药物。一些实施方案中，单独使用本发明的抗-C5药物，而其他实施方案中其与抗-VEGF和/或抗＝PDGF药物联合使用。
本发明的其他实施方案提供了治疗，稳定和/或预防补体-介导的眼部失调的抗-补体适体。抗-补体适体可以根据SELEXT M方法制备。特别实施方案中，本发明包括使用一种抗-补体适体，例如，一种方法中对主体施用一种减少，稳定和/或预防眼部失调中至少一种症状，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD的症状的抗-C5适体。
C5特异的适体
用于治疗，预防和/或减少补体-介导的眼部失调症状的C5特异适体可以通过SELEXTM方法制备。特定实施方案中，本发明包括在一种方法中对主体施用少，稳定和/或预防眼部失调中至少一种症状，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD的症状的抗-C5适体药物。
适体是一种核酸分子，其与分子的特定结合亲和力是不同于Watson-Crick碱基对的交互作用。
适体，类似于通过噬菌体显示或单克隆抗体(“mAbs”)制备的多肽，可以特定结合选择的目标并调节目标的活性，例如，通过与适体的结合可以阻止其目标的功能。
从随机序列寡核苷酸文库中进行体外选择制备的适体超过100种蛋白质，包括生长因子，转录因子，酶，免疫球蛋白，和受体。典型的适体为10-15kDa大小(30-45核苷)，以亚-摩尔亲和力结合其目标，并区分紧密向的目标(例如，适体典型地不与来源于相关基因家族的其他蛋白结合)。一系列结构研究已经显示适体可以使用相同的结合作用(例如，氢键，经典互补，疏水力，空间排阻)，产生抗体-抗原复合物的亲和力和特异性。
适体具有许多期望的用于治疗和诊断的特征，包括高特异性和亲和力，生物效应，和良好的药代动力学特性。
SELEX TM 方法
制备一种适体的首选方法，通常在图2中描述，是以“指数增长的配基系统演化”(“SELEXTM”)。SELEXTM过程，一种体外汇集高特异结合目标分子的核酸分子的方法，描述于，例如，U.S.专利申请系列号07/536，428，1990年6月11日归档，目前已废弃，U.S.专利申请号5475096，题为“核酸配基”，和U.S.专利申请号5270163(亦见WO 91/19813)，题为“核酸配基”。通过进行重复的选择和扩增循环，SELEXTM可用于获得适体，在此也指具有任何期望的目标结合亲和力水平的“核酸配基”。
SELEXTM过程基于唯一的观察，即核酸具有形成二-和三-维结构变体的能力，并具有作为任何化学化合物，无论是单体或多聚体的配基的充分的单体化学多能性(例如，形成特定结合对)。任何大小或成分的分子都可作为目标。
SELEXTM过程基于结合目标的能力。通过SELEXTM过程获得的适体将具有目标金额和特性。然而，SELEXTM过程不同选择适体或目标的其他特性，因此不能期望SELEXTM过程制备的适体具有除了结合期望目标的任何其他特性，虽然可以期望获得的适体将具有其他特性。这样，虽然期望一种适体将具有特异结合目标的能力，除了结合目标之外，一种给定的适体可以没有，或可以具有多种效应。例如，当目标是一种与多细胞表面受体作用的蛋白质，一种适体可以阻止或增强蛋白质和一种或多种该受体的结合，或其可以对任何交互作用不具有效应。另一实施例中，目标可以是一种接触反应类物质，而适体可以抑制或增强接触反应功能的效果，或对接触反应功能无作用。然而，在合适的方法试验之前，技术人员不能预测一种给定的适体具有的特性。事实上，单纯的目标结合对于功能效应并不提供信息，而其在适体结合的作用下可以外露。
目标分子特性的改变需要适体结合目标的特定位点，以对目标特性的改变产生效应。理论上，SELEXTM过程可以鉴定大量适体，其中每个适体结合目标的不同位点。实践中，适体-目标结合作用通常发生在一个或少量适合的目标结合位点，其提供了对于交互作用的稳定的和易达到的结构影响。此外，当对生理目标分子使用SELEXTM过程时，技术人员通常不能控制适体对于目标的定位。因此，适体在目标上的结合位点可以位于，或不可以位于，或接近于，可导致期望效应的潜在结合位点之一，或可以对目标分子无任何效应。
甚至当一种适体，由于其结合目标的能力，被发现具有一种效应，而酶哟方法预测此效应的存在，或预先知道该效应的类型。进行SELEXTM试验时，技术人员只能知道一种适体，一种针对目标点适体，将具有目标结合特性。可以进行SELEXTM试验，期望一些被鉴定的适体可以具有除了结合目标之外的效应，但这是不确定的。
SELEXTM方法作为包括随机序列的单链寡核苷酸文库或集合的起始。寡核苷酸可以是修饰的或未修饰的DNA，RNA，或DNA/RNA杂交。一些实施例中，集合包括100％随机或部分随机寡核苷酸。其他实施例中，集合包括的随机或部分随机寡核苷酸包括至少一种与随机序列整合的固定序列和/或保守序列。其他实施例中，集合包括的随机或部分随机寡核苷酸包括至少一种5′和/或3′端固定序列和/或保守序列，其可以包括寡核苷酸集合中所有分子共享的序列。固定序列是集合中寡核苷酸的共同序列，其出于预选择目的而被包括，如下文描述的CpG模体，PCR引物的杂交位点，RNA聚合酶启动子位点(例如，T3，T4，T7，和SP6)，限制性位点，或均聚序列，如聚A或聚T区域，催化核心，选择结合亲和柱的位点，和其他有助于期望的寡核苷酸的克隆和/或测序。保守序列是不同于前述的固定序列，由多种适体共享并结合相同目标的序列。
寡核苷酸集合合适地包括有效扩增需要的随机序列部分和固定序列。典型地，寡核苷酸的起始集合包括固定的5′和3′末端序列，其在侧面具有30-50个随机核苷的插入区域。随机核苷可以由多种方法制备，包括和血合成和从随机裂解的细胞核酸中进行大小选择。选择/扩增循环前或过程中可以通过突变引入或增加试验核酸中的序列变体。
寡核苷酸的随机序列部分可以为任何长度并可以包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，并可以包括修饰的或非-自然核苷或核苷类似物。见，例如，美国专利号5958691；美国专利号5660985；美国专利号5958691；美国专利号5698687；美国专利号5817635；美国专利号5672695，和PCT公开WO 92/07065。随机寡核苷酸可以由本领域中抑制的固相寡核苷酸合成技术以磷酸二酯-交联核苷合成。见，例如，Froehler等，Nucl.Acid Res.14：5399-5467(1986)和Froehler等，Tet.Lett.27：5575-5578(1986)。随机寡核苷酸可以使用液相方法合成，如三酯合成方法。见，例如，Sood等，Nucl.Acid Res.4：2557(1977)和Hirose等，Tet.Lett，28：2449(1987)。典型的合成是在自动DNA合成仪上进行，产生对于大多数SELEXTM试验足够的1014-1016的单独分子。在序列设计中，充分大范围的随机序列增加了每个合成分子代表一个唯一序列的可能性。
寡核苷酸的起始文库可以由DNA合成仪通过自动化学合成制备。为合成随机序列，在合成过程中每个核苷增加步骤加入所有四种核苷，使得核苷随机整合。如上所述，一个实施方案中，随机寡核苷酸包括完全瑞即序列；然而，其他实施方案中，随机序列可以包括一段非随机或部分随机序列。部分随机序列可以通过在每一核苷增加步骤以不同摩尔比例加入四种核苷。
寡核苷酸起始文库可以是RNA，DNA，替换的RNA或DNA或其组合。该情况下当使用RNA文库作为起始文库时，其典型地通过合成一个DNA文库，经合适的PCR扩增，使用T7RNA聚合酶或修饰的T7RNA聚合酶体外转录DNA文库，并纯化转录的文库而制备。核酸文库在适合于结合的条件下与目标混合并对结合进行逐步回归重复，分离并扩增，使用相同的常规选择方案，以获得任何实际的集合亲和力和选择特性。更特别地，以包括核酸起始集合的混合物开始，SELEXTM方法包括以下步骤：(a)在适合结合的条件下将混合物与目标接触；(b)将未结合的核酸从已经特异结合目标分子的核酸上分离下来；(c)解离核酸-目标复合物；(d)对从核酸-目标复合物中分离下的核酸进行扩增以制备富含配基的核酸混合物；并(e)通过错综循环重复结合，分离，解离和扩增步骤以制备对于目标分子高特异性，高亲和力的核酸配基。这些情况下，当RNA适体被选择时，SELEXTM方法进一步包括以下步骤：(i)在扩增步骤(d)进行前将从核酸-目标复合物中解离的核酸进行反转录；并且(ii)重新开始过程前对来源于步骤(d)的扩增的核酸进行转录。
在包括大量可能的序列和结构的核酸混合物中，对于一个给定的目标具有大范围的结合亲和力。这些对于目标具有高亲和力(更低解离常数)的核酸更趋向结合目标。分离，解离和扩增后，产生了具有更高结合亲和力候选物的第二种核酸混合物。额外的选择循环有助于获得最佳的配基，直至最后的核酸混合物主要有一种或几种序列构成。其可以被克隆，测序并单独作为配基或适体测定1)目标结合亲和力；和2)影响目标功能的能力。
重复进行选择和扩增循环直至获得期望的结果。多数情况下，持续进行选择/扩增直至重复循环时结合力信号不再增强。该方法典型地习惯于采用1014不同核酸，但也可以取样多至1018种不同核酸。通常，核酸适体分子经过15至20个循环过程被选择。一个实施方案中，异质成分仅在开始选择阶段加入，并在重复过程中不出现。
SELEXTM方法的一个实施方案中，选择过程对于强力结合被选目标的核酸是高效的，仅需要一步选择和扩增循环。这些有效的选择可以发生于，例如，色谱-类型过程，其中核酸与柱结合目标的相互关系以一种方式进行，其中柱子可以高效地分离最高亲和力的核酸配基。
许多情况下，不需要进行重复的SELEXTM步骤以鉴定单个核酸配基。目标-特异的核酸配基溶液可以包括核酸结构或模体家族，其具有大量保守序列和大量经替换或增加后不显著影响核酸配基对目标的亲和力的序列。在完成之前终止SELEXTM步骤，可以测定许多核酸配基家族成员的序列。
已知存在大量核酸一级，二级和三级结构。这些通常包括于非-Watson-Crick型作用的模体结构指发夹环，对称或不对称凸起，伪结和多重重复。几乎这些模体的所有已知情况显示其可以形成不超过30个核苷的核酸序列。出于此原因，通常更优选带有包括20至50个核苷的相邻随机片段的SELEXTM过程，一些实施方案中，为30至40个核苷。一个实施例中，5′-固定：随机：3′固定序列包括了约30至约50个核苷的随机序列。
核心SELEXTM方法已经被调整以获得许多特定的目标。例如，美国专利号5707796描述了联合凝胶电泳使用SELEXTM方法选择特别结构特征的核酸分子，如bent DNA。美国专利号4763177描述了基于SELEXTM方法选择包括磷反应基团的核酸配基，可以结合和/或磷-交联和/或磷失活目标分子。美国专利号5567588和美国专利号5861254描述了基于SELEXTM方法高效分离对目标分子具有高亲和力和低亲和力的寡核苷酸。美国专利号5496938描述了在进行SELEXTM方法之后获得改善的核酸配基的方法。美国专利号5705337描述了配基共价交联其目标的方法。
SELEXTM方法也可以用于获得结合超过一种目标分子位点的核酸配基，并获得包括非-核酸物质的结合目标特定位点的核酸配基。SELEXTM方法提供了结合任何预想目标的核酸配基，包括大的和小的生物分子，如核酸-结合蛋白和不知其功能的一部分，是否结合核酸的蛋白质，以及辅因子和其他小分子。例如，美国专利号5580737描述了通过SELEXTM方法鉴定的核酸序列，其可以高亲和力结合咖啡因和类似物，茶碱。
反向-SELEXTM方法是一种通过评估核酸配基序列与一种或多种非-目标分子的交联-反应，提高核酸配基对目标分子的特异性的方法。反向-SELEXTM方法包括以下步骤：(a)制备核酸混合候选物；(b)将候选混合物与目标接触，其中相对于候选混合物对目标具有高亲和力的核酸可以从候选混合物中分离；(c)从剩余的候选混合物中分离增加亲和力的核酸；(d)从目标上解离增加亲和力的核酸；(e)将增加亲和力的核酸与一种或多种非-目标分子接触，使得与非-目标分子具有亲和力的核酸配基被除去；(f)将仅对目标分子具有特定亲和力的核酸进行扩增，以制备可以测序的足量的核酸混合物，其具有相对更高的亲和力并特定结合目标分子。如上SELEXTM方法所述，根据需要重复选择和扩增循环直至获得期望的目标。
使用核酸作为治疗，诊断药物，和疫苗的潜在问题是，磷酸二酯形式的寡核苷酸在其期望的效应出现之前将在体液内被胞内和胞外酶，如核酸内切酶和核酸外切酶快速降解。SELEXTM方法包括鉴定包括修饰的核苷的高亲和力核酸配基，其提供配基改善的特性，如提高体内稳定性或提高递呈特征。这些修饰的实施例包括糖和/或磷和/或碱基位置的化学替换。SELEXTM方法-鉴定的核酸配基包括的修饰核苷描述于，例如，美国专利号5660985，其描述了在核糖2′位点，嘧啶的5位点，和嘌呤的8位点被化学修饰的寡核苷酸，美国专利号5756703描述了包括不同2′-修饰嘧啶的寡核苷酸，美国专利号5580737描述了包括一种或多种2′-氨(2′NH2)，2′-氟(2′-F)，和/或2′-O-甲基(2′-OMe)替换的修饰核苷的高亲和力核酸配基。
本发明中预期的核酸配基的修饰包括，但不局限于，提供其他化学基团，其为核酸配基碱基或核酸配基整合额外电荷，极化性，疏水性，水键，静电力，和立体易变性。抗核酸酶的常规寡核苷酸的修饰包括一种或多种替换核苷内交联，糖改变，碱基改变，或其组合。这些修饰包括，但不局限于，2′-位点糖修饰，5-位点嘧啶修饰，8-位点嘌呤修饰，环外胺的修饰，4-硫尿嘧啶核苷核苷，5-溴或5-碘-尿嘧啶；骨架修饰，硫逐磷酸酯或烷基磷修饰，甲基化，和不常见碱基-对的联合，如异碱基、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。修饰也可以包括3′和5′修饰，如加帽子，例如，增加3′-3′dT帽子以增加外切核酸酶抗性(见，例如，美国专利号5674685；5668264；6207816；和6229002，其中每个通过引述在此全部合并于本文)。
一个实施方案中，提供的寡核苷酸其P(O)O基团被P(O)S(“硫代”)，P(S)S(“二硫代”)，P(O)NR2(“酰胺化”)，P(O)R，P(O)OR’，CO或CH2(“formacetal”)或3′-胺(-NH-CH2-CH2-)，其中每个R或R′是独立的H或替换或非替换烷基。交联基团可以通过-O-，-N-，或-S-交联与相邻核苷连接。寡核苷酸中的所有连接不要求都相同。
额外实施方案中，寡核苷酸包括修饰的糖基，例如，一种或多种羟基被卤素，脂肪族基团替换，或作为酯或胺的功能。一个实施方案中，呋喃残基的2′-位点被O-甲基，O-烷基，O-稀丙基，S-烷基，S-稀丙基，或卤化基团。合成2′-修饰糖的方法描述于，例如，Sproat，等，Nucl.Acid Res.19：733-738(1991)；Cotten，等，Nucl.Acid Res.19：2629-2635(1991)；和Hobbs，等，Biochemistry 12：5138-5145(1973)。其他修饰是本领域中普通技术人员已知的。这些修饰可以是前-SELEXTM过程修饰或后-SELEXTM过程修饰(对先前鉴定的未修饰配基进行修饰)或整合入SELEXTM过程。
前-SELEXTM过程修饰或那些由整合入SELEXTM过程制备的核酸配基具有对于SELEXTM目标的特异性和提高的稳定性，例如，体内稳定性。对核酸配基的后-SELEXTM过程修饰可以提高稳定性，例如，体内稳定性而不相反地影响核酸配基的结合能力。
SELEXTM方法包括将选择的寡核苷酸与其他选择的寡核苷酸和非-寡核苷酸功能单元联合，如美国专利号5637459和美国专利号5683867中所描述。SELEXTM方法进一步包括将选择的寡核苷酸配基与亲脂性或非-免疫原性高分子量化合物在诊断或治疗复合物中联合，描述于美国专利号6011020，美国专利号6051698，和PCT公开号WO 98/18480。这些专利和申请描述了大量的形态和其他特性的联合，其带有寡核苷酸有效扩增和复制特征，和其他分子的期望特征。
通过SELEXTM方法对小的，柔韧性多肽的核酸配基也进行了鉴定。小多肽具有柔韧性并通常以多重均匀平衡性存在于溶液中，因此其最初被认为可以通过结合柔韧性多肽导致构象熵损失而限制结合亲和力。然而，鉴定溶液中小多肽的核酸配基的可行性在美国专利号5648214中已有描述。该专利中，鉴定了对于物质P，一种11氨基酸多肽的高亲和RNA核酸配基。
如此所述，本发明通过SELEXTM方法选择对于补体目标具有特异性和结合亲和力的适体。此外，选择过程可以整合修饰核苷以增加适体分子对于体内降解的稳定性。
2′修饰SELEX TM
为使适体适合于治疗或诊断使用，在体内安全，稳定地合成是合适的和偏移的。野生型RNA和DNA适体由于其对于核酸酶的降解敏感，在体内不稳定。可以通过整合入2′-位点修饰的基团增加对核酸酶降解的抗性。
2′-氟和2′-胺基团已经成功地整合入选择适体的寡核苷酸集合。然而，这些修饰极大地增加了合成最终适体的费用，并可能在某种情况下，由于通过修饰寡核苷酸的降解进而使用这些核苷作为DNA合成的材料，而使修饰的核苷循环进入宿主DNA造成安全问题。
包括2′-O-甲基(“2′-OMe”)核苷的适体，如前所述，克服了许多这些缺点。包括2′-OMe核苷的寡核苷酸是抗-核酸酶的并且合成较便宜。虽然2′-OMe核苷在生物系统中是到处存在的，生理条件下自然的聚合酶不接受2′-OMe NTPs作为底物，这样就不存在2′-OMe核苷进入宿主DNA的安全问题。制备2′-修饰适体的SELEXTM方法见描述于，例如，美国临时专利申请系列号60/430761，2002年12月归档，美国临时专利申请系列号60/487474，2003年7月15日归档，美国临时专利申请系列号60/417039，2003年11月4日归档，美国专利申请号10/729581，2003年12月3日归档，美国专利申请号10/873856，2004年6月21日归档，题目为“体外选择2′-O-甲基替换核酸的方法”，美国临时专利申请系列号60/696292，2005年6月30日归档，题目为“制备全部2′-修饰的核酸转录的改良材料和方法”和美国专利申请号11/480188，2006年6月30日归档，题目为“制备全部2′-修饰的核酸转录的材料和方法”，其每一个在此通过引述全部合并入本文。
本发明包括结合并调节补体目标功能的适体，其包括修饰的核苷(例如，在2′-位点修饰的核苷)使寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸对于酶和化学降解以及热和无力降解更稳定。优选实施方案中，所述的补体木笔哦啊是补体蛋白C5。文献中有几种包括2′-OMe的适体的实施例(见，例如，Green等，Current Biology2，683-695，1995)，其通过体外选择修饰的转录物文库制备，其中C和U残基是2′-氟(2′-F)替换而A和G残基是2′-OH。一旦功能序列被鉴定，测试每个A和G残基对于2′-OMe替换的耐受性，所有A和G残基都具有2′-OMe替换耐受性的适体被重新合成。大多数以该两步法制备的适体的A和G残基对于2′-OMe替换具有耐受性，虽然，平均有20％并无该特性。因此，该方法制备的适体趋向于包括从2个至4个2′-OH残基，并且最后得到折衷的稳定性和合成费用。通过在转录反应中整合修饰核苷制备寡核苷酸集合中使用的稳定的寡核苷酸，通过SELEXTM方法(和/或任何其改变和改良，包括这里所述的)选择和富集适体，本发明的方法评估了稳定选择的适体寡核苷酸的需要(例如，通过修饰核苷重新合成适体寡核苷酸)。
一个实施方案中，本发明提供了包括2′-OH，2′-F，2′-脱氧，和2′-OMe修饰的ATP，GTP，CTP，TTP，和UTP核苷联合物的适体。其他实施方案中，本发明提供了包括2′-OH，2′-F，2′-脱氧，和2′-OMe，2′-NH2和2′-甲氧基乙基修饰的ATP，GTP，CTP，TTP，和UTP核苷联合物的适体。另一实施方案中，本发明提供了包括2′-OH，2′-F，2′-脱氧，和2′-OMe，2′-NH2和2′-甲氧基乙基修饰的ATP，GTP，CTP，TTP，和UTP核苷56联合物的适体。优选实施方案中，本发明提供了包括所有或充分所有2′-OMe修饰的ATP，GTP，CTP，TTP，和/或UTP核苷的适体。
本发明的2′-修饰适体可以使用修饰聚合酶选择，例如，修饰的T7聚合酶，其对在呋喃糖2′位点大量替换的修饰核苷的整合速度高于野生型聚合酶。例如，639位点的酪氨酸残基改变为苯丙氨酸(Y639F)的突变T7聚合酶可以利用(整合)2′脱氧，2′氨-，和2′氟-三磷酸核苷(NTPs)，但不是大容量2′替换，如2′-OMe或2′-叠氮(2′-N3)替换的NTPs。为整合大容量2′替换，除了Y639F突变，在784位点的组氨酸变为丙氨酸残基的突变T7聚合酶(Y639F/H784A)已经在有限条件下用于整合修饰的嘧啶NTPs。见Padilla，R.和Sousa，R，Nucleic Acids Res，2002，30(24)：138。639位点的酪氨酸残基改变为苯丙氨酸，784位点的组氨酸变为丙氨酸残基，378位点的赖氨酸改变为精氨酸的突变T7 RNA聚合酶(Y639F/H784A/K378R)已经在有限条件下用于整合修饰的嘌呤和嘧啶NTPs，例如，2′-OMeNTPs，但需要2′-OH GTP用于转录。见Burmeister等，(2005)Chemistry and Biology，12：25-33。虽然并不期望受限于理论，K378R突变不靠近聚合酶的活性位点，从而被认为是沉默突变，对于2′-OMe修饰NTPs的整合没有效应。位点784的组氨酸改变为丙氨酸(H784A)的突变T7聚合酶已被描述。Padilla等，Nucleic Acid Research，2002，30：138。Y639F/H784A突变和H784A突变T7聚合酶中，改变为小氨基酸残基如丙氨酸可以促使大量核酸底物的整合，例如，2′-OMe替换核苷。见Chelliserry，K.和Ellington，A.D.，(2004)Nature Biotech，9：1155-60。更多的在其活性位点带有突变的T7 RNA聚合酶已经被描述，其更易于整合大量2′-修饰底物，例如，639位点酪氨酸改变为亮氨酸(Y639L)的T7 RNA聚合酶。
通常，已经发现在这里描述的条件下，Y693F突变可以用于整合除了GTP之外的所有2′-OMe替换的NTPs，而Y639F/H784A，Y639F/H784A/K378R，Y639L/H784A，Y639L/H784A/K378R，Y639L，Y639L/K378R，P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突变的T7 RNA聚合酶可以在这里描述的条件下使用以整合包括2′-OMe GTP的所有2′-OMEe替换NTPs。
2′-修饰的寡核苷酸可以完全由修饰的核苷，或修饰的核苷亚组合成。修饰可以是相同或不同的。一些或所有核苷可以被修饰，而那些被修饰的可以包括相同的修饰。一些或所有核苷可以被修饰，而那些被修饰的可以包括不同的修饰。例如，包括相同碱基的所有核苷可以具有一种类型的修饰，而包括其他碱基的核苷可以具有不同类型的修饰。所有嘌呤核苷可以具有一种类型的修饰(或不修饰)，而所有嘧啶核苷具有另一种不同类型的修饰(或不修饰)。这种情况下，使用任何修饰的联合制备转录物，或转录物的集合，包括，例如，核糖核苷酸(2′-OH)，脱氧核糖核苷酸(2′-脱氧)，2′-氨基核苷(2′-NH2)，2′-氟核苷(2′-F)，和2′-O-甲基(2′-OMe)核苷。包括2′-OH A和G和2′-F C和U的转录混合物称为“rRfY″混合物，而由此选择的适体为“rRfY″适体。包括2′-OMe C和U和2′-OH A和G的转录混合物称为“rRmY”混合物，而由此选择的适体称为“rRmY”适体。包括脱氧A和G和2′-OMe U和C的转录混合物称为“dRmY”混合物，由此选择的适体称为“dRmY”适体。包括2′-OMeA，C，和U，和2′-OH G的转录混合物称为“rGmH”混合物，由此选择的适体称为“rGmH”适体。选择性的包括2′-OMe A，C，U和G和2′-OMe A，U和C和2′-F G的转录混合物称为“选择性混合”，由此选择的适体指“选择性混合物”适体。包括2′-OMe A，U，C，和G，其中10％的G′s是核糖核苷酸的转录混合物称为“r/mGmH”混合物，由此选择的适体称为“r/mGmH”适体。包括2′-OMe A，U，和C，和2′-F G的转录混合物称为“fGmH″混合物，由此选择的适体称为“fGmH″适体。包括2′-OMe A，U，和C，和脱氧G的转录混合物称为“dGmH”混合物，由此选择的适体称为“dGmH”适体。包括脱氧A，和2′-OMeC，G和U的转录混合物称为“dAmB”混合物，由此选择的适体称为“dAmB”适体，包括所有2′-OH核苷的转录混合物称为“rN”混合物，由此选择的适体称为“rN”，“rRrY”或“RNA”适体。包括2′-OH三磷酸腺苷和三磷酸鸟苷和脱氧三磷酸胞嘧啶和三磷酸胸腺嘧啶的转录混合物称为rRdY混合物，由此选择的适体称为“rRdY″适体。“mRmY”也称为“MNA”适体，其除了起始核苷为2′-OH鸟苷或任何野生型鸟苷外，仅包括2′-O-甲基核苷，并可以通过后-SELEXTM将2′-OH Gs替换为2′-OMe Gs，从r/mGmH寡核苷酸派生出。可选的，mRmY适体可以通过mRmY SELEXTM鉴定。
一种优选实施方案包括任何2′-OH，2′-脱氧和2′-OMe核苷的联合。更优选的实施方案包括任何2′-脱氧和2′-OMe核苷的联合。甚至更优选的实施方案是任何2′-脱氧和2′-OMe核苷的联合，其中嘧啶是2′-OMe(如dRmY，mRmY或dGmH)。
在选择过程前(-预先)将修饰核苷整合进入本发明的适体(例如，前-SELEXTM过程修饰)。可选地，本发明通过前-SELEXTM过程修饰整合了修饰核苷的适体也可以进一步通过后-SELEXTM过程修饰(例如，SELEXTM之后的后-SELEXTM过程修饰)。前-SELEXTM过程修饰产生SELEXTM目标特异的修饰核酸配基并提高体内稳定性。后-SELEXTM过程修饰，例如，修饰(例如，对具有经前-SELEXTM过程修饰整合核酸的，先前鉴定的配基进行切断，删除，替换或增加核苷)可以进一步提高体内稳定性，而不明显影响具有前-SELEXTM过程修饰整合核苷的核酸配基的结合能力。
为在聚合酶接受2′-修饰的NTPs的条件下制备2′-修饰的(例如，2′-OMe)RNA转录物，可以使用Y693F，Y693F/K378R，Y693F/H784A，Y693F/H784A/K378R，Y639L，Y639L/K378R，P266L/Y639L/H784A和P266L/Y639L/H784A/K378R突变的T7 RNA聚合酶。其他T7 RNA聚合酶，特别是显示对大量2′-替换高耐受性的聚合酶，也可以用于本发明中。当在这里描述的条件下使用模板-控制的聚合时，Y693F/H784A，Y693F/H784A/K378R，P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突变的T7 RNA聚合酶可以用于整合所有2′-OMe NTPs，包括2′-OMe GTP，并且获得比使用Y693F，Y693F/K378R，Y693F/H784A，Y693F/H784A/K378R，Y639L，Y639L/K378R突变的T7 RNA聚合酶更好的转录产量。Y693F/H784A，Y693F/H784A/K378R，P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突变的T7 RNA聚合酶可以与2′-OH GTP共同使用，但其不是必需的，以获得高产量的2′-修饰的，例如，包括2′-OMe的寡核苷酸。
其他聚合酶，特别是那些显示了对于大量2′-替换具有高耐受性的，也可以用于本发明。在这里描述的转录条件下通过测试其整合修饰核苷的能力筛选这些聚合酶。
许多因素已经被确定对于这里描述的方法中使用的转录条件是重要的。例如，DNA转录模板5′末端固定序列上整合的引导序列对于增加修饰转录产物的产量是重要的，其中Y693F/K378R或Y693F/H784A/K378R突变的T7 RNA聚合物被用于转录，例如，在以下描述的dRmY或r/mGmH转录条件下。此外，引导序列可以用于帮助增加修饰转录产物的产量，但不是必需的，其中使用Y693F/H784A或Y693F/H784A/K378R突变T7 RNA聚合酶用于转录，例如，在以下描述的mRmY转录条件下。引导序列典型地为6-15核苷长度，并可以包括所有嘌呤，或嘌呤和嘧啶核苷的混合物。
另一个获得整合了修饰核苷的转录产物的重要因素是2′-OH鸟嘌呤核苷的存在或浓度(例如，GMP，GTP，或其他非-2′-OMe非-三磷酸盐)。转录产物可以分为两个阶段：第一种阶段是初始化，期间NTP加入GTP的3′-羟基末端(或GMP，或其他非-2′-OMe非-三磷酸盐)以制备二核苷酸，随后扩展为约10-12个核苷；第二阶段是延伸，期间在初始的10-12核苷上进行转录过程。已经发现加入小量2′-OH GTP(或GMP，或其他非-2′-OMe非-三磷酸盐)至含有过剩2′-OME GTP的转录混合物可以有效增强聚合酶使用2′-OH GTP(或GMP，鸟苷，或其他非-2′-OMe非-三磷酸盐)的初始转录能力。这样，例如，一种dRmY转录混合物(包括脱氧嘌呤和2′OMe嘧啶)需要额外加入小量的GMP以增强聚合酶的初始转录，而在r/mGmH转录混合物中(包括10％2′-OH GTP)，小量的GMP可以加入至转录混合物中，但由于2′-OH GTP基因存在于转录混合物中，所以其不是增强聚合酶初始转录所必需的。一旦转录进入延伸阶段，在2′-OMe和2′-OH GTP之间差别的减少，及2′-OMe GTP多于2′-OH GTP，使得整合主要为2′-OMe GTP。
如上所述，最初的带有2′-OH鸟苷的转录(例如，GMP，GTP或其他非-2′-OMe非-三磷酸盐)是重要的。此结果受聚合酶对于初始核苷的特异性影响。作为结果，任何此方法制备的任何转录产物的5′-末端核苷可能为2′-OH G。GMP的优选浓度是0.5mM，更优选地为1mM。已经发现转录反应中包括PEG，优选地为PEG-8000，可以使修饰核苷的整合最大化。
整合2′-OMe替换核苷进入转录产物的另一重要因素是在转录混合物中使用二价镁和锰。不同浓度的氯化镁和氯化锰的组合已经发现可以影响2′-O-甲基化转录产物的产量，氯化镁和氯化锰的最佳浓度依赖于转录反应混合物中复合二价金属离子的NTPs的浓度。为获得所有2′-O-甲基化转录产物(例如，所有的2′-OMe A，C，和U及约90％G核苷)的最大产量，在每种NTP浓度为0.5mM时氯化镁和氯化锰的最佳浓度是约5mM和1.5mM。当每种NTP的浓度是1.0mM时，氯化镁和氯化锰的合适浓度是6.5mM和2.0mM。当每种NTP的浓度是2.0mM时，氯化镁和氯化锰的合适浓度是9.6mM和2.9mM。任何情况下，两倍浓度的偏离仍可得到显著数量的修饰转录产物。
一些实施方案中，适合在初始转录中使用GMP或鸟苷。此结果受聚合酶对于初始核苷的特异性影响。作为结果，任何此方法制备的任何转录产物的5′-末端核苷可能为2′-OH G。GMP的优选浓度是0.5mM，更优选地为1mM。已经发现转录反应中包括PEG，优选地为PEG-8000，可以使修饰核苷的整合最大化。
为使2′-OMe ATP(100％)，UTP(100％)，CTP(100％)和GTP(～90％)(“r/mgmH)的整合最大化，以下条件是合适的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 5mM(当每种2′-OMe NTP浓度为1.0mM时其为6.5mM)，MnCl 1.5mM(当每种2′-OMe NTP浓度为1.0mM时其为2.0mM)，2′-OMe NTP(每种)500μM(更合适地为1.0mM)，2′-OHGTP 30μM，2′-OH GMP 500μM，pH7.5，Y639F/H784A T7RNA聚合酶15单位/ml，无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核苷长度的全嘌呤引导序列。这里使用的，一单位的Y639F/H784A突变T7 RNA聚合酶(或任何其他突变T7 RNA聚合物)被定义为在r/mGmH条件下，整合1nmole 2′-OMe NTPs入转录产物所需要的酶数量。这里使用的，一单位的无机焦磷酸酯酶定义为在pH7.2和25度下，每分钟释放1.0mole无机正磷酸盐所需的酶数量。
为使2′-OH GTP和2′-OMe ATP，UTP和CTP(“rGmH”)在转录产物中的整合最大化(100％)，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 5mM(当每种NTP浓度为2.0mM时其为9.6mM)，MnCl2 1.5mM(当每种NTP浓度为2.0mM时其为2.9mM)，NTP(每种)500μM(更合适地为2.0mM)，2′-OH GMP 1mM，pH7.5，Y639F/K378RT7 RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核苷长度的全嘌呤引导序列。
为使2′-OMe ATP(100％)，2′-OMe UTP(100％)，2′-OMe CTP(100％)，和2′-OMe GTP(100％)(“mRmY”或“MNA″)在转录产物中的整合最大化，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 8mM，MnCl2 2.5mM，2′-OMe NTP(每种)1.5mM，2′-OH GMP 1mM，pH7.5，Y639F/H784A/K378R T7 RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种在转录条件下增加转录产量的可选引导序列。一些实施方案中，可选引导序列是一个全嘌呤引导序列。另一实施方案中，可选引导序列是嘌呤和嘧啶的混合。
为使2′-OH ATP和GTP，和2′-OMe UTP和CTP(“rRmY”)在转录产物中的整合最大化(100％)，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-800010％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 5mM(当每种NTP浓度为2.0mM时其为9.6mM)，MnCl2 1.5mM(当每种NTP浓度为2.0mM时其为2.9mM)，NTP(每种)500μM(更合适地为2.0mM)，2′-OH GMP 1mM，pH7.5，Y639F/H784A/K378R T7 RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核苷长度的全嘌呤引导序列。
为使2′-OMe ATP，UTP和CTP(“rGmH”)在转录产物中的整合最大化(100％)，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-800010％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 5mM(当每种NTP浓度为2.0mM时其为9.6mM)，MnCl2 1.5mM(当每种NTP浓度为2.0mM时其为2.9mM)，NTP(每种)500μM(更合适地为2.0mM)，2′-OH GMP 1mM，pH7.5，Y639F T7 RNA聚合酶1.5单位/ml，无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核苷长度的全嘌呤引导序列。
为使2′-OMe UTP和CTP(“rRmY”)在转录产物中的整合最大化(100％)，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 5mM(当每种NTP浓度为2.0mM时其为9.6mM)，MnCl2 1.5mM(当每种NTP浓度为2.0mM时其为2.9mM)，NTP(每种)500μM(更合适地为2.0mM)，2′-OH GMP 1mM，pH7.5，Y639F/H784A T7 RNA聚合酶1.5单位/ml，无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核苷长度的全嘌呤引导序列。
为使脱氧ATP和GTP和2′-OMe UTP和CTP(“dRmY”)在转录产物中的整合最大化(100％)，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 9.6mM，MnCl2 2.9mM，NTP(每种)2.0mM，2′-OH GMP 1mM，pH7.5，Y639F/K378R T7 RNA聚合酶200nM/ml，无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核苷长度的全嘌呤引导序列。
为使2′-OMe ATP，UTP和CTP和2′-F GTP和(“fRmH”)在转录产物中的整合最大化(100％)，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 9.6mM，MnCl2 2.9mM，2′-OMe NTP(每种)2.0mM，2′-OH GMP 1mM，pH7.5，Y639F/K378R T7 RNA聚合酶200nM/ml，无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核苷长度的全嘌呤引导序列。
为使脱氧ATP和2′-OMe UTP，GTP和CTP(“dAmB”)在转录产物中的整合最大化(100％)，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 9.6mM，MnCl2 2.9mM，NTP(每种)2.0mM，2′-OH GMP 1mM，pH7.5，Y639F/K378R T7 RNA聚合酶200nM/ml，无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核苷长度的全嘌呤引导序列。
上述的每个转录过程优选地在(a)约20度至50度进行，优选地在30度至45度，更优选地为37度，至少2小时，(b)使用50-300nM双链DNA转录模板(循环1中使用200nM模板(dRmY转录中使用300nM模板))，随后循环中使用约50nM，1/10稀释的最佳PCR反应液，使用这里描述的条件)。以下描述的优选的DNA转录模板(其中ARC254和ARC256在所有2′-OMe条件下转录，而ARC255在rRmY条件下转录)。
ARC254系列号：99
5’-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
ARC 255系列号：100
5’-CATGCATCGCGCTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
ARC 256系列号：101
5’-CATCGATCGATGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
