JP2008523805A - グラム陰性菌におけるlpsの脱アシル化 - Google Patents
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Abstract
Description
K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001) S.H. Yeh: Pertussis: persistent pathogen, imperfect vaccines. Expert Rev. Vaccines 2: 113-127 (2003)
「配列同一性」は、本明細書において、2以上のアミノ酸(ポリペプチド又はタンパク質)配列又は2以上の核酸(ポリヌクレオチド)配列の間の、かかる配列を比較することによって決定される関係として定義されている。当該技術において「同一性」は、アミノ酸配列間又は核酸配列間の配列関連性の程度も意味し、配列関連性の程度は、場合によってはそうした配列間のマッチによって決定される。2つのアミノ酸配列間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換と、第二のポリペプチドの配列とを比較することによって、決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算可能である。そうした方法としては、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 及び Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
[実施例]
菌株及び増殖条件
本研究で使用したすべての菌株を表1に記載する。概ね、改変Luria-Bertani培地寒天、指定のLB寒天(Tommassen, J., van Tol, H., and Lugtenberg, B. (1983) EMBO J. 2, 1275-1279)、又はLB培地において、200rpmで震盪しながら、大腸菌株及び緑膿菌株を37℃で増殖させた。大腸菌については、培地に0.2%のグルコースを補充した。適切とされる場合には、プラスミドの維持及び株の選択のため、100μg/mlのアンピシリン、50μg/mlのカナマイシン、50μg/mlのナリジクス酸、又は100μg/mlのストレプトマイシンの存在下で、細菌を増殖させた。LB寒天プレート上でネズミチフス菌SR11を37℃で増殖させ、15%の脱線維素ヒツジ血液を補充したBorduet-Gengou寒天(Difco社製)上で気管支敗血症菌株及び百日咳菌株を35℃で増殖させた。百日咳菌中でpagL(Bb)遺伝子の発現を誘導するため、1mMのイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)(最終濃度)を補充した合成Thijs培地(Thalen, M., van den IJssel, J., Jiskoot, W., Zomer, B., Roholl, P., de Gooijer, C., Beuvery, C., and Trampen, J. (1999) J.Biotechnol. 75, 147-159)において、震盪しながら(180rpm)、細菌を35℃で増殖させた。
Promega Wizard(登録商標)Plus SV Miniprepsシステムを用いて、プラスミドDNAを単離した。製造者(Fermentas社)の指示にしたがい、子牛の腸のアルカリホスファターゼ及び制限エンドヌクレアーゼを使用した。Qiagen社のクイックゲル抽出キットを用いて、アガロースゲルからDNA断片を単離した。ラピッドDNAライゲーションキット(Roche社製)を使用して、ライゲーションを行った。
Bio-Rad Mini-PROTEAN(登録商標)3装置を用いて、0.2%のSDSを含むランニングゲルでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)(Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685)を行って、タンパク質を分析した。4%のスタッキングゲルで、試料を13%のポリアクリルアミドゲルに塗布し、150Vで電気泳動にかけた。クーマシーブリリアントブルーでタンパク質を染色した。前染色した、又は無染色の、Bio-Rad社製Precision Plus Proteina Standardを使用して、相対分子量(Mr)を測定した。ウェスタンブロッティング用に、タンパク質をSDS−PAGEゲルからニトロセルロース膜へ転写した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.6)、0.5%の無脂肪粉乳、0.1%のTween-20中で膜を一晩ブロッキングして、PagL(Pa)に対する一次抗体とともにブロッキング緩衝液中でインキュベーションし、引き続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗モルモットIgG抗体(Sigma社製)とともにブロッキング緩衝液中でインキュベーションを行った。SuperSignal(登録商標)WestPico Chemiluminescent Substrate(Pierce社製)を用いて、ブロットを現像した。
