JP2018512124A - トランスフォーミング増殖因子β１に高親和性、アビディティおよび特異性で結合する修飾ＩｇＧ抗体 - Google Patents

トランスフォーミング増殖因子β１に高親和性、アビディティおよび特異性で結合する修飾ＩｇＧ抗体 Download PDF

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Abstract

修飾ＩｇＧ抗体は、ＴＧＦβ１に選択的にならびに高親和性およびアビディティで結合し、中和する。修飾ＩｇＧ抗体は、４つのポリペプチド鎖を含み、ポリペプチド鎖の折れ曲がり領域への修飾を含みうる。修飾ＩｇＧ抗体は、メテリムマブと同じＶＨおよびＶＬドメインまたはＣＤＲ領域を含みうる。修飾ＩｇＧ抗体は、治療および診断適用に有用である。

Description

関連出願
本特許出願は、参照によって本明細書にその全体を組み入れる２０１５年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／１２８，１４９号の利益を主張する。
修飾ＩｇＧ抗体は、それぞれ第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を含み、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）に対して高い親和性およびアビディティを示すが、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３には示さない。該修飾ＩｇＧ抗体を含む組成物、およびＴＧＦβ１活性に関与する疾患の処置のための該組成物を使用する方法が提供される。
多くの重大な疾患が、ＴＧＦβ誘導シグナル伝達経路の機能不全と関連している。例えば、ＴＧＦβの組織レベルの増加は、特発性肺線維症および心筋線維症の発症の要因と考えられている。さらに、ＴＧＦβの高い局所組織レベルは、いくつかの種類のがん細胞の維持および発達を可能にする。したがって、ＴＧＦβシグナル伝達を下方制御することは、そのような腫瘍細胞の生存性を減少させうる。
ＴＧＦβアイソフォームは、２つのモノマーがジスルフィド結合を介して共有結合的に連結している、類似のフレームワーク構造を有する約２５ｋＤａのホモ二量体分子である。哺乳動物アイソフォームは、７０〜８２％の配列同一性を共有するが、血管発生および免疫細胞機能の制御における活性は重複していない。３種のＴＧＦβアイソフォーム、つまりＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３（それぞれＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１１３７、Ｐ０８１１２、およびＰ１０６００）がヒトで報告されている。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３は、ＴＧＦβ受容体Ｉ型およびＩＩ型として知られる２つの膜貫通受容体の細胞外ドメインに結合して、細胞シグナル伝達カスケードを引き起こす。ＴＧＦβ２は、ＴＧＦβ受容体Ｉ型およびＩＩ型ならびにＴＧＦβ受容体ＩＩＩ型に結合しうる。
ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合することができる抗体は、臨床適用のために試験されてきた。例えば、Ｇｒｕｔｔｅｒらは、悪性および線維性疾患を処置するための臨床開発においてヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体であるＧＣ１００８（Ｍａｂ；別言して、ＧＣ１００８）を開示した。非特許文献１。ＧＣ１００８は、ヒトＴＧＦβアイソフォームの３つ全てを中和することができるため、「汎特異的」ＴＧＦβ中和抗体である。ＴＧＦβ１を選択的に中和する抗体は、例えば、参照によって本開示に組み入れる特許文献１および特許文献２に開示されている。ＣＡＴ１９２（ＩｇＧ４）としても知られるメテリムマブは、ＴＧＦ−β１を選択的に中和するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。例えば、特許文献１を参照。メテリムマブは、強皮症（Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）としても知られるびまん性全身性皮膚硬化症（ｄｉｆｆｕｓｅ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の処置のために試験されたが、十分な効能は示されなかった。
米国特許第６，４９２，４９７号 米国特許第７，１５１，１６９号
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０５（５１）：２０２５１−５６（２００８）
本開示は、ヒトＴＧＦβ１に選択的に結合して中和することができるＴＧＦβ１結合修飾ＩｇＧ抗体を提供する。開示された修飾ＩｇＧ抗体は、メテリムマブから誘導されたものである。修飾ＩｇＧ抗体のＶＨおよびＶＬドメインは、メテリムマブのＶＨおよびＶＬドメインと同様のＴＧＦβ１結合親和性およびアビディティならびにＴＧＦβ１中和能力を示す。多くの場合に、開示された抗体は、メテリムマブを超える改善された親和性、アビディティおよび中和能力をもたらす。一実施形態では、修飾ＩｇＧ抗体は、それぞれＣＬドメインに連結しているＶＬドメインを含む２つのポリペプチド鎖、それぞれＣＨ１ドメインに連結しているＶＨドメインを含む２つのポリペプチド鎖、ヒンジおよびＦｃ領域を含む。
本発明の修飾ＩｇＧ抗体は、ＴＧＦβ１に結合することができる可変ドメインを含む。別の実施形態では、開示された修飾ＩｇＧ抗体は、表面プラズモン共鳴により測定されるヒトＴＧＦβ２に対する同じ結合タンパク質のＫｄよりも少なくとも約５０％低いＫｄをヒトＴＧＦβ１に対して示す結合タンパク質を含む。
別の実施形態では、本発明は、ＴＧＦβ１に結合することができる可変ドメインを含む単離された結合タンパク質であって、表面プラズモン共鳴により測定されるヒトＴＧＦβ３に対する同じ結合タンパク質のＫｄよりも少なくとも約５０％低いＫｄをヒトＴＧＦβ１に対して示す結合タンパク質を対象とする。
さらなる実施形態では、本発明は、ＴＧＦβ１に結合することができる可変ドメインを含む単離された結合タンパク質であって、表面プラズモン共鳴により測定されるヒトＴＧＦβ２に対する同じ結合タンパク質のＫｄよりも少なくとも約５０％低く、ヒトＴＧＦβ３に対する同じ結合タンパク質のＫｄよりも少なくとも約５０％低いＫｄをヒトＴＧＦβ１に対して示す結合タンパク質を対象とする。
さらなる実施形態では、本発明は、ＴＧＦβ１に結合する単離された結合タンパク質を対象とし、結合タンパク質は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖および第４のポリペプチド鎖を含む。一態様では、第１および第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、式：
（ＶＬドメイン）−（リンカー１）ｍ−（ＣＬドメイン）
を有し、式中、ＶＬドメインは、可変軽鎖相補性決定領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）１（ＬＣＤＲ１）、可変軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および可変軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、ｍは１であり、リンカー１は、ロイシン−グルタミン酸−イソロイシン−リジン−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−アルギニン−トレオニン−バリン−アラニンの配列を有するペプチドを含み、Ｘ、ＹおよびＺは、独立してセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐ、ｑおよびｒのそれぞれは、独立して０から５の整数である。別の態様では、第３および第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、式：
（ＶＨドメイン）−（リンカー２）ｎ−（ＣＨ１ドメイン）−（ヒンジ）ｓ−（Ｆｃ領域）
を有し、式中、ＶＨドメインは、可変重鎖相補性決定領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）１（ＨＣＤＲ１）、可変重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、および可変重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、ｎは０または１であり、ｓは０または１である。別の態様では、リンカー２は、トレオニン−バリン−セリン−Ａｄ−Ｂｅ−Ｃｆ−セリン−アラニン−セリン−トレオニンの配列を有するペプチドを含みえ、Ａ、ＢおよびＣは、独立してセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは、独立して０から５の整数である。
一態様では、リンカー２は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８からなる群から選択される配列を含みうる。
一態様では、ＨＣＤＲ１は、配列番号７のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１５のアミノ酸配列を有しうる。
ＶＨドメインのフレームワーク領域は、可変重鎖生殖系列配列から選択される。ＶＨドメインは、例えば、配列番号１または配列番号２に示されるヒトＶＨドメイン配列または５個までのアミノ酸の修飾を有するそのバリアントから選択される。
開示された結合タンパク質のＶＬドメインは、可変軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、可変軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および可変軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含みうる。一態様では、ＬＣＤＲ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号１４のアミノ酸配列を有しうる。
ＶＬドメインのフレームワーク領域は、可変ラムダまたはカッパ生殖系列配列から選択される。ＶＬドメインは、例えば、配列番号３または配列番号４に示されるヒトＶκドメイン配列または４個までのアミノ酸の修飾を有するそのバリアントから選択される。一実施形態では、二量体のそれぞれのポリペプチドは、配列番号１に示されるＶＨドメインおよび配列番号３に示されるＶκドメインを含んでもよく、これらはそれぞれメテリムマブに存在するＶＨおよびＶＬドメインである。
別の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒンジによりＣＨ１ドメインに接続されている。ヒンジは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４ヒンジ領域由来のアミノ酸配列を含みうる。例えば、ヒンジは、アミノ酸配列ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（配列番号５）または５個までのアミノ酸の修飾を有するそのバリアントを含みうる。一実施形態では、ヒンジの長さは、１〜１５アミノ酸の範囲でありうる。
別の実施形態では、ＴＧＦβ１結合親和性を改善するために、ＣＡＴ１９２Ｆａｂ折れ曲がり領域（ｅｌｂｏｗ ｒｅｇｉｏｎ）に部位特異的変異誘発が実施される。２つの鎖からの機能性結合パラトープを提示するために必要となりうるヒンジのフレキシビリティを増加させるために、１〜５個のアミノ酸（Ｇ、ＧＧ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳおよびＧＧＧＧＳ）を軽鎖折れ曲がり領域に挿入する。Ｅｘｐｉ２９３トランスフェクションからの馴化培地は、Ｏｃｔｅｔにより、良好な発現およびＴＧＦβ１に対する結合の顕著な改善を示す。変異体をＮｉ−ＮＴＡにより精製し、高ＴＧＦβ結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して確認する。ＬＣ折れ曲がり領域に挿入された１〜５個のアミノ酸を有するＣＡＴ１９２変異体は、ＴＧＦβ１に対するｓｃＦｖの高親和性結合を回復している。これらの改変された折れ曲がり部分挿入変異体は、アイソフォーム選択性も維持しており、ＴＧＦβ１特異的アンタゴニストとして役立ちうる。
別の態様では、ＶＨドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を有する可変重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号８のアミノ酸配列を有する可変重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、ならびに配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含みうる。
別の態様では、ＶＬドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１３のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号１４のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含みうる。
別の態様では、リンカー１は、ロイシン−グルタミン酸−イソロイシン−リジン−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−アルギニン−トレオニン−バリン−アラニンの配列を有するペプチドを含みえ、Ｘ、ＹおよびＺは、独立してセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐ、ｑおよびｒのそれぞれは、独立して０から５の整数である。別の態様では、Ｘ、ＹおよびＺのそれぞれは、好ましくはセリンおよびグリシンである。別の態様では、ｐ、ｑおよびｒのそれぞれは１である。別の態様では、ｐは０であり、ｑおよびｒのそれぞれは１である。別の態様では、ｐは１であり、ｑおよびｒのそれぞれは０である。別の態様では、ｐは２であり、ｑおよびｒのそれぞれは１である。別の態様では、ｐは１であり、ｑおよびｒのそれぞれは２である。