在rN转录条件下，转录混合物包括2′-OH三磷酸腺苷(ATP)，2′-OH三磷酸鸟苷(GTP)，2′-OH三磷酸胞苷(CTP)，和2′-OH三磷酸尿苷(UTP)。用本发明的rN转录混合物制备的修饰寡核苷酸充分地包括所有2′-OH腺苷，2′-OH鸟苷，2′-OH胞苷，2′-OH尿苷。优选的rN转录实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺苷是2′-OH腺苷，至少80％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少80％的胞苷是2′-OH胞苷，至少80％的尿苷是2′-OH尿苷。更优选的rN转录实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺苷是2′-OH腺苷，至少90％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少90％的胞苷是2′-OH胞苷，至少90％的尿苷是2′-OH尿苷。最优选的rN转录实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少100％的腺苷是2′-OH腺苷，至少100％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少100％的胞苷是2′-OH胞苷，至少100％的尿苷是2′-OH尿苷。
rRmY转录条件下，转录反应混合物包括2′-OH三磷酸腺苷，2′-OH三磷酸鸟苷，2′-OMe三磷酸胞苷，和2′-OMe三磷酸尿苷。用本发明的rRmY转录混合物制备的修饰寡核苷酸充分地包括所有2′-OH腺苷，2′-OH鸟苷，2′-OMe胞苷，2′-OMe尿苷。优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺苷是2′-OH腺苷，至少80％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少80％的胞苷是2′-OMe胞苷，至少80％的尿苷是2′-OMe尿苷。更优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺苷是2′-OH腺苷，至少90％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少90％的胞苷是2′-OMe胞苷，至少90％的尿苷是2′-OMe尿苷。最优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少100％的腺苷是2′-OH腺苷，至少100％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少100％的胞苷是2′-OMe胞苷，至少100％的尿苷是2′-OMe尿苷。
dRmY转录条件下，转录反应混合物包括2′-脱氧三磷酸腺苷，2′-脱氧三磷酸鸟苷，2′-O-甲基三磷酸胞苷，和2′-O-甲基三磷酸尿苷。用本发明的dRmY转录混合物制备的修饰寡核苷酸充分地包括所有2′-脱氧腺苷，2′-脱氧鸟苷，2′-O-甲基胞苷，2′-O-甲基尿苷。优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺苷是2′-脱氧腺苷，至少80％的鸟苷是2′-脱氧鸟苷，至少80％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少80％的尿苷是2′-O-甲基尿苷。更优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺苷是2′-脱氧腺苷，至少90％的鸟苷是2′-脱氧鸟苷，至少90％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少90％的尿苷是2′-O-甲基尿苷。最优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少100％的腺苷是2′-脱氧腺苷，至少100％的鸟苷是2′-脱氧鸟苷，至少100％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少100％的尿苷是2′-O-甲基尿苷。
rGmY转录条件下，转录反应混合物包括2′-OH三磷酸鸟苷，2′-OMe三磷酸胞苷，2′-OMe三磷酸尿苷，和2′-OMe三磷酸腺苷。用本发明的rGmY转录混合物制备的修饰寡核苷酸充分地包括所有2′-OH鸟苷，2′-OMe胞苷，2′-OMe尿苷，和2′-OMe腺苷。优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少80％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少80％的胞苷是2′-OMe胞苷，至少80％的尿苷是2′-OMe尿苷，至少80％的腺苷是2′-OMe腺苷。更优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少90％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少90％的胞苷是2′-OMe胞苷，至少90％的尿苷是2′-OMe尿苷，至少90％的腺苷是2′-OMe腺苷。最优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少100％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少100％的胞苷是2′-OMe胞苷，至少100％的尿苷是2′-OMe尿苷，至少100％的腺苷是2′-O-甲基腺苷。
r/mGmH转录条件下，转录反应混合物包括2′-O-甲基三磷酸腺苷，2′-O-甲基三磷酸胞苷，2′-O-甲基三磷酸鸟苷，2′-O-甲基三磷酸尿苷和2′-OH三磷酸鸟苷。用本发明的r/mGmH转录混合物制备的修饰寡核苷酸充分地包括所有2′-O-甲基腺苷，2′-O-甲基胞苷，2′-O-甲基鸟苷，2′-O-甲基尿苷，其中鸟苷中2′-OH鸟苷数量最大为10％。优选实施方案中，本发明中结果的r/mGmH修饰寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺苷是2′-O-甲基腺苷，至少80％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少80％的鸟苷是2′-O-甲基鸟苷，至少80％的尿苷是2′-O-甲基尿苷，并且不超过10％的鸟苷是2′-OH鸟苷。更优选的实施方案中，结果修饰寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺苷是2′-O-甲基腺苷，至少90％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少90％的鸟苷是2′-O-甲基鸟苷，至少90％的尿苷是2′-O-甲基尿苷，并且不超过10％的鸟苷是2′-OH鸟苷。最优选的实施方案中，结果修饰寡核苷酸包括的序列中至少100％的腺苷是2′-O-甲基腺苷，至少100％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少90％的鸟苷是2′-O-甲基鸟苷，至少100％的尿苷是2′-O-甲基尿苷，并且不超过10％的鸟苷是2′-OH鸟苷。
mRmY转录条件下(这里也指MNA)，转录混合物只包括2′-O-甲基三磷酸腺苷，2′-O-甲基三磷酸胞苷，2′-O-甲基三磷酸鸟苷，2′-O-甲基三磷酸尿苷。使用本发明的mRmY转录混合物制备的结果修饰寡核苷酸包括的序列中100％的腺苷是2′-O-甲基腺苷，100％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，100％的鸟苷是2′-O-甲基鸟苷(除了寡核苷酸的第一个鸟苷)，100％的尿苷是2′-O-甲基尿苷。
fGmH转录条件下，转录反应混合物包括2′-O-甲基三磷酸腺苷，2′-O-甲基三磷酸尿苷，2′-O-甲基三磷酸胞苷，2′-F三磷酸鸟苷。用本发明的fGmH转录混合物制备的修饰寡核苷酸充分地包括所有2′-O-甲基腺苷，2′-O-甲基尿苷，2′-O-甲基胞苷，2′-F鸟苷。优选实施方案中，本发明中结果的修饰寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺苷是2′-O-甲基腺苷，至少80％的尿苷是2′-O-甲基尿苷，至少80％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少80％的鸟苷是2′-F鸟苷。更优选的实施方案中，本发明中结果的修饰寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺苷是2′-O-甲基腺苷，至少90％的尿苷是2′-O-甲基尿苷，至少90％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少90％的鸟苷是2′-F鸟苷。最优选的实施方案中，本发明中结果的修饰寡核苷酸包括的序列中至少100％的腺苷是2′-O-甲基腺苷，至少100％的尿苷是2′-O-甲基尿苷，至少100％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少100％的鸟苷是2′-F鸟苷。
dAmB转录条件下，磷酸盐，2′-O-甲基三磷酸胞苷，2′-O-甲基三磷酸鸟苷，2′-O-甲基三磷酸尿苷。使用本发明的dAmB转录混合物制备的修饰寡核苷酸充分地包括所有2′-脱氧腺苷，2′-O-甲基胞苷，2′-O-甲基鸟苷，和2′-O-甲基尿苷。优选实施方案中，结果的修饰寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺苷是2′-脱氧腺苷，至少80％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少80％的鸟苷是2′-O-甲基鸟苷，至少80％的尿苷是2′-O-甲基尿苷。更优选实施方案中，结果的修饰寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺苷是2′-脱氧腺苷，至少90％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少90％的鸟苷是2′-O-甲基鸟苷，至少90％的尿苷是2′-O-甲基尿苷。最优选实施方案中，结果的修饰寡核苷酸包括的序列中至少100％的腺苷是2′-脱氧腺苷，至少100％的胞苷是2′-O-甲基胞苷，至少100％的鸟苷是2′-O-甲基鸟苷，至少100％的尿苷是2′-O-甲基尿苷。
每种情况下，转录产物可以作为SELEXTM过程中的文库来鉴定适体和/或测定序列中具有给定目标结合特异性的保守序列。结果序列已经是稳定的，从过程中消除该步骤以获得稳定的适体序列并作为结果，给予更稳定的适体。2′-OMe SELEXTM过程的另一优势是结果序列具有更少的序列所需的2′-OH核苷，也可能不包括。剩余2′OH核苷可以通过后-SELEX修饰去除。
如下所述，更低的但是有作用的完全整合2′替换核苷的转录产物可以在除了上述最优条件之外的条件下获得。例如，上述专利条件的变化包括：
HEPES缓冲液浓度可以为0至1M。本发明也试用其他pKa值在5和10之间的缓冲液，例如，Tris(羟甲基)氨基甲烷。
DTT浓度范围可以为0至400mM。本发明的方法也提供了试用其他还原试剂，例如，巯基乙醇。
亚精胺和/或精胺浓度范围可以为0至20mM。
PEG-8000浓度范围可以为0至50％(w/v)。本发明的方法也提供了使用其他亲水聚合物，包括，例如，其他分子量的PEG或其他聚乙二醇。
Triton X-100浓度范围可以为0至0.1％(w/v)。本发明的方法也提供了使用其他非-离子去垢剂，包括，例如，其他去垢剂，包括其他Triton-X去垢剂。
MgCl2浓度范围可以为0.5mM至50mM。MnCl2浓度范围可以为0.15mM至15mM。MgCl2和MnCl2的浓度必须在所述范围内，优选实施方案中MgCl2∶MnCl2为10至3，优选地，为3-5：1，更优选地，比例约为3-4∶1。
2′-OMe NTP的浓度(每种NTP)范围为5μM至5mM。
2′-OH GTP浓度范围可以0μM至300mM。一些实施方案中，转录可以在缺失2′-OH GTP(0μM)时进行。
2′-OH GMP，鸟苷或其他除了2′糖基位点的2′-OH G替换的浓度范围可以为0至5mM，其中，一些实施方案中，2′-OH GTP不包括在反应中，2′-OH GMP是需要的并其范围为5μM至5mM。
DNA模板浓度范围为5nM至5μM。
突变聚合酶浓度范围为2nM至20μM。
无机焦磷酸酶范围为0至100单位/ml。
pH范围为pH6至pH9。本发明的方法可以在最多数聚合酶整合修饰核苷的活性pH范围内实施。
转录反应时间可以为1小时至数周，优选地为1至24小时。
以下实施例中描述的生物方法显示的，具有最高亲和力和结合特异性的所选择的适体适合于治疗C5补体蛋白相关的疾病的治疗。
适体药物化学
一旦结合期望目标的适体被鉴定，可以执行几种技术进一步增强所鉴定的适体序列的结合和/或功能特征。通过SELEXTM过程(包括2′-修饰SELEXTM)鉴定的结合期望目标的适体可以任意地平末端化以获得具有期望结合和/或功能特征的最小化适体序列(这里也指“最小化结构”)。使用折叠方法和序列分析(例如，对来源于选择的克隆序列结果进行校准以寻找保守模体和/或协变)以获知最小化构造的设计。生化探针时间也可以测定适体序列的5′和3′边界，以获知最小化构造的设计。最小化结构可以被化学合成并测定其相比于起源的非-最小化序列的结合和功能特征。包括一系列5′，3′和/或内部删除的适体序列的变体也可以直接通过化学合成并测试其相比于其起源的非-最小化序列的结合和/或功能特征。
此外，掺杂重选可以用于研究单一活性适体序列(例如，通过SELEXTM过程鉴定的结合期望目标的适体，(包括2′-修饰SELEXTM)，或一种单一最小化适体序列)的序列需要。使用合成的，已经基于期望的单一序列设计的简并集合进行掺杂重选。简并水平通常为野生型核苷的70％至85％间变化，例如，期望的单一序列。通常，通过掺杂重选过程鉴定带有中立突变的序列，但一些情况下序列改变可以获得增强亲和力的结果。来源于使用掺杂重选鉴定克隆的合成序列信息可以用于鉴定最小结合模体并有助于获得最优效果。
使用SELEXTM过程鉴定的适体序列(包括2′-修饰SELEX和掺杂重选)和/或最小化的适体序列也可以在SELEXTM之后使用Aptamer Medicinal Chemistry进行最优化处理，进行随机或直接序列突变以增加结合亲和力和/或功能特征，或测定序列中对于结合活性和/或功能特征所必要的位点。
适体药物化学是一种适体改良技术，其中各组变体数据通过化学合成。这些变体典型地与母体适体不同，其引入了单一替换，并由于替换位点的不同相互区别。这些变体之间及与母体之间进行相互比较。特征上的改良可以是意义深远的，其包括的单一替换可以是获得特定治疗标准所必要的。
可选地，从单一变体组中获得的信息可以用于设计增加的变体组，其中超过一种替换被同时引入。一种设计策略中，所有单一替换变体被归类，选择前4种，并且这4中单一替换变体的所有可能的双(6)，三(4)和四(1)重联合被合成和分析。第二种设计策略中，最佳的单一替换变体被作为新的母本，包括最高-级别单一替换变体的所有可能的双替换变体被合成和分析。其他策略也可以被使用，并且这些策略可以重复使用使得替换的数量逐渐增加，连续鉴定增加-改善的变体。
适体药物化学可以特定地作为一种方法对局部引入的替换，而非整体，进行研究。由于适体是在通过转录制备的文库中选择的，在SELEXTM过程中引入的替换必须是整体引入的。例如，如果期望在核苷间引入硫代磷酸酯交联，其只能在每个A(或每个G，C，T，U等)中引入(整体替换)。在一些A(或一些G，C，T，U等)中需要硫代磷酸酯(局部替换)而在其他A中无耐受性的适体不能通过此方法发现。
适体药物化学方法使用的替换类型仅受固相合成试剂制备并引导其进入聚合物合成方案的能力的限制。方法不单独受限于核苷。适体药物化学方法包括的替换可以引入空间，疏水性，亲水性，亲脂性，疏脂性，阳离子，影子里，中性离子，两性离子，极化性，核酸酶-抗性，构象硬度，构象柔韧性，蛋白-结合特性，质量等。适体药物化学方法可以引入碱基-修饰，糖基-修饰或磷酸二酯交联-修饰。
当考虑可以有利于治疗适体的替换的类型，则期望引入具有以下一种或两种特性的替换。
(1)已经在身体中存在的替换，例如，2’-脱氧，2’-核糖，2’-O-甲基嘌呤或嘧啶或5-甲基胞苷。
(2)已经是所提供的治疗剂的一部分的替换，例如，硫代磷酸酯-交联的寡核苷酸。
(3)水解或降解至上述两种特性中的一种的替换，例如，甲基磷酸酯-交联的寡核苷酸。
本发明的适体包括由此所述的适体药物化学方法制备的适体。
本发明的适体的目标结合亲和力可以通过一系列适体和目标(例如，一种蛋白质)之间的结合反应而测定，其中32P-标记的适体与缓冲液重的系列稀释目标共孵育，并使用真空过滤集合管通过硝酸纤维素膜过滤分析。这里所指的斑点印记方法，使用三层(由上到下)由硝酸纤维素，尼龙膜，和凝胶斑点纸组成的膜介质。与目标结合的RNA被纤维素过滤膜捕获，而非-目标结合RNA在尼龙过滤膜上被捕获。凝胶斑点纸作为其他过滤膜的支持介质。随着过滤进行，过滤层被分离，干燥并暴露于荧光屏并使用荧光显示系统对齐进行定量。量化结果可以用于生成适体结合曲线，其中可以计算分离常数(KD)。一个优选实施方案中，用于进行结合反应的缓冲液介质是加有0.1mg/ml BSA的1*Dulbecco’s PBS(带有Ca++和Mg++)。
通常，适体调节目标功能活性的能力，例如，适体的功能，可以使用体外和体内模型分析，并且其根据目标的生物学功能而变化。一些实施方案中，本发明的适体可以抑制目标的已知生物学功能，而其他实施方案中，本发明的适体可以刺激目标的已知生物学功能。本发明的适体的功能活性可以使用测定补体成分目标已知功能的体外和体内模型进行分析。
本发明的适体根据本领域中的普通技术人员使用的任何技术，可以常规地适用于诊断目的。诊断应用可以包括体内或体外诊断应用。诊断试剂仅需要可以用于鉴定特定区域或浓度中给定目标的存在。简单地，与目标形成结合对的能力可以有效引发诊断目的的阳性信号。本领域中的技术人员也可以通过本领域已知的方法对适体改造，引入一个标记标签以定位这些配基的存在。这些标签可以在多种诊断方法中使用。
适体治疗剂的药代动力学和生物分布调节
包括适体的所有基于-寡核苷酸的治疗药物，其药代动力学特性与药物应用设计充分匹配是非常重要的。然而直接针对细胞外目标的适体并不耐受细胞内输送相关的困难(如反义和基于-RNAi的治疗情况)，这些适体必须能够分布于目标器官和组织，并且与期望剂量方案相符，在体内维持段一时间(无变化)。
这样，本发明提供了印象字体组合物的药代动力学的材料和方法，并且，特别是，转变适体药代动力学的能力。适体药代动力学的转变能力(例如，调节能力)是通过修饰配基(例如，PEG聚合物)与适体的结合和/或引入修饰核苷(例如，2’-氟或2’-O-甲基)以转变核酸的化学组成而达到的。转变适体药代动力学的能力被应用于改良已有的治疗应用，或可选地，发展新的治疗应用。例如，一些治疗应用中，例如，抗-肿瘤或急性治疗中期望药物的快速清除或失效，则期望减少适体在循环中的残留时间。可选地，其他治疗应用中，例如，在维持治疗中期望维持治疗的系统循环时，可以期望增加适体在循环中的残留时间。
此外，适体药代动力学的转变能力被应用于修饰主体中的适体治疗剂的生物分布。例如，一些治疗应用中，在定位于特定组织类型或特定器官(或一组器官)的应用中，可以期望改变适体治疗剂的生物分布。在这些应用中，适体治疗优先刺激特定的组织或器官。其他治疗应用中，期望目标组织显示细胞标记或一种给定疾病相关的症状，细胞损害或其他非正常病理，从而使适体治疗在受影响的组织中优先积累。例如，如描述于美国临时申请序列号60/550790，2004年3月5日归档，题目为“适体治疗的药代动力学和生物分布的受控调节”，和美国非-临时申请系列号11/075648，2005年3月7号归档，题目为“适体治疗的药代动力学和生物分布的受控调节”，适体治疗的PEG化(例如，20kDaPEG聚合物的PEG化)被用于定位炎症组织，从而使PEG化适体治疗剂优先在炎症组织中聚集。
为测定适体治疗剂(例如，适体共价物或具有改变化学性的适体，如修饰的核苷)的药代动力学和生物分布特性，需监控各种参数。这些参数包括，例如，半衰期(t1/2)，血浆清除率(C1)，分布体机(Vss)，浓度-时间曲线下的面积(AUC)，最大血清或血浆浓度(Cmax)，和适体组合物的平均残留时间(MRT)。这里使用的术语“AUC”指适体治疗剂的血浆浓度相对于适体治疗后时间的曲线下的面积。AUC值用于评估生物利用度(例如，适体给药后在循环中的适体治疗剂的百分率)和/或给定适体治疗剂的全部清除率(C1)(例如，适体治疗剂从循环中清楚的速率)。分布体积与试剂治疗剂的血浆浓度和身体中适体的存在数量相关。Vss越大，血浆外发现的适体越多(例如，更多外渗)。
本发明提供了通过将适体与调节配基相结合，如一种小分子，多肽，或聚合末端基团，或通过在适体中引入修饰核苷，在受控模式中调节稳定的适体组合物的体内药代动力学和生物分布的的材料和方法。如此所述，与修饰配基的结合和/或核苷化学组合物的改变可以改变适体循环残留时间和组织分布的基本方面。
除了核酸酶的清除作用，核苷治疗剂还受限于肾过滤排除功能。因此，通过静脉内给药的抗-核酸酶的寡核苷酸的体内半衰期小于10分钟，除非过滤功能可以被抑制。可以通过促进从血流进入组织的快速分布速度或增加寡核苷酸的适体分子量，使其超过肾小球的截止大小而完成。小治疗剂与PEG聚合物的结合(PEG化)，如下所述，可以显著地增长适体在循环中的残留时间，从而减少给药频率并增强针对血管目标的效力。
进一步，眼部组织的适体过滤也可以被调整，特别是被抑制，通过与PEG聚合物结合增加本发明的适体的表观分子量。
适体可以与各种修饰配基结合，如高分子量聚合物，例如，PEG；多肽，例如，Tat(HIV Tat蛋白的13个氨基酸片段(Vives，等(1997)，J.Biol.Chem.272(25)：16010-7))，Ant(来源于果蝇触角同源蛋白第三螺旋的16-氨基酸序列(Pietersz，等(2001)，Vaccine 19(11-12)：1397-405))和Arg7(一种短的，聚合精氨酸组成的正电荷细胞-渗透多肽(Arg7)(Rothbard，等(2000)，Nat.Med.6(11)：1253-7；Rothbard，J等(2002)，J.Med.Chem.45(17)：3612-8))；和小分子，例如，亲脂性化合物如胆固醇。这里所述的各种结合中，与PEG基团的结合最明显地影响适体的体内特性。例如，上述的非-临时申请(美国系列号，11/075648，2005年3月7日归档，题目为“适体治疗剂药代动力学和生物分布的受控调节”)，适体与20kDa PEG聚合物的结合阻抑的肾过滤并促进适体在健康和炎症组织中的分布。此外，20kDa PEG-多肽聚合物与40dDa PEG聚合物对适体的肾过滤阻抑效果类似。虽然PEG化的一种效应是适体清除，20kDa配基提供的延长的系统暴露时间有助于适体在组织中的分布，特别是那些高度灌注的器官和炎症部位。适体-20kDa PEG聚合结合物使适体直接定位于炎症部位，使得PEG化适体优先在炎症组织中聚集。一些情况中，20kDa PEG化适体结合物可以接近细胞内部，例如，肾细胞。
综上所述，低分子量配基，包括胆固醇和细胞渗透多肽对适体药代动力学和组合分布的影响明显小于PEG化或核苷修饰(例如，化学成分的改变)造成的影响。然而，不期望受限于理论，具显示胆固醇-介导的与血浆脂蛋白的结合，假设其发生在反义结合状态下，被排除在特的别适体-胆固醇结合折叠结构之外，并且/或者与胆固醇基团的亲脂性相关。与胆固醇类似，相对于48小时时肾脏中高水平的结合物，Tat多肽标签促进适体从血流中的清除。本文中已报导的介导大分子在体外通过细胞膜的其他多肽(例如，Ant，Arg7)，不促进适体在循环中的清除。然而，相似于Tat，相对于其他适体，Ant结合物显著地在肾脏中聚集。然而，不期望受限于理论，Ant和Arg7多肽修饰配基可能对适体的体内三维折叠产生不利影响，削弱这些多肽影响适体转运特性的能力。
修饰核苷也可以用于调整适体的血浆清除。例如，非结合的适体与例如，2′-氟，2′-OMe，和/或稳定其化学性的硫代磷酸酯的整合，其在目前制备的显示高水平体外和体内核酸酶稳定性的适体中具有典型性，与非修饰合适相比，显示了血浆中的快速清除(例如，快速血浆清除率)和组织中的快速分布，主要分布于肾脏中。
PAG-派生的核酸
如上所述，高分子量非免疫原性的核酸派生物具有改变核酸药代动力学和药效学特性的潜力，使其称为更有效的治疗药物。活性的有力改变可以包括增加对核酸的抗性，减少肾过滤，减少免疫系统的暴露，并改变治疗剂在身体中的分布。
本发明的适体组合物可以由聚烷撑二醇(″PAG”)配基派生。PAG-派生的核酸的实施例见美国专利申请系列号10/718833，2003年11月21日归档，其通过在此引述全部合并与本文。本发明中使用的典型的聚合物包括聚(乙二醇)(″PEG：″)，聚(乙撑氧)(“PEO”)和聚丙烯醇(包括聚异丙烯醇)。此外，不同的烯氧化物(例如，乙烯氧化物和丙烯氧化物)可以在许多应用中使用。其最常用的形式，聚乙二醇，如PEG，是一种在每一个末端具有羟基基团：HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH的线性聚合物。该聚合物，alha-，omega-二羟基聚(乙二醇)，也可以由HO-PEG-OH表示，其被理解为-PEG-符号表示以下结构单元：-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中n典型的范围为4至10000。
适合于治疗的PAG聚合物典型地具有在水中和许多有机溶剂中的可溶性，无毒性，并无免疫原性的特征。我们使用的PAG将聚合物与非水溶性分子共价结合，使得PAG-分子“结合物”具可溶性。例如，具显示非水溶性药物紫杉醇，当与PEG结合时，变得具有水溶性。Greenwald，等，J.Org.Chem.，60：331-336(1995)。PAG结合物通常不仅仅用于增强可溶性和稳定性，也可以延长分子的血液循环半衰期。
PAG派生物，例如，PAG结合物，改变治疗剂的生物分布的能力与许多因素相关，包括结合物的外观大小(例如，以水力半径测定的)。已知更大的结合物(＞10kDa)更有效地抑制肾过滤，并且从而增加小的高分子(例如，多肽，反义寡核苷酸)的血清半衰期。具显示，PEG结合物抑制过滤的能力将随PEG的大小增高至50kDa而增大(由于半衰期将由巨噬细胞-介导的代谢而非肾过滤被定义，使得进一步的增加具有很小的效应。)
本发明的PAG派生的化合物大小典型地为5至80kDa之间，然而任何大小都可以被使用，该选择依赖于适体和其应用。其他本发明的PAG派生的化合物大小为10至80kDa之间。而其他他本发明的PAG派生的化合物大小为10至60kDa之间。本发明的组合物的PAG配基大小范围为10，20，30，40，50，60，或80kDa。以下实施方案中，PEG是线性PEG，而其他实施方案中，PEG是分支PEG。其他实施方案中PEG是图4中描述的40kDa分支PEG。一些实施方案中，如图5所示，40kDa分支PEG与适体的5′末端连接。
本发明提供了合成高分子PEG-核酸(优选地，适体)结合物，包括多重PEG化核酸的经济方法。本发明也包括PEG-连接的多体寡核苷酸，例如，二聚适体。在生物-表达的蛋白治疗剂中，核酸治疗剂典型地从活性单体核苷化学合成。PEG-核酸结合物可以通过运用相同的重复单体合成整合PEG而制备。例如，通过转变为亚磷酰胺形式激活的PEG可以整合入固相寡核苷酸合成。可选地，可以通过位点-特异整合入PEG结合反应位点而完成寡核苷酸的合成。
活性PEG
高分子量的PEG(＞10kDa)的制备可能是困难的，低效的，并且昂贵的。在合成高分子量PEG-核酸结合物的过程中，先前的工作关注于制备高分子量的活性PEG。自闭这些分支的方法包括制备线性活性PEG，或分支活性PEG，其中两个或多个PEG与带有活性基团的中心结合。这些高分子量PEG分支的末端部分，例如，相关的非-反应羟基(-OH)基团，可以被激活，或转变为功能基团，以使一种或多种PEG与其他化合物通过反应位点相连接。分支的活性PEG将具有超过两个末端，在两个或更多末端被激活的情况下，这些活性高分子量PEG分支在此称为多重-活性PEG。一些情况中，分支PEG分子中不是所有末端都被激活。分支PEG分子的任何两个末端被激活的情况中，该PEG分子指双-活性PEG。分支PEG分子的任何两个末端被激活的情况中，该PEG分子指双-活性PEG。分支PEG分子的一个末端被激活的情况中，该PEG分子指单-活性。作为该途径的一个实施例，描述了通过将两个单甲氧基PEG与随后被激活的赖氨酸中心连接制备活性PEG的方法(Harris等，Nature，vol.2：214-221，2003)。
如图6所示，线性PEG分子是双-功能的，并有时称为“PEG二醇”。PEG分子的末端部分是相对的非-反应羟基基团，-OH基团，其可以被激活，或转变为功能基团，使PEG与其他化合物通过反应位点连接。这些活性PEG二醇在此指双-活性PEG。例如，可以通过将相对非-反应羟基基团，-OH，替换为来源于N-羟基琥珀酰亚胺的琥珀酰亚胺活性酯基团，使PEG二醇的末端配基成为具有与氨基基团进行选择反应的活性碳酸酯而功能化。可选地，PEG二醇可以由许多基团激活，包括但不限制于α-卤代乙酸，epihalohydrines，马来酸，酒石酸和碳酸，其在适当的操作后可以制备结合的活性羰基或类似物。其他激活PEG的方法描述于Roberts等，(2002)Advanced Drug Deliver Reviews 54：549-476，通过在此引述全部合并于本文。使用一种前述方法激活PEG之外，PEG分子的一个或两个末端的乙醇功能团可以被修饰以结合不同类型的核酸。例如，将末端乙醇功能团转变为氨基，或硫醇，可以结合尿素和硫代尿烷。
许多应用中，期望于将PEG分子的一个末端用充分非-反应基团封闭，使PEG分子称为单-功能(或单-活性的)。在通常显示多重活性PEG活性位点的蛋白质治疗剂中，双-功能活性PEG导致额外的交联，产生低活性聚集。为制备单-活性PEG，PEG二醇分子末端的一个羟基典型地替换为非-活性甲氧基末端基团，-OCH3-。而另一个非-封闭的PEG分子末端典型地转变为反应末端基团，其可以被激活，与一种表面或分子，如蛋白质的反应位点连接。
连接一个或更多PEG的适体
最常见地，通过在5′-末端增加自由伯胺(在固相合成的最后偶联步骤使用修饰亚磷酰胺整合)合成高分子量PAG-核酸结合物。使用该方法，反应PEG(例如，其被激活以与氨基反应和形成交联)与纯化的寡核苷酸结合并且在溶液中进行交联反应。
此外，高分子量PAG-核酸-PAG结合物可以通过将单功能活性PEG与包括超过一个反应位点的核酸反应制备。一个实施方案中，核酸是双-反应活性的，并且包括两个反应位点：通过常规亚磷酰胺合成并且以3′-氨基固相支持起始，将5′-氨基基团和3′-氨基基团整合入寡核苷酸，例如：图6中描述的3′-5′-双-PEG化。可选的实施方案中，反映位点可以在内部位点引入，使用嘧啶的5-位点，嘌呤的8-位点，或核糖的2′-位点作为连接伯胺的位点。该实施方案中，核酸可以具有几个活性或反应位点并且是多重活性的。
为制备核酸-PEG-核酸结合物，核酸被首先合成，从而其具有单活性位点(例如，其是单-活性的)。优选实施方案中，反应位点是通过在寡核苷酸固相合成最后步骤中增加修饰亚磷酰胺，在5′-末端整合入的一个氨基基团。另一优选实施方案中，使用3′-氨基修饰物，加上在5′-末端引入氨基完成合成，产生3′，5′-双-氨基寡核苷酸。通过对修饰的寡核苷酸去蛋白和纯化，其在溶液中以高浓度再生，使活性PEG的自然水解最小化。优选实施方案中，寡核苷酸的浓度是1mM，再生溶液包括200′mM NaHCO3-缓冲液，pH8.3。连接物的合成是通过缓慢的，逐步地增加高纯度的活性PEG起始的。优选实施方案中，PEG被激活为p-硝基苯基碳酸盐。随着反应进行，PEG-核酸结合物通过凝胶电泳或液相色谱纯化以分离完全的-，部分-，和非-结合物质。
结合一个PEG的多重适体
本发明也包括高分子量适体组合物，其中两个或多个核酸配基共价结合至少一个聚烷撑二醇基团。聚烷撑二醇基团作为一种稳定基团。稳定基团是一种分子，或分子的一部分，其可以改善本发明的高分子量适体组合物的药代动力学和药效学特性。一些情况中，稳定基团是一种分子或分子的一部分，其可以使两个或更多适体，或适体区域接近，或提供本发明的高分子量适体组合物的减少的整体转动自由度。稳定基团可以是聚烷撑二醇，如聚乙二醇，其可以是线性或分支的，单聚物或杂聚物。其他稳定基团包括多肽核酸(PNA)等聚合物。寡核苷酸也可以是一种稳定基团；这些寡核苷酸可以包括修饰核苷，和/或修饰联接；如硫代磷酸酯。
稳定基团可以是适体组合物的内部部分，例如，其与适体共价结合。在一种聚烷撑二醇共价结合适体任一末端的组合物中，如聚烷撑二醇与核酸基团共同连接在一个分子中，该聚烷撑二醇称为连接基团。这些组合物中，联接分子的最初结构包括线性排列的核酸-PAG-核酸。在一种组合物的实施例中，其中PEG稳定基团作为适体的分离不同部分的联接，是一种PEG与单适体序列连接的组合物，从而高分子量适体组合物的线性排列是，例如，核酸-PEG-核酸(-PEG-核酸)n，其中n大于等于1。
为制备核酸-PEG-核酸结合物，核酸被最初合成从而其带有一个单一反应位点(例如，其是单-活性的)。优选实施方案中，反应位点是一种通过寡核苷酸的固相合成最后步骤中引入额外的修饰硫代磷酸酯，在5′-末端引入的一个氨基基团。将修饰核苷去蛋白和纯化后，其在溶液中以高浓度再生，使活性PEG的自然水解最小化。优选实施方案中，寡核苷酸的浓度是1mM，再生溶液包括200mM NaHCO3-缓冲液，pH8.3。连接物的合成是通过缓慢的，逐步地增加高纯度的双-功能PEG起始的。优选实施方案中，通过衍生为硝苯基碳酸酯，PEG二醇的两个末端都被激活(双-活性)。随反应进行，PEG-核酸结合物通过凝胶电泳或液相色谱纯化以分离完全的-，部分的-，和非-结合的物质。多重PAG分子连接(例如，随机或模块聚合物)或更小的PAG链可以相连接以获得不同长度(或分子量)。非-PAG连接可以在不同长度的PAG链之间使用。
连接区域可以具有一个或多个与其相连的聚烷撑二醇基团。这些PAG可以是不同长度并以适当的组合使用以获得组合物的期望分子量。
特定连接物的效果可以受其化学组成和长度影响。太长，或太短，或形成不宜的空间排列的连接物和/或与补体成分目标的离子交互作用将影响适体和补体成分目标间复合物的形成。一种连接物，其长于核酸间跨度所需，将通过减少联接的效应浓度减弱结合稳定性。这样，有必要经常对联接组合物和其长度进行优化以使适体对目标的亲和力达到最大。
对补体系统蛋白C5具有结合亲和力的适体
一些实施方案中，本发明的材料和方法包括一系列特异结合补体蛋白C5并对其功能调节的15至60核苷长度的核酸适体，例如，阻抑补体蛋白C5体内活性和/或细胞-基础的化验的活性。
本发明的一些实施方案中，描述了可以特异结合并调节补体蛋白C5的适体。这些适体提供了低-毒性，安全性，和治疗有效形态，改良和/或防止各种补体-相关的疾病或失调，例如，补体-相关的心脏失调(例如，心肌损伤；冠状动脉搭桥术(CABG)相关的C5介导的补体并发症如手术后出血，系统嗜中性细胞和白细胞活性，增加心肌梗死危险，并增加认知功能紊乱；再狭窄；和经皮冠状动脉介入治疗相关的C5介导的补体并发症)，缺血再灌注损伤(例如，心肌炎症，中风，冻伤)，补体相关的炎症失调(例如，哮喘，关节炎，脓血症，和器官移植后排斥)，和补体-相关的自身免疫失调(例如，重症肌无力，系统性红斑狼疮(SLE))。其他期望的C5抑制症状包括，例如，肺部炎症(Mulligan等，(1998)J.Clin.Invest.98：503)，体外补体活性(Rinder等，(1995)J.Clin.Invest.96：1564)，抗体-介导的补体活性(Biesecker等，(1989)J.Immunol.142：2654)，血管球性肾炎和其他肾病，眼部症状如C5介导的眼部组织损伤，例如，糖尿病视网膜病，渗出性和/或非-渗出性年龄相关黄斑变性(AMD)，阵发性睡眠性血红蛋白尿症。这些适体也可以用于诊断。
一些实施方案中，本发明的低毒性，安全，和有效调节的适体可以在发明的方法中用于治疗，稳定和/或防止不同补体-相关眼部疾病或失调，包括，例如，急性或慢性炎症和/或免疫-介导的眼部失调，炎症性结膜炎，包括过敏性巨乳头性结膜炎，黄斑水肿，葡萄膜炎，眼内炎，角膜溃烂，干眼症，青光眼，糖尿病视网膜病，角膜移植排斥，眼部手术相关的并发症，如人工晶体植入术和白内障手术相关的炎症，Behcet′s疾病，免疫复合脉管炎，Fuch′s疾病，小柳原田病，亚视网膜纤维化，角膜炎，玻璃体-视网膜炎，眼部寄生虫感染/转移，色网膜色素变性，巨细胞病毒视网膜炎(“AMD”)，非-渗出性(“干性”)AMD，或眼部新生血管化失调，包括糖尿病视网膜炎或渗出性(“湿”)AMD。这些适体也可以在眼部诊断中使用。
这些适体也可以包括这里描述的修饰，例如，与亲脂性或高分子量化合物(例如，PEG)连接，整合帽子基团，整合修饰核苷，并对磷酸骨架进行修饰。
本发明的一个实施方案中，提供了一个分离的，非-自然发生的结合C5补体蛋白的适体。另一实施方案中，提供了在本发明的方法中使用，以治疗，稳定和/或预防补体-介导的眼部失调的分离的，非-自然发生的结合C5补体蛋白的适体。一些实施方案中，分离的，非-自然发生的适体与C5补体蛋白的分离常数(“Kd”)小于100μM，小于1μM，小于500nM，小于100nM，小于50nM，小于1nM，小于500pM，小于100pM，小于50pM。本发明的一些实施方案中，分离常数是以下列实施例1中描述的斑点染色滴定方法测定的。
另一实施方案中，本发明中使用的适体调节C5补体蛋白的功能，特别是抑制C5补体蛋白功能和/或C5补体蛋白变体功能。这里使用的C5补体蛋白变体包括执行与C5补体蛋白充分类似功能的变体。C5补体蛋白变体合适地充分包括相同的结构，并且一些实施方案中与包括下列氨基酸序列的C5补体蛋白的氨基酸序列(系列号：102)(引用于Haviland等，J Immunol.1991年1月1日；146(1)：362-8)相比，包括至少80％的序列一致性，更合适地包括至少90％序列一致性，更适合地包括至少95％序列一致性。
本发明的一些实施方案中，与目标变体一致的序列是使用下述的BLAST测定的。两个或更多核酸或蛋白序列间的术语“序列一致”，指使用以下一种序列比较程序或通过目检方法，与最高对应的排列相比，两种或更多序列或亚序列间具有相同的或特定百分比相同的氨基酸残基或核苷。对于序列比较，典型地，一种序列被作为参考序列，与另一测试序列比较。当使用序列比较程序时，测试和参考序列被输入电脑，如有需要则指明亚序列同等物，并设计序列算法程序常数。序列比较程序随后根据设计的程序常数计算测试序列与参考序列间的序列一致百分比。可以执行以下最佳的序列比较程序，例如，定位同源算法，Smith&Waterman，Adv，Appl.Math.2：482(1981)，同源阵列算法，Needleman&Wunsch，J Mol.Biol.48：443(1970)，相似方法的研究，Pearson&Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444(1998)，这些算法的计算机处理(GAP，BESTFIT，PASTA，和Wisconsin遗传软件包中的TFASTA，遗传计算机组，575Scinece Dr.，Madison，Wis.)，或通过目检(通常见下列，Ausubel等)。
