TW202019481A

TW202019481A - 末稍神經障礙或伴隨著觀察到末稍神經障礙或星狀細胞障礙之疾病的疼痛之預防或治療方法

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Publication number: TW202019481A
Application number: TW108124203A
Authority: TW
Inventors: 石田勇人; 石田裕一; 喬瑟夫帕倫堡; 佐佐木淳
Original assignee: 日商田邊三菱製藥股份有限公司
Priority date: 2018-07-10
Filing date: 2019-07-10
Publication date: 2020-06-01
Also published as: KR20210032412A; BR112021000300A2; SG11202100235YA; AU2023200728A1; US20210269516A1; JPWO2020013238A1; WO2020013238A1; AU2019301336A1; CA3106074A1; IL280018A; JP2024026683A; CN117919419A; AU2019301336B2; CN117919420A; EP3821908A4; PH12021550055A1; CN112533635A; CN117919418A; JP7449859B2; MX2021000324A

Abstract

以提供新穎的末梢神經障礙之預防或治療方法及觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀之預防或治療方法為課題。本發明提供含有RGM阻礙物質的末梢神經障礙或觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀之預防或治療劑。

Description

末稍神經障礙或伴隨著觀察到末稍神經障礙或星狀細胞障礙之疾病的疼痛之預防或治療方法

本發明係關於以阻礙RGMa活性為特徵的末梢神經障礙或伴隨著觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病的疼痛之預防或治療劑及使用其之預防或治療方法。

星狀細胞(Astrocyte)，為存在於中樞神經系統之神經膠細胞之一，其具有(1)於構造面支持神經元之網路的功能、(2)透過物質輸送來調節星狀細胞周邊之各種條件的功能、(3)通過前突觸、後突觸、神經膠細胞間之密切的關係，於3種細胞所發揮之1個突觸功能、(4) 細胞外離子之濃度調節、(5)於能量方面的緩衝作用，及(6)增進寡樹突細胞之髓鞘形成活性等各種功能。在各種腦疾病中，如以上之星狀細胞的功能受到注目，特別是與伴隨老化之星狀細胞之功能降低導致的阿茲海默症、巴金森氏症及認知障礙等之神經退化疾病、腦血管障礙，以及精神性疾病的關聯性受到注目(非專利文獻1~3)。末梢神經障礙，為末梢神經之正常傳導受到障礙的病態。於末梢神經障礙受到障礙的神經之種類包括運動神經、感覺神經、自律神經。末梢神經障礙，在臨床學上分類為單神經障礙(單神經病變；單一之神經障礙)、多發單神經障礙(多發性單神經病變；於不同區域之2個以上之神經的障礙)，或多發神經障礙(多發性神經病變；左右對稱產生之廣泛的神經障礙)，於病理學上分類為軸突於中心被入侵之軸突障礙，或髓鞘變性脫落之髓鞘障礙。末梢神經障礙，會對運動神經、感覺神經及自律神經造成障礙。其結果，特徵為造成疼痛、知覺異常、麻痺、麻木、肌力降低、排汗異常，或排尿障礙等之症狀，並隨時間而惡化。末梢神經障礙之主要原因，可列舉變形等之身體性要因導致的損傷、壓迫、血液循環障礙、遺傳性要因、代謝異常等。糖尿病性神經障礙包含多發神經障礙與單神經障礙，多發神經障礙包含末梢神經系統之感覺神經、運動神經及自律神經障礙。作為對末梢神經障礙之治療藥，於臨床上使用甲基維生素B12(甲基鈷胺素)(非專利文獻4)，但臨床上有效的病例極為稀少。又，伴隨神經障礙之運動麻痺，對日常生活造成深刻影響，但有效的治療方法尚未確立。

RGM(repulsive guidance molecule)當初係作為視覺系統的軸突引導分子而被鑑定的膜蛋白質(參照非專利文獻5)。RGM家族包含稱為RGMa、RGMb及RGMc之3種成員(非專利文獻6)，已知至少RGMa與RGMb係以相同之訊息傳導機制作用(參照非專利文獻7)。RGMc於鐵代謝上發揮重要角色。由之後的研究，得知RGM具有於爪蟾及雞胚之軸突引導及分層(lamina)形成，以及於小鼠胚胎之頭部神經管的閉鎖控制等之功能(參照非專利文獻8)。專利文獻1揭示含有抗RGM中和抗體作為有效成分之軸突再生促進劑。

RGMa除了發育階段的功能以外，於成人人類及大鼠之中樞神經系統損傷後會再表現，且於大鼠之RGMa阻礙，會使脊髓損傷後之軸突成長亢進，促進功能回復(參照非專利文獻9)，故RGMa被認為係中樞神經系統損傷後之軸突再生阻礙劑。作為中和RGMa之具體的抗體，例如記載於專利文獻2(例如5F9、8D1)、專利文獻3(例如AE12-1、AE12-1Y)、專利文獻4(例如r116A3、r70E4、r116A3C、rH116A3)中。又，已知抗RGMa抗體對視神經脊髓炎具有效果(參照非專利文獻10)。如此地，於中樞神經系統損傷中RGMa的角色係已究明，但於末梢神經障礙或伴隨著觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病的疼痛症狀中，RGMa之關聯則尚未被鑑定。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開WO2005/087268號 [專利文獻2]國際公開WO2009/106356號 [專利文獻3]國際公開WO2013/112922號 [專利文獻4]國際公開WO2016/175236號 [非專利文獻]

[非專利文獻1]Dallerac G et al., Prog Neurobiol. 144： 48-67(2016) [非專利文獻2]Gerkau NJ et al., J Neurosci Res. 2017 Feb 2. [非專利文獻3]Alam Q et al., Curr Pharm Des. 22： 541-8(2016) [非專利文獻4]Yamazaki et al. Neurosci Lett, 170： 195-197. (1994) [非專利文獻5]Stahl, B., Muller, B., von Boxberg, Y., Cox, E.C. & Bonhoeffer, F. Biochemical characterization of a putative axonal guidance molecule of the chick visual system. Neuron 5, 735-743 (1990) [非專利文獻6]Mueller et al.,Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 361：1513‐29, 2006 [非專利文獻7]Liu, X., Hashimoto, M., Horii, H., Yamaguchi, A., Naito, K. and Yamashita, T. Repulsive guidance molecule b inhibits neurite growth and is increased after spinal cord injury. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 795-800 (2009) [非專利文獻8]Yamashita, T., Mueller, B.K. & Hata, K. Neogenin and repulsive guidance molecule signaling in the central nervous system. Curr. Opin. Neurobiol.17, 29-34 (2007) [非專利文獻9]Hata, K. et al. RGMa inhibition promotes axonal growth and recovery after spinal cord injury. J. Cell Biol. 173, 47-58 (2006) [非專利文獻10]Harada K. et al., Inhibition of RGMa alleviates symptoms in a rat model of neuromyelitis optica. Scientific Reports 8：34 1-9 (2018)

[發明所欲解決之課題]

本發明之目的，為提供新穎之末梢神經障礙或伴隨著觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病的疼痛症狀之預防或治療方法。 [用以解決課題之手段]

本發明者等人為了解決上述課題而進行了深入探討。其結果，發現了RGMa阻礙物質，可成為末梢神經障礙之預防或治療劑。又，發現了RGMa阻礙物質，不僅是末梢神經障礙，且藉由改善星狀細胞之障礙或功能降低，對疼痛症狀顯示出效果，故可成為對伴隨著觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病的疼痛症狀之預防或治療劑，而完成本發明。亦即，本發明關於以下之各發明。

