ES2293635T3 - Metodo para reducir la inmunogenicidad de la region variable de anticuerpos. - Google Patents
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3153—Streptokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
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-
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Abstract
SE HAN DESCUBIERTO COMPUESTOS DE FUSION INMUNOGENICA REDUCIDA. LOS COMPUESTOS DE FUSION DEL INVENTO CONSTAN DE COMPUESTOS INMUNOGENICOS LIGADOS A SECUENCIAS AUTO-ANTIGENICAS QUE HACEN QUE EL COMPUESTO TENGA UNA INMUNOGENIDAD MENOR. ADEMAS, SE HA DESCUBIERTO UN METODO PARA REDUCIR LA INMUNOGENICIDAD DE UN COMPUESTO INMUNOGENICO. EL METODO INCLUYE LA UNION DE UNA SECUENCIA AUTO-ANTIGENICA CON OTRO COMPUESTO OTRORA INMUNOGENICO. SE HAN INVENTADO TAMBIEN SECUENCIAS NUCLEOTIDAS RECOMBINANTES QUE CODIFICAN SECUENCIAS AUTO-ANTIGENICAS.
Description
Método para reducir la inmunogenicidad de la
región variable de anticuerpos.
La presente invención se refiere a un método
para reducir la inmunogenicidad de una región variable de anticuerpo
inmunogénico mediante la incorporación de una secuencia
autoantigénica, que forma un epítopo reconocido por anticuerpos
preinmunitarios humanos cuya presencia da como resultado una
respuesta inmunitaria reducida contra la región variable de un
anticuerpo.
El uso farmacéutico de compuestos inmunogénicos,
tales como proteínas y carbohidratos, para diagnóstico o terapia en
seres humanos tiene un enorme potencial. Sin embargo, un problema
principal es que los compuestos inmunogénicos a menudo provocan
respuestas inmunitarias que podrían limitar su eficacia y, en
algunos casos, provocar reacciones alérgicas peligrosas. Esto es
particularmente cierto para proteínas no humanas. Además, es
posible que incluso proteínas con secuencias de aminoácidos humanas
puedan ser inmunogénicas, como en los casos en los que la proteína
está alterada en la estructura o conformación como consecuencia de
la fabricación o cuando la proteína se produce en huéspedes
extraños debido a modificación postraduccional inapropiada o
plegamiento impropio. Por otra parte, muchos compuestos no
proteínicos provocan una respuesta inmunitaria.
El sistema inmunitario del ser humano al que se
administra el compuesto inmunogénico reconoce el compuesto como
"extraño" y monta una respuesta inmunitaria para retirarlo. La
respuesta inmunitaria incluye la producción de anticuerpos
específicos de alta afinidad que se unen a y efectúan la eliminación
del compuesto inmunogénico.
Los anticuerpos monoclolanes (Mabs) proporcionan
ejemplos de los usos terapéuticos de proteínas extrañas. La mayoría
de los Mabs son de origen múrido y generalmente se ha encontrado que
son inmunogénicos cuando se inyectan en seres humanos. Se han hecho
intentos de reducir la inmunogenicidad de Mabs múridos substituyendo
por regiones constantes humanas las regiones múridas análogas para
formar anticuerpos quiméricos o Mabs quiméricos, o yendo un paso
más allá y substituyendo por secuencias de entramado humanas los
homólogos múridos en las regiones variables de los anticuerpos
(anticuerpos humanizados o Mabs humanizados). Estos sistemas pueden
reducir la respuesta inmunitaria provocada por regiones constantes o
entramados múridos, pero pueden ser ineficaces para reducir
respuestas inmunitarias dirigidas contra las regiones variables o
los idiotipos de los Mabs. En efecto, existen varios ejemplos de
Mabs quiméricos que provocan respuestas inmunitarias dirigidas
contra las regiones variables (por ejemplo, B72.3 presentado por
Meredith y otros, (1992) J. Nucl. Medicine 33:23-29,
y ch14.18 presentado por Saleh y otros, (1992) Hum. Antibody
Hybridoma 3:19-24). De hecho, las respuestas
inmunitarias a la anti-región variable pueden ser la
norma en vez de la excepción. En estos casos, se requiere otro
sistema.
Existe una necesidad de compuestos terapéuticos
o diagnósticos que o bien no provoquen una respuesta inmunitaria o
bien que provoquen una respuesta inmunitaria reducida. Existe una
necesidad de un método para reducir o eliminar la inmunogenicidad
de compuestos terapéuticos y diagnósticos.
La presente invención proporciona un método para
reducir la inmunogenicidad de regiones variables de anticuerpos en
el que el sistema monta una respuesta inmunitaria reducida contra el
compuesto o no monta ninguna respuesta inmunogénica en absoluto
contra él. De acuerdo con esto, estos compuestos pueden
administrarse como substancias terapéuticas o diagnósticas con una
reducción o eliminación de los problemas asociados con la
administración de compuestos inmunogénicos.
La presente invención se refiere a compuestos de
fusión con inmunogenicidad reducida que comprenden compuestos
inmunogénicos conectados a secuencias autoantigénicas. La presencia
de la secuencia autoantigénica hace al compuesto menos
inmunogénico. Además, la presente invención se refiere a un método
para reducir la inmunogenicidad de un compuesto inmunogénico
conectando una secuencia autoantigénica a un compuesto de otro modo
inmunogénico. La presente invención también se refiere a una
secuencia de nucleótidos recombinante que codifica secuencias
autoantigénicas y a péptidos autoantigénicos esencialmente
puros.
Se ha observado la presencia de anticuerpos en
suero humano normal que son específicos para porciones de proteínas
degradadas, tales como porciones de proteínas endógenas degradadas
por enzimas proteolíticas. Existen muchos informes en la
bibliografía que se refieren a inmunorreactividad endógena observada
a fragmentos de anticuerpos segmentados. Esta inmunorreactividad
endógena a proteínas endógenas segmentadas se denomina en la
presente memoria "preinmunidad". Los anticuerpos implicados en
la inmunorreactividad preinmunitaria se describieron inicialmente
como "aglutinadores" o "anticuerpos
anti-Fab" ("\alphaFABA"). Se presenta que
los anticuerpos preinmunitarios 1) están presentes en la mayoría de
los individuos, 2) tienen concentraciones variables a través de una
población, 3) no son IgM o factores reumatoides, 4) son específicos
para fragmentos y 5) generalmente son de baja afinidad. Estos
anticuerpos pueden describirse generalmente como un grupo
heterogéneo de anticuerpos que comparten las características de
reconocer fragmentos proteínicos endógenos, habitualmente las
porciones terminales de fragmentos de anticuerpo, que se exponen
mediante degradación de proteínas, habitualmente degradación
proteolítica.
