ES2493440T3 - Desacilación de LPS en bacterias Gram negativas - Google Patents

Abstract

Bacteria de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis o Bordetella bronchiseptica o bacteria de la especies de Neisseria que comprende un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido con al menos 95% identidad de secuencia de aminoácidos con SEC I D nº: 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos confiere un aumento en la actividad de la 3-O-deacilasa del lípido A en comparación con la bacteria de tipo salvaje.

Description

Desacilación de LPS en bacterias Gram negativas

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere al área de la microbiología, en particular la biología de síntesis y modificación de los LPS (lipopolisacáridos) de bacterias Gram negativas. La invención también se refiere al campo de la medicina, en particular al campo de la vacunación contra patógenos bacterianos. La presente invención además se refiere a bacterias Gram negativas, lipopolisacáridos bacterianos de Gram negativas (LPS) y composiciones que constan de LPS, que pueden usarse con fines farmacéuticos y/o veterinarios, en particular para la preparación de vacunas contra Gram negativas tal como Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica. La invención además dispone vacunas que constan de LPS desacetilados, y el uso de LPS modificados y detoxificados en la preparación de vacunas de células enteras y vacunas acelulares.

Antecedentes de la invención

[0002] La infección por Bordetella pertussis es un agente causante de tos ferina, con un número estimado de 60 millones de casos cada año, causando la muerte de aproximadamente 355.000 personas a nivel mundial cada año (OMS), en particular niños e individuos con sistemas inmunitarios comprometidos. Aunque se encuentra disponible el tratamiento con antibióticos (eritromicina), para cuando la enfermedad es diagnosticada, frecuentemente las toxinas bacterianas han causado daños severos. La prevención de la enfermedad es, por lo tanto, de gran importancia. Uno de los principales medios de control es la vacunación. De forma convencional, las vacunas contra las infecciones de pertussis ("tos ferina") se han basado en células enteras de B. pertussis. Las vacunas de células enteras de Bordetella pertussis, que comprenden bacterias enteras matadas por tratamiento térmico, formalina u otros medios, han sido incluidas en programas generales de vacunación desde principios de los años 50.

[0003] La inmunización con la vacuna de células enteras de pertussis, a la vez que resulta eficaz en la prevención de la tos ferina en bebés, se ha asociado con reacciones neurológicas, locales y sistémicas, incluyendo fiebre, convulsiones y encefalopatía en niños. Los LPS son responsables de la mayor parte de las reacciones adversas en niños tras la inmunización de pertussis. Cuando se producen infecciones bacterianas en animales, los LPS o su fracción de lípido A activan el sistema inmunológico innato mediante la interacción con receptores de tipo Toll, principalmente mediante TLR

4. La respuesta del infectado para lípidos A menudo incluye la producción de péptidos antimicrobianos catiónicos, citocinas, quimiocinas y moléculas inmunoestimuladoras adicionales. En algunas infecciones, la respuesta del lípido A ayuda a alejar a la bacteria, pero en sepsis incontrolables, los altos niveles de citocinas circulantes y la actividad que favorece la coagulación pueden dañar la microvasculatura y precipitar el síndrome de shock séptico por Gram negativas con coagulación intravascular diseminada.

[0004] No hay pruebas concluyentes disponibles acerca del papel de protección que los LPS juegan en las vacunas de pertussis, sin embargo los experimentos de inmunización pasiva en ratones han demostrado que los anticuerpos contra LPS pueden conferir un nivel de protección. Además y de forma más importante, la presencia de LPS en una vacuna no obstante proporciona actividad adyuvante para aumentar la respuesta inmune contra otros antígenos (K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001).

[0005] El interés sobre la seguridad ha afectado inversamente al entendimiento de la vacuna y ha motivado el desarrollo de vacunas de pertussis acelulares, preparadas con antígenos altamente purificados de B. pertussis. En los últimos años, además de las denominadas "vacunas de células enteras" o "VCEs", también las vacunas acelulares o "VACs" han sido ahora introducidas en diferentes países.

[0006] Las vacunas acelulares normalmente comprenden de 1 a 3 o más antígenos del organismo patógeno. En el caso de los antígenos de B. pertussis comúnmente se utilizan los siguientes: toxina de pertussis (PT, normalmente tratada para la destrucción de su toxicidad al mismo tiempo que logra retener la inmunogenicidad), hemaglutinina filamentosa (FHA), fimbrias, y la proteína 69kD o pertactina (Pm). En general, la reactogenicidad de las vacunas acelulares es muy inferior a la reactogenicidad de las vacuna de célula enteras. Las vacunas acelulares se asocian con una frecuencia significativamente reducida de reacciones sistémicas (fiebre, vómitos, irritabilidad, anorexia) y reacciones locales (inflamación, rojez, calor, sensibilidad, rigidez, dolor). No obstante, los datos clínicos son todavía controvertidos en cuanto a si la inmunidad protectora de las vacunas acelulares se combina con el efecto protector de las vacunas de células enteras. En muchos estudios el efecto protector de las vacunas de células enteras resulta ser superior y en la actualidad se mantiene un debate sobre si esto pesa más que los riesgos de los raros pero graves efectos adversos de las vacunas de células enteras en bebés. Actualmente se han evaluado varios esquemas de inmunización, donde se dan hasta seis dosis de vacuna acelular. La vacuna de células enteras fue dada inicialmente 5 veces, incorporada al calendario rutinario de vacunas rutinario con la última dosis adicional dándose entre los 4 y 6 años de edad. Se

recomienda ahora que la vacuna acelular de pertussis se de 6 veces incluyendo una última dosis (combinada con la vacuna del tétanos-difteria) durante la pubertad. La vacuna acelular parece ser más segura que la vacuna de células enteras, pero ambas no deberían darse en niños con reacciones alérgicas previas a la vacuna de pertussis.

[0007] Los efectos secundarios adversos de las vacunas de células enteras de pertussis han sido bien documentados en la técnica (ver: S.H. Yeh: persistent pathogen, imperfect vaccines. Expert Rev. Vaccines 2: 113-127 (2003 ). Aunque las vacunas acelulares son usadas actualmente en parte para superar estos efectos secundarios adversos, la inmunidad protectora proporcionada por las mismas sigue resultando controvertida y deja mucho espacio para su mejora. En un modelo con ratones se encontró de forma significativa una protección superior a largo plazo con células enteras en comparación con las vacunas acelulares (K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001 )). Por otra parte, las vacunas acelulares son más costosas y más difíciles de producir, requiriendo aislamiento, una extensa purificación y control de calidad de varios antígenos y su mezcla y formulación en las cantidades óptimas / deseadas. Claramente existe una gran necesidad de mejora de las vacunas contra B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica y otras bacterias Gram negativas.

Descripción detallada de la invención

[0008] La presente invención proporciona métodos y medios para la preparación de vacunas mejoradas contra pertussis. La invención divulga nuevas proteínas de Bordetella. Estas nuevas proteínas de B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica y moléculas de ADN que codifican estas proteínas se usan de acuerdo con la invención con el fin de modificar el lípido A y así proporcionar nuevas cepas bacterinas de B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica y otras células bacterianas Gram negativas, constando de al menos LPS detoxificados y 3-O-desacetilados parcialmente. La presente invención también proporciona composiciones mejoradas para la vacunación, constando de células bacterianas de especies de Bordetella que comprenden LPS 3-O-desacetilados parcialmente, composiciones farmacéuticas que comprenden LPS aislados y al menos LPS parcialmente 3-O-desacetilados o LPS 3-O-desacetilados in vitro. La divulgación además proporciona anticuerpos específicos y dirigidos contra el lípido A 3-O-desacetilado y/o moléculas de LPS.

[0009] Los lipopolisacáridos (LPS), componentes principales de la membrana bacteriana externa de Gram negativa, son conocidos por su importancia en el funcionamiento de dicha membrana como barrera de permeabilidad y por su resistencia contra la lisis complementada y mediada por células (visto en 1). Consta de tres dominios covalentemente enlazados: el lípido A, el núcleo, y el antígeno O. El lípido A forma el anclaje de la membrana hidrofóbica y es el responsable de la actividad endotóxica de los LPS. En Escherichia coli, consta de un disacárido de glucosamina 1,4'bifosforilado β-1,6-vinculado, que se sustituye con residuos de ácidos R-3-hidroximirísticos en las posiciones 2, 3, 2', y 3' por medio de éster o enlace amídico. Los grupos secundarios de lauroilo y miristoilo sustituyen al grupo hidroxilo de R-3hidroximiristoilo en las posiciones 2'y 3' respectivamente (Fig. 1A). Estudios precedentes han mostrado que los grupos de fosfato, el disacárido de glucosamina y el número y longitud correcto de las cadenas de acilo son importantes para la actividad biológica del lípido A (1, 2,3).

[0010] La estructura básica del lípido de A se conserva razonablemente bien entre bacterias Gram negativas, aunque se han observado ligeras variaciones en el patrón de las sustituciones de los dos fosfatos y en el número y longitud de la cadena de acilo (4,5). Las modificaciones adicionales del lípido A (Fig. 1B) se regulan en Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) por el sistema regulador de dos componentes PhoP/PhoQ (6,7). En respuesta a los bajos niveles de Mg2+, la quinasa del dominio sensor PhoQ fosforila y activa así el activador transcripcional PhoP, que lleva a la activación o represión de 40 genes diferentes (6,8). Un segundo sistema regulador implicado en la modificación del lípido A es el sistema de dos componentes PmrA/PmrB, que por sí mismo se regula mediante PhoP/PhoQ (9,10). Las mutaciones con alteraciones en el sistema PhoP/PhoQ muestran una virulencia reducida y una susceptibilidad aumentada a péptidos anti-microbianos (11,12). Se han identificado homólogos de los sistemas PhoP/PhoQ y PmrA/PmrB en otras bacterias Gram negativas, incluyendo E. coli, Yersinia pestis, y Pseudomonas aeruginosa (13,14).

[0011] Hasta la fecha, se han identificado varias enzimas modificadoras del lípido A. La sustitución de los grupos de fosfatos 1 y 4' con una o dos fracciones de 4-amino-4-deoxi-L-arabinosa (L-Ara4N) en S. Typhimurium resultó depender de la enzima ArnT (15). Recientemente, se ha identificado a la prometína PmrC como mediadora en la adición de fosfoetanolamina (pEtN) al lípido A en Salmonella enterica (16). Otra enzima, designada LpxO, cataliza la hidroxilación dependiente de O2 del lípido A (17), y una 1-fosfatasa de lípido se identificó en Rhizobium leguminosarum (18). Se considera que todas estas enzimas deben residir en la membrana interna o en el espacio periplásmico (15, 16, 17,18). Recientemente ha sido descubierta una nueva clase de enzimas modificantes del lípido A, localizadas en la membrana externa. Una de éstas es la palmitoiltransferasa PagP (19). La palmitoilación del lípido A conlleva un aumento de la resistencia a péptidos anti-microbianos catiónicos (7). Además, el lípido A palmitoilado provoca la activación inducida de LPS en células humanas (20). Se han encontrado homólogos de PagPs, entre otros, en S. Typhimurium, Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella Parapertussis, Legionella pneumophila, E. coli,y Y. pestis (19,21).

[0012] Otra enzima modificante del lípido A localizada en la membrana externa es la PagL 3-O-deacilasa (22). Esta enzima fue descubierta en S. Typhimurium y se mostró que hidroliza el enlace estérico en la posición 3 del lípido A, liberando así la fracción primaria de 3-hidroximiristoilo (22). Hasta el momento, no han podido encontrarse homólogas obvias de la PagL en las bases de datos de microbios no redundantes o inacabadas, excepto en las que se relacionan estrechamente con las especies de Salmonella typhi y Salmonella paratyphi (22). Sin embargo, otras bacterias Gram negativas, incluyendo P. aeruginosa (14), R. leguminosarum (23), Helicobacter pilori (24), y Porhyromonas gingivalis (25) contienen especies de lípidos A 3-O-desacetilados, lo que sugiere que estos organismos contienen enzimas con una actividad similar a la PagL.

[0013] La presente invención divulga la identificación de homólogos de PagL en una variedad de bacterias Gram negativas. Se usaron las similitudes de la secuencia limitada entre distintas proteínas y avanzadas herramientas de la bioinformática con el fin de identificar estos homólogos y sus residuos de sitio activo. En esta especificación, se describe la presencia y uso de homólogos de PagL para su expresión heteróloga en una variedad de bacterias Gram negativas. Aunque la similitud en general de la secuencia con genes de pagL conocidos procedentes de Salmonella spp. es más bien baja, puede distinguirse la conservación de un dominio de PagL en la región terminal C.