1.一種末梢神經障礙之預防或治療劑，其含有RGM阻礙物質。 2.如項1之預防或治療劑，其中RGM阻礙物質為RGMa阻礙物質。 3.如項2之預防或治療劑，其中RGMa阻礙物質為抗RGMa中和抗體或其片段。 4.如項3之預防或治療劑，其中抗RGMa中和抗體為人類化抗體。 5.如項3或4之預防或治療劑，其中抗RGMa中和抗體為認識由序列編號16、序列編號36、序列編號37、序列編號38及序列編號39中選擇的胺基酸序列之抗體。 6.如項3~5中任一項之預防或治療劑，其中抗RGMa中和抗體，為由下述(a1)~(l1)中選擇的抗體： (a1)包含含有包含序列編號5記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號6記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號7記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號8記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號9記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號10記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (b1)包含含有包含序列編號11記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號12記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號13記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號14記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號15記載之胺基酸序列之HCDR2及胺基酸序列中包含SFG之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (c1)包含含有包含序列編號17記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號18記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號19記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號20記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號21記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號22記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (d1)包含含有包含序列編號23記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號24記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號25記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號26記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號27記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號28記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (e1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號31記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (f1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號35記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (g1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號40記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (h1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號41記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (i1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號42記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (j1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號43記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (k1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號44記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體，及 (l1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號45記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體。 7.如項1~6中任一項之預防或治療劑，其中末梢神經障礙，係由糖尿病性神經障礙、陷套性神經障礙(腕隧道症候群、肘部尺骨神經障礙、腓骨神經麻痺或跗骨隧道症候群)、家族性類澱粉蛋白多發性神經病變、中毒性神經病變、癌性神經病變、免疫媒介性神經病變(Guillain-Barré症候群(GBS)或慢性發炎性脫髓鞘性多發神經病變(CIDP))、伴隨膠原病之神經病變、Crow‐Fukase症候群(POEMS症候群)、遺傳性神經病變(Charcor-Marie-Tooth病)、帶狀疱疹後神經痛、AIDS或萊姆病所致之末梢神經障礙、尿毒症、多病灶性運動神經病變及血管炎性神經病變中選出。 8.如項1~6中任一項之預防或治療劑，其中末梢神經障礙，為糖尿病性神經障礙。 9.如項8之預防或治療劑，其中糖尿病性神經障礙，為疼痛性糖尿病性神經障礙，及/或無症狀性糖尿病性神經障礙。 10.如項1~6中任一項之預防或治療劑，其係使用於觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀之預防或治療。 11.如項10之預防或治療劑，其中觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病，係由糖尿病性神經障礙、陷套性神經障礙(腕隧道症候群、肘部尺骨神經障礙、腓骨神經麻痺或跗骨隧道症候群)、家族性類澱粉蛋白多發性神經病變、中毒性神經病變、癌性神經病變、免疫媒介性神經病變(Guillain-Barré症候群(GBS)或慢性發炎性脫髓鞘性多發神經病變(CIDP))、伴隨膠原病之神經病變、Crow‐Fukase症候群(POEMS症候群)、遺傳性神經病變(Charcor-Marie-Tooth病)、帶狀疱疹後神經痛、AIDS或萊姆病所致之末梢神經障礙、尿毒症、多病灶性運動神經病變、血管炎性神經病變、視神經脊髓炎及亞歷山大氏症中選出。 12.如項11之預防或治療劑，其中觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病，為糖尿病性神經障礙或視神經脊髓炎。 13.如項11之預防或治療劑，其中觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病，為糖尿病性神經障礙。 14.如項11之預防或治療劑，其中觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病，為視神經脊髓炎。 15.一種末梢神經障礙之預防或治療方法，其包含對需要治療之哺乳動物投予有效量之RGMa阻礙物質。 16.如項15之方法，其中末梢神經障礙為糖尿病性神經障礙。 [發明之效果]

依照本發明，可提供末梢神經障礙之預防或治療劑。又，本發明可提供伴隨著觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病的疼痛症狀之預防或治療劑。

以下說明本發明之實施形態。本說明書中只要未另外定義，則相關於本發明所使用的科學用語及技術用語具有所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解之意義。用語之意義及範圍雖必需明確，但意義潛在性地不明確時，本說明書中所給予的定義係優先於字典或外部之定義。進一步地，只要無特別的記述，單數形之用語包含複數，複數形之用語包含單數。本說明書中，「或」的使用，只要無特別的記述，意指「及/或」。

一般而言，相關於本說明書中所記載之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、蛋白質及核酸化學，以及雜交所使用之命名法及該等之技術在本技術領域係為公知，而常態地被使用。本發明之方法及技術，只要無特別指示，通常在本技術領域係為公知，係遵照各種一般文獻以及本說明書中所引用、探討的更具體的文獻所記載之慣用方法來實施。酵素反應及純化技術係於本技術領域中常態被實施，或如本說明書中所記載，遵照製造業者的說明書來實施。相關於本說明書中所記載之分析化學、合成有機化學，以及醫藥化學及作為醫藥之化學所使用的命名法以及該等之實驗流程及技術在本技術領域係為公知，而常態地被使用。在化學合成、化學分析、醫藥品、處方、藥物傳輸及患者治療的目的上係使用標準技術。為了容易理解本發明，以下說明本發明所用之用語。

[中和] 本案中，中和係指可結合於目標之標的，且阻礙該標的之任一功能的作用。例如，RGMa阻礙物質，係指結合於RGMa，結果阻礙RGMa之生物活性的物質。

[抗原決定位] 本案中，抗原決定位，包含可對免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合的多肽決定基。在一實施形態中，抗原決定位包含分子之具化學活性之表面基(例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，在一實施形態中，可具有特定之3維構造特性及/或特定之電荷特性。抗原決定位為藉著抗體而結合的抗原區域。

[經單離] 本案中，經單離之RGMa阻礙物質(例如抗體等)等之「經單離」，係指經鑑定，且經分離，及/或經從自然狀態下之成分回收的意義。自然狀態下之雜質，為可妨害該抗體之診斷或治療性使用的物質，可列舉酵素、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性之溶質。一般而言，欲單離RGMa阻礙物質等，只要藉由至少1個純化步驟來純化即可，可將經至少1個純化步驟而純化的RGMa阻礙物質稱為「經單離之RGMa阻礙物質」。

[抗體] 本案中，抗體在廣義上係指保持免疫球蛋白(Ig)分子之實質上結合於抗原決定位的特徵之由2條重鏈(H鏈)與2條輕鏈(L鏈)共4條多肽鏈所構成之Ig分子。

[人類抗體] 本案中，「人類抗體」係指輕鏈、重鏈均來自人類免疫球蛋白之抗體。人類抗體依重鏈之恆定區域的不同，包含具有γ鏈之重鏈的IgG(包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、具有μ鏈之重鏈的IgM、具有α鏈之重鏈的IgA(包含IgA1、IgA2)、具有δ鏈之重鏈的IgD，或具有ε鏈之重鏈的IgE。又，原則上輕鏈包含κ鏈與λ鏈之任一方。

[人類化抗體] 本案中，「人類化抗體」，係指由來自非人類動物之抗體的互補性決定區域，與來自人類抗體之框架區域所構成的可變區域，及來自人類抗體之恆定區域所構成之抗體。

[嵌合體抗體] 本案中，「嵌合體抗體」，係指輕鏈、重鏈，或其兩方，由來自非人類之可變區域，與來自人類之恆定區域所構成之抗體。

[單專一性抗體] 本案中，「單專一性抗體」，係指具有單一之抗原特異性的具備單一之獨立的抗原認識部位之抗體。本說明書中，例如有將認識RGMa之單專一性抗體稱為RGMa單專一性抗體者。

[多專一性抗體] 本案中，「多專一性抗體」，係指具有2個以上之相異的抗原特異性之具備2個以上之獨立的抗原認識部位之抗體，可列舉具有2個抗原特異性之雙專一性抗體、具有3個抗原特異性之三專一性抗體等。

[互補性決定區域(CDR)] 「互補性決定區域(CDR)」係指免疫球蛋白分子之可變區域當中，形成抗原結合部位的區域，亦稱為超可變區域，係止每個免疫球蛋白分子胺基酸序列之變化特別大的部分。就CDR而言係於輕鏈及重鏈各有3個CDR。有將輕鏈所含的3個CDR分別稱為LCDR1、LCDR2及LCDR3，以及將重鏈所含的3個CDR稱為HCDR1、HCDR2及HCDR3者。例如免疫球蛋白分子之CDR係遵照Kabat之編號系統(Kabat等人、1987、Sequences of Proteins of Immunological Interest、US Department of Health and Human Services、NIH、USA)來決定。

[有效量] 「有效量」，係指減輕或改善障礙或其1個以上之症狀的重症度及/或期間、預防障礙之進行、使障礙倒退、預防障礙相關之1個以上之症狀的再發、發生、發病或進行、檢測障礙，或強化或提高別的治療(例如預防藥或治療藥)之1個以上之預防或治療效果所充分的預防或治療劑之量。

[胺基酸序列之百分率(%)同一性] 可變區域等之候補多肽序列的胺基酸序列之關於參照多肽序列之胺基酸序列的「百分率(%)同一性」，係排列序列，為了得到最大的%同一性，若必要則導入間隙，不管何種保守性取代均不視為序列同一性之一部分之後，定義為與特定之參照多肽序列的胺基酸殘基相同的候補序列中之胺基酸殘基的百分率。以測定%同一性為目的之比對(alignment)，可藉由使用所屬技術領域中具有通常知識者之技能範圍內的各種方法，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN，或Megalign(DNASTAR)軟體般的可公開獲得之電腦軟體來達成。所屬技術領域中具有通常知識者可決定包含相對於所比較之序列全長而言為了達成最大比對所必要之任意演算法的用以比對序列之適切的參數。但是，為了達成此處的目的，%同一性值係藉由於成對式(pairwise)比對中使用序列比較電腦程式BLAST而得到。於胺基酸序列比較中使用BLAST的狀況下，給定之胺基酸序列A之與給定之胺基酸序列B的%同一性係如下般計算：分率X/Y之100倍此處，X為藉由序列比對程式BLAST之A及B的程式比對與相同一致之分數的胺基酸殘基的數目，Y為B之全部胺基酸殘基數。胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度相異時，A對B之%同一性，應可理解為與B對A之%同一性相異。只要無特別指明，此處之全部的%同一性值，如上一段落中所示般，係使用BLAST電腦程式得到。