Osterland, C.K. y otros, (1963) Vos Sang 8:133,
presentan una actividad sérica capaz de "aglutinar" eritrocitos
humanos revestidos con Fab o F(ab')_{2}. La reactividad se
dirige a epítopos que solo se exponen después de que una
inmunoglobulina sea segmentada por una enzima proteolítica. Esto es,
estos anticuerpos reconocen la proteína degradada pero no la
proteína intacta.
Waller, M. y otros, (1969) Immunochemistry
6:207-214, presentan que los "anticuerpos
naturales" en suero humano eran capaces de diferenciar
fragmentos Fab producidos por diferentes enzimas. Diferentes
anticuerpos de este grupo eran específicos para diferentes epítopos
en fragmentos Fab que se generaban, es decir, se exponían, mediante
la segmentación específica que sufría un fragmento Fab
específico.
Ling, N.R. y P. Drysdale, (1981) Int. Archs.
Allergy Appl. Immun. 66:459, presentan que fragmentos
F(ab')_{2} de paraproteínas policlonales humanas, bovinas
y de conejo y de IgG humana de diferente subclase y tipo de cadena
ligera se acoplaban a glóbulos rojos humanos y se usaban para
detectar "anticuerpos aglutinadores" en suero humano normal y
patológico. Se presentó que tales anticuerpos se producían
comúnmente y demostraban heterogeneidad específica.
Persselin, J.E. y R.H. Stevens, (1985) J. Clin.
Invest. 76:723, presentan que sueros de pacientes con artritis
reumatoide contenían dos poblaciones de anticuerpos dirigidos contra
la porción Fab de IgG humana reunida.
Heimer R. y otros, (mayo de 1985) Arthritis and
Rheumatism 28(5):562, presentan un examen de la especificidad
de anticuerpos anti-F(ab')_{2} de IgG en
sueros no fraccionados de pacientes con artritis reumatoides y
procedentes de preparaciones de anticuerpos purificados por
afinidad.
Persselin, J.E. y R.H. Stevens (1989) Mongr.
Allergy 26:74, presentan un grupo de "anticuerpos autólogos"
que se dirigen contra las porciones Fab y F(ab')_{2} de IgG
humana. Este grupo, que se presentó que era común en individuos
normales y en pacientes que sufrían una variedad de trastornos, se
caracterizó por ser un grupo heterogéneo de anticuerpos con
diversas propiedades biológicas y especificidades elegidas como
objetivo.
Aunque muchos de los informes de "anticuerpos
naturales" se refieren a la existencia de tales anticuerpos que
se unen específicamente a fragmentos de IgG, se cree que existen
grupos de este tipo de anticuerpos que se unen a porciones
degradadas de otras proteínas endógenas.
Jordan y otros, (Circulation, vol 86, no. 4,
supl. 1, página I411) describen la producción del anticuerpo
anti-Fab de GP IIb/IIIa quimérico c7E3.
Según se usan en la presente memoria, los
términos "aglutinadores", "anticuerpos aglutinantes",
"anticuerpos naturales", "anticuerpos autólogos",
"anticuerpos preinmunitarios" y "anticuerpos séricos
preinmunitarios" se usan intercambiablemente y se entiende que
se refieren a anticuerpos que están normalmente presentes en un
individuo. Los anticuerpos preinmunitarios son un grupo heterólogo
de anticuerpos que se unen a proteínas endógenas degradadas pero
habitualmente no se unen a las intactas. Existen en bajos niveles y
generalmente se unen a la porción terminal en un sitio de
segmentación de una proteína endógena segmentada. Existen algunos
anticuerpos preinmunitarios que reaccionan con proteínas intactas.
Sin embargo, muchos de tales anticuerpos reconocen fragmentos pero
no se unen a la proteína intacta. En los casos en los que no
reaccionan cruzadamente con proteínas intactas, un anticuerpo
preinmunitario generalmente reconoce un epítopo que está presente en
la porción terminal de una proteína después de la segmentación.
Este epítopo habitualmente se presenta en el extremo C.
Presentándose en estas posiciones, el epítopo es extremadamente
específico de modo que el epítopo solo es accesible y reconocible
cuando aparece en el extremo de la proteína.
Se ha descubierto que la presencia, en un
compuesto de otro modo inmunogénico, de una secuencia de aminoácidos
que forma el epítopo para un anticuerpo preinmunitario reduce o
elimina la inmunogenicidad de ese compuesto. La inclusión de tal
secuencia de aminoácidos permite convertir un compuesto inmunogénico
en un compuesto con inmunogenicidad reducida.
Según se usan en la presente memoria, los
términos "secuencia autoantigénica", "péptido
autoantigénico", "secuencia preinmunitaria", "secuencia
de aminoácidos preinmunitaria" y "péptido preinmunitario" se
usan intercambiablemente y se entiende que se refieren a una
secuencia de aminoácidos que es un epítopo reconocido por un
anticuerpo preinmunitario y que, cuando se asocia con un compuesto
inmunogénico, hace al compuesto inmunogénico menos
inmunogénico.
Según se usan en la presente memoria, los
términos "compuestos de fusión", "compuesto con
inmunogenicidad reducida" y "compuestos menos
inmunogénicos" se usan intercambiablemente y se refieren a
compuestos que comprenden un compuesto de otro modo inmunogénico
conectado a una secuencia autoantigénica, con lo que la presencia de
las secuencias autoantigénicas da como resultado la reducción o la
eliminación de la inmunogenicidad del compuesto de otro modo
inmunogénico. Cuando un compuesto inmunogénico, que es un compuesto
que normalmente provoca una respuesta inmunitaria cuando se
administra a un paciente, está conectado con una secuencia
autoantigénica para formar un compuesto de fusión, el compuesto de
fusión no provoca respuesta inmunitaria o provoca una respuesta
inmunitaria reducida cuando se administra a un paciente en
comparación con la respuesta inmunitaria provocada por el compuesto
inmunogénico por sí mismo.
Según se usa en la presente memoria, el término
"menos inmunogénico" se refiere a la inmunogenicidad
comparativamente reducida exhibida por un compuesto inmunogénico
conectado a una secuencia autoantigénica con relación a la
inmunogenicidad exhibida por el mismo compuesto inmunogénico que no
está conectado a un compuesto autoantigénico.