适合于测定序列一致百分比的算法是基础定位算法研究工具中使用的算法(以下的“BLAST”)，见，例如，Altschul等，JMol.Biol.215：403-410(1990)和Altschul等，Nucleic Acids Res，15：3389-3402(1997)。执行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(以下的“NCBI”)公开获得。使用NCBI中软件，例如，BLASTN(核酸序列)和BLASTP(氨基酸序列)测定序列一致性的默认参数描述于McGinnis等，Nucleic Acids Res，32：W20-W25(2004)。
本发明的另一实施方案中，提供了与包括下列任何一种适体充分相同的结合C5补体蛋白的能力：系列号：1-2，5-67，75-81，83或88-98。本发明的另一实施方案中，适体具有包括下列任何一种适体充分相同的结构和结合C5补体蛋白的能力：系列号：1-2，5-67，75-81，83或88-98。本发明的实施方案中，本发明的适体具有的序列，包括任何化学修饰，对应于任何系列号：1-2，5-67，75-81，83或88-98。另一实施方案中，本发明的适体作为药物组合物中的活性成分使用。另一实施方案中，适体或包括本发明的适体的组合物用于治疗多种包括任何从以下组中选择的补体-相关的疾病或失调：补体-相关心脏失调(例如，心肌损伤；冠状动脉搭桥术(CABG)相关的C5介导的并发症，如术后出血，嗜中性粒细胞和白细胞活性，增加心肌梗死和认知紊乱的危险；在狭窄；和经皮冠状动脉介入治疗相关的C5介导的补体并发症)，缺血再灌注损伤(例如，心肌梗死，中风，冻伤)，补体-相关的炎症失调(例如，哮喘，关节炎，脓血症，和器官移植后排斥)，和补体-相关的自身免疫失调(例如，重症肌无力，系统性红斑狼疮(SLE)，肺炎，体外补体活性，抗体-介导的补体活性和补体相关的眼部疾病，如糖尿病视网膜炎以及年龄-相关的黄斑变性(AMD)。
一种实施方案中，本发明的抗-C5适体包-氟修饰核苷，2′-OMe修饰核苷-OMe”)和2′-OH嘌呤残基的混合物。修饰的抗C5适体的描述性序列(系列号：1)见下表1，其结构见图3A。大多数嘌呤和(A和G)具有2′-OMe，除了仅有两个G残基仍为2′-OH(突出显示的残基)。带圈的残基表示可以同时修饰为2′-H而不充分改变适体的抗C5活性的嘧啶组群(见下表1中的ARC330(系列号：2，图3B))。图3A中下划线显示的残基表示可以包括2′-氟和2′-H修饰(但不是2′-OMe)的嘌呤残基，而带框的残基表示可以包括2′-氟或2-OMe修饰(但不是2′-H)的嘧啶残基。带有箭头()的残基必须含有2′-氟修饰。带有箭头()的残基如果不含有2′-氟修饰，将使适体的溶血活性显著减弱。优选实施方案中，本发明的抗-C5适体包括对应于系列号：1中的核苷序列。
根据本发明的抗-C5适体的实施例是ARC186(系列号：4)，其在图3C中显示并描述于美国专利系列号6395888，其通过在此引述全部合并于本文。ARC186的所有21个嘧啶残基具有2′-氟修饰。主要的嘌呤(14个残基)具有2′-OMe修饰，除了三个为2′-OH嘌呤残基(图3C中突出显示)。本发明的抗-C5适体也可以包括不同的2′-氟和2′-H修饰的混合。例如，本发明的另一抗-C5适体是图3B中的ARC330(系列号：2)。ARC330(系列号：2)包括7个2′-H修饰(图3B中画圈表示)，14个带有2′-氟修饰的嘧啶残基，14个2′-OMe修饰的嘌呤残基，和三个2′-OH嘌呤残基(图3B中突出表示)。
下表1表述了其他的包括2′-氟修饰，2′-OMe修饰，2′-OH嘌呤残基，和连接非-免疫原性，不同大小的高分子量化合物(例如，PEG)的适体的组合物，其每一个都来源于ARC186(系列号：4)。本发明包括下表1描述的适体。本发明也包括下列描述的但缺失所需的3′帽子(例如，反向脱氧嘧啶帽)的适体和/或下列描述的包括3′帽子(例如，反向dT)的适体，其中该3′帽子是非需要的。
本发明的一些实施方案中描述的方法中使用的抗-C5适体可以是包括任何下列描述的适体：序列号NOS 1至69，75，76，81，91，95和96。
除非另有说明，下表1中的核酸序列以5′至3′反向表示。对于表1中的每个序列，所有2′-OMe嘌呤或嘧啶修饰以相应核苷前的“m”表示；所有2′-氟嘧啶修饰以相应核苷前的“f”表示；所有嘌呤或嘧啶的脱氧修饰以相应核苷前的“d”表示；任何无“m”，“f”，或“d”显示的嘌呤或嘧啶表示2′-OH残基核苷。进一步，“3T”表示反向脱氧嘧啶，“NH”表示己胺连接，“NH2″表示己胺末端，″PEG”表示具有特定分子量的聚乙二醇基团，“biotin”表示5′具有生物素连接的适体。
表1：
序列号：1
X1X2fCfCrGfCX3X4fUX5X6X7X8X9X10X11rGX12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23fUfUX24X25X26X27X28fCX29
其中：
X1＝fC或mC
X2＝rG或gy
X3＝rG或mG
X4＝rG或mG
X5＝fC或dC
X6＝fU或dT
X7＝fC或dC
X8＝rA或mA
X9＝rG或mG
X10＝rG或mG
X11＝fC或dC
X12＝fC或mC
X13＝fU或mU
X14＝rG或mG
X15＝rA或mA
X16＝rG或mG
X17＝fU或dT
X18＝fC或dC
X19＝fU或dT
X20＝rG或mG
X21＝rA或mA
X22＝rG或mG
X23＝fU或dT
X24＝rA或mA
X25＝fC或dC
X26＝fC或dC
X27＝fU或dT
X28＝rG或mG
X29＝rG或mG
ARC330(序列号：2)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC185(序列号：3)
GAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUfUfCGfUfC
ARC186(序列号：4)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC187(序列号：5)
40kDa PEG--NH-fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3TWhere the branched 40kDa PEG is，3-bis(mPEG-[20kDa])-propyl-2-(4’-butamide)
ARC188(序列号：6)
AGGAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUfUfCGfUfC
ARC189(序列号：7)
AGfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC250(序列号：8)
GGfCGfCfCGfCGGfUfCfUfCAGGfCGfCfUGAGfUfCfUGAGfUfUfUAfCfCfUGfCG
ARC296(序列号：9)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGfCmG-3T
ARC297(序列号：10)
mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGmCmG-3T
ARC331(序列号：11)
dCmGdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGdCmG
ARC332(序列号：12)
dCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC333(序列号：13)
fCmGdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC334(序列号：14)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGdCmG
ARC411(序列号：15)
fCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC412(序列号：16)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGmCmG
ARC413(序列号：17)
mCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC414(序列号：18)
mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGmCmG
ARC415(序列号：19)
fCmGfCdCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC416(序列号：20)
fCmGfCfCGdCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARCA17(序列号：21)
fCmGfCdCGdCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC418(序列表：22)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGdCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC419(序列表：23)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCTmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC420(序列号：24)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGdCTmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC421(序列表：25)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGTfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC422(序列号：26)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUTfUAfCfCfUmGfCmG
ARC423(序列表：27)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUTAfCfCfUmGfCmG
ARC424(序列表：28)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGTTTAfCfCfUmGfCmG
ARC425(序列号：29)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCTmGfCmG
ARC426(序列表：30)
fCmGfCfCGfCmGmGmUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGfCmG
ARC427(序列表：31)
fCmGfCmCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC428(序列号：32)
fCmGfCfCGmCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfGfUmGmAmGTdGTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARCA29(序列号：33)
fCmGfCmCGmCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC430(序列号：34)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGmCfUmGmAmGfUdCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARCA31(序列表：35)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGfCmUmGmAmGfUdCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCm
ARC432(序列号：36)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGfUdCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC433(序列号：37)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdGTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGmUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC434(序列号：38)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUmUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC435(序列号：39)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUmUAfCfCfUmGfCmG
ARC436(序列号：40)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGmUmUmUAfCfCfUmGfCmG
ARC437(序列号：41)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCmUmGfCmG
ARC438(序列表：42)
fCmGfCfCdGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC439(序列表：43)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCdGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC440(序列号：44)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUdAfCfCfUmGfCmG
ARC457(序列号：45)
mGfCmGfUfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmAfCmGmC
ARC458(序列号：46)
mGmGmGfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmCmCmC
ARC459(序列号：47)
mGfCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGmC
ARC473(序列号：48)
mGmGmAfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGfUfCfU-3T
ARC522(序列号：49)
mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGTdCTmGmAmGTfUfUAdCdCTmGfCmGmCmC
ARC523(序列号：50)
mGmGmCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGTdCTmGmAmGTTTAdCdCTmGdCmGmCmC
ARC524(序列号：51)
mGmGmCmGdCdCGdCmGmGTdCTdCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGTdCTmGmAmGTTTmAdCdCTmGdCmGmCmC
ARC525(序列号：52)
mGmGmCmGdCdCGdCmGmGTdCmUmCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGmUmCmUmGmAmGTTTmAdCdCTmGdCmGmCmC
ARC532(序列号：53)
Biotin-AGfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC543(序列号：54)
mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGmCmC
ARC544(序列号：55)
mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUmCmUmCmAmGmGmCGfCfUmGmAmGmUmCmUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGmCmC
ARC550(序列号：56)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUmAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC551(序列号：57)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC552(序列号：58)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGTfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC553(序列号：59)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUmAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC554(序列号：60)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGmAmGTfUfUmAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC 657(序列号：61)
20kDa PEG-NH-fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC 658(序列号：62)
30kDa PEG-NH-fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC 672(序列号：63)
NH2-fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC706(序列号：64)
10kDaPEC-NH-fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC1537(序列号：65)
40kDa PEG-NH-fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC1730)(序列号：66)
PEG20K-NH-fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-NH-PEG20K
ARC1905(序列号：67)
40K PEG-NH--fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3TWhere the branched 40kDa PEG is 2，3-bis(mPEG-[20kDa])-propyl-1-carbamoyl
ARC243(序列号：68)
GGfCGAfUfUAfCfUGGGAfCGGAfCfUfCGfCGAfUGfUGAGfCfCfCAGAfCGAfCfUfCGfCfC
ARC244(序列号：69)
GGfCfUfUfCfUGAAGAfUfUAfUfUfUfCGfCGAfUGfUGAAfCfUfCfCAGAfCfCfCfC
本发明进一步包括下表2中的适体。表2中的适体以5′至3′方向表示，并显示了以dRmY SELEXTM条件下选择的适体的核糖序列。本发明中源于该选择的一些实施方案中(在所列的序列中反应)，嘌呤(A和G)是脱氧的而嘧啶(U和C)2′-OMe。一些实施方案中适体包括一个帽子(例如，3′-反向dT)。一些实施方案中适体包括一种PEG。
表2/dRmY抗-C5适体
本发明的结合补体蛋白C5的其他适体在下列实施例3中描述。C5特异的适体进一步包括美国临时专利申请60/544542，60/547747，60/581685和60/608048，其每一个通过在此引述全部合并于本文。
一些实施方案中，本发明的适体治疗剂具有对其目标更大的亲和力和特异性，并当适体治疗剂在病人或主体体内破碎时减少非自然发生的核苷替换造成的副作用。一些实施方案中，本发明的包括适体的治疗组合物不含有或含有较少的氟化核苷。
本发明的适体可以使用任何领域中已知的寡核苷酸合成技术合成，包括本领域中已知的固相寡核苷酸合成技术(见，例如，Froehler等，Nucl.Acid.Res.14：5399-5467(1986)和Froehler等，Tet.Lett.27：5575-5578(1986))和液相方法如三酯合成方法(见，例如，Sood等，Nucl.Acid Res.4：2557(1997)和Hirose等，Tet.Lett，28：2449(1978))。
本发明也包括在稳定，治疗和/或预防眼部失调的方法中，与本发明的PDGF和/或VEGF和/或其同源受体PDGFR和VEGFR特异的适体联合使用抗-C5药物。相应地，上述描述的方法也可以用于制备本发明的适体，以抑制配基(例如，PDGF或VEGF)与其目标如同源受体的结合。
本发明的方法中使用的抗-PDGF适体的实施例描述于国际专利申请号PCT′/US2005/039975，归档于2005年11月2日，通过在此引述全部合并于本文，特别是描述的ARC513，ARC594，ARC127和ARC404。
本发明的方法中使用的VEGF特异适体的实施例描述于美国专利系列号：5919455，5932462，6113906，6011020，6051698和6147204。例如，与本发明的抗-C5药物联合使用的治疗眼部失调的适体可以是以PEG化或非PEG化的EYE001(先前的NX1838)，特别是pegaptanib纳注射液(Eyetech Pharmaceuticals，Inc和Pfizer，Inc.NY，NY)。
抗-C5抗体药物
本发明的抗-C5药物包括直接针对补体蛋白C5的拮抗抗体和其在C5介导的眼部失调的治疗中的应用。本发明的C5拮抗抗体紧密地结合C5并防止其活性和裂解。特别实施方案中，发明包括对主体施用抗-C5抗体以减少，稳定和/或预防眼部失调的至少一种症状，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非渗出性AMD症状。
本发明的拮抗抗体包括单克隆抑制抗体。单克隆抗体，或其片段，包括所有免疫球蛋白家族，如IgM，IgG，IgD，IgE，IgA，或其亚组，如IgG亚组或其混合物。IgG和其亚组作为IgG1，IgG2，IgG2a，IgG2b，IgG3或IgGM。IgG亚型IgG.sub.1/kapa和IgG.sub.2b/kapp包括在使用实施方案中。值得关注的片段是所有平末端或修饰的抗体片段，其具有一个或两个抗原补充结合位点，对哺乳动物C5具有高结合和中和活性，如由轻链和重链组成的具有对应于抗体结合位点的抗体的一部分，如Fv，Fab或F(ab′)2片段，或单-股片段。平末端的双-链片段如Fv，Vab或F(ab′)2是特别有用的。这些片段可以通过酶方法获得，如通过化学氧化或通过抗体基因的遗传操作，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶将Fc部分从抗体上去除。也可以并且是有利地使用遗传突变的，非-平末端的片段。
新的抗体，抗体片段，或其派生物的混合物对于C5的结合亲和力范围为1*10-7M至1*10-12M，或1*10-8M至1*10-11M，或1*10-9M至5*10-10M。
用于遗传操作的抗体基因可以由技术人员从杂交瘤细胞中分离。出于此目的，制备抗体的细胞是培养的，当细胞充分达到最佳密度时，通过已知的方法用异硫氰酸胍裂解细胞，醋酸钠酸化，酚抽提，氯仿/异戊醇处理，异丙醇沉淀并用乙醇洗涤，从细胞中分离mRNA。应用反转录由mRNA合成cDNA。合成的cDNA可以直接或经遗传操作后被插入，例如，通过位点-直接变异，引入插入，倒置，删除，或碱基替换入合适的动物，真菌，细菌或病毒载体并在合适的宿主组织中表达。用于基因克隆在在细菌，如E.coli或酵母，如酿酒酵母中表达的有用的细菌或酵母载体是pBR322，pUC18/19，pACYC184，lambda或酵母mu载体。
本发明进一步涉及合成C5抗体的细胞。其包括如上所述转化后的动物，真菌，细菌细胞或酵母细胞。其方便地为杂交瘤细胞或三源杂交瘤细胞，典型地为杂交瘤细胞。这些杂交瘤细胞可以被制备，例如，以一种已知的方法从C5免疫的动物中分离其抗体-生产B细胞，选择C5-结合抗体的细胞并随后与这些细胞融合，例如，人类或动物的，例如，小鼠黑色素瘤细胞，人类淋巴母细胞细胞或同源杂交瘤细胞(见，例如，Koehler等，(1975)Nature 256：496)或以合适的病毒感染这些细胞以制备永生细胞系。通过融合制备的杂交瘤细胞系是有用的，小鼠杂交瘤细胞系是特别有用的。本发明的杂交瘤细胞系分泌有用的IgG型抗体。本发明的mAb抗体以高亲和力结合补体蛋白C5并减少或中和其生物学活性(如，C5的裂解)。
本发明进一步包括这些抗-C5抗体的派生物，其保留C5-抑制活性，而改变一种或多种与其作为药物制剂相关的其他特性，例如，血清稳定性或制备有效性。这些抗-C5-抗体派生物的实施例包括多肽，抗体的抗原-结合区域的拟肽，和与固体或液体载体如聚乙二醇，玻璃结合的抗体，抗体片段或多肽，合成的聚合物如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯或自然聚合物如纤维素，凝胶或琼脂糖，或酶联合物，毒素或放射活性或非放射活性标记，如3H，123I，125I，131I，32P，35S，14C，51Cr，36Cl，57Co，55Fe，59Fe，90Y，99mTc，75Se，或共价结合荧光/化学发光标记物如若丹明，荧光素，异硫氰酸酯，藻红蛋白，藻青蛋白，荧光胺，金属螯合物，抗生物素蛋白，链霉素或生物素的抗体，片段，或多肽。
新抗体，抗体片段，混合物，和其派生物可以与上述的载体结合，或与其他药物活性和辅助物质形成药物制剂后，经干燥如冻干后直接使用。所指的活性和辅助物质的实施例是其他抗体，具有杀菌和抑菌活性的抗菌活性物质如常规或磺胺类抗生素，抗肿瘤药物，水，缓冲液，盐，乙醇，脂肪，蜡，惰性介质或其他制备注射剂的常规物质，如氨基酸，稠化剂或糖。这些药物制剂用于治疗疾病，有利于稳定，减少和/或预防至少一种眼部新生血管失调和疾病的症状的发生，包括AMD(渗出性和/或非-渗出性)和糖尿病视网膜炎。
新抗体，抗体片段，其混合物或派生物可以与上述的固体或液体载体，酶，毒素，放射或非放射标记或荧光/化学发光标记连接，直接用于治疗或诊断。
本发明的人类C5单克隆抗体可以通过本领域中已知的方法获得。例如，以人类C5免疫哺乳动物。纯化的人类C5可以商业获得(例如，Quidel Corporation，San Diego，CA或Advanced Research Technologies，San Diego，CA)。可选地，人类C5可以从人类血浆中纯化。制备抗-人类C5抗体的哺乳动物是不受限制的并且可以是灵长类，啮齿类(如小鼠，大鼠或兔子)，牛，绵羊，山羊或狗。
随后，抗体-产生细胞如脾细胞从免疫动物中分离并与骨髓瘤细胞融合。该杂交瘤细胞在本领域中是已知的(例如，p3x63-Ag8-653，NS-0，NS-1或P3U1细胞)。细胞融合超过可以根据本领域中任何常规方法进行。
经细胞融合操作后的细胞在HAT选择培养基中培养以选择杂交瘤。筛选产生抗人类单克隆抗体的杂交瘤细胞。筛选可以通过一些方法进行，例如，三明治酶-联免疫吸收方法(ELISA)或类似方法，其中产生的单克隆抗体与固定人类C5的孔结合。该情况下，可以使用对被免疫动物的免疫球蛋白特异的抗体，如二抗，其带有酶标记如过氧化物酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，beta-D-牛乳糖，或类似物。通过将标记酶与其底物反应并测定产生的颜色对标记进行测定。可以使用底物，如3，3-二氨基联苯胺，2，2-联苯双-o-二茴香胺，4-氯萘，4-氨基安替比林，o-苯二胺或其类似物。
通过上述的操作，可以选择产生抗-C5抗体的杂交瘤。选择的杂交瘤随后通过常规限制稀释方法或软琼脂方法克隆。如期望的，克隆的杂交瘤可以使用血清-包括的或无血清培养基大量培养，或注入小鼠腹腔收获腹水，从而获得大量的克隆杂交瘤。
选择的抗-人类C5单克隆抗体中，那些具有阻止C5裂解能力的抗体(例如，在一个基于细胞的C5方法系统中)被选择进一步分析和处理。如果抗体抑制C5分裂，其意味测试的单克隆抗体具有减少或中和人类C5活性的能力。即单克隆抗体特异识别和/或干涉C5裂解和活性。
这里的单克隆抗体进一步包括杂交和重组抗体，其通过将抗-C5抗体可变(包括超变)区域与不变区域(例如，“人源化”)，或轻链与重链，或一种物种中的链与另一物种中的链相结合，或不同蛋白的融合而制备，不考虑来源的物种或指定的免疫球蛋白组或亚组，以及抗体片断[例如，Fab，F(ab)2，和Fv]，只要其显示期望的生物学活性。[见，例如，美国专利号：4816567和Mage&Lamoyi，单克隆抗体制备技术和应用，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.)，New York(1987)]。
这样，术语“单克隆”表示所获得的抗体的特性是来源于充分同源的抗体组群，并且不要求任何限定的方法进行制备。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler&Milstein，Nature 256：495(1975)中首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(美国专利号：4816567)。“单克隆抗体”也可以从McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)描述的方法制备的噬菌体文库中分离。
非-人类(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式是特别改造的免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab’，F(ab)2或其他抗体的抗原-结合亚序列)，其含有最少的来源于非-人类免疫球蛋白的序列。对于绝大多数，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受纳抗体)，其中受纳抗体补体决定区域(CDRs)的残基被非-人类物种(捐赠抗体)的CDRs中的具有期望特异性，亲和力和结合力的残基替换，如小鼠，大鼠或兔子。一些情况中，人类免疫球蛋白Fv框架区域(FR)残基被对应的非-人类FR残基替换。进一步，人源化抗体可以包括不在受纳抗体也不在插入CDR或FR序列中发现的残基。这些修饰进一步改善和优化了抗体的性能。通常，人源化抗体将充分包括至少一种，典型地为两种，可变区域，其中或有或充分所有的FR残基是人类免疫球蛋白一致序列。人源化抗体合适地也包括免疫球蛋白，典型地为人类免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。
非-人类抗体的人源化方法是本领域中已知的。通常，人源化抗体具有一个或多个非-人类来源的插入氨基酸残基。这些非-人类氨基酸残基通常指“插入”残基，其典型地位于“插入”可变区域。人源化可以按照Winter和co-workers的方法(Jones等，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等，(1988)Nature332：323-327；和Verhoeyen等，(1988)Science239：1534-1536)，通过将啮齿类CDRs或CDR序列替换对应的人类抗体序列而完成。对应的，这些“人源化”抗体是嵌合抗体，其中充分少于一种完整的人类可变区域已经被替换为非-人类物种的对应序列。实践中，人源化抗体是典型的人类抗体，其中一些CDR残基和一些FR残基被啮齿类抗体相同微点的残基替换。
用于制备人源化抗体的轻链和重链中人类可变区域的选择对于减少免疫原性是非常重要的。根据所谓的“最佳-符合”方法，啮齿类抗体的可变区域序列针对人类可变-区域序列的全部已知文库进行筛选。与啮齿类像是的人类序列作为人源化抗体的人类框架(FR)(Sims等，(1993)J.Immunol，151：2296；和Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol，196：901)。另一方法使用来源于所有人类抗体轻链和重链的特定亚组的一致序列的特别框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，89：5285；和Presta等，(1993)J.Immuol，151：2623)。
人源化的抗体保持与抗原的高亲和力和其他有利的生物特性是尤其重要的。为达到该目的，根据一种实用方法，通过分析母本序列和概念化的人源化产物方法，使用母本和人源化序列的三维模型制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型可以商业获得并且在本领域中的技术人员中是熟知的。计算机程序是可行的，其阐明并显示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些显示的观察提供了对候选免疫球蛋白序列机能中残基的可能功能的分析，例如，对残基影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的分析。此方面，FR残基可以被选择并与一致和插入序列合并，从而获得期望的抗体特征，如增加的目标抗原亲和力。通常，CDR残基直接和充分影响抗原的结合。
本发明也包括直接针对C5的人类单克隆抗体。这些抗体可以通过杂交瘤方法制备。已经描述了制备人类单克隆抗体的人类黑色素瘤和小鼠-人异源黑色素瘤细胞系，例如，Kozbor(1984)J.Immunol，133，3001；Brodeur，等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekke，Inc.，New York，1987)；和Boemer等，(1991)J.Imunol.，147：86-95。
目前可以制备转基因动物(例如，小鼠)，其可以通过免疫，在缺失内源性免疫球蛋白生产的情况下，制备完全的人类抗体。例如，具描述嵌合和种系突变小鼠中抗体重链结合区(J.sub.H)基因的纯合子的删除造成内源性抗体产生的完全抑制。转化人类germ-line免疫球蛋白基因队列进入突变小鼠的germ-line，将在受到抗原作用时产生人类抗体(见，例如，Jakobovits等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，90：2551；Jakobovits等，(1993)Nature，362：255-258；和Bruggermann等，(1993)Year in Immuno，7：33)。
可选地，噬菌体显示技术(McCafferty等，(1990)Nature，348：552-553)可以用于从未免疫的志愿者中免疫球蛋白可变(V)区域基因组中体外制备人类抗体和抗体片段(综述见，例如，Johnson等，(1993)Current Opinion in Structural Biology，3：564-571)。几种V-基因片段来源可以用于噬菌体显示。例如，Clackson等，((1991)Nature，352：624-628)从来源于免疫小鼠脾细胞的V基因小随机组合文库中分离多种排列的抗-唑酮抗体。来源于非免疫人类志愿者的V基因组可以被构建，针对不同队列抗原的抗体(包括自身-抗原)可以按照Marks等描述的方法分离((1991)J.Mol.Biol，222：581-597，或Griffith等，(1993)EMBO J，12：725-734)。
在自然免疫应答中，抗体基因以高比例聚集突变(体内过渡突变)。一些引入的改变将提供更高的亲和力，并且抗收到抗原亚序列刺激时，显示高-亲和力表面免疫球蛋白的B细胞优先被复制和分化。使用“链替换”技术可以模范自然过程(见Marks等，(1992)Bio.Technol，10：779-783)。本方法中，通过噬菌体显示获得的“原初”人类抗体的亲和力可以通过将重链和轻链V区基因替换为来源于未免疫捐赠者V区基因的自然发生变体而改良。本技术可以制备具有nM亲和力范围的抗体和抗体片段。制备非常大的噬菌体抗体文库的策略已经描述于Waterhouse等，((1993)Nucl.Acids Res，21：2265-2266)。
基因替换也可以用于从啮齿类抗体中获得人类抗体，其中人类抗体的亲和力和特异性与开始的啮齿类抗体相似。根据本方法，其也指“表位烙印”，通过噬菌体显示技术获得的啮齿类抗体的重链和轻链V区基因被替换为人类V区基因，产生啮齿类-人类嵌合物。对抗原的选择可以分离能够恢复功能性抗原-结合微点的人类变体，例如，表位支配(烙印)配体的选择。当过程重复进行以替换剩余的啮齿类V区时，可获得人类抗体(见PCT WO 93/06213，1993年4月1日)。不同于通常的CDR嫁接的啮齿类抗体的人源化，本技术提供了完全的人类抗体，其不带有啮齿类的框架或CDR。
可以在本发明的方法中用作抗-C5药物的单克隆抗体和抗体片段的实施例分别是Eculizumab(亦为SolirisTM，Alexion，cheshire，CT)和Pexelizumab(Alexion，cheshire，CT)，两者都描述于USSN 6355245，在此通过引述全部合并于本文。
本发明也包括在本发明的方法中，与直接针对PDGF和/或VEGF和其同源受体PDGFR和/或VEGFR的拮抗剂抗体联合使用本发明的抗-C5药物，以稳定，资料和/或预防眼部失调。相应的，上述的方法可以用于制备本发明的抗体拮抗剂以抑制配基(例如，PDGF或VEGF)与其受体，如同源受体的结合。相应的，本发明的PDGF拮抗剂抗体包括直接针对PDGF和PDGFR目标的抗体。
本发明的方法中与抗-C5药物联谊使用的直接针对VEGF的拮抗剂抗体的实施例是：美国专利号6054297中的bevacizumab(亦为Genentech，San Francisco，CA)，在此通过引述全部合并于本文；和ranibizumab(亦为Genentech，San Francisco，CA).
