NO340331B1

NO340331B1 - Deacylering av LPS i gramnegative bakterier

Info

Publication number: NO340331B1
Application number: NO20073088A
Authority: NO
Inventors: Johannes Petrus Maria Tommassen; Peter André Van Der Ley; Jeroen Johannes Gerardus Geurtsen
Original assignee: De Staat Der Nederlanden Vert Door De Mini Van Vws
Priority date: 2004-12-17
Filing date: 2007-06-18
Publication date: 2017-04-03
Also published as: NO20073088L; PL1828378T3; WO2006065139A2; MX2007007288A; US20080274145A1; CA2590906C; EP1828378A2; AU2005317304A1; DK1828378T3; JP5378685B2; US8048433B2; ES2493440T3; CA2590906A1; JP2008523805A; AU2005317304B2; CN101203605A; BRPI0519923A2; BRPI0519923A8; WO2006065139A3; NZ555889A

Description

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører området mikrobiologi, spesielt biologien for Gram-negativ LPS-syntese og modifisering. Oppfinnelsen vedrører også område medisin, spesielt området vaksinering mot bakterielle patogener. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre Gram-negative bakterier, Gram-negative bakterielle lipopolysakkarider (LPS) og sammensetninger omfattende LPS, som kan anvendes for farmasøytiske og/eller veterinæriske formål, spesielt for framstilling av vaksiner mot Gram-negative så som Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis og Bordetella bronchiseptica. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre vaksiner inneholdende deacylert LPS, og anvendelse av modifisert og detoksifisert LPS for framstilling av helcelle og acellulære vaksiner.

Bakgrunn for oppfinnelsen.

Bordetella pertussis infeksjon er et forårsakende agens for kikhoste, med et estimert antall på 60 millioner tilfeller hvert år, og som dreper ca 355000 personer verden over årlig (WHO), spesielt barn og immunkompromitterte individer. Selv om behandling med antibiotika er tilgjengelig (erytromycin), så har bakterielle toksiner ved det tidspunkt sykdommen diagnostiseres ofte forårsaket alvorlig skade. Hindring av sykdommen er derfor av stor viktighet. Det primære middel for regulering forblir vaksinering. Konvensjonelt har vaksiner mot pertussis ("kikhosteinfeksjoner") vert basert på helcelle av B. pertussis. Helcelle Bordetella pertussis vaksiner, omfattende hele bakterier som har blitt drept med varmebehandling, formalin eller andre midler, er blitt inkludert i generelle vaksineringsprogram siden tidlig 1950 tallet. Immunisering medd helcelle pertussis vaksine, idet den er effektiv i å hindre kikhoste i spedbarn, har vært assosiert med lokal, systemisk og nevrologiske reaksjoner, inkluderende feber, krampeanfall og hjernehinnebetennelse i barn. LPS er ansvarlig for hoveddelen av de skadelige reaksjoner i barn etter immunisering med pertussis. Under bakterielle infeksjoner av dyr, aktiverer LPS eller dets lipid A enhet det naturlige immunsystem igjennom interaksjon med Toll-lignende reseptorer, primært TLR-4. Vertresponsen til lipid A inkluderer produksjon av kationiske antimikrobielle peptider, cytokiner, kjemokiner og ytterligere immunstimulerende molekyler. I begrensede infeksjoner vil respons til lipid A fungere i å klarne bakteriene, men i overveldende sepsis kan høye nivåer av sirkulerende cytokiner og prokoagulant aktivitet medføre skade på mikrovaskulatur og presipitere syndrom av Gram negativ septisk sjokk med utbredt intravaskulær koagulering.

Ingen konkluderende bevis for en beskyttende rolle for LPS i pertussisvaksiner er tilgjengelig, selv om passive immuniseringseksperimenter i mus har vist at antistoff mot LPS kan gi en grad av beskyttelse. I tillegg, og mer viktig, nærvær av LPS i en vaksine tilveiebringer imidlertid adjuvansaktivitet med å forsterke immunresponsen mot andre antigener. (K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes og Infection 3: 655-677 (2001).

Bekymringer med hensyn til sikkerhet har skadelig påvirket vaksineopptak og har motivert utvikling av acellulære pertussisvaksiner, fremstilt med sterkt rensede antigener fra B. pertussis. I de siste år, har i tillegg til de såkalte "helcellevaksiner" eller "WCVer", også acellulære vaksiner eller "ACV er" nå blitt introdusert i mange land.

Acellulære vaksiner omfatter normalt fra 1 til 3 eller flere antigener av patogenisk organisme. I tilfelle B. pertussis er antigener som vanligvis benyttes: pertussistoksin (PT, normalt behandlet for å ødelegge dets toksisitet mens det opprettholder immunogenisiteten), filamentøst hemaglutinin (FHA), fimbriae, og 69 kD proteiner eller pertaktin (Prn). Generelt er reaktogenisiteten av acellulær vaksine langt lavere enn reaktogeniteten av helcellevaksiner. Acellulær vaksine er assosiert med en betydelig redusert frekvens av systemiske reaksjoner (feber, oppkast, irriterbarhet, anoreksi) og lokale reaksjoner (svelging, rødhet, varme, ømhet, stivhet, smerter). Imidlertid, de kliniske data er fremdeles kontroversielle med hensyn til om den beskyttende immunitet av acellulære vaksiner matcher den beskyttende effekt av helcellevaksiner. I mange studier er den beskyttende effekt av helcellevaksiner overlegen, og en debatt pågår om dette overveier risiko av sjeldne men alvorlige skadelige effekter av helcellevaksiner i spedbarn. For tiden testes forskjellige immuniseringsskjema, hvor opp til seks doseringer av acellulære vaksiner gis. Helcellevaksinen ble opprinnelig gitt 5 ganger, inkorporert med rutinevaksine tidsskjema hvor den siste booster ble gitt mellom 4-6 års alder. Den acellulære pertussis vaksine anbefales nå å bli gitt 6 ganger, inkluderende en siste dosering (kombinert med difteri- stivkrampevaksine) i løpet av tenårene. Den acellulære vaksine syntes å være sikrere enn den helcellebaserte vaksine, men skal ikke gis til barn med en tidlig allergisk reaksjon mot pertussisvaksine.

De skadelige bieffekter av pertussis helcellevaksiner har blitt godt dokumentert innen fagfeltet (oversikt: S.H. Yeh: Pertussis: persistent pathogen, imperfect vaccines. Expert Rev. Vaccines 2: 113-127 (2003)). Selv om for tiden anvendte acellulære vaksiner delvis overkommer disse skadelige bieffekter, er den beskyttende immunitet som tilveiebringes av disse vaksiner fremdeles kontroversiell og gir mye rom for forbedring. I en musemodell ble det funnet overlegen langtidsbeskyttelse med helcelle sammenlignet med acellulære vaksiner (K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001)). Videre, acellulære vaksinerer mer kostnadsdyre og vanskelig å produsere, krever isolering, utstrakt rensing og kvalitetskontroll av forskjellige antigener, og blanding og formulering av disse i optimale/ønskete mengder. Der har vært et klart, og i lang tid, et behov for bedre B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica og andre Gram negative vaksiner.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter og midler for fremstilling av forbedrede pertussisvaksiner. Foreliggende oppfinnelse beskriver nye Bordetella proteiner. Disse nye B. pertussis, B. parapertussis og B. brochiseptica proteiner og DNA-molekyler som koder for disse proteiner anvendes i samsvar med oppfinnelsen for å modifisere lipid A og dermed tilveiebringe nye B. pertussis, B. parapertussis og 8. brochiseptica bakterielle stammer og andre Gram-negative bakterielle celler, omfattende minst partielt 3-O-deacylert og detoksifisert LPS. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også forbedrete sammensetninger for vaksinering, omfattende Bordetella arter bakterielle celler omfattende partielt 3-O-deacylert LPS, farma-søytiske sammensetninger omfattende isolerte og minst partielt 3-O-deacylert LPS eller in vitro 3-O-deacylert LPS. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre antistoff som er rettet mot og som er spesifikke for 3-O-deacylert lipid A og/eller LPS-molekyler.