Bio-Rad Mini-PROTEAN(登録商標)3装置を用いて、0.2%のSDSを含むランニングゲルでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)(Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685)を行って、タンパク質を分析した。セミネイティブSDS−PAGEのため、ランニング及びスタッキングゲルにSDSを添加することはなく、電気泳動に先立って試料を加熱することもなかった。4%のスタッキングゲルで、試料を13%のポリアクリルアミドゲルに塗布し、150Vで電気泳動にかけた。セミネイティブSDS−PAGEのため、電気泳動は氷上で15mAの定電流で行われた。クーマシーブリリアントブルーでタンパク質を染色した。前染色した、又は無染色の、Bio-Rad社製Precision Plus Proteina Standardを使用して、相対分子量(Mr)を測定した。
LPS含有試料に対して、0.5mg/mlのプロテイナーゼK(最終濃度)を試料緩衝液に添加した(Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685)。55℃で60分間、続いて、95℃で10分間、試料をインキュベーションして、プロテイナーゼKを不活性化した。次いで、試料緩衝液を添加して試料を10倍に希釈し、その後、2μlの試料をトリシン−SDS−PAGEゲルに塗布した(Lesse, A. J., Campagnari, A. A., Bittner, W. E., and Apicella, M. A. (1990) J. Immunol. Methods 126, 109-117)。35Vでブロモフェノールブルーを分離ゲルに流し込み、その後、電圧を105Vに上げた。最前部がゲルの底に到達した後、さらに45分間、試料を流れるままに放置した。水/エタノール/酢酸を11:8:1(v/v/v)としたものの中でゲルを一晩固定し、その後、文献記載のように銀で染色した(Tsai, C. M., and Frasch, C. E. (1982) Anal. Biochem. 119, 115-119)。
抗体の作製のため、pPagL(Pa)(-)を用いて大腸菌BL21StarTM(DE3)を形質転換し、切断されたpagL遺伝子の発現を可能にした。封入体中に蓄積しているPagL(Pa)タンパク質を単離し(Dekker, N., Merck, K., Tommassen, J., and Verheij, H. M. (1995) Eur. J. Biochem. 232, 214-219)、分取SDS−PAGEゲルから精製し、Eurogentec社でのモルモットの免疫付与に使用した。
Bio-Rad Mini-PROTEAN(登録商標)2ブロッティング装置を用いて、SDS−PAGEゲルから、192mMのグリシン、25mMのTris(pH8.3)、10%のメタノール(v/v)中のImmobilona-P二フッ化ポリビニリデン膜(Millipore Corp.社製)に、タンパク質を100Vで1時間転写した。転写後、蒸留水で膜を15分間、3回洗浄した。転写したタンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色した。膜を風乾し、推定PagLバンドを切り取って、オランダ国ユトレヒト大学のシークエンシングセンター施設で、マイクロシークエンシングにかけた。