反义和核酶抗-C5药物
本发明的抗-C5药物包括反义寡核苷酸和核酶，其通过抑制信使RNA的蛋白质转录或直接降解对应的C5mRNA而抑制C5。也提供了使用抗-C5反义和核酶药物治疗眼部失调的方法。特别诉讼方案中，本发明包括对主体施用一种抗-C5反义或核酶药物的方法，以减少，稳定和/或预防至少一种眼部失调的症状，特别是糖尿病视网膜病，渗出性和/或非-渗出性AMD的症状。
设计和合成反义寡核苷酸和核酶的方法在本领域中是已知的。这里提供了额外的参考。
一种设计特异和有效的mRNA-目标寡核苷酸(反义ODNs)和核酶的方法是鉴定反义链与目标mRNA对中的接近位点(其自身折叠为部分的自身-对二级结构)。联合计算机算法预测RNA对接近位点和分子扫描可以制备针对多数mRNA目标的特异和有效的核酶和/或反义寡核苷酸。已经描述了几种方法测定目标RNA分子对反义或核酶抑制物的接近位点。一种方法应用利用尽可能多的反义脱氧寡核苷酸进行体外筛选方法(见Monia等，(1996)Nature Med，2：668-675；和Milner等，(1997)Nature Biotechnol，15：537-541)。另一种则利用ODNs随机文库(Ho等，(1996)Nucleic Acids Res，24：1901-1907；Birikh等，(1997)RNA 3：429-437；和Lima等，(1997)J.Biol，Chem，272：626-638)。接近位点可以通过Rnase H裂解监视(见Birikh等，supra；和Ho等，(1998)Nature Biotechnol，16：59-63)。Rnase H刺激DNA-RNA双链中RNA链磷酸骨架的水解。
另一种方法中，包括使用半-随机，嵌合化学合成的ODNs集合，通过体外对合成的RNA目标以RNase H裂解鉴定接近位点。引物延伸分析被用于目标分子中的这些位点(见Lima等，supra)。另一设计RNA反义目标的方法基于计算机辅助RNA折叠模型。已经出版了几种使用随机核酶文库筛选有效裂解的报道(见Campbell等，(1995)RNA 1：598-609；Lieber等，(1995)Mol.Cell Biol，15：540-551；和Vaish等(1997)Biochem，37：6459-6501)。
其他体外方法，其利用随机或半-随机ODNs文库和RNaseH比计算机模拟更为有用(Lima等，supra)。然而，使用体外合成的RNA不能预测体内反义ODSs的接近性，由于目前的研究显示多聚寡核苷酸的退火交互作用可受RNA-结合蛋白影响(见Tsuchihashi等，(1993)Science，267：99-102；Protman等，(1994)EMBO J，13：213-221；和Bertrand和Rossi(1994)EMBO J，13：2904-2912)。美国专利号6562570，提供了存在模拟体内环境的细胞提取物时测定mRNA中接近位点的组合物和方法，其通过在此引述合并于本文。
简要的，本方法包括将天然的或体外合成的RNA与鉴定的反义ODN，核酶，或DNA酶，或随机或半-随机ODN，核酶，或DNA酶文库，在包括含有内源性RNA-结合蛋白的细胞提取物，或模拟细胞提取物的含有一种或多种RNA-结合蛋白的反应介质中，在杂交条件下共孵育。任何与目标RNA的接近位点互补的反义ODN，核酶，或DNA酶将与该位点结合。当使用鉴定的ODN或一个ODN文库时，RNase H在杂交时存在，或在杂交后加入，以裂解杂交的RNA。RNase H可以在使用核酶或DNA酶时存在，但由于核酶和DNA酶也可裂解杂交的RNA，故其不是必需的。一些情况下，使用包括内源性mRNA，RNA-结合蛋白和RNase H的细胞提取物中的随机或半-随机ODN文库。
随后，多种方法可以用于鉴定目标RNA上结合反义ODS，核酶或DNA酶并发生裂解的位点。例如，末端脱氧核酸转移酶-依赖的聚合酶链反应(TDPCR)可以用于此目的(见Komura和Riggs(1998)Nucleic Acids Res，26：1807-11)。随着TDPCR，反转录步骤用于将RNA转变为DNA。本发明中，TDPCR方法需要的3’末端是通过使用任何合适的RNA依赖的DNA聚合酶(例如，反转录酶)将目标RNA反转录制备的。这是通过将第一ODN引物(PI)与RNA中被研究部分下游位置(例如，RNA分子上的5’至3’方向)区域杂交而获得的。聚合酶在含有dNTP时将RNA以3’末端至P1方向复制DNA，并在由反义ODN/RNase H，核酶和DNA酶产生的裂解位点终止。新的DNA分子(这里指第一链)作为TDPCR的PCR部分的第一个模板，其用于鉴定RNA上相应的可接近目标序列。
例如，TDPCR方法也可用于，例如，带有三磷酸鸟苷的反转录DNA(rGTP)在存在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)时反应，在DNA分子3’末端加入一个(rG)2-4尾。随后与双链ODN链接交联，其在一条链上具有一个与(rG)2-4尾碱基对的3’2-4悬挂。随后加入两条PCR引物。第一条是连接引物(LP)，其与结合(rG)2-4尾的TDPCR连接链互补(有时指更低链)。另一引物(P2)可以与P1相同，但也可以与P1相嵌套，例如，其可以与目标RNA上的区域互补，其至少部分地位于P1结合区域的下游(例如，RNA分子上3’至5’方向)，但其应当在研究的目标RNA分子区域的下游。目标RNA分子上研究测定是否具有可接近位点的部分，是位于与P2互补区域下游的部分。按照已知方法，存在DNA聚合酶和dNTPs时进行PCR，以扩增由LP和P2定义的DNA片段。扩增产物可以通过任何已知方法捕获并随后在自动DNA测序仪上测序，提供了精确定义的裂解位点。一旦进行了此鉴定，可以在体外或体内合成定义序列的反义DNA或核酶。
可以使用合成的反义寡核苷酸序列对特定基因的表达进行干涉(见，例如，Lefebvre-d’Hellencourt等，(1995)Eur.Cyokine New，6：7；Agrawal(1996)TIBTECH，14：376；和Lev-Lehman等，(1997)Antisense Therap.Cohen和Smicek，等(Plenum Press，New York))。简要的，反义寡核苷酸序列可以是DNA短序列，典型地为15-30核苷，但可小于7个核苷(见Wagner等，(1994)Nature，372：333)，其设计与目标mRNA互补并形成RNA：AS复合物。该复合物形式可以阻止相应mRNA的递呈，拼接，诉讼或翻译。此外，特定AS核苷序列与其目标mRNA杂交时可以刺激细胞RNase H活性，造成mRNA的降解(见Calabretta等(1996)Semin.Oncol，23：78)。该情况下，RNase H将裂解复合物中的RNA部分并可能释放更多的AS与额外的目标RNA分子杂交。AS与基因组DNA交互作用的额外活性结果是形成可以使转录失活的三重螺旋结构。
在一个非限制性实施例中，在上述的反义序列之外，可以使用核酶作为附加，或替换对基因功能的抑制。在反义治疗受化学计量考虑限制时，其是特别需要的。可以使用针对相同序列的核酶。核酶是一种RNA分子，其支配RNA的接触能力，在目标RNA的特定位点进行裂解。由核酶裂解的RNA分子的数量大于预测的1∶1化学计量(见Hampel和Tritz(1989)Biochem，28：4929-33；和Uhlenbeck(1987)Nature，328：596-600)。因此，本发明也可以使用针对PDGF或VEGF mRNA可接近区域并含有合适的接触中心的核酶序列。根据这里进一步描述的和本领域中已知的方法制备和输送核酶。核酶可以与反义序列联合使用。
核酶催化RNA磷酸酯链的裂解。几种核酶结构家族已经被鉴定，包括组I基因内区，RNase P，delta肝炎病毒核酶，来源于烟草花叶病毒人造RNA(sTRSV)负链的锤头核酶和发卡核酶(见Sullivan(1994)Investig.Dermatolog，(Suppl.)103：95S；和美国专利号5225347)。后两个家族来源于类病毒和拟病毒，其中核酶被认为在旋转循环复制的产生过程中由低聚体分离为单体(见Symons(1989)TIBS，14：445-50；Symons(1992)Ann.Rev.Biochem，61：641-71)。锤头和发卡核酶模体对于mRNA基因治疗的反式剪切是最适合的。本发明中的核酶以本领域中已知的技术选择。发卡核酶在临床应用中是已知的并且是特别有用的类型。通常核酶为30-100核苷长度。
当使用在位点特异识别序列上裂解mRNA的核酶以裂解特定mRNA时，锤头核酶的使用是特别有用的。锤头核酶在与目标mRNA形成互补碱基对的侧翼区域位置裂解mRNA。关键之处是目标mRNA具有以下两个碱基序列：5’-UG-3，。锤头核酶的结构和制备在本领域中是已知的并且更详细的描述见Haseloff和Gerlach((1988)Nature，334：585)。
本发明的核酶也包括RNA内切核酸酶(这里为“Cech-型核酶“)，如喜温四膜虫中自然发生的(IVS，或L-19IVS RNA)，其进一步描述于Thomas Cech和合作者(见Zaug等，(1984)Science，224：574-578；Zaug和Cech(1986)Science，231：470-475；Zaug，等(1986)Nature，324：429-433；国际专利申请号W088/04300；Been和Cech(1986)Cell，47：207-216)。Cech-型核酶具有八碱基对的活性位点，其与目标RNA序列杂交，该位点之后发生目标RNA的裂解。本发明包括这些Cech-型核酶，其针对八碱基对活性位点序列。本发明不限定特定语的操作机制理论，使用本发明的锤头核酶可以具有超越使用针对-PDGF/VEGF反义链的优势，目前的报道表明锤头核酶通过抑制RNA翻译和/或mRNA目标的特定裂解而起作用。
在翻译链方案中，核酶可以调节修饰寡核苷酸(例如，提高稳定性，针对性，等)并被输送至表达目标mRNA的细胞。一种有用的输送方法是使用受强polIII或pol II启动子控制的“编码”核酶的DNA结构，从而使转化细胞产生充足数量的核酶以破坏目标信使并抑制其翻译。由于核酶不同于反义分子，是接触反应的，因此其效应只需要较低的细胞内浓度。
如上所述，核酸酶抗性，当其需要时，可以通过任何本领域中已知的方法提供，而不充分地影响在需要的使用和输送方法中反义寡聚脱氧核糖核酸或核酶的生物学活性(Iyer等，(1990)J.Org.Chem，55：4693-99；Eckstein(1985)Ann.Rev.Biochem，54：367-402；Spitzer和eckstein(1998)Nucleic Acids Res，18：11691-69；和Shaw等，(1991)Nucleic Acids Res，18：11691-704)。如上关于适体的描述，可以对反义寡核苷酸或核酶进行的，以增强核酸酶抗性的非-限制性代表性修饰包括对磷酸骨架中的磷和氧原子进行修饰，缩短链状烷基或环状烷基内部糖链或缩短链状杂环或杂环内部糖链。包括，例如，制备2’-氟化，O-甲基化，甲基磷酸酯化，硫代磷酸酯化，二硫代磷酸酯化，和吗啉低聚物。例如，反义寡核苷酸或核酶可以在3’末端的4至6核苷间发生硫代磷酸酯交联。可选地，硫代磷酸酯交联可以连接所有核苷。硫代磷酸酯反义寡核苷酸在有效浓度下并不显示明显的毒性，并且在动物中显示充分的药代动力学半衰期(见Agarwal等，(1996)TIBTECH，14：376)并且具核酶抗性。可选地，AS-ODN的核酶抗性可以由3’-末端的9核苷环状序列CGCGAAGCG提供。使用抗-生物素结合反应也可以用于提高AS-ODN对于血清核酶降解的保护力(见Boado和Pardridge(1992)Bioconj.Chem，3：519-23)。根据此理论，AS-ODN药物是3’-末端单生物素化的。当与生物素反应时，其形成高于非-结合ODN稳定性6倍的紧密的，核酶-抗性的复合物。
其他研究已经显示了反义寡核苷酸的体内范围(Agarwal等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：7595)。该过程，预测为有用的从循环中去除异源AS-寡核苷酸的清除机制，依赖于接触的寡核苷酸上自由3’-末端的存在。因此此重要位点的局部的硫代磷酸酯，环形保护或抗-生物素将充分确保这些AS-寡聚脱氧核苷酸。
如上所述使用修饰碱基之外，也可以制备核苷类似物，其中核苷的结构被根本改变并且适合于作为治疗或试验药物。核苷类似物的一个实施例是多台核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸骨架替换为聚酰胺骨架，其与在多肽中所发现的类似。PNA类似物已经显示了对酶降解的抗性，并可在体内和体外长期存在。进一步，据显示PNA与互补DNA序列的结合强于DNA分子。该现象归因于PNA链和DNA链间缺失离子排斥。其他可以对寡核苷酸进行的修饰包括聚合骨架，吗啉聚合骨架(见，例如，美国专利号5034506，其通过在此引述合并于本文)，环状骨架，或无环骨架，糖类似物或其他可以改善寡核苷酸药代动力学特性的修饰。
本发明的额外方面涉及使用DNA酶以减少目标mRNA的表达，例如，C5酶整合了反义链和核酶技术的机制特征。设计的DNA酶可识别特定的目标核酸序列，类似于反义寡核苷酸，也类似于核酶，可以接触并特异裂解目标核酸。
目前有两种DNA酶基本类型，其都由Santoro和Joyce鉴定(见，例如，美国专利号6110462)。10-23DNA酶包括连接两个臂的环形结构。两个臂提供了识别特定目标核酸序列的特异性，而环形结构提供了在生理条件下的接触功能。
简要地，为设计特异识别和裂解目标核酸的DNA酶，本领域中的技术人员必需首先鉴定唯一的目标序列。可以通过使用反义寡核苷酸中列出的方法实现。特定情况下，唯一或充分的序列是富含G/C的18至22核苷的序列。高G/C含量确保DNA酶和目标序列的牢固结合。
当合成DNA酶时，定位酶与信使的特定反义识别序列被划分，使其包括DNA酶的两个臂，DNA酶的环形位于两个特异臂之间。
制备和施用DNA酶的方法见，例如，美国专利号6110462。在体外或体内输送DNA酶的方法包括这里所述的输送RNA酶的方法。此外，本领域中的技术人员可以认识到，类似于反义寡核苷酸，DNA酶可以被合适地修饰以增加稳定性并提高降解抗性。
本发明也包括联合使用本发明的抗-C5药物，与针对PDGF和/或VEGF的反义链，核酶和/或DNA酶药物，稳定，治疗和/或预防眼部失调的方法。相应的，上述的方法可以用于制备反义链，核酶和/或DNA酶药物，与本发明的抗-C5药物一起抑制或阻止PDGF和/或VEGF表达。
抗-C5RNAi药物
本发明的一些实施方案使用RNA干涉(RNAi)的材料和方法影响C5的表达。相应的，本发明的抗-C5药物包括抗-C5RNAi药物。本发明包括在本发明治疗眼部失调的方法中使用抗-C5RNAi药物。特别实施方案中，本发明包括对主体施用抗-C5RNAi药物以减少，稳定和/或预防眼部失调中至少一种症状，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD症状。
RNAi是真核细胞中发生的序列-特异的转录后基因抑制过程。通常，此过程包括由序列同源的双链RNA(dsRNA)介导的特定序列mRNA的降解。例如，对应于特定单链mRNA(ssmRNA)的长dsRNA的表达将降解该信使，从而“干涉”相应基因的表达。相应的，任何选择的基因可以通过引入对应于该基因mRNA全部或充分部分的dsRNA而抑制。据显示当表达长dsRNA时，其首先被核酸酶III降解为21至22碱基对长度的短dsRNA寡核苷酸。相应的，RNAi可以通过引入或相应短同源dsRNAs的表达而起作用。事实上，如下所述施用相应的短同源dsRNA具有特定的优势。
哺乳动物细胞具有至少两种双链RNA(dsRNA)的影响途径。RNAi(序列特异的)途径中，如上所述，最初的dsRNA首先破裂为短干涉(si)RNA。SiRNA具有约21个核苷的正义和反义链，形成在每个3’末端具有两个突出的约19核苷的siRNA。短干涉RNA被认为提供序列信息，使得特定的信使RNA定位降解。相反，非特异性途径有任何序列的dsRNA引发，只要其至少为30碱基对长度。非特异效应的发生是由于dsRNA具有两种酶活性：PKR(双链RNA-活性蛋白激酶)，其活性形式可以使转录起始银子eIF2磷酸化以终止所有蛋白质合成，以及2’，5’寡聚腺苷酸合成酶(2’，5’-AS)，其合成激活RNase L的分子，其为一种针对所有mRNA的酶。非特异途径可以代表宿主对压力或病毒感染的应答，并且，通常，非特异性效应途径在本发明中的特定使用方法中被最小化。明显地，常dsRNA对于引发非限制途径是必需的，相应的，短于30碱基对的dsRNA对于RNAi引起的基因抑制是特别有用的(见，例如，Hunter等(1975)J.Biol.Chem，250：409-17；Manche等，(1992)Mol.Cell Biol，12：5239-48；Minks等，(1979)J.Biol.Chem，254：10180-3；和Elbashir等，(2001)Nature，411：494-8)。
用于RNAi的特定的双链寡核苷酸其长度小于30碱基对，并可以包括25，24，23，22，21，20，19，18或17碱基对。合适地，本发明的dsRNA寡核苷酸可以包括3’突出末端。非-限制性示范性2-核苷3’突出可以包括任何类型的核苷并且甚至可以包括2’-脱氧胸腺嘧啶残基，其可以降价RNA合成的费用并且增强siRNA在细胞培养基和转化细胞中的核酸酶抗性(见Elbashi等，(2001)Nature，411：494-8)。
本发明的特定实施方案中也可以使用更长的，为50，75，100或甚至500碱基对或更长的dsRNA。有效RNAi的示范性浓度约为0.04nM，0.1nM，0.5nM，1.0nM，1.5nM，25nM或100nM，虽然根据所处理细胞的自然性，针对的基因和其他可被技术人员识别的因素可以使用其他浓度。示范性dsRNA可以通过化学合成或使用合适的表达载体体外或体内合成。示范性的合成RNA包括使用本领域中已知的方法化学合成的21核苷的RNA(例如，加速亚磷酸根RNA和亚磷酸根胸苷(Proligo，德国))。可以使用本领域中的方法对寡核苷酸去蛋白和凝胶纯化(见，例如，Elbashir等，(2001)Genes Dev，15：188-200)。更长的RNA可以只用本领域中已知的启动子，如T7RNA聚合酶启动子转录。单一的RNA目标，位于体外启动子下游的两个可能的方向，将转录出目标的两条链以产生期望的目标序列的dsRNA寡核苷酸。
用于设计寡核苷酸的特定序列可以是目标基因(例如，C5)中表达的任何相邻核苷序列。本领域中已知的程序和算法，可以用于选择合适的目标序列。此外，如上所述，利用设计预测特定单链核酸序列二级结构的程序，使得选择可以发生于折叠mRNA中暴露单链区域的那些序列，可以选择优化的序列。设计合适的寡核苷酸的方法和组合物可见，例如，美国专利号6251588，其通过引述在此合并于本文。mRNA通常被认为是线性分子，其核糖核酸序列中含有蛋白合成的信息。研究已经显示许多mRNA中存在大量二级和三级结构。RNA二级结构元素主要由相同RNA分子的不同区域的Watson-Crick型交互作用形成。重要的结构元素包括细胞内双链区域，发卡回环，双链RNA突出部分和内部回环。当二级结构元素相互接触或与一级结构一起形成三级结构，产生更复杂的三-维结构。许多研究已经测定了大量RNA复合结构的结合能量并引申出许多可以用于预测RNA二级结构的规律(见，例如，Jaeger等，(1989)Proc.natl.Acad.Sci.(USA)86；7706(1989)；和Turner等，(1988)Ann.Rev.Biophys.Biophys.Chem，17：167)。该规律可用于鉴定RNA结构元素，并且，特别是，鉴定单链RNA区域，其可以代表mRNA针对的沉默RNAi，核酶或反义技术的特别有用的片段。相应的，mRNA目标的特定片段可以被鉴定以设计RNAi介导的dsRNA寡核苷酸以及设计合适的本发明的核酶和锤头核酶组合物。
dsRNA寡核苷酸可以使用载体组合物，如脂质体，将外源目标基因转化入细胞，其在本领域中是已知的，例如，Lipofectamine 2000(Life Technologies，Rockville Md.)，如制造商描述的粘合细胞系。东魏内源基因的dsRNA寡核苷酸的转化可以使用Oligofectamine进行(Life Technologies)。转化效率可以使用在哺乳动物细胞系中共转化编码pAD3的hGFP，通过荧光显微镜检测(Kehlenback等，(1998)J.Cell.Biol，141：863-74)。RNAi的效率可以用引导dsRNA的多种方法中的任何一种测定。其包括，但不局限于，在新蛋白合成受抑制后，使用识别目标基因产物的抗体，对内源性文库反应充分时间进行Western blot分析，和Northern blot分析以测定目标mRNA的存在水平。
本发明使用的RNAi技术的额外组合物，方法和应用见美国专利号6278039，5723750和5244802，其通过引述在此合并于本文。
本发明也包括在本发明的方法中联合使用PDGF和/或VEGF抑制的RNAi药物和本发明的抗-C5药物，以稳定，治疗和/或预防眼部失调。相应的，上述的方法可以用于制备与本发明的抗-C5药物合用的抑制PDGF和/或VEGF的RNAi药物。
抗-C5蛋白和聚肽
本发明的一些实施方案中，抗-C5药物是一种蛋白质或聚肽。本发明包括使用抗-C5蛋白或聚肽药物治疗眼部失调的方法。特别实施方案中，本发明包括在减少，稳定和/或预防至少一种眼部失调症状，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD症状的方法中对主体使用一种抗-C5蛋白或聚肽药物。
例如，TP 10(Avant Imunotherapeutics，Inc.Needham，MA)，一种可溶性分支补体受体类型I和抗-C5蛋白或聚肽药物，其描述于美国专利号5212071，5252216，5256642，5456909，5472939，5840858，5856297，5858969，5971481，6057131，6169068和6316604，其每一个通过引述在此全部合并于本文，可以用于本发明的方法。APT070(亦为Inflazyme Pharmaceuticals，LTD，Richmond，B.C.加拿大)可以用于本发明的方法。
本发明也包括在本发明的方法中联合使用蛋白质和/或聚肽抗-PDGF和/或抗-VEGF药物和本发明的抗-C5药物，以稳定，治疗和/或预防眼部失调。
小分子抗-C5药物
本发明的一些实施方案中，抗-C5药物是一种小分子，特别是小有机分子。本发明包括在治疗眼部失调的方法中使用抗-C5小分子药物。特别实施方案中，本发明包括在减少，稳定和/或预防至少一种眼部失调症状，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD症状的方法中对主体使用一种抗-C5小分子药物。
本发明也包括在本发明的方法中联合使用小分子抗-PDGF和/或抗-VEGF药物和本发明的抗-C5药物，以稳定，治疗和/或预防眼部失调。例如，本发明的抗-C5药物可以于抗-PDGF药物Imatinib Mesylate(Novartis Pharmaceuticals，Inc.East Hanover，NJ)联合使用。本发明的抗-C5药物也可以与抗-VEGF药物联合使用，如sorafenib(Onyx Pharmaceticals，Inc.Emeryville，CA and Bayer Pharmaceuticals Corportion，West Haven，CT)；sunitnab malate(Pfizer，Inc.NY，NY)。
抗-C3药物
一些实施方案中，本发明的材料包括以高亲和力结合补体蛋白C3的一系列核酸适体，其功能性地调节，例如，阻止，补体蛋白C3体内和/或细胞基础方法的活性。这些适体提供了低-毒性，安全，和有效的调节的本发明的方法，以治疗，稳定和/或预防多种补体-相关的眼部疾病或失调，包括，例如，急性或慢性炎症和/或免疫-介导的眼部失调，炎症性结膜炎，包括过敏性巨乳头性结膜炎，黄斑水肿，葡萄膜炎，眼内炎，巩膜炎，角膜溃烂，干眼症，青光眼，糖尿病视网膜病，角膜移植排斥，眼部手术相关的并发症，如人工晶体植入术和白内障手术相关的炎症，Behcet′s疾病，免疫复合脉管炎，Fuch′s疾病，小柳原田病，亚视网膜纤维化，角膜炎，玻璃体-视网膜炎，眼部寄生虫感染/转移，色网膜色素变性，巨细胞病毒视网膜炎，脉络膜炎，黄斑变性，年龄相关黄斑变性(“AMD”)，非-渗出性(“干性”)AMD，或眼部新生血管化失调，包括糖尿病视网膜炎或渗出性(“湿”)AMD。这些适体也可以在眼部诊断中使用。
这些适体也可以包括这里描述的修饰，例如，与亲脂性或高分子量化合物(例如，PEG)连接，整合帽子基团，整合修饰核苷，并对磷酸骨架进行修饰。
本发明的一个实施方案中，提供了一个分离的，非-自然发生的结合C3补体蛋白的适体。另一实施方案中，提供了在本发明的方法中使用，以治疗，稳定和/或预防补体-介导的眼部失调的分离的，非-自然发生的结合C3补体蛋白的适体。一些实施方案中，分离的，非-自然发生的适体与C3补体蛋白的分离常数(“Kd”)小于100μM，小于1μM，小于500nM，小于100nM，小于50nM，小于1nM，小于500pM，小于100pM，小于50pM。本发明的一些实施方案中，分离常数是以下列实施例2中描述的斑点染色滴定方法测定的。
另一实施方案中，本发明中使用的适体调节C3补体蛋白的功能，特别是抑制C3补体蛋白功能和/或C3补体蛋白变体功能。这里使用的C3补体蛋白变体包括执行与C3补体蛋白充分类似功能的变体。C3补体蛋白变体合适地充分包括相同的结构，并且一些实施方案中与包括下列氨基酸序列的C3补体蛋白的氨基酸序列相比，包括至少80％的序列一致性，更合适地包括至少90％序列一致性，更适合地包括至少95％序列一致性，De Bruijn，MH和Fey，GH(1985)人类补体成分C3：cDNA编码序列和派生初级结构。Proc Natl Acad Sci USA 82，708-12。
本发明的其他结合补体蛋白C3的适体进一步描述于美国专利申请系列号6140490，6395888和6566343，其每一个通过在此引述全部合并于本文。
抗-C1q适体
一些实施方案中，本发明的材料包括以高亲和力结合补体蛋白C1q的一系列核酸适体，其功能性地调节，例如，阻止，补体蛋白C1q体内和/或细胞基础方法的活性。
这些适体提供了低-毒性，安全，和有效的调节的本发明的方法，以治疗，稳定和/或预防多种补体-相关的眼部疾病或失调，包括，例如，急性或慢性炎症和/或免疫-介导的眼部失调，炎症性结膜炎，包括过敏性巨乳头性结膜炎，黄斑水肿，葡萄膜炎，眼内炎，巩膜炎，角膜溃烂，干眼症，青光眼，糖尿病视网膜病，角膜移植排斥，眼部手术相关的并发症，如人工晶体植入术和白内障手术相关的炎症，Behcet′s疾病，免疫复合脉管炎，Fuch′s疾病，小柳原田病，亚视网膜纤维化，角膜炎，玻璃体-视网膜炎，眼部寄生虫感染/转移，色网膜色素变性，巨细胞病毒视网膜炎，脉络膜炎，黄斑变性，年龄相关黄斑变性(“AMD”)，非-渗出性(“干性”)AMD，或眼部新生血管化失调，包括糖尿病视网膜炎或渗出性(“湿”)AMD。这些适体也可以在眼部诊断中使用。
这些适体也可以包括这里描述的修饰，例如，与亲脂性或高分子量化合物(例如，PEG)连接，整合帽子基团，整合修饰核苷，并对磷酸骨架进行修饰。
本发明的一个实施方案中，提供了一个分离的，非-自然发生的结合C1q补体蛋白的适体。另一实施方案中，提供了在本发明的方法中使用，以治疗，稳定和/或预防补体-介导的眼部失调的分离的，非-自然发生的结合C1q补体蛋白的适体。一些实施方案中，分离的，非-自然发生的适体与C1q补体蛋白的分离常数(“Kd”)小于100μM，小于1μM，小于500nM，小于100nM，小于50nM，小于1nM，小于500pM，小于100pM，小于50pM。本发明的一些实施方案中，分离常数是以下列实施例2中描述的斑点染色滴定方法测定的。
另一实施方案中，本发明中使用的适体调节C1q补体蛋白的功能，特别是抑制C1q补体蛋白功能和/或C1q补体蛋白变体功能。这里使用的C1q补体蛋白变体包括执行与C1q补体蛋白充分类似功能的变体。C1q补体蛋白变体合适地充分包括相同的结构，并且一些实施方案中与包括下列氨基酸序列的C1q补体蛋白的氨基酸序列相比，包括至少80％的序列一致性，更合适地包括至少90％序列一致性，更适合地包括至少95％序列一致性，Sellar，GC，Blake，DJ和Reid，KB(1991)编码人类补体亚成分C1q的A-，B-和C-链的基因特征和结构。人类C1q氨基酸序列派生的补体。Biochem J.274，481-90。
本发明的其他结合补体蛋白C1q的适体进一步描述于美国专利申请系列号6140490，6395888和6566343，其每一个通过在此引述全部合并于本文。
本发明的适体治疗剂的一些实施方案中，包括抗-C5，C3和/或C1q具有对其目标更大的亲和力和特异性，并当适体治疗剂在病人或主体体内破碎时减少非自然发生的核苷替换造成的副作用。
本发明的抗-补体适体，包括本发明的抗-C5，C3和/或C1q适体，可以使用任何领域中已知的寡核苷酸合成技术合成，包括本领域中已知的固相寡核苷酸合成技术(见，例如，Froehler等，Nucl.Acid.Res.14：5399-5467(1986)和Froehler等，Tet.Lett.27：5575-5578(1986))和液相方法如三酯合成方法(见，例如，Sood等，Nucl.Acid Res.4：2557(1997)和Hirose等，Tet.Lett，28：2449(1978))。
本发明也包括在稳定，治疗和/或预防眼部失调的方法中，与本发明的PDGF和/或VEGF和/或其同源受体PDGFR和VEGFR特异的适体联合使用本发明的抗-补体适体(包括抗-C5，C3和/或C1q适体)。
本发明的方法中使用的抗-PDGF适体的实施例描述于国际专利申请号PCT′/US2005/039975，归档于2005年11月2日，通过在此引述全部合并于本文，特别是描述的ARC513，ARC594，ARC127和ARC404。
本发明的方法中使用的VEGF特异适体的实施例描述于美国专利系列号：5919455，5932462，6113906，6011020，6051698和6147204。例如，与本发明的抗-补体适体联合使用的治疗眼部失调的适体可以是以PEG化或非PEG化的EYE001(先前的NX1838)，特别是pegaptanib纳注射液(Eyetech Pharmaceuticals，Inc和Pfizer，Inc.NY，NY)。
药物组合物
本发明也包括含有一种抗-C5药物的药物组合物，特别是结合补体蛋白C5的适体分子，特别是结合补体蛋白C5并阻止其裂解的适体。一些实施方案中，组合物适合于内用并包括有效数量的本发明的药物活性成分，其可以单独存在或联合一种或多种药物可接受载体。该化合物如果具有毒性，则是非常低的，使得其特别有用。
本发明的组合物可以用于治疗或预防一种病理，如一种疾病或失调，或减少病人中这些疾病或失调症状的病痛。例如，本发明的组合物可以用于治疗或预防补体-相关心脏失调(例如，心肌损伤；冠状动脉搭桥术(CABG)相关的C5介导的并发症，如术后出血，嗜中性粒细胞和白细胞活性，增加心肌梗死和认知紊乱的危险；在狭窄；和经皮冠状动脉介入治疗相关的C5介导的补体并发症)，缺血再灌注损伤(例如，心肌梗死，中风，冻伤)，补体-相关的炎症失调(例如，哮喘，关节炎，脓血症，和器官移植后排斥)，和补体-相关的自身免疫失调(例如，重症肌无力，系统性红斑狼疮(SLE)，肺炎，体外补体活性，抗体-介导的补体活性和补体相关的眼部疾病，如糖尿病视网膜炎以及年龄-相关的黄斑变性(AMD)。一个特别实施方案中，本发明的组合物用于减少，稳定和/或预防C5-介导的眼部失调，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD。
一些实施方案中，本发明的组合物可以用于稳定，治疗和/或预防病人中的病理，如眼部疾病或失调。例如，本发明的组合物可以用于稳定，治疗和/或预防补体相关的眼部失调，如：急性或慢性炎症和/或免疫-介导的眼部失调，炎症性结膜炎，包括过敏性巨乳头性结膜炎，黄斑水肿，葡萄膜炎，眼内炎，巩膜炎，角膜溃烂，干眼症，青光眼，糖尿病视网膜病，角膜移植排斥，眼部手术相关的并发症，如人工晶体植入术和白内障手术相关的炎症，Behcet′s疾病，免疫复合脉管炎，Fuch′s疾病，小柳原田病，亚视网膜纤维化，角膜炎，玻璃体-视网膜炎，眼部寄生虫感染/转移，色网膜色素变性，巨细胞病毒视网膜炎，脉络膜炎，黄斑变性，年龄相关黄斑变性(“AMD”)，非-渗出性(“干性”)AMD，或眼部新生血管化失调，包括糖尿病视网膜炎或渗出性(“湿”)AMD。
本发明的组合物用于补体蛋白C5相关或引发的疾病或失调的病人施药，该C5蛋白受本发明的抗-C5药物抑制或本发明的抗-C5药物特异结合。一些实施方案中，本发明的组合物对于患有，或处于眼部疾病或失调的病人是特别有用的，其与本发明的抗-补体适体抑制和/或本发明的抗-补体适体特异结合的补体蛋白相关或由其引发。
一些实施方案中，提供了对患有或处于补体-相关眼部失调的主体治疗的组合物。特定实施方案中，提供了对患有或处于补体-相关眼部失调，特别是非-渗出性AMD和/或眼部新生血管化失调危险，特别是糖尿病视网膜炎和渗出性-AMD的主体进行治疗的组合物。一些实施方案中，处于危险的主体具有视网膜色素玻璃疣和/或改变，但无临床视觉敏感性损失。使用opthalmascope测定玻璃疣，典型地在视网膜红色背景上显示黄色斑点和颗粒。临床视觉敏感性损失使用糖尿病视网膜炎早期治疗表(“ETDRS表”)以1至3列的视觉减少显示。其他黄斑变性相关的视觉改变包括由Amsler格栅测定的扭曲和/或盲点(暗点)，黑暗适应性的改变(红细胞健康诊断)或色彩辨认改变(锥形细胞健康诊断)。一些实施方案中，处于危险的主体是与野生型补体因子H相比，具有其变体的主体。见，例如，Edwards等描述的变体，Science vol 308，pp421-422(2005)，hageman，G等，PNAS，vol.102，pp.7227-7231(2005)，和Haines，J等，Science，vol.308，pp419-421(2005)。一些实施方案中处于危险的主体皆具有玻璃疣，无视觉敏感性损失和补体因子H变体。一些实施方案中，处于危险的主体被测定出具有玻璃疣。一些实施方案中，治疗的处于危险的主体被测定出具有玻璃疣并具有临床视觉敏感性损失和/或其他视觉改变。
本发明的组合物可以用于治疗具有病理的病人或主体的方法，一些优选实施方案中，其为眼部病理。本发明的方法包括对主体施用抗-C5药物，特别是C5特异的适体或包括相同的组合物，从而抗-C5药物结合补体蛋白C5，而与补体蛋白C5的结合改变其生物功能，例如，防止其体内裂解从而治疗C5介导的病理。特别实施方案中，本发明的抗-C5药物的结合，特别是本发明的C5特异的适体，特别是在视网膜组织，RPE细胞，脉络膜脉管和/或视网膜毛细管，在治疗VEGF和/或PDGF介导的失调的病人中，特别是眼部新生血管化失调如AMD和/或糖尿病视网膜炎中，可减少VEGF和/或PDGF表达和/或bFGF和/或其他刺激内源性细胞生长的生长因子。
一些实施方案中，本发明的抗-补体适体，特别是本发明的抗-C5适体，以充分的数量对主体通过眼部或眼周给药以减少眼部VEGF和/或PDGF体内表达水平。本发明方法的特别实施方案中，以抗-补体适体，特别是本发明的抗-C5适体施用的主体，被定义为具有或处于眼部新生血管化失调危险，其中VEGF和/或PDGF表达啊减少有助于预防，稳定和/或减少至少一种眼部新生血管化失调症状。
具有眼部病理的病人或主体，例如，以本发明的方法治疗的病人可以使脊椎动物，更特别地为哺乳动物，或跟特别地为人类。
实践中，本发明的抗-C5药物，特别是本发明的C5特异的适体或其药物可接受盐或药物前体，以有效显示其期望的生物学活性的数量给药，例如，显示适体对于其受体的结合，防止目标蛋白的裂解。
本发明的一个方面包括本发明的一种适体组合物与其他C5介导的补体失调治疗的联合。一个实施方案中本发明描述了一个与其他补体-介导的眼部失调治疗联合的本发明的适体组合物。本发明的失调组合物可以包括，例如，超过一种适体。一些实施例中，本发明的包括一种或几种本发明化合物的适体组合物，与其他有用的组合物联合给药，如一种抗-炎症药物，一种免疫抑制剂，一种抗病毒药物，或类似物。此外，本发明的化合物可以与上述的细胞毒素，细胞抑制剂，或化疗药物如一种烷化剂，抗-代谢物，有丝分裂抑制剂或细胞毒素拮抗剂联合给药。特别实施方案中，本发明的抗-C5药物，通常，目前联合施用的已知治疗药物的可用的剂量形式是合适的。
“联合治疗”(或“共-治疗”)包括施用本发明的抗-C5药物，特别是本发明的C5特异的适体组合物和至少一种第二药物，作为特定的治疗药物，以提供这些治疗药物协同-作用的有利效果。联合的有利效果包括，但不局限于，由治疗药物联合获得的药代动力学或药效学协同-作用结果。典型地以一段定义的时间期联合施用这些治疗药物(根据所选择的联合，通常为数分钟，小时，天或周)。一些实施方案中，第二药物可以是抗-VEGF药物和/或抗-PDGF药物。
上述方法的实施方案中，其中本方法进一步包括对主体施用抗-VEGF药物，抗-VEGF药物可以从包括以下物质的组中选择：一种核酸分子，一种适体，一种反义分子，一种RNAi分子，一种蛋白，一种多肽，一种环状多肽，一种抗体或抗体片段，一种糖，一种聚合物，和一种小分子。
上述方法的实施方案中，其中本方法进一步包括对主体施用抗-PDGF药物，抗-PDGF药物可以从包括以下物质的组中选择：一种核酸分子，一种适体，一种反义分子，一种RNAi分子，一种蛋白，一种多肽，一种环状多肽，一种抗体或抗体片段，一种糖，一种聚合物，和一种小分子。
上述方法的一些实施方案中，其中本方法进一步包括对主体施用抗-血管药物，该抗-血管药物是一种卟啉派生物。卟啉派生物的一些实施方案中，其是注射用verteporfin(Novartis Pharmaceuticals Corporation，East Hanover，NJ)。一些实施方案中，本方法进一步包括用激光激活卟啉派生物。