Lipopolysakkarid (LPS), en hovedkomponent i den Gram-negative bakterielle ytre membran, er kjent for å være viktig for funksjonering av denne membran som en permeabilitetsbarriere og for motstandsdyktighet mot komplementmediert celle-lysering (oversikt i 1). Den består av tre kovalent koblede domener: lipid A, kjernen, og O-antigen. Lipid A danner den hydrofobiske membranforankring og er ansvarlig for den endotoksiske aktivitet av LPS. I Escherichia coli, består den av en 1, 4'-bifosforylert (3-1,6-koblet glukosamin disakkarid, som er substituert med R- 3-hydroksymyristisk syreenheter ved posisjoner 2, 3, 2', og 3' via ester- eller amid-binding. Sekundære lauroyl- og myristoylgrupper substituerer hydroksylgruppen av R- 3 hydroksymyristoyl ved 2'- og 3'- posisjoner, respektivt (fig 1A). Tidligere forsøk har vist at fosfatgruppene, glukosamindisakkarider, og det korrekte antall og lengde av acylkjedene er viktige for den biologiske aktivitet av lipid A (1, 2, 3).

Hovedstrukturen til lipid A er bemerkelsesverdig godt konservert blant Gram-negative bakterier, selv om noe variasjon i mønsteret av substitueringer av de to fosfater og acylkjedenummeret og lengden er observert (4, 5). Ytterligere modifiseringer av lipid A (fig 1 B) er regulert i Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) av det tokomponent regulatoriske system PhoP/PhoQ (6, 7). I respons til lave Mg<2+->nivåer fosforyleres sensorkinase PhoQ og dermed aktiverer transkripsjonsaktivering PhoP, som fører til aktivering eller represjon av 40 forskjellige gener (6, 8). Et andre regulatorisk system involvert i lipid A modifisering er PmrA/PmrB tokomponent system, som i seg selv er PhoP/PhoQ regulert (9, 10). Mutanter med forandringer i PhoP/PhoQ-systemet oppviser redusert virulens og en øket mottagelighet for antimikrobielle peptider (11, 12). Homologer av PhoP/PhoQ og PmrA/PmrB systemene har blitt identifisert i andre Gram-negative bakterier, inkluderende E. coli, Yersinia pestis og Pseudomonas aemginosa (13,14).

Til nå har flere lipid A - modifiserende enzymer blitt identifisert. Substituering av 1 og 4' fosfatgruppene med en eller to 4-amino-4-deoksy-L-arabinose (L-Ara4N) enheter i S. Typhimurium blitt funnet å være avhengig av enzymet ArnT (15). Nylig ble PmrC-proteinet identifisert til å mediere tilføying av fosforetanolamin (pEtN) til lipid A i Salmonella enterica (16). Et annet enzym, benevnt LpxO, katalyserer den O2-avhengige hydroksyleringen av lipid A (17), og en lipid A 1 - fosfatase ble identifisert i Rhizobium leguminosarum (18). Alle disse enzymer er tenkt å befinne seg i den indre membran eller periplasmatisk rom (15,16,17,18). Nylig ble en ny klasse yttermembranlokaliserte lipid A - modifiserende enzymer oppdaget. En av disse er palmitoyl transferase PagP (19). Palmitoylering av lipid A fører til en øket motstand mot kationiske antimikrobielle peptider (7). Videre, palmitoylert lipid A antagoniserer LPS-indusert aktivering av humane celler (20). Homologer av PagP er funnet, blant annet i S. Typhimurium, Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Legionella pneumophila, E. coli og Y. pestis (19, 21).

Et annet yttermembranlokalisert lipid A - modifiserende enzym er 3-O-deacylase PagL (22). Dette enzym ble oppdaget i S. Typhimurium og vist å hydrolysere esterbindingen ved 3-posisjon til lipid A, og dermed frigjøre den primære 3-hydroksymyristoyl enhet (22). Så langt kan ingen åpenbar homolog for pagL blitt funnet i ikke-overflødige eller uferdige mikrobielle databaser, med unntak av den nær beslektete art Salmonella typhi og Salmonella paratyphi (22). Likeledes, noen andre Gram-negative bakterier, inkluderende P. aeruginosa (14), R. leguminosarum (23), Helicobacterpylori (24), og Porhyromonas gingivalis (25) inneholder 3-O-deasylert lipid A arter, noe som antyder at disse organismer inneholder enzymer med en lignende aktivitet som PagL.

Foreliggende oppfinnelse beskriver identifiseringen av PagL homologer i en rekke Gram-negative bakterier. Begrenset sekvenslikhet mellom de forskjellige proteiner og avanserte bioinformatikkverktøy ble anvendt for å identifisere disse homologer og deres aktive sete enheter. I denne beskrivelse beskrives nærvær og anvendelse av pagL homologer for heterolog ekspresjon i en rekke Gram-negative bakterier. Selv om den totale sekvenslikhet med kjente pagL-gener fra Salmonella spp er ganske lav, kan et konservert PagL-domene skilles i den C-terminale region.

Teknikkens stilling beskriver kun PagL proteiner fra Salmonella spp og beskriver kun heterolog ekspresjon av pagL i E. coli (22), resulterende i deacylert LPS. Ingen data er tilgjengelig innen fagfeltet om nærvær av pagL homologer i andre Gram-negativer. Heterolog pagL ekspresjon i andre Gram-negative, og om PagL er funksjonell i andre Gram-negativer, effekten av PagL på lipid A/LPS sammensetning, bakteriell levedyktighet, toksisitet og immunogenisitet i andre Gram negative er alle ukjente faktorer. Kun begrenset data for heterolog Salmonella pagL ekspresjon i E. coli er tilgjengelig, hvor en TLR-respons ble målt i celler som uttrykker rekombinant humant TLR4, noe som ikke reflekterer en naturlig situasjon for Gram-negative infeksjoner.

(Kawasaki et al., J Biol Chem. 2004).

Beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse viser aktivitet av Pseudomonas aeruginosa og Bordetella bronchiseptica pagL homologer, som ble bekreftet ved heterolog ekspresjon i Escherichia coli og Bordetella spp, som resulterte i fjerning av en R- 3-hydroksymyristoyl gruppe fra lipid A. Effekten på biologisk aktivitet av LPS ble undersøkt med humane makrofagceller. Ved deacylering med PagL, undergikk E. coli lipid A (men ikke B. pertussis Lipid A) en annen modifisering, som var resultatet av aktiviteten av den endogene palmitoyl transferase PagP. Videre, et konservert histidin-serin-par som aktiv sete enheter ble identifisert, noe som antyder en katalytisk mekaniske tilsvarende til serin hydrolaser. Til slutt, in vitro aktivitet av PagL for LPS-substrater vises. Den biologiske funksjon for PagL kan appliseres i samsvar med foreliggende oppfinnelse for å modifisere Gram-negativ patogenisitet, toksisitet og immunogenisitet. Denne modifisering kan foregå på bakterielle helceller eller deler, fraksjoner eller forbindelser som er avledet derfra. Oppfinnelsen tilveiebringer til slutt nye vaksiner mot Gram-negative bakterielle infeksjoner, omfattende helceller av Gram-negative bakterier i samsvar med foreliggende oppfinnelse eller modifisert lipid A/LPS som kan oppnås, og/eller isoleres fra disse bakterier, eller in vitro modifisert LPS/lipid A molekyler.

Detaljert beskrivelse

Definisjoner:

"Sekvensidentitet" defineres heri som forholdet mellom to eller flere aminosyre (polypeptid eller protein) sekvenser, eller to eller flere nukleinsyresekvenser (polynukleotid), som bestemt ved å sammenligne sekvensene. Innen fagfeltet angir "identitet" også grad av sekvenslikhet mellom aminosyrer eller nukleinsyresekvenser, slik det i tilfellet kan bestemmes med matching mellom strenger av slike sekvenser. "Likhet" mellom to aminosyresekvenser bestemmes ved å sammenligne aminosyre-sekvensen og dets konserverte aminosyresubstitueringer av en polypeptid i forhold til sekvensen av et andre polypeptid. "Identitet" og "likhet" kan enkelt beregnes med kjente metoder, inkluderende men ikke begrenset til de som er beskrevet i (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics og Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I,

Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; og Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. og Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; og Carillo, H., og Lipman, D., SIAM J. Applied Matn., 48:1073 (1988).

Foretrukne fremgangsmåter for å bestemme identitet er konstruert for å gi den største match mellom sekvensene som testes. Fremgangsmåter for å bestemme identitet og likhet er kodet i offentlig tilgjengelige datamaskinprogrammer. Foretrukne datamaskinprogrammetoder for å bestemme identitet og likhet mellom to sekvenser inkluderer for eksempel GCG-programpakken (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, og FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990).BLAST X programmet tilgjengelig offisielt fra NCBI og andre kilder (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Den kjente Smith Waterman algoritme kan også anvendes for å bestemme identitet.

Foretrukne parametere for polypeptidsekvens sammenligning inkluderer følgende: Algoritme: Needelman og Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453 (1970); Sammenligningsmatriks:BLOSSUM62 fra Hentikoff og Hentikoff, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 89:10915-10919 (1992); Gap straff: 12; og Gap lengde straff: 4. Et program som er nyttig med disse parametere er offentlig tilgjengelig som "Ogap"- programmer fra Genetics Computer Group, lokalisert i Madison, Wl. De ovenfor nevnte parametere er default-parametere for aminosyre sammenligninger (sammen med ingen straff for ende gap). Foretrukne parametere for nukleinsyresammenligning inkluderer følgende: Algoritme: Needleman og Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Sammenligningsmatriks: matches=+10, mismatch=0; Gap Penalty: 50; Gap Length Penalty: 3. Tilgjengelig som Gap program fra Genetics Computer Group, lokalisert i Madison, Wisconsin. Det som er gitt over er default-parametere for nukleinsyre sammenligninger.

Valgfritt, ved bestemmelse av graden av aminosyrelikhet kan den fagkyndige også ta hensyn til såkalte "konservative" aminosyresubstitueringer, slik det vil være åpenbart for fagkyndige. Konservative aminosyresubstitueringer refererer til ombyttbare enheter som har lignende sidekjeder. For eksempel, en gruppe av aminosyrer som har alifatiske sidekjeder er glycin, alanin, valin, leucin, og isoleucin: en gruppe aminosyrer som har alifatiske hydroksylsidekjeder er serin og treonin; en gruppe aminosyrer som har amidinneholdende sidekjeder er asparagin og glutamin; en gruppe aminosyrer som har aromatiske sidekjeder er fenylalanin, tyrosin og tryptofan; en gruppe aminosyrer som har basiske sidekjeder er lysin, arginin og histidin; en gruppe aminosyrer som har sure sidekjeder er asparaginsyre og glutaminsyre og en gruppe aminosyrer som har svovelinneholdende sidekjeder er cystein og metionin. Foretrukne konservative aminosyresubstitueringsgrupper er: valin-leucin-isoleucin, fenylalanin-tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, og asparagin-glutamin. Substitueringsvarianter av aminosyresekvensene beskrevet heri er de hvor minst en enhet i de beskrevne sekvenser har blitt fjernet og en forskjellig enhet er blitt innsatt i stedet. Fortrinnsvis er aminosyreforandringen konservativ. Foretrukne konservative substitueringer for hver av de naturlig forekommende aminosyrer er som følger: Ala til ser; Arg til lys; Asn til gin eller his; Asp til glu; Cys til ser eller ala; Gin til asn; Glu til asp; Gly til pro; His til asn eller gin; Ile til leu eller val; Leu til ile eller val; Lys til arg; Gin eller glu; Met til leu eller ile; Phe til met, leu eller tyr; Ser til thr; Thr til ser; Trp til tyr; Tyr til trp eller Phe; og Val til ile eller leu.

Et DNA-segment i samsvar med foreliggende oppfinnelse er "funksjonelt koblet" idet det er plassert i et funksjonelt forhold med et annet DNA-segment. For eksempel, en promoter eller enhancer er funksjonelt koblet til en kodesekvens dersom den stimulerer transkripsjon av sekvensen. DNA for en signalsekvens er funksjonelt koblet til DNA som koder for et polypeptid dersom det uttrykkes som et preprotein som tar del i sekresjon av polypeptidet. Generelt, DNA-sekvenser som er funksjonelt koblet er kontigøse, og i tilfelle en signalsekvens, både kontigøs og i lesefase. Imidlertid, enhancere trenger ikke være kontigøse med kodesekvensene hvis transkripsjon de regulerer. Linking utføres ved ligering av hensiktsmessige restriksjonsseter eller ved adaptere eller linkere innsatt i stedet derfor.

Seleksjon av en egnet promotersekvens er generelt avhengig av vertscellen som er utvalgt for ekspresjon av DNA-segmentet. Eksempler på egnete promotorsekvenser inkluderer prokariote og eukariote promoter som er godt kjent innen fagfeltet (se for eksempel Sambrook og Russell, 2001, supra). Transkripsjonsregulatoriské sekvenser inkluderer typisk en heterolog enhancer eller promoter som gjenkjennes av verten. Seleksjon av en egnet promoter avhenger av verten, men promotere så som promoterne av typen trp, lac og fag, tRNA promotere og glykolytiske enzym-promotere er kjente og tilgjengelige (se for eksempel Sambrook og Russell, 2001, supra). Ekspresjonsvektorer inkluderer replikasjonssystemet og transkripsjons- og transalasjonsregulatoriske sekvenser sammen med innskuddssetet for det poly-peptidkodende segment kan benyttes. Eksempler på kombinasjoner av cellelinjer og ekspresjonsvektorer er beskrevet i Sambrook og Russell (2001, supra) og i Metzger et al. (1988) Nature 334: 31- 36. For eksempel kan egnete ekspresjonsvektorer være uttrykt i gjær, for eksempel S. cerevisiae, insektsceller, for eksempel Sf9-celler, mammalske celler, for eksempel CHO-celler og bakterielle celler, for eksempel E. coli eller Bordetella spp.