以下，詳細說明本發明。本發明之實施形態，提供RGM阻礙物質、特別是RGMa阻礙物質之新穎用途的末梢神經障礙之預防或治療劑。又，本發明之實施形態，提供例如RGMa阻礙物質之糖尿病性神經障礙之預防或治療劑。進一步地，本發明之其他實施形態，提供RGMa阻礙物質之觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀之預防或治療劑。又，本發明之其他實施形態，提供包含對需要治療之哺乳動物投予含有有效量之RGMa阻礙物質的預防或治療劑之步驟的末梢神經障礙，例如糖尿病性神經障礙之預防或治療方法。

＜RGM阻礙物質＞本發明之RGM阻礙物質，可為阻礙RGM之活性(以下有僅稱為「RGM活性」者)的物質或阻礙RGM之表現的物質之任意者，該RGM係誘導後述末梢神經障礙或觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀，或阻礙自該疾病或症狀的回復。此處，RGM意指由RGMa、RGMb及RGMc中選擇的一者或二者以上，較佳為RGMa。

RGMa係被鑑定為中樞神經系統中之神經突起成長阻礙蛋白質，人類RGMa蛋白質係如序列編號1所示般，係被生合成為由450個胺基酸所構成的前驅蛋白質。存在於N末端之訊息胜肽Met1~Pro47(係指由N末端側起1號之甲硫胺酸殘基至47號之脯胺酸殘基為止的胜肽，以後係同樣地記載)被去除，Asp168與Pro169之間的胜肽鍵被切斷，生成N末端結構域，進一步地自Pro169起C末端側之片段的C末端胜肽Ala425~Cys450被去除，並且對作為C末端之Ala424之C末端羧基附加GPI錨定(anchor)，生成C末側結構域。進一步，作為將上述N末側結構域(Cys48~Asp168)與C末側結構域(Pro169~Ala424)以雙硫鍵連結的成熟蛋白質，透過GPI錨定表現於細胞膜上。

本發明中，RGMa係任何動物由來者均可，較佳為人類RGMa。人類之RGMa之前驅蛋白質係由序列表之序列編號1所示的胺基酸序列所構成。小鼠之RGMa之前驅蛋白質係由序列表之序列編號2所示的胺基酸序列、大鼠之RGMa之前驅蛋白質係由序列表之序列編號3所示的胺基酸序列所構成，但由於C末端胜肽會被去除，故作為成熟蛋白質係成為相同胺基酸序列。 RGMa基因，例如可列舉由序列編號4所示之鹼基序列所構成的人類RGMa基因等，但不限定於此。各種生物由來的RGM基因之鹼基序列可由公知之資料庫(GenBank等)輕易地取得。

本發明中之RGMa阻礙物質，可為阻礙(中和)RGMa之活性(以下，本說明書中有僅稱為「RGMa活性」者)的物質或阻礙RGMa之表現的物質之任意者，該RGMa會誘導末梢神經障礙或觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀或阻礙自該疾病或症狀的回復。例如，本發明中之RGMa阻礙物質，可藉由實施例1記載之評估方法，亦即評估對使用大鼠STZ誘發糖尿病性神經障礙模式的疼痛及神經傳導障礙之改善效果等來選擇。

本發明中之RGMa阻礙物質，例如意指結合於RGMa而直接阻礙RGMa活性，或阻礙RGMa與受體之結合來間接阻礙RGMa活性之物質，具體而言，可列舉低分子化合物、抗RGMa中和抗體、其功能改變抗體、其接合抗體或該等之片段等。又，藉由阻礙RGMa之表現來阻礙RGMa活性之物質亦為RGMa阻礙物質，具體而言，可列舉RGMa基因之siRNA(short interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)、反義寡核苷酸等，此等之RGMa阻礙物質當中，較佳為抗RGMa中和抗體、其功能改變抗體、其接合抗體、該等之片段；更佳為抗RGMa中和抗體或其片段；特佳為抗RGMa中和抗體。

進一步地，就本發明之RGMa阻礙物質而言，亦包含雖非直接作用於RGMa者，但阻礙RGMa誘導末梢神經障礙，例如糖尿病性神經障礙之症狀的訊息傳導系當中任一相關分子之活性的物質。

本發明之實施形態中，抗RGMa中和抗體，只要係結合於RGMa，而中和本發明之RGMa活性的抗體即可，可為多株抗體亦可為單株抗體，較佳為單株抗體。又，本發明之RGMa中和抗體可為RGMa單專一性抗體，亦可為複數認識RGMa及其他抗原之多專一性抗體，較佳為RGMa單專一性抗體。

又，具體的抗原決定位，較佳為人類RGMa中，序列編號16(序列編號1之胺基酸編號47-69)、序列編號36(序列編號1之胺基酸編號298-311)、序列編號37(序列編號1之胺基酸編號322-335)、序列編號38(序列編號1之胺基酸編號349-359)、序列編號39(序列編號1之胺基酸編號367-377)中之1者以上；更佳為序列編號36及37之組合；特佳為序列編號36、37及39之組合。

本發明之抗RGMa中和抗體，包含以RGMa蛋白質或其部分片段(例如上述之抗原決定位片段)為抗原，將該抗原對小鼠等哺乳動物誘發免疫所得之多株抗體或單株抗體、使用基因重組技術所製造之嵌合體抗體及人類化抗體，以及使用產生人類抗體之基因轉殖動物等所製造之人類抗體等。以本發明之抗體為醫藥來對人類投予時，就副作用之觀點，較期望為人類化抗體或人類抗體。

本發明之抗RGMa中和抗體，具體而言，可列舉下述(a1)~(l2)之抗體，各自的製造方法可使用專利文獻2-4記載之方法。

由(a1)包含含有包含序列編號5記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號6記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號7記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號8記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號9記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號10記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號36、37及39為抗原決定位之抗體)、 (b1)包含含有包含序列編號11記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號12記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號13記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號14記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號15記載之胺基酸序列之HCDR2及胺基酸序列中包含SFG之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號36、37及38為抗原決定位之抗體)、 (c1)包含含有包含序列編號17記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號18記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號19記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號20記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號21記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號22記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (d1)包含含有包含序列編號23記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號24記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號25記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號26記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號27記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號28記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (e1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號31記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (f1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號35記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (g1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號40記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (h1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號41記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (i1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號42記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (j1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號43記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (k1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號44記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)，及 (l1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號45記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體) 中選擇之抗體；更佳可列舉由下述(a2)~(l2) (a2)包含含有由序列編號5記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號6記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號7記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號8記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號9記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號10記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號36、37及39為抗原決定位之抗體)、 (b2)包含含有由序列編號11記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號12記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號13記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號14記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號15記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由SFG之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號36、37及38為抗原決定位之抗體)、 (c2)包含含有由序列編號17記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號18記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號19記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號20記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號21記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號22記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (d2)包含含有由序列編號23記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號24記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號25記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號26記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號27記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號28記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (e2)包含含有由序列編號29記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號30記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號31記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號32記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號33記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號34記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (f2)包含含有由序列編號29記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號30記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號35記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號32記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號33記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號34記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (g2)包含含有由序列編號29記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號30記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號40記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號32記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號33記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號34記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (h2)包含含有由序列編號29記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號30記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號41記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號32記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號33記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號34記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (i2)包含含有由序列編號29記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號30記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號42記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號32記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號33記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號34記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (j2)包含含有由序列編號29記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號30記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號43記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號32記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號33記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號34記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、 (k2)包含含有由序列編號29記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號30記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號44記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號32記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號33記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號34記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)，及 (l2)包含含有由序列編號29記載之胺基酸序列所構成之LCDR1、由序列編號30記載之胺基酸序列所構成之LCDR2及由序列編號45記載之胺基酸序列所構成之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有由序列編號32記載之胺基酸序列所構成之HCDR1、由序列編號33記載之胺基酸序列所構成之HCDR2及由序列編號34記載之胺基酸序列所構成之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體，亦包含進一步以序列編號16為抗原決定位之抗體)、中選擇的抗體。此等之中，特佳可列舉(a2)記載之抗體。