“联合治疗”可以，但通常不是，意指包括作为分离的单一治疗方法的一部分，施用两种或多种这些治疗药物，其附带地或任意地达到本发明的联合结果。“联合治疗”包括以先后顺序方式施用这些治疗药物，即每个治疗药物在不同时间施用，以及在充分同时的方式施用这些治疗药物，或至少两种治疗药物。充分同时的方式可以包括，例如，对主体施用包括固定比例治疗药物的单个药丸，或多个每种治疗药物的单一药丸。另一实施方案中，充分同时给药可以包括，例如，对主体施用具有每种治疗药物固定比例注射剂，或多个，每个治疗药物的单一胶囊。
按顺序地或充分同时施用每种治疗药物可以通过任何合适途径起效应，但不局限于，局部途径，口服途径，静脉内途径，肌肉内途径，眼部途径和通过粘膜组织直接吸收。资料药物可以通过相同或不同途径给药。例如，在组合物中的第一种选择的治疗药物可以通过注射给药，而组合物的其他治疗药物可以通过局部给药。
可选地，例如，所有治疗药物可以通过局部给药或所有治疗药物可以通过注射给药。治疗药物使用的顺序不是严格要求的，除非另有说明。“联合治疗”也可以包括如上所述施用治疗药物并额外联合其他生物学活性成分。其中联合治疗进一步包括一种非-药物治疗，非-药物治疗可以在任何何时的时间进行，只要获得联合治疗药物和非-药物治疗协同作用的有利效果。例如，在合适的情况中，当非-药物治疗临时从治疗药物中去除，可能为数天或数周时，仍可获得有利效果。
本发明的治疗或药物学组合物通常包括一种溶解或分散在一种药物可接受介质中的有效数量的治疗活性成分。药物可接受介质或载体包括任何和所有溶剂，分散介质，包裹，抗细菌和抗真菌药物，等渗和吸收延迟药物和类似物。药物活性物质的这些介质和药物的使用是本领域中已知的。辅助的活性成分也可以整合入本发明的治疗组合物。
本领域中的技术人员可以根据这里所描述知晓药物或药理组合物的制备。典型地，这些组合物可以制备为注射剂，其可以为液体溶液或分散剂；适于在注射前溶解，或分散于液体的固体形式；口服给药的药片和其他固体；缓释胶囊；或其他任何目前使用的形式，包括滴眼液，霜剂，洗液，药膏，吸入剂和类似物。消毒制剂的使用，如外科医生，内科医师或健康护理人员使用的治疗手术部位特定区域的盐洗液也可以被特殊使用。组合物也可以通过微装置，微粒或海绵体输送。
以制剂的形式，治疗剂可以以与剂量形式相符的方式，并以起药物学效应的数量给药。制剂可以以多种剂量形式方便地给药，如上述的注射液，也可以包括药物缓释胶囊和类似物。
本文中，活性成分的数量和施用的组合物的体积依赖于治疗的宿主动物。给药所需的活性化合物的实践性成分依赖于从业者的判断并且对于每种情况都是特殊的。
分散活性成分所需的组合物的最小体积被典型地使用。合适的给药方式也是可变的，但典型地通过最初施用化合物并监控结果，并随后在进一步间隔中给予额外的的受控剂量。
例如，对于药片或胶囊形式口服给药(例如，凝胶胶囊)，活性药物成分可以与一种口服的，非-毒性药物可接受内部载体联用，如乙醇，甘油，水和类似物。此外，当有期望或需要时，合适的结合物，润滑剂，分裂剂和染色剂也可以整合入混合物中。合适的结合物包括淀粉，硅酸镁铝，浆糊，凝胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，自然糖如葡萄糖或beta-乳糖，玉米甜味剂，自然和合成橡胶如阿拉伯树胶，黄芪胶或藻酸，聚乙二醇，蜡和类似物。这些剂量形式中使用的润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，硅，滑石，硬脂酸，其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇和类似物。分散剂包括，但不局限于，淀粉，甲基纤维素，琼脂，膨润土，黄原胶淀粉，琼脂，褐藻酸或其钠盐，或泡腾合剂，和类似物。稀释剂，包括，例如，乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘露糖，山梨糖醇，纤维素和/或氨基乙酸。
本发明的化合物也可以以口服剂量形式，如缓释和持续释放药片或胶囊，药丸，粉末，颗粒，西也剂，酊剂，悬浮剂，糖浆和乳剂。
注射组合物合适地为水等渗的溶液或悬浮液，而栓剂合适地由脂肪乳剂或分散剂制备。组合物可以是无菌的/并包括佐剂，如保存剂，稳定剂，湿润剂或乳化剂，促溶剂，渗透压调节盐和/或缓冲液。此外，其也可以包括其他治疗药物。组合物根据常规的混合，粒化或包裹方法制备，并典型地包括约0.1％至75％，合适地为1至50％的活性成分。
液体，特别是注射组合物，可以，例如，通过溶解，分散等制备。活性成分在药物纯的溶剂中溶解或混合，例如，水，盐，葡萄糖水溶液，甘油，乙醇，和类似物，以形成注射溶液或分散剂。此外，可以制备在注射前溶解于液体的固定形式。
本发明的化合物可以同静脉内(推注或灌输)，腹膜内，皮下或肌肉内形式给药，所有使用形式对于药物领域中的普通技术人员是已知的。可以以常规形式，液体溶液或悬浮液制备注射剂。
注射用给药通常用于皮下，肌肉内或静脉内注射和灌输使用。此外，注射给药的一种方法应用缓释或持续释放系统灌输，其确保维持剂量的持续水平，根据美国专利号3710795，其通过引述在此合并于本文。
此外，本发明的合适的化合物可以通过局部使用合适的鼻内媒介，吸入器以鼻内形式给药，或使用本领域中普通技术人员已知的透皮贴片形式给药。以透皮输送系统形式给药时，剂量输送形式将为持续性的而非间歇性。其他合适的局部制备物包括霜剂，油膏，洗液，气溶胶喷雾和凝胶，其中活性成分的浓度典型地为0.01％至15％，重量/重量或重量/体积。
对于固体组合物，赋形剂包括药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁，和类似物。上述定义的活性化合物，也可以使用聚乙二醇，丙烯二醇作为载体，制备为栓剂。一些实施方案中，栓剂合适地由脂肪乳液或悬浮液制备。
本发明的化合物也可以以脂质体输送系统给药，如小单层囊泡，大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由多种磷脂制备，包括胆固醇，硬脂酰基胺或磷脂酰胆碱。一些实施方案中，一种脂成分膜以药物水溶液水合以形成脂层包裹药物的形式，如美国专利号5262564中描述。例如，这里描述的适体分子可以与亲脂性化合物或只用本领域中已知方法构建的的非-免疫原性，高分子量化合物形成复合物。核酸-相关复合物的实施例提供于美国专利号6011020。
本发明的化合物也可以与作为药物载体的可溶性化合物联合。这些聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚，聚氢氧基乙基aspanamidephenol，或棕榈酰残基替换的polyethyleneoxidepolylysine。此外，本发明的化合物可以与用于获得药物受控释放的一组生物降解聚合物结合，例如，聚乳酸，polyepsilon caprolactone，聚羟基丁酸，聚原酸酯，聚甲醛，聚二氢吡喃，聚基丙烯酸酯和交联或水凝胶两性阻抑共聚物。
一个优选实施方案中，本发明的化合物可以通过玻璃体内，眼周，眼内，结膜内，或跨巩膜注射入眼腔或直接进入眼部或眼周组织。本发明的化合物可以注射入subtenon空间或眼球后空间。本发明的化合物也可以通过到达眼部和其组织的系统血液和体液，输送至眼室或组织，从而通过持续性系统注射，通过静脉内，肌肉内或皮下输送途径给药。结膜内，玻璃体内或跨巩膜施用本发明的药物组合物是系统性施用药物的有用补充，以治疗眼部疾病和/或眼部症状系统疾病。本发明中稳定，治疗和/或预防糖尿病视网膜炎和/或Behcet’s疾病方法的一些实施方案中，抗-补体适体不是系统性给药的，其合适地为局部给药。
本发明的化合物也可以通过手术植入一种生物分解的微型聚合物系统，以存储或持续释放凝胶或聚合物形式输送至眼室或组织，例如，微装置，微粒，或海绵，或在治疗眼部疾病时植入的其他缓释跨巩膜装置，或一种眼部输送装置，例如，聚合物接触晶体持续输送装置。本发明的化合物也可以局部施用于眼室或组织，例如，眼药水形式，带有本发明化合物的接触镜形式，或施用电流将药物从表面输送至眼睛深处的电离子透入疗法。
如期望，施用的药物组合物也可以含有微量的无-毒性辅助物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲液，和其他物质如醋酸钠，和油酸三乙醇胺。
使用适体的剂量方法是依据多种因素，包括类型，物种，年龄，重量，性别和病人的医疗条件；治疗症状的严重性；给药途径；病人肾和肝功能；和使用的特定适体或其盐。普通技术的医师或兽医可以决定和指定预防，逆转或阻止疾病进程的药物的有效数量。
由于获得指定效果的本发明的适体组合物的口服剂量，其范围为口服0.05至7500mg/天。组合物合适地以包括0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，50.0，100.0，250.0，500.0和1000.0mg活性成分的标记药片形式提供。本发明的化合物可以以每日单次剂量给药，或日剂量可以以两次，三次或四次给药。
本发明的适体组合物的灌输剂量，鼻内给药剂量和透皮剂量范围为0.05至7500mg/天。本发明的适体组合物的皮下，静脉内和腹膜内剂量范围为0.05至3800mg/天。
本发明的适体组合物的眼部剂量范围为眼部给药0.001至10mg/眼，例如，以每周一次至每三月一次或以连续释放装置或形式，通过玻璃体内注射。
本发明的适体组合物的有效血浆水平范围为0.002mg/mL至50mg/mL。本发明的适体组合物的有效眼部水平范围为20nM至250μM。
治疗的效果
新生血管失调
治疗新生血管失调的效果，例如AMD，特别是渗出性或糖尿病视网膜炎，是通过任何可接受的测定方法评估的，其中血管生成被减缓或消除。其包括直接观察和非直接评估，如通过评估客观症状或主观生理表现。例如，可以基于新生血管化，微血管病，血管渗漏或血管水肿或任何其联合症状的预防，稳定和/或逆转评估治疗效果。眼部新生血管失调的评估抑制治疗效果也可以由视觉敏度的稳定或改善定义。
测定单独抗-C5药物或联合一种抗-VEGF药物和/或抗-PDGF药物对稳定，减少一种症状和/或预防眼部新生血管失调的效果中，病人也可以在注射数天后至在此注射前由眼科医生进行临床评估。ETDRS视觉敏度，柯达彩色胶片摄像，和荧光素血管造影术也可以每月进行。
测定单独抗-补体药物或联合一种抗-VEGF药物和/或抗-PDGF药物对稳定，减少一种症状和/或预防眼部新生血管失调的效果中，病人也可以在注射数天后至在此注射前由眼科医生进行临床评估。ETDRS视觉敏度，眼底照像，和光学相干断层扫描，和荧光素血管造影术也可以每月进行。
例如，为评估抗-C5药物，特别是一种单独的C5特异适体或联合一种抗-VEGF药物和/或一种抗-PDGF药物治疗眼部新生血管的效果，将对遭受黄斑下脉络膜新生血管化次生年龄相关黄斑变性的病人，根据眼科领域中已知的方法，进行包括单独或多重腹膜内注射施用抗-C5药物的研究，特别是一种单独的C5特异适体或与一种抗-VEGF药物和/或一种抗-PDGF药物的联合。黄斑下脉络膜新生血管化(CNV)次生年龄-相关黄斑变性(AMD)的病人将以单次静脉内注射抗-C5药物，特别是一种C5特异适体和/或一种VEGF特异适体和/或一种PDGF特异适体。对效果进行监控，例如，通过眼科评估和/或荧光素血管造影术。治疗三个月后病人显示稳定或改善的视觉，例如，ETDRS图表显示3-排或更大的视觉改善，被认为获得有效剂量。
其他眼部失调
治疗的炎症结膜炎，包括本领域中接受的方法评估的过敏性和巨乳头性结膜炎，黄斑水肿，葡萄膜炎，眼内炎，巩膜炎，角膜溃烂，干眼症，青光眼，缺血性视网膜疾病，糖尿病视网膜病，角膜移植排斥，眼部手术相关的并发症，如人工晶体植入术和白内障手术相关的炎症，Behcet′s疾病，眼底黄色斑点症，免疫复合脉管炎，Fuch′s疾病，小柳原田病，亚视网膜纤维化，角膜炎，玻璃体-视网膜炎，眼部寄生虫感染/转移，色网膜色素变性，巨细胞病毒视网膜炎和脉络膜炎症。测定单独抗-补体药物或联合其他药物对稳定，减少一种症状和/或预防眼部新生血管失调的效果中，病人也可以由眼科医生通过临床评估。临床评估可以在注射后数日后并在下一次注射前进行。临床评估可以包括直接观察和非直接评估，如通过评估客观症状或主观生理表现。例如，可以基于血管渗漏或血管水肿或任何其联合症状的预防，稳定和/或逆转评估治疗效果。青光眼的治疗评估中，可以基于视网膜神经纤维层或眼部神经的健康的稳定性进行评估，其可以使用眼底摄影或局部光学相干断层扫描监控。
这里描述的所有出版和专利文件通过在此引述全部合并于本文，其每一个出版或文件特异地和独立地通过在此引述合并于本文。出版和专利文件的引用不作为一种任何与之前的领域相关的陈述，其也不组成任何相关的内容或数据陈述。本发明已经通过描写在此描述，本领域中的技术人员将认识到本发明可以以不同实施方案被实践，以下描述和实施例出于描述目的，并非以下权利要求的限制。
实施例1
经典和选择性补体途径中的抗-C5适体活性
实施例1A：溶血试验
CH50试验测试血清试验样本中补体系统溶解50％抗体-包裹绵羊红细胞标准悬浮液的能力。在存在或缺失各种抗-C5适体时将0.2％人血清与抗体-包裹的绵羊红细胞混合(DiamedixEZ Complement CH50Kit，Diamedix Corp，Miami，FL)。布根据试剂盒方案操作，在含钙，镁和1％凝胶的巴比妥-缓冲盐溶液中(GVB++补体缓冲液)以37℃孵育30分钟。孵育后，样本经离心沉淀完整红细胞。在412nm测定悬浮液吸光度(OD412)以定量可溶性血色素，其与溶血程度成比例(Green等，(1995)Chem.Biol.2：683-95)。为验证适体抑制C5活性，根据ELISA试剂盒的方案，一些溶血上清液通过ELISA分析C5a和C5b-9的存在(C5b-9ELISA试剂盒，Quidel，San Diego，CA；C5a ELISA试剂盒，BD Biosciences，San Diego，CA)。
在反应液中加入额外的非-PEG化抗-C5适体(ARC186)(序列号：4)将以剂量-依赖的方式抑制溶血，如图7A所示，其IC50为0.5±0.1nM，(见图7B)，其值与硝化纤维过滤测定的KD值一致。在非常高的适体浓度(＞10nM)，血溶的程度与背景(无血清加入)充分无区别，表明ARC186(序列号：4)可以完全抑制补体活性。ARC186(序列号：4)适体与20kDa(ARC657；序列号：61)，30kDa(ARC658；序列号：62)，分支40kDa(1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4’-丁唑酰胺)(ARC187；序列号：5)，分支40kDa(2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰)(ARC1905；序列号：67)，线性40kDa(ARC1537；序列号：65)，和线性2×20kDa(ARC1730；序列号：66)PEG基团的结合对适体在CH5O溶血分析中的抑制活性只有较少影响(图7A-图7D)。
额外研究中，PEG化抗-C5适体ARC1905(分支40kDa(2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰)；序列号：67)与含有一个末端5’-氨基的非-PEG化前体(ARC672(序列号：63)，在CH50溶血分析中进行比较。人血清溶液(Innovative Research，Southfield，MI)与抗体-包裹绵羊红细胞混合(Diamedix EZ Complement CH50Kit，Diamedix Corp，Miami，FL)，缺失或存在不同浓度的ARC1905和ARC627，最终血清浓度为0.1％，根据制造商推荐方案进行分析。在37℃以搅动1小时进行血溶反应以保证细胞悬浮。孵育末，离心沉淀完整细胞(2000rpm，2分钟，室温)，200μL上清转移至平底聚苯乙烯盘(VWR，cat#62409-003)。测定上清液在415nm的吸光度(OD415)以定量可溶性血色素的释放。使用等式％抑制＝100-100×(A样 本-A无血清)/(A无适体-A无血清)计算每个适体浓度下的％抑制率，其中A样本是不同浓度适体时的样本吸光度，A无血清是无血清是的背景血溶吸光度(100％吸光对照)，A无适体是无适体时的基本补体活性造成的吸光度(0％吸光对照)。使用等式％抑制＝(％抑制)最大×[抑制物]n/(IC50 n+[抑制物]n)+背景，由％抑制相对于[抑制物]的图表测定IC50值。使用等式IC90＝IC50×[90/(100-90)]1/n和IC99＝IC50×[99/(100-99)]1/n计算来源于IC50的IC90和IC99值。本平行研究中ARC1905和ARC627的IC50值为0.648+/-0.0521和0.913+/-0.0679，进一步确证PEG化如果对于适体有影响，其较微弱。
溶血上清的ELISA分析表明该功能性抑制与C5a释放的抑制相一致。因此，溶血数据显示ARC186(序列号：4)，和其PEG化结合物，是抑制C5转化酶催化活性的高度潜在补体抑制物。
非-PEG化材料的溶血分析表明抗-C5适体不与来自多种非-灵长类物种的C5交叉反应，包括，大鼠，豚鼠，狗和猪。然而，在灵长类血清的筛选中观察到明显的抑制活性，包括猕猴，恒河猴和黑猩猩。使用ARC658(序列号：62)，一种ARC186(序列号：4)的30kDa-PEG类似物在猕猴血清中进一步研究抗-C5适体的体外效果。在一种平行比较中(n＝3)，ARC658抑制人类补体活性的IC50为0.21±0.0nM，抑制猕猴补体活性的IC50为1.7±0.4nM(图8)。这样在此测试中ARC658(序列号：62)在猕猴血清中的效力比人类中小8±3倍。
随后的研究中，存在人类血清(Innovative Research，Southfield，MI)，猕猴(Bioreclamation，Hicksville，NY)，或大鼠血清(Bioreclamation，Hicksville，NY)时，通过绵羊红细胞溶血试验分析分支40kDa(2，3-双(mPEG-[20kDa]-丙基-1-氨基甲酰)PEG化抗-C5适体，ARC1905(序列号：67)在经典补体途径中的活性。这些试验在高稀释度血清中进行，人类和猕猴为0.1％，大鼠为0.3％，在相同的条件下，如前所述比较ARC1905和ARC672对绵羊红细胞溶血的抑制效果。一种并列比较中，ARC1905在人类和猕猴血清中都获得对体外补体活性的完全抑制(90-99％)，而ARC1905在大鼠补体样本中显示较少或无特异抑制活性(图59A)。类似与ARC658，ARC1905在试验条件下对于猕猴补体活性的抑制效果降低10倍，如图59B中报道的IC90和IC99值所反映的。
硝化纤维滤膜结合试验。单独的适体通过与γ-32P-ATP和多核苷酸激酶(New England Biolabs，Beverly，MA)共孵育以在其5’末端进行32P-标记。聚丙烯酰胺凝胶电泳后通过凝胶过滤从放射性适体中纯化去除自由ATP。为测定抗-C5适体的亲和力，放射标记的适体(≤10pM)与增加浓度(0.05-100nM)的纯化C5蛋白(Quidel，San Diego，CA)在含有1mM MgCl2的磷酸盐缓冲液中以室温(23℃)和37℃孵育15分钟和4小时。使用Minifold I点杂交96-孔真空吸滤装置(Schleicher&Schuell，keene，NH)通过硝化纤维过滤分析结合反应。使用三层过滤介质，(从顶部至底部)为Protran硝化纤维(Schleicher&Schuell)，Hybond-pnylon(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)和GB002凝胶杂交纸(Schleicher&Schuell)。硝化纤维层，其相对于核酸，优先选择与蛋白结合，适合于捕获带有蛋白配给的复合物中的抗-C5适体，而非-复合的抗-C5适体将通过硝化纤维并与尼龙膜结合。凝胶杂交纸作为其他过滤介质的支撑介质。过滤后，分离过滤层，干燥并暴露于荧光屏(Amersham Biosciences)并使用Storm 860杂交显像系统(Amersham Biosciences)定量。
如图9和图10中显示，C5浓度的增加增加了硝化纤维膜上捕获的ARC186比例。所结合的ARC186对于增加C5浓度的依赖性可以用单-位点结合模型很好描述 C最大是饱和[C5]时的最大％结合；KD是分离常数)。图9和10显示了两种温度孵育15分钟或4小时后ARC186的结合曲线。15分钟孵育后，23和37℃时的ARC186结合曲线是充分无差别的，符合0.5-0.6nM的KD值(图9)。23和37℃时的结合曲线的差别随孵育时间增加而更加明显。4小时孵育后(图10)，23℃时获得的KD值减少至0.08±0.01nM，而37℃时获得的KD值无变化(0.6±0.1nM)。
为验证室温下长时间孵育的理论基础，使用动力学方法进一步分析室温下的亲和力。描述C5·ARC186的分离的逆反应率为vrev＝k-1[C5·ARC186]，其中vrev是速率(单位为M分钟-1)，k-1是第一分离率常数(单位为分钟-1)。描述C5.ARC186复合物形成的正向反应率为vfor＝k1[C5][ARC186]，其中vfor是速率(单位为M分钟-1)，k1是第二分离率常数(单位为分钟-1)。使用假设第一设想分析数据，其中一种反应物的浓度(该情况下为C5)超过另一种([C5]＞＞[ARC186])，这样在反应过程中保持充分的无变化。这些条件下，通过第一过程速率等式描述正向反应，vfor＝k1’[ARC186]，其中k1’＝k1[C5]。
为分析C5·ARC186的解离，放射标记的ARC186(≤10pM)以5nM C5蛋白在含有1mM MgCl2的磷酸盐缓冲液中于室温(23℃)预孵育。通过加入非-标记的ARC186(1μM)起始解离反应，其作为自由C5的捕获剂，并通过硝化纤维过滤终止以分离结合和自由的放射标记ARC186。通过对起始解离反应和过滤间隔的变化，获得ARC186解离时间进程。解离时间进程，表现为硝化纤维膜上捕获的放射标记ARC186百分数的减少(等于结合C5的百分数)，可以用单-指数衰减描述，其中％ARC186结合＝100*e-k-1t(见图11)。由本方法测定的分离速率常数值为0.013±0.03分钟-1，对应于53±8分钟的半衰期(t1/2＝In2/k-1)。
为分析结合反应，C5·ARC186形成的平衡速率常数(keq)以不同浓度的C5蛋白(1-5nM)测定。将C5蛋白和放射标记的ARC186在含有1mM MgCl2的磷酸盐缓冲液中于室温(23℃)混合起始复合物的形成，并通过硝化纤维过滤分离终止。如解离反应中所描述，通过起始反应和过滤间隔的变化获得复合物形成的时间进程。平衡时间进程，表现为硝化纤维膜上捕获的放射标记ARC186百分数的增加，可以用单-指数衰减描述，其中％ARC186结合＝100*e-k-1t。图12显示了1，2和4nM C5的平衡时间进程。如期望的，keq值随[C5]线性增加((keq 1nM)＝0.19±0.02分钟-1；(keq2nM)＝0.39±0.03分钟-1；(keq3nM)＝0.59±0.05分钟-1；(keq4nM)＝0.77±0.06分钟-1；(keq5nM)＝0.88±0.06分钟-1)。试验条件下，keq，k1和k-1间的关系为keq＝k1[C5]+k-1。这样，在0.18±0.01nM-1分钟-1的情况下，从keq相对于[C5]的曲线图得出k1的评估值(见图12插入)。
这些数据表明，在低浓度的C5条件下(例如，0.1nM)，需要延长孵育以使C5和放射标记ARC186的混合物达到平衡。此条件下，keq＝(0.18±0.1nM-1分钟-1)(0.1nM)+0.013分钟-1＝0.03分钟-1，对应于22分钟的半衰期。这样，近2小时的室温孵育(～5半衰期)对于完全(＞95％)平衡是需要的。短时间(例如，15分钟)的孵育将显著低估复合物的实际亲和力，如上显示15分钟(KD＝0.5nM)相对于4小时(KD＝0.08nM)孵育获得的亲和力的差异。可以根据关系KD＝k-1/k1，由动力学数据计算选择性评估的室温KD。此情况下，计算的KD为0.07±0.01nM，其与上述由热动力方法测定的KD完全一致。
ARC186(序列号：4)对于C5的特异性也可以通过比较补体级联放大中C5上游和下游补体成分，以硝化纤维过滤分析方法评估。从Complement Technologies公司(Tyler，TX)购买的纯化的蛋白和蛋白复合物包括：C1q(货号#A099.18；2.3μM)，C3(货号#A113.c8；27μM)，C5(货号#A120.14；5.4μM)，C5ades Arg(货号#A145.6；60μM)，sC5b-9(货号#A127.6；1μM)，因子B(货号#A135.12；11μM)和因子H(货号#A137.13P；6.8μM)。将系列稀释的蛋白在含有1mM MgCl2，0.02mg/mL BSA和0.002mg/mL tRNA的PBS中，于25℃或37℃孵育1-4小时，随后如上所述应用于硝化纤维过滤设备，建立结合反应。通过将数据代入等式：％硝化纤维结合＝振幅×[C5]/(KD+[C5])，根据％硝化纤维结合相对于[C5]的半-对数图测定分离常数KD。
图13中的结果显示适体本质上不识别C5a(KD＞＞3μM)，虽然假设由于其与C5b成分的交互作用，可显示对于可溶性C5b-9较弱的亲和力(KD＞0.2μM)。其他补体成分显示对于适体的中等至较弱的亲和力。非-激活的C3充分地不结合适体；然而，因子H(KD～100nM)和，更小范围内，C1q(KD＞0.3μM)的确结合。综述，数据显示ARC186(序列号：4)主要通过是被C5b区域，以高亲和力结合人类C5。这样，ARC186和其PEG化派生物，例如，ARC1905应不干扰C3b的产生，而其对于细菌的调理作用是非常重要的，或通过调节因子对C’活性具有自然调节。
适体与高分子量PEG配基的结合造成的空间位阻导致亲和力的减弱。PEG-修饰的适体由于这些适体趋向于在缺失目标蛋白的情况下仍结合硝化纤维，因此不适于以硝化纤维过滤方法通过直接结合评估。然而，这些适体的相对亲和力可以通过已知的竞争结合方法，在37℃，以硝化纤维过滤测定其与放射标记的，非-PEG化适体(≤pM)竞争结合目标的能力而对相对亲和力进行测定。当冷(例如，非-放射标记)竞争物浓度增加时，结合目标蛋白的放射标记的适体百分数减少。如图14所示，冷ARC186(序列号：4)或PEG化适体(ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)，和ARC187(序列号：5)(0.05-1000nM)与放射标记的ARC186(序列号：4)竞争结合2nM C5蛋白。此外，所有始终适体的滴定曲线接近重叠，表明ARC657，ARC658和ARC18的PEG-结合对于适体与C5的亲和力具有较少或无影响。
在相似研究中，通过竞争结合试验比较ARC672(具有5’-末端氨基的ARC186；序列号：63)与ARC1905(ARC627结合分支40kDa(2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰)PEG)测定PEG结合物与C5的结合效率。以含1mMMgCl2，0.01mg/mL BSA，0.002mg/mL tRNA的PBS制备适体的10μM储备液，并通过系列稀释制备包括＞100-倍适体浓度范围的10×样本系列。12μL每种适体分别加入至含96μL32P-放射标记的ARC186的96孔板中，制备标标记和冷竞争物的1.1×溶液。90μL标记/竞争物溶液加入至10μL10×C5蛋白以起始反应。每个反应中放射标记ARC186的最终浓度维持常数。结合反应在37℃平衡15-30分钟，随后如前所述在硝化纤维过滤装置上过滤。为对数据进行分析，冷竞争适体被认为是ARC186/C5交互作用的竞争抑制物；通过将缺失竞争物的对照反应(0％竞争对照)进行标准化而计算％抑制。将数据代入等式：％抑制＝振幅×[竞争物]n/(IC50 n+[竞争物]n)，从％抑制相对于[ARC672]或][ARC1905]的半对数图测定IC50值。
如图60所示，通过竞争结合测定，加入分支40kDa(2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰)PEG对于适体的亲和力具有较少或无作用。图60中IC50相对于C5数据的直线的y-截距代表的ARC672和ARC1905的KD值分别近似为0.46+/-0.149nM和0.71+/-0.130nM。该值与37℃测定的ARC186KD值接近。
ARC1905和C5交互作用的温度依赖性也通过竞争方法评估。如上所述将ARC1905系列稀释制备10×样本系列。在25℃和37℃平衡结合反应1-4小时，并在硝化纤维过滤装置上过滤。通过将缺失竞争物的对照反应(％抑制对照)或缺失C5蛋白(100％抑制对照)的数据进行标准化而计算抑制百分数。将数据代入等式：％抑制＝振幅×[竞争物]n/(IC50 n+[竞争物]n)，从％抑制相对于[ARC672]或][ARC1905]的半对数图测定IC50值。如图61所示，ARC1905在25℃和37℃高亲和力结合C5。从IC50相对于C5数据的直线的y-截距获得25℃和37℃的KD值分别0.15±0.048nM和0.69±0.148nM。该值与上述测定的ARC186/C5交互作用KD值一致。
实施例1B：全血化验。
使用以下的全血化验分析抗-C5适体在补体系统选择性途径中的效果。缺失抗凝血剂时，从正常人类志愿者中分离血液。等份量的血液(不含抗-抗凝血剂)与增加浓度的ARC186(序列号：4)在室温或37℃反应5小时。样本经离心分离血清，通过sC5b-9ELISA(C5b-9ELISA试剂盒，Quidel，San Diego，CA)测定血清中C5b的存在。如图15所示，以C5b-9表示的抗-补体活性，在不同温度孵育的样本间的偏离为3μM。室温数据显示定量抑制所需的适体浓度范围为3-6μM，而报道的C5浓度约为400nM。这些结果显示超过10-倍摩尔过剩量的抗-C5适体(ARC186；序列号：4)对于C5完全抑制活性是必需的。
实施例1C：酵母聚糖的补体活性。
酵母聚糖是酵母细胞壁的多糖成分，并且是选择性补体级联放大中的潜在激活剂。血液，血浆或血清体外样本中加入酵母聚糖可以造成补体活性产物聚集的结果，包括C5a和C5b-9的可溶性形式(sC5b-9)。未稀释的人类血清样本(血液研究中心，Boston，MA)，柠檬酸处理的人类全血(血液研究中心，Boston，MA)，或猕猴血清(Charles River实验室，Wilmington，MA)以增加浓度的ARC658(序列号：62)处理，其为ARC186(序列号：4)的30K PEG类似物。对于活性补体，样本中加入10×酵母聚糖悬浮液(Sigma，St.louis，MO)至终浓度为5mg/mL。37℃孵育15分钟后，离心去除酵母聚糖颗粒并通过C5a和/或sC5b-9ELISA(C5b-9ELISA试剂盒，Quidel，San Diego，CA；C5a ELISA试剂盒，BD Biosciences，San Diego，CA)测定补体活性程度。
缺失适体时，相对于未处理样本中～1％的活性，酵母聚糖处理可激活～50％血清或全血C5。加入抗-C5适体至50nM(～10％血液C5浓度)对于sC5b-9的形成具有较小效果。然而，如图16显示，增加浓度的ARC658(序列号：62)对C5进一步滴定可以以剂量-依赖形式抑制C5活性。人类血清或全血中，相对于～2倍C5摩尔量的适体，0.8-1μM ARC658(序列号：62)可以观察到定量(～99％)抑制。为获得猕猴血清中可比较的抑制，需要更高浓度的适体。此情况下，只有10μM适体，或相对于～20倍C5摩尔量的适体，可以获得99％抑制。
类似的研究中，通过使用酵母聚糖激活补体选择性途径，在人类和猕猴样本中测定ARC1905(ARC186的分支40kDa(2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰)PEG化形式)的抑制效果。来源于啤酒酵母的酵母聚糖A由Sigma-Aldrich，Inc供应(货号Z4250-1G，St.Louis，MO)。酵母聚糖以粉末形式提供，并在Dulbecco’s PBS(Gibco，Carlsbad，CA，货号14190-144)中悬浮以制备50mg/mL悬浮液。冷冻的正常人类血清(货号IPLA-SER)从Innovative Research(Southfield，MI)购买。冷冻的正常猕猴血清(货号CYNSRM)从Bioreclamation(Hicksville，NY)购买。供应的5-10mL血清在37℃融解，分装(～1mL)并储存于-20℃。在需要使用前于37℃融解，并在试验过程中放置于冰上。每个试验中血清最终浓度为～100％。用0.9％盐溶液制备20μM ARC1905储液，并系列稀释以制备包括～90倍范围适体浓度的10×样本系列。无-适体(仅有盐溶液)样本作为阴性(0％抑制)对照。
90μL血清加入至96-孔PCR板(VWR，货号1442-9596)。10μL适体样本于室温直接稀释入血清并混合。另一96-孔PCR板中加入8μL50mg/mL酵母聚糖。两块板同时于37℃预-孵育15分钟。预-孵育后，立即将80μL血清/适体混合物直接加入至8μL酵母聚糖并混合，使酵母聚糖最终浓度为5mg/mL。反应板密封并于37℃孵育15分钟。孵育末，每孔加入8μL 0.5M EDTA并混合终止反应。离心沉淀酵母聚糖(3700rpm，5分钟，室温)，～80μL终止上清液转移至新96-孔PCR板并密封。上清于液氮中速冻并储存于-20℃。为控制酵母聚糖-不依赖的背景活性，如上所述制备并处理血清样本，除了以8μL盐溶液替代酵母聚糖。
根据C5a ELISA试剂盒方案以C5a ELISA(ALPCO Diagnostics，Windham，NH，货号EIA-3327)测定，以每个酵母聚糖-激活样本中C5a产生相对水平测定C5活性程度。C5a ELISA试剂盒包括人类特异试剂并用于分析血浆或血清样本中的人类C5a(hC5a)。有必要使用猕猴浓度标准品测定ELISA对于猕猴C5a的反应。为制备一套通用标准，0.5mL人类或猕猴血清与5mg/mL酵母聚糖于37℃孵育15分钟，加入12.5μL 0.5M EDTA终止并离心去除酵母聚糖。酵母聚糖激活的人类血清样本中C5a的浓度经与试剂盒提供的hC5a标准血浆相比，测定为约2μg/mL hC5a。猕猴样本中C5a的浓度，以人类C5a(hC5a eq)相当量表示，约为0.6μg/mL hC5a eq。包括0.4-400ng/mL hC5a或0.12-120ng/mL hC5a eq范围的系列标准通过在大鼠血清中稀释制备(其不干扰ELISA)。标准品用蛋白-预沉淀试剂根据ELISA试剂盒方案预处理，并不经进一步稀释应用预ELISA板。使用VersaMax紫外/可见吸收板读板仪(Molecular dynamies，sunnyvale，CA)于450nm(A450)测定最大吸收。A450对应于C5a浓度的变化为，对于低C5a，其低值为0.1-0.2，高C5a，其高值为～3.5。为在分析样本中对C5a定量，定量的上、下限分别为，人类为25和0.78ng/mL h C5a，猕猴为15和0.94ng/mL hC5a eq。如图62显示对A450相对于ng/mL h C5或hC5a eq作图，使用等式y＝((A-D)/(1+(x/C)B))+D由4-参数获得标准曲线。
C5a分析之前，按照ELISA试剂盒方案将分析样本(包括盐溶液和非-酵母聚糖对照)以蛋白-预沉淀试剂预-处理，并在0.9％盐溶液中系列稀释。未稀释的分析样本中(包括一些无-酵母聚糖对照)的C5a水平典型地超过定量上限(ULOQ)。因此，以1/5，1/50和1/250稀释度进行测定以适应C5a分析样本浓度的全范围。比较合适的(人类或猕猴)标准曲线和稀释度定量C5a水平。使用等式％抑制＝100-100×(C5a样本-C5a无酵母聚糖)/(C5a盐溶液-C5a无酵母聚糖)计算每个适体浓度的％抑制。使用等式％抑制＝(％抑制)最大×[ARC1905]n/(IC50 n+[ARC1905]n)+背景，从％抑制相对于[ARC1905]的图表测定IC50值。使用等式IC90＝IC50×[90/(100-90)]1/n和IC99＝IC50×[99/(100-99)]1/n由IC50值计算IC90和IC99。
C3活性(C5上游的共同补体途径中的步骤)程度可以通过每个酵母聚糖-激活样本中C3a相对水平，以C3a ELISA(Becton-dickinson OptiEIA C3a ELISA试剂盒，货号550499，Franklin Lakes，NJ)根据C3a ELISA试剂盒方案进行测定。
C3a分析之前，样本(包括盐溶液和无-酵母聚糖对照)在0.9％盐溶液中系列稀释。C3a ELISA比C5a跟灵敏；因此，需要进行1/500，1/5000和1/25000稀释以适应样本C3a浓度的全范围。来源于人类血清的试剂盒标准品，替代C5a分析中制备的通用标准品而使用。因为C3a水平变化不大，人类-特异标准品提供了其相对水平的充分指示。
由C5a和C3ELISA获得的数据以Microsoft Excel分析，平均％抑制值使用Kaleidagraph(v.3.51，Synergy Software)作图。使用Excel插件程序Slfit4.1测定IC50，IC90和IC99值。本方法测定的ARC1905在人类和猕猴补体活性中的相对效应在图63和图64中显示。如这些图中所示，ARC1905在人类和猕猴血清中可以体外完全抑制选择性途径的C5活性。人类血清中，在未稀释样本中90％抑制C5活性所需的ARC1905浓度为442±23nM，约等于C5平均摩尔浓度。然而，在分析条件下，以IC90和IC99值表示的ARC1905对于猕猴补体活性抑制效果减少4-6倍。
图65描述了以C3a水平测定的，ARC1905对于C3活性的效应。特异针对补体途径末端的基本原理是抑制C5a的促-炎症功能和膜攻击复合物(MAC)而不阻止C3a和C3b生产中的最后下游因子的病原-攻击功能。图65的数据显示ARC1905，直至2μM，不抑制C3a的产生，表明下游补体活性不受ARC1905负面影响。使用ARC1905在人类和猕猴血清中获得C5活性的选择性途径的充分完全抑制。ARC1905在本方法的条件下对于抑制猕猴C5活性比抑制人类C5活性的能力小数个量级。虽然不期望限制于理论，ARC1905对于补体活性的抑制效果特异针对C5，因此C3的活性未受抑制。