一実施形態では、リンカー１は、配列番号２１からそれぞれ誘導される変異形態である、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択される配列を含みうる。別の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、ＣＡＴ１９２ＩｇＧ１の軽鎖（配列番号３８）からそれぞれ誘導される変異形態である、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなる群から選択される配列を含む。
別の態様では、リンカー１およびリンカー２は、それぞれ独立して上記のリンカー１に記載のリンカーである。この態様では、リンカー２は、ロイシン−グルタミン酸−イソロイシン−リジン−Ａｄ−Ｂｅ−Ｃｆ−アルギニン−トレオニン−バリン−アラニンの配列を有するペプチドを含みえ、Ａ、ＢおよびＣは、独立してセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは独立して０から５の整数である。別の態様では、Ａ、ＢおよびＣのそれぞれは、好ましくはセリンおよびグリシンである。別の態様では、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは１である。別の態様では、ｄは０であり、ｅおよびｆのそれぞれは１である。別の態様では、ｄは１であり、ｅおよびｆのそれぞれは０である。別の態様では、ｄは２であり、ｅおよびｆのそれぞれは１である。別の態様では、ｄは１であり、ｅおよびｆのそれぞれは２である。
別の実施形態では、リンカー２は、配列番号２１からそれぞれ誘導される変異形態である、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群より選択される配列を含みうる。別の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、ＣＡＴ１９２ＩｇＧ１の軽鎖（配列番号３８）からそれぞれ誘導される変異形態である、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなる群から選択される配列を含む。
別の実施形態では、開示されたＴＧＦβ１結合ＦａｂまたはＩｇＧ分子は、選択的にＴＧＦβ１に結合するが、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３には有意な程度に結合しない。
別の実施形態では、本明細書に開示された修飾ＩｇＧ抗体をコードするヌクレオチド配列を含みうる単離されたポリヌクレオチドが開示される。単離されたポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、組み換えＤＮＡまたは合成ＤＮＡでありうる。宿主細胞は、単離された核酸を含みうる。宿主細胞は、ヒト細胞、例えばヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞およびそれから誘導された細胞株、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でありうる。修飾ＩｇＧ抗体を作製する方法は、修飾ＩｇＧ抗体を製造するために適切な条件下で宿主細胞を培養することを含んでもよい。修飾ＩｇＧ抗体は、精製されたものでもよい。精製の程度は９０％、９５％、９９％、９９．５％またはそれ以上でありうる。
ある特定の実施形態では、本発明の修飾ＩｇＧ抗体は、組成物の構成要素でありうる。組成物は、医薬組成物でありうる。医薬組成物は、治療有効量の修飾ＩｇＧ抗体を含みうる。組成物はさらに生物学的活性成分、賦形剤または希釈剤の１つまたはそれ以上を含みうる。
さらに、ヒトにおいてＴＧＦβ１活性に直接的または間接的に起因する疾患または状態を処置する方法であって、治療有効量の修飾ＩｇＧ抗体を含む医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。疾患または状態は、線維性疾患、がんまたは免疫媒介性疾患、例えば、びまん性全身性皮膚硬化症、骨リモデリング疾患、腎臓疾患および／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。修飾ＩｇＧ抗体は、線維性疾患、がん、免疫媒介性疾患、例えば、びまん性全身性皮膚硬化症、骨リモデリング疾患、腎臓疾患および／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される疾患または障害の処置のための医薬の製造において使用される。疾患または障害の処置は、ＴＧＦβ１を中和することまたはＴＧＦβ１シグナル伝達を阻害することを含みうる。疾患または障害の処置は、ＴＧＦβ１媒介フィブロネクチン産生、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）産生、上皮細胞増殖、内皮細胞増殖、平滑筋細胞増殖および／または免疫抑制を阻害することを含みうる。疾患または障害の処置は、ナチュラルキラー細胞活性の増加を含みうる。
本明細書で提示する図面は、例証を目的とするものであり、本発明の範囲を限定するために使用されるものではない。
ｓｃＦｖ（ＣＡＴ１９１）が全長ＩｇＧ４（ＣＡＴ１９２）分子に変換されたときに親和性を喪失したことを示す、Ｂｉａｃｏｒｅ ＴＧＦβ１結合アッセイの結果を示す図である。 親和性を取り戻すために改変されたｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＩｇＧ分子および折れ曲がり領域の構造要素を示す図である。 重および軽鎖折れ曲がり領域に追加のアミノ酸を有する精製ＩｇＧバリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を示す図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、還元および非還元条件下の精製ＩｇＧバリアントの純度を示す。 重および軽鎖折れ曲がり領域における追加のアミノ酸を有する精製ＩｇＧバリアントのＢｉａｃｏｒｅ結合アッセイを示す図である。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ結果は、バリアントによるアイソフォーム選択的および高親和性結合を示す。 軽鎖折れ曲がり領域における追加のアミノ酸を有する精製ＩｇＧバリアントのＡ５４９細胞バイオアッセイを示す図である。Ａ５４９アッセイは、様々な抗体構築物によるＴＧＦβ１−刺激ＩＬ−１１産生に対する阻害効果を比較するものであり、折れ曲がり部分改変バリアントが、この細胞ベースの効力アッセイにおいて効力が高いことを示している。 ＣＡＴ１９２Ｆａｂの重および軽鎖の両方の折れ曲がり領域に追加のアミノ酸を挿入したときに高親和性結合が回復（ｒｅｇａｉｎ）されたことを示す、Ｂｉａｃｏｒｅ ＴＧＦβ１結合アッセイを示す図である。 図６−１の続き。 図６−２の続き。 図６−３の続き。 図６−４の続き。 図６−５の続き。 図６−６の続き。 図６−７の続き。 ＣＡＴ１９２Ｆａｂ変異体の熱安定性についての示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）解析の結果を示す図である。 ＣＡＴ１９２ＩｇＧ４変異体の熱安定性についての示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）解析の結果を示す図である。 ＣＡＴ１９２Ｆａｂバリアントについて解明された結晶構造を示す図である。 図９−１の続き。
開示された修飾ＩｇＧ抗体は、ＴＧＦβ１に選択的に高い親和性およびアビディティで結合し、中和する。修飾ＩｇＧ抗体は、メテリムマブと同じＶＨおよびＶＬドメインで構成される。修飾ＩｇＧ抗体は、有利なことに、可変ドメインを他のフォーマットで使用するときよりもＴＧＦβ１中和において大きい効能を示す。
本明細書で使用するとき、第１の要素「および／または」第２の要素は、第１の要素もしくは第２の要素が別々にまたは第１および第２の要素が組み合わせで具体的に開示されていることを意味する。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示していない限り、複数の参照物を含む。
「単離された」ポリヌクレオチド（もしくは核酸）またはタンパク質は、遺伝的な改変技術を使用して、その天然形態から、かけ離れているおよび／または変化している。「精製された」核酸またはタンパク質は、実質的に純粋であり、例えば、少なくとも９０％純粋、または均質形態でありうる。
ヒトＴＧＦβ１に対して「選択的結合」または「選択的に結合する」とは、結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ二量体）が、ヒトＴＧＦβ２またはヒトＴＧＦβ３に対する結合よりも高い親和性でヒトＴＧＦβ１に結合できること、例えば、ＴＧＦβ１に対して、表面プラズモン共鳴により測定されるヒトＴＧＦβ２またはヒトＴＧＦβ３に対する解離定数よりも少なくとも約５０％低い解離定数を有することを意味する。
一実施形態では、本発明の修飾ＩｇＧ抗体の可変ドメインは、参照により本明細書に組み入れる米国特許第６，４９２，４９７号に開示のＣＤＲ（例えば、米国特許第６，４９２，４９７号の配列番号１１〜１９）に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲ領域を下記に列挙する。
Figure 2018512124
驚くべきことに、以下の配列を有するコンセンサスＨＣＤＲ３結合モチーフが明らかにされる。
Figure 2018512124
 ここで、
Ｘ１は、任意のアミノ酸（好ましくは、ＥもしくはＦ）でありうるか、または存在せず、Ｘ２は、任意のアミノ酸（好ましくは、Ｓ、ＤもしくはＰ）でありうるか、または存在せず、
Ｘ３は、任意のアミノ酸（好ましくは、Ｇ、ＰもしくはＡ）でありうるか、または存在せず、
Ｘ４は、任意のアミノ酸（好ましくは、Ｖ、ＱもしくはＳ）でありうるか、または存在せず、
Ｘ５は、任意のアミノ酸（好ましくは、Ｅ、ＹもしくはＰ）でありうるか、または存在せず、
Ｘ６は、任意のアミノ酸（好ましくは、Ｌ、ＳもしくはＤ）でありうるか、または存在しない。
一実施形態では、開示された修飾抗体のＶＨドメインは、配列番号１：ヒトＩｇＧ１ ＶＨドメインクローンＳＬ１５（ＳＱＮ４ ＵＳ６４９２４９７）
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSS
配列番号２：ヒトＩｇＧ１ ＶＨドメインクローンＪＴ１８２（ＳＱＮ１０ ＵＳ６４９２４９７）
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTPASPDWGQGTTVTVSS
配列番号３：ヒトＩｇＧ１ ＶκドメインクローンＳＬ１５Ａ：（ＳＱＮ６ ＵＳ６４９２４９７）
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIK
配列番号４：ヒトＩｇＧ１ ＶκドメインクローンＳＬ１５Ｓ：（ＳＱＮ８ ＵＳ６４９２４９７）
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIK
配列番号５：ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
配列番号６：ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号７の配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号８の配列を有するＨＣＤＲ２、ならびに配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１５からなる群から選択される配列を有するＨＣＤＲ３を含む。ＣＤＲ配列は、１〜４個のフレームワーク領域から、Ｎ末端から順に、ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＣＤＲ２−ＦＷ３−ＣＤＲ３−ＦＷ４のいずれでも分離される。ＶＨドメインのフレームワーク領域は、可変重鎖生殖系列配列から選択される。一実施形態では、ＦＷ領域配列は、同じヒトの可変重鎖生殖系列配列から選択される。ＶＬドメインのフレームワーク領域は、可変ラムダまたはカッパ生殖系列配列、例えば、同じヒトの可変ラムダまたはカッパ生殖系列配列から選択される。現在のところ、約４０の可変重鎖生殖系列配列が当該分野で知られており、同様に約４０の可変カッパ生殖系列配列および約３０の可変ラムダ生殖系列配列、例えば、ＶＨ３、Ｖκ１、ＶＨ１−６９およびＶＨ１−ｅが知られている。
別の実施形態では、複合ＶＨまたはＶＬドメインが、本明細書に開示のＣＤＲ配列を使用して生成される。例えば、ＶＨまたはＶＬドメインの結晶構造は、１つの抗体からＣＤＲ配列を使用し、別の抗体から生殖系列ＦＷ領域を使用して複合ドメインを生成するためのガイダンスとして使用される。さらなる詳細は、参照によって本明細書に組み入れる米国特許出願公開第２００２００９９１７９号ならびにＨｏｍｅｓ ａｎｄ Ｆｏｏｔｅ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｍａｒ １；１５８（５）：２１９２−２０１において見出される。
本発明の修飾ＩｇＧ抗体は、メテリムマブと同じ、それぞれ配列番号１および配列番号３に示される配列を有するＶＨおよびＶＬドメインで構成される。ＶＨドメインは、配列番号２に示される配列を有するＶＨドメインで置き換えてもよく、ＶＬドメインは、配列番号４に示される配列を有するＶＬドメインで置き換えてもよい。これらのＶＨおよびＶＬドメインは、参照によって本明細書に組み入れる米国特許第６，４９２，４９７号（例えば、米国特許第６，４９２，４９７号に記載の配列番号４、６、８および１０）に開示されている。
「可変ドメイン」（ＶＤ）は、免疫グロブリンの超可変結合ドメイン、または当業者に既知のように抗原／リガンド結合に関与する受容体のリガンド結合ドメインを指す。可変ドメインは、通常、免疫グロブリン内の位置または由来により参照され、例えば、免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）、ラクダ科免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（ＶＨＨ）と参照される。
「バリアント」可変ドメインは、参照配列と比較して、アミノ酸の付加、置換および／または欠失を含む。ＶＨまたはＶＬドメインの「バリアント」は、４個までのそのようなアミノ酸修飾を含みうる。例えば、２つのドメインの１つがアミノ酸置換を含みうる一方で、他のドメインは未修飾であり、または両方のドメインがアミノ酸置換を含みうる。アミノ酸残基を付加または欠失させる修飾は、ＶＨまたはＶＬドメインのＮ末端またはＣ末端でなされる。例えば、ＶＨドメインのＮ末端残基が欠失される。