本發明之抗RGMa中和抗體之製造方法，可使用已知之一般所用的製造方法。抗原可直接使用於免疫誘發、亦可作為與載體蛋白質之複合體使用。抗原與載體蛋白質之複合體的調製，可使用戊二醛、碳二亞胺、馬來醯亞胺活性酯等之縮合劑。載體蛋白質例示有牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、血藍素、KLH等。

誘發免疫之哺乳動物，可列舉小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔子、貓、狗、豬、山羊、馬或牛等，接種方法可列舉皮下、肌肉內或腹腔內投予。投予時抗原可與完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑混合來投予，投予通常每2~5週進行1次。由經誘發免疫之動物的脾臟或淋巴節所得到的抗體產生細胞係與骨髓瘤(myeloma)細胞進行細胞融合，作為融合瘤而單離。作為骨髓瘤細胞，係使用來自哺乳動物，例如來自小鼠、大鼠、人類等者。

多株抗體例如可藉由將如前述之抗原，依需要與弗氏佐劑(Freund's Adjuvant)一起，對如上述之哺乳動物誘發免疫，自由該免疫敏化動物所得之血清取得。

單株抗體，例如可採用『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987))、Antibodies：A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)記載之方法得到，分泌單株抗體之「融合瘤」的調製，可遵照Köhler及Milstein等之方法(Nature, 256, 495, 1975)及根據其之修飾方法進行。具體而言單株抗體可如下述般取得。亦即，藉由以前述抗原為免疫原，將該免疫原依需要與弗氏佐劑(Freund's Adjuvant)一起，對如上述之哺乳動物的皮下、肌肉內、靜脈內、足墊內或腹腔內注射1~數次或移植，實施免疫敏化。通常，自初次免疫誘發起約每1~14日進行1~4次免疫誘發，自最終免疫誘發起約1~5日後自免疫敏化之該哺乳動物取得抗體產生細胞。

融合瘤，係藉由將上述抗體產生細胞，與來自哺乳動物，較佳為小鼠、大鼠或人類之不具自我抗體產生能力的骨髓瘤細胞，依需要使用融合促進劑進行細胞融合來調製。

細胞融合所用之骨髓瘤細胞，例如可使用來自小鼠之骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/O、Sp2)、PAI、F0或BW5147、來自大鼠之骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.、來自人類之骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11或CEM-T15等。

融合促進劑可列舉聚乙二醇等，通常可藉由使用20~50%左右之濃度的聚乙二醇(平均分子量1000~4000)於20~40℃、較佳為30~37℃之溫度下，使抗體產生細胞數與骨髓瘤細胞數之比通常成為1：1~10：1左右，反應約1~10分鐘左右，來實施細胞融合。

產生單株抗體之融合瘤殖株的篩選，可藉由將融合瘤於例如微量滴定盤中培養，以ELISA等之免疫化學方法測定微孔之培養上清對免疫抗原的反應性藉以進行。

抗體產生融合瘤之篩選中，除了與RGMa蛋白質之結合分析以外，亦進行該抗體是否阻礙本發明之RGMa活性的評估。藉由此等之篩選方法，可選擇本發明之抗RGMa中和抗體。

可由含有產生目標抗體之融合瘤的微孔中進一步藉由極限稀釋法進行選殖，來得到殖株。融合瘤之選取、育種，通常係添加HAT(次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺核苷)，以含有10~20%胎牛血清之動物細胞用培養基來進行。

自融合瘤製造單株抗體，可藉由將融合瘤於體外培養，或於小鼠、大鼠等之哺乳動物之腹水中等之體內增殖，並由所得的培養上清，或哺乳動物之腹水中單離來進行。

於體外培養時，可配合所培養之細胞種類的特性及培養方法等之各種條件，將融合瘤增殖、維持及保存，使用適合在培養上清中產生單株抗體的營養培養基。營養培養基可列舉公知之營養培養基或自基本培養基所調製的營養培養基等。

基本培養基例如可列舉Ham’F12培養基、MCDB153培養基或低鈣MEM培養基等之低鈣培養基及MCDB104培養基、MEM培養基、D-MEM培養基、RPMI1640培養基、ASF104培養基或RD培養基等之高鈣培養基等，該基本培養基，可依目的，含有例如血清、激素、細胞激素及/或各種無機或有機物質等。

可藉由將上述培養上清或腹水，進行飽和硫酸銨、優球蛋白沈澱法、己酸法、辛酸法、離子交換層析(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白管柱或蛋白質A管柱等之親和管柱層析等來進行單株抗體之單離、純化。具體而言，單株抗體之純化只要使用已知作為免疫球蛋白之純化法的方法即可，例如，該製法可藉由硫酸銨份化法、PEG份化法、乙醇份化法、陰離子交換體之利用、進而使用RGMa蛋白質之親和層析等之手段而容易地達成。

單株抗體亦可藉由噬菌體顯示法取得。噬菌體顯示法中，係將由任意之噬菌體抗體基因庫所選取的噬菌體，使用目標之免疫原進行篩選，選擇具有對免疫原之所期望之結合性的噬菌體。接著，將噬菌體內所含的抗體對應序列予以單離或決定序列，基於經單離之序列或經決定之序列資訊，構築包含編碼抗體或抗原結合結構域之核酸分子的表現載體。然後藉由培養經轉染該表現載體之細胞株，可產生單株抗體。藉由使用人類抗體基因庫作為噬菌體抗體基因庫，可生成具有所期望之結合性的人類抗體。

編碼抗RGM抗體或其片段之核酸分子，例如可藉由以下方法得到。首先，由融合瘤等之細胞，使用市售之RNA抽出套組調製全RNA，使用隨機引子等，藉由反轉錄酵素合成cDNA。接著，藉由使用於已知的人類抗體重鏈基因、輕鏈基因之可變區域中，分別得到保存之序列的寡核苷酸作為引子的PCR法，放大編碼抗體之cDNA。就編碼恆定區域之序列而言，可藉由將已知序列以PCR法放大而得到。DNA之鹼基序列，可藉由接入於序列決定用質體等常規方法來決定。或者，亦可藉由化學合成可變區域或其一部分之序列，並結合於包含恆定區域之序列而得到編碼本發明之單株抗體的DNA。該核酸分子可為編碼重鏈與輕鏈之恆定區域與可變區域全部者，亦可為僅編碼重鏈與輕鏈之可變區域者。編碼恆定區域與可變區域全部時之重鏈及輕鏈之恆定區域的鹼基序列，較佳為於Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、 The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 及 Cell vol.22, p197, 1980中記載者。

功能改變抗體，係藉由如以下之方法調製。例如，藉由使用提高對Fc受體之1的FcRn之結合的Fc區域之變異體，可實現血中半衰期之延長(橋口周平等、生化學、2010、Vol.82(8), p710)。此等之功能改變抗體，可基因工程學地予以製造。

接合抗體可列舉對抗RGMa中和抗體以化學或基因工程學地結合有聚乙二醇(PEG)等之非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、生長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、白蛋白、酵素、其他抗體等之本案之抗RGMa中和抗體以外的功能分子之抗RGMa中和抗體。

結合PEG作為功能分子時，PEG可非限定地使用分子量2000至100000Da、更佳為10000至50000Da者，可為直鏈型、亦可為分支型者。PEG可藉由例如使用NHS活性基，結合於RGMa阻礙物質之胺基酸的N末端胺基等。

使用放射性物質作為功能分子時，可使用¹³¹ I、¹²⁵ I、⁹⁰ Y、⁶⁴ Cu、⁹⁹ Tc、⁷⁷ Lu或²¹¹ At等。放射性物質，可藉由氯胺T法等直接結合於RGMa阻礙物質。

使用毒素作為功能分子時，可使用細菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如蓖麻毒素)、低分子毒素(例如格爾德黴素(geldanamycin))、美登素(maytansinoid)，及卡奇黴素(calicheamicin)等。

使用低分子化合物作為功能分子時，可列舉道諾黴素(daunomycin)、阿黴素、胺甲喋呤、絲裂黴素、新抑癌素(neocarzinostatin)、長春地辛(vindesine)及FITC等之螢光色素等。

使用酵素作為功能分子時，可使用螢光酵素(例如螢火蟲螢光酵素及細菌螢光酵素；美國專利第4737456號)、蘋果酸去氫酶、尿素酶、過氧化酶(例如辣根過氧化酶(HRPO))、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖類氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶，及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環式氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶等)、乳過氧化酶、微過氧化酶等。