实施例1D：补体活性的管环模型
为测试暴露于异体材料引发的抗-C5适体抑制补体活性的能力，如在心肺循环中发现的，我们使用Nilsson和同事描述的管环模型(Gong等，(1996)Journal of Clinical Immunology 16，222-9；Nilsson等，(1998)Blood 92，1661-7)。Tygon S-50-HL医疗/手术管(1/4’内径)(美国塑料公司((Lima，OH)，货号#00542)被切割为300mm长度(约9mL体积)并灌注5mL含有0.4单位/mL肝素(Celsus)的人类志愿者血液并改变ARC658浓度(序列号：62)(0-5μM)。如Gong等所述，以非-手术硅树脂管(3/8’内径)(美国数量公司(型号R-3603，货号#00271)短节段(～50mm)将每个长度的Tygon管连接成闭合环。管环在37℃水浴中以30rpm旋转1小时。环中的内容物加入至含有EDTA(10nM终浓度)的聚丙烯圆锥管中以终止补体活性。离心分离无血小板的血浆并通过ELISA分析C5a和C3a(C3a ELISA试剂盒，Quidel，San Diego，CA；C5a ELISA试剂盒，BD Biosciences，San Diego，CA)。
缺失适体时的全部补体活性相对于酵母聚糖分析较小。典型地，1小时孵育后C5a水平增加6gn/mL，对应于可利用C5活性的＜1％。然而，该增长是可重现的并可被ARC658(序列号：62)滴定抑制。图17所示，300-400nM ARC658(序列号：62)充分获得C5活性的99％抑制，其水平等于或略小于血液中C5的摩尔浓度。然而不期望限制于理论，虽然在本模型中比酵母聚糖模型需要较少的适体获得C5活性的99％抑制，本现象也可以表明两种方法中使用的补体-活性刺激物的充分不同。C3a的产生也可以作为一种监控以验证ARC658(序列号：62)在补体级联放大中不早于C5抑制活性步骤。孵育1小时后C3a水平增加4000ng/mL，对应于可用C3活性的10％。与C5a产生不同，C3a的产生对ARC658(序列号：62)滴定无依赖性，表明ARC658(序列号：62)特异阻止C5裂解。
管环模型用抗-C5适体ARC1905(序列号：67)重复进行研究。ARC1905在0.9％盐溶液中系列稀释制备包括100倍适体浓度范围(10-1000nM终浓度)的20×样本系列。包括不相关适体(ARC127)的样本作为非-特异寡核苷酸效应的对照。无-适体(盐溶液)样本作为阴性对照。单志愿者血液样本通过标准采血方法获取。来自5个志愿者的血液直接以60mL注射器(Becton-Dickinson，(Franklin Lakes，NJ)，货号309653)吸取，并立即分装入比伐芦定(20μM终浓度)(Prospec-Tany Technogene Ltd.，(Israel)，货号#105BIV01)+/-适体。抗-凝血比伐芦定，一种直接凝血酶抑制剂，替代干扰补体活性的肝素使用。
如上所述进行管环模型。从志愿者中采血后立即在～300mm环(直径1/4’，体积～9mL)中灌注5mL血液/适体/比伐芦定样本。用硅树脂连接管短节段(～50mm)将管闭合成环，产生容积为～4mL。管环在37℃水浴中以32rpm旋转1小时。孵育后，所有5mL样本转移至含有100μL0.5M EDTA的15mL圆锥管(Corning，(Corning，NY)，货号630766)，最终EDTA浓度为10mM。4℃离心(3300rpm，20分钟)(Eppendorf离心机5804)从每个终止样本中手机1mL血浆上清。上清在液氮中速冻并储存于-20℃。为控制背景活性，5mL新鲜血液加入至含有100μL 0.5M EDTA的置冰上的15mL圆锥管制备预-CPB样本。该样本按血浆处理并如上所述储存。
如上所述通过C5a ELISA，以每个活性样本中C5a产生的相对水平测定C5活性程度。按照ELISA试剂盒方案对未稀释的血浆样本进行C5a ELISA，同制造商提供的C5a标准品比较定量C5a样本水平。每个适体浓度对C5a产生的％抑制通过等式％抑制＝100-100×(C5a样本-C5aCPB-前)/(C5a盐溶液-C5aCPB-前)计算。使用等式％抑制＝(％抑制)最大×[ARC1905]n/(IC50 n+[ARC1905]n)+背景，从％抑制相对于[ARC1905]的图表测定IC50值。使用等式IC90＝IC50×[90/(100-90)]1/n和IC99＝IC50×[99/(100-99)]1/n由IC50值计算IC90和IC99。
如上所述通过C3a ELISA，以每个活性样本中C3a产生的相对水平测定C3活性程度。C3a分析之前，样本(包括盐溶液和CPB-前对照)在0.9％盐溶液中系列稀释。C3a ELISA比C5a更灵敏，因此，需要1/5000稀释度以适应样本C3a浓度范围。通过与试剂盒标准品比较对样本C3a水平定量，如C5a所述计算％抑制。使用Microsoft Excel分析数据，使用Kaleidagraph(v3.5Synergy Software)对％抑制值作图。使用Excel插件程序Slfit4.1测定IC50，IC90和IC99值。
五为志愿者中ARC1905和无关适体，ARC127对于补体活性的平均效应在图66中描述。如图67显示，以C5a产生为反映的C5活性的完全抑制，ARC1905可获得＜500nM，而无关适体无抑制效应，其值为1μM。平均全血IC50，IC90和IC99值分别为119±28.6nM，268±39.2nM和694±241nM，(图66)。不期望限制于理论，假设ARC1905排除于细胞血体积，其包括全部的45％。IC50，IC90和IC99值，适合于反映血浆中C5抑制情况，因此，为216±52.0nM，487±71nM和1261±438nM。这些值与由酵母聚糖-介导的血清补体活性ARC1905抑制计算的参数一致，表明细胞血成分不明显干扰ARC1905的抗-C5活性。ARC1905或无关适体至1μM前不抑制C3a产生。然而不期望限制于理论，其表明ARC1905既不抑制C3转化酶反应，也不抑制其他改变级联活性的步骤，如C3沉淀和转化酶装配。
实施例2
重新选择和测序
dRmY集合选择C5
进行两种选择以鉴定人类全长C5蛋白的dRmY适体。C5蛋白(Quidel Corporation，San Diego，CA或Advanced ResearchTechnologies，San Diego，CA)以全长(“FL”)和部分胰酶化(“TP”)形式使用，两种选择直接针对固定于疏水板上的蛋白目标进行。相对于未选择的集合，两种选择都产生富含结合全长C5的集合。这里的实施例显示的所有序列以5’至3’显示。
集合制备：DNA模板序列
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GGTCGATCGATCGATCATCGATG(ARC520；序列号：70)使用ABI EXPEDITETM DNA合成仪合成，并通过标准方法去蛋白。模板以5′引物TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC(序列号：71)和3′引物CATCGATGATCGATCGATCGACC(序列号：72)扩增，并随后用于Y639F单点突变T7 RNA聚合酶体外转录的模板。使用200mM HEPES，40nM DTT，2mM亚精胺，0.01％Triton X-100，10％PEG-8000，9.5mM MgCl2，2.9mM MnCl2，2mM NTPs，2mM GMP，2mM精胺，0.01单位/μl无机焦磷酸酶，和Y639F单点突变T7 RNA聚合酶。
选择：第一轮，在硝化纤维过滤结合柱进行阳性选择步骤。简要的，1×1015分子(0.5n摩尔)的RNA文库在含有3μM全长C5或2.6μM部分胰酶化的C5于100μl结合缓冲液(1×DPBS)中室温孵育1小时。使用Schleicher&Schuell(Keene，NH)0.45μm硝化纤维旋转柱分离RNA：蛋白复合物和自由RNA分子。柱子用1mL 1×DPBS预冲洗，含有RNA：蛋白的溶液加入至柱子并以1500g离心2分钟。以1mL缓冲液冲洗三次以从滤膜上去除非特异结合物，随后与滤膜结合的RNA：蛋白复合物用洗脱缓冲液(7M尿素，100mM醋酸钠，3mM EDTA，预热至95℃)冲洗2次洗脱。洗脱的RNA进行沉淀(2μL糖原，1体积异丙醇，1/2体积乙醇)。RNA以ThermoScript RT-PCRTM系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据制造商说明，使用上述的序列号：72的3’引物进行逆转录，随后进行PCR扩增(20nM Tris pH 8.4，50mM KCl，2mM MgCl2，0.5μM引物，序列号：71和序列号：72，每种dNTP 0.5Mm，0.05单位/μL Taq聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA))。使用Centricep柱子(Princeton Separatrions，Princeton，NJ)纯化PCR模板并用于下一轮集合的转录。
随后一轮的的选择中，以Nunc Maxisorp疏水板(Nunc，Rochester，NY)进行结合和自由RNA的分离。分别以含20p摩尔全长C5和部分胰酶化C5的100μL 1×DPBS于室温1小时固定于板表面。去除上清，孔用120μL洗涤缓冲液(1×DPBS)冲洗4次。蛋白孔以含有0.1mg/mL酵母tRNA和0.1mg/mL鲑精DNA作为竞争物的1×DPBS缓冲液封闭。使用的集合的浓度通常高于蛋白浓度的5倍。结合RNA也于室温结合空孔1小时以去除任何结合塑料的序列，并在不含蛋白的封闭孔中孵育以在阳性选择步骤前从集合中去除任何结合竞争物的序列。RNA文库于室温孵育1小时，与固定C5结合的RNA在选择板中通过加入RT混合物(3’引物，序列号：72和Thermoscript RT，Invitrogen)直接反转录，并于65℃孵育1小时。最后的cDNA用于PCR(Taq聚合酶，New England Biolabs)模板。扩增的集合模板DNA以Centrisep柱子(Princeton Separations)根据制造商的说明去除盐，并用于下一轮选择的RNA文库的转录。每一轮的转录集合以10％聚丙烯酰胺凝胶纯化。
使用三明治过滤结合(点杂交)方法监控选择过程。5’-32P-标记的RNA文库(痕量)与C5，1×DPBS加上0.1mg/mL tRNA和0.1mg/mL鲑精DNA于室温孵育30分钟，随后用点杂交装置(Schleicher和Schuell)进行硝化纤维和尼龙三明治过滤。以单点扫描(+/-300nM C5)每3轮计算和监控与硝化纤维结合的RNA文库百分数。如上所述使用蛋白滴定和点杂交装置测定文库Kd值。
选择数据：两种选择经10轮扩增后都超过天然文库。见图18。第10轮，文库Kd值对于全长大约为115nM，胰酶化的为150nM，但是两者中的结合程度在稳定期仅为10％。R10文库使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆并测序。
序列信息：对每个文库的45个克隆测序。单克隆ARC913(序列号：75)占据R10全长文库的24％，2组副本和单一序列弥补剩余。R10胰酶化文库含有8拷贝的相同ARC913序列(序列号：75)，但该文库主要为另一序列(AMX221.A7；46％)。克隆ARC913(序列号：75)Kd值约为140nM，结合程度为20％。见图19。
表3中所列的单一序列为5’至3’方向，表示dRmY SELEXT M条件下选择的适体的核酸序列。本发明的实施方案中，来源于选择的(并且如序列所列的)嘌呤(A和G)是脱氧的，嘧啶(U和C)和2’-OMe。表3所列的序列可以含有或不含有帽子(例如，3’-反向dT)。下列适体的唯一序列从核苷23开始，紧密跟随5’固定序列GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(序列号：73)，并延伸至3’固定核酸序列GUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG(序列号：74)。
表3：C5dRmY适体的核苷序列
ARC913(序列号：75)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG
溶血分析：使用上述的溶血方法，与ARC186(序列号：4)(抗-C5适体，阳性对照)和未选择的dRmY文库(阴性对照)比较，分析ARC913(序列号：75)对于补体系统经典途径的效应。溶血抑制方法中，在缺失ARC913(序列号：75)时将0.2％人类血清与抗体-包被的绵羊红细胞(Diamedix Ez Complement CH50试验，Diamedix Corporation，Miami，FL)混合。在含有钙，镁和1％凝胶的巴比妥盐缓冲液(GVB++补体缓冲液)中进行试验，并于25℃孵育1小时。孵育后样本经离心。测定上清的415nm吸光度(OD415)。与对照的％溶血活性比较表示以溶血抑制活性。见图20。适体的IC50经计算为30nM。
实施例3
成分和序列优化
实施例3A：ARC913优化
基于ARC913(序列号：75)的六种结构经转录，凝胶纯化，以点杂交测定与C5的结合。ARC954与母本克隆相似，其Kd值为130nM，结合程度为20％，而ARC874(序列号：96)是另一种结合C5的克隆，其Kd值为1Mm。
表4所列的独立序列为5’至3’方向，来源于以dRmY SELEX条件选择的适体。本发明的实施方案中来源于该选择的(及所列序列表示的)嘌呤(A和G)是脱氧的，嘧啶(U和C)是2’-OMe。表4中所列的每一种可以包括或不包括帽子(例如，3’-反向dT)。
表4.ARC913最小克隆的核苷序列
ARC874(序列号：76)
CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGG
ARC875(序列号：77)
CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAAACGCAGGG
ARC876(序列号：78)
GGGUUUGGCACAGGCAUACAUACCC
ARC877(序列号：79)
ARC878(序列号：80)
GGCGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGCC
ARC954(序列号：81)
CGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCG
实施例3B：ARC913的优化：掺杂重选
进行掺杂重选以优化克隆ARC913(序列号：75)的C5结合亲和力并测定关键结合因素。掺杂重选用于将所需的序列暴露于活性克隆或minimer。以基于单一序列设计的合成，退化文库进行选择。退化水平通常为野生型核苷的70％至85％。通常，可获得自然突变，一些情况下序列的改变可以增强亲和力。合成序列信息可以用于鉴定最小结合模体并定位于优化效果。
文库的制备：模板序列
taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GTTACGACTAGCATCGATG(序列号：82)是基于ARC913(序列号：75)的，以每个起源于掺杂水平为15％的随机区域的残基合成，例如，每个随机(“N”)位点，残基具有85％的可能性为野生型序列CTTGGTTTGGCACAGGCATACATACGCAGGGGTCGATCG(序列号：83)中的核苷，15％可能性为其他三种核苷的一种。
如上所述制备掺杂重选的模板和RNA文库。模板经引物taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC(序列号：84)和CATCGATGCTAGTCGTAAC(序列号：85)扩增。用全长C5进行两次选择，一种选择的洗涤步骤中使用高浓度盐溶液。如上所述进行选择方法，除了：1)第1轮使用疏水板(以及随后的循环中)，仅有一步阳性步骤；及2)所有选择中不使用竞争物。C5浓度和RNA文库浓度分别维持为200nM和1μM。
掺杂重选数据。正常和高盐浓度的选择经5轮循环后富集。第5轮，文库的kd值在高盐浓度选择中为165nM，正常盐选择中为175nM。两者稳定期的结合程度都为20％。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，carlsbad，CA)克隆R4文库，对每个文库中的48个克隆测序。每个文库中的12个克隆进行转录并以500nM C5进行单点杂交分析。使用上述的点杂交方法再测定分离常数(Kds)。通过将数据代入等式：片断RNA结合＝增幅*Kd/(+[Kd]C5)，评估单点扫描中鉴定的11个最佳克隆的Kds。三个最佳Kd的克隆是序列号：91(73nM)，序列号：96(84nM)和序列号：95(92nM)。表5列出了11个克隆的序列。
表5所列的序列为5’至3’方向，表示以dRmY SELEX条件选择的适体核苷序列。本发明的实施方案中来源于该选择的(及所列序列表示的)，如文中描述的，对应的序列包括残基的dRmY联合，其中嘌呤(A和G)是脱氧的，嘧啶(U和C)是2’-OMe。表5中所列的每一种可以包括或不包括帽子(例如，3’-反向dT)。下列适体的唯一序列从核苷23开始，紧密跟随5’固定序列GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(序列号：86)，并延伸至3’固定核酸序列GUUACGACUAGCAUCGAUG(序列号：87)。
表5.掺杂重选的克隆序列
(序列号：88)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(序列号：89)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGUGUCGAUCUGUUACGACUAGCAUCGAUG
(序列号：90)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUAAAUACGCAGGGCUCGAUCGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(序列号：91)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCCCAGGCAUAUAUACGCAGGGAUUGAUCCGUUACGACUAGCAUCGAUG
(序列号：92)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCGCAGGCAUACAUACGCAGGUCGAUCGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(序列号：93)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGUUGUGGCACAGCCAACCCUACGCACGGAUCGCCCGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(序列号：94)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGUCGAUCGGUUACGACUA
(序列号：95)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUAGGUUCGCACUGUCAUACAUACACACGGGCAAUCGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(序列号：96)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCNCAGGCAUANAUACGCACGGGUCGAUCGGUUACGACUAGCAU
(序列号：97)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUUCUCUGCCACAAGCAUACCUUCGCGGGGUUCUAUUGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(序列号：98)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUAUAUACGCAGGGUCGAUCCGUUACGACUAGCAUCGAUG
实施例3C；ARC186的40kDa分支PEG修饰
寡核苷酸5’NH2-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T-3’(ARC672，序列号：63)在加速DNA合成仪(ABI，Foster City，CA)上根据制造商的方案使用商业提供的2’-OMe RNA和2’-F RNA和TBDMS-保护的RNA亚磷酰胺(Glen Research，Sterling，VA)和反向脱氧嘧啶CPG标准品合成。末端氨基功能团与5’-氨-修饰物，6-(三氟乙酰氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺，C6-TFA(Glen Research，Sterling，VA)结合。去蛋白后，寡核苷酸以离子交换色谱在Super Q 5PW(30)树脂(Tosoh Biosciences)上纯化并经乙醇沉淀。
合成后氨基修饰的适体与不同的PEG配基结合。适体溶解于水/DMSO(1∶1)溶液至浓度为1.5至3mM之间。加入pH8.8碳酸钠缓冲液至终浓度为100mM，寡核苷酸与溶解与等体积乙腈中的超过其摩尔量1.7倍的期望的PEG试剂结合(例如，ARC190540kDa Sunbright GL2-400NP p-硝基苯磷酸酯[NOFCorp，日本]，或ARC 18740kDa mPEG2-NHS酯[Nektar，Huntsville AL])。最后的产物以Super Q 5PW(30)树脂(TosohBiosciences)进行离子交换色谱纯化，并使用amberchrom CG300-S树脂(Rohm和Haas)进行反向色谱去盐，并冻干。图21显示了ARC187(序列号：5)的结构，图22显示了ARC1905(序列号：67)的结构。
实施例4
分离灌注心脏模型
实施例4A：ARC186原理试验
人类血浆中补体成分C5的平均浓度约为500nM。Krebs Heinseleit缓冲液灌注的分离小鼠心脏暴露于6％人类血浆时，可激活人类补体级联放大，导致C5裂解为C5a和C5b。成分C5b随后与补体成分C6，C7，C8和C9形成复合物，称为“膜攻击复合物”(“MAC”或C5b-9)，其可损害心脏血管和心肌，这样导致心肌损伤(增加的舒张期末压，心律不齐)和心搏停止(Evants等，Molecular Immunology，32，1183-1195(1995))。先前的，抑制人类C5裂解的单克隆和单链抗体(Pexelizumab或Pexelizumab的单-链scFv形式)可以在本模型中进行试验并显示了对心肌损伤和功能紊乱的抑制(Evans等，1995)。
本模型用于建立C5-抑制适体ARC186(序列号：4)，类似于Pexeluzimab，抑制人类C5-介导的分离灌注小鼠心脏的补体损伤。从Charles River实验室(Wilmington，MA)购买C57B1/6小鼠。简要的，深度麻醉后，分离每个小鼠的心脏，并用平末端针头插入大动脉，以Krebs Heinseleit缓冲液连续灌注。压力传感器(小鼠特异的，Boston，MA)插入至左心室以连续测定心律和心室内压力。平衡15分钟，测定基线，随后心脏以含有6％人类血浆+/-不同浓度适体的缓冲液灌注(见图23)。如Evans等描述的本研究中，我们发现以Krebs Heinseleit缓冲液+6％人类血浆在5分钟内出现衰竭，而仅以缓冲液连续灌注的心脏持续跳动超过2小时。因此，每种试验的长度定义为15分钟。图23描述了ARC186进行的研究结果。
连续监测和纪录心室内压力可获得压力变化图(图24和25)。最低的交点表示舒张期末压(“EDP”)，最高交点表示收缩压(“SP”)。每个图形中位于垂直黑线左边的基线压力曲线标记为“0”。如前述(Evans等，1995)，以6％人类血浆灌注的心脏表现出左心室舒张期末压的快速升高，最后在5分钟内心搏停止(心脏停止)时达到顶点。以50-倍摩尔过量的无关适体加入至人类血浆中，也观察到增加了的EDP和心搏停止(图24)。
当ARC186以等摩尔量加入系统中时，EDP也有快速增加，心搏停止时达到顶点(图25)。显示补体-介导损伤，升高的EDP和心搏停止的所有三组心脏中，试验末心脏呈明显的半透明色和浮肿状。当血浆中加入10-倍或50-倍摩尔过量的ARC186(图25)时，心室压力曲线维持正常，且未观察到心搏停止。此外，也未在这些组中观察到前述的浮肿和肿胀。
每个试验中，每5-分钟间隔纪录心率，对各组中每个间隔间的平均心率作图。如图26显示，无适体灌注或以无关适体灌注的心脏立即出现心搏停止，通常在5分钟内。以等摩尔两加入至系统中的ARC186明显地延缓心搏停止的出现。然而，本组中的心脏最后仍衰竭。加入超过10-倍或50-倍摩尔量的ARC186在每个试验中都保护了心率。
计算代表性的衰竭心脏(无适体或50-倍摩尔过量的无关适体)和相对的ARC186-保护的心脏(10-倍和50-倍摩尔过量的ARC186)超过基线的心脏重量增加百分数。如图27所示，ARC186保护的心脏比对照组中衰竭心脏的重量明显减少。
由于ARC186抑制C5而非C3的裂解，从ARC186保护的分离心脏的流出物中发现C3裂解产物(C3a)，而非C5裂解产物(C5a或C5b)。为直接显示ARC186抑制人类血浆C5的裂解，各组流出物中的人类补体蛋白C5a和C5b(C5裂解产物)和C3a(C3裂解产物)的相对水平通过商业提供的ELISA试剂盒测定(C5b-9ELISA试剂盒，Quidel，San Diego，CA；C5a和C3aELISA试剂盒，BD biosciences，San Diego，CA)。ARC186以计量依赖的形式抑制人类血浆C5的裂解和C5a(图28)和C5b-9(图29)的产生。相反，ARC186对于人类C3裂解为C3a和C3b(图30)无效应，进一步显示C5的分子特异性。
一旦产生，补体C3b和C5b片段在临近补体活性位点的组织中沉积。试验完成后，小鼠心脏在OCT介质(Sakura Rinetek，Torrance，CA)中冷冻，切片并使用标准免疫组化染色，观察人类C3b(克隆H11，Chemicon，Temecula，CA)，人类C5b-9(克隆aE11，DAKO，Carpinteria，CA)或对照小鼠IgG(VectorLaboratories，Burlingame，CA)的存在。图31显示的该研究的结果。
如本研究所述，基于前述的研究，测试抗-C5抗体Pexeluzimab在补体系统的的效应(Evans，Molecular Immunol 32：1183，(1995)，使用Krebs Heinseleit缓冲液和6％肝素化人类血浆灌注的分离小鼠心脏，以补体成分C5-介导的组织损伤体外模型对C5-抑制适体ARC186进行测试。使用该模型，显示C5-抑制适体(a)抑制人类血浆C5(而非C3)的裂解，(b)抑制人类C5(而非C3)在小鼠心脏组织上的沉积和(c)以临床相关浓度(5μM，超过C510倍摩尔量)抑制人类C5b-9介导的心肌损伤。这些数据显示当人类补体级联放大在生理相关方式上被激活时，C5-抑制适体可以抑制血浆C5的裂解并防止心肌损伤和衰竭。
实施例4B：PEG化适体的效应
本研究中使用的材料和方法与上述的实施例4A中相同。图32显示试验设计和结果。试验前半部分使用人类肝素化血浆(血液研究中心，Harvard Medical School，Boston，MA)作为补体来源，第二部分使用肝素化猕猴血浆(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)作为补体来源。PEG化适体(ARC658；序列号：62)以增加的摩尔比例加入至系统中。虽然所有相关的心室压力曲线都被收集，表列出了增加的末期舒张压(EDP)的存在或缺失，无论心搏停止是否发生，时间为直至心脏衰竭(定义为EDP增高和心搏停止的出现)。
人类血浆进行的试验过程中，ARC658(序列号：62)的最佳剂量经测定为等摩尔(500nM)，而非人类灵长类血浆试验中，需要50-倍摩尔过量(25μM)以保护心脏受C5b-介导的损伤(见图32)。
这些数据与体外试验中显示的抗-C5适体对于人类和非-人类灵长类C5亲和力的差异相一致。不期望限制于理论，实施例5描述的我们随后的猕猴PK/PD研究中，进一步显示30-倍摩尔过量的适体是抑制酵母聚糖-介导的血浆C5裂解所需的，进一步支持适体结合灵长类C5的亲和力低于人类C5的观点。
综述，这些研究表明C5-抑制适体ARC186(序列号：4)和更广范围的ARC658(序列号：62)在小鼠分离灌注心脏模型中是有效的。本模型也显示相比于人类C5-介导的心脏损伤(等摩尔量)，需要使用更多ARC658(序列号：62)以抑制猕猴血浆C5-介导的心脏损伤(30+摩尔过量)，进一步支持适体与灵长类C5结合的更低亲和力的体外试验数据。最后，这些数据表明猕猴需要超过30-倍摩尔量以在PK/PD研究总显示体内C5抑制。
实施例5抗-C5适体在动物中的药物代谢和药代动力学
实施例5A-5G中，所有基于质量的浓度数据仅指适体的寡核苷酸部分的分子量，与PEG连接的质量无关。
实施例5A：C5抑制物ARC186在灵长类和大鼠血浆中的代 谢稳定性
适体的非PEG化寡核苷酸前体(例如，ARC186；序列号：4)在大鼠和猕猴血浆(Charles River Labs，Wilmington，MA)中测试以评估其稳定性，动力学速率，和降解途径。使用5’末端-放射标记(32P)的适体，于37℃在95％血浆(柠檬酸化)中孵育超过50小时进行试验。所有选择的时间点，吸取等量的含有适体的血浆，立即在液氮中速冻，储存于-80℃。使用液相-液相(酚-氯仿)抽提，凝胶电泳(10％还原聚丙烯酰胺测序凝胶)和高清放射自显影对血浆中适体和其代谢进行测定和分析。
图33显示了大鼠和猕猴血浆中，作为孵育时间参数的全长适体剩余量的对数线性图。两个物种中的降解特性似乎为充分单相的，其速率恒定为k～0.002小时-1。
实施例5B：ARC657，ARC658和ARC187在大鼠中静脉注 射后的药代动力学
为分析ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)的药代动力学特性，并评估灵长类和人类中所需的剂量水平和给药频率，在插入导管的Sprague-dawley大鼠(Charles River Labs，Wilmington，MA)上进行药代动力学研究。适体在标准盐溶液中制成10mg/mL(寡核苷酸重量)形式，并在无菌条件下无菌过滤(0.2μm)入预先消毒的剂量瓶中。大鼠研究中的给药途径为以10mg/kg剂量通过尾静脉推注。研究中每组由3个动物组成，给药前和给药48小时后的特定时间点无菌采血。图34显示了研究设计。从手术插入的颈静脉导管获得血液样本，直接转移至EDTA-包被的管中，振荡混匀，并放置于冰上直至进行血浆操作。
血液-EDTA管经5000rpm离心5分钟收集血浆，上清(血浆)转移至新的预-标记管。血浆样本储存于-80℃直至试验。通过直接将血浆等量加入含有商业提供的荧光核算测定试剂OligreenTM(Molecular Probes，Eugen，OR)进行均一试验形式对血浆样本ARC187分析。室温孵育短时间后(5分钟)，避光，以荧光板读数仪(SpectraMax Gemini XS，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测定试验板。每个孔中的荧光信号与适体浓度成比例，通过将荧光值代入由荧光浓度标准曲线(二重或三重平均值曲线)计算样本浓度。获得每组每个动物每个时间点的平均血浆浓度。使用工业标准药代动力学模型软件WinNonLinTM v.4.0(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)对血浆浓度相对与时间数据进行非分割分析(NCA)。从下列基本药代动力学参数获得评估：最大血浆浓度，Cmax；浓度-时间曲线下的面积，AUC；半衰期，t1/2；终端清除，C1；和恒定态的体积分布，Vss。
图35显示了平均血浆浓度相对于时间的数据，并在图36中作图。使用WinNonLinTM v.4.0对浓度相对于时间的数据进行分割分析(NCA)。该分析产生的数据描述于图37。
如预期的，40kDa适体ARC187(序列号：5)具有最长的半衰期，而20kDa适体ARC187(序列号：61)具有最短的。获得的相对于已知血浆体积(～40mL/kg)的Vss显示ARC187(序列号：5)对于蛋白和/或静脉外空间组织的中等程度的结合/隐没。假设需要维持5倍摩尔过量的适体，本研究显示ARC187(序列号：5)提供了维持期望血浆水平所需的适体给药频率和总量的明显优势。
之前在啮齿类和灵长类中进行的相似适体的研究(数据未显示)已经显示剂量比例性/线性，直至剂量高至30mg/kg，所以该剂量水平将造成非线性药代动力学的特性是非预期的。
实施例5C：ARC187和ARC1905在小鼠静脉内给药后的药 代动力学
为研究与不同的40kDa分支PEG连接的ARC186(序列号：4)寡核苷酸骨架区别于ARC187(序列号：5)的药代动力学，在雌性CD-1小鼠(从Charles River Labs，Wilmington，MA获得)上进行药代动力学研究。适体在标准盐溶液中制成2.5mg/mL(寡核苷酸重量)形式，并在无菌条件下无菌过滤(0.2μm)入预先消毒的剂量瓶中。小鼠研究中的给药途径为以10mg/kg剂量通过尾静脉推注。研究中每组由3个动物组成，给药前和给药72小时后的特定时间点无菌采血。图38A显示了研究的设计。
同末端心室穿刺采血，直接转移至EDTA-包被的管中，振荡混匀，并放置于冰上直至进行血浆操作。血液-EDTA管经5000rpm离心5分钟收集血浆，上清(血浆)转移至新的预-标记管。血浆样本储存于-80℃直至试验。通过直接将血浆等量加入含有商业提供的荧光核算测定试剂OligreenTM(Molecular Probes，Eugen，OR)进行均一试验形式对血浆样本ARC187分析。室温孵育短时间后(5分钟)，避光，以荧光板读数仪(SpectraMax Gemini XS，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测定试验板。每个孔中的荧光信号与适体浓度成比例，通过将荧光值代入由荧光浓度标准曲线(二重或三重平均值曲线)计算样本浓度。获得每组每个动物每个时间点的平均血浆浓度。使用工业标准药代动力学模型软件WinNonLinTM v.4.0(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)对血浆浓度相对与时间数据进行非分割分析(NCA)。从下列基本药代动力学参数获得评估：最大血浆浓度，Cm ax；浓度-时间曲线下的面积，AUC；半衰期，t1/2；终端清除，C1；和恒定态的体积分布，Vss。图38B显示了平均血浆浓度相对于时间的数据。
使用WinNonLinTM v.4.0对浓度相对于时间的数据进行分割分析(NCA)。该分析产生的数据描述于图38C。如预期的，来源于两个供应商的40kDa PEG在小鼠中显示了相同的药代动力学。
上述使用oligreen分析的相同的ARC187和1905血浆样本使用高效液相色谱(HPLC)分析并以UV测定。
使用Microsoft Excel 2003计算ARC187和ARC1905的平均血浆浓度值。当血浆浓度值低于给药前(0时间)的生物分析LIOQ值时，则赋予0值。给药后低于LIOQ值的样本从平均血浆浓度计算中忽略。使用WinNonlin，版本5.1(Pharsight Corporation，Mountainview，CA)，将平均血浆浓度数据用于模型-非依赖的PK分析。使用线性梯形规则评估血浆浓度-时间曲线(AUC0-最终)下的面积。为进行计算，低于LIOQ分析的值，除了给药前的样本，将从PK参数评估计算中忽略。使用等式t1/2＝0.693/λz计算外显半衰期，其中λz是浓度相对于时间曲线的终端斜率衰减中评估的恒定清除速率。峰浓度后的末端相中的至少三个血浆浓度被用于测定λz，并且测定的相关系数(r2)要求≥0.85。
综述，HPLC分析确证了先前的oligreen分析，显示基于平均C最大，AUC0-最终和AUC0-∞参数比较，ARC1905和ARC187具有生物等同性。ARC1905和ARC187间AUC0-最终和AUC0-∞值的差异(由HPLC测定)在生物等同可接受要求±20％内。
实施例5D：小鼠静脉内推注给药后C5抑制物ARC657，AR C658和ARC187的组织分布研究
从Charles River Labs(Wilmington，MA)获得雌性CD-1小鼠。制备5mg/mL ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)注射盐溶液。在无菌条件下将剂量形式无菌过滤(0.2μm)如预先-除菌的剂量瓶中，动物以25mg/kg的剂量通过尾静脉推注给药。每组包括3个动物和4个时间点，t＝给药前，3，6，12小时。放血后，每个动物的脉管系统用大量盐溶液(V～30mL)冲洗以去除任何脉管中存留的血液。收集组织(心脏，肺，肾)，称重，以50％w/v在标准盐溶液中均质化，储存于-80℃直至分析。