本開示の目的において、用語「の間」「から」「まで」および「少なくとも」は包括的である。例えば、整数「０から５まで」は、０以上、５以下の任意の整数を意味する。
一実施形態では、５個までのアミノ酸置換が、修飾ＩｇＧ抗体を脱免疫化するためになされる。脱免疫化は、例えば、Ｈａｒｄｉｎｇら、（２０１０）、ｍＡｂｓ、２：２５６−２６５に記載の方法にしたがって実施される。
ＶＨおよび／またはＶＬドメインのフレームワーク残基は、例えば、修飾ＩｇＧ抗体の安定性を増加させるおよび／または凝集の傾向を低下させるために置換してもよい。安定性に劣ると、発現された修飾ＩｇＧ抗体が組み換え的に発現されるときに適切にフォールディングされる能力に影響を与え、発現された抗体の一画を非機能的にする可能性がある。また安定性の低い抗体は、潜在的に免疫原性凝集物を形成しやすく、または不十分なアビディティもしくは半減期貯蔵期間を有しうる。修飾ＩｇＧ抗体のＶＨおよび／またはＶＬドメインの安定性を増加させるおよび／または凝集の傾向を低下させると考えられるフレームワークアミノ酸置換は、例えば、ＷＯ２００７／１０９２５４に開示されている。本発明のＶＨおよびＶＬドメインにおける対応残基の置換は、同様に修飾ＩｇＧ抗体の安定性を増加させるおよび／または凝集の傾向を低下させると考えられる。
許容される置換として、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸を、別のヒトＶＨまたはＶＬドメイン生殖系列配列に存在する対応アミノ酸で置き換える置換を含むことが考えられる。これらの生殖系列配列のいずれかに存在するアミノ酸でフレームワークアミノ酸を置換することが許容される。例えば、配列番号１のＶＨドメインの残基は、任意のＶＨ生殖系列配列、例えば、ＤＰ−１０（ＶＨ１−６９）またはＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）由来の生殖系列配列の対応する位置に現れるアミノ酸で置換される。この場合の対応する位置は、当該分野で周知のアライメント技術、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用した、様々な生殖系列配列間の配列アライメントにより決定される。
許容されると考えられる追加の置換は、三共結晶構造（ｔｈｒｅｅ ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の解析により決定される場合その側鎖のほとんどが溶媒に曝されているアミノ酸になされる置換である。残基の溶媒接触性表面積は、当該分野で周知の技術を使用して推定することができる。さらに、可変ドメイン内に埋め込まれたアミノ酸への置換は、アミノ酸の側鎖が隣接残基との立体障害を生じない場合に、より良好に許容されると考えられる。この理由により、埋め込まれたアミノ酸は、一般に、側鎖が同様またはより小さい大きさのアミノ酸で置換される。例えば、埋め込まれたＩｌｅ残基のＬｅｕ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＧｌｙを用いた置換が許容されると考えられる。置換により生じる可能性のある立体障害は、三共結晶構造の解析により予測することができる。許容されると考えられるさらなる置換は、可変ドメイン内の既存の静電相互作用、例えば、双極子−双極子相互作用、誘起双極子相互作用、水素結合、またはイオン結合を維持させる置換である。
可変ドメインの追加のアミノ酸置換としては、抗体またはその抗原結合断片に新たな有用な特性を付与すると考えられるものが挙げられる。例えば、ＶＨおよび／またはＶＬドメインの推定Ｎ−グリコシル化部位は、Ｎ−グリコフォームの形成を予防するまたは減少させるために除去してもよい。アミノ末端残基をＧｌｎ残基に置換してピログルタミル化を生じさせることができ、これにより電荷バリアントの数を減少させることができる。アミノ酸置換は等電点を下げるために使用することができ、これにより、例えばＩｇＧポリペプチド抗体の排泄率を減少させることができる。
可変ドメインの表面残基を、例えばＣｙｓまたはＬｙｓ残基で置換して、共有結合的に修飾、および抗体もしくはその抗原結合断片に有用な特性を付与する分子、例えば、検出可能な標識、毒素、標的化部分もしくはタンパク質に結合させてもよい。例えば、Ｃｙｓ残基は、薬物コンジュゲートを形成するために、細胞毒性薬と結合させることができる。またＣｙｓ残基は、血清半減期を延長させる分子、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または血清アルブミンと結合させることもできる。そのようなアミノ酸修飾は、例えば、Ｂｅｃｋら、（２０１０）、Ｎａｔｕｒｅ、１０：３４５−５２に概説されている。
検出可能な標識としては、放射性標識、例えば、１３１Ｉまたは９９Ｔｃが挙げられ、これらは当該分野で既知の方法を使用して、抗体またはその抗原結合断片に結合させることができる。また標識としては、酵素標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。さらに標識としては、特別な同系検出可能部分、例えば標識アビジンに対する結合を介して検出されるビオチンなどの化学的部分が挙げられる。精製を容易にする他の部分を結合させてもよい。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、周知の組み換え修飾および発現方法を使用してＨｉｓタグ化してもよい。
修飾ＩｇＧ抗体のＶＬドメインは、本明細書でリンカー１と称されるリンカーにより、ＣＬドメインに連結させる。修飾ＩｇＧ抗体のＶＨドメインは、本明細書でリンカー２と称される第２のリンカーにより、ＣＨ１ドメインに場合により連結させる。修飾ＩｇＧ抗体を作製するために適切なリンカーは、当該分野で周知である。例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５：５８７９−５８８３を参照。連結は、例えば、コード核酸をインフレームで融合して、融合タンパク質を適切な宿主細胞で発現することにより、達成することができる。
リンカー１は、ＩｇＧ分子またはその修飾型のＶＬおよびＣＬに接続する、増加したフレキシビリティを有するペプチドを含んでもよい。例えば、ロイシン−グルタミン酸−イソロイシン−リジン−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−アルギニン−トレオニン−バリン−アラニンの配列を有してもよく、Ｘ、ＹおよびＺは、独立してセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐ、ｑおよびｒのそれぞれは、独立して０から５の整数である。Ｘ、ＹおよびＺのそれぞれは、好ましくはセリンおよびグリシンであり、ｐ、ｑおよびｒのそれぞれは１である。別の態様では、ｐは０であり、ｑおよびｒのそれぞれは１である。別の態様では、ｐは１であり、ｑおよびｒのそれぞれは０である。
リンカー２は、トレオニン−バリン−セリン−Ａｄ−Ｂｅ−Ｃｆ−セリン−アラニン−セリン−トレオニンの配列を有するペプチドを含みえ、Ａ、ＢおよびＣは、独立してセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは独立して０から５の整数である。
別の実施形態では、ヒンジは、修飾ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインとＦｃ領域との間に場合により挿入される。一態様では、ヒンジ領域は、Ｆｃ領域のＣＨ１部分に場合により連結させるフレキシブルドメインである。ＩｇＧ分子のヒンジ領域のフレキシビリティは、Ｆａｂアームが広範囲の角度をとることを許容し、空間的に様々な距離で離れたエピトープに結合することを可能にする。別の態様では、適切なヒンジ領域には、例えば、アミノ酸配列ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（配列番号５）を有するヒトＩｇＧ１ヒンジ領域が含まれる。この配列は、例えば、米国特許第８，０４８，４２１号の図４Ｂに開示されているように、ヒトＩｇＧ１上部ヒンジの一部分、中部ヒンジ、およびＣＨ２ドメインのＮ末端部に対応する。
別の実施形態では、修飾ＩｇＧ抗体の適切なＦｃ領域は、２つまたは３つの定常領域を含む。Ｆｃ領域は、配列番号６に示されるヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、または配列番号１７のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに示されるＩｇＧ４のＦｃ領域を含みうる。抗体のＦｃ領域は、血清半減期ならびにエフェクター機能、例えば補体依存性細胞傷害性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＣＰ）などに介在する。
修飾は、修飾ＩｇＧ抗体の様々な特性を改善するために、ヒンジおよびＦｃ領域になされる。一実施形態では、天然ヒトＦｃ領域の１個、２個、３個、４個、５個、または１０個までのアミノ酸が、ヒンジ領域の修飾に加えて、修飾される。例えば、Ｆｃ領域は、修飾ＩｇＧ抗体の血清半減期を延長させるために修飾される。ＩｇＧの半減期は、受容体ＦｃＲｎに対するｐＨ依存性結合に依存する。ＦｃＲｎは、内皮細胞の表面に発現し、ｐＨ依存的な形でＩｇＧに結合して、ＩｇＧを分解から保護する。例えば、ＣＨ２とＣＨ３ドメインとの境界面に位置する変異は、ｉｎ ｖｉｖｏでＦｃＲｎに対する結合親和性およびＩｇＧ１の半減期を延長させることが示された。そのような修飾は、例えば、Ｓｔｒｏｈｌ ＷＲ．、２００９． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０（６）：６８５−９１；およびＶａｃｃａｒｏ Ｃ．ら、２００５． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｅｖｅｌｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３（１０）：１２８３−８に概説されている。
ヒンジおよび／またはＦｃ領域に対する他の修飾は、エフェクター機能を増加または減少させることができる。４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、および補体（Ｃ１ｑ）の第１成分に異なる親和性で結合し、異なるエフェクター機能をもたらす。ＩｇＧのＦｃγＲまたはＣ１ｑに対する結合は、例えば、ＩｇＧヒンジ領域およびＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。これらの残基の単一または複数のアミノ酸置換は、ＩｇＧのＦｃγＲまたはＣ１ｑとの相互作用の調節により、エフェクター機能に影響を与えうる。他の置換が、エフェクター機能に影響を与えることは公知である。これらの修飾は、例えば、Ｓｔｒｏｈｌ（２００９）、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：６８５−９１に概説されている。
ヒンジおよび／またはＦｃ領域の代表的修飾を表１にまとめる。
Figure 2018512124
さらに、組み換えアミノ酸修飾を使用して、発現ポリペプチドの構造的均一性を減少させることができる。代表的な例は、Ｐｅｔｅｒｓら、（２０１２）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２８７（２９）：２４５２５−３３であり、この文献には、ＩｇＧ４ヒンジ領域におけるＣｙｓからＳｅｒへの置換により、ジスルフィド結合の不均一性を減少させ、Ｆａｂドメインの熱安定性を増加させることが開示されている。同様に、Ｚｈａｎｇら、（２０１０）、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、８２：１０９０−９９には、ＩｇＧ２ヒンジ領域を改変し、治療適用においてジスルフィド結合スクランブリングおよび構造異性体の形成を制限することが開示されている。ＣＨ３ドメインへのアミノ酸修飾を使用して、カルボキシ末端Ｌｙｓ残基を削除し、電荷バリアントの数を減少させることもできる。アミノ酸修飾を使用して、組み換え抗体またはその抗原結合断片の薬理学的機能を改善することもできる。例えば、アミノ酸修飾を使用して、補体活性を増加、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合増加もしくはＦｃγＲＩＩＩＢ結合減少により抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強、および／またはＦｃＲｎ結合増加により血清半減期を延長させることができる。そのようなアミノ酸修飾は、例えば、Ｂｅｃｋら、（２０１０）、Ｎａｔｕｒｅ、１０：３４５−５２に概説されている。
核酸および修飾ＩｇＧ抗体を作製する方法
本発明のさらなる態様は、修飾ＩｇＧ抗体をコードする核酸を提供する。単離された核酸は、例えば、合成ＤＮＡ、非天然ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡでありうる。例としては、米国特許第６，４９２，４９７号の配列番号３、５、７および９に示されるＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸が挙げられる。組み換え宿主細胞は、上記構築物の１つまたはそれ以上を含みうる。修飾ＩｇＧ抗体を調製する方法は、修飾ＩｇＧ抗体を製造するための条件下でコード核酸を宿主細胞において発現させ、抗体を回収することを含む。抗体を回収する方法は、抗体の単離および／または精製を含みうる。製造方法は、抗体を、少なくとも１つの追加の成分、例えば薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に配合することを含みうる。
用語「組み換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書で使用するとき、外来性ＤＮＡが導入された細胞を指すことを意図している。そのような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されていると理解されるべきである。ある特定の修飾は、変異または環境的影響のいずれかにより、後の世代でも生じうるため、そのような子孫が実際上親細胞と同一でない場合もあるが、依然として本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。好ましくは、宿主細胞は、動物界の任意の種類から選択される原核および真核細胞を含む。好ましくは、真核細胞としては、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞および動物細胞が挙げられる。最も好ましくは、宿主細胞としては、限定されないが、原核細胞株の大腸菌；哺乳動物細胞株のＣＨＯ、ＨＥＫ２９３およびＣＯＳ：昆虫細胞株のＳｆ９；ならびに真菌細胞のサッカロマイセス・セレビシエが挙げられる。