I en første utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nye polypeptider omfattende lipid A 3-O-deacylase aktivitet, hvor polypeptidet oppviser minst 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 eller 99 % aminosyreidentitet med SEQ ID No. 1 og polypeptidet oppviser lipid A 3-0- deacylaseaktivitet som bestemt med analysene beskrevet i denne beskrivelse, in vivo som eksemplifisert i eksempel 3 eller in vitro i samsvar med eksempel 9. Fortrinnsvis er polypeptidet som har lipid A 3-0 deacylaseaktivitet polypeptidet i samsvar med SEQ ID No. 1, PagL-proteinet av Bordetella bronchiseptica og Bordetella parapertussis, eller en del derav, en mutant derav, eller et fusjonsprotein omfattende minst en del av SEQ ID No. 1 omfattende lipid A 3-0-deacylaseaktivitet. 1 en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en nukleinsyresekvens som koder for polypeptidet som oppviser minst 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 eller 99 % aminosyreidentitet med SEQ ID No.1. Fortrinnsvis oppviser nukleinsyresekvensen i samsvar med foreliggende oppfinnelse minst 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 eller 99 % identitet med nukleinsyresekvensen i samsvar med SEQ ID No. 2 eller SEQ ID No. 3, pagL-genene fra B. bronchiseptica og B. parapertussis, respektivt. Nukleinsyresekvensen kan være en fullengde kodende sekvens eller kan være kodende eller ikke-kodende (eller komplementære) gener, fragmenter eller også oligonukleotider avledet derav.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre DNA-vektorer omfattende nukleinsyre-sekvensene i samsvar med oppfinnelsen og/eller som koder for polypeptider som oppviser minst 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 eller 99 % aminosyreidentitet med SEQ ID No. 1. DNA-vektorer i samsvar med oppfinnelsen kan være enhver vektor kjent innen fagfeltet, så som, men ikke begrenset til, plasmider, fag, fagemider, kosmider, artifisielle kromosomer, vektorer for (homolog) genomisk integrasjon. Vektorene kan inneholde markører, så som selekterbare markører, som tilveiebringer antibiotisk resistens, fluoriserende markører, molekylære tags, etc. Fremgangsmåter for kloning av nukleinsyrer, og ekspresjon av kodete proteiner i samsvar med oppfinnelsen er kjent for fagkyndige og kan for eksempel finnes i Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989 og Ausubel F. et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 2004. Fortrinnsvis er vektoren i samsvar med foreliggende oppfinnelse en vektor hvor nukleinsyresekvensen er funksjonelt koblet til regulatoriske sekvenser så som promotorer, enhancere og terminatorer, som tilveiebringer ekspresjon av genet og translasjon av messeger til lipid A 3-0- deacylaseprotein. Mest fortrinnsvis er vektoren i stand til å besørge ekspresjon og lipid A 3-0- deacylaseaktivitet til en Gram-negativ bakteriell vertscelle, valgfritt på en induserbar måte, for eksempel med den induserbare tac-promotor på plasmid pMMB67.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også antistoff i stand til å binde seg til polypeptidet i samsvar med SEQ ID No. 1. Antistoff i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan være monoklonale antistoff eller polyklonale antistoff, som er dannet i en vert ved å injisere polypeptidet i samsvar med oppfinnelsen, som vist i eksemplet. Antistoff kan anvendes for diagnostiske formål, for eksempel for å analysere ekspresjon av PagL-proteiner og mutanter eller homologer derav i Gram-negative bakterier. Antistoff kan også anvendes ved isolering og/eller rensing av proteiner som oppviser lipid A 3-O-deacylaseaktivitet.

Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører Gram-negative bakterier som omfatter en nukleinsyremolekyl i samsvar med oppfinnelsen og/eller som koder for et polypeptidmolekyl i samsvar med oppfinnelsen. Fortrinnsvis, nukleinsyre-molekylet er arrangert i en DNA-vektor i samsvar med oppfinnelsen, som tilveiebringer ekspresjon av det kodete protein i Gram-negative bakterielle celler og som tilveiebringer en kilde av lipid A 3-0- deacylaseaktivitet til cellen. Fortrinnsvis er nevnte Gram-negative bakterie en bakterie som ikke omfatter i dets genom et gen som koder for et funksjonelt protein som oppviser lipid A 3-0- deacylaseaktivitet så som et protein som har en betydelig (mer enn 40 %) identitet med et PagL-protein som i SEQ ID No.1. Mest fortrinnsvis, å tilveiebringe en kilde av lipid A 3-0- deacylaseaktivitet vil forandre sammensetningen av LPS i den ytre membran i celleveggen til den Gram-negative bakterielle celle. Den Gram-negative bakterie som skal tilveiebringes med en kilde av lipid A 3-0- deacylaseaktivitet kan også være en bakterie omfattende et ikke-funksjonelt gen, som har betydelig homologi med en nukleinsyresekvens som tilveiebrakt i SEQ ID No.2 eller 3, for eksempel med en mutasjon, rammeskift eller deletering, så som Bordetella pertussis.

imidlertid, også en Gram-negativ bakterie som ikke omfatter et (partiell) funksjonelt gen i dets genom som koder for et protein som har lipid A 3-O-deacylaseaktivitet, kan tilveiebringes med en ytterligere kilde for dets aktivitet innen rammen av foreliggende oppfinnelse. Gram-negative bakterier kan ha et visst nivå av lipid A 3-O-deacylaseaktivitet men nevnte aktivitet kan forsterkes ved å tilveiebringe ytterligere og/eller forsterket ekspresjon av et polypeptid i samsvar med oppfinnelsen. Fortrinnsvis vil dette resultere i en temporær eller permanent økning i lipid A 3-O-deacylaseaktivitet i bakterien i slik grad at lipid A og/eller LPS sammensetningen til bakterien midlertidig eller permanent forandres eller modifiseres, sammenlignet med villtypebakterien. En slik Gram-negativ bakterie kan for eksempel være Bordetella parapertussis eller en Bordetella bronchiseptica bakterie, men enhver annen Gram negativ bakterie, fortrinnsvis en patogen Gram-negativ bakterie kan velges, for eksempel Neisseria spp, så som N. meningitidis, N. gonorrhoeae, N. lactamica.