將毒素、低分子化合物或酵素予以化學性結合時所使用之連結子(linker)，可列舉二價自由基(例如伸烷基、伸芳基、雜伸芳基)、-(CR₂ )_n O(CR₂ )_n -(R為任意取代基、n為正整數)表示之連結子或烷氧基之重複單位(例如聚伸乙氧基、PEG、聚亞甲氧基等)及烷基胺基之重複單位(例如聚乙胺基、Jeffamine^TM )，以及二酸酯及醯胺(可列舉琥珀酸酯、琥珀醯胺、二甘醇酸酯、丙二酸酯及己醯胺等)。使功能分子結合之化學的修飾方法在本領域中已確立(D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc； Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152：127； Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93：8681)。

本發明之實施形態中，抗體之「片段」，意指如前述之抗體的具有抗原結合性之一部分區域，具體而言可列舉F(ab')₂ 、Fab'、Fab、Fv(variable fragment ofantibody)、雙硫鍵Fv、單鏈抗體(scFv)，及此等之聚合物等，進一步地，於片段中包含將聚乙二醇(PEG)等之非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、生長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、白蛋白、酵素、其他抗體等之本案之抗RGMa中和抗體以外的功能分子予以化學或基因工程學地結合的接合片段。

「F(ab')₂ 」及「Fab」，係藉由將免疫球蛋白以蛋白質分解酵素之胃蛋白酶或木瓜酶等處理而製造，意指於存在於絞鏈區域中之2條重鏈間的雙硫鍵前後消化所生成之抗體片段。例如，將IgG以木瓜酶處理時，於存在於絞鏈區域中之2條重鏈間的雙硫鍵之上游被切斷而可製造由VL(輕鏈可變區域)與CL(輕鏈恆定區域)所構成的輕鏈，及由VH(重鏈可變區域)與CHγ1(重鏈恆定區域中之γ1區域)所構成的重鏈片段在C末端區域經雙硫鍵而結合的相同之2個抗體片段。此等2個相同之抗體片段各稱為Fab。又，將IgG以胃蛋白酶處理時，於存在於絞鏈區域中之2條重鏈間的雙硫鍵之下游被切斷而可製造較將前述2個Fab以絞鏈區域連結者稍大的抗體片段。該抗體片段稱為F(ab')2。

本發明之抗RGMa中和抗體的較佳態樣可列舉嵌合體抗體。「嵌合體抗體」，例示有可變區域為來自非人類動物(小鼠、大鼠、倉鼠、雞等)之免疫球蛋白的可變區域，恆定區域為來自人類免疫球蛋白的恆定區域之嵌合體抗體。例如，可將抗原對小鼠誘發免疫，自該小鼠單株抗體之基因切出與抗原結合之可變區域，與來自人類骨髓之抗體恆定區域結合來製作。來自人類免疫球蛋白之恆定區域，依IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD及IgE等之同型而具有各自固有之胺基酸序列，本發明中之重組嵌合體抗體之恆定區域，不管屬何種同型之人類免疫球蛋白的恆定區域均可。較佳為人類IgG之恆定區域。可使用如此方式所製作之嵌合體抗體的基因來製作表現載體。藉由以該表現載體將宿主細胞轉形得到嵌合體抗體產生轉形細胞，藉由培養該轉形細胞，由培養上清中得到目標的嵌合體化抗體。

本發明之抗RGMa中和抗體之別的較佳態樣可列舉人類化抗體。本發明中之「人類化抗體」，為僅將小鼠等之非人類動物抗體之抗原結合部位(CDR；互補性決定區域)之DNA序列移植至人類抗體基因(CDR移植)的抗體。例如，可參照日本特表平4-506458號公報及日本專利2912618號說明書等記載的方法來製作。具體而言，意指一種人類化抗體，其特徵為其CDR之一部分或全部為來自非人類哺乳動物(小鼠、大鼠、倉鼠等)之單株抗體的CDR，其可變區域之框架區域為來自人類免疫球蛋白之可變區域的框架區域，且其恆定區域為來自人類免疫球蛋白之恆定區域。

本發明中之人類化抗體，例如可如以下般製造。但是，當然不限定於如此的製造方法。

例如，來自小鼠單株抗體之重組人類化抗體，可參照日本特表平4-506458號公報及日本特開昭62-296890號公報等，予以基因工程學地製作。亦即，由產生小鼠單株抗體之融合瘤，單離出小鼠重鏈CDR部分之DNA與小鼠輕鏈CDR部分之DNA，由人類免疫球蛋白基因，單離出人類重鏈CDR以外之全部區域的人類重鏈基因，與人類輕鏈CDR以外之全部區域的人類輕鏈基因。

將經移植所單離的小鼠重鏈CDR部分之DNA的人類重鏈基因導入適當之表現載體，使能夠表現，同樣地將經移植小鼠輕鏈CDR部分之DNA的人類輕鏈基因導入適當之另1表現載體，使能夠表現。或者，亦可將經移植小鼠之CDR的人類之重鏈及輕鏈基因導入於同一表現載體，使能夠表現。藉由以如此方式所製作之表現載體將宿主細胞轉形，得到人類化抗體產生轉形細胞，且藉由培養該轉形細胞，自培養上清中得到目標之人類化抗體。

本發明之抗RGMa中和抗體之別的較佳態樣可列舉人類抗體。「人類抗體」，係指包含構成免疫球蛋白之重鏈可變區域及重鏈恆定區域以及輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域的全部區域為來自編碼人類免疫球蛋白之基因的免疫球蛋白之抗體，可將人類抗體基因導入於小鼠來製作。具體而言，例如，可藉由對藉由至少將人類免疫球蛋白基因接入於小鼠等之人類以外的哺乳動物之基因座中所製作之基因轉殖動物，以抗原進行免疫敏化，與前述多株抗體或單株抗體之製作法同樣地來製造。

例如，產生人類抗體之基因轉殖小鼠，可遵照Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；日本特表平4-504365號公報；日本特表平7-509137號公報；國際公開WO94/25585號小冊；Nature, Vol.368,p.856-859, 1994；及日本特表平6-500233號公報等記載之方法製作。更具體而言，可列舉HuMab(註冊商標)小鼠(Medarex, Princeton NJ)、KMTM小鼠 (Kirin Pharma Company, Japan)、KM(FCγRIIb-KO)小鼠等。

本發明之抗RGMa中和抗體，具體而言，可列舉重鏈可變區域具有包含特定之胺基酸序列的CDR，輕鏈可變區域具有包含特定之胺基酸序列的CDR者(上述(a1)~(l2)之抗體)。再者，只要維持具有與RGMa之結合能力，且阻礙(中和)RGMa之活性的本發明之抗體之特性，則抗RGMa中和抗體之胺基酸序列中，亦可具有1或數個之胺基酸(1~20個、1~10個、1~5個、1~3個或1~2個)的取代、缺失、附加或插入。如此的取代、缺失、附加亦可導入於CDR中，但較佳為導入於CDR以外之區域。又，為了維持本發明之特性，該胺基酸取代較佳為保守性取代。

胺基酸序列中包含取代、缺失等的本發明之抗體之胺基酸序列，例如為胺基酸序列改變後之重鏈可變區域為與改變前之胺基酸序列具有90%以上(更佳為95%、96%、97%、98%、99%以上)之%同一性的胺基酸序列，胺基酸序列改變後之輕鏈可變區域為與改變前之胺基酸序列具有90%以上(更佳為95%、96%、97%、98%、99%以上)之%同一性的胺基酸序列。

siRNA，為可抑制作為標的之基因(本發明中為RGMa基因)之表現的短雙股RNA。只要作為阻礙本發明之RGMa活性的siRNA而發揮功能，則鹼基序列或長度(鹼基長)並無特殊限定，較佳為約未達30鹼基、更佳為約19~27鹼基、又更佳為約21~25鹼基。shRNA係指由藉由以單股RNA而部分地包含回文狀之鹼基序列，於分子內成為雙股構造，於3'末端具有突出部之短的髮夾(hairpin)構造所成之約20鹼基對以上的分子。如此的shRNA，當導入細胞內後，於細胞內分解為約20鹼基(代表而言例如21鹼基、22鹼基、23鹼基)之長度，與siRNA同樣地可抑制作為標的之基因的表現。本發明中，siRNA及shRNA，只要為可抑制RGMa基因之表現者，則何種形態皆可。

siRNA或shRNA，可人工地化學合成。又，例如可使用T7RNA聚合酶及T7啟動子，於體外由模板DNA合成反義及正義之RNA。反義寡核苷酸，只要係對RGMa基因之DNA序列中之連續5至100長度的鹼基序列互補或雜交之核苷酸即可，其係DNA或RNA均可。又，只要不對功能造成妨礙，則亦可經修飾。反義寡核苷酸可藉由常規方法合成，例如可藉由市售之DNA合成裝置而容易地合成。較佳的序列可使用通常的選擇方法選擇，本發明中之siRNA或shRNA，可藉由評估功能性RGMa之表現阻礙來確認。