Según se usa en la presente memoria, el término
"inmunogénico" se refiere a la capacidad de un compuesto para
provocar una respuesta inmunitaria.
Según se usa en la presente memoria, el término
"antigénico" se refiere a la capacidad de un compuesto para
reaccionar con el sistema inmunitario, es decir, los
anticuerpos.
Las secuencias autoantigénicas pueden
identificarse mediante una variedad de métodos que pueden ser
fácilmente llevados a cabo por los que tienen experiencia normal en
la especialidad. Proteínas endógenas, tales como anticuerpos,
citoquinas, factores de crecimiento, receptores, enzimas y proteínas
estructurales, pueden segmentarse mediante un grupo de enzimas
proteolíticas. Los fragmentos producidos pueden exponerse a suero
humano y esos fragmentos que se unen a anticuerpos preinmunitarios
en el suero pueden identificarse fácilmente. La secuencia de
aminoácidos del epítopo que está implicado en el anticuerpo
preinmunitario puede determinarse. Este epítopo representa una
secuencia autoantigénica. Alternativamente, pueden producirse
bibliotecas de péptidos que contienen una variedad aleatoria de
péptidos de aproximadamente 5 o más residuos de aminoácido. Estas
bibliotecas pueden usarse en un rastreo con suero humano normal
para identificar péptidos que son epítopos reconocidos por
anticuerpos preinmunitarios endógenos. Estos péptidos pueden
identificarse y usarse o probarse como secuencias
autoantigénicas.
Un ejemplo de un grupo heterogéneo de
anticuerpos preinmunitarios específicos para productos de
degradación de proteínas son anticuerpos que reconocen epítopos que
están presentes en la secuencia C-terminal de la
cadena pesada cuando anticuerpos IgG son degradados mediante
segmentación proteolítica. De acuerdo con esto, algunas modalidades
de la presente invención se refieren a un método para hacer a un
compuesto de otro mono inmunogénico menos inmunogénico conectándolo
a una de una variedad de secuencias autoantigénicas encontradas en
el extremo C de la cadena pesada de moléculas de Fab o
F(ab')_{2} humanas o quiméricas.
Las secuencias de aminoácidos que son los
epítopos para anticuerpos preinmunitarios
anti-fragmento de IgG a menudo se encuentran en la
región de bisagra de la cadena pesada. La segmentación de la cadena
pesada en la región de bisagra genera una secuencia de aminoácidos
en el extremo C que puede ser reconocida por anticuerpos
preinmunitarios específicos que no reaccionan con moléculas de IgG
intactas. Dependiendo de dónde se produce la segmentación, se
expone un epítopo diferente y así un grupo diferente de anticuerpos
preinmunitarios puede unirse a él. Así, anticuer-
pos individuales de este grupo reconocen los epítopos discretos producidos mediante segmentación en diversos sitios.
pos individuales de este grupo reconocen los epítopos discretos producidos mediante segmentación en diversos sitios.
La secuencia autoantigénica se deriva de la
región de bisagra de IgG. En algunas modalidades preferidas, las
secuencias autoantigénicas se derivan de la región de bisagra de
IgG_{1}.
La región de bisagra se refiere a diversos
segmentos estructurales de la cadena pesada de moléculas de IgG.
Diferentes clases de moléculas de IgG tienen diferentes secuencias
de aminoácidos en sus regiones de bisagra respectivas. La región de
bisagra es un elemento particularmente variable de la estructura de
las inmunoglobulinas. La Tabla 1 proporciona un listado de las
diferentes secuencias de aminoácidos de las regiones de bisagra
respectivas de las diversas clases de moléculas de IgG.
Para identificar si una secuencia de aminoácidos
particular es una secuencia autoantigénica, las moléculas de IgG
pueden segmentarse, por ejemplo, con uno de un grupo de proteasas
para proporcionar fragmentos de IgG que contienen diferentes
secuencias de la región de bisagra en el extremo terminal.
Alternativamente, pueden producirse péptidos y polipéptidos
mediante tecnología de síntesis de péptidos o DNA recombinante que
son modelados sobre la secuencia de la región de bisagra. En
cualquier caso, pueden rastrearse sueros humanos para determinar si
están presentes anticuerpos preinmunitarios que se unen a una
secuencia terminal o un péptido sintético expuestos particulares,
respectivamente.
Se ha observado que la secuencia de aminoácidos
cerca del sitio de segmentación con papaína de moléculas de Fab
humanas es reactiva con los anticuerpos preinmunitarios
"anti-Fab" humanos endógenos. Esta secuencia
puede instruir al sistema inmunitario para ignorar a una molécula
que incluye, de modo que no se provoque más respuesta inmunitaria.
Esta secuencia autoantigénica evita la respuesta inmunitaria a un
compuesto conectado que de otro modo sería inmunogénico.
Una secuencia preinmunitaria derivada de Fab que
tiene la secuencia C-terminal CDKTH (Nº ID SEC:1) se
identificó a partir de observaciones realizadas relativas a la
naturaleza de inmunidad humana preexistente y respuestas
inmunitarias inducidas a fragmentos de Fab 7E3 múrido y quimérico.
Las cadenas tanto pesada como ligera del Fab de 7E3 quimérico
comprenden regiones variables múridas y regiones constantes humanas.
Esta secuencia imita a un fragmento natural o la conformación de
IgG humana encontrada en suero humano y, por lo tanto, no se monta
una respuesta inmunitaria de alta afinidad típica contra la molécula
o contra la secuencia de Fab relacionada. Se observaba una
inmunogenicidad reducida de la región variable de 7E3 múrido cuando
se conectaba a esta secuencia en la molécula de c7E3. De acuerdo
con la invención, un compuesto inmunogénico, tal como una proteína
extraña, puede hacerse no inmunogénico o menos inmunogénico
conectando una secuencia autoantigénica, tales como las encontradas
en el extremo C de moléculas de Fab humanas generadas por papaína
derivadas de IgG_{1}, a un compuesto extraño. Así, la asociación
de una secuencia autoantigénica con un agente terapéutico o
diagnóstico inmunogénico es útil para reducir la inmunogenicidad
del agente terapéutico o diagnóstico, evitando o reduciendo de ese
modo una respuesta inmunitaria significativa al agente cuando se
administra a un paciente. De forma similar, fragmentos Fab
generados por papaína de anticuerpo quimérico c128 que es específico
para CD4 y fragmentos Fab generados por papaína de anticuerpo
quimérico c168 que es específico para factor de necrosis tumoral
tienen la secuencia preinmunitaria, CDKTH (Nº ID SEC:1), en sus
extremos C.