熱フェノール/水抽出法を用いて、LPSを単離した(Steeghs, L., Berns, M., ten Hove, J., de Jong, A., Roholl, P., van Alphen, L., Tommassen, J., and van der Ley, P. (2002) Cell. Microbiol. 4, 599-611)。すなわち、プラスミドpMMB67EH-PagL(Bb)をもつ又はもたない百日咳菌株Tohamaを、1mMのIPTG(最終濃度)の存在下で、3リットルのThijs培地(Thalen, M., van den IJssel, J., Jiskoot, W., Zomer, B., Roholl, P., de Gooijer, C., Beuvery, C., and Trampen, J. (1999) J.Biotechnol. 75, 147-159)中で増殖させた。遠心分離により細胞を回収し、5mMのEDTAを含む40mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中に再懸濁した。細胞をリゾチームで4℃にて一晩処理し、その後、等量のフェノールを添加した。懸濁液を70℃まで加熱し、震盪しながら30分間インキュベーションした。懸濁液を10℃まで冷却した後、遠心分離により相を分離した。上部相を回収し、下部相に等量の蒸留水を添加することにより、抽出を繰り返した。続いて70℃でのインキュベーション、冷却、及び遠心分離を行った後、2つの上部相を混合し、フェノール臭が消えるまで、水道水で透析した。透析した画分を凍結乾燥させた後、LPSを濃度1mg/mlでリン酸緩衝生理食塩水(pH7.2)中に溶解させた。GC/MSによる脂肪酸分析のため、単離したLPSのアリコートに5倍(v/v)を超えるアセトンを添加し、その後、溶液を窒素流下で60℃にて乾燥させた。続いて、塩化アセチル/エタノールを1:9(v/v)としたもの100μl、及び、内部標準として10μgのC12:0(2OH)(エタノール中で1mg/ml)を添加し、その後で試料を90℃で1時間誘導体化した。冷却後、1MのK2HPO4(pH8.0)を200μl添加することにより反応を停止させ、引き続いて、200μlの酢酸エチルでアシル−エチルエステルを抽出した。1μl量の上部相を、電子衝撃モードのFinnigan MAT SSQでのGC/MSによる分析に使用した。
野生型百日咳菌TohamaLPS及びPagL修飾百日咳菌TohamaLPSによるIL−6及びIL−10の誘導について、ヒトマクロファージ細胞株MM6(Ziegler-Heitbrock, H. W., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) J. Cancer 41, 456-461)でテストを行った。マイクロタイタープレート(2.105/ウェル)において、10%のウシ胎仔血清(Gibco BRL社製)を補充した400μlのIMDM(Gibco BRL社製)中にMM6細胞を播種し、5%のCO2を含む湿潤雰囲気中で16〜18時間、37℃にて、LPS原液の連続希釈液200μlで刺激した。製造者の指示にしたがい、ヒトIL−6又はIL−10に対するELISAで、培養上清液のIL−6及びIL−10のレベルを定量した(PeliPairTM試薬セット、Sanquin Reagents社製、オランダ国、アムステルダム)。
1,500×gで10分間の遠心分離により細胞を回収し、0.9%の塩化ナトリウムの冷溶液50mlで1回洗浄した。細胞ペレットを−80℃で少なくとも15分間凍結した後、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche社製)を含む、3mMのEDTA及び10mMのTris−HCl(pH8.0)20mlに懸濁した。超音波処理で細胞を破壊した後、破壊されなかった細胞を、1,500×gで10分間の遠心分離により除去した。150,000×gで1.5時間の遠心分離により、上清液から細胞外皮をペレット化し、2mMのTris−HCl(pH7.4)に再懸濁した。細胞外皮をアリコートの形で−80℃にて保管した。
封入体の単離のため、大腸菌BL21StarTM(DE3)中でpPagL(Pa)(-)からPagL(Pa)(-)を発現させた(表1)。アンピシリンを補充したLB培地において、OD600が0.4〜0.6になるまで、2リットルの培養物を37℃で増殖させた。次いで、1mMのIPTG(最終濃度)を培養物に添加して、組換え遺伝子の発現を誘導し、その後、培養物を震盪しながら37℃でさらにインキュベーションした。約4時間後、遠心分離(4000rpmで15分間(4℃))により、細胞を回収した。回収した細胞を400mlの0.9%NaClで1回洗浄した後、80mlのTE50:40(50mMのTris−HCl(pH8.0)、40mMのEDTA)に再懸濁した。スクロース(0.25g/ml(最終濃度))及びリゾチーム(0.2mg/ml(最終濃度))を添加し、その後、懸濁液を震盪しながら室温(RT)で30分間インキュベーションした。Branson 250 Sonfierをマクロチップとともに用いて(出力9、デューティーサイクル50%)、懸濁液を氷上で3回超音波処理した(1.5分間、間に2分間の休止をはさむ)。超音波処理に続いて、0.13%(w/v)のBrij-35P(Fluka社製)を添加し、懸濁液をさらに2分間超音波処理した。4,000rpm(4℃)で2時間の遠心分離により高密度物質(封入体)を回収した後、ペレットを40mlのTE50:40で1回洗浄し、引き続いて、10mMのTris−HCl(pH8.3)を40ml用いてさらなる洗浄工程を行った。得られた封入体を、10mMのグリシン(pH8.3)を補充した8Mの尿素中で可溶化し、TCAで析出させた。最後に、得られたタンパク質を、10mMのグリシン(pH8.3)を補充した8Mの尿素中で、タンパク質濃度10mg/mlで可溶化した。この混合物を13,000rpmで2時間の遠心分離にかけ、残留する不溶性物質及び膜を除去した。