修飾ＩｇＧ抗体をコードする核酸を含む適切なベクターは、例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および場合に応じた他の配列を含めた適当な制御配列を含む形で選択または構築することができる。ベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、ファージミド、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスから選択される。核酸の操作のための技術および手順、例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入、および遺伝子発現は、当該分野で周知である。
用語「ベクター」は、本明細書で使用するとき、連結されている別の核酸を運ぶことができる核酸分子を指すことを意図している。ベクターの１種は、環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」であり、このループの中に追加のＤＮＡセグメントをライゲートしうる。ベクターの別の１種は、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムにライゲートしうる。ある特定のベクターは、導入された宿主細胞内で自律増殖することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際し、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、操作可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書で「組み換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）として参照される。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用性のある発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形態であるため、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は相互に交換可能に使用される。しかしながら、本発明は、同様の機能を有する他の発現ベクターの形態、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）も含むことを意図している。
そのような核酸の宿主細胞への導入は、当該分野で周知の技術を使用して達成することができる。真核細胞について、適切な技術としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルスを用いた形質導入を挙げることができる。細菌細胞については、適切な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを用いたトランスフェクションを挙げることができる。導入に続き、例えば遺伝子を発現するための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を生じさせるまたは可能にしてもよい。一実施形態では、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム、例えば染色体に組み込まれる。組み込みは、標準技術にしたがって、ゲノムの組み換えを促進する配列を含めることにより促進される。
多種多様な宿主細胞においてポリペプチドをクローニングおよび発現するための系は周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌、酵母、ならびにトランスジェニック植物および動物が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当該分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスメラノーマ細胞、ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ヒト胚性網膜細胞、および多くの他の細胞が挙げられる。大腸菌などの原核細胞における抗体および抗体断片の発現は、当該分野で十分確立されている。概要について、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：５４５−５５１（１９９１）を参照。培養真核細胞における発現も、例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、（２００２）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３：１１７−２３に概説されているように、当業者にとって利用可能である。
別の実施形態では、開示された修飾ＩｇＧ抗体は、天然にまたは選択した発現宿主、例えばＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはＮＳＯ（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）細胞によりグリコシル化され、または、例えば原核細胞での発現により製造する場合はグリコシル化されない。グリコシル化は意図的に変化させてもよく、例えば、得られる修飾ＩｇＧ抗体のＡＤＣＣ活性を増加させるために、フコシル化を抑制してもよい。
抗体またはその抗原結合断片の使用方法
修飾ＩｇＧ抗体は、ヒトまたは動物体の処置または診断方法において使用することができ、例えば、患者を処置するために有効量を投与することを含む、ヒト患者における疾患または障害の処置（予防的処置を含みうる）方法において使用することができる。処置可能な状態としては、ＴＧＦβ１が作用している任意の状態、例えば、線維性疾患、がん、免疫媒介性疾患および創傷治癒、例えば、びまん性全身性硬化症（ｄｉｆｆｕｓｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、骨リモデリング疾患、腎臓疾患および／またはそれらの組み合わせが挙げられる。
ヒトＴＧＦβ１に特異的な抗体は、ＴＧＦβ１糸球体腎炎（Ｂｏｒｄｅｒら、（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：３７１−３７４）、神経瘢痕（ｎｅｕｒａｌ ｓｃａｒｒｉｎｇ）（Ｌｏｇａｎら、（１９９４）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、６：３５５−３６３）、皮膚瘢痕（Ｓｈａｈら、（１９９２）、Ｌａｎｃｅｔ、３３９：２１３−２１４；Ｓｈａｈら、（１９９４）、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０７：１１３７−１１５７；Ｓｈａｈら、（１９９５）、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０８：９８５−１００２）、および肺線維症（Ｇｉｒｉら、（１９９３）、Ｔｈｏｒａｘ、４８：９５９−９６６）の処置について動物モデルで有効であることが示されてきた。さらに、ＴＧＦβ１、２および３に対する抗体は、肺線維症、放射線誘発線維症（米国特許第５，６１６，５６１号）、骨髄線維症、火傷、デュピュイトラン拘縮、胃潰瘍および関節リウマチ（Ｗａｈｌら、（１９９３）、Ｅｘｐ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１７７：２２５−２３０）のモデルに有効であることが示されてきた。
修飾ＩｇＧ抗体は、ＴＧＦβ１活性に直接的または間接的に起因する疾患および状態を処置するために有用である。修飾ＩｇＧ抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでヒトＴＧＦβ１アイソフォームの活性を選択的に阻害しうる。ＴＧＦβ１アイソフォームの活性としては、限定されないが、ＴＧＦβ媒介シグナル伝達、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）沈着、上皮および内皮細胞増殖の阻害、平滑筋増殖の促進、ＩＩＩ型コラーゲン発現の誘導、ＴＧＦ−β、フィブロネクチン、ＶＥＧＦおよびＩＬ−１１発現の誘導、潜在関連ペプチドの結合、腫瘍誘導免疫抑制、血管新生の促進、筋線維芽細胞の活性化、転移の促進、ならびにＮＫ細胞活性の阻害が含まれる。例えば、修飾ＩｇＧ抗体は、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、肝線維症（ＨＦ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、強皮症（ＳＳｃ）、およびマルファン症候群を処置するために有用である。
修飾ＩｇＧ抗体は、疾患および状態、例えば、限定されないが、線維性疾患（糸球体腎炎、神経瘢痕、皮膚瘢痕、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、放射線誘発線維症、肝線維症、骨髄線維症など）、火傷、免疫媒介性疾患、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）、移植拒絶、がん、デュピュイトラン拘縮、および胃潰瘍を処置するために有用である。修飾ＩｇＧ抗体は、腎機能不全、例えば、限定されないが、糖尿病性（Ｉ型およびＩＩ型）腎障害、放射線誘発性腎症、閉塞性腎症、びまん性全身性硬化症、肺線維症、同種移植片拒絶、遺伝性腎臓疾患（例えば、多発性嚢胞腎、海綿腎、馬蹄腎）、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、バージャー病、全身性または糸球体性高血圧、尿細管間質性腎炎、尿細管性アシドーシス、腎結核ならびに腎梗塞の処置、予防および発現リスクの減少のためにも有用である。特に、修飾ＩｇＧ抗体は、レニン−アンジオテンシン−アルドステロン系のアンタゴニスト、例えば、限定されないが、レニン阻害剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、Ａｎｇ ＩＩ受容体アンタゴニスト（「Ａｎｇ ＩＩ受容体ブロッカー」としても知られる）およびアルドステロンアンタゴニストと組み合わせるとき、有用である。例として、そのようなアンタゴニストとの組み合わせで修飾ＩｇＧ抗体を使用する方法が、ＷＯ２００４／０９８６３７に示されている。
また修飾ＩｇＧ抗体は、ＥＣＭの沈着に関連する疾患および状態、例えば、全身性硬化症、術後癒着、ケロイドおよび肥厚性瘢痕、増殖性硝子体網膜症、緑内障排出路手術（ｇｌａｕｃｏｍａ ｄｒａｉｎａｇｅ ｓｕｒｇｅｒｙ）、角膜損傷、白内障、ペイロニー病、成人呼吸促迫症候群、肝硬変、心筋梗塞後瘢痕、血管形成術後再狭窄、くも膜下出血後瘢痕、多発性硬化症、椎弓切除術後線維症、腱および他の修復後の線維症、タトゥー除去による瘢痕、胆汁性肝硬変（硬化性胆管炎を含む）、心膜炎、胸膜炎、気管切開術、穿通性中枢神経系損傷、好酸球性筋痛性症候群、血管再狭窄、静脈閉塞性疾患、膵炎、ならびに乾癬性関節症を処置するために有用である。
さらに修飾ＩｇＧ抗体は、疾患および状態の再上皮化、例えば静脈性潰瘍、虚血性潰瘍（褥瘡）、糖尿病性潰瘍、移植部位、移植ドナー部位、表皮剥脱および火傷、気管支上皮の疾患、例えば、喘息、ＡＲＤＳ、腸上皮の疾患、例えば、細胞毒処置に関連する粘膜炎、食道潰瘍（逆流症）、胃潰瘍、小腸および大腸病変（炎症性腸疾患）の再上皮化を促進するために有用である。
修飾ＩｇＧ抗体は、内皮細胞増殖の促進、例えばアテローム性動脈硬化プラークの安定化、血管吻合術の治癒促進における内皮細胞増殖の促進、または平滑筋細胞増殖の阻害、例えば、動脈疾患、再狭窄および喘息における平滑筋細胞増殖の阻害のために使用してもよい。
修飾ＩｇＧ抗体は、マクロファージ媒介感染に対する免疫応答を増強させるために有用である。また修飾ＩｇＧ抗体は、例えば、腫瘍、ＡＩＤＳまたは肉芽腫性疾患によって引き起こされる免疫抑制を減少させるために有用である。修飾ＩｇＧ抗体は、がんなどの過剰増殖性疾患、例えば、限定されないが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、膵臓がん、結腸直腸がん、皮膚がん、肺がん、子宮頸部がん、および膀胱がん、グリオーマ、中皮腫、ならびに様々な白血病および肉腫、例えばカポジ肉腫の処置に有用であり、そのような腫瘍の再発または転移を処置または予防するために有用である。また修飾ＩｇＧ抗体は、シクロスポリン媒介転移を阻害するために有用である。
がん治療の文脈において、「処置」は、腫瘍増殖の遅延、または腫瘍転移の減少、ならびに患者の平均余命を延長させるためのがんの部分的寛解をもたらす任意の医学的介入を含む。
処置方法は、修飾ＩｇＧ抗体、または修飾ＩｇＧ抗体を含む医薬組成物の投与を含む。修飾ＩｇＧ抗体は、投与される医薬の製造において使用される。例えば、医薬または医薬組成物を作製する方法は、修飾ＩｇＧ抗体を、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することを含む。組成物は、単独でまたは他の処置と組み合わせて、処置される状態に応じて、同時にまたは連続的に投与される。
患者への利益を示すためには、十分な「治療有効量」で投与されることが好ましい。そのような利益は、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を少なくとも改善するものでありうる。投与される実際の量、速度および投与経過は、処置される疾患または状態の性質および重症度に依存する。処置の処方、例えば、投与量の決定などは、前臨床および臨床試験に基づいて判断することができ、その設計は十分に当該分野の技術水準の範囲内である。
正確な用量は、因子の数、例えば、修飾ＩｇＧ抗体が診断のためまたは処置のためであるか、処置される領域の大きさおよび位置、ならびに修飾ＩｇＧ抗体に結合している任意の検出可能な標識または他の分子の性質に依存する。修飾ＩｇＧ抗体の典型的な用量は、例えば、全身投与に対して１００μｇ〜１ｇの範囲とされ、局所適用に対して１μｇ〜１ｍｇの範囲とされる。成人患者の単独処置のための用量は、幼児および乳児のために比例的に調節しうる。処置は、医師の判断で、毎日、１週間に２回、毎週、毎月または他の間隔で繰り返してもよい。処置は周期的であってもよく、投与の間の期間が、約２週間またはそれ以上、好ましくは約３週間またはそれ以上、より好ましくは約４週間またはそれ以上であってもよく、または約１カ月に１回であってもよい。