Además, la segmentación de anticuerpos con
regiones constantes humanas tales como c128, c168 o c7E3 con
elastasa expone a una secuencia preinmunitaria en el extremo C del
fragmento de anticuerpo así generado.
Se ha encontrado que el fragmento
F(ab')_{2} de 7E3 quimérico exhibe una característica
similar a la molécula de Fab, tal como mostrar una inmunidad
natural, o preinmunidad, en suero humano normal. Por lo tanto, la
secuencia autoantigénica en su secuencia C-terminal
también puede ser útil para reducir la inmunogenicidad de compuestos
extraños en seres humanos.
Secuencias autoantigénicas preferidas pueden
comprender secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que
consiste en: CDKTH (Nº ID SEC:1), PKSCD (Nº ID SEC:2), KSCDK (Nº ID
SEC:3), SCDKT (Nº ID SEC:4), DKTHT (Nº ID SEC:5), KTHTC (Nº ID
SEC:6), THTCP (Nº ID SEC:7), HTCPP (Nº ID SEC:8), TCPPC (Nº ID
SEC:9) y CPPCP (Nº ID SEC:10). Estas secuencias pueden asociarse
con el otro compuesto inmunogénico de tal modo que aseguren que el
último residuo de cada secuencia particular represente un residuo de
aminoácido C-terminal.
Para determinar si una secuencia de aminoácidos
será útil como una secuencia autoantigénica, constructos que
comprenden la secuencia específica que ha de probarse se exponen a
suero humano para determinar si están presentes anticuerpos en
suero que reconocen y se unen específicamente a la secuencia.
La secuencia autoantigénica más preferida
comprende la secuencia de aminoácidos CDKTH (Nº ID SEC:1). Según se
apunta anteriormente, el residuo H es el residuo
C-terminal de cualquier construcción que contenga
este péptido. Cuando se asocia con una región variable de
anticuerpo y está presente en la región C-terminal,
este péptido reduce o elimina la inmunogenicidad de la región
variable de anticuerpo, haciendo así menos inmunogénica a la región
variable de anticuerpo.
Una vez identificada, una secuencia
autoantigénica puede conectarse a una región variable de anticuerpo
inmunogénico mediante una variedad de medios que pueden ser puestos
en práctica fácilmente por los que tienen experiencia normal en la
especialidad. Una secuencia de nucleótidos que codifica una
secuencia autoantigénica puede conectarse a la secuencia de
nucleótidos que codifica la región variable de anticuerpo
inmunogénico para formar un gen quimérico que codifica una proteína
de fusión. La secuencia autoantigénica aparecerá en la porción
terminal de la proteína de fusión resultante cuando el gen
quimérico se exprese. Estos péptidos pueden conectarse químicamente
a la región variable de anticuerpo inmunogénico usando técnicas bien
conocidas. Las secuencias autoantigénicas también pueden conectarse
a una región variable de anticuerpo por medios químicos.
Independientemente del método para conectar una secuencia
autoantigénica a una región variable de anticuerpo de otro modo
inmunogénico, la región variable de anticuerpo inmunogénico se
convierte en una región variable de anticuerpo con inmunogenicidad
reducida mediante la incorporación de una secuencia autoantigénica
que sirve como un epítopo para anticuerpos preinmunitarios. Un
experto normal en la especialidad puede efectuar la conexión de una
secuencia autoantigénica a una región variable de anticuerpo
inmunogénico mediante técnicas bien conocidas. Técnicas de
acoplamiento estándar, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a:
acoplamiento a través de sulfhidrilo libre de cisteína,
acoplamiento a través de un grupo amino en \varepsilon de lisina y
acoplamiento a través de cualquier amina libre. Las técnicas para
someter a ingeniería los anticuerpos son bien conocidas y se
describen en Winter y Millstein (1991) Nature 349:293 y Larrich y
Fry (1991) Hum. Antibod. and Hybridomas 2:17.
De acuerdo con la invención, una secuencia
autoantigénica puede enlazarse a una región variable de anticuerpo
inmunogénico para convertir la región variable de anticuerpo
inmunogénico en una región variable de anticuerpo de
inmunogenicidad reducida. Según se usan en la presente memoria, los
términos "compuestos de inmunogenicidad reducida",
"compuestos menos inmunogénicos", "compuestos no
inmunogénicos" y "compuestos de fusión" se usan
intercambiablemente y pretenden referirse a una región variable de
anticuerpo que comprende una secuencia autoantigénica conectada a
una región variable de anticuerpo de otro modo inmunogénico. La
presencia de la secuencia autoantigénica conectada a la región
variable de anticuerpo de otro modo inmunogénico provoca una
respuesta inmunitaria reducida en individuos a los que se administra
tal región variable de anticuerpo con relación a la respuesta
inmunitaria provocada por la región variable de anticuerpo
inmunogénico estando ausente la secuencia autoantigénica. Una
secuen-
cia autoantigénica puede añadirse a Fabs no humanos procesados o Fabs humanos producidos recombinantemente.
cia autoantigénica puede añadirse a Fabs no humanos procesados o Fabs humanos producidos recombinantemente.
Un compuesto inmunogénico preferido que ha de
convertirse en un compuesto de inmunogenicidad reducida de acuerdo
con la presente invención es una región variable de anticuerpo IgG
múrido. Normalmente, una región variable de anticuerpo IgG múrido
provocará una respuesta inmunitaria cuando se administre a un ser
humano. Esta respuesta puede hacerla ineficaz o menos eficaz debido
a que la molécula de la región variable de anticuerpo de IgG es
neutralizada y/o retirada antes de alcanzar y unirse a su antígeno
diana. Haciendo menos inmunogénica a la región variable de
anticuerpo IgG múrido, se hace más eficaz como un compuesto
terapéutico o diagnóstico ya que es menos refrenada por el sistema
inmunitario del paciente.
Una modalidad preferida de la presente invención
es una molécula de IgG múrida que tiene una secuencia autoantigénica
que comprende CDKTH (Nº ID SEC:1) conectada de modo que el residuo
H sea un residuo C-terminal. De acuerdo con la
invención, tal molécula puede producirse mediante técnicas de DNA
recombinante estándar usadas para producir anticuerpos. Por
ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia
autoantigénica puede insertarse en el extremo 3' de un gen que
codifica una porción C-terminal de la molécula de
IgG, preferiblemente la porción C-terminal de la
cadena pesada. La secuencia de nucleótidos se inserta en el marco de
lectura apropiado de modo que los residuos codificados por ella se
presenten totalmente en el extremo de la proteína resultante.