[0014] Las técnicas previas sólo describen las proteínas de PagL procedentes de Salmonella spp. y divulgan la expresión heteróloga de pagL solo en E. coli (22), dando como resultado LPS desacetilados. No hay datos disponibles en la técnica acerca de la presencia de homólogos de PagL en otras bacterias Gram negativas. La expresión de heterólogos de la PagL en otras bacterias Gram negativas, en caso de que la PagL sea funcional en otras Gram negativas, el efecto de la PagL en la composición de lípido A / LPS y la viabilidad bacteriana, toxicidad e inmunogenicidad en otras Gram negativas resultan ser todos ellos factores desconocidos. Sólo se encuentran disponibles datos limitados para expresiones heterólogas de PagL de Salmonella en E.coli, donde una respuesta TLR se midió en células que expresaban el receptor recombinante humano TLR4, lo cual no refleja una situación natural de infección por Gram negativas (Kawasaki et al., J Biol Chem. 2004).

[0015] La actual especificación divulga la actividad de los homólogos de Pagl de Pseudomonas aeruginosa y Bordetella bronchiseptica, lo que se confirmó sobre la expresión heteróloga en Escherichia coli y Bordetella spp., resultando en la eliminación de un grupo de R-3-hidroximiristoilo pertenecidiente al lípido A. El efecto en la actividad biológica de los LPS fue analizado con células macrófagas humanas. En cuanto a la desacilación por PagL, el lípido A de E. coli (pero no el lípido A de B. pertussis) fue sometido a otra modificación, la cual fue el resultado de la actividad de la palmitoil transferasa endógena de la PagP. Además, se identificó una pareja de histina-serina conservada como residuos de sitio activo, sugiriendo un mecanismo catalítico similar al de las hidrolasas de serina. Finalmente, se demuestra la actividad in vitro de la PagL en sustratos de LPS. La función biológica de la PagL puede aplicarse de acuerdo con la invención para modificar la patogenicidad, toxicidad e inmunogenicidad de Gram negativas. Esta modificación puede tener lugar en células bacterianas enteras o partes, fracciones o compuestos derivados de las mismas. La invención en última instancia proporciona nuevas vacunas contra las infecciones bacterianas de Gram negativas, constando de células enteras de bacterias Gram negativas de acuerdo con la invención o lípido A / LPS modificado obtenible y/o aislado de estas bacterias, o moléculas modificadas in vitro de LPS / lípido A.

Descripción detallada

Definiciones:

[0016] "Identidad de secuencia" se define en la presente como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptidos o proteínas) o dos o más secuencias de ácido nucleico (polinucleótidos), como se ha determinado mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también tiene el significado del grado de relación de la secuencia entre las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, como podría ser el caso, como se determina por la correspondencia entre las cadenas de tales secuencias. La "similaridad" entre dos secuencias de aminoácidos se determina por la comparación de la secuencia de aminoácido y los sustitutos del aminoácido conservado de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y la "similaridad" pueden calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo pero no limitándose a los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk,

A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988 ; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993 ; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994 ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987 ; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988 ).

[0017] Los métodos preferibles para determinar la identidad son diseñados para brindar la mayor correspondencia probada entre las secuencias. Los métodos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos con programas informáticos preferibles a la hora de determinar la

identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, por ejemplo, GCG program package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984 )), BestFit, BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403410 (1990). El programa BLAST X está disponible para el público en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894 ; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El conocido algoritmo de Smith Waterman también puede usarse para determinar la identidad.

[0018] Los parámetros preferibles para la comparación de secuencias polipeptídicas incluyen los siguientes: Algorithm: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970 ); Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU. 89:10915-10919 (1992); Penalización por Gap: 12; y longitud de la penalización por Gap: 4. Un programa útil con estos parámetros se encuentra disponible públicamente como el programa "Ogap" del Genetics Computer Group, ubicado en Madison, WI. Los parámetros ya mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para las comparaciones de aminoácidos (junto con la no penalización por gaps finales). Los parámetros preferibles para la comparación de ácido nucleico incluye los siguientes: Algorithm: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970 ); matriz de comparación: coincidencias=+10; no coincidencias=0; penalización de gap: 50; longitud de penalización del gap: 3. Disponible como el programa de gaps del Genetics Computer Group, localizado en Madison, Wisconsin. Los parámetros arriba mostrados son los parámetros por defecto para las comparaciones de ácido nucleico.

[0019] Opcionalmente, a la hora de determinar el grado de similitud de aminoácidos, el experto en la materia también puede tener en cuenta las sustituciones de los denominados aminoácidos "conservados", como se aclarará al experto en la materia. Las sustituciones de aminoácidos conservados se refieren a la intercambiabilidad de residuos con cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos con cadenas alifáticas laterales es el de glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos con cadenas alifáticas de hidroxilo laterales es serina y treonina; un grupo de aminoácidos con cadenas lateral que contiene amida es el de asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos con cadenas aromáticas laterales es el de fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales de ácidos es el de ácido aspártico y ácido glutámico y un grupo de aminoácidos con cadenas laterales de azufre es el de cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservados preferibles son: valina-leucina-isoleucina, fenilalaninatirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina. Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos aquí descritas son aquellas en las que al menos un residuo en las secuencias descritas ha sido eliminado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácido es conservativo. Las sustituciones conservativas preferibles para cada uno de los aminoácidos de origen natural son como se describen a continuación: Ala por ser; Arg por lys; Asn por gln o his; Asp por glu; Cys por ser o ala; Gln por asn; Glu por asp; Gly por pro; His por asn o gln; Ile por leu o val; Leu por ile o val; Lys por arg; gln o gln; Met por leu o ile; Phe por met, leu o tyr; Ser por thr; Thr por ser; Trp por tyr; Tyr por trp o phe; y Val por ile o leu.

[0020] Un segmento de ADN de acuerdo con la presente invención está "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otro segmento de ADN. Por ejemplo, un promotor o intensificador se encuentra operativamente enlazado a una secuencia codificante si éste estimula la transcripción de la secuencia. El ADN para una secuencia señal se encuentra operativamente enlazada al ADN que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido. Generalmente, las secuencias de ADN que están enlazadas operativamente son contiguas, y, en el caso de una secuencia señal, ambas son contiguas y se encuentran en fase de lectura. No obstante, los potenciadores necesitan no ser contiguos a las secuencias de codificación cuya transcripción controlan. El enlace se realiza por ligadura a sitios de restricción convenientes o a adaptadores o enlaces insertados en el lugar del mismo.

[0021] La selección de una secuencia promotora apropiada generalmente depende de la célula huésped seleccionada para la expresión del segmento de ADN. Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas incluyen a los promotores procarióticos y ucarióticos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y Russell, 2001, supra). Las secuencias reguladoras transcripcionales típicamente incluyen un promotor o intensificador heterólogo que es reconocido por el huésped. La selección de un promotor apropiado depende del huésped, pero se conocen y se encuentran disponibles promotores tales como trp, lac y promotores fago, promotores ARNt y promotores de enzima glucolítica (ver, por ejemplo Sambrook y Russell, 2001, supra). Los vectores de expresión incluyen el sistema de replicación y pueden emplearse secuencias reguladoras traslacionales y transcripcionales junto con el sitio de inserción para el segmento de codificación de polipéptidos. Ejemplos de combinaciones factibles de líneas celulares y vectores de expresión son los descritos en Sambrook y Russell (2001; supra) y en Metzger et al. (1988) Naturaleza 334: 31-36. Por ejemplo, pueden expresarse vectores de expresión adecuados en levadura, por ejemplo S.cerevisiae, células de insecto, por ejemplo, células Sf9, células de mamíferos, por ejemplo, células CHO y células bacterianas, por ejemplo, E. coli o Bordetella spp.

[0022] En una primera forma de realización, la divulgación actual proporciona nuevos polipéptidos que comprenden actividad de 3-O-deacilasa de lípido A, por la cual el polipéptido muestra al menos 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 o

99% de identidad de aminoácido con SEC ID nº 1 y el polipéptido muestra actividad de 3-O-deacilasa de lípido A como se determina en los ensayos descritos en esta especificación, in vivo, como se muestra en el ejemplo 3 o in vitro, según el Ejemplo 9. Preferiblemente el polipéptido con actividad de 3-O-deacilasa de lípido A es el polipéptido de acuerdo con SEC ID nº 1, la proteína PagL de Bordetella bronchiseptica y Bordetella parapertussis, o una parte de la misma, un mutante de la misma, o una proteína de fusión que comprende al menos una parte de la SEC ID Nº1 que consta de actividad de 3-O-deacilasa de lípido A.

[0023] En otra forma de realización la presente divulgación consta de una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido mostrando al menos un 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 o 99% de identidad de aminoácido con SEC ID nº 1. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención muestra al menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 o 99% de identidad con la secuencia de ácido nucleico según SEC ID Nº2 o SEC ID nº 3, los genes de PagL de B. bronchiseptica y B. parapertussis respectivamente. La secuencia de ácido nucleico puede ser una secuencia codificante de longitud completa o puede tener partes codificantes o no codificantes (o complementarias), fragmentos o incluso oligonucleótidos derivados de la misma.

[0024] La divulgación consta además de vectores de ADN que comprenden las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o polipéptidos codificantes que muestran al menos 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 o 99% de identidad de aminoácido con SEC ID nº 1. Los vectores de ADN de acuerdo con la invención pueden ser cualquier vector conocido en la técnica, como por ejemplo pero no limitándose a: plásmidos, fagos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales, vectores para la integración (homóloga) genómica. Los vectores pueden contener marcadores, tales como marcadores seleccionables, dotando de resistencia antibiótica, etiquetas fluorescentes, etiquetas moleculares etc. Los métodos para la clonación de ácido nucleico y expresión de proteínas codificadas de acuerdo con la invención son conocidas por el experto en la materia y pueden por ejemplo encontrarsen en Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989 y Ausubel F. et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 2004 ._ Preferiblemente el vector de acuerdo con la presente divulgación es un vector donde la secuencia de ácidos nucleicos se encuentra operativamente enlazada a secuencias reguladoras tales como promotores, potenciadores y terminadores, dotando de expresión del gen y traduciendo al mensajero en la proteína 3-O-deacilasa del lípido A. De la forma más preferible el vector es capaz de conferir expresión y actividad de 3-O-deacilasa del lípido A a una célula huésped bacteriana de Gram negativa, opcionalmente en una forma inducible, por ejemplo mediante el promotor tac inducible en el plásmido pMMB67.

[0025] La divulgación también proporciona anticuerpos capaces de unirse al polipéptido de acuerdo con SEC ID Nº1. Los anticuerpos de acuerdo con la divulgación pueden ser anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales, cultivados en un huésped por la inyección de polipéptidos de acuerdo con la divulgación mostrada en los ejemplos. Los anticuerpos pueden utilizarse con el fin de establecer un diagnóstico, por ejemplo para analizar la expresión de proteínas PagL y mutaciones u homólogos del mismo en bacterias Gram negativas. Los anticuerpos pueden también utilizarse para el aislamiento y/o purificación de proteínas mostrando una actividad de 3-O-deacilasa de lípido A.

[0026] En otro aspecto la invención se refiere a bacterias Gram negativas que constan de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o codifican una molécula de polipéptido de acuerdo con la invención. Preferiblemente la molécula de ácido nucleico es comprendida por un vector de ADN de acuerdo con la invención, proporcionando expresión a la proteína codificada en células bacterianas Gram negativas y una fuente de actividad de 3O-deacilasa de lípido A a la célula. Preferiblemente dicha bacteria Gram negativa es una bacteria que no comprende en su genoma un gen que codifica una proteína funcional mostrando una actividad de 3-O-deacilasa de lípido A tal como una proteína con una identidad significativa (>40 por ciento) con una proteína PagL como en la SEC ID nº 1. De la forma más preferible, el proporcionar una fuente de actividad de 3-O-deacilasa de lípido A alterará la composición de los LPS en la membrana externa de la pared celular de la célula bacteriana Gram negativa. La bacteria Gram negativa a ser proporcionada con una fuente de actividad de 3-O-deacilasa de lípido A también puede ser una bacteria que conste de un gen no funcional, teniendo una homología importante con una secuencia de ácido nucleico como la proporcionada en las SEC ID Nº 2 o 3, por ejemplo por mutación, desplazamiento del marco de lectura o eliminación, tal como Bordetella pertussis.