本發明之實施形態中，末梢神經障礙，可列舉糖尿病性神經障礙、陷套性神經障礙(腕隧道症候群、肘部尺骨神經障礙、腓骨神經麻痺或跗骨隧道症候群等)、家族性類澱粉蛋白多發性神經病變、中毒性神經病變、癌性神經病變、免疫媒介性神經病變(Guillain-Barré症候群(GBS)或慢性發炎性脫髓鞘性多發神經病變(CIDP))、伴隨膠原病之神經病變、Crow‐Fukase症候群(POEMS症候群)、遺傳性神經病變(Charcor-Marie-Tooth病)、帶狀疱疹後神經痛、AIDS或萊姆病所致之末梢神經障礙、尿毒症、多病灶性運動神經病變或血管炎性神經病變等。

本發明之其他實施形態中，觀察到星狀細胞障礙之疾病，意指觀察到星狀細胞障礙或功能降低之疾病，具體而言，可列舉視神經脊髓炎、亞歷山大氏症等。此等實施形態當中，末梢神經障礙，較佳可列舉糖尿病性神經障礙。又，觀察到星狀細胞障礙之疾病，較佳可列舉視神經脊髓炎。

進一步地，本發明之其他實施形態中，觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀，可列舉因末梢神經受到損傷，或於中樞神經系統星狀細胞受到障礙，或功能降低導致發病的症狀。此處，本發明中，引起疼痛症狀之觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病，係與上述觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病同義。例如如此的疼痛症狀當中，觀察到末梢神經障礙之疾病中，如後述實施例1(1-6)表示，由於藉由RGMa阻礙物質，例如抗RGMa抗體，改善神經傳導速度，故暗示了RGMa阻礙物質會治療觀察到末梢神經障礙之疾病，進而亦抑制疼痛，故暗示了RGMa阻礙物質會對觀察到末梢神經障礙之疾病所導致的疼痛顯示鎮痛效果。

又，觀察到星狀細胞障礙之疾病導致之疼痛症狀，可認為1個作用機制係因星狀細胞之障礙或功能降低，中樞之麩胺酸轉運蛋白的表現降低，其結果，麩胺酸之作用增強，神經因過度敏感或興奮而發病(例如Neuron 67, 834-846, Sep.9, 2010)。該疼痛症狀，係因星狀細胞障礙，觀察到伴隨前述疾病發病之麻痺感、痛覺或感覺遲鈍等之症狀。

因此，如後述實施例1(1-6)表示，於大鼠STZ誘發糖尿病性神經障礙模式中，引起末梢神經障礙與星狀細胞障礙，其結果，疼痛發病，RGMa阻礙物質例如抗RGMa中和抗體對該疼痛觀察到鎮痛效果。另一方面，藉由RGMa阻礙物質例如抗RGMa中和抗體，對小神經膠細胞之減少雖無效果，但觀察到對星狀細胞減少之抑制效果，故暗示了RGMa阻礙物質例如抗RGMa中和抗體，對觀察到星狀細胞障礙或功能降低之疾病所導致的疼痛顯示鎮痛效果。因此，由實施例1之實驗結果，可期待RGMa阻礙物質，較佳為抗RGMa中和抗體，對如此的觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病的任一方或兩方所導致的疼痛症狀顯示出效果。再者，非專利文獻10中，係進行關於視神經脊髓炎中的星狀細胞障礙之實驗。但是，本實驗模式中因為是無法評估疼痛之動物模式，因此由該文獻，觀察到星狀細胞障礙之疾病與疼痛症狀的關係不明。因此，觀察到星狀細胞障礙之疾病與疼痛症狀的關係，係本申請案之實施例1所得的新穎見解。

本發明之較佳實施形態中，例如，糖尿病性神經障礙，為糖尿病患者中最多的合併症之一，其係因血糖控制不良、長期之糖尿病罹病期間、高血壓、脂質異常等之公知風險因子而引起，但其發病機制尚未確知。糖尿病性神經障礙，分為遠端性對稱性之多發神經障礙與局部性之單神經障礙，特別是前者，係稱為糖尿病性神經障礙之核心症狀，包含感覺神經障礙、運動神經障礙、自律神經障礙。

糖尿病性神經障礙之診斷，不存在特異性症狀或檢查，係充分專注地對患者進行神經症狀之聽診，並且實施痛覺、振動覺、壓觸覺、腱反射檢查等之神經學檢查，綜合地判斷。糖尿病性神經障礙之主要症狀，粗略可列舉感覺神經障礙、運動神經障礙、自律神經障礙。感覺神經障礙，係存在有痛覺異常顯著的疼痛性神經障礙，與無自發性感覺異常之無症狀性神經障礙。感覺神經障礙，於發病早期在下肢末端觀察到麻痺感、疼痛，之後症狀進行時，感覺遲鈍變得顯著。又，症狀進行時，不僅下肢，於上肢末端亦出現麻痺感、疼痛、感覺遲鈍等之症狀。感覺神經障礙不僅造成患者之QOL降低，當症狀進行，出現感覺遲鈍時，造成足壞疽或Charcot氏關節之風險提高，亦產生造成四肢切斷或生命預後之惡化之虞。因此，糖尿病性神經障礙從發病早期之治療介入係重要的。另一方面，運動神經障礙中，特別係觀察到下肢之肌力降低及肌肉萎縮、足部變形等症狀。通常，未明顯到對日常生活動作造成影響，但當障礙進行，此等症狀可見對平衡維持，或坡道或階梯之上下、快走等負擔較重的步行造成影響。本發明中之糖尿病性神經障礙之預防或治療劑，可使用於由前述檢查所發現的症狀之改善或自前述症狀中選擇的症狀之預防或治療。

藉由本發明中之糖尿病性神經障礙之預防或治療劑所預防或治療的糖尿病性神經障礙，在呈現上述症狀者當中，較佳可列舉疼痛性糖尿病性神經障礙，及無症狀性糖尿病性神經障礙，更佳可列舉疼痛性糖尿病性神經障礙。

此處，「治療」包含哺乳動物、特別是人類之疾病的任意治療，且包含阻礙疾病症狀，亦即阻止其進行或使疾病或症狀消滅，及減輕疾病症狀，亦即引起疾病或症狀之後退，或症狀之進行延遲。再者，本發明中，治療並非基於血糖降低等所致之糖尿病的治療來治療糖尿病性神經障礙，而是直接治療糖尿病性神經障礙者。於別的實施形態中，治療為治療上之神經再生性或神經保護性的局部或全身之治療。

又，「預防」包含於哺乳動物、特別是人類，防止上述疾病之發病。

本發明中的末梢神經障礙之預防或治療劑或觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀之預防或治療劑，通常係以全身性或局部性，經口或非經口之形態投予。本發明中的末梢神經障礙之預防或治療劑或觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀之預防或治療劑，能夠以RGMa阻礙物質為有效成分，做為適當摻合藥學上容許之藥物載體或添加劑的醫藥組成物而製劑化。具體而言可為錠劑、包覆錠劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑、懸浮劑、乳劑等之經口劑；注射劑、輸液、栓劑、軟膏、貼片劑等之非經口劑。關於藥物載體或添加劑之摻合比例，只要基於醫藥品領域中通常採用的範圍來適當設定即可。可摻合之藥物載體或添加劑並無特殊限制，例如可列舉水、生理食鹽水、其他水性溶劑、水性或油性基劑等之各種藥物載體；賦形劑、結合劑、pH調整劑、崩解劑、吸收促進劑、潤滑劑、著色劑、除味劑、香料等之各種添加劑。

RGMa阻礙物質為抗RGMa中和抗體、其功能改變抗體、其接合抗體或該等之片段時，較佳作為與藥學上容許之藥物載體一起製劑化之注射劑或輸液，以非經口投予路徑，例如靜脈內、肌肉內、皮膚內、腹腔內、皮下或局部投予。含有抗RGMa中和抗體之注射劑或輸液，可作為溶液、懸浮液或乳濁液使用。其溶劑例如可使用注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖溶液及等張液(例如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、丙二醇等之溶液)等。進一步地，該注射劑或輸液，亦可含有安定劑、溶解輔助劑、懸浮化劑、乳化劑、無痛化劑、緩衝劑、保存劑、防腐劑、pH調整劑等。安定劑例如可使用白蛋白、球蛋白、明膠、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖、乙二醇、丙二醇、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、EDTA鈉、檸檬酸鈉、二丁基羥基甲苯等。溶解輔助劑例如可使用醇(例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(例如聚山梨醇酯80(註冊商標)、HCO-50等)等。懸浮化劑例如可使用單硬脂酸甘油、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧基甲基纖維素、羥基甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。乳化劑例如可使用阿拉伯膠、海藻酸鈉、龍膠等。無痛化劑例如可使用苯甲醇、氯丁醇、山梨醇等。緩衝劑例如可使用磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、硼酸緩衝液、碳酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、TRIS緩衝液等。保存劑例如可使用對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、氯化苄二甲烴銨、去氫乙酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、硼酸、硼砂等。防腐劑例如可使用氯化苄二甲烴銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。pH調整劑例如可使用鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸等。