一実施形態では、患者の体重１ｋｇあたり約０．１、０．３、１、３、１０、１５ｍｇまたは２０ｍｇの開示された抗体の用量レベルが、ヒトにおいて有用および安全でありうる。例えば、ラットおよびマウスにおいて０．５〜５ｍｇ／ｋｇが、急性状況における有効量であった。したがって、長期投与では、２１日間の推定半減期に基づいて、０．３〜１０ｍｇ／ｋｇがヒトに対して投与される。用量は、効能のために十分な量とされ、一方で最適な投与を容易にするために十分に低用量とされる。例えば、５０ｍｇ未満の用量は皮下投与を容易にする。静脈内投与が、重度疾患に対する送達経路として使用されるが、高用量および長期投与間隔が必要となりうる。皮下注射は、製品に対する潜在的な免疫応答を増加させうる。局所性疾患に対する局所投与は、投与製品の量を減少させ、作用部位の濃度を増加させることができ、安全性を向上させることができる。
修飾ＩｇＧ抗体は、注射により、例えば、皮下、静脈内、腔内（例えば、腫瘍切除後）、病巣内、腹腔内または筋肉内に投与してもよい。また修飾ＩｇＧ抗体は、吸入により、または局所的に（例えば、眼内、鼻腔内、直腸、創傷内、皮膚上に）、または経口により送達してもよい。
修飾ＩｇＧ抗体は、通常、修飾ＩｇＧ抗体に加えて少なくとも１つの成分を含みうる医薬組成物の形態で投与される。したがって、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤、または当業者に周知の他の物質を含みうる。そのような物質は、非毒性で、かつ活性成分の効能に干渉しないものであるべきである。そのような物質には、例えば、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗生剤、抗菌剤、等張剤および吸収遅延剤が含まれうる。薬学的に許容される担体の一部の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせである。多くの場合には、等張剤、例えば、糖、マンニトールもしくはソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを、組成物に含めることが好ましい。薬学的に許容される物質のさらなる例は、湿潤剤、または補助物質、例えば乳化剤、保存剤またはバッファーであり、これらは貯蔵期間または効果を増加させる。
担体または他の材料の詳細な性質は、投与経路に依存する。静脈内注射または患部での注射について、活性成分は、発熱物質不含で適切なｐＫ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液および乳酸加リンゲル液などの等張ビヒクルを使用して、適切な溶液を十分に調製することができる。保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤および／または他の添加剤を含めてもよい。
修飾ＩｇＧ抗体は、液体、半固体または固体形態で、例えば、液体溶液（例えば、注射および注入溶液）、分散液、懸濁液、粉末、リポソームおよび坐剤で製剤化しうる。好ましい形態は、意図する投与様式、治療適用、分子の物理化学的性質、および送達経路に依存する。製剤には、賦形剤、または賦形剤の組み合わせ、例えば、糖、アミノ酸および界面活性剤を加えてもよい。液体製剤には、広い範囲の修飾ＩｇＧ抗体濃度およびｐＨを含めうる。固体製剤は、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、または超臨界流体技術による乾燥により製造しうる。
治療組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の秩序ある構造で製剤化することができる。滅菌注射液は、適切な溶媒中に、修飾ＩｇＧ抗体を、上記に列挙した成分の１種または組み合わせと共に組み入れて、その後、滅菌ろ過することにより、調製することができる。一般に分散液は、基礎分散媒体および上記に列挙した中の他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み入れることにより調製される。滅菌注射溶液調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前述の滅菌ろ過溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を生じさせる、真空乾燥法および凍結乾燥法である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することにより、分散液の粒径を維持することにより、または界面活性剤を使用することにより、維持することができる。注射性組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを、組成物に含めることによりもたらされる。
ある特定の実施形態では、活性化合物は、急速な放出に対して修飾ＩｇＧ抗体を保護する担体、例えば、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系などの徐放製剤を用いて調製してもよい。生分解性、生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などを使用してもよい。そのような製剤の調製のための多くの方法が特許となっており、または当業者に一般に知られている。
修飾ＩｇＧ抗体を使用する方法には、ＴＧＦβに対する結合を生じさせることまたは可能にすることを含めてもよい。そのような結合は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、修飾ＩｇＧ抗体を患者に投与した後に生じてもよく、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降、親和性クロマトグラフィーまたは細胞ベースアッセイにおいて生じてもよく、またはｅｘ ｖｉｖｏで、治療方法に基づき、例えば、細胞もしくは体液をｅｘ ｖｉｖｏで修飾ＩｇＧ抗体と接触させ、次いで患者に投与する方法に基づいて生じてもよい。
修飾ＩｇＧ抗体を含むキットが提供される。修飾ＩｇＧ抗体は、試料中の反応性を決定するために標識してもよい。キットは、例えば、診断解析で利用してもよい。キットには、成分を使用するための指示書を含めてもよい。そのような方法の実施を援助するまたは可能にする付属的材料を、キット内に含めてもよい。
試料中の修飾ＩｇＧ抗体の反応性は、任意の適切な手段、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定しうる。放射活性標識抗原は、未標識抗原（試験試料）と混合させてもよく、修飾ＩｇＧ抗体に結合させてもよい。結合抗原を未結合抗原から物理的に分離し、修飾ＩｇＧ抗体に結合した放射活性抗原の量を決定する。競合的結合アッセイも、抗原またはレポーター分子に連結したアナログを使用して、非放射活性抗原で使用される。レポーター分子は、蛍光色素、リン光体または色素でありうる。適切な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッドが挙げられる。適切な発色性色素としては、ジアミノベンジジンが挙げられる。
他のレポーターとしては、巨大分子コロイド粒子または有色、磁性もしくは常磁性のラテックスビーズなどの粒状物質が挙げられ、また視覚的に観察される、電子工学的に検出されるまたは他の方法で記録される検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に生じさせることができる生物学的または化学的に活性な物質が挙げられる。これらの分子は、例えば、色を発色もしくは変化させる反応を触媒するまたは電気的特性の変化を生じさせる酵素でありうる。それらは分子的に励起性でありえ、エネルギー状態間の電子遷移により、特徴的なスペクトル吸収または発光をもたらしうる。それらはバイオセンサと組み合わせて使用される化学的実体を含んでもよい。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出系を使用してもよい。抗体−レポーターコンジュゲートにより生成されたシグナルを使用して、試料中の関連する抗体結合の定量可能な絶対的または相対的データを誘導してもよい。
また本発明は、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための修飾ＩｇＧ抗体の使用を提供する。修飾ＩｇＧ抗体は、例えば、結合に際して物理的または光学的変化が生じるようにレポーター分子に連結させてもよい。レポーター分子は、検出可能、好ましくは測定可能なシグナルを、直接的にまたは間接的に生成しうる。レポーター分子は、共有結合により、例えばペプチド結合を介して、または非共有結合により、直接的または間接的に連結させることができる。修飾ＩｇＧ抗体とタンパク質レポーターは、ペプチド結合により、および融合タンパク質として組み換え的に発現させることにより、連結させうる。
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の実験的例証を含む本開示に照らして、当業者に明らかとなる。
軽鎖折れ曲がり領域に追加のアミノ酸を有する修飾ＩｇＧ４抗体
ＣＡＴ１９２は、ＴＧＦβ１特異的抗体であるが、その結合親和性のほとんどは、ｓｃＦｖから全長ＩｇＧ４に変換されたときに失われた（図１）。抗体サブタイプおよびＦｃフォーマットだけではこの現象は説明されず、なぜならＩｇＧ１およびＩｇＧ４ Ｆａｂの両方がＴＧＦβ１に対して非常に低い親和性を示したためである。ｓｃＦｖのＴＧＦβ１に対する強い結合は、重および軽鎖Ｆｖドメインに接続している長い（ＧＧＧＧＳ）３リンカーに起因する高いフレキシビリティによるものでありえた。この高いフレキシビリティは、ｓｃＦｖがＦａｂまたはＩｇＧ型に変換される間に失われた可能性があった。ＣＡＴ１９２の低い親和性は、非常に遅い結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）ならびに非常に遅い解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）により特徴づけられた。遅い結合速度および解離速度から、ＣＡＴ１９２とＴＧＦβ１との間の結合に必要となりうる潜在的な構造変化が、ＣＡＴ１９２（ＩｇＧ４）の好ましくないアミノ酸により制限されたことが示唆された。抗体ＦｖドメインをＣＨ１ドメインに連結する軽鎖折れ曲がり領域に、追加のアミノ酸を加えることによって、ｓｃＦｖのＦａｂまたはＩｇＧ型のフレキシビリティ／親和性を増加させるように設計した実験を本明細書に記載した。より詳細には、下記表２に示すように、野生型軽鎖折れ曲がり領域に１個のグリシン（Ｇ）、２個のグリシン（ＧＧ）、２個のグリシンおよび１個のセリン（ＧＧＳ）、３個のグリシンおよび１個のセリン（ＧＧＧＳ）、ならびに４個のグリシンおよび１個のセリン（ＧＧＧＧＳ）配列を加えて変異体を設計した。付加したアミノ酸には下線を付した。
Figure 2018512124
軽鎖アミノ酸番号２５は、ｓｃＦｖにおいてＡｌａであるが、ＩｇＧ４に変換したとき、Ｓｅｒに変化させた。したがって、ＡｌａからＳｅｒへの変化がｓｃＦｖのＴＧＦβ１に対する親和性に影響を与えるかを試験するために、追加的にＡ２５Ｓ変異体を対照として含めた。野生型ＣＡＴ１９２および変異体のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、以下に示した。
配列番号３８：下線を付した折れ曲がり領域を有するＣＡＴ１９２ＩｇＧ１野生型ＬＣのアミノ酸配列
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号２７：ＣＡＴ１９２（ＩｇＧ１）軽鎖のコード配列
atgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggccacagccaccggcgtgcacagcGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCGGCGACGACCTGGGATGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCCATCCTGCTGATCTACGGCACCAGCACACTGCAGAGCGGCGTGCCCTCCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAACAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAAGACAGCAACTACCCCCTGACCTTCGGCGGAGGCACCCGGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
ＣＡＴ１９２ＬＣ＋Ｇ（ＬＥＩＫＧＲＴＶＡ）
フォワード 5'-ggctggaaatcaagggccgtacggtggccgc-3'（配列番号２８）
相補体 5'-gcggccaccgtacggcccttgatttccagcc-3'（配列番号２９）
CAT192LC+GG. (LEIKGGRTVA)
フォワード 5'-ggctggaaatcaagggcggccgtacggtggccgc-3'（配列番号３０）
相補体 5'-gcggccaccgtacggccgcccttgatttccagcc-3'（配列番号３１）
CAT192LC+GGS. (LEIKGGSRTVA)
フォワード 5'-ggctggaaatcaagggcggcagccgtacggtggccgc-3'（配列番号３２）
相補体 5'-gcggccaccgtacggctgccgcccttgatttccagcc-3'（配列番号３３）
CAT192LC+GGGS. (LEIKGGGSRTVA)
フォワード 5'-ggctggaaatcaagggcggcggcagccgtacggtggccgc-3'（配列番号３４）
相補体 5'-gcggccaccgtacggctgccgccgcccttgatttccagcc-3'（配列番号３５）
CAT192LC+GGGGS. (LEIKGGGGSRTVA)
フォワード 5'-ggctggaaatcaagggcggcggcggcagccgtacggtggccgc-3'（配列番号３６）
相補体 5'-gcggccaccgtacggctgccgccgccgcccttgatttccagcc-3'（配列番号３７）