[0027] No obstante, también puede proporcionarse con una fuente adicional para dicha actividad dentro del objeto de la presente invención una bacteria Gram negativa que consta de un gen (parcialmente) funcional en su genoma que codifique una proteína teniendo una actividad de 3-O-deacilasa de lípido A. Las bacterias Gram negativas pueden tener un nivel determinado de actividad de 3-O-deacilasa de lípido A pero dicha actividad debe ser mejorada proporcionando expresión adicional y/o mejorada de un polipéptido de acuerdo con la divulgación. Preferiblemente esto dará como resultado un aumento temporal o permanente en la actividad de la 3-O-deacilasa del lípido A en la bacteria hasta tal punto que el lípido A y/o la composición de LPS de la bacteria se encontrará temporal o permanentemente alterada o modificada, en comparación con la bacteria de tipo salvaje. Tal bacteria Gram negativa puede por ejemplo ser una Bordetella Parapertussis o una bacteria Bordetella bronchiseptica, pero puede elegirse cualquier otra bacteria Gram

negativa, preferiblemente una bacteria Gram negativa patógena, como por ejemplo Neisseria spp., como por ejemplo N.meningitidis, N.gonorrhoeae, N.lactamica.

[0028] Una bacteria Gram negativa de acuerdo con la invención que consta de actividad de 3-O-deacilasa del lípido A o de niveles elevados de actividad de 3-O-deacilasa de lípido A preferiblemente consta al menos de un lípido A parcialmente 3-O-desacetilado y/o especies de LPS en la membrana externa de la pared celular bacteriana. De forma alternativa la bacteria Gram negativa de acuerdo con la divulgación puede comprender especies de LPS o lípido A que conlleven una modificación secundaria tras la 3-O-desacilación del lípido A, tal como palmitoilación, desfosforilación o cualquier otra modificación secundaria tras la 3-O-desacilación del lípido A. La célula bacteriana de acuerdo con la divulgación puede comprender al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 por ciento de su LPS/lípido A total en una forma 3-O-desacetilada, o puede comprender alternativamente al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 por ciento de su lípido A/LPS en una forma que conlleva una modificación secundaria, tal como por ejemplo pero no limitándose a palmitoilación o desfosforilación.

[0029] En otro aspecto de la presente invención se proporcionan métodos para la producción de LPS parcialmente 3-Odesacetilados. En una primera forma de realización, tal método comprende un proceso de cultivo de bacterias Gram negativas de acuerdo con la invención bajo condiciones propicias para la síntesis de los LPS dactilados y, opcionalmente, la recuperación de los LPS desacetilados. Los métodos para el cultivo de varias bacterias Gram negativas se conocen en la técnica y pueden encontrarse por ejemplo en Methods for General and Molecular Bacteriology. P. Gerhardt et al., Eds. American Society for Microbiology, Washington DC, 1994 . Los métodos para la recuperación, aislamiento y/o purificación de LPS son también conocidos en la técnica (Meningococcal Vaccines, Methods and Protocols. A.J. Pollard and M.C.J. Maiden, Eds. Capítulo 12: Construction of LPS mutants, pp.155-165. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 2001 ) y pueden por ejemplo realizarse de acuerdo con los ejemplos proporcionados en la presente especificación.

[0030] Alternativamente la presente invención proporciona un método para la producción in vitro de LPS al menos parcialmente 3-O-desacetilados o lípido A, constando el método de fases para proporcionar una composición que consta de LPS o lípido A en crudo o en forma (parcialmente) purificada y para poner esta composición en contacto con un polipéptido o proteína de acuerdo con la divulgación bajo condiciones propicias para la 3-I-desacilación enzimática in vitro. Tales condiciones pueden ser encontradas en la presente especificación, en el ejemplo 9 y en la sección de métodos.

[0031] En otra forma de realización la presente divulgación proporciona composiciones constando de al menos LPS parcialmente 3-O-desacetilados y/o lípido A, preferiblemente comprendiendo al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 o 99 por ciento del total de LPS o lípido A en su forma 3-O-desacetilada o en otra forma que conlleve una modificación secundaria tras la 3-O-desacilación, tal como una forma palmitoilada.

[0032] Las composiciones de acuerdo con la divulgación, constando de LPS parcialmente 3-O-desacetilados y/o lípido A y opcionalmente conllevando modificaciones secundarias, bien comprendidas en la membrana externa de la pared celular de las células bacterianas, o en formas purificadas o crudas, pueden utilizarse para la producción de composiciones farmacéuticas. En una forma de realización particularmente preferible, tales composiciones farmacéuticas de acuerdo con la divulgación pueden ser composiciones adecuadas para fines de vacunación. Tales composiciones farmacéuticas son capaces de suscitar una respuesta inmune en un organismo huésped, preferiblemente un mamífero, de forma más preferible un humano, contra una bacteria Gram negativa. La presencia de al menos LPS parcialmente 3O-desacetilados y/o lípido A o alternativamente LPS que conlleven modificaciones secundarias tras la 3-O-desacilación, proporciona diferentes beneficios, tales como el beneficio de una toxicidad, número y gravedad reducidos de los efectos secundarios en el sujeto y una dosis tolerada más alta para la composición en el sujeto a ser tratado o vacunado. La composición farmacéutica puede contener 1 o más excipientes y/o adyuvantes. Son conocidos en la técnica los adyuvantes y excipientes farmacéuticamente aceptables y pueden ser libremente elegidos por el experto en la materia, por ejemplo a partir de: Current protocols in Immunology, Wiley Interscience 2003 o Remmington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990 .

[0033] En una primera forma de realización la composición farmacéutica puede ser una vacuna de células enteras, que conste de células bacterianas vivas o vivas atenuadas o células bacterianas no viables, las cuales deben haberse inactivado por congelación, tratamiento térmico, interrupción mecánica, tratamiento químico u otros métodos conocidos en el área de la farmacia y la vacunación (J.L. Pace, H.A. Rossi, V.M. Esposito, S.M. Frey, K.D. Tucker, R.I. Walker. Inactivated whole-cell bacterial vaccines: current status and novel strategies. Vaccine 16: 1563-1574 (1998)). Preferiblemente la célula bacteriana es una célula bacteriana patógena Gram negativa, de forma más preferible la célula bacteriana es de los géneros Bordetella, Salmonella, Shigelda, Neisseria, Klebsiella, Pseudomonas, Haemophilus, Escherichia, Proteus y de la forma más preferible es Bordetella pertussis, Bordetella Parapertussis o Bordetella bronchiseptica.

[0034] En un segunda forma de realización preferible, la composición farmacéutica de acuerdo con la divulgación puede ser una vacuna acelular, que conste de 1, 2, 3 o más componentes inmunogénicos de las bacterias patógenas Gram negativas y que conste de al menos LPS parcialmente 3-O-desacetilados o lípido A, o los mencionados LPS que conlleven modificaciones secundarias tras la 3-O-desacilación. Preferiblemente el lípido A parcialmente 3-O-desacetilado y/o los LPS son obtenidos a partir de una célula bacteriana Gram negativa patógena de acuerdo con la invención, donde preferiblemente la célula bacteriana es del género Bordetella, y de la forma más preferible es Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis o Bordetella bronchiseptica. Al menos el lípido A parcialmente 3-O-desacetilado y/o los LPS, opcionalmente conllevando modificaciones secundarias tras la desacilación, pueden utilizarse con el fin de suscitar una respuesta inmune protectora contra la bacteria que la produce, pero puede utilizarse también alternativamente y mezclarse con otras composiciones para su utilización como sustancia adyuvante apropiada. Los LPS son conocidos en la técnica por ser un adyuvante apropiado para su utilización con fines de vacunación, activando receptores de tipo Toll y estimulando una respuesta inmunitaria innata. De acuerdo con la invención, los LPS parcialmente 3-O-desacetilados y al menos parcialmente detoxificados y/o lípidos A retienen en gran medida esta actividad (adyuvante) de estimulación inmunitaria, a la vez que causan una menor toxicidad relacionada con efectos secundarios adversos tales como inflamación local, rojez, dolor y fiebre.

[0035] Deben utilizarse composiciones farmacéuticamente aceptables y vacunas de acuerdo con la divulgación en métodos para el tratamiento de sujetos que padecen o sufren riesgo de padecer una infección bacteriana patógena de Gram negativas, constando la administración de la composición farmacéutica de una vacuna de células enteras o una vacuna acelular de acuerdo con la divulgación. Es conocido el uso de adyuvantes específicos, las cantidades absolutas y relativas de sustancias en las composiciones y el régimen de dosis para la administración o bien pueden ser determinados por el experto en la materia y pueden ser adaptados a las circunstancias propias de la infección patógena en particular o el estado del sujeto a ser tratado en particular. El régimen de dosis pueden constar de una única dosis pero también puede constar de múltiples dosis, por ejemplo de dosis de refuerzo, y pueden administrarse por vía oral, intranasal o parenteral. Los regímenes formados por varias dosis con fines de vacunación son conocidos en la técnica y pueden ser adecuadamente adaptados por el experto en la materia.

Leyendas de la figura [0036]

Fig. 1. Arquitectura del lípido A. A, El lípido A de E. coli consiste en un disacárido de glucosamina bifosforilado sustituido con cuatro fracciones de R-3-hidroximiristoilo, de las que se esterifican las cadenas de acilo graso 2' y 3' con laurato y miristato respectivamente. B, Modificaciones reguladas de Lípido A de Salmonella. La sustitución de las fracciones de fosfato con L-Ara4N o pEtN es mediada por ArnT y PmrC; respectivamente, la formación de un lípido A modificado con 2-hidroximiristato por LpxO, la adición de una cadena secundaria de palmitoilo a la posición 2 por PagP, y la eliminación de la fracción de 3-hidroximiristoilo a la posición 3 por PagL.

Fig.2 Alineamiento de secuencias múltiples de proteínas PagL. Las secuencias fueron alineadas utilizando ClustalW (http: //www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html). Los guiones indican los gaps introducidos para un alineamiento óptimo. Los residuos absolutamente conservados se marcan con asteriscos. Se indican con dos puntos y puntos aquellos residuos fuerte y débilmente conservados respectivamente. El ORF de la PagL en B. pertussis se vio interrumpido por un desplazamiento del marco de lectura, que fue restaurado para dicho alineamiento añadiendo dos nucleótidos en el codón 33. Los números de registro de la proteína GenBank para los homólogos de la PagL son: S. Typhimurium AAL21147, B. bronchiseptica NP_890306, B. parapertussis NP_885487, B. Pertussis BX470248§, P. aeruginosa NP_253350, P. fluorescens NZ_AAAT03000006§ à, P. putida NC_002947§ à, P. syringae ZP_00125465, B. fungorum NZ_AAAJ03000003§, B. mallei NC_002970§, B. pseudomallei NC_002930§, R. metallidurans ZP_00274744, R. solanacearum NP_522762, y A. vinelandii ZP_00089534. El símbolo § indica los números de registro de GenBank de genomas enteros (incompletos), en los que se identificó manualmente a los homólogos de la PagL.

Fig. 3. Expresión y localización de membrana de la PagL en E. coli BL21 Star™ (DE3). Las membranas de E.coli BL21 Star™ (DE3) que contienen pET-11a vacío o plásmidos de la pPagL se aislaron y analizaron mediante SDS-PAGE. Las proteínas se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue. Los asteriscos indican las bandas que fueron sometidas a microsecuenciación y que resultaron corresponder con proteínas de PagL maduras. La banda indicada por el asterisco doble corresponde a la proteína precursora PagL(Bb). Las proteínas de peso molecular estándar se encuentran presentes en el lado izquierdo.

Fig. 4. Análisis por Tricina-SDS-PAGE de modificación de LPS in vivo. Las células E. coli BL21 Star™ (DE3) en crecimiento exponencial que contienen pET-11a o constructos de pPagL fueron inducidas con IPTG durante el tiempo indicado, tras el cual se recogieron y analizaron muestras de cultivo 1 OD600 de la unidad mediante Tricina-SDS-PAGE.

Fig. 5. Análisis de GC/MS de tipo salvaje y LPS de E. coli BL21 Star™ (DE3) modificados por PagL. Análisis de GC/MS de LPS de tipo salvaje (TS) de E. coli BL21 Star™ (DE3) purificado, LPS (L(St)) modificado por PagL(St ), LPS (L(Bb)) modificado por PagL(Bb), y LPS (Pa)) modificado por PagL (Pa) (t= tiempo tras la inducción). Se indican las proporciones de C14/C14-30H normalizadas con LPS de tipo salvaje establecidass en 100 (los valores de muestran en las barras de arriba).