RGMa阻礙物質為核酸(siRNA、shRNA、反義寡核苷酸，以及編碼抗RGMa中和抗體及其片段之核酸分子等)時，能夠以非病毒載體或病毒載體之形態投予。非病毒載體形態時，可利用使用微脂體導入核酸分子之方法(微脂體法、HVJ-微脂體法、陽離子型微脂體法、脂質體轉染法、Lipofectamine法等)、微量注射法、以基因槍(Gene Gun)與載子(金屬粒子)一起使核酸分子移入細胞之方法等。例如使用病毒載體對生物體投予時，可利用重組腺病毒、反轉錄病毒等之病毒載體。藉由對無毒化之反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、小兒麻痺病毒、辛德畢斯病毒、仙台病毒、SV40等之DNA病毒或RNA病毒，導入表現siRNA或shRNA之DNA，並使該重組病毒感染細胞或組織，可將基因導入細胞或組織內。

如此方式所得之製劑，藉由對以治療為必要之對象，例如人類或其他哺乳動物(例如大鼠、小鼠、兔子、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴子等)，投予其有效量，可預防或治療末梢神經障礙例如糖尿病性神經障礙，或觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀。投予量係考慮目的、疾病之嚴重度、患者之年齡、體重、性別、既往病歷、有效成分之種類等來適當設定。例如有效成分為抗RGMa中和抗體時，以具有約65~70kg體重之平均的人類為對象時，較佳為每1日0.02mg~4000mg左右、更佳為0.1mg~200mg左右。每1日之總投予量，可為單一投予量亦可為分割投予量。

本發明之末梢神經障礙之預防或治療劑或觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病中的疼痛症狀之預防或治療劑，可與既存之疼痛治療藥合併使用或合劑化。與本發明合併使用之藥劑，可列舉疼痛治療藥、糖尿病藥等。作為疼痛治療藥，例如可與三環系抗憂鬱藥(阿米曲替林、伊米帕明等)、α2δ配位體((例如普瑞巴林(Pregabalin)等)、Na通道阻斷劑(墨西律定等)、抗癲癇藥(加巴噴丁(gabapentine)、卡巴馬平等)、醛醣還原酵素阻礙藥(依帕司他(epalrestat)等)、羥色胺/去甲基腎上腺素再攝取阻礙藥(SNRI、例如度洛西汀(duloxetine))合併使用或合劑化。

作為抗糖尿病藥，例如可與磺醯基脲系抗糖尿病藥、雙胍系抗糖尿病藥、胰島素阻抗改善藥(吡格列酮(pioglitazone)等)、α葡萄糖苷酶阻礙藥、DPP-4阻礙藥、SGLT-2阻礙藥、GLP-1類似物、胰島素類似物等合併使用或合劑化。 [實施例]

以下列舉實施例以更具體說明本發明，但此等不限制本發明之範圍。 [實施例1] 大鼠STZ誘發糖尿病性神經障礙模式之抗RGMa中和抗體對疼痛及運動神經傳導障礙之效果的探討該大鼠STZ誘發糖尿病性神經障礙模式，係評估對末梢神經障礙，特別是糖尿病性神經障礙中的末梢神經障礙之效果的模式。此外，本模式除了對末梢神經障礙，特別是糖尿病性神經障礙之疼痛症狀的效果以外，為亦可評估對觀察到星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀之效果的模式。 (1-1)大鼠STZ誘發糖尿病性神經障礙模式之製作實驗係使用SD系雄性大鼠。將以0.75 mM檸檬酸緩衝液(pH 4.5)溶解為30%濃度之STZ(鏈脲佐菌素)(60 mg/kg)對大鼠尾靜脈內投予，3週後，使用血糖值達300 mg/dl以上者作為STZ實驗群(糖尿病群)。正常群係使用與實驗群相同週齡之STZ非投予大鼠。

(1-2)行動的疼痛評估 von Frey刺激試驗係使用up-down法(參照Chaplan, S.R., Bach, F.W., Pogrel, J.W., Chung, J.M., Yaksh, T.L., Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw, J. Neurosci. Methods, 53, 55-63(1994))，求出舉起後肢之50%逃避反應閾值(g)，來評估機械性痛覺過敏。

(1-3)運動神經傳導速度(MNCV)之測定以異氟醚氣體使大鼠持續吸入麻醉，於腹位固定，藉由體溫控制裝置(ATB-1100、日本光電股份有限公司)將體溫(直腸溫度)保持一定(37.5~38.5℃)，測定MNCV。以右坐骨神經之坐骨結節部位為近遠端刺激點(S1)、右脛骨神經之足關節部位為遠近端刺激點(S2)，各自插入針電極(-極)。又，將中性電極(+極)於自S1起向脊髓側約1cm之部位插入。另一方面，將記錄用之引導電極(-極)及基準電極(+極)分別於右足底肌部位淺淺地插入。再者，基準電極(+極)係設置於較-極更末梢側。使用誘發電位記錄裝置[Neuropack μ(型號：MEB-9102、日本光電工業股份有限公司)]對S1、S2各自施加單一矩形脈衝(刺激頻率：1Hz、持續時間：0.1msec、電流：supramaximal、刺激次數：1次)之電刺激，記錄以記錄電極所得之活動電位的變化。對於S1刺激、S2刺激各自測定由刺激時至活動電位上升為止的潛伏時間t1、t2(msec)及S1、S2間之距離d(mm)，由下式算出MNCV。

MNCV = d / (t1 - t2)

(1-4)分群及抗RGMa中和抗體之投予 STZ投予3週後，將血糖值300 mg/dL以下之動物由分群對象除外，分群為體重、50%逃避閾值及MNCV之平均值與分散在各群中均質化。STZ/控制組抗體投予群、STZ/抗RGMa中和抗體投予群、正常/控制組抗體投予群均為以10隻構成。

將抗RGMa中和抗體或控制組抗體(小鼠IgG)以10 mg/kg之用量對尾靜脈內投予，自STZ投予第3週起一週1次，合計實施4次。抗RGMa中和抗體，係使用以文獻記載之方法所製作的r116A3(參照專利文獻4)。

(1-5)GFAP、Iba1免疫染色之病理組織學評估自被試驗物質初次投予起28日後(自STZ投予起51日後)，灌流生理食鹽水，放血而安樂死，以10vol%中性緩衝福馬林灌流固定。之後採取脊髓，浸漬固定於10vol%中性緩衝福馬林。實施GFAP(星狀細胞之染色)及Iba1(小神經膠細胞之染色)之免疫染色，於光學顯微鏡下病理組織學地評估GFAP及Iba1之表現。

將載玻片標本以虛擬載玻片掃描器Aperio(Aperio AT2, Leica Microsystems)攝影(倍率20倍)後，將標本全體之影像100% extract，轉換為JPEG影像。使用影像解析軟體Image-Pro premier(ver.9.3.2, Media Cybernetics)，將灰白質部分之前角(腹角)、後角(背角)以Area of Interest (AOI)包圍，抽出各區域之免疫染色陽性面積予以測定(尺寸＞ 1 mm² )後，算出各區域之全體面積之染色陽性面積率。所得之結果，係以個體值及平均值±標準誤差表示，對於各面積率，於非糖尿病群與糖尿病群之間及糖尿病群與糖尿病+被試驗物質投予群之間實施Student’s t檢定。

(1-6)結果抗RGMa中和抗體重複投予對機械性痛覺過敏之效果如圖1所示。藉由誘發糖尿病所降低之50%逃避反應閾值，在抗RGMa中和抗體投予後1週起，觀察到顯著的改善。改善效果每週地增強，改善效果至少持續到最終評估時間點之4週為止。

抗RGMa中和抗體重複投予對運動神經傳導障礙之效果如圖2所示。對藉由糖尿病誘發所降低之運動神經傳導速度，抗RGMa中和抗體亦顯示改善作用，於投予開始後4週見到顯著的改善。