En Gram negativ bakterie i samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatter lipid A 3-0 deacylaseaktivitet eller forhøyete nivåer av lipid A 3-0 deacylaseaktivitet fortrinnsvis minst partielt 3-O-deacylert lipid A og/eller LPS-former i den ytre membran i den bakterielle cellevegg. Alternativt kan den Gram negativ bakterie i samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatte LPS eller lipid A former som bærer en sekundær modifisering etter 3-0-deacylering i lipid A, så som palmitoylering, defosforylering eller en hver annen sekundær modifisering etter 3-0-deacylering av lipid A. Den bakterielle celle i samsvar med oppfinnelsen kan omfatte minst 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 eller 90 % av dets totale LPS/lipid A i 3-O-deacylert form, eller kan alternativt omfatte minst 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 eller 90 % av dets lipid A/LPS i en form som bærer en sekundær modifisering, så som for eksempel, men ikke begrenset til, palmitoylering eller defosforylering.

1 et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for å produsere partielt 3-O-deacylert LPS. I en første utførelse omfatter en slik fremgangsmåte trinnet å dyrke den Gram negative bakterie i samsvar med oppfinnelse under betingelser som fører til syntese av deacylert LPS, eller valgfritt gjenvinning av deacylert LPS. Fremgangsmåter for å dyrke forskjellige Gram negative bakterier er kjent innen fagfeltet og kan for eksempel finnes i Methods for General and Molecular Bacteriology. P. Gerhardt et al., Eds. American Society for Microbiology, Washington DC, 1994. Fremgangsmåter for gjenvinning, isolering og/eller rensing av LPS er også kjent innen fagfeltet (Meningococcal Vaccines, Methods and Protocols. A.J. Pollard and M.C.J. Maiden, Eds. Chapter 12: Construction of LPS mutants, pp.155- 165. Humana Press, Totowa, New Jersey, 2001 )og kan for eksempel utføres I samsvar med eksemplene som gis i denne beskrivelse.

Alternativt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å produsere

i det minste partielt 3-O-deacylert LPS eller lipid A in vitro, hvor fremgangsmåten omfatter trinnene å tilveiebringe en sammensetning omfattende LPS eller lipid A i ubehandlet eller (partielt) renset form, og bringe denne sammensetning i kontakt med et polypeptid eller protein i samsvar med oppfinnelsen under betingelser som bidrar til enzymatisk 3-O-deacylering in vitro. Slike betingelser kan finnes i gjeldende beskrivelse, i eksempel 9 og i fremgangsmåteavsnittet.

I en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse sammensetninger omfattende minst partielt 3-O-deacylert LPS og/eller lipid A, fortrinnsvis omfattende minst 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 eller 99 % av det totale LPS eller lipid A i dets 3-0- deacylerte form eller i en annen form som bærer en sekundær modifisering etter 3-0 deacylering, så som palmitoylert form.

Sammensetninger i samsvar med oppfinnelsen, omfattende partielt 3-O-deacylert LPS og/eller lipid A, og som valgfritt bærer sekundære modifiseringer, enten i den ytre membran i celleveggen i de bakterielle celler, eller i ubehandlet form eller rensete former, kan anvendes for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger. I en spesielt foretrukket utførelse kan slike farmasøytiske sammensetninger i samsvar med oppfinnelsen kan være sammensetninger som er egnet for vaksineringsformål. Slike farmasøytiske sammensetninger er i stand til å utløse et immunforsvar i en vertsorganisme, fortrinnsvis et pattedyr, mer fortrinnsvis et menneske, mot en Gram-negativ bakterie. Nærvær av mjnst partielt 3-O-deacylert LPS og/eller lipid A eller alternativt LPS som bærer sekundære modifiseringer etter 3-O-deasylering, tilveiebringer flere muligheter, så som fordelen med en redusert toksisitet, et redusert antall og redusert alvorlighet av bi-effekter i individene og en høyere tolerert dosering av sammensetningen i individet som skal behandles eller vaksineres. Den farma-søytiske sammensetning kan inneholde en eller flere eksipienter og/eller adjuvanser. Farmasøytisk akseptable eksipienter og adjuvanser er kjent innen fagfeltet og kan fritt velges av den fagkyndige, for eksempel fra Current protocols in Immunology, Wiley Interscience 2003 eller Remmington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990.

I en første utførelse kan den farmasøytiske sammensetning være en helcelle-vaksine, omfattende levende eller levende attenuerte bakterielle celler eller ikke-levedyktige bakterielle celler, som kan ha blitt inaktivert med frysing, varmebehandling, mekanisk ødeleggelse, kjemisk behandling eller andre fremgangsmåter kjent innen fagfeltet farmasi og vaksinering (J.L. Pace, H.A. Rossi, V.M. Esposito, S.M. Frey, K.D. Tucker, R.l. Walker. Inactivated whole-cell bacterial vaccines: current status and novel strategies. Vaccine 16:1563-1574 (1998)). Fortrinnsvis er den bakterielle celle en Gram-negativ patogen bakteriell celle, mer fortrinnsvis er den bakterielle celle av genus Bordetella, Salmonella, Shigella, Neisseria, Klebsiella, Pseudomonas, Haemophilus, Escherichia, Proteus og mest fortrinnsvis Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis eller Bordetella bronchiseptica.

I en andre foretrukket utførelse kan den farmasøytiske sammensetning i samsvar med oppfinnelsen være en acellulær vaksine, omfattende 1, 2, 3 eller flere immuno-geniske komponenter fra den Gram-negative patogene bakterie og omfattende minst partielt 3-O-deacylert LPS eller lipid A, eller nevnte LPS bærer sekundære modifiseringer etter 3-O-deacylering. Fortrinnsvis er den partielle 3-0- deacylerte lipid A og/eller LPS opptatt fra en Gram negativ, patogen bakteriell celle i samsvar med oppfinnelsen, hvor den bakterielle celle fortrinnsvis er av genus Bordetella, og mest fortrinnsvis er Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis eller Bordetella bronchiseptica. Den minst partielt 3-0-deacylerte lipid A og/eller LPS, som valgfritt bærer sekundære modifiseringer etter deacylering, kan anvendes for å utløse en beskyttende immunrespons mot bakterien som produserer den, men kan alternativt også anvendes og samblandes med andre sammensetninger ved anvendelse som en egnet adjuvanssubstans. LPS er kjent innen fagfeltet å være en egnet adjuvans for vaksineringsformål, aktiverende Toll-lignende reseptorer og stimulerer en naturlig immunrespons. Partielt 3-O-deacylert og minst partielt detoksifisert LPS og/eller lipid A i samsvar med oppfinnelsen bibeholder i stor grad sin immunstimulerende (adjuvans) aktivitet, mens den forårsaker mindre toksisitetsrelaterte skadelige bieffekter, så som lokal svelging, rødhet, smerte og feber.

Farmasøytisk akseptable sammensetninger og vaksiner i samsvar med oppfinnelsen kan anvendes i fremgangsmåter for behandling av individer som lider, eller som har risiko for å erverve en patogen, Gram-negativ bakteriell infeksjon, omfattende å administrere den farmasøytiske sammensetning, en helcelle eller en acellulær vaksine i samsvar med oppfinnelsen. Anvendelse av spesifikke adjuvanser, de relative og absolutte mengder av substansene i sammensetningene og doserings regimer for administrering er kjent eller kan bestemmes av fagkyndige og kan tilpasses for forhold så som bestemt patogen infeksjon eller status til det bestemte individ som skal behandles. Doseringsregimet kan omfatte en enkelt dosering, men kan også omfatte flere doseringer, for eksempel booster doseringer, og kan administreres oralt, intranasalt eller parenteralt. Forskjellige doseringsregimer for vaksineringsformål er kjent innen fagfeltet og kan hensiktsmessig tilpasses av den fagkyndige.