Fig. 6. Análisis estructural por ESI-MS de LPS de tipo salvaje y LPS de E. coli BL21 Star™ modificado por PagL. Se analizaron por ESI-MS las especies de lípido A a partir de E. coli BL21 Star™ (DE3) de tipo salvaje que contienen pET11a (A) vacío, y las especies de lípido A modificadas por PagL(St) (B), PagL(Pa) (C), y PagL(Bb) (D). Los mayores valores en m/z 1797, 1928, 1622, y 1490 se interpretaron como las especies características de bifosfonato hexa-acilado que se encuentran típicamente en E. coli, especies de bifosfonato hexa-acilado sustituidas con una fracción de L-Ara4N, especies de monofosfato 3-O-desacilado sustituidas con una fracción de L-Ara4N, y especies de monofosfato 3-Odesacetilado, respectivamente. Los mayores picos en m/z 1716 y 1847 probablemente representan fragmentos iónicos de las especies en m/z 1797 y 1928.

Fig. 7. Remodificación in vivo de LPS desacetilados y el papel del endógeno de PagP. A, Células E. coli BL21 Star™ (DE3) en crecimiento exponencial que contenían el vector pET-11 vacío o el plásmido de pPagL(Bb) se indujeron con IPTG durante el tiempo indicado. Las muestras que se corresponden con la unidad 1 OD600 fueron recogidas y analizadas mediante Tricina-SDS-PAGE. B y C, el contenido de ácido graso de los LPS de tipo salvaje (TS) de E. coli BL21 Star™ (DE3) purificado y los LPS (L(Bb)) modificados por PagL(Bb), aislados en el tiempo indicado tras la inducción de la expresión de PagL, que se analizaron mediante GC/MS. Se indican los C14/C14-3OH (B) normalizados y las proporciones de C16/C14 (C) con LPS de tipo salvaje establecidos en 100 (los valores de muestran en las barras arriba). D, Crecimiento exponencial de E. coli BL21 Star™ (DE3) de tipo salvaje o E. coli BL21 Star™ (DE3) y el mutante derivado JG101 de itspagP, conteniendo pPagL(Pa), fueron inducidos con IPTG durante el período de tiempo indicado, tras lo cual se recogieron muestras de cultivo de la unidad 1 OD600 en gel de Tricina-SDS-PAGE.

Fig. 8.Modelo de topología para la PagL de P. aeruginosa. Se construyó un modelo para la topología de la PagL(Pa) utilizando las reglas generales de la arquitectura de la membrana externa de la proteína como se describe en (44). El modelo propuesto consiste en un β-barril de ocho hebras con cuatro bucles (L1-4) extendiéndose en el entorno externo. Los residuos en las β-hebras postuladas se muestran con rombos, que se sombrean para los residuos expuestos a las bicapas del lípido. His149 y Ser151 (marcados en rojo; posición en el precursor de la PagL(Pa)) son absolutamente conservados (Fig. 2) y se sugiere que forman parte de una tríada catalítica ''clásica'' de una hidrolasa de serina. Los candidatos potenciales para el residuo de ácido de la tríada catalítica se indican en amarillo. Los números reflejan la posición de los residuos en la secuencia precursora.

Fig. 9. Identificación de residuos de sitio activo de la PagL(Pa) por sustitución de aminoácidos. Las células E.coli BL21 Star™ (DE3) en crecimiento exponencial que contienen el vector pET-11a vacío, el plásmido de pPagL(Pa), o los plásmidos mutantes de pPagL(Pa) se indujeron con IPTG durante 75 min, tras los cuales se recogieron y analizaron muestras de cultivo de la unidad 1 OD600 mediante SDS-PAGE seguidas de una inmunotransferencia con anticuerpos primarios contra la PagL(Pa) (A) y mediante Tricina-SDS-PAGE para visualizar LPS (B).

Fig. 10. Modificación in vivo de LPS de B. pertussis. A, Los LPS de tipo salvaje de B. pertussis de la cepa Tohama llevando el plásmido pMMB67EH de PagL(Bb) se aislaron y analizaron por Tricina-SDS-PAGE. B, el contenido de ácido graso de LPS de tipo salvaje (TS) de B. pertussis de la cepa Tohama purificado, y los LPS (PagL) modificados con PagL (Bb) fueron analizados mediante GC/MS. Se indica la proporción de C14-30H/C10-30H normalizado con LPS tipo salvaje establecido en 100 (valores mostrados en las barras arriba).

Fig. 11. Actividad biológica de los LPS aislados. Inducción de IL-6 (A) o IL-10 (B) en células MM6 por LPS purificados. Los ejes horizontales muestran la concentración de LPS en mg/ml y los verticales la lectura de ELISA en 450 mm.

Fig. 12. Modificabilidad térmica de la PagL(Pa) (-) purificados y replegados analizados mediante SDS-PAGE seminativo. Se tiñó gel de SDS-PAGE con Coomassie Brilliant Blue mostrando la modificabilidad térmica de la PagL(Pa) (-) purificado y replegado. Las muestras se trataron en el buffer de muestra conteniendo un SDS de 0,1% a temperatura ambiente (RT) o SDS de 2% SDS a 100°C (15 min), anterior a la electroforesis. Las proteínas de peso molecular estándar se encuentran presentes en el lado izquierdo.

Fig. 13. Modificación in vitro por unión de membrana o repliegue in vitro de la PagL. Los geles de Tricina-SDS-PAGE teñidos con plata muestran actividad in vitro de la PagL. A, LPS de N. meningitis L3 purificados se incubaron en un tampón con detergente durante 18 h a 37°C con o sin envolturas celulares obtenidos a partir de E. coli BL21 Star™ (DE3) conteniendo pET-11a vacio, o plásmidos de la pPagL. B, Se incubaron LPS de N. meningitis L3 purificados en un tampón con detergente en ausencia o presencia de 5 mM de EDTA durante 18 h a 37°C con o sin 4 µg de PagL(Pa)

replegado in vitro sin secuencia señal (PagL(Pa) (-)). Se cargaron cantidades similares de mezclas de ensayo en todas las líneas.

Fig 14. Análisis por Tricina-SDS-PAGE de modificación de LPS in vivo. Se aislaron los LPS de tipo salvaje y el PagP/PagL expresando B. pertussis de la cepa Tohama por una extracción de agua/fenol caliente y se analizaron mediante Tricina-SDS-PAGE.

Fig. 15. Análisis estructural por ESI-MS de LPS de tipo salvaje y B. pertussis modificada por PagL/PagP. Se analizaron mediante ESI-MS las especies de lípidos A de B. pertussis de la cepa Tohama de tipo salvaje (A), y las especies de lípido A modificadas por PagL(Bb) (B); PagP(Ec) (C), y PagP(Bp) (D). Los mayores picos en m/z 1557, 1477, 1387, 1307, 1251, y 1081 se interpretaron como las especies características de bifosfonato penta-acilado que se encuentra típicamente en B. pertussis, las especies correspondientes a monofosfato penta-acilado, las especies de lípido A desacetilado del ión molecular en m/z 1557 faltando el residuo primario de ácido 3-hidroxidecanoico en la posición 3, las especies de lípido A del ión molecular en m/Z 1477 faltando el residuo primario de ácido 3-hidroxidecanoico en la posición 3, las especies de lípido A desacetilado del ión molecular en m/z 1477 faltando un residuo primario de ácido 3hidroxitetradecanoico, y las especies de lípido A desacetilado del ión molecular en m/z 1477, faltando el residuo primario de ácido 3-hidroxidecanoico en la posición 3 y un residuo primario de ácido 3-hidroxitetradecanoico, respectivamente. Los picos en m/z 1320, 1490, 1545, 1625, 1715, y 1796 corresponden a la palmitoilación mediada por PagP de los iones moleculares presentes en m/z 1081, 1251, 1307, 1387, 1477, y 1557, respectivamente.

Ejemplos

Procedimientos Experimentales

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

[0037] Son descritas todas las cepas bacterianas usadas en el presente estudio en la Tabla I. Típicamente, las cepas de

E. coli y P. aeruginosa se cultivaron a 37°C en agar de caldo de Luria-Bertani modificado, denominado LB agar (26), o en caldo LB, mientras se agitaba a 200 r.p.m. Para E. coli, el medio fue suplementado con 0,2% de glucosa. Cuando se consideró apropiado, se cultivaron bacterias en presencia de 100 µg/ml de ampicilina, 50 µg/ml de canamicina, 50 µg/ml de ácido naladíxico, o 100 µg/ml estreptomicina, para el mantenimiento del plásmido o la selección de cepa. Se cultivó S. Typhimurium SR11 en las placas de LB agar a 37°C. Se cultivaron cepas de B. bronchiseptica y B. pertussis a 35°C en agar de Borduet-Gengou (Difco) suplementadas con 15% de sangre de oveja desfibrinada. Para inducir la expresión del gen de la pagL(Bb) en B. pertussis, las bacterias se cultivaron en el medio sintético Thijs (48) suplementadas con 1 mM de isopropil-1-tio-β -D-galactopiranósido (IPTG) (concentración final) a 35°C, mientras se agitaba (180 r.p.m.).

TABLA 1: Cepas bacterianas y plásmidos usados en el presente estudio

Cepa o plásmido Cepas B. bronchiseptica B505

Cepa de tipo salvaje Genotipo o descripción Fuente o referencia N.V.I.a

B. pertussis B509

Cepa holandesa de la vacuna N.V.I.a

B134 Tohama

Cepa holandesa de la vacuna Cepa de tipo salvaje NalR StrepR N.V.I.a 36

P. aeruginosa PAO25

PAO1 leu arg 45

S. Typhimurium

SR11

Cepa de tipo salvaje 46

E. coli

TOP10F'

F'{lacIq Tn10 (TetR )} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Invitrogen

ΔlacX74 deoR recA1 araD139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1

nupG

DH5α

F Δ(lacZYA-algF)U169 thi-1 hsdR17 gyrA96 recA1 endA1 supE44 47

relA1 phoA Φ80 dlacZΔM15

BL21 Star™ (DE3)

F ompT hsdS B (rBmB-) gal dcm rne131 (DE3) Invitrogen

SK2257

F crcA280::Tn10c thyA6 rpsL120(StrR ) deoCl CGSCb

JG101

BL21 Star™ (DE3) crcA280::Tn10c Este estudio

SM10

RP4-2-Tc::Mu recA KmR 50

Plásmidos

pCRH-TOPO

Vector de clonación de E. coli AmpR KanR Invitrogen

pET-11a

Vector de expresión de E. coli con copia de alta fidelidad, AmpR , Novagen

promotor T7

pMMB67EH

Vector de amplio espectro de hospedador, AmpR, promotor tac 51

pMMB67EH

Vector de amplio espectro de hospedador, AmpR, promotortac 51

pMMB67-PagL(Bb)

Derivativo de pMMB67 albergando B. bronchiseptica pagL Este estudio

pPagL(Pa)

Derivativo de pET-11a albergando P. aeruginosa pagL Este estudio

pPagL(Bb)

Derivativo de pET-11a albergando B. bronchiseptica pagL Este estudio

pPagL(St)

Derivativo de pET-11a albergando S. Typhimurium pagL Este estudio

pPagL(Pa) (-)

Derivativo de pET-11a codificando P. aeruginosa pagL sin secuencia de señal Este estudio

pPagL(Pa)(H81A)

pPagL(Pa) PagL(Pa) Con sustitución de H81A Este estudio

codificante

pPagL(Pa)(H81N)

pPagL(Pa) PagL(Pa) Con sustitución de H81N Este estudio

codificante

pPagL(Pa)(S84A)

pPagL(Pa) PagL(Pa) Con sustitución de S84A Este estudio

codificante

pPagL(Pa)(S84C)

pPagL(Pa) PagL(Pa) Con sustitución de S84C Este estudio

codificante

pPagL(Pa)(H149A)

pPagL(Pa) PagL(Pa) Con sustitución de H149A Este estudio

codificante

pagL(Pa)(S151A)

pPagL(Pa) PagL(Pa) Con sustitución de S151A Este estudio

codificante

pPagL(Pa)(S151C) pPagL(Pa) PagL(Pa) Con sustitución de S151A Este estudio

codificante

aNetherlands Vaccine Institute, Bilthoven, Holanda bE. coli genetic stock center, Universidad Yale, New Haven (CT) c pagP también se conoce como crac

[0038] Se aisló el plásmido de ADN utilizando el sistema Promega Wizard® Plus SV Minipreps. Se utilizaron fosfatasa alcalina de intestino de ternera y endonucleasas de restricción siguiendo las instrucciones del fabricante (Fermentas). 5 Los fragmentos de ADN se aislaron de geles de agarosa utilizado el kit de extracción rápida de gel Qiagen. Se realizaron ligaduras con la utilización del kit de ligadura rápida de ADN (Roche).