５つのＣＡＴ１９２ＬＣ変異体、ならびにＡ２５Ｓ変異体およびＷＴ ＬＣを、２４ウェルプレートフォーマット（４×１ｍＬ）においてＥｘｐｉ２９３Ｆトランスフェクション系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｈｉｓタグ化ＣＡＴ１９２ＨＣ Ｆａｂと共発現した。馴化培地（ＣＭ）を、トランスフェクション後４日で回収し、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４機器を使用して、単一アッセイの発現レベルおよびＴＧＦβ１結合を計算した。精製ＣＡＴ１９２Ｆａｂ−Ｈｉｓを標準曲線として使用した（１００から３．１２５μｇ／ｍＬへ２倍希釈）。ＣＡＴ１９２Ｆａｂ ＣＭを、希釈剤で１：１０希釈し、ＧＣ１００８ Ｆａｂ ＣＭを陽性対照として含めた。抗Ｆａｂ−ＣＨ１バイオセンサへの結合を、１０００ｒｐｍおよび３０℃のプレート温度で２分間測定し、定量および捕捉のために測定した。次いで、結合評価のために２００ｎＭのＴＧＦβ１を含有するウェルにセンサを移した。
ＴＧＦβ１結合結果は、それぞれの追加のアミノ酸挿入が、ＷＴ対応物と比較して、ＣＡＴ１９２Ｆａｂの結合親和性を増加させたことを示した。少なくとも２つのグリシンの付加は、ＧＣ１００８Ｆａｂ抗体のレベルと匹敵するレベルに結合親和性を増加させた。Ａ２５Ｓ変異体は、ＷＴおよび精製組み換えＣＡＴ１９２Ｆａｂの親和性と同様の低いＴＧＦβ１結合親和性を示した。センサに捕捉されたＦａｂの量が、濃度に対して正規化されても、バッファーについて減算されてもいなかったので、結果は定性的であった。
次いで、表面プラズモン共鳴を使用してＴＧＦβ１に対する親和性を正確に評価し、アイソフォーム−特異性を確認するために、ＣＡＴ１９２ＬＣ Ｆａｂバリアントを、Ｒａｉｎｉｎ製のＰｕｒｅＳｐｅｅｄ ＩＭＡＣチップを使用して精製した。それぞれの試料について２つの１ｍＬ精製チップ（２０μＬ樹脂）を使用するために、それぞれの試料の馴化培地を４つのウェルに分割し（それぞれ約８００μＬ）、それぞれに約２００μＬの平衡化バッファーを加えた。イミダゾールを除去する溶出工程の後、試料を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルターを使用して、Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ ｐＨ７．２にバッファー交換した。濃度をＡ２８０により測定し、３．５μｇを非還元４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色により純度を検査した。全体の収率は、ＣＭ中の出発物質に対して１２〜４２％の範囲であった。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して、精製ＣＡＴ１９２ＷＴおよびＬＣ変異体ＦａｂのＴＧＦβ結合親和性を評価した。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３（１２４、１２５および１１２ＲＵ）を、アミン化学反応を使用して、ＣＭ５シリーズＳチップに固定化した。低親和性および高親和性の結合物質両方を考慮して広範囲の濃度を使用した。Ｆａｂを、ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー中で２７０から０．３７ｎＭへ３倍希釈した。それぞれの試料は２連で注入した。ＫＤは、最高濃度が３０ｎＭの典型的な濃度範囲を使用して測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ結合結果は、上述のＯｃｔｅｔの結果と一致し、つまりＣＡＴ１９２ＬＣの折れ曲がり領域におけるアミノ酸の付加は、ＴＧＦβ１に対する結合親和性を改善した。追加の残基の挿入ごとに段階的な改善が示された（図６）。ＣＡＴ１９２Ｆａｂ ＬＣ変異体のいずれも、同じ条件下でＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３に結合せず、変異体がアイソフォーム選択性を保持しつつ、ＴＧＦβ１結合性を顕著に増加させていることが示された。それゆえ、折れ曲がり部分改変変異体は、アイソフォーム選択性およびＴＧＦβ１に対する高親和結合性を有する一連の新規バリアントであった。
Figure 2018512124
重鎖折れ曲がり領域に追加のアミノ酸を有する修飾ＩｇＧ４抗体
高親和性およびＴＧＦβ１選択的結合を示した折れ曲がり領域における軽鎖変異体に続く探求として、抗体のＦｖドメインをＣＨ１ドメインに連結させる重鎖折れ曲がり領域に追加のアミノ酸を挿入することによって、フレキシビリティ／親和性を増加させるように変異体を設計した。より詳細には、下記表４に示すように、野生型重鎖折れ曲がり領域に１個のグリシン（Ｇ）、２個のグリシン（ＧＧ）、ならびに４個のグリシンおよび１個のセリン（ＧＧＧＧＳ）配列を加えて変異体を設計した。付加したアミノ酸には下線を付した。
Figure 2018512124
ＨＣ＋ＧＧ−ＳＴは、ＰＣＲ変異誘発プロセスからは予測されなかった副生成物であり、設計したように折れ曲がり部分に２つのグリシンが加わっていたが、ＤＮＡ配列決定で確認されたように、折れ曲がり領域末端で２つのアミノ酸が欠失していた。この変異体は、重鎖折れ曲がり領域のアミノ酸の数は同じであるが、折れ曲がり部分リンカーにおけるアミノ酸組成が異なっていた。この変異体を、特性決定および親和性比較のための対照として含めた。
ＣＡＴ１９２ ＨＣ＋Ｇプライマー
フォワード 5'-ccaccgtgacagtgtctggcagcgccagc-3'
（配列番号５０）
相補体 5'-gctggcgctgccagacactgtcacggtgg-3'
（配列番号５１）
ＣＡＴ１９２ ＨＣ＋ＧＧ−ＳＴプライマー
フォワード 5'-ccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagc-3'
（配列番号５２）
相補体 5'-gctggcgctgccgccagacactgtcacggtgg-3'
（配列番号５３）
ＣＡＴ１９２ ＨＣ＋ＧＧＧＧＳプライマー
フォワード 5'-caccaccgtgacagtgtctggcggcggcggcagcagcgccagca-3'
（配列番号５４）
相補体 5'-tgctggcgctgctgccgccgccgccagacactgtcacggtggtg-3'
（配列番号５５）
ＣＡＴ１９２ ＨＣ＋ＧＧプライマー
フォワード 5'- caccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagca -3'
（配列番号５２９）
相補体 5'- tgctggcgctgccgccagacactgtcacggtggtg -3'
（６０）
これらのＣＡＴ１９２ＨＣ変異体を、２４ウェルプレートフォーマット（４×１ｍＬ）においてＥｘｐｉ２９３Ｆトランスフェクション系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＡＴ１９２ＬＣ Ｆａｂと共発現した。馴化培地をトランスフェクション後４日で回収し、次いでＲａｉｎｉｎ製のＰｕｒｅＳｐｅｅｄ ＩＭＡＣチップを使用して精製し、ＴＧＦβ１に対する親和性を正確に評価した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して、実施例１に記載されるように、精製ＣＡＴ１９２変異体ＦａｂのＴＧＦβ結合親和性を評価した。図６に示す結果から、軽鎖折れ曲がり領域の変異体と同様に、ＣＡＴ１９２重鎖の折れ曲がり領域におけるアミノ酸の付加も、ＴＧＦβ１に対する結合親和性を改善させたことが示唆された。例えば、ＣＡＴ１９２ ＨＣ＋ＧＧＧＧＳ変異体は、ＴＧＦβ１に対する非常に高親和性の結合を示した。
重および軽鎖組み合わせ変異体
組み合わせＣＡＴ１９２変異体を、２４ウェルプレートフォーマット（４×１ｍＬ）においてＥｘｐｉ２９３Ｆトランスフェクション系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、重および軽鎖の両方の折れ曲がり領域に変異体を有するコトランスフェクションＤＮＡにより作製した。様々な組み合わせを表５に列挙した。
Figure 2018512124
馴化培地をトランスフェクション後４日で回収し、次いで、ＴＧＦβ１に対する親和性を正確に評価するために、Ｒａｉｎｉｎ製のＰｕｒｅＳｐｅｅｄ ＩＭＡＣチップを使用して精製した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して、実施例１に記載されるように、精製ＣＡＴ１９２変異体ＦａｂのＴＧＦβ結合親和性を評価した。図３に示される結果から、組み合わせ変異体が、ＣＡＴ１９２のＴＧＦβ１に対する高親和性結合を取り戻したことが示唆された。これらの変異体Ｆａｂによる結合親和性（ＫＤ）を表６にまとめた。
Figure 2018512124
重鎖および軽鎖の両方の折れ曲がり領域が改変されるとき、必要なアミノ酸挿入は、より少なくなった。例えば、「ＨＣ＋Ｇ」および「ＬＣ＋Ｇ」変異体の組み合わせは、ＴＧＦβ１に対して非常に高親和性の結合を示した。
全長ＩｇＧ４バリアントの親和性および効力の特性決定
ＩｇＧ４フォーマットの変異体を生成し、Ｂｉａｃｏｒｅによる回復した親和性が、Ａ５４９細胞ベースの効力アッセイにおいて確認できるかどうかを測定した。ＣＡＴ１９２ＨＣ Ｆａｂを重鎖Ｓ２２８Ｐ ＩｇＧ４主鎖にクローニングしてハーフ抗体の形成を最小化し、次いでＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にＣＡＴ１９２ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ ＨＣおよびＬＣ挿入変異体をコトランスフェクトした。
バイオアッセイのために十分な材料を得るために、３０ｍＬのトランスフェクションを全長ＣＡＴ１９２ＨＣおよびＬＣ挿入変異体に実施した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に、３０μｇのＤＮＡ（１５μｇ ＬＣ＋１５μｇ ＨＣ）をトランスフェクトした。馴化培地を、トランスフェクション後４日で回収し、ＯｃｔｅｔによりプロテインＡバイオセンサを使用して解析し、約２００μｇ／ｍＬの発現を得た。次いでＣＭを、ぜん動ポンプを備えたＨｉ−ＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラムを使用して精製した。ＣＭを０．５ｍＬ／分で各カラムに負荷し、２５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭ ＮａＰｉ、２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．１（２ｍＬ／分）で洗浄し、２５ＣＶの１０ｍＭコハク酸ナトリウムｐＨ６．０（２ｍＬ／分）で洗浄し、３×２ｍＬの画分を、１０ｍＭコハク酸ナトリウムｐＨ３．７５を用いて１ｍＬ／分で溶出した（＃１、＃２、＃３と標識）。プロテインＡ溶出物を０．２Ｍ ＮａＯＨで中和し、０．２Ｍ ＮａＣｌを加え、４０ｍＭ ＮａＣｌの最終濃度とした。次いで試料を濃縮し、５０ｍＭ ＮａＰｉ、２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．１にバッファー交換した。次いでＣＡＴ１９２ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ ＨＣおよびＬＣ挿入変異体プロテインＡ溶出物を４〜２０％Ｔｒｉｓグリシンゲル上で泳動させ（図３）、ＴＧＦβ１／ＴＧＦβ２／ＴＧＦβ３結合についてＢｉａｃｏｒｅにより比較した（図４）。Ｂｉａｃｏｒｅ結果から、精製ＣＡＴ１９２ＩｇＧ４変異体が、実際にＴＧＦβ１結合を回復したことが示された。変異体のいずれもＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３に結合しなかった（図４）。
Figure 2018512124
次いで、ＣＡＴ１９２ＩｇＧ Ｓ２２８Ｐ ＬＣ挿入変異体を、Ａ５４９細胞効力アッセイ（Ｒａｐｏｚａら、２００６、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、３１６巻、１８頁）で特性決定した。結果（図５）は、ＴＧＦβ１刺激ＩＬ−１１産生に対するＣＡＴ１９２挿入変異体による阻害効果で示されるように、ＣＡＴ１９２挿入変異体が、ＴＧＦβ１活性を中和することを示した。軽鎖折れ曲がり部分に付加された２つのグリシンは、Ｂｉａｃｏｒｅ結合実験で観察されたように、ＣＡＴ１９２が効能を回復するために十分であるようであった。
熱安定性試験
示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）を折れ曲がり部分挿入変異体に実施して、重鎖および軽鎖のヒンジ領域の追加のアミノ酸がＣＡＴ１９２Ｆａｂ挿入変異体の熱安定性にどのように影響を与えるかを測定した。ＤＳＦの基本的原理は、温度が上昇するとき、アンフォールディングするタンパク質の疎水性領域に蛍光色素が結合して、シグナルの増加をもたらすものである。この方法は、限定された試料で実施することができ、高スループット様式で試料の相対的安定性を得るために使用することができる。Ｓｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅを蛍光色素として使用した。使用条件は、０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質、１：４０００の色素比率、および全体積１０μＬであった。結果は、ＣＡＴ１９２Ｆａｂ挿入変異体の相対的安定性が、折れ曲がり部分におけるグリシンの付加によってわずかに減少し、最も長い付加を有する変異体が最も安定性が低いことを示した（図７）。Ｔｍ値を図７にまとめた。一部の長い鎖の変異体のＴｍ値は、そのアンフォールディングパターンのため、計算されなかった。相対的安定性のわずかな減少は、一部の軽鎖変異体を、ＦａｂからＩｇＧ４フォーマットに変換させたときにも観察された（図８）。
ＣＡＴ１９２Ｆａｂバリアントの結晶構造決定
ＣＡＴ１９２Ｆａｂ ＷＴおよび３つのバリアントのタンパク質構造を、可変ドメインのフレキシビリティの増加にともなって高親和性がどのように取り戻されるのかについて構造的な説明を提供するために解明した。