Figurbeskrivelser

Fig. 1. Lipid A arkitektur. A, E. coli lipid A består av en bifosforylert glukosamin disakkarid substituert med fire P-3-hydroksymyristoyl enheter, av hvilke 2' - og 3' fettasylkjedene er esterifisert med laurat og myristat, respektivt. B, Regulerte modifiseringer av Salmonella lipid A. Substituering av fosfatenhetene med L-Ara4N eller pEtN er mediert av ArnT og PmrC, respektivt, dannelse av en 2-hydroksy-myristat-modifisert lipid A av LpxO, tilføying av en sekundær palmitoylkjede ved 2-posisjon av PagP, og fjerning av 3-hydroksymyristoylenhet ved 3-posisjon av PagL. Fig. 2. Multippel sekvens alignment av PagL proteiner. Sekvensene ble tilordnet ved anvendelse av ClustalW (http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html). Bindestrek indikerer mellomrom introdusert for optimal alignment. Absolutt konserverte enheter er markert med stjerner. Angitt med kolonner eller punktum er sterkt og svakt konserverte enheter, respektivt. pagL ORF i 8. pertussis er splittet av et rammeskift, som ble reparert for denne alignment ved tilføying av to nukleotider i kodon 33. Genbank proteinkatalognummer for PagL homologer er: S. Typhimurium AAL21147, 8. bronchiseptica NP_890306, 8. parapertussis NP_885487, 8. pertussis BX470248<5>, P. aeruginosa NP_253350, P. fluorescens NZ_AAAT03000006§, P. putida NC_002947<§>, P. syringae ZP_00125465, 8. fungorum NZ_AAAJ03000003<§>, 8. mallei NC_002970<§>, 8. pseudomallei NC_002930<§>, R. metallidurans ZP_00274744, R. solanacearum NP_522762, and A. vinelandii ZP_00089534. The symbolet § indikerer GenBank katalognummer av hele (uferdige) genomer, hvor PagL homologer manuelt ble identifisert. Fig3. Ekspresjon og membranlokalisering av PagL i E. coli BL21 Star™ (DE3). Membraner fra E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende tom pET-11a eller pPagL plasmider ble isolert og analysert med SDS-PAGE. Proteiner ble farget med Coomassie Brilliant Blue. Stjerner indikerer bånd som ble underlagt mikro sekvensering og ble funnet å korrespondere med modne PagL proteiner. Båndet som er angitt med en dobbel stjerne korresponderer til PagL(Bb) forløper protein. Molekylvekt standardproteiner er gitt på venstre side. Fig 4. Analyse med Tricin-SDS-PAGE av LPS modifisering in vivo. Eksponentielt voksende E- coli BL21 STAR™ (DE3) celler inneholdende pET-11a eller pPagL konstrukter ble indisert med IPTG i den angitte tid, hvoretter 1 OD6ooenhet dyrkningsprøver ble samlet og analysert med Tricin-SDS-PAGE. Fig 5. GC/MS analyse av villtype og PagL-modifisert E. coli BL21 Star™ (DE3) LPS. GC/MS analyse av renset E. coli BL21 Star™ (DE3) villtype LPS (WT), PagL(St) - modifisert LPS (L(St)), PagL(Bb)-modifisert LPS (L(Bb)), og PagL(pa)-modifisert LPS (L(Pa)) (t= tid etter induksjon). Angitt er de normaliserte C14/C14-30H-forhold med villtype LPS innstilt med 100 (verdier vist over stolper). Fig 6. Strukturanalyse med ESI-MS med villtype PagL modifisert E. coli BL21 Star™ (DE3) LPS. Lipid A former fra villtype E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende tom pET-11a (A), og lipid A former modifisert med PagL(st), (B), PagL(Pa) (C) og PagL(Bb) (D)ble analysert med ESI-MS. Hovertopper ved m/ z 1797,1928, 1622, og 1490 ble tolket som de karakteristiske heksaacylerte 6/s-fosfat former som typisk finnes i E. coli, en heksaacylert b/s-fosfater arter substituert med en L-Ara4N enhet, en 3-O-deacylert monofosfatform substituert med en L-Ara4N enhet, og en 3-O-deacylert monofosfatform, respektivt. Hovedtoppene ved m/ z 1716 og 1847 representerer sannsynligvis fragmentioner av formene ved m/ z 1797 og 1928. Fig 7. In vivo re- modifisering av deasylert LPS og funksjonen til endogent PagP. A, eksponentielt voksende E. coli BL21 Star™ (DE3) celler inneholdende den tomme pET-11a vektor eller PagL(Bb) plasmid ble indusert med IPTG for angitt tidsperiode. Prøvene korresponderende til 1 OD6ooenhet ble samlet og analysert med Tricin-SDS-PAGE. B og C, fettsyreinnhold i renset E. coli BL21 Star™ (DE3) villtype LPS (WT) og PagL(Bb) modifisert LPS (LBB), isolert ved den angitte tid etter induksjon av PagL ekspresjon, ble analysert med GC/MS. Angitt er de normaliserte C14/C14-30H- B og C14/C14(C) forhold med villtype LPS satt til 100 (verdier vist overstolpene). D, eksponentielt voksende villtype E. coli BL21 Star™ (DE3) eller E. coli BL21 Star™ (DE3) og dets pagP mutant derivat JG101, inneholdende Ppagl (Pa), ble indusert med IPTG for den angitte tidsperiode, hvoretter 1 OD6ooenhet dyrkningsprøver ble samlet og analysert på Tricin-SDS-PAGE gel. Fig 8. Topologimodell for PagL fra P aeruginosa. En modell for topologi av Pagl (Pa), ble konstruert ved anvendelse av generelle regler for ytre membranprotein-arkitektur som beskrevet i (44). Den foreslåtte modell består av en åttetrådet p-barell med fire sløyfer (L1-4) som strekker seg til det eksterne miljø. Enheter i de postulerte (3-tråder er vist i en ruter, som er skygget for enheter som eksponert til lipidbisjiktene. His-ugog Ser-151(markert i rødt; posisjon i Pagl(pa), forløper) er absolutt konservert (fig 2) og er antatt å være en del av en "klassisk" katalytisk triade av en serin hydrolase. Potensielle kandidater for syreenheten av den katalytiske triade er angitt med gult. Tallene refererer til posisjonen av enhetene i forløpersekvensen. Fig. 9. Identifisering av Pagl (pa), aktiv seteenheter med aminosyre-substituering. Eksponentielt voksende E. coli BL21 Star™ (DE3) celler inneholdende den tomme pET-11A vektor, pPagL(pa), plasmidet, eller mutant pPagL(Pa)iplasmidene ble indusert med IPTG i 75 min, hvoretter 1 OD6ooenheter dyrkningsprøver ble samlet og analysert med SDS-PAGE etterfulgt av immunoblotting med primære antistoff mot Pagl(pa)i(A) og Tricin-SDS-PAGE for å visualisere

LPS (B).