[0039] Los genes de la PagL de S. Typhimurium SR11 (pagL(St), B. bronchiseptica B505 (pagL(Bb), y el gen de la PagL, con o sin su parte de codificación de secuencia de señal, de P. aeruginosa PAO25 (pagL(Pa); pagL(Pa) (-)) fueron clonados 10 en pET-11a (Novagen) tras el promotor T7. Los genes fueron amplificados por PCR usando ADN cromosómico como modelo. El modelo ADN se preparó por resuspensión de 109 bacterias en 50 µl de agua destilada, tras la cual la suspensión fue calentada durante 15 min a 95°C. La suspensión se centrifugó luego durante 1 min a 16,100x g, después de lo cual el sobrenadante se usó como modelo de ADN. Las secuencias de los cebadores directos, que contenían un sitio NdeI (subrayado), incluyendo un codón de inicio ATG, fueron 5'-AACATATGAAGAGAATATTTATATATC-3' (pagL(St), 15 5'-AACATATGAAGAAACTACTTCCGCTGG-3' (pagL(Pa), 5'-AACATATGGCGGACGTCTCGGCCGCCG-3' (pagL(Pa) (-)), y 5'-AACATATGCAATTTCTCAAGAAAAACA-3' (pagL(Bb)). Las secuencias de los cebadores inversos, que contenían un sitio de BamHI (subrayado) incluyendo un codón de terminación, fueron 5'-AAGGATCCTCAGAAATTATAACTAATT-3' (pagL(St), 5'-AAGGATCCCTAGATCGGGATCTTGTAG-3' (pagL(Pa), pagL(Pa)(-)), y 5'-AAGGATCCTCAGAACTGGTACGTATAG-3' (pagL(Bb)). Los PCR se realizaron bajo las siguientes condiciones: 50 µl 20 volumen total de reacción, 25 pmol de cada cebador, 0,2 mM dNTPs, 3 µl de solución de modelo de ADN, 1,5% dimetilsulfóxido, 1,75 unidades de enzima Expand High Fidelity mezclada con un tampón suministrado por el fabricante (Roche). El programa de temperatura fue de la siguiente manera: 95°C durante 3 min, un ciclo de 1 min a 95°C, 1 min a 60°C, y 1 min 30 s a 72°C repetido 30 veces, seguido de 10 min a 72°C y enfriamiento posterior a 4°C. Los productos PCR fueron purificados por gel de agarosa y posteriormente clonados en pCRII-TOPO. El ADN plásmido de los clones 25 correctos fue digerido con NdeI y BamHI, y los fragmentos de PagL codificante se ligaron en NdeI/pET-11a digerido en BamHI. La ligadura-mezcla se usó para transformar E. coli DH5α utilizando el método CaCl2 (27). El ADN plásmido de los transformantes fue controlado para la presencia de la PagL codificada correcta insertada por digestión con NdeI y BamHI. Los plásmidos que brindaron un perfil de digestión correcto fueron designados pPagL(Pa), pPagL(Pa) (-); pPagL(Bb), y pPagL(St) (tabla I). Las secuencias de codificación correctas de los genes pagL clonados fueron confirmadas por

30 secuenciación nucleótida en ambas direcciones. Para subclonar el gen pagL(Bb) en un amplio espectro hospedador, el vector pMMB67EH con copia de baja fidelidad, el ADN plásmido de pPagL(Bb) se digirió con XbaI y HinDIII, y el fragmento codificante de PagL(Bb) se ligó en pMMB67EH XbaI/ digerido por HinDIII. La mezcla de la ligadura fue usada para transformar DH5α

deE. coli. El ADN plásmido de los transformantes fue controlado por la presencia del correcto codificante PagL insertándose por digestión con XbaI y HinDIII. Un plásmido que brindó un perfil correcto de digestión se 35 designó como pMMB67EH-PagL(Bb) (tabla I). El último plásmido fue usado para transformar SM10 de E. coli, que permitió posteriormente la transferencia de PagL(Bb) pMMB67EH a B. pertussis por conjugación en el medio sólido descrito por Stibitz et al (52). Se introdujeron mutaciones en PagL usando el QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) y los cebadores catalogados en la tabla II. El pPagL(Pa) plásmido fue usado como la plantilla donde se crearon las mutaciones. La presencia de las mutaciones correctas se confirmó por secuenciación nucleótida en ambas

40 direcciones.

Tabla II

Cebadores utilizados para mutagénesis de sitio dirigido

Nombrea Secuencia (5'-3')b

H81A_FW GAAGGCGCCGGCAAGGCGTCGCTGTCGTTCGCT H81A_REV AGCGAACGACAGCGACGCCTTGCCGGCGCCTTC H81N_FW GAAGGCGCCGGCAAGAACTCGCTGTCGTTCGCT H81N_REV AGCGAACGACAGCGAGTTCTTGCCGGCGCCTTC S84A_FW GGCAAGCATTCGCTGGCGTTCGCTCCGGTATTC S84A_REV GAATACCGGAGCGAACGCCAGCGAATGCTTGCC S84C_FW GGCAAGCATTCGCTGTGCTTCGCTCCGGTATTC

S84C_REV

GAATACCGGAGCGAAGCACAGCGAATGCTTGCC

H149A_FW

GGCGTTCGGGCGATCGCGTATTCCAACGCCGGC

H149A_REV

GCCGGCGTTGGAATACGCGATCGCCCGAACGCC

H149N_FW

GGCGTTCGGGCGATCAACTATTCCAACGCCGGC

H149N_REV

GCCGGCGTTGGAATAGTTGATCGCCCGAACGCC

S151A_FW

CGGGCGATCCACTATGCGAACGCCGGCCTGAAA

S151A_REV

TTTCAGGCCGGCGTTCGCATAGTGGATCGCCCG

S151C_FW

CGGGCGATCCACTATTGCAACGCCGGCCTGAAA

S151C_REV

TTTCAGGCCGGCGTTGCAATAGTGGATCGCCCG

a El cebador aporta la sustitución de aminoácidos, p. ej. H81A_FW indica que el oligonucleótido mostrado se usó como cebador directo en un procedimiento de mutagénesis de sitio dirigido para sustituir la histidina de la posición 81 de la PagL(Pa) precursor por una alanina.

b Las mutaciones introducidas se encuentran subrayadas.

SDS-PAGE e inmunotransferencia

[0040] Se analizaron las proteínas por electroforesis en gel de sulfato-poliacrilamida de dodecilo de sodio (SDS-PAGE) (28), con 0,2% de SDS en el gel de funcionamiento, usando el equipo Bio-Rad Mini-PROTEAN®3. Se aplicaron las muestras a un 13% gel de poliacrilamida con un 4% de gel de apilamiento y se sometieron a electroforesis a 150 V. Las proteínas se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue. Se utilizó Precisión Plus Protein™ manchado o sin mancha previa Standard de Bio-Rad para determinar la masa molecular relativa (Mr) Para la transferencia de Western, las proteínas se transfirieron de los geles SDS-PAGE en membranas de nitrocelulosa. Las membranas se rellenaron durante toda la noche en tampón fosfato salino (PBS) (pH 7,6), con 0,5% de leche en polvo sin grasas, 0,1% Tween-20 e incubado con anticuerpos primarios dirigidos contra la PagL(Pa) en el tampón de relleno, seguido por una incubación de anticuerpos anti conejillo de indias lgG conjugado con peroxidasa de rábano silvestre (Sigma) en el tampón de relleno. Las manchas se desarrollaron con el uso de SuperSignal® WestPico Chemiluminescent Substrate (Pierce).

SDS-PAGE semi-nativo

[0041] Las proteínas se analizaron por electroforesis en gel de sulfato-poliacrilamida de dodecilo de sodio (SDS-PAGE) (28), con 0,2% SDS en el gel de funcionamiento, usando el aparato Bio-Rad Mini-PROTEAN® 3. Para el SDS-PAGE semi-nativo, no se añadió SDS al gel de funcionamiento o apilamiento, y las muestras no se calentaron antes de la electroforesis. Se aplicó a las muestras un 13% de gel de poliacrilamida con un 4% de gel de apilamiento y se sometieron a electroforesis a 150 V. Para el SDS-PAGE semi-nativo, la electroforesis se realizó a una corriente constante de 15 mA en hielo. Las proteínas se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue. Se utilizó Precision Plus Protein™ Standard de Bio-Rad con y sin tinción previa con el fin de determinar la masa molecular relativa (Mr).

Tricina-SDS-PAGE

[0042] Se añadió en el tampón de muestra 0,5 mg/ml de proteinasa K (concentración final) a las muestras con LPS (28). Las muestras se incubaron durante 60 min a 55°C, seguidas de 10 min a 95°C para inactivar la proteinasa K. Las muestras se diluyeron luego 10 veces añadiendo un tampón de muestra, tras lo cual 2 µl de la muestra se aplicaron a un gel de Tricina-SDS-PAGE(30). Se permitió que el bromofenol se encontrara con el gel de separación a 35 V, después de lo cual el voltaje se aumentó a 105 V. Después de que la parte superior alcanzara la parte inferior del gel, se dejó a las muestras funcionando otros 45 min. Los geles se fijaron durante toda la noche en ácido de acético/etanol/agua 11:8:1 (v/v/v) y posteriormente se tiñeron con plata como es descrito (31).

Anticuerpos policlonales

[0043] Para la producción de anticuerpos, se utilizó pPagL(Pa) (-), para transformar E. coli BL21 Star™ (DE3) con el fin de permitir la expresión del gen de PagL truncado. La proteína de PagL(Pa), acumulada en los cuerpos de inclusión, fue aislada (29), purificada con una preparación de gel SDS-PAGE y utilizada para la inmunización de conejillos de Indias en

Eurogentec.

Microsecuenciación

[0044] Las proteínas se transfirieron desde los geles SDS-PAGE en una membrana Immobilon™-P de difluoruro de polivinilideno (Millipore Corp.) en 192 mM de glicina, 25 mM Tris (pH 8,3), 10% metanol (v/v) a 100 V durante 1 h utilizando el aparato Bio-Rad Mini-PROTEAN®. Tras la transferencia, la membrana se lavó 3 veces durante 15 min con agua destilada. Las proteínas transferidas se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue. La membrana se secó al aire, y las bandas del putativo de PagL fueron cortadas y sometidas a microsecuenciación en el Sequencing Center Facility, Universidad de Utrecht, Holanda. Aislamiento de LPS y análisis por Espectrometría de masa cromatografía de gas (GC/MS).

[0045] Los LPS fueron aislados utilizando el método de extracción de agua/fenol caliente (3). En poco tiempo, la B. pertussis de la cepa Tohama, con o sin el plásmido pMMB67EH de PagL(Bb), fue cultivada en 3 litros de medio de Thijs

(48) en presencia de 1 mM IPTG (concentración final). Se cosecharon las células por centrifugación y se resuspendieron en 40 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7.0) que contenía 5 mM de EDTA. Las células se trataron durante la noche con lisozima a 4°C, tras lo cual se añadió un volumen igual de fenol. La suspensión se calentó a 70°C y se incubó durante 30 minutos mientras se procedía a su agitación. La suspensión se enfrió a 10°C, tras lo cual las fases fueron separadas por centrifugado. La fase superior fue recogida y se repitió la extracción añadiendo un volumen igual de agua destilada a la fase inferior. Tras las posteriores incubación a 70°C, enfriamiento y centrifugado, las dos fases superiores se mezclaron y dializaron contra agua del grifo hasta que el fenol oloroso desapareció. Después de la liofilización de las fracciones dializadas, se disolvieron los LPS en la solución de tampón fosfato salino (pH 7.2) en una concentración de 1 mg/ml. Para analizar el ácido graso por GC/MS, se añadió un pliegue de cinco (v/v) excesos de acetona a una parte alícuota de los LPS aislados, tras lo cual la solución se secó a 60°C bajo un flujo de nitrógeno. Posteriormente, los 10 µg de C12:0(20H) (1 mg/ml en el etanol) se añadieron como estándar interno, al igual que 100 µl de cloruro de acetilo/etanol

1:9 (v/v), tras lo cual se derivatizaron las muestras 1 h a 90°C. Tras el enfriamiento, la reacción se detuvo añadiendo 200 µl de 1 M K2 HPO4 (pH 8.0), seguido de la extracción de los ésteres acilo-etilo con 200 µl de acetato de etilo. Un volumen de 1-µl de la fase superior se usó para el análisis por GC/MS en una Finnigan MAT SSQ en el modo de impacto de electrones.