Los resultados clínicos demuestran una reducción
en la inmunogenicidad para antígenos extraños que contienen una
secuencia autoantigénica que es expuesta mediante la segmentación
proteolítica de una cadena pesada de IgG. Se han hecho varias
observaciones durante el desarrollo del Mab antiplaquetario
terapéutico 7E3 que conducen al descubrimiento de que la
inmunogenicidad de un compuesto normalmente inmunogénico puede
reducirse asociándolo con una secuencia de aminoácidos que
representa un epítopo reconocido por un anticuerpo preinmunitario.
Estos experimentos se presentan en el Ejemplo 1.
Brevemente, se inyectó Mab 7E3 en seres humanos
como un fragmento Fab múrido y también como un fragmento Fab
quimérico (c7E3). Se analizó la inmunogenicidad de ambos fragmentos.
Existía una diferencia fundamental en la naturaleza de las
respuestas inmunitarias provocadas por los Fabs múrido y quimérico.
El Fab de 7E3 múrido provocaba una respuesta inmunitaria en
pacientes que se dirigía totalmente contra la región variable de
7E3. En contraste, aunque el Fab de c7E3 contenía la región
variable idéntica al Fab de 7E3 múrido, c7E3 no provocaba
respuestas inmunitarias comparables, indicando que la región
constante humana del Fab de c7E3 hacía a la región variable menos
inmunogénica.
Análisis de EIA independientes de afinidad con
revestimiento directo indicaban que 50-80% de la
población humana normal tiene anticuerpos séricos preinmunitarios
que reaccionan con fragmentos Fab quiméricos. Esta reactividad
preinmunitaria no es específica para las regiones variables de estas
moléculas ya que diversos fragmentos Fab quiméricos monoclonales
así como fragmentos Fab voluminosos preparados a partir de Ig sérica
humana total eran reconocidos por los anticuerpos
anti-Fab endógenos. Esta reactividad
anti-fragmento parecía ser de baja afinidad y era
detectable solo mediante ensayos de EIA en fase sólida relativamente
sensibles.
La localización de los epítopos reactivos de los
Fabs quiméricos (o humanos) monoclonales estaba en el extremo C de
la cadena pesada del fragmento Fab generado por digestión con
papaína de la molécula de IgG intacta. Estos anticuerpos
preinmunitarios anti-Fab de 7E3 quimérico endógenos
se neutralizaron fácilmente usando el fragmento Fab de otro
anticuerpo quimérico IgG_{1} pero no mediante otras proteínas.
Estas observaciones indicaban que el epítopo reactivo es
probablemente una secuencia corta de aminoácidos que debe estar
presente en o cerca del extremo C del fragmento Fab.
Un fragmento Fab humano quimérico imita a una
molécula que se encuentra normalmente en suero y que provoca una
respuesta de anticuerpo de baja afinidad normal. Parece que la
respuesta inmunitaria contra moléculas que contienen la secuencia
autoantigénica como un epítopo accesible puede regularse para
impedir una respuesta secundaria de alta afinidad. En efecto, el
sistema inmunitario puede desensibilizarse o hacerse tolerante a la
estimulación antigénica con moléculas que tienen el epítopo. Por lo
tanto, una estimulación adicional con una molécula similar no
conduciría a una respuesta inmunitaria de alta afinidad típica.
La preinmunidad para un epítopo particular
parece ser específica de la especie. Cuando se analizaban las
respuestas inmunitarias de primates tratados con Fab de 7E3
quimérico, los sueros de pretratamientos procedentes de estos monos
demostraban poca o ninguna inmunorreactividad con Fab de 7E3
quimérico pero mostraban una reactividad significativa con
fragmentos Fab generados de IgG de mono. A la inversa, el suero
humano no mostraba inmunorreactividad preexistente con Fab de mono.
Además, los monos han demostrado una inmunogenicidad inducida
significativamente mayor a Fab de 7E3 quimérico que los seres
humanos enrolados en experimentos clínicos de Fase 1.
También se examinaron otras especies con
respecto a inmunorreactividad preexistente para sus fragmentos Fab
y F(ab')_{2} autólogos. Grupos autólogos de sueros de
conejos y cabras se rastrearon con respecto a la reactividad hacia
fragmentos Fab y F(ab')_{2} policlonales procedentes de IgG
de sus especies respectivas. De nuevo, se observó que existía una
reactividad IgG significativa hacia ambos de estos fragmentos de
anticuerpo procedentes de sus propias especies. Sin embargo, no se
hizo la misma observación para anticuerpos múridos hacia Fab de 7E3
múrido.
Aunque no se han realizado experimentos
comparativos sobre seres humanos usando fragmentos
F(ab')_{2} de 7E3 múridos y quiméricos u otros fragmentos
Fab y F(ab')_{2} múridos y quiméricos, se han observado
anticuerpos específicos que se unen a fragmentos Fab y
F(ab')_{2} humanos. Los individuos con alta reactividad
anti-Fab quimérico no tienen necesariamente alta
reactividad anti-F(ab')_{2} quimérico, y
viceversa. Por otra parte el reconocimiento inmunitario de estos
fragmentos quiméricos es aparentemente específico, ya que la unión
de anticuerpos anti-Fab generalmente no puede
bloquearse mediante Fab' o F(ab')_{2} quiméricos.
La descripción de la presente invención se
presenta generalmente en la presente memoria en relación con
compuestos que son no inmunogénicos como resultado de conectar una
secuencia autoantigénica humana a un compuesto de otro modo
inmunogénico, y a un método para reducir la inmunogenicidad de
compuestos conectando el compuesto inmunogénico con una secuencia
autoantigénica humana. Se contempla que la presente invención puede
aplicarse a otras especies. El alcance de la presente invención
pretende extenderse a compuestos que son menos inmunogénicos en una
especie particular como resultado de conectar una secuencia
autoantigénica procedente de la especie a un compuesto de otro modo
inmunogénico y a un método para reducir la inmunogenicidad de
compuestos en una especie particular conectando el compuesto
inmunogénico con una secuencia autoantigénica procedente de
esa
especie.
especie.
Por otra parte, la descripción de la presente
invención se presenta con relación a compuestos en los que una
secuencia autoantigénica se enlaza físicamente a un compuesto de
otro modo inumogénico. Sin embargo, es posible que no se requiera
conexión física.