10%(w/v)のラウリルジメチルアミン酸化物(LDAO)による10mg/mlのタンパク質溶液(上記参照)の2倍希釈、及びその後の10分間の超音波処理により、PagL(Pa)(-)のリフォールディングをインビトロで行った。リフォールディングされたPagL(Pa)(-)を、1mlのMonoQ(Amersham Biosiences社製)イオン交換カラムを用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)により精製した。緩衝液A(20mMのTris−HCl(pH8.0)、0.08%(w/v)のC10E5)で、タンパク質溶液を4倍希釈した。緩衝液Aで前平衡化し、緩衝液Aで1回洗浄したカラムにかかる溶液を充填し、緩衝液A中のNaClが0〜1Mとなるように直線的濃度勾配をかけてタンパク質の溶出を行った。リフォールディングされたPagL(Pa)(-)タンパク質の有無について、画分をSDS−PAGEで分析した。かかるタンパク質を含有するものをプールし、分子量カットオフ値が3kDaのCentricon濃縮器(Amicon社製)を使用して、タンパク質濃度10mg/mlまで濃縮した。その後、分子量カットオフ値が3.5kDaの膜を使用して、10mlの、2mMのTris−HCl(pH8.0)、0.06%(w/v)のC10E5で、タンパク質溶液の透析を一晩3回行った。
リフォールディングされたPagL(Pa)(-)(10mg/ml)、又は空のベクターpET-11a若しくはpPagLプラスミドを含む大腸菌BL21StarTM(DE3)から単離した細胞外皮を、再蒸留水で10倍に希釈した。リフォールディングされたタンパク質又は細胞外皮の希釈液を、最終的な量としては10μlの、50mMのHepes(pH8.0)、0.1%のTriton X-100、0.5MのNaCl、及び0.75nmolの髄膜炎菌L3−LPS中で、37℃にて16時間インキュベーションした。反応が二価陽イオンに依存するかどうかをテストするため、リフォールディングされたPagL(Pa)(-)を用いた反応には5mMのEDTAを添加した。試料緩衝液中での煮沸により反応を終了させ(Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685)、その後、試料を0.5mg/mlのプロテイナーゼKで1時間、55℃にて処理し、引き続いて、95℃で10分間のインキュベーションを行った。試料緩衝液を添加して試料を25倍に希釈した後、2μlの試料をトリシン−SDS−PAGEで分析した(上記参照)。
熱フェノール/水抽出法(Westphal and Jann, Methods Carbohydr. Chem. 5; 83-91,1965)をわずかに改変した方法を用いて、LPSを単離した。すなわち、1mMのIPTG(最終濃度)の存在下で、細菌をTHIJS培地中で64時間増殖させた。遠心分離により細胞を回収し、5mMのEDTAを含む40mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中に懸濁した。細胞をリゾチームで4℃にて一晩処理し、その後、等量のフェノールを添加した。懸濁液を70℃まで加熱し、震盪しながら30分間インキュベーションを行った後、懸濁液を10℃まで冷却し、その後、8,000×gで10分間の遠心分離により相を分離した。上部相を回収し、下部相に等量の蒸留水を添加することにより、抽出を繰り返した。2つの上部相を組み合わせ、フェノール臭が消えるまで水道水で透析し、凍結乾燥させ、その後、蒸留水に入れた。続いて、150,000×gで3時間の遠心分離によりLPSをペレット化し、蒸留水に溶解した後、文献(Welch, Clin. Microbiol. Rev. 1991)記載の通り、6890 Agilentガスクロマトグラフを用いて3−ヒドロキシテトラデカン酸の含有量を分析することにより、LPS濃度を測定した。ESI−MSのため、単離したLPS(50nmol/ml)のアリコート200μlを凍結乾燥させ、2%の酢酸0.1mlに入れた。混合物を95℃で2時間加熱して、LPSを加水分解し、リピドA部分を放出させた。続いて、混合物を室温まで冷却し、16,100×gで10分間の遠心分離を行った。0.1mlの再蒸留水でペレットを2回洗浄し、0.1mlの再蒸留水に入れ、0.3mlのクロロホルム/メタノール(2:1、v/v)を添加した。激しくボルテックスした後、16,100×gで10分間の遠心分離により相を分離した。その後、上部相を、陰イオンモードのFinnigan LCQでのナノエレクトロスプレータンデムMSによる精製リピドAの構造分析に使用した(Wilm and Mann, Anal. Chem. 1996)。
NCBIのデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)に存在するグラム陰性菌の解読(completed)ゲノム及び未解読(unfinished)ゲノムのすべてを検索することにより、ネズミチフス菌PagL前駆タンパク質の187アミノ酸配列(GenBankアクセッション番号AAL21147、配列番号17)を手がかりとして使用し、他のグラム陰性菌における推定PagL相同体を同定した。BLAST検索(Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410)により、ボルデテラ菌種の、百日咳菌、気管支敗血症菌、及びパラ百日咳菌における推定相同体の存在が明らかになった(図2)。気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌のPagL相同体は、シグナルPサーバー(signalP server)により予測されていたように(Nielsen, H., Brunak, S., and von Heijne, G. (1999) Protein Eng. 12, 3-9)、25個のアミノ酸からなるN末端シグナルペプチドをもつ、178個のアミノ酸からなる、お互いに一致する2つのポリペプチドである(図2)。PagL相同体の遺伝子も百日咳菌株Tohama Iのゲノム中で発見されている(Parkhill, J., Sebaihia, M., Preston, A., Murphy, L. D., Thomson, N., Harris, D. E., Holden, M. T., Churcher, C. M., Bentley, S. D., Mungall, K. L., Cerdeno-Tarraga, A. M., Temple, L., James, K., Harris, B., Quail, M. A., Achtman, M., Atkin, R., Baker, S., Basham, D., Bason, N., Cherevach, I., Chillingworth, T., Collins, M., Cronin, A., Davis, P., Doggett, J., Feltwell, T., Goble, A., Hamlin, N., Hauser, H., Holroyd, S., Jagels, K., Leather, S., Moule, S., Norberczak, H., O'Neil, S., Ormond, D., Price, C., Rabbinowitsch, E., Rutter, S., Sanders, M., Saunders, D., Seeger, K., Sharp, S., Simmonds, M., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Stevens, K., Unwin, L., Whitehead, S., Barrell, B. G., and Maskell, D. J. (2003) Nat. Genet. 35, 32-40)が、このオープンリーディングフレーム(ORF)はフレームシフト(配列番号4)により破壊されており、こうした破壊を配列番号5のように修復して、配列番号1のようにタンパク質をコードすることが可能な場合もある。百日咳菌B509株及びB134株由来のPagLORFのヌクレオチドシークエンシングでも、同じフレームシフト2の存在が示されており、このことは、PagLORFの破壊は百日咳菌株における共通の特徴であるという可能性を示している。