１５０ｍＬのトランスフェクションを、ＣＡＴ１９２ＨＣおよびＬＣ Ｆａｂ挿入変異体に実施して、構造試験のための十分な材料を得た。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に、１５０μｇのＤＮＡ（７５μｇ ＬＣ＋７５μｇ ＨＣ）をトランスフェクトした。馴化培地を、トランスフェクション後５日で回収した。次いでＣＭを、２０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールを使用して平衡化したＨｉｓ−Ｔｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラムを使用して精製した。Ｆａｂタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００）を使用して、２０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールで溶出し、すぐに２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌにバッファー交換した。次いでＦａｂを２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、スパース行列スクリーンを室温および４℃の両方で設定した。構造決定に使用した全ての結晶は、４℃で１：１タンパク質対結晶化条件比率（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）で取得した。野生型タンパク質および低結合親和性の変異体を、Ｐ２１空間群で、同様のＰＥＧ条件（ＷＴ：１２％ ＰＥＧ ８Ｋ／０．１Ｍカコジル酸ナトリウムｐＨ６／０．２Ｍ ＭｇＣｌ２、ＣＡＴ１９２ＷＴ ＨＣ／ＬＣ＋Ｇ：１２％ＰＥＧ ２０Ｋ／０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５、ＣＡＴ１９２ＨＣ＋ＧＧＧＧＳ／ＷＴ ＬＣ：１２％ＰＥＧ ２０Ｋ、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ５．７５）で結晶化した。高い結合親和性の変異体（ＨＣ＋ＧＧ／ＬＣ＋ＧＧ）を、２Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６（空間群：Ｃ２）中で結晶化した。
低／中程度結合親和性のバリアントと野生型Ｆａｂの構造（ＨＣ＋ＷＴ／ＬＣ＋ＧおよびＨＣ＋ＧＧＧＧＳ／ＬＣ＋ＷＴ）は、ほぼ同一であった（図９、パートＡ）。ＷＴ ＨＣ／ＬＣ＋ＧおよびＨＣ＋ＧＧＧＧＳ／ＷＴ ＬＣは、ＷＴ ＣＡＴ１９２と、それぞれ０．５１６Åおよび０．５３８ÅのＲ．Ｍ．Ｓ．Ｄで重ね合わされた。これらの構造のそれぞれにおいて、ＣＤＲＨ３領域に関する電子密度は、非対称ユニットの全ての分子で欠けていた。このことは、このＣＤＲが、低／中程度結合親和性変異体に対して高度にフレキシブルであったことを示唆していた。対照的に、高結合親和性変異体（ＨＣ＋ＧＧ／ＬＣ＋ＧＧ）は、他のＣＡＴ１９２Ｆａｂ構造（図９、パートＡ）と比較して、可変ドメインの大きなコンホメーション変化を示した。４つ全てのＦａｂ間の定常ドメインは良好に重ね合わせられるが、ＣＡＴ１９２ＨＣ＋ＧＧ／ＬＣ＋ＧＧの可変ドメインは、他の構造と比較して、有意にシフトしていた（図９、パートＢ）。さらにＨＣ ＣＤＲ３領域は、高結合親和性構造で完全に構築されており、ＬＣ ＣＤＲ３との相互作用（＜３Å）により安定化されていた。これらの４つの構造は、Ｂｉａｃｏｒｅの結果と一致し、ＣＡＴ１９２の高結合親和性を取り戻すには、大きなコンホメーション再編成が必要であることを示唆した。
〔配列表〕
配列番号１：ヒトＩｇＧ１ ＶＨドメインクローンＳＬ１５（ＳＱＮ４ ＵＳ６４９２４９７）
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSS
配列番号２：ヒトＩｇＧ１ ＶＨドメインクローンＪＴ１８２（ＳＱＮ１０ ＵＳ６４９２４９７）
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTPASPDWGQGTTVTVSS
配列番号３：ヒトＩｇＧ１ ＶκドメインクローンＳＬ１５Ａ：（ＳＱＮ６ ＵＳ６４９２４９７）
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIK
配列番号４：ヒトＩｇＧ１ ＶκドメインクローンＳＬ１５Ｓ：（ＳＱＮ８ ＵＳ６４９２４９７）
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIK
配列番号５：ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
配列番号６：ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号７
SYGMH
配列番号８
VISYDGSIKYYADSVKG
配列番号９
TGEYSGYDTSGVEL
配列番号１０
TGEYSGYDTDPQYS
配列番号１１
TGFYSGYDTPASPD
配列番号１２
RASQGIGDDLG
配列番号１３
GTSTLQS
配列番号１４
LQDSNYPLT
配列番号１５
TGX1YSGYDTX2X3X4X5X6
配列番号１６：ＣＡＴ１９２（ＩｇＧ４）軽鎖
EWLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１７：ＣＡＴ１９２（ＩｇＧ４）重鎖
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号１８：ＣＡＴ１９２（ＩｇＧ４）Ｓ２２８Ｐ重鎖
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号１９：ＣＡＴ１９１（ｓｃＦｖ）
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIK
配列番号２０：ヒトＴＧＦβ１
ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
配列番号２１：ＣＡＴ１９２ＩｇＧ４野生型ＬＣ折れ曲がり領域
LEIKRTVA
配列番号２２：追加のアミノ酸１個が挿入された変異体ＬＣ折れ曲がり領域
LEIKGRTVA
配列番号２３：追加のアミノ酸２個が挿入された変異体ＬＣ折れ曲がり領域
LEIKGGRTVA
配列番号２４：追加のアミノ酸３個が挿入された変異体ＬＣ折れ曲がり領域
LEIKGGSRTVA
配列番号２５：追加のアミノ酸４個が挿入された変異体ＬＣ折れ曲がり領域
LEIKGGGSRTVA
配列番号２６：追加のアミノ酸５個が挿入された変異体ＬＣ折れ曲がり領域
LEIKGGGGSRTVA
配列番号２７：ＣＡＴ１９２（ＩｇＧ１）軽鎖のコード配列
atgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggccacagccaccggcgtgcacagcGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCGGCGACGACCTGGGATGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCCATCCTGCTGATCTACGGCACCAGCACACTGCAGAGCGGCGTGCCCTCCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAACAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAAGACAGCAACTACCCCCTGACCTTCGGCGGAGGCACCCGGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号２８：CAT192LC+G (LEIKGRTVA)、フォワード
5'-ggctggaaatcaagggccgtacggtggccgc-3'
配列番号２９：CAT192LC+G (LEIKGRTVA)、相補体
5'-gcggccaccgtacggcccttgatttccagcc-3'
配列番号３０：CAT192LC+GG (LEIKGGRTVA)、フォワード
5'-ggctggaaatcaagggcggccgtacggtggccgc-3'
配列番号３１：CAT192LC+GG (LEIKGGRTVA)、相補体
5'-gcggccaccgtacggccgcccttgatttccagcc-3'
配列番号３２：CAT192LC+GGS (LEIKGGSRTVA)、フォワード
5'-ggctggaaatcaagggcggcagccgtacggtggccgc-3'
配列番号３３：CAT192LC+GGS (LEIKGGSRTVA)、相補体
5'-gcggccaccgtacggctgccgcccttgatttccagcc-3'
配列番号３４：CAT192LC+GGGS (LEIKGGGSRTVA)、フォワード
5'-ggctggaaatcaagggcggcggcagccgtacggtggccgc-3'
配列番号３５：CAT192LC+GGGS (LEIKGGGSRTVA)、相補体
5'-gcggccaccgtacggctgccgccgcccttgatttccagcc-3'
配列番号３６：CAT192LC+GGGGS (LEIKGGGGSRTVA)、フォワード
5'-ggctggaaatcaagggcggcggcggcagccgtacggtggccgc-3'
配列番号３７：CAT192LC+GGGGS (LEIKGGGGSRTVA)、相補体
5'-gcggccaccgtacggctgccgccgccgcccttgatttccagcc-3'
配列番号３８：ＣＡＴ１９２ ＩｇＧ１野生型ＬＣ
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号３９：追加のアミノ酸１個が挿入された変異体軽鎖
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIKGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号４０：追加のアミノ酸２個が挿入された変異体軽鎖
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIKGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号４１：追加のアミノ酸３個が挿入された変異体軽鎖
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIKGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号４２：追加のアミノ酸４個が挿入された変異体軽鎖
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIKGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号４３：追加のアミノ酸５個が挿入された変異体軽鎖
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIKGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号４４：ＣＡＴ１９２ ＩｇＧ４野生型ＨＣ折れ曲がり領域
TVTVSSAS
配列番号４５：追加のアミノ酸１個が挿入された変異体ＨＣ折れ曲がり領域
TVTVSGSAS
配列番号４６：追加のアミノ酸２個が挿入された変異体ＨＣ折れ曲がり領域
TVTVSGGSAS
配列番号４７：追加のアミノ酸２個が挿入され、アミノ酸１個が欠失した変異体ＨＣ折れ曲がり領域
TVTVSGGSA
配列番号４８：追加のアミノ酸５個が挿入された変異体ＨＣ折れ曲がり領域
TVTVSGGGGSSAS
配列番号４９：ＣＡＴ１９２ ＩｇＧ４野生型ＨＣのコード配列
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGGAATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGAACTGGAATGGGTGGCCGTGATCAGCTACGACGGCAGCATCAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCTAGAACCGGCGAGTACAGCGGCTACGACACCGACCCTCAGTACTCTTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCTAGCGCCAGCACCAAGGGCCCAAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCAGCAGAAGCACCAGCGAATCTACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCATACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGCATCACCACCACCATCAC
配列番号５０：CAT192HC+G (TVTVSGSAS)、フォワード
5'-ccaccgtgacagtgtctggcagcgccagc-3'
配列番号５１：CAT192HC+G (TVTVSGSAS)、相補体
5'-gctggcgctgccagacactgtcacggtgg-3'
配列番号５２：CAT192HC+GG-ST (TVTVSGGSA)、フォワード
5'-ccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagc-3'
配列番号５３：CAT192HC+GG-ST (TVTVSGGSA)、相補体
5'-gctggcgctgccgccagacactgtcacggtgg-3'
配列番号５４：CAT192HC+GGGGS (TVTVSGGGGSSAS)、フォワード
5'-caccaccgtgacagtgtctggcggcggcggcagcagcgccagca-3'
配列番号５５：CAT192HC+GGGGS (TVTVSGGGGSSAS)、相補体
5'-tgctggcgctgctgccgccgccgccagacactgtcacggtggtg-3'
配列番号５６：追加のアミノ酸１個が挿入された変異体重鎖
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号５７：追加のアミノ酸２個が挿入され、アミノ酸２個が欠失した変異体重鎖
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSGGSAKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号５８：追加のアミノ酸５個が挿入された変異体重鎖
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSGGGGSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号５９：CAT192HC+GG (TVTVSGGSAS)、フォワード
5'- caccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagca-3'
配列番号６０：CAT192HC+GG (TVTVSGGSAS)、相補体
5'- tgctggcgctgccgccagacactgtcacggtggtg-3'
配列番号６１：追加のアミノ酸２個が挿入された変異体重鎖
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims (38)