El anticuerpo monoclonal 7E3 se ha desarrollado
para terapia de seres humanos como un fragmento Fab de la molécula
de anticuerpo. El reactivo se produjo en dos versiones; una derivada
del anticuerpo monoclonal múrido (isotipo gamma 1 múrido) mediante
digestión con papaína (7E3) y una derivada de un anticuerpo
monoclonal quimérico de ratón/ser humano (isotipo gamma 1 humano)
también mediante digestión con papaína (c7E3). El Mab quimérico se
produjo usando técnicas de clonación estándar para obtener la región
variable procedente del hibridoma 7E3 y fusionándola a genes de la
región constante humanos clonados previamente in vitro. Los
genes quiméricos se introdujeron en células mamíferas apropiadas
para la expresión.
Las dos moléculas de Fab tienen la misma región
variable, pero diferentes regiones constantes. Las secuencias de
aminoácidos C-terminales expuestas después de la
digestión con papaína son diferentes. La papaína sujeta las
moléculas de anticuerpo en la región de bisagra de la cadena pesada
entre el dominio CH1 y CH2. Las secuencias de aminoácidos de
bisagra de la gamma 1 humana y la gamma 1 de ratón son muy
diferentes (véase la Tabla 1). Después de la segmentación de c7E3
con papaína, el extremo C de la cadena pesada termina en los
aminoácidos CDKTH (Nº ID SEC:1). El punto de segmentación exacto de
la papaína en la bisagra de gamma 1 de ratón es desconocido, pero
debe producir un extremo C muy diferente de la secuencia humana, ya
que la bisagra de ratón no contiene una secuencia similar a CDKTH
(Nº ID SEC: 1).
Los fragmentos Fab de m7E3 y c7E3 se probaron
para determinar si el suero humano contiene anticuerpos que
reaccionan con los fragmentos. Se usó un ensayo ELISA en fase sólida
en el que bien Fab de m7E3 o bien Fab de c7E3 se inmovilizaba
directamente sobre una placa de ensayo de plástico y se exponía a
suero humano. Los anticuerpos humanos unidos se detectaron usando
anticuerpos antihumanos de cabra conjugados a una enzima que
producirá un producto coloreado cuando se incube con el substrato
apropiado. Este ensayo es muy sensible y capaz de detectar
interacciones de baja afinidad. Se probó un gran número de sueros
humanos y el Fab de m7E3 generalmente era no reactivo, mientras que
el Fab de c7E3 reaccionaba con al menos 60% de las muestras de
suero humano.
La especificidad de los anticuerpos reactivos en
suero humano se determinó incluyendo un exceso de diversas
moléculas en el ensayo como inhibidores competitivos. Si una
molécula dada inhibe la unión a c7E3, entonces también debe
presentar el epítopo o los epítopos reactivos. Según se espera, c7E3
soluble podía inhibir la unión de los anticuerpos humanos a c7E3
inmovilizado. Otras molécula que podían inhibir la unión incluían
fragmentos Fab de otros anticuerpos gamma 1 quiméricos, y Fab humano
policlonal derivado de suero. En contraste, ninguna de las
siguientes moléculas podía inhibir la unión: 1) Fab de m7E3; 2) IgG
de c7E3 entera; 3) fragmento Fab derivado de la versión IgG_{4}
de 7E3 (contiene una región de bisagra diferente de gamma 1); 4)
fragmento F(ab')_{2} de c7E3; y 5) fragmento Fab' de c7E3.
El fragmento Fab es extremadamente específico para el extremo C
expuesto después de la digestión con papaína del anticuerpo
c7E3.
Las inmunogenicidades de Fab de m7E3 y Fab de
c7E3 se probaron en seres humanos en experimentos clínicos de Fase
I. Usando un formato de ensayo que minimiza la reactividad
preinmunitaria de baja afinidad de modo que pueden observarse
fácilmente respuestas relacionadas con el tratamiento reales, se
encontró que 17/86 o aproximadamente 20% de los sujetos que
recibían Fab de m7E3 exhibían respuestas inmunitarias con
concentraciones que variaban de 1:50-1:1600. En
contraste, solo 1/67 ó 1,5% de los sujetos que recibían Fab de c7E3
exhibían una respuesta inmunitaria (concentración = 1:50). Por lo
tanto, se observó que el Fab de c7E3, que reacciona con anticuerpos
humanos endógenos, era mucho menos inmunogénico que Fab de m7E3, que
no reacciona con anticuerpos endógenos.
Las posibles secuencias derivadas de la región
de bisagra de Fab (y F(ab')_{2}) gamma 1 humano reactivo
con anticuerpos preinmunitarios "antifragmento" endógenos
pueden identificarse mediante experimentos de rastreo y competición
usando péptidos sintéticos. Se producen péptidos sintéticos de
aproximadamente 5 aminoácidos o más de longitud que contienen
diversas secuencias encontradas en la secuencia de aminoácidos de la
región de bisagra.
Las secuencias más reactivas pueden conectarse a
continuación a un compuesto inmunogénico de interés para reducir la
inmunogenicidad. La conexión puede efectuarse de varios modos. Si el
compuesto inmunogénico es una proteína, el extremo C natural de la
proteína inmunogénica puede convertirse en la secuencia deseada
mediante mutagénesis dirigida al sitio del gen, efectuado lo más
fácilmente usando cebadores de PCR diseñados apropiadamente para
someter a deleción el codón de terminación natural y añadir la
secuencia deseada. Estas técnicas podrían usarse para añadir o
substituir la secuencia en cualquier posición en cualquier gen.
Alternativamente, puede construirse un péptido sintético
correspondiente a la secuencia reactiva mínima y podría conectarse
al compuesto inmunogénico por medios químicos.
Secuencias de aminoácidos que son reactivas con
anticuerpos en suero humano normal, que pueden usarse como
secuencias autoantigénicas para hacer a las moléculas extrañas o
normalmente inmunogénicas menos inmunogénicas, pueden identificarse
rastreando péptidos sintéticos con sueros humanos. Este es un método
general que no requiere la identificación de un sitio de
segmentación específico para proteasa de una proteína endógena y ni
siquiera requiere que la secuencia real esté presente en la
naturaleza.
Brevemente, se genera una biblioteca de péptidos
aleatorios de al menos aproximadamente 5 o más y preferiblemente
aproximadamente 5-10 aminoácidos de longitud. Estos
péptidos se rastrean con respecto a la reactividad con anticuerpos
en sueros humanos. Esto se efectúa, por ejemplo, inmovilizando los
péptidos sobre una fase sólida y reali-
zando un ensayo de ELISA estándar para detectar anticuerpos humanos unidos después de la exposición a los sueros.
zando un ensayo de ELISA estándar para detectar anticuerpos humanos unidos después de la exposición a los sueros.