新規に同定された気管支敗血症菌のPagL相同体をさらなるBLAST分析のプローブとして用いて、別の推定PagL相同体を、以下のゲノム中で同定することができた:緑膿菌(配列番号6、30%の同一性)、シュードモナスフルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)(配列番号7、29%の同一性)、シュードモナス シリンゲ(Pseudomonas syringae)(配列番号8、31%の同一性)、シュードモナスプチダ(Pseudomonas putida)、2x(配列番号9+10、32/33%)、ラルストニア メタリデュランス(Ralstonia metallidurans)(配列番号15、28%)、青枯病菌(Ralstonia solanacearum)(配列番号16、29%)、鼻疽菌(Burkholderia mallei)(配列番号12、28%)、類鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei)(配列番号13、28%)、バークホルデリア ファンゴラム(Burkholderia fungorum)(配列番号11、29%)、及びアゾトバクター ビネランジー(Azotobacter vinelandii)(配列番号14、27%)。図2に、アラインメントを示す。総合して、ネズミチフス菌に対する同一性(24%の同一性)よりは高いとはいえ、いずれのPagL相同体も、相互間の配列同一性として全体的に低い数値を示したが、C末端付近にはっきりとした相同ドメインを含んでいた。本発明者らによるこの保存モチーフの発見によって、他の(細菌)種におけるPagL相同体の同定が可能となり、また、3−O−脱アシル化されるあらゆる宿主細菌及び/又はあらゆるLPSに対して、適切なPagL相同体の使用が可能となる。
推定リピドA脱アシル化酵素活性を実証するため、本発明者らは、緑膿菌のPagL相同体(pagL(Pa))及び気管支敗血症菌のPagL相同体(pagL(Bb))のクローニングを行った。本発明者らにより、pagL(St)も参考用としてこれらの研究に含められた。これらのpagL遺伝子をPCRにより染色体から増幅し、最終的にはT7プロモーターの制御下でpET-11aにクローニングした結果、pPagL(Pa)プラスミド、pPagL(Bb)プラスミド、及びpPagL(St)プラスミドが得られた。
クローニングしたPagL相同体が大腸菌LPSに対して活性を示すかどうかを研究するため、空のベクターpET-11a又はpPagLプラスミドを含む対数増殖期の大腸菌BL21StarTM(DE3)細胞にIPTGを添加し、各種インキュベーション期間の後で、OD600が1ユニットに相当する試料を回収し、そのLPS含有量をトリシン−SDS−PAGEで分析した。リピドAの3位におけるR−ヒドロキシミリスチン酸の予測された加水分解にしたがって、3つのPagL相同体のいずれかの発現が、より電気泳動移動度の高い形態へとLPSを変換した(図4)。そうした変換は、PagL(Pa)又はPagL(Bb)が誘導されてから75分以内にほぼ完了したが、PagL(St)の場合は、それよりもやや長い時間がかかった。
これらの実験の過程において、PagLの長期発現後は、PagL修飾LPSがトリシン−SDS−PAGEゲル上で検出できなくなること、及び、PagL(Bb)発現株について図示したように、LPSが、野生型LPSの位置に再び移動することが観察された(図7A)。SDS−PAGEゲル上で明らかとなったように、PagLタンパク質は、この時点で依然として豊富に存在していた(データは図示せず)。また、GC/MSによる分析で、C14:0/C14:0(3OH)比が、5時間にわたるPagL(Bb)の誘導後に単離したLPSについては、二度と低下しなかったことが明らかになった(図7B)。このように、トリシン−SDS−PAGEゲル上で観察された二次修飾(図7A)は、PagL修飾の修復の結果ではなく、電気泳動移動度を、野生型LPSの電気泳動移動度へと修復した別の修飾の結果であった。そのため、他の脂肪酸比を比較してみた。PagLの産生を5時間にわたって誘導した細胞のLPSにおいて、C16:0/C14:0比の著しい増大が認められ、PagLで脱アシル化したLPSが、その後パルミトイル化されたことが示唆された。
同定したPagL相同体相互間の配列同一性は、非常に低い(図2)。完全に保存された数個の残基のなかにヒスチジンとセリンがあり、本発明者らは、これらはセリン加水分解酵素の「古典的」Asp/Glu−His−Ser触媒3残基(catalytic triad)の一部ではないかとの仮説を立てている。これらの推定活性部位残基は、本発明者らが提案した位相モデルのβ鎖の頂点付近にある脂質露出側に位置している(図8)。外膜ホスホリパーゼAにおいて、活性部位His及び及びSerが同様の位置にあることは、興味深い(Snijder, H. J., Ubarretxena-Belandia, I., Blaauw, M., Kalk, K. H., Verheij, H. M., Egmond, M. R., Dekker, N., and Dijkstra, B. W. (1999) Nature 401, 717-721)。PagL(Pa)前駆タンパク質の149位と151位にそれぞれ位置するこれらの残基が実際に触媒活性に重要であるかどうかをテストするため、それらをアラニン又はアスパラギンで、及びアラニン又はシステインで、それぞれ置換した。