Fig 10. In vivo modifisering av B. pertussis LPS. A, LPS fra villtype B. pertussis stamme Tohama eller B. pertussis stamme Tohama som bærer pMMB67EH-PagL(Bb) plasmidet ble isolert og analysert med Tricine-SDS-PAGE. B, fettsyreinnhold i renset B. pertussis stamme Tohama villtype LPS (WT) og PagL(Bb)-modifisert LPS (PagL) ble analysert med GC/MS. Indikert er det normaliserte C14-3OH/C10-3OH forhold med villtype LPS innstilt ved 100 (verdier vist over stolpene). Fig 11. Biologisk aktivitet av isolert LPS. IL-6 (A) eller IL-10 (B) induksjon i MM6-celler med renset LPS. De horisontale akser gir LPS konsentrasjonen i mg/ml og de vertikale akser gir ELISA- avlesning ved 450nm. Fig 12. Varmemodifiserbarhet av renset, refoldet Pagl(Pa),(-) analysert med seminativ SDS-PAGE. Coomassie Brilliant blue fargete seminative SDS- PAGE gel viser varmemodifisrbarheten av renset, refoldet Pagl (pa)(-). Prøvene ble behandlet i prøvebuffere inneholdende 0,1 % SDS ved romtemperatur (RT) eller 2 % SDS ved 100° C (15 min), før elektroforese. Molekylvekt standardproteiner foreligger på venstre side. Fig 13. In vitro LPS modifisering av membranbunnet eller in vitro refoldet PagL. Sølvfarget Tricin-SDS-PAGE geler viser in vitro PagL aktivitet. A, renset N. meningitidis L3- LPS ble inkubert i en detergent inneholdende buffer i 18T ved 37° C med eller uten cellelommer fremstilt fra E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende tom pET-11 A, eller pPagL plasmidene. B, renset N. meningitidis L3-LPS ble inkubert i en detergentinneholdende buffer i fravær eller nærvær av 5mM EDTA i 181 ved 37° C med eller uten 4 ug in vitro refoldet Pagina), uten dets signalsekvens (Pagl(pa)(-)). Tilsvarende mengde av analyseblandinger ble applisert i alle spor. Fig 14. Analyse med Tricin-SDS-PAGE av in vivo LPS modifisering. LPS ble isolert fra villtype- og Pag P/Pag L-uttykkende B. pertussis stamme Tohama ved varm fenol/vann-ekstrahering, og analysert med Tricin-SDS-PAGE. Fig 15. Strukturanalyse med ESI-MS av villtype PagL/PagP- modifisert 8. pertussis LPS. Lipid A former av villtype B. pertussis stamme Tohama (A) og lipid A former modifisert med PagL(Bb) (B), PagP(Ec) (C), og PagL(Bp) (D) ble analysert med ESI-MS. Hovedtopper ved m/ z 1557, 1477, 1387, 1307, 1251 og 1081 ble tolket som det karakteristiske pentaacylerte 6/s-fosfat formene som typisk finnes i B. pertussis, de korresponderende pentaacylerte monofosfatformene, de deacylerte lipid A formene av molekylionet ved m/ z 1557 som mangler den primære 3-hydroksydekanoisk syreenhet ved 3- posisjon, den deacylerte lipid A form av det molekylære ion ved m/ z 1477 som mangler den primære 3-hydroksy dekanoisk syreenhet ved 3-posisjon, den deacylerte lipid A form av molekyl ion ved m/ z 1477 som mangler en primær 3-hydroksy tetradekanoisk syreenhet, og de deacylerte lipid A former av molekylion ved m/ z 1477 som mangler både primær 3-hydroksy dekanoisk syreenhet ved 3-posisjon og en primær 3-hydroksy tetradekanoisk syreenhet, respektivt. Toppene ved m/ z 1320,1490,1545,1625,1715 og 1796 korresponderer til PagP-mediert palmitoylering av molekylionene foreliggende ved m/ z 1081,1251,1307, 1387, 1477 og 1557, respektivt.

Eksempler.

Eksperimentelle prosedyrer.

Bakterielle stammer og vekstbetingelser.

Alle bakterielle stammer anvendt i dette forsøk er beskrevet i tabell I. Typisk, E. coli og P. aeruginosa stammene fikk vokse ved 37° C på modifisert Luria-Bertani buljong agar, benevnt LB agar (26), eller i LB-buljong, ristende ved 200 rpm. For E. coli ble medium tilsatt 0,2 % glukose. Dersom hensiktsmessig fikk bakteriene vokse i nærvær av 100 ug/ml ampicillin, 50 ug/ml kanamycin, 50 ug/ml naladixic syre, eller 100 ug/ml streptomycin, for plasmid opprettholdelse eller stammeseleksjon. S. Typhimurium SR11 fikk vokse på LB agarplater ved 37° C. B. Bronchiseptica og B. pertussis stammene fikk vokse ved 35° C på Borduet-Gengou agar (Difco) tilsatt 15 % defibrinert saueblod. For å indisere ekspresjon av pagL(Bb) genet i B. pertussis fikk bakteriene vokse i syntetisk Thisj medium (48) tilsatt 1 med mer isopropyl-1-thio-p-D-galaktopyranosid (IPTG) (slutt konsentrasjon) ved 35° C, under risting (180 rpm).

Rekombinante DNA- teknikker

Plasmid DNA ble isolert ved anvendelse av Promega Wizard<®>Plus SV Minipreps system. Alkalisk fosfatase fra kalvetarm og restriksjonsendonuklease ble anvendt i samsvar med restriksjonene fra leverandøren (Fermentas). DNA- fragmenter ble isolert fra agarosegeler ved anvendelse av Quiagen hurtiggel ekstraheringskitt. Ligering ble utført ved anvendelse av hurtig DNA ligeringskitt (Roche).

pagL genene fra S. Typhimurium SR 11 (pagL(st), B. bronchiseptica B505 (pagL(Bb) og pagL genet, med eller uten dets signalsekvenskodende del, fra P. aeruginosa PA025 (pagL(Pa), pagL(Pa)(-)) ble klonet inn i pET-11a (Novagen) bak T7-promotoren. Genene ble mangfoldiggjort med PCR ved anvendelse av kromosomalt DNA som templat. Templat DNA ble fremstilt ved å respondere~10<9>bakterier i 50 pl destillert vann, hvoretter suspensjonen ble oppvarmet i 15 min ved 95 °C. Suspensjonen ble deretter sentrifugert i 1 min ved 16100x g, hvoretter supernatanten ble anvendt som templat DNA. Sekvensene av forward primere som inneholdt et A/del sete (understreket), inkluderende et ATG startkodon, var

Sekvensene av de reverse primere, som inneholdt en BamHI sete (understreket) og inkluderende et stoppkodon, var 5'-AA GGATCCTCAGAAATTATAACTAATT-3'

(pagL(st)), 5'-A AGGATCCCTAGATCGGGATCTTGTAG-3' ( pagL{ Pa), pagL{ Pa)(-)), og 5'-A AGGATCCTCAGAACTGGTACGTATAG-3' ( pagLm).