  1. ＴＧＦβ１に結合する単離された結合タンパク質であって、前記結合タンパク質は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖および第４のポリペプチド鎖を含み、
    前記第１および第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、式：
    （ＶＬドメイン）−（リンカー１）ｍ−（ＣＬドメイン）
    を有し、
    前記第３および第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、式：
    （ＶＨドメイン）−（リンカー２）ｎ−（ＣＨ１ドメイン）−（ヒンジ）ｓ−（Ｆｃ領域）を有し、
    式中、ｍは１であり、ｎは０または１であり、ｓは０または１であり、
    該第３または第４のポリペプチド鎖のそれぞれの前記ＶＨドメインは、可変重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、可変重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、および可変重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号８のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
    該第１および第２のポリペプチド鎖のそれぞれの前記ＶＬドメインは、可変軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、可変軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および可変軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、前記ＬＣＤＲ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は配列番号１４のアミノ酸配列を含み；
    前記リンカー１は、ロイシン−グルタミン酸−イソロイシン−リジン−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−アルギニン−トレオニン−バリン−アラニンの配列を有するペプチドを含み、Ｘ、ＹおよびＺは、独立してセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐ、ｑおよびｒのそれぞれは、独立して０から５の整数である前記結合タンパク質。
  2. ｎは１であり、前記リンカー２は、トレオニン−バリン−セリン−Ａｄ−Ｂｅ−Ｃｆ−セリン−アラニン−セリン−トレオニンの配列を有するペプチドを含み；
    Ａ、ＢおよびＣは、それぞれ独立してセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
    ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは独立して０から５の整数である、請求項１に記載の結合タンパク質。
  3. ＴＧＦβ１に結合する単離された結合タンパク質であって、前記結合タンパク質は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖および第４のポリペプチド鎖を含み、
    前記第１および第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、式：
    （ＶＬドメイン）−（リンカー１）ｍ−（ＣＬドメイン）、
    を有し、
    前記第３および第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、式：
    （ＶＨドメイン）−（リンカー２）ｎ−（ＣＨ１ドメイン）−（ヒンジ）ｓ−（Ｆｃ領域）を有し、
    式中、ｍは１であり、ｎは０または１であり、ｓは０または１であり、
    該第３および第４のポリペプチド鎖のそれぞれの前記ＶＨドメインは、可変重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、可変重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、および可変重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号８のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
    該第１および第２のポリペプチド鎖のそれぞれの前記ＶＬドメインは、可変軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、可変軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および可変軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、前記ＬＣＤＲ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は配列番号１４のアミノ酸配列を含み；
    前記リンカー２は、トレオニン−バリン−セリン−Ａｄ−Ｂｅ−Ｃｆ−セリン−アラニン−セリン−トレオニンの配列を有するペプチドを含み；
    Ａ、ＢおよびＣは、それぞれは独立してセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
    ｎは１であり、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは、独立して０から５の整数である前記結合タンパク質。
  4. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
  5. Ａ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項２または３に記載の結合タンパク質。
  6. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれ、ならびにＡ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項２に記載の結合タンパク質。
  7. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐは１であり、ｑおよびｒのそれぞれは０である、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
  8. Ａ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｄは１であり、ｅおよびｆのそれぞれは０である、請求項２または３に記載の結合タンパク質。
  9. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれ、ならびにＡ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐは１であり、ｑおよびｒのそれぞれは０であり、ｄは１であり、ｅおよびｆのそれぞれは０である、請求項２に記載の結合タンパク質。
  10. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐは０であり、ｑおよびｒのそれぞれは１である、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
  11. Ａ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｄは０であり、ｅおよびｆのそれぞれは１である、請求項２または３に記載の結合タンパク質。
  12. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれ、ならびにＡ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐは０であり、ｑおよびｒのそれぞれは１であり、ｄは０であり、ｅおよびｆのそれぞれは１である、請求項２に記載の結合タンパク質。
  13. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐ、ｑおよびｒのそれぞれは１である、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
  14. Ａ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは１である、請求項２または３に記載の結合タンパク質。
  15. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれ、ならびにＡ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐ、ｑおよびｒのそれぞれは１であり、ｄ、ｅおよびｆのそれぞれは１である、請求項２に記載の結合タンパク質。
  16. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐは２であり、ｑおよびｒのそれぞれは１である、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
  17. Ａ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｄは２であり、ｅおよびｆのそれぞれは１である、請求項２または３に記載の結合タンパク質。
  18. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれ、ならびにＡ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐは２であり、ｑおよびｒのそれぞれは１であり、ｄは２であり、ｅおよびｆのそれぞれは１である、請求項２に記載の結合タンパク質。
  19. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐは１であり、ｑおよびｒのそれぞれは２である、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
  20. Ａ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｄは１であり、ｅおよびｆのそれぞれは２である、請求項２または３に記載の結合タンパク質。
  21. Ｘ、ＹおよびＺの前記それぞれ、ならびにＡ、ＢおよびＣの前記それぞれは、独立してセリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｐは１であり、ｑおよびｒのそれぞれは２であり、ｄは１であり、ｅおよびｆのそれぞれは２である、請求項２に記載の結合タンパク質。
  22. 前記リンカー１およびリンカー２は、それぞれ独立して配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択される配列を含む、請求項１、２または３に記載の結合タンパク質。
  23. 前記第１および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、独立して配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３からなる群から選択される配列を含む、請求項１、２または３に記載の結合タンパク質。
  24. 前記リンカー２は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８からなる群から選択される配列を含む、請求項１、２または３に記載の結合タンパク質。
  25. 前記第３および第４のポリペプチド鎖のそれぞれは、独立して配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８および配列番号６１からなる群から選択される配列を含む、請求項１、２または３に記載の結合タンパク質。
  26. 前記結合タンパク質は選択的にＴＧＦβ１に結合する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  27. 請求項１〜２６のいずれか１項に記載の結合タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  28. 請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  29. 請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  30. 請求項１〜２６のいずれか１項に記載の結合タンパク質を作製する方法であって、請求項２９に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養して、前記結合タンパク質を製造する工程を含む前記方法。
  31. 請求項１〜２６のいずれか１項に記載の結合タンパク質を含む組成物。
  32. 治療有効量の結合タンパク質を含む医薬組成物である、請求項３１に記載の組成物。
  33. さらに生物学的活性成分、賦形剤または希釈剤の１つまたはそれ以上を含む、請求項３１または３２に記載の組成物。
  34. ヒトにおいてＴＧＦβ１活性に直接的または間接的に起因する疾患または状態を処置する方法であって、治療有効量の請求項１〜２６のいずれか１項に記載の結合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む前記方法。
  35. 疾患または状態は、線維性疾患、がん、免疫媒介性疾患、骨リモデリング、腎臓疾患、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 疾患は、びまん性全身性皮膚硬化症である、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 線維性疾患、がん、免疫媒介性疾患、骨リモデリング、腎臓疾患、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される疾患または障害の処置のための医薬の製造における、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の結合タンパク質の使用。
  38. 疾患は、びまん性全身性皮膚硬化症である、請求項３７に記載の使用。
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