Actividad biológica de los LPS

[0046] La inducción de IL-6 e IL-10 por LPS de B. pertussis de la cepa Tohama de PagL modificada y de tipo salvaje se evaluó con la línea celular macrófaga humana MM6 (49). Las células MM6 se cultivaron en placas de microtitulación (2.105/pocillo) en 400 µl de IMDM (Gibco BRL) suplementadas con 10% de suero fetal de ternera (Gibco BRL) y estimuladas con 200 µl de diluciones en serie de la solución madre de LPS, durante 16-18 h a 37°C en una atmósfera húmeda que contenía 5% de CO2. Los niveles de IL-6 e IL-10 en los sobrenadantes de cultivo se cuantificaron con ELISA contra IL-6 o IL-10 humano de acuerdo con las instrucciones del fabricante (PeliPair™ reagent set, Sanquin Reagents, Amsterdam, Holanda).

Aislamiento de envolturas celulares

[0047] Las células fueron cosechadas por centrifugación durante 10 min a 1,500x g, y lavadas una vez en 50 ml de solución de 0,9% cloruro sódico frío. Los granulados celulares se congelaron al menos 15 min a -80°C, y luego se suspendieron en 20 ml de 3 mM de EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) que contenían cóctel inhibidor Complete Protease (Roche). Las células se interrumpieron por sonicación, tras lo cual las células ininterrumpidas se eliminaron por centrifugación durante 10 min a 1,500x g. Las envolturas celulares se granularon a partir del sobrenadante por centrifugado durante 1,5 h a 150,000x g y se resuspendieron en 2 mM Tris-HCl (pH 7,4). Las envolturas celulares se almacenaron a -80°C en partes alícuotas.

Aislamiento de cuerpos de inclusión

[0048] Para el aislamiento de cuerpos de inclusión, se expresó PagL(Pa) (-) en E. coli BL21 Star™ (DE3) de pPagL(Pa) (-) (tabla 1). Se realizó un cultivo de dos litros a 37°C en el medio LB suplementado con ampicilina hasta un OD600 entre 0,4 y 0,6. Luego, se añadió 1 mM IPTG (concentración final) al cultivo para inducir expresión del gen recombinante, tras lo cual el cultivo fue además incubado a 37°C, mientras se agitaba. Tras 4 horas aproximadamente, las células se cosecharon por centrifugado (15 min a 4,000 r.p.m. (4°C)). Las células cosechadas se lavaron una vez en 400 ml 0,9% de NaCl y luego se resuspendieron en 80 ml TE 50:40 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM EDTA). Se añadieron sacarosa (0,25 g/ml (concentración final)) y lisozima (0,2 mg/ml (concentración final), tras lo cual se incubó la suspensión durante 30 min a RT, mientras se agitaba. La suspensión se sonicó tres veces en hielo (1.5 min, con pausas de 2 min entremedias) utilizando un Branson 250 Sonfier con macropunta (salida 9, ciclo de funcionamiento 50%). Se añadió la

siguiente sonicación, 0,13% (w/v) Brij-35P (Fluka), y la suspensión se sonicó durante dos minutos adicionales. El material denso (cuerpos de inclusión) se recogió por centrifugado durante 2 hrs a 4,000 r.p.m. (4°C), tras lo cual el granulado se lavó una vez en 40 ml TE 50:40, seguido de otro proceso de lavado usando 40 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,3). Los cuerpos de inclusión obtenidos fueron solubilizados en 8 M de urea suplementada con 10 mM de glicina (pH 8.3) y precipitados con ATC. Finalmente, las proteínas obtenidas fueron solubilizadas en 8 M de urea suplementada con 10 mM de glicina (pH 8.3) en una concentración de proteínas de 10 mg/ml. Esta mezcla se centrifugó durante 2 hrs a 13,000 r.p.m. con el fin de eliminar el material insoluble residual y las membranas.

Replegado y purificación de la PagL(Pa) (-)

[0049] Se replegó la PagL(Pa) (-) in vitro por dilución dos veces de la solución de 10 mg/ml de proteína (ver arriba) en 10% (w/v) de óxido de lauril dimetilaminea (LDAO) y con sonicación posterior durante 10 min. Se purificó el PagL(Pa) (-) replegado por cromatografía en fase líquida de proteína rápida (FPLC) utilizando una columna de intercambio de iones MonoQ 1ml (Amersham Biosiences). La solución de proteína se diluyó 4 veces en el tampón A (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,08 % (w/v) C10 E5). La solución se cargó en la columna, que fue preequilibrada con el tampón A, y lavada una vez con tampón A, y las proteínas se eludieron con un gradiente lineal de 0-1 M NaCl en el tampón A. Se analizaron las fracciones con SDS-PAGE para la presencia de proteína PagL(Pa) (-) replegada. Aquellas que contenían la proteína se agruparon y se concentraron en una concentración de proteínas de 10 mg/ml usando concentradores Centricon con un corte de masa molecular de 3 kDa (Amicon). La solución de proteínas se dializó en tres ocasiones durante toda la noche contra 10 ml 2 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.06% (w/v) C10 E5 utilizando una membrana con un corte de masa molecular de

3.5 kDa.

Ensayo de modificación in vitro

[0050] Se diluyó LA PagL(Pa) (-) (10 mg/ml) replegadA o envolturas celulares aisladas de E. coli BL21 Star™ (DE3) conteniendo el vector vacío de pET-11a o plásmidos de la pPagL 10 veces en el agua doblemente destilada. Se incubaron 4 µl de la proteína replegada diluida o una solución de envoltura celular en LPS de meningitis L3 de 50 mM Hepes (pH 8,0), 0,1% Triton X-100, 0,5 a X M NaCl, y 0,75 nmolN en un volumen final de 10 µl a 37°C durante 16 h. Para probar si la reacción dependía de cationes bivalentes, se añadieron 5 mM de EDTA en la reacción con la PagL(Pa) () replegada. Las reacciones se terminaron por ebullición en el tampón de muestra (28), tras lo cual las muestras se trataron con 0,5 mg/ml de proteinasa K durante 1 hora a 55°C, seguidos de una incubación de 10 min a 95°C. Las muestras se diluyeron 25 veces añadiendo un tampón de muestra, tras lo cual 2 µl de las muestras se analizaron por Tricina-SDS-PAGE (ver arriba).

Aislamiento de los LPS y análisis por Espectrometría de masa de ionización por electrospray (ESI MS)

[0051] Los LPS se aislaron utilizando el método de extracción de agua/fenol caliente (Westphal y Jann, Methods Carbohydr. Chem. 5,83-91,1965) con ligeras modificaciones. En poco tiempo, se cultivaron las bacterias en el medio de Tijs en presencia de 1 mM IPTG (concentración final) durante 64 h. Las células se cosecharon por centrifugación y se resuspendieron en 40 mM de tampón fosfato de sodio (pH 7.0) que contenía 5 mM de EDTA. Las células se trataron durante toda la noche con lisozima a 4°C, tras lo cual se añadió un volumen equivalente de fenol. La suspensión se calentó a 70°C, se incubó durante 30 min mientras se procedía a su agitación, y posteriormente se enfrió a 10°C, tras lo cual las fases fueron separadas por centrifugado durante 10 min a 8,000 x g. Se recogió la fase superior y se repitió la extracción tras añadir un volumen igual de agua destilada a la fase inferior. Las dos fases superiores fueron combinadas, dializadas contra agua del grifo hasta la desaparición del olor a fenol, liofilizadas y posteriormente recogidas en el agua destilada. Los LPS se granularon posteriormente por centrifugado durante 3 h a 150,000 x g y se disolvieron en el agua destilada, tras lo cual la concentración de LPS se determinó por el análisis del contenido de ácido 3hidroxitetradecanoico, utilizando cromatógrafo de gases Agilent 6890, como es descrito (Welch, Clin. Microbiol. Rev. 1991 )). Para ESI-MS, una parte alícuota de 200 µl de LPS aislados (50 nmol/ml) se liofilizó y se recogió en 0,1 ml de 2% de ácido acético. La mezcla fue calentada durante 2 h a 95°C para hidrolizar los LPS y liberar la fracción de lípido A. Posteriormente, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se centrifugó durante 10 min a 16,100 x g. El granulado se lavó dos veces en 0,1 ml de agua doblemente destilada, absorbiéndose en 0,1 ml de agua doblemente destilada, y se añadieron 0,3 ml de metanol/cloroformo (2:1; v/v). Tras una agitación vigorosa las fases se separaron por centrifugado durante 10 min en 16,100 x g. La fase superior fue después usada para realizar un análisis estructural del lípido A purificado mediante una MS en tándem con una fuente de nanoelectroespray en un LCQ Finnigan en el modo de ión negativo (Wilm y Mann, Anal. Chem. 1996).

Ejemplo 1: Identificación de los homólogos de la PagL en varias bacterias Gram negativas

[0052] La secuencia del aminoácido 187 de la proteína precursora de PagL de S. Typhimurium (GenBank Accession

Number AAL21147, ID SEC Nº 17) se usó como método que llevar a la identificación de homólogos putativos de la PagL en otras bacterias Gram negativas, mediante la búsqueda de todos los genomas completos e incompletos de bacterias Gram negativas presentes en la base de datos del NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom table.cgi). La búsqueda con BLAST (34) reveló la presencia de homólogos putativos en las especies de Bordetella B. pertussis, B. bronchiseptica, y B. parapertussis (Fig. 2). Los homólogos de la PagL de B. bronchiseptica y B. parapertussis son dos polipéptidos del aminoácido 187 mutuamente idénticos (Fig. 2) con, como fue pronosticado por el servidor de señal de péptidos (35), un péptido señal N-terminal de aminoácido 25. Se encontró también un gen para una PagL homóloga en el genoma de B. pertussis de la cepa Tohama (36), pero este marco abierto de lectura (ORF) se interrumpió por un desplazamiento del marco de lectura (SEC ID nº 4), que podría restaurarse como ID SEC nº 5 para codificar una proteína como en la SEC ID Nº1. La secuenciación nucleótida de los marcos abiertos de lectura de la PagL de las cepas de B. pertussis B509 y B134 también mostró la presencia del mismo desplazamiento del marco de lectura, lo que indica que la interrupción del ORF de la PagL puede ser una característica común de las cepas de B. pertussis. Con el uso del recientemente identificado homólogo de la PagL de B. bronchiseptica como prueba para análisis adicionales con BLAST, se pudieron identificar los homólogos putativos de la PagL adicionales en los genomas de P. aeruginosa (SEC ID nº 6, identidad 30%), Pseudomonas fluorescens (SEC ID nº 7, identidad 29%), Pseudomonas syringae (SEC ID nº 8, identidad 31%), Pseudomonas putida, 2x (SEC ID nº 9 + 10,32/33%),Ralstonia metallidurans (SEC ID nº 15, 28%), Ralstonia solanacearum (SEC ID nº 16,29%), Burkholderia mallei (SEC ID nº 12,28%), Burkholderia pseudomallei (SEC ID nº 13,28%), Burkholderia fungorum (SEC ID nº 11,29%), y Azotobacter vinelandii (SEC ID nº 14,27%) Los alineamientos se muestran en la Fig. 2. Juntos, todos los homólogos de la PagL mostraron una identidad de secuencia mutua y generalmente baja, no obstante superior que con S. typhimurium (24% de identidad), pero conteniendo un dominio claro de homólogos cerca de la terminación C. Nuestro hallazgo sobre este asunto permitió la identificación de homólogos de la PagL en otras especies (bacterianas) y permitió el uso de un homólogo apropiado de la PagL para cualquier bacteria hospedadora y/o cualquiera de los LPS a ser 3-O-desacetilados.