使用杂交基础的ELISA-型方法对组织ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)进行分析。本方法中，以浓度为125nM的生物素标记的探针预先固定于96孔板3小时。板用1×PBS冲洗5次。以150μl/孔1×SuperBlock TBS(Pierce Chemical，Rockford，IL)封闭板子。在此冲洗板，覆盖并储存于4℃直至使用。在分离管中，样本在含有200nM FAM-标记的(5’-荧光素)样本测定探针于90℃退火10分钟，立即置于冰上。浓度标准品和血浆/组织对照样本也以样本-测定探针溶液预-退火，并加入至含有固定生物素探针的试验板孔中，于45℃退火2.5小时。再次冲洗板，以100μl/孔加入含有1μg/mL连接辣根过氧化酶的抗-荧光素单克隆抗体(抗-FITC MAb-HRP，Molecular Probes，Eugene，OR)的1×PBS，并孵育约1小时。如上再次冲洗板。加入100μl含有荧光HRP底物(QuantaBlu，Pierce Chemical，Rockford，IL)的溶液，避光孵育20-30分钟。孵育45分钟后，以100μl/孔加入终止液以终止荧光沉淀生成反应。于荧光微孔板读数仪(SpectraMax Gemini XS，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)以325nm激发光和420nm吸收光读板。每孔测定10次。心脏组织中的所有三种适体在三个时间点测定(图39)。
实施例5E：研究1中C5抑制物ARC657，ARC658和ARC 187猕猴静脉内给药后的药代动力学和药效学
ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)在标准盐溶液中制成10mg/mL形式，并在无菌条件下无菌过滤(0.2μm)入预先消毒的剂量瓶中。用于猕猴研究的给药途径为通过手术植入股动脉导管以30mg/kg剂量静脉推注(约为50-倍摩尔过量)。图40描述了研究设计。从股动脉导管获得血液样本，立即转移至柠檬酸钠包被的管中，振荡混匀，放置冰上直至离心分离血浆(3000rpm 5分钟)。血浆等分为25μl，储存于-80℃，每个样本取一份使用前述大鼠PK章节中描述的荧光-基础的OligreenTM方法评估适体浓度。
灵长类血浆浓度相对于时间的数据在图41中以表格形式表示。如预期的，40kDa PEG适体ARC187(序列号：5)在血浆中维持最长时间，而20kDa PEG适体ARC657(序列号：61)维持最短的时间。图41中的数据显示双-间隔模型将使数据最适合。这样，图42中报道的药代动力学参数评估值来源于使用工业标准药代动力学模型软件WinNonlinTM v.4.0(Pharsight corp.，Mountain view，CA)的双-间隔模型。
如图42显示，所有适体具有相似的C最大值，在23和30μM之间，表明适体剂量(30mg/kg)可充分获得血浆适体相对C550倍摩尔过量的浓度(50倍摩尔过量，约为25μM)。索然其有10000分子量的差异，ARC657(20kDa PEG)(序列号：61)和ARC658(30kDa PEG)(序列号：62)具有相似的暴露(AUC)，t1/2(α)和t1/2(β)值，比其他分子具有延长的t1/2(α)和略长的t1/2(β)。
药代动力学研究中收集的额外血浆样本随后用于体外分析测定灵长类C5抑制的效果。如上所述进行酵母聚糖活性试验以测定灵长类C5b-9和C5a数量。以多种形式对数据作图，包括C5b-9浓度相对于样本时间(图43a)，C5b-9浓度相对于适体浓度(图43b)，C5a浓度相对于样本时间(图43c)，和C5a浓度相对于适体浓度(图43d)。
40kDa PEG适体ARC187(序列号：5)长时间抑制灵长类C5的裂解(C5b-9和C5a浓度)。当对C5b-9和C5a数据相对于适体浓度作图时，其显示C5抑制适体浓度必须超过30倍摩尔量，而不论PEG分子的大小，以完全抑制C5裂解(图43b和43d)。
概要，猕猴PK/PD研究数据显示(a)如预期的，需要至少30倍过量的适体(约15μM血浆适体浓度)以已知C5在猕猴体内的裂解，而不论PEG基团的大小，(b)C5-抑制适体在该物种中不导致明显毒性，并且(c)当动物给予相对高剂量时(50倍摩尔过量)，血浆适体水平在试验期间维持在何时的分析水平使之可以计算药代动力学参数。
实施例5F：C5抑制物ARC658和ARC187在猕猴静脉内给 药后的药代动力学和药效学-研究2
研究2与上述的研究1相似，除了a)只评估了两个化合物(ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5))；b)每组中的动物增加至4个；和c)删除了1-分钟血浆样本，替代以144小时样本以确证末端半衰期是基于更多数据点。这两种形式和剂量，血液取样和血浆分离技术与上述研究1中描述的方法一致。图44描述了研究2的设计。
研究2完成后，如研究1分析血浆以测定a)静脉内给药后不同时间点的血浆适体浓度，和b)C5抑制的效应。
血浆适体浓度作为时间的函数(图45)作图，ARC658(序列号：62)和ARC187)(序列号：5)的最初结果在图39和40中以表格表示。40kDa PEG适体ARC187(序列号：5)在血浆中长时间存在。图45的检查显示双-间隔模型可以时数据最佳适合。这样，图46中报道的药代动力学参数评估值来源于使用WinNonlinTM v.4.0(Pharsight corp.，Mountain view，CA)的双-间隔模型。
在上述的PK/PD研究1和研究2产生的药代动力学参数的比较中，ARC658(序列号：62)和ARC187)(序列号：5)的数据除了ARC187的t1/2(α)测定值之外都是相似的。然而不期望限制于任何理论，两种研究中ARC187t1/2(α)测定值的差异可能由于初步研究中较小的样本大小引起。
如图46显示，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)的C最大值相似。相反的，药物暴露(AUC)在以ARC187(序列号：5)处理的动物中明显更大。ARC187比ARC658(序列号：62)具有更长的t1/2(α)值和t1/2(β)值这些数据，与PK/PD研究1中产生的数据一起，显示C5-抑制适体ARC187可以以给定剂量提供最有效的体内C5抑制。
药代动力学研究中收集的额外血浆样本随后用于体外分析测定灵长类C5抑制的效果。如上所述进行酵母聚糖活性试验以测定灵长类C5b-9和C5a数量。以C5b-9浓度相对于适体浓度(图47)，和C5a浓度相对于适体浓度(图48)对数据作图。如前述PK/PD研究1中显示，C5抑制适体的浓度必须超过30倍摩尔量(适体对于血浆C5浓度)，或大约15μM，而不论PEG分子的大小，以完全抑制灵长类C5的裂解(图41和42)。
通过对图39和40中的数据表进行检查，显示30-mg/kg I.V.推注后，ARC658(序列号：62)4小时后维持15μM而ARC1878小时后维持15μM。这样，给予相似的药物剂量，40K适体ARC187提供了两倍于30K适体ARC658(序列号：62)的临床效果。
概要，猕猴必须以至少相对于血浆C530倍摩尔过量的适体治疗以抑制C5体内转化。这些数据与先前的体外(溶血)和间接体内(分离灌注小鼠心脏)研究中的数据一致，其显示C5-结合适体在灵长类C5中比人类C5具有更低的亲和力。已经显示C5-一致适体可以以高至30mg/kg剂量安全地通过静脉推注给药，其等于C5浓度的50倍摩尔过量的适体。
实施例5G：ARC1905在猕猴中的静脉内推注给药
C5抑制物ARC1905的药效学通过猕猴静脉内给药评估。适体在标准盐溶液中制成7.5mg/mL形式，并在无菌条件下无菌过滤(0.2μm)入预先消毒的剂量瓶中。猕猴(n＝4)通过静脉推注以剂量0(盐溶液对照)或30mg/kg给药。由外周静脉或动脉采血，血液样本(0.5mL)直接转移至二钾(K2)EDTA管，置于湿冰上，4℃离心30分钟收集。
血浆样本以体外试验测定ARC1905在灵长类C5抑制中的效果。实施例1C中描述的ARC1905相关的酵母聚糖试验被用于测定灵长类C5a产生的数量。给药0.5和2小时后后-酵母聚糖C5a值的减少表明ARC1905抑制C5在猕猴中的体内裂解的方式，与ARC187以相同浓度和相同给药途径，使用酵母聚糖活性试验体外测定的方式相似。
实施例5H：C5抑制物ARC187在猕猴中静脉内推注给药和 灌输的药代动力学和药效学
通过猕猴静脉内推注后立即进行静脉内灌输，评估ARC187(序列号：5)的药代动力学(PK)和药效学(PD)特性。图49显示了该研究设计。
使用图50中列出的静脉内推注研究中得出的药代动力学参数计算获得目标稳定阶段1μM血浆浓度所需的推注剂量和灌输速率。
三只猕猴用于ARC187给药，静脉内推注剂量为1mg/kg，立即以0.0013mg/kg/分钟进行静脉内灌输48小时。从治疗后0-192小时收集全血样本，置于湿冰上，用于血浆试验，随后储存于-80℃。使用荧光核算染色方法(实施例5B中描述)和GLP-验证的高效液相(HPLC)方法测定ARC187血浆浓度。测定猕猴血浆中ARC187的HPLC方法通过ClinTrials Bio-Research(Montreal，Canada)验证。验证操作根据美国食品药品监督管理局(FDA)实验室操作规范(GLP)要求(21CFR§58)完成。以选择性，线性，定量低限(LLOQ)，延后，批内精度和准确度，批间精度和准确度，储液稳定性，注射剂稳定性，短期基质稳定性，冻融稳定性，长期基质稳定性和稀释度间隔对HPLC方法进行验证。可用的线性动力学浓度范围经测定为0.080至50.0μM。
这些条件下测定的ARC187PK特性与仅使用静脉内灌注PK参数(见图51)产生的计算特性一致。1μM的目标血浆浓度在给药后5分钟内出现并维持至灌输全过程。灌输停止后，适体显示了半衰期为，t1/2(β)～40～60小时的终末清除。
对前述的酵母聚糖活性试验进行修改，猕猴样本血浆10倍稀释入10％的人类血浆并以5mg/mL酵母聚糖处理，使用PK研究中收集的血浆样本对ARC187(序列号：5)在猕猴中的药效学活性进行体外评估。以C5a裂解物的产生为反应的C5活性，通过人类C5a特异的ELISA测定(C5a ELISA试剂盒，BD Biosciences，San Diego，CA)。通过与使用已知ARC187水平制备的样本进行的酵母聚糖试验获得的标准曲线进行比对，测定每个样本中的活性ARC187浓度(见图52)。本研究显示ARC187在灌输期间和之后维持其抗-补体活性，其水平与上述的药代动力学特性充分一致。
实施例5I：预测人类需要剂量
预防，改善，或治疗CABG手术相关并发症的的所需剂量基于以下假设：第一，CABG病人在手术前给予单次抗-C5适体静脉内推注，CABG手术后24-48小时连续灌注以建立和维持1.5μM的稳定阶段血浆浓度。使用前述猕猴研究中仅仅静脉内推注和推注加上灌输获得的药代动力学参数计算推注剂量和灌输速率。评估的ARC187推注剂量为1mg/kg，相关的灌输速率为0.0013mg/kg/分钟。对于该推注加上48小时灌输的方法，预期的ARC187全部药物需要量为0.4g，其中重量仅指寡核苷酸重量(见图53表第7列)。图53表第2列反应了与ARC187连接的PEG机关的重量，第3列反应ARC187寡核苷酸分子量(对于这里的适体，包括ARC186(序列号：4)的寡核苷酸序列是相同的)，第4列反应了如上述实施例3C中描述的通过氨基反应化学与ARC186(序列号：4)连接的40kDA PEG的分子量，第5列反应双分割模型中ARC187α相半衰期，第6列反应双分割模型中ARC187β相半衰期.。
实施例6
抗-C5适体和肝素/鱼精蛋白的交互作用
抗-C5适体的一种预期应用是预防或减缓冠状动脉搭桥术(CABG)相关副反应炎症的预防药物。高浓度的抗凝集肝素(3-5单位/mL或1-2μM)在CABG期间给药以防止血栓症和维持旁路泵的畅通；在此过程后通过施用相似高浓度的鱼精蛋白(～5μM)逆转肝素的效应，并回复正常止血。这些药物间可能的任何交互作用具有对病人潜在的危险，需要测定抗-C5适体(1)不改变两种药物的活性和(2)不显示使病人抗凝血治疗复杂化的天然止血效应。
肝素是带有纯阴离子的硫酸化多糖，平均分子量15kDa，具有通过促进与抗凝血酶的交互作用抑制凝血级联中的蛋白酶的效应。鱼精蛋白，一种高阳离子多肽，可以通过至少在自然下为部分静电作用的低特征交互作用抑制肝素活性。ARC187(序列号：5)的功能中心，类似于肝素，是高阴离子的。这样，可想像ARC187可以非特异结合肝素-结合位点或鱼精蛋白并干扰这些分子的活性。以下研究调查了ARC187固有的(例如，肝素-类似的)抗凝血特性，ARC187对肝素功能的效应，ARC187对鱼精蛋白中和的肝素的效应，和鱼精蛋白对ARC187补体抑制特性的效应。
实施例6A：ARC187对凝血的体外效应
分别使用凝血级联外臂和内臂标准临床试验，凝血时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)研究ARC187(序列号：5)对于血浆凝血的固有效应。如图54所示，以过剩的设计剂量(高至20μM)的柠檬酸化人类血浆滴定对于PT无改变，aPTT有少量上升。
为评估ARC187对于肝素和鱼精蛋白功能的体外效应，3个个体的血液加入4-5单位/mL肝素，与CABG手术中使用相关的肝素水平。这些样本的凝血情况使用活性凝结时间(ACT)评估，全血凝结试验通常用于监测手术期间的肝素活性。在这些肝素浓度，无其他添加剂时，ACT在存在4U/mL肝素时明显高于基线～150秒至～500秒，或存在5U/mL肝素时增高～800秒。这些样本中加入10μM ARC187对于凝血时间有较小效应，显示ARC187不干扰肝素的抗凝血活性。
肝素的凝血效应可以由6-8μM鱼精蛋白(4U/mL肝素)或12μM(5U/mL肝素)滴定中和。存在肝素和中和浓度的鱼精蛋白时ACT值与基线充分无区别。因为ARC187(12kDa)的核酸中心比鱼精蛋白(5kDa)具有更大分子量，期望鱼精蛋白中加入等摩尔浓度的ARC187可以充分完全逆转鱼精蛋白的中和效应。然而，与鱼精蛋白等浓度的ARC187的预诱导对于ACT具有较小效应。含有中和浓度鱼精蛋白的血液样本在存在或缺失10μM ARC187时显示了相似的ACT值，表明ARC187对于鱼精蛋白的促凝血活性仅具有较小效应。图55描述了这些结果。
实施例6B：ARC187对凝血的体内效应
对临床剂量肝素和临床/亚临床/超临床剂量鱼精蛋白同时施用抗-C5适体ARC187(序列号：5)时肝素和鱼精蛋白功能交互作用被研究，以测定是否亚临床/超临床血浆浓度的ARC187存在可以干扰鱼精蛋白对肝素抗血凝作用的逆转。图56描述了该研究结果，简要地，10μM(例如，超过临床剂量10倍摩尔量)的ARC187在所有剂量测试肝素中对于ACT基线值无影响。类似地，肝素抗凝血活性的程度未受10Mm ARC187影响。缺失ARC187时，鱼精蛋白的最小有效剂量是～30％(临床剂量＝100％)。此外，30％鱼精蛋白对肝素抗血凝效果的逆转未受超过临床剂量10倍摩尔量的ARC187(例如，10μM)的影响。这样，临床应用中(例如，CABG)使用ARC187作为补体抑制剂对于同时使用的典型剂量肝素和鱼精蛋白无影响。
实施例6C：肝素和鱼精蛋白对ARC187抗-补体功能的影 响
如实施例1描述，以酵母聚糖集激活柠檬酸化全血样本中测定肝素和鱼精蛋白对于ARC187(序列号：5)抗-补体活性的效应。酵母聚糖激活前，ARC186加入至4种条件下的柠檬酸化血液样本：1)无处理(无肝素或鱼精蛋白)；2)4U/mL肝素；3)6μM鱼精蛋白；4)4U/mL肝素+6μM鱼精蛋白。随着酵母聚糖的激活，以ELISA测定血浆sC5b-9(C5b-9ELISA试剂盒，Quidel，San Diego，CA)对C5活性定量。每种条件，以C5活性抑制相对于ARC187浓度表示的结果无明显偏差(见图57)。所有条件下1-2μM ARC187可获得完全抑制。这样，分别或联合的肝素和鱼精蛋白，以在CABG手术中使用的浓度，不影响ARC187的抗-补体活性。
实施例7
脉络膜血管新生
激光介导的脉络膜血管新生通常作为年龄-相关黄斑变性的模型。其也可以用作糖尿病视网膜炎的模型。施用抗-C5药物的效应，在本发明优选实施方案中是这里描述的抗-补体适体，对脉络膜血管新生的预防和稳定和/或减缓，是在以下描述的模型中评估的，Krzystolik，M.G等，Arch Opthalmol，vol.120，pp 338-346(2002)。
当评估脉络膜血管新生的预防时，抗-C5药物，特别是结合并抑制猕猴补体蛋白C5功能的C5特异适体，通过玻璃体内注射入每个猴的一只眼，而对照眼施用介质。适体注射数天至数周后，对每个猕猴的双眼进行激光凝固。通过眼科检查，彩色摄影和荧光血管造影对每个动物的眼睛进行监测。抗-C5药物，特别是C5特异适体治疗的眼睛中脉络膜血管新生(血管造影评估)明显低于对照组眼睛，抗-C5特异药物被认为是有效的。当评估联合抗-C5药物和一种抗-VEGF药物和/或一种抗-PDGF药物的在预防脉络膜血管新生中的治疗时，如上进行试验，除了激光凝固法之前数天至数周，每个动物的一只眼以抗-C5药物和抗-VEGF药物和/或抗-PDGF药物进行治疗。
另一实施方案中，当评估对于脉络膜血管新生的预防时，抗-补体适体，特别是抑制猕猴补体蛋白如C5或C3的适体，注射入每个猕猴的一只眼，而对照眼施用介质。适体注射数天至数周后，对每个猕猴的双眼进行激光凝固。通过眼科检查，彩色摄影和荧光血管造影对每个动物的眼睛进行监测。抗-C5药物，特别是抗-补体适体治疗的眼睛中脉络膜血管新生(血管造影评估)明显低于对照组眼睛，抗-补体适体被认为是有效的。当评估联合抗-补体适体和一种抗-VEGF药物和/或一种抗-PDGF药物的在预防脉络膜血管新生中的治疗时，如上进行试验，除了激光凝固法之前数天至数周，每个动物的一只眼以抗-补体适体和抗-VEGF药物和/或抗-PDGF药物进行治疗。
当评估脉络膜血管新生的稳定和/或延缓时，对每个猕猴的双眼进行激光凝固法。激光凝固法之后数天至数周，本发明的抗-C5适体通过玻璃体内注射对每个动物的一只眼给药，而另一只眼施用介质。一个实施方案中，抗-C5药物是一种抗-补体适体。优选实施方案中，所述的抗-补体适体是C5和/或C3抑制抗体。适体注射数天至数周后，对每个猕猴的双眼进行激光凝固。通过眼科检查，彩色摄影和荧光血管造影对每个动物的眼睛进行监测。抗-C5药物，特别是C5适体治疗的眼睛中脉络膜血管新生(血管造影评估)相同或明显低于对照组眼睛时，抗-补体适体被认为是有效的。当评估联合抗-C5药物和一种抗-VEGF药物和/或一种抗-PDGF药物的在预防脉络膜血管新生中的治疗时，如上进行试验，除了激光凝固法之前数天至数周，每个动物的一只眼以抗-C5药物和抗-VEGF药物和/或抗-PDGF药物进行治疗。
与上述的猕猴评估相似，抗-C5药物和抗-补体适体单独地或与抗-VEGF药物和/或抗-PDGF药物联合，在预防，稳定和/或延缓脉络膜血管新生中的效应，可以使用调整鼠科C5补体蛋白的抗-C5药物，或其他物种的C5补体蛋白在小鼠或其他物种中评估。另一实施方案中，与上述的猕猴评估相似，抗-补体适体单独地或与抗-VEGF药物和/或抗-PDGF药物联合，在预防，稳定和/或延缓脉络膜血管新生中的效应，可以使用调整，特别是抑制期望的鼠科补体蛋白的抗-补体适体，或其他期望的补体蛋白在小鼠或其他物种中评估。见，例如，Bora等，Journal of Immunolgy，174：491-497(2005)。
实施例8
非-渗出性AMD的视网膜退化小鼠模型
具有单核化学引诱蛋白1(MCP-1或Cc1-2)或其同源C-C趋化受体2(Ccr-2)突变的小鼠模型可以模范人类年龄-相关黄斑变性症状，包括玻璃疣的产生，色素受体萎缩和脉络膜血管新生。见Ambati等，Nature Medicine.2003年11月2003；9(11)：1390-7。该小鼠模型显示了明显的视网膜色素上皮细胞和脉络膜中的C5聚集，表明补体表达与疾病相关。此外，CD46(补体的膜结合调节物)，玻连蛋白(MAC调节物)和C3c(C3b的降解产物)在视网膜色素上皮细胞和/或脉络膜中的存在表明发生了补体活性。
当评估视网膜退化的稳定和/或延缓时，本发明的抗-补体适体，例如小鼠C5或C3抑制适体通过玻璃体内注射入每个动物的一只眼，而另一只眼施用介质。监控每个动物的眼睛发生的视网膜退化，包括RPE/脉络膜中的补体产物聚集，异常电生理和/或RPE和/或光感器的局部萎缩，和脉络膜血管新生范围。其中在抗-补体适体，特别是抗-C5或抗-C3适体治疗的眼中，视网膜退化的范围相同于和/或明显低于对照眼睛时，适体被认为是有稳定和/或延缓效果的。
本发明已经以描写和举例的方法进行了说明，本领域中的普通技术人员可以认识到本发明可以按多种实施方案实施，以上的描述和举例是处于说明目的，并不作为以下权利要求的限制。

Claims (18)

1.治疗有效量的抗C5试剂在制备用于治疗、稳定和/或预防渗出型的年龄有关的黄斑变性的药物中的应用，其中抗C5试剂结合C5补体并且具有下列结构：
其中适体＝fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(序列号：4)
其中，fC和fU＝2’氟代核苷，并且mG和mA＝2’-OMe核苷，并且所有其他的核苷都是2’-OH的，并且3T表示反相脱氧胸腺嘧啶。
2.根据权利要求1所述的应用，其中抗C5试剂通过被制成眼部给药、玻璃体给药、或者眼周给药进行施用。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所施用的抗C5试剂存在于缓释制剂中。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述的药物是用于与抗-VEGF试剂一起使用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中所述抗-VEGF试剂是一种针对VEGF的拮抗剂抗体或者抗体片段。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的应用，其中所述抗C5试剂和抗VEGF试剂被顺序或者同时施用。
7.根据权利要求5的应用，其中针对VEGF的拮抗剂抗体是贝伐单抗(bevacizumab)，并且其中针对VEGF的拮抗剂抗体片段是兰尼单抗(ranibizumab)。
8.根据权利要求4所述的应用，其中，抗-VEGF是兰尼单抗(ranibizumab)。
9.根据权利要求4所述的应用，其中，抗-VEGF是贝伐单抗(bevacizumab)。
10.治疗有效量的抗C5试剂在制备用于治疗、稳定和/或预防非渗出型的年龄有关的黄斑变性的药物中的应用，其中抗C5试剂结合C5补体并且具有下列结构：
其中适体＝fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(序列号：4)
其中，fC和fU＝2’氟代核苷，并且mG和mA＝2’-OMe核苷，并且所有其他的核苷都是2’-OH的，并且3T表示反相脱氧胸腺嘧啶。
11.根据权利要求10所述的应用，其中抗C5试剂通过被制成眼部给药、玻璃体给药、或者眼周给药进行施用。
12.根据权利要求10所述的应用，其中所施用的抗C5试剂存在于缓释制剂中。
13.根据权利要求10所述的应用，其中所述的药物是用于与抗-VEGF试剂一起使用。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述抗-VEGF试剂是一种针对VEGF的拮抗剂抗体或者抗体片段。
15.根据权利要求10-14中任意一项所述的应用，其中所述抗C5试剂和抗VEGF试剂被顺序或者同时施用。
16.根据权利要求14的应用，其中针对VEGF的拮抗剂抗体是贝伐单抗(bevacizumab)，并且其中针对VEGF的拮抗剂抗体片段是兰尼单抗(ranibizumab)。
17.根据权利要求13所述的应用，其中，抗-VEGF是兰尼单抗(ranibizumab)。
18.根据权利要求13所述的应用，其中，抗-VEGF是贝伐单抗(bevacizumab)。
CN201510087938.6A 2006-03-08 2007-03-08 治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-c5药物 Pending CN104623692A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78090506P 2006-03-08 2006-03-08
US60/780,905 2006-03-08
US84827406P 2006-09-29 2006-09-29
US60/848,274 2006-09-29

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA200780016834XA Division CN101443050A (zh) 2006-03-08 2007-03-08 治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-c5药物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104623692A true CN104623692A (zh) 2015-05-20

Family

ID=38475591

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510087938.6A Pending CN104623692A (zh) 2006-03-08 2007-03-08 治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-c5药物

Country Status (21)

Country Link
US (2) US20090269356A1 (zh)
EP (5) EP3360582A1 (zh)
JP (3) JP5406534B2 (zh)
KR (3) KR20150017388A (zh)
CN (1) CN104623692A (zh)
AU (1) AU2007223796B2 (zh)
BR (1) BRPI0708588A2 (zh)
CA (4) CA3009846C (zh)
DK (2) DK1991275T3 (zh)
ES (2) ES2562423T3 (zh)
HK (3) HK1181308A1 (zh)
HU (1) HUE026496T2 (zh)
IL (1) IL193828A (zh)
MX (1) MX2008011323A (zh)
NZ (1) NZ571791A (zh)
PL (2) PL1991275T3 (zh)
PT (2) PT2596807E (zh)
RU (2) RU2477137C2 (zh)
SG (3) SG2014011290A (zh)
SI (2) SI1991275T1 (zh)
WO (1) WO2007103549A2 (zh)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6395888B1 (en) * 1996-02-01 2002-05-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
ES2390425T3 (es) 2000-12-22 2012-11-12 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Uso de moléculas de orientación repulsivas (RGM) y sus moduladores
US7803931B2 (en) 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
US8840893B2 (en) 2004-06-10 2014-09-23 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
US8906864B2 (en) 2005-09-30 2014-12-09 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (RGM) protein family and functional fragments thereof, and their use
EP4342995A3 (en) 2006-03-31 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
ES2643469T3 (es) 2006-04-07 2017-11-23 Aerpio Therapeutics, Inc. Anticuerpos que se unen a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTP-beta) y usos de los mismos
US7622593B2 (en) 2006-06-27 2009-11-24 The Procter & Gamble Company Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
KR20100072185A (ko) * 2007-09-24 2010-06-30 녹손 파르마 아게 씨파이브에이 결합형 핵산
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
TW200927169A (en) * 2007-11-07 2009-07-01 Alcon Res Ltd Complement Clq inhibitors for the prevention and treatment of glaucoma
BRPI0820343A2 (pt) * 2007-11-08 2017-08-22 Genentech Inc Anticorpos de antifator b e seus usos
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
EP3056513A1 (en) 2008-04-11 2016-08-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US9891219B2 (en) 2008-10-10 2018-02-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for treating neuromyelitis optica (NMO) by administration of eculizumab to an individual that is aquaporin-4 (AQP4)-IgG autoantibody positive
US20110125090A1 (en) * 2008-11-13 2011-05-26 Peyman Gholam A Ophthalmic drug delivery system and method
WO2010108657A2 (en) * 2009-03-23 2010-09-30 Noxxon Pharma Ag C5a binding nucleic acids and the use thereof
US9175075B2 (en) 2009-12-08 2015-11-03 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Methods of treating retinal nerve fiber layer degeneration with monoclonal antibodies against a retinal guidance molecule (RGM) protein
US9408746B2 (en) 2010-03-31 2016-08-09 Ocuject, Llc Device and method for intraocular drug delivery
US9320647B2 (en) 2010-03-31 2016-04-26 Ocuject, Llc Device and method for intraocular drug delivery
CN103228785B (zh) 2010-11-24 2016-09-07 株式会社钟化 扩增核酸的检测方法和检测装置
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
PE20140471A1 (es) 2011-01-04 2014-04-13 Novartis Ag Moduladores de la via del complemento y usos de los mismos
AU2013201626B2 (en) * 2011-04-08 2016-02-11 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
US9644035B2 (en) 2011-04-08 2017-05-09 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
MX355648B (es) 2011-04-08 2018-04-26 Univ Leicester El uso de un agente inhibidor de masp-2 para tratar condiciones asociadas con la activacion del complemento dependiente de masp-2.
JP5793188B2 (ja) 2011-05-13 2015-10-14 国立大学法人 東京大学 自己免疫疾患治療及び予防薬としてのｃｔｒｐ６
CN104039351A (zh) 2011-10-13 2014-09-10 阿尔皮奥治疗学股份有限公司 用于治疗血管渗漏综合征和癌症的方法
WO2013093762A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting factor p
KR102034203B1 (ko) 2012-01-10 2019-10-18 아프타리온 바이오테크 아게 새로운 C5a 결합 핵산
SG10202006762PA (en) 2012-01-27 2020-08-28 Abbvie Deutschland Composition and method for diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
AU2013222836B2 (en) 2012-02-20 2017-07-20 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Polypeptides binding to human complement C5
US9504603B2 (en) * 2012-04-02 2016-11-29 Ocuject, Llc Intraocular delivery devices and methods therefor
US9421129B2 (en) 2012-04-02 2016-08-23 Ocuject, Llc Intraocular delivery devices and methods therefor
WO2013162026A1 (ja) * 2012-04-27 2013-10-31 株式会社カネカ 核酸の増幅方法、および、増幅核酸の検出方法
CA2875567C (en) * 2012-06-18 2023-11-14 Omeros Corporation Compositions and methods of inhibiting masp-1 and/or masp-2 and/or masp-3 for the treatment of various diseases and disorders
US9388199B2 (en) 2012-06-28 2016-07-12 Novartis Ag Pyrrolidine derivatives and their use as complement pathway modulators
WO2014002054A1 (en) 2012-06-28 2014-01-03 Novartis Ag Pyrrolidine derivatives and their use as complement pathway modulators
JP6273274B2 (ja) 2012-06-28 2018-01-31 ノバルティス アーゲー 補体経路モジュレーターおよびその使用
CN104640855B (zh) 2012-06-28 2017-08-29 诺华股份有限公司 补体途经调节剂及其用途
ES2648962T3 (es) 2012-06-28 2018-01-09 Novartis Ag Derivados de pirrolidina y su uso como moduladores de la vía del complemento
KR20150036481A (ko) 2012-07-12 2015-04-07 노파르티스 아게 보체 경로 조절제 및 그의 용도
KR102213609B1 (ko) 2012-07-13 2021-02-08 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
WO2014055835A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Novelmed Therapeutics, Inc. Alternative pathway specific antibodies for treating hemolytic diseases
JP6538561B2 (ja) 2012-10-25 2019-07-03 バイオベラティブ・ユーエスエイ・インコーポレイテッド 抗補体Ｃ１ｓ抗体とそれらの用途
PT2914291T (pt) 2012-11-02 2022-05-05 Bioverativ Usa Inc Anticorpos anti-complemento c1s e suas utilizações