GFAP陽性面積率之算出結果如圖3所示。於前角，相較於非糖尿病群而言，於糖尿病群觀察到顯著的減少，於前角及後角，相較於糖尿病群而言，於糖尿病+被試驗物質投予群觀察到顯著的增加。 Iba1陽性面積率之算出結果如圖4所示。於前角及後角，相較於非糖尿病群而言，於糖尿病群觀察到顯著的減少。

＜序列表之說明＞序列編號1：人類RGMa前驅蛋白質之胺基酸序列序列編號2：小鼠RGMa前驅蛋白質之胺基酸序列序列編號3：大鼠RGMa前驅蛋白質之胺基酸序列序列編號4：人類RGMa基因之DNA序列序列編號5：抗RGMa中和抗體r116A3之LCDR1之胺基酸序列序列編號6：抗RGMa中和抗體r116A3之LCDR2之胺基酸序列序列編號7：抗RGMa中和抗體r116A3之LCDR3之胺基酸序列序列編號8：抗RGMa中和抗體r116A3之HCDR1之胺基酸序列序列編號9：抗RGMa中和抗體r116A3之HCDR2之胺基酸序列序列編號10：抗RGMa中和抗體r116A3之HCDR3之胺基酸序列序列編號11：抗RGMa中和抗體r70E之LCDR1之胺基酸序列序列編號12：抗RGMa中和抗體r70E之LCDR2之胺基酸序列序列編號13：抗RGMa中和抗體r70E之LCDR3之胺基酸序列序列編號14：抗RGMa中和抗體r70E之HCDR1之胺基酸序列序列編號15：抗RGMa中和抗體r70E之HCDR2之胺基酸序列序列編號16：人類RGMa之抗原決定位之胺基酸序列序列編號17：抗RGMa中和抗體5F9之LCDR1之胺基酸序列序列編號18：抗RGMa中和抗體5F9之LCDR2之胺基酸序列序列編號19：抗RGMa中和抗體5F9之LCDR3之胺基酸序列序列編號20：抗RGMa中和抗體5F9之HCDR1之胺基酸序列序列編號21：抗RGMa中和抗體5F9之HCDR2之胺基酸序列序列編號22：抗RGMa中和抗體5F9之HCDR3之胺基酸序列序列編號23：抗RGMa中和抗體8D1之LCDR1之胺基酸序列序列編號24：抗RGMa中和抗體8D1之LCDR2之胺基酸序列序列編號25：抗RGMa中和抗體8D1之LCDR3之胺基酸序列序列編號26：抗RGMa中和抗體8D1之HCDR1之胺基酸序列序列編號27：抗RGMa中和抗體8D1之HCDR2之胺基酸序列序列編號28：抗RGMa中和抗體8D1之HCDR3之胺基酸序列序列編號29：抗RGMa中和抗體AE12-1之LCDR1之胺基酸序列序列編號30：抗RGMa中和抗體AE12-1之LCDR2之胺基酸序列序列編號31：抗RGMa中和抗體AE12-1之LCDR3之胺基酸序列序列編號32：抗RGMa中和抗體AE12-1之HCDR1之胺基酸序列序列編號33：抗RGMa中和抗體AE12-1之HCDR2之胺基酸序列序列編號34：抗RGMa中和抗體AE12-1之HCDR3之胺基酸序列序列編號35：抗RGMa中和抗體AE12-1Y之LCDR3之胺基酸序列序列編號36：人類RGMa之抗原決定位之胺基酸序列序列編號37：人類RGMa之抗原決定位之胺基酸序列序列編號38：人類RGMa之抗原決定位之胺基酸序列序列編號39：人類RGMa之抗原決定位之胺基酸序列序列編號40：抗RGMa中和抗體AE12-1F之LCDR3之胺基酸序列序列編號41：抗RGMa中和抗體AE12-1H之LCDR3之胺基酸序列序列編號42：抗RGMa中和抗體AE12-1L之LCDR3之胺基酸序列序列編號43：抗RGMa中和抗體AE12-1V之LCDR3之胺基酸序列序列編號44：抗RGMa中和抗體AE12-1I之LCDR3之胺基酸序列序列編號45：抗RGMa中和抗體AE12-1K之LCDR3之胺基酸序列 [產業上之可利用性]

本發明係有用於末梢神經障礙之預防或治療，或伴隨著觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病的疼痛症狀之預防或治療，於醫藥品產業具有高利用價值。

[圖1]圖1為顯示對大鼠鏈脲佐菌素(STZ)誘發糖尿病性神經障礙模式之機械性痛覺過敏的r116A3重複投予所致的改善效果之圖。 [圖2]圖2為顯示對大鼠STZ誘發糖尿病性神經障礙模式之運動神經傳導速度降低的r116A3重複投予所致的改善效果之圖。 [圖3]圖3為顯示對大鼠STZ誘發糖尿病性神經障礙模式之脊髓的神經膠細胞纖維性酸性蛋白質(GFAP)免疫染色陽性面積率之r116A3重複投予所致的效果之圖。 [圖4]圖4為顯示對大鼠STZ誘發糖尿病性神經障礙模式之脊髓的Iba1免疫染色陽性面積率之r116A3重複投予所致的效果之圖。

Claims

一種RGM阻礙物質之使用，其係用於製造末梢神經障礙之預防或治療劑。
如請求項1之使用，其中RGM阻礙物質為RGMa阻礙物質。
如請求項2之使用，其中RGMa阻礙物質為抗RGMa中和抗體或其片段。
如請求項3之使用，其中抗RGMa中和抗體為人類化抗體。
如請求項3之使用，其中抗RGMa中和抗體為認識由序列編號16、序列編號36、序列編號37、序列編號38及序列編號39中選擇的胺基酸序列之抗體。
如請求項3之使用，其中抗RGMa中和抗體，為由下述(a1)~(l1)中選擇的抗體： (a1)包含含有包含序列編號5記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號6記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號7記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號8記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號9記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號10記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (b1)包含含有包含序列編號11記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號12記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號13記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號14記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號15記載之胺基酸序列之HCDR2及胺基酸序列中包含SFG之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (c1)包含含有包含序列編號17記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號18記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號19記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號20記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號21記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號22記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (d1)包含含有包含序列編號23記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號24記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號25記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號26記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號27記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號28記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (e1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號31記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (f1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號35記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (g1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號40記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (h1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號41記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (i1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號42記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (j1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號43記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (k1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號44記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體，及 (l1)包含含有包含序列編號29記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號30記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號45記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，以及含有包含序列編號32記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號33記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號34記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體。
如請求項1~6中任一項之使用，其中末梢神經障礙，係由糖尿病性神經障礙、陷套性神經障礙(腕隧道症候群、肘部尺骨神經障礙、腓骨神經麻痺或跗骨隧道症候群)、家族性類澱粉蛋白多發性神經病變、中毒性神經病變、癌性神經病變、免疫媒介性神經病變(Guillain-Barré症候群(GBS)或慢性發炎性脫髓鞘性多發神經病變(CIDP))、伴隨膠原病之神經病變、Crow‐Fukase症候群(POEMS症候群)、遺傳性神經病變(Charcor-Marie-Tooth病)、帶狀疱疹後神經痛、AIDS或萊姆病所致之末梢神經障礙、尿毒症、多病灶性運動神經病變及血管炎性神經病變中選出。
如請求項1~6中任一項之使用，其中末梢神經障礙，為糖尿病性神經障礙。
如請求項8之使用，其中糖尿病性神經障礙，為疼痛性糖尿病性神經障礙，及/或無症狀性糖尿病性神經障礙。
如請求項1~6中任一項之使用，其係使用於觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病所導致的疼痛症狀之預防或治療。
如請求項10之使用，其中觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病，係由糖尿病性神經障礙、陷套性神經障礙(腕隧道症候群、肘部尺骨神經障礙、腓骨神經麻痺或跗骨隧道症候群)、家族性類澱粉蛋白多發性神經病變、中毒性神經病變、癌性神經病變、免疫媒介性神經病變(Guillain-Barré症候群(GBS)或慢性發炎性脫髓鞘性多發神經病變(CIDP))、伴隨膠原病之神經病變、Crow‐Fukase症候群(POEMS症候群)、遺傳性神經病變(Charcor-Marie-Tooth病)、帶狀疱疹後神經痛、AIDS或萊姆病所致之末梢神經障礙、尿毒症、多病灶性運動神經病變、血管炎性神經病變、視神經脊髓炎及亞歷山大氏症中選出。
如請求項11之使用，其中觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病，為糖尿病性神經障礙或視神經脊髓炎。
如請求項11之使用，其中觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病，為糖尿病性神經障礙。
如請求項11之使用，其中觀察到末梢神經障礙或星狀細胞障礙之疾病，為視神經脊髓炎。