Ejemplo 2: Clonación de la PagL y expresión heteróloga en E. coli

[0053] Para verificar la actividad de su putativo de lípido A-desacilasa, se clonaron los homólogos de la PagL de P. aeruginosa (pagL(Pa)) y B. bronchiseptica (pagL(Bb)). PagL(St) es incluido en estos estudios como una referencia. Estos genes de PagL se amplificaron a partir de los cromosomas por PCR y finalmente se clonaron en un pET-11a bajo el control del promotor de T7, dando como resultado plásmidos, pPagL(Pa), pPagL(Bb), y pPagL(St).

[0054] Para investigar la expresión y localización de la membrana de la PagL en E. coli, se cultivó durante toda la noche

E. coli BL21 Star™ (DE3) conteniendo el vector vacío pET-11a o plásmidos de la pPagL en LB, tras lo cual se aislaron las envolturas celulares. El análisis por SDS-PAGE reveló la presencia de bandas adicionales prominentes con Mrs de 15000-18000 en las envolturas celulares de la células que expresaban la PagL (Fig. 3). Esto resultó coherente con las masas moleculares previstas de las proteínas maduras de PagL, es decir PagL(Pa) 16.1 kDa, PagL(Bb) 17.2 kDa, y PagL(St) 18.2 kDa. Se sometieron a microsecuenciación con el fin de identificar las bandas proteicas adicionales. Las secuencias de los residuos de los 5 primeros aminoácidos de PagL(Pa), PagL(Bb), y PagL(St) fueron ADVSA, QPTQG, y NDNVF, respectivamente, indicando que se da lugar una escisión del péptido señal por la peptidasa líder entre los residuos de los aminoácidos 23 y 24 (AQA-ADV), 25 y 26 (AQA-QPT), y entre 20 y 21 (CSA-NDN), respectivamente. Particularmente en el caso de la expresión de la PagL(Bb), resultó visible en el gel una banda adicional con un Mr superior (Fig. 2). La secuencia N-terminal de esta banda, MQFLK, correspondió con la del precursor de la PagL(Bb).

Ejemplo 3: modificación in vivo de LPS de E. coli por PagL

[0055] Para analizar si los homólogos clonados de la PagL se encontraban activos en LPS de E. coli, se añadió IPTG a las células E. coli BL21 Star™ (DE3) en crecimiento exponencial con el vector vacío pET-11a o los plásmidos de la pPagL, y tras varios periodos de incubación, las muestras equivalentes a una unidad OD600 se recogieron y se analizó su contenido de LPS mediante Tricina-SDS-PAGE. De acuerdo con la hidrólisis prevista del R-3-hidroximiristato en la posición 3 del lípido A, la expresión de cualquiera de los tres homólogos de la PagL convirtió los LPS en una forma con una movilidad electroforética superior (Fig. 4). La conversión era casi completa 75 min después de la inducción de la PagL(Pa) o la PagL(Bb), pero tomó algo más de tiempo en el caso de la PagL(St).

[0056] Análisis estructural de LPS modificados por PagL: para determinar su contenido de ácido graso, los LPS se aislaron de las bacterias que se cultivaron en presencia de 10 mM de MgCl2 para regular las modificaciones reguladas por PhoP/PhoQ de lípido A y se analizaron por GC/MS. La proporción de C14:0/C14:0(3OH) en las muestras de LPS modificados por PagL aumentó cuando se comparó con aquellas de LPS de tipo salvaje (Fig. 5), de acuerdo con la eliminación prevista de un C14-30H de lípido A. Para confirmar estos datos, las fracciones de lípido A se aislaron y fueron analizadas por ESI-MS en el modo de ión positivo, que reveló la presencia de cuatro especies principales de lípido A en los LPS de tipo salvaje (Fig. 6A). El valor máximo en m/z 1797 representa las especies características de bifosfato hexa-acilado que se encuentran típicamente en el E. coli, mientras que el valor máximo en m/z 1928

corresponde con una especie de bifosfato hexa-acilado sustituida por una fracción de L-Ara4N. Los dos picos restantes en m/z 1716 y m/z 1847 representan muy probablemente iones fragmentados de las dos especies anteriores faltando un grupo de fosfato. Sobre la expresión de la PagL(St) (Fig. 6B), PagL(Pa) (Fig. 6C), o PagL(Bb) (Fig. 6D), las especies principales de lípido A estuvieron presentes en m/z 1622 y m/z 1490, lo cual se corresponde con la pérdida de un residuo de β-hidroximiristato y de un grupo de fosfato de las especies principales en m/z 1928 y m/z 1797 presentes en el control de vector vacío respectivamente. También aquí, la pérdida del grupo de fosfato es probablemente un artefacto del proceso de ionización. Basándose en los datos de GC/MS y ESI-MS, se puede concluir que los homólogos identificados de la PagL de P. aeruginosa y B. bronchiseptica, como el proveniente de S. Typhimurium, son desacilasas activas de lípido A. Además, los datos sugieren que la desacilación no depende de la ausencia o presencia de una fracción de L-Ara4N, dado que ambas especies se desacetilaron eficazmente.

Ejemplo 4: Resultados posteriores a la modificación de LPS desacilado por PagL in Vivo

[0057] En el curso de estos experimentos, se observó que tras la expresión prolongada de la PagL, los LPS modificados por PagL no pudieron volver a detectarse en los geles de Tricina-SDS-PAGE, y que los LPS migraron nuevamente a la posición de los LPS de tipo salvaje, como se ilustra para la cepa que expresa PagL(Bb) (Fig. 7A). La proteína de PagL se encontraba aún presente abundantemente en este momento, como se revelaba en los geles de SDS-PAGE (datos no mostrados). Además, los análisis por GC/MS revelaron que la proporción de C14:0/C14: 0(3OH) no disminuyó de nuevo para los LPS aislados tras 5 h de inducción de la PagL(Bb) (Fig. 7B). Así, la modificación secundaria observada en el gel de Tricina-SDS-PAGE (Fig. 7A) no era la consecuencia de la restauración de la modificación de la PagL, sino el resultado de (unas) modificación(es) adicional(es) que restauraron la movilidad electroforética a aquel LPS de tipo salvaje. Por ello, se compararon otras proporciones de ácido graso. Se encontró un sorprendente aumento en la proporción de C16:0/C14:0 en los LPS de células inducidas 5 h para la producción de la PagL (Fig. 7C), sugiriendo que los LPS de la PagL-desacilada fueron posteriormente palmitoilados.

[0058] Una proteína que añade palmitato al lípido A es la proteína de membrana externa de PagP (19) (Fig. 1). Por lo tanto, se da la hipótesis de que la modificación secundaria de los LPS modificados por PagL podrían ser el resultado de la actividad endógena de PagP. Para indagar en esta posibilidad, se transformó E. coli BL21 Star™ (DE3) de tipo salvaje y su mutante derivado de la PagP JG101 con el plásmido de pPagL(Pa). La modificación secundaria de los LPS modificados por PagL se observó de nuevo en el caso de la cepa tipo salvaje, pero no en aquella cepa mutante (Fig. 7D). Este resultado sugiere fuertemente que la modificación secundaria de LPS modificados por PagL (Fig. 7A) fue por lo tanto la consecuencia de la actividad endógena de PagP.

Ejemplo 5: identificación de residuos de sitio activo de la PagL

[0059] La identidad de secuencia mutua entre el homólogo identificado de la PagL resulta muy bajo (Fig. 2). Entre los pocos residuos totalmente conservados se encuentran una histidina y una serina, que se cree pueden formar parte de una tríada catalítica 'clásica' de Asp/Glu-His-Ser de hidrolasas de serina. Estos residuos putativos de sitio activo se localizan en el lado expuesto a lípidos cercano a la parte superior de una β-hebra en un modelo topológico aquí propuesto (Fig. 8). En la membrana externa fosfolipasa A, interesantemente se observa que His y Ser se localizan en una posición similar (37). Para probar si estos residuos, localizados en las posiciones 149 y 151 de la proteína precursora de PagL(Pa), respectivamente, son realmente importantes para la actividad catalítica, fueron sustituidos por alanina o asparagina, y por alanina o cisteína, respectivamente. Como forma de control, las mismas sustituciones se realizaron en histidina no conservada y en residuos de serina, localizados en las posiciones 81 y 84 del precursor de la PagL(Pa), respectivamente. Se analizaron las proteínas y los perfiles de LPS de células E. coli BL21 Star™ (DE3) que transportan los plásmidos pertinentes y se indujeron durante 75 min con IPTG por inmunotransferencia (Fig. 9A) y Tricina-SDS-PAGE (Fig. 9B), respectivamente. Mientras que la sustitución del His81 no conservado y Ser84 no afectó a la desacilación de LPS, esta no volvió a observarse cuando el His149 conservado y Ser151 se sustituyeron (Fig. 9B), aunque la expresión de las mutaciones de estas proteínas no se vio afectada (Fig. 9A). Estos resultados apoyan considerablemente la hipótesis de que la histidina conservada en la posición 149 y la serina en la posición 151 de la proteína precursora de la PagL(Pa) son residuos de sitio activo y que las funciones mecanicistas de la PagL son como una hidrolasa de serina.

Ejemplo 6: clonación de la pagL(Bb) y de la expresión heteróloga en B. pertussis

[0060] Para modificar LPS de B. pertussis in vivo, se clonó el gen de PagL de B. bronchiseptica (pagL(Bb)). El gen de la PagL se amplificó a partir del cromosoma por PCR y finalmente fue clonado en pMMB67EH bajo el control del promotor Tac, dando como resultado un plásmido, pMMB67EH-PagL(Bb), que fue transferido a la B. pertussis de la cepa Tohama por conjugación.

[0061] Para dirigir la modificación de LPS de B. pertussis in vivo, B. pertussis de la cepa Tohama de tipo salvaje, o la B.

pertussis de la cepa Tohama que contenía el plásmido pMMB67EH-PagL(Bb) fueron cultivados en el medio de Thijs suplementados con 1 mM de IPTG (concentración final). Se aislaron los LPS por el método de extracción de agua/fenol caliente y se analizaron por Tricina-SDS-PAGE (Fig. 10A) y GC-MS (Fig. 10B). El análisis en el gel de Tricina-SDS-PAGE mostró que los LPS aislados de PagL(Bb) expresaban una migración de la cepa ligeramente más rápida que cuando se comparaba con los LPS de tipo salvaje de B. pertussis. Sorprendentemente, los LPS aislados de la PagL(Bb) que expresaban una cepa mostraron dos poblaciones de LPS diferentes. Una población migró cerca de la altura de los LPS de tipo salvaje de Tohama, y otra población migró más rápidamente. Esta última población de LPS puede también observarse en la preparación de LPS de tipo salvaje, no obstante la cantidad de los mismos es muy inferior. Para verificar que los LPS de la PagL con expresión de cepa fueron realmente desacetilados en su posición 3, se analizaron por medio de GC-MS. La proporción de C14:0(3OH)/C10:0(3OH) en la muestra de LPS modificados por PagL aumentó en comparación con aquella en los LPS de tipo salvaje (Fig. 10B), de acuerdo con la eliminación prevista de un C10-3OH de la posición 3 de lípido A de B. pertussis.

Ejemplo 7: actividad biológica de LPS de modificado por PagL

[0062] Para valorar la actividad endotóxica de los LPS modificados por PagL y de B. pertussis de tipo salvaje, se midió su capacidad para estimular la producción de IL-6 e IL-10 en la línea celular macrófaga humana MM6. Como se puede observar en la figura 2, para LPS de tipo salvaje, se incrementó la producción tanto de IL-6 (Fig. 11A) como de IL-10 (Fig. 11B) por las células MM6 en comparación con la estimulación de las células con un cantidad idéntica de LPS modificados por PagL. Así, se puede concluir que la desacilación in vivo de LPS de B. pertussis por los resultados de la PagL conlleva una reducción en la actividad endotóxica de estos LPS.

Ejemplo 8: clonación, expresión, purificación, y repliegue de la PagL(Pa)

[0063] El gen PagL de P. aeruginosa PAO25 sin su secuencia de señal codificante fue clonado en pET-11a, dando como resultado un plásmido de pPagL(Pa) (-). Para obtener cuerpos de inclusión, se expresó la PagL sin su secuencia de señal en E. coli BL21 Star™ (DE3). Se aislaron y se solubilizaron los cuerpos de inclusión en urea, tras lo cual la proteína se replegó por la dilución dos veces en 10% de óxido de laurildimetilaminea (LDAO) y se purificó además por cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC). El correcto repliegue fue confirmado por SDS-PAGE (Fig. 12) y mediciones de dicroismo circular (CD) (datos no mostrados). En el gel de SDS-PAGE, la proteína replegada tenía una movilidad electroforética inferior en comparación con la forma desnaturalizada, mientras que las mediciones de CD mostraban que la proteína replegada tenía predominantemente conformación de -lámina.