コントロールとして、PagL(Pa)前駆体の81位と84位にれぞれ位置する非保存ヒスチジン及びセリン残基に対して同じ置換を行った。関連するプラスミドを有しIPTGで75分間誘導した大腸菌BL21StarTM(DE3)細胞のタンパク質及びLPSプロフィールを、イムノブロッティング(図9A)及びトリシン−SDS−PAGE(図9B)でそれぞれ分析した。非保存His81及びSer84の置換がLPSの脱アシル化に影響しなかったのに対し、保存されたHis149及びSer151が置換された場合は、これらの変異タンパク質の発現が影響を受けなかった場合でさえも(図9A)、LPSの脱アシル化は、もはや観察されなかった(図9B)。これらの結果は、前駆PagL(Pa)タンパク質の149位にある保存されたヒスチジン及び151位にあるセリンは活性部位残基であり、PagLはセリン加水分解酵素として機械的に機能するという仮説を、強く裏付けるものである。
百日咳菌LPSをインビボで修飾するため、本発明者らは、気管支敗血症菌のpagL遺伝子(pagL(Bb))をクローニングした。pagL遺伝子をPCRにより染色体から増幅し、最終的にはTacプロモーターの制御下でpMMB67EHにクローニングした。その結果、pMMB67EH-PagL(Bb)プラスミドが得られ、結合によってこれを百日咳菌株Tohamaへ移し替えた。
PagL修飾百日咳菌LPS及び野生型百日咳菌LPSの内毒素活性を査定するため、それらのLPSの、ヒトマクロファージ細胞株MM6におけるIL−6及びIL−10の産生を刺激する能力を測定した。図2からわかるように、野生型LPSに関しては、MM6細胞によるIL−6(図11A)及びIL−10(図11B)の産生は、等量のPagL修飾LPSで細胞を刺激した場合と比較して、いずれも増加した。したがって、PagLによる百日咳菌LPSのインビボでの脱アシル化の結果、このLPSの内毒素活性が低下すると結論づけることができる。
シグナル配列コード部分をもたない緑膿菌PAO25由来のPagL遺伝子をpET-11aにクローニングし、結果としてpPagL(Pa)(-)プラスミドを得た。封入体を得るため、シグナル配列をもたないPagLを大腸菌BL21StarTM(DE3)中で発現させた。封入体を単離して尿素中で可溶化し、その後、10%のラウリルジメチルアミン酸化物(LDAO)で2倍に希釈することによりタンパク質をリフォールディングし、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)でさらに精製した。SDS−PAGE(図12)及び円偏光二色性(CD)測定(データは図示せず)で正しいリフォールディングを確認した。SDS−PAGEゲル上では、リフォールディングされたタンパク質は変性型よりも電気泳動移動度が低かったのに対し、CD測定では、リフォールディングされたタンパク質の大部分がβシート構造を有することが示された。
膜局在PagL又はインビトロでリフォールディングされたPagLが外部から付加されたLPSをインビトロで修飾できるかどうかをテストするため、本発明者らは、リフォールディングされたPagL(Pa)(-)、又は空のベクターpET-11a若しくはpPagLプラスミドを含む大腸菌BL21StarTM(DE3)から単離した細胞外皮に対し、髄膜炎菌の精製LPSとともにインキュベーションを行った。LPSの修飾をトリシン−SDS−PAGEで査定した(図13)。リピドAの3位におけるR−ヒドロキシミリスチン酸の予測された加水分解にしたがって、膜局在PagL(図13A)又はリフォールディングされたPagL(Pa)(-)(図13B)の存在時は、LPSがより電気泳動移動度の高い形態へと変換された。LPSの脱アシル化が5mMのEDTAの存在下でも依然として観察されたことから、リフォールディングされたPagL(Pa)(-)を用いた反応は、二価陽イオンの存在に依存していなかったことになる(図13B)。
PagP及びPagLを百日咳菌株Tohamaで発現させるため、宿主範囲が広範な低コピー数発現ベクターpMMB67EHから、気管支敗血症菌のPagL遺伝子(pagL(Bb))及び百日咳菌のPagP遺伝子(pagP(Bb))を発現させた。コントロールとして、大腸菌のPagP遺伝子(pagP(Ec))を発現する株も構築した。野生型、PagP発現又はPagL発現百日咳菌株TohamaからLPSを単離し、トリシン−SDS−PAGEで分析した。PagL(Bb)発現株から単離したLPSは、ゲル上で全く影響を受けていないように見受けられたのに対し、PagP発現株由来のLPSは、強く修飾されているように見受けられた。というのは、野生型百日咳菌LPSのものよりも電気泳動移動度が低いバンドが検出されたためである(図14)。