Los péptidos positivos se evalúan a continuación
adicionalmente para establecer si son reactivos solo con sueros
humanos y no con otras especies, y para determinar la afinidad de
las interacciones. Los péptidos que reaccionan con la mayoría de
los sueros humanos pero no con sueros de otras especies se estudian
a continuación para determinar si son capaces de conferir
inmunogenicidad reducida a compuestos de otro modo inmunogénicos.
Que un péptido dado provoque o no una respuesta inmunitaria requiere
datos de inmunogenicidad empíricos.
Existen muchos modos posibles de generar y
rastrear bibliotecas o secuencias de péptidos aleatorios. Un método
es sintetizar colecciones de péptidos (Schoofs, P.G. y otros, (1988)
Immun. 140:611) y ensayar las fracciones reunidas con respecto a la
reactividad contra suero humano. Las fracciones reunidas positivas
se subdividen y se reensayan múltiples veces de modo que la especie
activa se identificara finalmente. Otro método es generar una
secuencia de DNA que codifica para segmentos de aminoácidos
aleatorios y fusionar las secuencias de DNA a un gen de
bacteriófago (McCafferty y otros, (1990) Nature 348:552). Las
secuencias de aminoácidos aleatorios se presentan en el exterior de
la partícula de bacteriófago como un extremo C artificial de una
proteína fágica. El fago se inmoviliza y se rastrea con respecto a
la reactividad con anticuerpos humanos endógenos. El fago positivo
se aísla y el DNA se extrae y se somete a secuenciación para
determinar la secuencia de aminoácidos del segmento peptídico
reactivo.
En general, es difícil en la práctica probar
candidatos de secuencias autoantigénicas en seres humanos para
determinar si su presencia hace o no a los compuestos inmunogénicos
menos inmunogénicos debido a que requiere la prueba experimental en
seres humanos lo que produce problemas éticos en muchas
circunstancias. Debido a esta dificultad para probar la
inmunogenicidad de posibles moléculas en seres humanos, se usa un
modelo de conejo para imitar el sistema humano y demostrar que
epítopos de anticuerpos preinmunitarios pueden identificarse y
conectarse a compuestos inmunogénicos para reducir la
inmunogenicidad de los compuestos.
Epítopos de anticuerpos preinmunitarios pueden
identificarse como se describe en el Ejemplo 3, pero substituyendo
por sueros de conejo los sueros humanos usados en los protocolos
descritos en la presente memoria. Secuencias de aminoácidos que
reaccionan con los anticuerpos endógenos pueden identificarse y
conectarse a diversos compuestos mediante métodos bien conocidos.
Pueden generarse datos comparativos a partir de experimentos en los
que los compuestos conectados a las secuencias autoantigénicas
sospechadas y compuestos solos se administran a conejos. La
respuesta inmunitaria contra cada uno de los compuestos puede
medirse.
Se ha observado que los conejos exhiben el mismo
tipo de reactividad normal con fragmentos Fab homólogos; esto es,
preinmunidad para fragmentos Fab. La región apropiada de DNA de
conejo procedente del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina
se clona y se determina la secuencia de la región de bisagra. Esto
permite la construcción de un compuesto de fusión que comprende una
secuencia autoantigénica de conejo conectada a la IgG de 7E3
quimérico en el extremo C de una molécula de Fab y evaluar su
inmunogenicidad en comparación con la inmunogenicidad de Fab de 7E3
quimérico en conejos.
La estreptoquinasa es una proteína trombolítica
que se ha probado como un fármaco para pacientes con ataque
cardíaco que sufren bloqueos coronarios. Una desventaja principal de
la estreptoquinasa es que es altamente inmunogénica en seres
humanos. De acuerdo con esto, su utilidad está muy limitada.
Particularmente, una vez que a un paciente se le ha administrado
estreptoquinasa, existe la posibilidad de una reacción inmunitaria
peligrosa a cualquier administración subsiguiente.
La presente invención proporciona un método para
reducir la inmunogenicidad de la estreptoquinasa, reduciendo de ese
modo las desventajas inherentes de la molécula como un agente
terapéutico que forma la base para los problemas de seguridad que
están asociados con su uso.
La producción de estreptoquinasa usando
tecnología de DNA recombinante es bien conocida y puede ser
realizada por los que tienen experiencia normal en la especialidad
usando materiales de partida fácilmente disponibles. De forma
similar, pueden realizarse técnicas bien conocidas para producir un
derivado de estreptoquinasa que tiene la secuencia autoantigénica
CDKTH (Nº ID SEC:1) en el extremo C de la proteína. Un experto
normal en la especialidad puede producir tal derivado de
estreptoquinasa sin una experimentación excesiva.
El derivado de estreptoquinasa puede probarse
in vitro y en modelos animales para asegurar que retiene
actividad de estreptoquinasa. Pueden realizarse a continuación
experimentos clínicos comparativos para medir la inmunogenicidad de
estreptoquinasa frente a la inmunogenicidad de un derivado de
estreptoquinasa. Las técnicas para realizar estos experimentos son
bien conocidas y pueden ser realizadas fácilmente por los que tienen
experiencia normal en la especialidad.
Existen varios ejemplos de Mabs quiméricos que
provocan respuestas inmunitarias dirigidas contra las regiones
variables. Estos incluyen B72.3 (Meredith y otros, (1992) J. Nucl.
Medicine 33:23-29) y ch14.18 (Saleh y otros, (1992)
Hum. Antibody Hybridoma 3:19-24). El hecho de que
estos anticuerpos provoquen respuestas inmunitarias representa un
obstáculo principal en su eficacia y su utilidad está muy limitada
por su inmunogenicidad. Particularmente, los pacientes desarrollan
anticuerpos contra los anticuerpos y neutralizan su actividad.
La presente invención proporciona un método para
reducir la inmunogenicidad de Mabs quiméricos, reduciendo de ese
modo la base para los problemas de seguridad que están asociados con
su uso e incrementando su utilidad. Técnicas para someter a
ingeniería los anticuerpos son descritas en Winter y Millstein
(1991) Nature 349:293 y Larrich y Fry (1991) Hum. Antibod. and
Hybridomas 2:17. La producción de B72.3 y ch14.18 puede efectuarse
a partir de materiales de partida fácilmente disponibles usando
tecnología de DNA recombinante bien conocida por los que tienen
experiencia normal en la especialidad. Asimismo, pueden realizarse
técnicas bien conocidas para producir derivados de Mab quiméricos
dB72.3 y dch14.18 en los que la secuencia autoantigénica CDKTH (Nº
ID SEC:1) está presente en el extremo C de cada anticuerpo,
respectivamente, preferiblemente la cadena pesada. Un experto
normal en la especialidad puede producir tales Mabs quiméricos y
derivados de Mabs quiméricos sin experimentación excesiva.