Ejemplo 9: modificación de LPS in vitro por PagL de membrana localizada y replegados

[0064] Para probar si la PagL localizada en la membrana o replegada in vitro era capaz de modificar LPS añadidos de manera externa in vitro, se incubaron pagL replegada (Pa )(-), o envolturas celulares aisladas de E. coli BL21 Star™ (DE3) que contenían el vector vacío pET-11a, o los plásmidos de pPagL, junto con LPS purificados de N. meningitis. La modificación de los LPS se evaluó por Tricina-SDS-PAGE (Fig. 13). De acuerdo con la hidrólisis prevista del R-3hidroximiristato en la posición 3 del lípido A, los LPS se convirtieron en una forma con una mayor movilidad electroforética cuando se encontraban presentes o bien la PagL se encontraba localizada en la membrana (Fig 13A) o PagL(Pa) (-) replegada (Fig 13B). La reacción con la PagL(Pa) (-) replegada era independiente en presencia de cationes bivalentes, mientras que la desacilación de LPS se observaba aún en presencia de 5 mM EDTA (Fig. 13B).

Ejemplo 10: Estructura alterada de lípido A tras la expresión de PagP y PagL en B.pertussis

[0065] Para expresar PagP y PagL en B. pertussis de la cepa Tohama, el gen de la PagL de B. bronchiseptica (pagL(Bb)) y el gen de PagP de B. pertussis (pagP(Bp)) fueron expresados a partir del amplio espectro de hospedador del vector de expresión numérica pMMB67EH con copia de baja fidelidad. Como forma de control, se construyó también una cepa con expresión del gen de PagP de E. coli (pagP(Ec)). Los LPS se aislaron de B. pertussis de la cepa Tohama de tipo salvaje, con expresión PagP, o con expresión de PagL y se analizaron por Tricina-SDS-PAGE. Los LPS aislados de la cepa con expresión PagL(Bb) aparecieron sin resultar afectados en el gel, mientras que aquellos con expresión PagP aparecieron potencialmente modificados, ya que se detectó una banda con una movilidad electroforética inferior que la de los LPS de B. pertussis de tipo salvaje (Fig. 14). Además, en comparación con la cepa con expresión PagP(Bp), apareció una mayor eficiencia de modificación en la cepa con expresión PagP(Ec) (Fig. 14). Para evaluar las posibles modificaciones de LPS con mayor detalle, se analizaron las fracciones de lípido A de las cepas por ESI-MS en el modo de ión negativo. Este análisis reveló la presencia de cuatro especies principales de lípido A en el LPS de tipo salvaje (Fig. 15A). El valor máximo en m/z 1557 representa las especies características de bifosfato penta-acilado que se encuentran típicamente en B. pertussis (Caroff et al., Microbes. Infect., 1994), mientras que el valor máximo en m/z 1477 corresponde con las especies de monofosfato penta-acilado. Los dos picos restantes en m/z 1307 y 1251 representan especies de lípido A desacetiladas del ión molecular en m/z 1477, a las cual les falta el residuo primario de ácido 3

hidroxidecanoico en la posición 3 o un residuo primario de ácido 3-hidroxitetradecanoico (bien en la posición 2 o 3'), respectivamente. Estos resultados indican una alta heterogeneidad entre las especies de lípido A en B. pertussis de tipo salvaje, lo cual no se resolvió aparentemente en el análisis de gel (Fig. 14). Resulta interesante que el cálculo de las cantidades relativas de las especies individuales de lípido A de sus valores máximos correspondientes reveló que en los LPS de B. pertussis de tipo salvaje, una gran cantidad de especies de lípido A (~50%) constan de formas tetra-aciladas. Además, la gran mayoría de especies de lípido A eran formas de monofosfato (~80%). Para excluir la posibilidad de que una alta abundancia de especies de lípidos A acilados e hipofosforilados fuera un resultado del proceso de hidrolización usado para aislar al lípido A, se evaluó si los periodos más cortos o largos de hidrolización (variando entre 1 y 4 h) influían en la abundancia relativa de las especies de lípido A, lo cual no fue, no obstante, el caso (datos no mostrados). Además, se determinó el contenido total de fosfato de una solución con una concentración conocida de LPS de B. pertussis de tipo salvaje purificados. De acuerdo con la prevalencia de especies de monofosfato de lípido A detectadas por ESI-MS, sólo se detectó poco más de la mitad del contenido de fosfato previsto una vez los LPS habían sido completamente fosforilados (datos no mostrados).

[0066] En cuanto a la expresión de la PagL(Bb) (Fig. 15B), estuvieron presentes tres especies de lípido A en m/z 1081, 1307, y 1387, respectivamente. El valor máximo en m/z 1307 corresponde con la forma desacetilada de monofosfato con la falta del residuo de ácido 3hidroxidecanoico en la posición 3, mientras que el valor máximo en m/z 1387 corresponde con la forma bisfosforilada del ión molecular en m/z 1307. El valor máximo en m/z 1081 se corresponde con una forma de monofosfato con la falta tanto de residuos de ácido 3-hidroxidecanoico como de 3-hidroxitetradecanoico. El contenido relativo de especies de lípido A con la falta de residuo de ácido 3-hidroxidecanoico en la posición 3 aumentó de alrededor de un 37 por ciento en LPS de B.pertussis de tipo salvaje a un 92 en la cepa con la expresión de la PagL(Bb). Así, aunque no se detectó movilidad electroforética de los LPS (Fig. 14, apartado 2), la paGL(Bb) codificada de 3-O-deacilasa de lípido A se encontraba activa en B. pertussis.

[0067] En cuanto a la expresión de PagP(Ec) (Fig. 15C) y PagP(Bp) (Fig. 15D), se detectaron nuevas especies de lípido A (tabla III). Los valores máximos en m/z 1320, 1490, 1545, 1625, 1715, y 1796 se corresponden con la palmitoilación prevista de PagP-mediado de los iones moleculares presentes en m/z 1081, 1251, 1307, 1387, 1477, y 1557, respectivamente. La diferencia en la eficiencia de la modificación entre E. coli y PagP de B. pertussis, lo cual se observó tras el análisis por Tricina-SDS-PAGE (Fig. 14), se reveló también en el análisis espectométrico de masa. En la expresión de cepa de PagP de E. coli, se palmitoiló el ~47% de la población total de lípido A, en contraste con sólo el ~9% en la cepa con expresión PagP(Bp). Resulta interesante que en la cepa con expresión PagP(Bp), en contraste con la que expresa PagP(Ec), no se encontraban especies de lípido A con la falta de un residuo de ácido 3hidroxitetradecanoico al ser palmitoilada. Una posible explicación para esta discrepancia es la diferencia en la especificidad de las dos enzimas de PagP. Mientras que el PagP de E. coli aporta una cadena de acilo en la posición 2 de lípido A, el PagP de B. pertussis aporta un palmitato en la posición 3' (Bishop et al., EMBO J., 2000 ; Preston et al., Mol. Microbiol., 2003 )). Así, la ausencia completa de especies de lípido A palmitoilado con la pérdida de un residuo de ácido 3-hidroxitetradecanoico en la cepa con expresión de PagP de B. pertussis sugiere que las moléculas de lípido A con la falta de residuo de ácido 3-hidroxitetradecanoico se da específicamente en su posición 3'. Esto podría explicar entonces parcialmente la diferencia en la eficiencia de modificación que se observó entre las dos enzimas de PagP, cuando el conjunto de sustrato para PagP de E. coli sería mayor que aquel para PagP de B. pertussis. Además, esta hipótesis es coherente con la presencia de especies de lípido A hipoacilado in vivo.

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LISTADO DE SECUENCIAS

15 [0069]

<110> Nederlands Vaccin Instituut

<120> Desacilación de LPS en bacterias Gram negativas 20

<130> P218195 EP

<160> 17

25 <170> Versión PatentIn 3.3

<210> 1

<211> 178 5 <212> PRT

<213> Bordetella sp.

<400> 1

<210> 2 10 <211> 537

<212> ADN

<213> Bordetella bronchiseptica

<400> 2 <210> 3

<211> 537 5 <212> ADN

<213> Bordetella parapertussis

<400> 3 10

<210> 4

<211> 535

<212> ADN

<213> Bordetella pertussis

<400> 4

<210> 5

<211> 537

<212> ADN

<213> Bordetella pertussis

<220>

<221> Desplazamiento del marco de lectura restaurado.

<222> (96)..(97)

<400> 5

<210> 6 10 <211> 173

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

15 <400> 6

<210> 7

<211> 172

<212> PRT

<213> Pseudomonas fluorescens

<400> 7

<210> 8

<211> 172

<212> PRT

<213> Pseudomonas syringae

<400> 8

<210> 9

<211> 173

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 9

<210> 10

<211> 172

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 10

<210> 11

<211> 187

<212> PRT

<213> Burkholderia fungorum

<400> 11

<210> 12

<211> 189

<212> PRT

<213> Burkholderia mallei

<400> 12

<210> 13

<211> 189

<212> PRT

<213> Burkholderia pseudomallei

<210> 14

<211> 177

<212> PRT

<213> Azotobacter vinelandii

<211> 195

<212> PRT

<213> Ralstonia metallidurans

<400> 15

<210> 16

<211> 187

<212> PRT

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 16

5

<210> 17 <211> 187 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium

10

<400> 17

37

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Bacteria de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis o Bordetella bronchiseptica o bacteria de la especies de Neisseria que comprende un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido con al menos 95% identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID nº: 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos confiere un aumento en la actividad de la 3-O-deacilasa del lípido A en comparación con la bacteria de tipo salvaje.

2. 2.

   Bacteria de acuerdo con la reivindicación 1, donde la bacteria es Neisseria Meningitidis, Neisseria gonorrhoeae o Neisseria lactamica.

3. 3.

   Bacteria de Bordetella pertussis que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 y que confiere actividad de 3-O-deacilasa de lípido A a la bacteria.

4. 4.

   Método para la producción de LPS al menos parcialmente 3-O-desacetilados, donde el método comprende el proceso de cultivo de una bacteria tal y como se describe en las reivindicaciones de 1 a 3 bajo condiciones propicias para la síntesis de LPS al menos parcialmente 3-O-desacetilados y, opcionalmente, recuperación de LPS al menos parcialmente 3-O-desacetilados, donde los LPS al menos parcialmente 3-O-desacetilados comprenden al menos el 10 por ciento de su total de lípido A en la forma 3-O-desacetilada.

5. 5.

   Composición que comprende LPS obtenibles a partir de una bacteria Bordetella pertussis o bacterias de Neisseria tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, donde al menos el 10 por ciento del total de lípido A en los LPS en la composición se encuentra en la forma 3-O-desacetilada.

6. 6.

   Bacterias de Bordetella pertussis de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 3, para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones de Bordetella pertussis.

7. 7.

   Uso de bacterias de Bordetella pertussis de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 3 para la producción de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección de Bordetella pertussis.

8. 8.

   Composición que consta de LPS obtenibles a partir de bacterias de Bordetella pertussis tal y como se describe en las reivindicaciones de 1 a 3, donde al menos el 10 por ciento de lípido A total en los LPS en la composición se encuentra en forma 3-O-desacetilada, para su uso en el tratamiento o prevención de infección de Bordetella pertussis.

9. 9.

   Uso de una composición que comprende LPS obtenibles a partir de una bacteria de Bordetella pertussis tal y como se describe en las reivindicaciones de 1 a 3, donde al menos el 10 por ciento del total de lípido A en los LPS en la composición se encuentra en la forma 3-O-desacetilada, para la producción de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección de Bordetella pertussis.

10. 10.

    Vacuna de células enteras que comprende una bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, donde la bacteria es Bordetella pertussis o del género Neisseria.

11. 11.

    Vacuna acelular que comprende una composición de acuerdo con la reivindicación 5.

12. 12.

    Método in vitro para la desacilación de LPS de bacterias de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis o Bordetella bronchiseptica o especies de Neisseria o composiciones que comprenden LPS, comprendiendo el proceso de la puesta en contacto de LPS o la composición con un polipéptido que muestra al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID nº: 1 y que muestra actividad de 3-O-deacilasa de lípido A, bajo condiciones propicias para la desacilación enzimática de LPS de bacterias Gram negativas.