また、PagP(Bb)発現株との比較では、PagP(Ec)発現株のほうが修飾効率が高いように見受けられた(図14)。考えられるLPS修飾をより詳しく評価するため、菌株のリピドA部分をESI−MSで陰イオンモードにて分析した。この分析により、野生型LPSにおいて、4つの主要なリピドA種の存在が明らかになった(図15A)。m/z1557のピークは、百日咳菌に一般に見られる特徴的なペンタアシル化ビスリン酸種を示す(Caroff et al., Microbes. Infect., 1994)のに対し、m/z1477のピークは、ペンタアシル化モノリン酸種に相当する。m/z1307及び1251における残りの2つのピークは、それぞれ、3位の一次3−ヒドロキシデカン酸残基又は(2位若しくは3’位のいずれかの)一次3−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失している、m/z1477の分子イオンの脱アシル化リピドA種を示す。これらの結果は、野生型百日咳菌のリピドA種間における異質性の高さを示すものであり、これについては、このゲル分析ではっきりとは解明されなかった(図14)。興味深いことに、個々のリピドA種の相対量を相当するピークの高さから計算することにより、野生型百日咳菌LPSでは、大量のリピドA種(〜50%)が、テトラアシル化型からなることが明らかになった。また、リピドA種の大多数は、モノリン酸型である(〜80%)。低アシル化(under-acylated)又は次リン酸化リピドA種の存在度の高さが、リピドA種を単離する場合に用いる加水分解手順の人為的影響であるという可能性を排除するため、本発明者らは、加水分解時間の長短(1〜4時間まで様々である)がリピドA種の相対存在度に影響を及ぼすかどうかをテストしたが、そうした事実はなかった(データは図示せず)。さらに、精製した野生型百日咳菌LPSの濃度がわかっている溶液について、その全リン酸含有量を測定した。ESI−MSで検出されたモノリン酸リピドA種の高い陽性率と矛盾することなく、LPSが完全にリン酸化されていた場合は、予測されたリン酸含有量の半分をわずかに超える程度の量が検出されるにとどまった(データは図示せず)。
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Claims (18)
- 配列番号1に対して少なくとも25%のアミノ酸同一性を示し、リピドA3−O−脱アシル化酵素活性を示すポリペプチド。
- 配列番号1記載のアミノ酸配列を示すポリペプチド。
- 請求項1又は2に定義したアミノ酸配列を備えたポリペプチドをコードするDNA配列。
- 請求項3記載のDNA配列を含むDNAベクター。
- ポリペプチドをコードするDNA配列が、転写調節配列に作用可能な状態で結合している、請求項4記載のDNAベクター。
- 請求項1又は2記載のポリペプチドに結合可能な抗体。
- 請求項4又は5記載のDNAベクターを含むグラム陰性菌。
- 請求項1又は2記載のポリペプチドをコードするDNA配列を含む百日咳菌。
- その外膜に、部分的又は完全に3−O−脱アシル化されたリポ多糖(LPS)種を含む、請求項8記載の百日咳菌。
- その外膜に、パルミトイル化LPSを含む、請求項9記載の百日咳菌。
- 部分的に3−O−脱アシル化されたLPSを製造する方法であって、3−O−脱アシル化LPSの合成、及び、任意で、3−O−脱アシル化LPSの回収を促進する条件下で、請求項7〜10に定義した細菌を培養するステップを含む方法。
- 少なくとも部分的に3−O−脱アシル化されたLPSを含むボルデテラ菌種から入手可能なLPSを含む組成物。
- ボルデテラ感染症、好ましくは百日咳菌感染症の治療薬又は予防薬を製造するための、請求項7〜10記載の細菌の使用。
- ボルデテラ感染症の治療薬又は予防薬を製造するための、少なくとも部分的に3−O−脱アシル化されたLPSを含む単離されたボルデテラLPSの使用。
- 請求項7〜10のいずれか記載の細菌を含む全細胞ワクチン。
- 請求項12記載の組成物を含む無細胞ワクチン。
- グラム陰性LPS又はグラム陰性LPSを含む組成物を脱アシル化するためのインビトロ法であって、グラム陰性LPSの、酵素による脱アシル化を促進する条件下で、前記LPS又は前記組成物を請求項1記載のポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
- ボルデテラに対する免疫応答を引き起こす方法であって、ボルデテラ菌種由来の3−O−脱アシル化リピドA、3−O−脱アシル化LPS、又はパルミトイル化LPSのソースを、対象に投与することを含む方法。
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