Los derivados de Mabs quiméricos dB72.3 y
dch14.18 pueden probarse in vitro y en modelos animales para
asegurar que retienen su especificidad y actividad. Pueden
realizarse experimentos clínicos comparativos para medir la
inmunogenicidad de Mabs quiméricos B72.3 y ch14.18 frente a la
inmunogenicidad de derivados de Mabs quiméricos dB72.3 y dch14.18,
respectivamente. Las técnicas para realizar estos experimentos son
bien conocidas y pueden ser realizadas fácilmente por los que
tienen experiencia normal en la especialidad.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Asp Lys Thr His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Ser Cys Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ser Cys Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Cys Asp Lys Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Lys Thr His Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Thr His Thr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr His Thr Cys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Thr Cys Pro Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Cys Pro Pro Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Pro Pro Cys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
Pro Pro Cys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
Pro Arg Cys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificada en el sitio
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "OTRO"
\hskip6.55cm/nota = "SER O PRO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Xaa Cys
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile
Cys Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL Nº ID SEC:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID SEC:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro
Pro Cys Lys Cys Pro}
Claims (16)
1. Un método para reducir la inmunogenicidad de
una región variable de anticuerpo inmunogénico en un ser humano,
que comprende:
- a)
- seleccionar una secuencia autoantigénica de uno o más fragmentos proteínicos y/o péptidos que son reconocidos por anticuerpo preinmunitario humano, en donde dicha secuencia autoantigénica comprende una secuencia de aminoácidos carboxiterminal que forma un epítopo reconocido por dicho anticuerpo preinmunitario humano; y
- b)
- conectar dicha región variable de anticuerpo inmunogénico al extremo amino de dicha secuencia autoantigénica, no estando conectado el extremo carboxi de dicha secuencia autoantigénica,
con lo que se produce un compuesto
de fusión que tiene inmunogenicidad reducida en un ser humano con
relación a dicha región variable de anticuerpo inmunogénico, en
donde el compuesto de fusión que tiene inmunogenicidad reducida en
un ser humano no es Fab de
c7E3.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha secuencia autoantigénica se selecciona en a)
combinando anticuerpo preinmunitario y uno o más fragmentos
proteínicos y/o péptidos, y seleccionando una secuencia
autoantigénica que es reconocida por dicho anticuerpo preinmunitario
humano de uno o más fragmentos proteínicos y/o péptidos.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el que dicha secuencia autoantigénica se selecciona en a)
combinando anticuerpo preinmunitario humano y uno o más fragmentos
de IgG humana que contienen secuencias de la región de bisagra en
el extremo terminal y/o péptidos procedentes de la región de bisagra
de una IgG humana, y seleccionando una secuencia autoantigénica que
es reconocida por dicho anticuerpo preinmunitario humano de dichos
uno o más fragmentos y/o péptidos de IgG.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, en el que dicha región
variable de anticuerpo es una región variable de anticuerpo no
humano.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que dicha región variable de anticuerpo no humano es una
región variable de un anticuerpo monoclonal múrido.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, en el que dicha secuencia
autoantigénica está presente en el extremo C de un fragmento de una
secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada
de IgG humana.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que dicha secuencia autoantigénica se deriva de la región de
bisagra de una IgG1 humana.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, en el que dicha secuencia
autoantigénica se deriva de la región de bisagra de una IgG
humana.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, en el que dicha secuencia
autoantigénica es un fragmento de una proteína humana que tiene un
extremo carboxi producido mediante la segmentación de la proteína
humana con una enzima proteolítica.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, en el que el extremo
carboxi de dicha secuencia autoantigénica consiste en una secuencia
de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: Nº ID SEC:1,
Nº ID SEC:2, Nº ID SEC:3, Nº ID SEC:4, Nº ID SEC:5, Nº ID SEC:6, Nº
ID SEC:7, Nº ID SEC:8, Nº ID SEC:9 y Nº ID SEC:10.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que dicha secuencia
autoantigénica se conecta a dicho compuesto inmunogénico conectando
químicamente un péptido que comprende dicha secuencia
autoantigénica a dicho compuesto inmunogénico.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-10, en el que la conexión de
la región variable de anticuerpo inmunogénico a la secuencia
autoantigénica comprende expresar un gen quimérico que codifica una
proteína de fusión, comprendiendo dicho gen quimérico una primera
secuencia de nucleótidos que codifica dicha región variable de
anticuerpo inmunogénico y una segunda secuencia de nucleótidos que
codifica dicha secuencia autoantigénica, de modo que la expresión
de dicho gen quimérico produzca una proteína de fusión que tiene
dicha secuencia autoantigénica conectada a dicha región variable de
anticuerpo inmunogénico.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que dicha segunda secuencia de nucleótidos está unida al
extremo 3'-terminal de dicha primera secuencia de
nucleótidos.
14. Un método para reducir la inmunogenicidad de
una región variable de un anticuerpo monoclonal múrido en un ser
humano, que comprende:
- a)
- combinar anticuerpo preinmunitario humano y uno o más fragmentos de IgG humana que contienen secuencias de región de bisagra en el extremo terminal y/o péptidos procedentes de la región de bisagra de una IgG humana, y seleccionar una secuencia autoantigénica que es reconocida por dicho anticuerpo preinmunitario humano procedente de dichos uno o más fragmentos y/o péptidos de IgG,
- en donde dicha secuencia autoantigénica comprende una secuencia de aminoácidos carboxiterminal que forma un epítopo reconocido por dicho anticuerpo preinmunitario humano; y
- b)
- conectar dicha región variable al extremo amino de dicha secuencia autoantigénica, no estando conectado el extremo carboxi de dicha secuencia autoantigénica,
con lo que se produce un compuesto
de fusión que tiene inmunogenicidad reducida con relación a dicha
región variable de un anticuerpo monoclonal múrido, en donde dicho
compuesto de fusión que tiene inmunogenicidad reducida no es Fab de
c7E3.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
14, en el que dicha IgG humana es IgG1 humana.
16. El método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que dicha secuencia autoantigénica es el Nº ID SEC:1, Nº
ID SEC:2, Nº ID SEC:3, Nº ID SEC:4 o Nº ID SEC:5.
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