US10280215B2 (en) * 2013-01-31 2019-05-07 Seoul National University R&Db Foundation Anti-C5 antibodies and methods of treating complement-related diseases
KR20230162998A (ko) 2013-03-14 2023-11-29 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 보체 성분 Ｃ5 ｉＲＮＡ 조성물 및 그 이용 방법
EP2978451B1 (en) 2013-03-29 2019-11-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the serum half-life of a therapeutic agent targeting complement c5
EA201690212A8 (ru) * 2013-07-12 2016-08-31 Офтотек Корпорейшн Способы лечения или профилактики офтальмологических патологических состояний
ES2842105T3 (es) * 2013-08-28 2021-07-12 Ipc Res Llc Polipéptidos estables que se unen a C5 de complemento humano
JP6654137B2 (ja) * 2013-09-16 2020-02-26 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター Ｈｓｃｔ関連血栓性微小血管症の治療のための組成物及び方法
AU2014332021B2 (en) * 2013-10-07 2020-05-07 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods of preventing or reducing photoreceptor cell death
WO2015076356A1 (ja) 2013-11-22 2015-05-28 株式会社カネカ 短鎖ｒｎａの検出方法
US10183989B2 (en) 2013-12-24 2019-01-22 Novelmed Therapeutics, Inc. Methods of treating ocular diseases
SG11201606379UA (en) * 2014-02-05 2016-09-29 Univ Deakin Aptamer construct
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
EP3191591A1 (en) * 2014-09-12 2017-07-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting complement component c5 and methods of use thereof
EP3194596A1 (en) * 2014-09-16 2017-07-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
CA3103560C (en) 2014-09-26 2023-01-17 Somalogic, Inc. Cardiovascular risk event prediction and uses thereof
US20160168237A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method for treating a complement mediated disorder caused by an infectious agent in a patient
TW201809008A (zh) 2014-12-19 2018-03-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ｃ５抗體及使用方法
KR20180006379A (ko) 2015-04-06 2018-01-17 바이오버라티브 유에스에이 인코포레이티드 인간화 항-c1s 항체 및 이들의 이용 방법
WO2016200627A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Children's Hospital Medical Center Dosing algorithm for complement inhibitor
KR20180054677A (ko) 2015-09-23 2018-05-24 에르피오 세러퓨틱스 인코포레이티드 Tie-2의 활성화제로 안내압을 치료하는 방법
CA3005592C (en) * 2015-12-18 2024-01-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
JP7088454B2 (ja) 2015-12-30 2022-06-21 コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッド 抗体および抗体複合体
CA3011819A1 (en) 2016-01-20 2017-07-27 Vitrisa Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inhibiting factor d
WO2017139417A1 (en) * 2016-02-08 2017-08-17 Vitrisa Therapeutics, Inc. Compositions with improved intravitreal half-life and uses thereof
US20190127453A1 (en) 2016-06-07 2019-05-02 Novartis Ag An anti-c5 antibody dosing regimen
TW202300168A (zh) 2016-08-05 2023-01-01 日商中外製藥股份有限公司 Il-8相關疾病之治療用或預防用組成物
WO2018136827A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Vitrisa Therapeutics, Inc. Stem-loop compositions and methods for inhibiting factor d
CN110603054B (zh) 2017-03-06 2024-05-10 宾夕法尼亚大学理事会 抗c5抗体及其用途
WO2019040397A1 (en) * 2017-08-21 2019-02-28 Ophthotech Corporation METHOD FOR TREATING OR PREVENTING MACULAR DEGENERATION OF THE NEOVASCULAR AGE
WO2019210194A1 (en) * 2018-04-26 2019-10-31 Vitrisa Therapeutics, Inc. Pegylated compositions for ocular use, and methods thereof
EP3597222A1 (en) * 2018-07-16 2020-01-22 Easemedcontrol R & D GmbH & Co KG Treatment and diagnosis of unresolved inflammatory diseases
WO2020109343A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for treatment of macular degeneration
WO2020223209A1 (en) 2019-04-29 2020-11-05 Aerpio Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 activators targeting the schlemm's canal
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
AU2020378982A1 (en) * 2019-10-27 2022-05-26 Iveric Bio, Inc. Anti-C5 agent for treatment of dry age-related macular degeneration (AMD) or geographic atrophy secondary to dry AMD
RU2738001C1 (ru) * 2020-03-23 2020-12-07 Борис Сергеевич Першин Способ определения риска развития цитомегаловирусного (ЦМВ) ретинита после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
WO2023044048A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Novartis Ag Methods for prevention of graft rejection in xenotransplantation
WO2023183556A2 (en) * 2022-03-24 2023-09-28 Amcyte Pharma, Inc. Treatment for retinal disorders
WO2023212719A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Annexon, Inc. Compositions and methods for treating ocular diseases
WO2024006902A2 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Iveric Bio, Inc. Sustained release silica hydrogel composites for treating ophthalmological conditions and methods of using same
WO2024059873A2 (en) * 2022-09-16 2024-03-21 Sirnaomics, Inc. Products and compositions

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004041160A2 (en) * 2002-10-30 2004-05-21 University Of Kentucky Research Foundation Methods and animal model for analyzing age-related macular degeneration
US20060018871A1 (en) * 2004-02-12 2006-01-26 Claude Benedict Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US5981481A (en) 1974-12-06 1999-11-09 The Johns Hopkins University Human C3b/C4b receptor (CR1)
US5212071A (en) 1988-04-01 1993-05-18 The Johns Hopkins University Nucleic acids encoding a human C3b/C4b receptor (CR1)
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4959309A (en) * 1983-07-14 1990-09-25 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE3546806C2 (zh) * 1985-03-30 1991-03-28 Marc Genf/Geneve Ch Ballivet
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US4935363A (en) * 1987-03-30 1990-06-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Sterol regulatory elements
US5256642A (en) 1988-04-01 1993-10-26 The Johns Hopkins University Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof
US5244805A (en) * 1989-05-17 1993-09-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Baculovirus expression vectors
US5225347A (en) 1989-09-25 1993-07-06 Innovir Laboratories, Inc. Therapeutic ribozyme compositions and expression vectors
US5070010A (en) * 1989-10-30 1991-12-03 Hoffman-La Roche Inc. Method for determining anti-viral transactivating activity
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5668264A (en) 1990-06-11 1997-09-16 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity PDGF nucleic acid ligands
WO1991019813A1 (en) 1990-06-11 1991-12-26 The University Of Colorado Foundation, Inc. Nucleic acid ligands
US5674685A (en) 1990-06-11 1997-10-07 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity PDGF nucleic acid ligands
US5472841A (en) * 1990-06-11 1995-12-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying nucleic acid ligands of human neutrophil elastase
US6011020A (en) * 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5543293A (en) * 1990-06-11 1996-08-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. DNA ligands of thrombin
US5763173A (en) * 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US5459015A (en) * 1990-06-11 1995-10-17 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity RNA ligands of basic fibroblast growth factor
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5707796A (en) * 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US6147204A (en) 1990-06-11 2000-11-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5763177A (en) * 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5861254A (en) 1997-01-31 1999-01-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Flow cell SELEX
US5527894A (en) * 1990-06-11 1996-06-18 Nexstar Pharmacueticals, Inc. Ligands of HIV-1 tat protein
US6140490A (en) 1996-02-01 2000-10-31 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5637459A (en) * 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5635615A (en) * 1990-06-11 1997-06-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV nucleocapsid nucleic acid ligands
US5476766A (en) * 1990-06-11 1995-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Ligands of thrombin
US5496938A (en) 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US6395888B1 (en) * 1996-02-01 2002-05-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US5726017A (en) * 1990-06-11 1998-03-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV-1 gag nucleic acid ligands
US5648214A (en) * 1990-06-11 1997-07-15 University Research Corporation High-affinity oligonucleotide ligands to the tachykinin substance P
US5654151A (en) * 1990-06-11 1997-08-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV Nucleocapsid nucleic acid ligands
US5789157A (en) * 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5503978A (en) * 1990-06-11 1996-04-02 University Research Corporation Method for identification of high affinity DNA ligands of HIV-1 reverse transcriptase
CA2093664C (en) 1990-10-12 2003-07-29 Fritz Eckstein Modified ribozymes
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
AU665025B2 (en) 1991-09-23 1995-12-14 Cambridge Antibody Technology Limited Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5252216A (en) 1992-03-24 1993-10-12 Smithkline Beecham Corporation Protein purification
US5456909A (en) 1992-08-07 1995-10-10 T Cell Sciences, Inc. Glycoform fractions of recombinant soluble complement receptor 1 (sCR1) having extended half-lives in vivo
US5338671A (en) * 1992-10-07 1994-08-16 Eastman Kodak Company DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody
US5262564A (en) 1992-10-30 1993-11-16 Octamer, Inc. Sulfinic acid adducts of organo nitroso compounds useful as retroviral inactivating agents anti-retroviral agents and anti-tumor agents
AU685433B2 (en) 1993-02-12 1998-01-22 Regents Of The University Of Minnesota Pulmonary administration of sCR1 and other complement inhibitory proteins
US5428149A (en) * 1993-06-14 1995-06-27 Washington State University Research Foundation Method for palladium catalyzed carbon-carbon coulping and products
RU2073518C1 (ru) * 1993-06-17 1997-02-20 Совместное русско-американское акционерное общество закрытого типа "Неофарм" Средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза
WO1995001797A1 (en) * 1993-07-09 1995-01-19 Smithkline Beecham Corporation Protein purification
US5817635A (en) 1993-08-09 1998-10-06 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Modified ribozymes
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5723750A (en) 1995-01-12 1998-03-03 Vanderbilt University Transgenic plants expressing disassembly deficient viral coat proteins
US6013443A (en) * 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
EP0828849B1 (en) 1995-06-02 2006-10-25 Gilead Sciences, Inc. High-affinity oligonucleotide ligands to pdgf
US6229002B1 (en) 1995-06-07 2001-05-08 Nexstar Pharmaceuticlas, Inc. Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
EP2080813B1 (en) * 1995-06-07 2011-01-05 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands that bind to and inhibit DNA polymerases
ES2259188T3 (es) 1996-10-25 2006-09-16 Gilead Sciences, Inc. Complejos de ligando de acido nucleico de factor de crecimiento endotelial vascular (vegf).
US6051698A (en) 1997-06-06 2000-04-18 Janjic; Nebojsa Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
US6278039B1 (en) 1997-05-28 2001-08-21 Axys Pharmaceuticals, Inc. C. elegans deletion mutants
US7419663B2 (en) * 1998-03-20 2008-09-02 Genentech, Inc. Treatment of complement-associated disorders
US6251588B1 (en) 1998-02-10 2001-06-26 Agilent Technologies, Inc. Method for evaluating oligonucleotide probe sequences
EP2016953A3 (en) * 1998-12-22 2009-04-15 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists and uses thereof
US20020102581A1 (en) * 1999-02-19 2002-08-01 Hageman Gregory S. Diagnostics and therapeutics for ocular disorders
US20020015957A1 (en) * 2000-04-29 2002-02-07 Hageman Gregory S. Diagnostics and therapeutics for macular degeneration-related disorders
US6110462A (en) 1999-03-03 2000-08-29 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules that contain modified nucleotides
AU4028800A (en) 1999-04-02 2000-10-23 City Of Hope Method for identifying accessible binding sites on rna
US7306799B2 (en) * 1999-06-08 2007-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for treatment of eye disorders
US6573299B1 (en) * 1999-09-20 2003-06-03 Advanced Medical Instruments Method and compositions for treatment of the aging eye
US20020097416A1 (en) 2001-01-19 2002-07-25 Chang William Ho Output controller processor for universal data output
US20040249130A1 (en) * 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US20040022727A1 (en) * 2002-06-18 2004-02-05 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
AU2003294437A1 (en) * 2002-11-21 2004-06-18 Archemix Corporation Multivalent aptamer therapeutics with improved pharmacodynamic properties and methods of making and using the same
US20050037394A1 (en) * 2002-12-03 2005-02-17 Keefe Anthony D. Method for in vitro selection of 2'-substituted nucleic acids
JP2006508688A (ja) * 2002-12-03 2006-03-16 アーケミックス コーポレイション ２’−置換核酸のインビトロ選択のための方法
JP2006516288A (ja) * 2003-01-21 2006-06-29 アーケミックス コーポレイション 眼の薬物療法において有用なアプタマー治療薬
KR101471732B1 (ko) * 2003-08-27 2014-12-16 옵쏘테크 코포레이션 안구의 혈관신생성 장애를 치료하기 위한 조합 치료법
EP3385384B1 (en) * 2004-02-12 2020-04-08 Archemix LLC Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
US20060030535A1 (en) * 2004-03-05 2006-02-09 Healy Judith M Controlled modulation of the pharmacokinetics and biodistribution of aptamer therapeutics
US7919094B2 (en) * 2004-06-10 2011-04-05 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
CN101495504A (zh) * 2005-06-30 2009-07-29 阿切埃米克斯有限公司 用于生产全2’-修饰的核酸转录产物的材料和方法
US7564805B1 (en) 2005-08-08 2009-07-21 At&T Intellectual Property, Ii, L.P. Systems, methods, and device for simulating capacity in a network
US9119701B2 (en) 2012-10-22 2015-09-01 Alcon Research, Ltd. Pressure control in phacoemulsification system
US10718833B2 (en) 2014-08-18 2020-07-21 Magnetica Limited Magnet for head extremity imaging

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004041160A2 (en) * 2002-10-30 2004-05-21 University Of Kentucky Research Foundation Methods and animal model for analyzing age-related macular degeneration
US20060018871A1 (en) * 2004-02-12 2006-01-26 Claude Benedict Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIHO NOZAKI等: "Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization", 《PNAS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4159220A1 (en) 2023-04-05
KR20150017388A (ko) 2015-02-16
ES2562423T3 (es) 2016-03-04
IL193828A0 (en) 2009-08-03
HK1225996A1 (zh) 2017-09-22
AU2007223796A1 (en) 2007-09-13
KR101513308B1 (ko) 2015-04-28
PL1991275T3 (pl) 2015-04-30
SG2014011290A (en) 2014-06-27
CA3148917A1 (en) 2007-09-13
SI1991275T1 (sl) 2015-03-31
EP2596807A1 (en) 2013-05-29
EP1991275B1 (en) 2014-11-05
EP1991275A2 (en) 2008-11-19
CA3009854A1 (en) 2007-09-13
HK1127281A1 (zh) 2009-09-25
JP2014172910A (ja) 2014-09-22
SG172686A1 (en) 2011-07-28
RU2477137C2 (ru) 2013-03-10
HK1181308A1 (zh) 2013-11-08
PT1991275E (pt) 2015-02-03
KR20080100388A (ko) 2008-11-17
KR101584468B1 (ko) 2016-01-13
EP3034094A1 (en) 2016-06-22
SG10201706440RA (en) 2017-09-28
PT2596807E (pt) 2016-03-18
EP2596807B1 (en) 2015-12-16
WO2007103549A2 (en) 2007-09-13
WO2007103549A3 (en) 2007-12-27
JP2009529058A (ja) 2009-08-13
BRPI0708588A2 (pt) 2011-06-07
US20170145416A1 (en) 2017-05-25
JP2013067661A (ja) 2013-04-18
HUE026496T2 (en) 2016-06-28
CA3009846C (en) 2021-08-31
JP5406534B2 (ja) 2014-02-05
IL193828A (en) 2015-03-31
PL2596807T3 (pl) 2016-06-30
RU2012153978A (ru) 2014-06-20
KR20140072219A (ko) 2014-06-12
US20090269356A1 (en) 2009-10-29
NZ571791A (en) 2012-03-30
DK1991275T3 (en) 2014-12-08
AU2007223796B2 (en) 2013-01-24
RU2008139901A (ru) 2010-04-20
SI2596807T1 (sl) 2016-03-31
ES2527695T3 (es) 2015-01-28
JP5746232B2 (ja) 2015-07-08
EP1991275A4 (en) 2009-07-08
DK2596807T3 (en) 2016-03-07
CA3009846A1 (en) 2007-09-13
MX2008011323A (es) 2008-11-18
EP3360582A1 (en) 2018-08-15
CA2643951A1 (en) 2007-09-13
CA2643951C (en) 2019-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104623692A (zh) 治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-c5药物
CN104404046B (zh) 用于治疗补体‑相关失调的适体治疗
KR20120061086A (ko) 조직 인자 경로 저해제에 대한 앱타머 및 출혈 장애 치료제로서의 이의 용도
CN101443050A (zh) 治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-c5药物
AU2022202115A1 (en) Complement binding aptamers and anti-C5 agents useful in the treatment of ocular disorders
AU2016204713B2 (en) Complement Binding Aptamers and Anti-C5 Agents Useful in the Treatment of Ocular Disorders

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150520

RJ01 Rejection of invention patent application after publication