PCRene ble utført under følgende betingelser; 50 pl totalt reaksjonsvolum, 25 pmol av hver primer, 0,2 med mer dNTPer, 3 pl templat DNA- løsning, 1,5 % dimetyl-sulfoksid, 1,75 enheter av Expand High Fidelity enzymblanding med buffer levert av leverandør (Roche). Temperaturprogrammet var som følger: 95 °C i 3 min, en syklus på 1 min ved 95 °C, 1 min ved 60 °C, og 1 min 30 s ved 72 °C repetert 30 °C, etterfulgt av 10 min ved 72° C og deretter avkjøling til 4 °C. PCR- produktene ble renset fra agarosegel og deretter klonet inn i pCRII-TOPO. Plasmid DNA fra korrekte kloner ble oppkuttet med Nde\/ BamH\, og PagL-kodende fragmenter ble ligert inn i Nde\ IBamH\- oppkuttet pET-11a. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli DH5a ved anvendelse av CaCI2metoden, (27). Plasmid DNA fra transformanter ble kontrollert for nærvær av det korrekte PagL-dekodende innskudd ved oppkutting med A/del og BamHI. Plasmidene som gav en korrekt oppkuttingsprofil ble angitt pPagL(Pa), pPagl_(Pa)(-), pPagL(Bb) og pPagL(St) (tabell I). De korrekte kodesekvenser av de klonete pagL gener ble bekreftet med nukleotidsekvensering i begge retninger. For å subklone pagL{ Bb) genet inn i bred vert, lavkopi pMMB67EH vektoren, ble pPagL(Bb)-plasmid DNA oppkuttet med Xbal og H/nDIII, og Pagl_(Bb)-kodende fragment ble ligert inn i Xba\ IHinD\\\- oppkuttet pMMB67EH. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E-coli DH5 a. Plasmid DNA fra transformanter ble kontrollert for nærvær av det korrekte PagL-kodende innskudd med oppkutting med Xba\ og H/nDIII. Et plasmid som gav en korrekt oppkuttingsprofil ble angitt som pMMB67EH- PagL(Bb) (tabell I). Det siste plasmid ble anvendt for å transformere E. coli SM10, som muliggjorde påfølgende overføring av pMMB67EH- PagL(Bb)til B. pertussis ved konjungering på faststoffmedium som beskrevet av Stibitz et al (52). Mutasjoner ble introdusert i pagL med anvendelse av QuikChange<®>seterettet mutagenesekitt (Stratagene), og primerene angitt i tabell II. Plasmid pPagL(Pa) ble anvendt som templatet hvor mutasjonene ble etablert. Nærvær av de korrekte mutasjoner ble bekreftet med nukleotidsekvensering i begge retninger.

SDS-PAGE og immunoblotting

Proteiner ble analysert med natriumdodesylsulfat polyakrylamidgel elektroforese

(SDS-PAGE) (28), med 0,2 % SDS i den kjørende gel, ved anvendelse av Bio-Rad Mini-Protean<®>3 apparatur. Prøvene ble applisert på en 13 % polyakrylamidgel med en 4 % stacking gel og underlagt elektroforese ved 150 V. Proteinet ble farget med Coomassie Brilliant Blue. Prefargete eller refargete Precision Plus Protein™ Standard fra Bio-Rad ble anvendt for å bestemme den relative molekylmasse (Mr). For Western blotting ble proteinene overført fra SDS-PAGE geler til nitrocellulose-membraner. Membranene ble blokkert natten over i fosfatbufret saltløsning ((PBS)

(pH 7,6), 0,5 % ikke- fett tørket melk, 0,1 % Tween-20 og inkubert med primære antistoff rettet mot PagL(Pa) i blokkeringsbuffer, etterfulgt av inkubering med pepper-rot peroksidasekonjungert kanin antimarsvin IgG antistoff (Sigma) i blokkeringsbuffer. Blottenne ble utviklet ved anvendelse av SuperSignal<®>WestPico Chemiluminiscent Substrat (Pierce).

Semi-Nativ SDS-PAGE.

Proteiner ble analysert med natrium dodesyl sulfatpolyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) (28) med 0,2 % SDS i kjøregelen, ved anvendelse av Bio-Rad Mini-Protean<®>3 apparatur. For seminativ SDS-PAGE ble ingen SDS tilsatt til kjøregel og stacking gel, og prøvene ble ikke oppvarmet før elektroforese. Prøvene ble applisert på en 13 % polyakrylamid gel med en 4 % stacking gel og underlagt elektroforese ved 150 V. For seminativ SDS-PAGE ble elektroforese utført med en konstant strøm på 15 mA på is. Proteinene ble farget med Coomassie Brilliant Blue. Prefargete eller ufargete Precision Plus Protein™ Standard fra Bio-Rad ble anvendt for å bestemme den relative molekylmasse (Mr).

Tricin-SDS-PAGE

LPS-inneholdende prøver 0,5 mg/ml proteinase K (sluttkonsentrasjon) ble tilsatt til prøvebuffer (28). Prøvene ble inkubert i 60 min ved 55 °C, etterfulgt av 10 min ved 95 °C for å inaktivere proteinase K. Prøvene ble deretter fortynnet 10 ganger ved tilsetning av prøvebuffer, hvoretter 2 pl av prøvene ble applisert til en Tricin-SDS-PAGE gel (30). Bromfenol blått fikk kjøre inn i den separerende gel ved 35 V, hvoretter spenningen ble økt til 105V. Etter at fronten hadde nådd bunnen av gelen ble prøvene satt til henstand på kjøring for ytterligere 45 min. Gelene ble fiksert natten over i vann/etanol/eddiksyre 11:8:1 (v/v/v) og deretter farget med sølv som beskrevet (31).

Polyklonale antistoff

For antistoffproduksjon ble pPagL(Pa)(-) anvendt for å transformere E. coli BL21 Star™ (DE3) for å muliggjøre ekspresjon av det trunkerte pagL gen. PagL(Pa) protein, akkumulerende i inklusjonslegemer, ble isolert (29), renset fra en preperativ SDS-PAGE gel, og anvendt for immunisering av marsvin ved Eurogentec.

Mikrosekvensering

Proteiner ble overført fra SDS-PAGE geler til et lmmobilon™-P polyvinyliden difluormembran (Millipore Corp.) i 192mM glysin, 25mM Tris,(pH 8,3), 10 % metanol (v/v) ved 100 V i 1 time ved anvendelse av Bio-Rad Mini-PROTEAN<®>2 blottings- apparatur. Etter overføring ble membranen vasket tre ganger i 15 min med destillert vann. Overførte proteiner ble farget med Coomassie Brilliant Blue. Membranen ble tørket i luft, og diputative PagL bånd ble utkuttet og underlagt mikrosekvensering ved Sequencing Center Facility, Utrecht University, the Netherlands.

Isolering av LPS og analyse med gasskromatografi/massespektrometri (GC/MS).

LPS ble isolert ved anvendelse av varm fenol/vann ekstraheringsmetode (3). Kort forklart, B. pertussis stamme Tohama, med eller uten plasmid pMMB67EH- PagL(Bb), fikk vokse i 3 liter Thijs medium (48) i nærvær av 1mM IPGT (sluttkonsentrasjon). Cellene ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i 40mM natriumfosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 5mM EDTA. Cellene ble behandlet natten over med lysozym ved 4 °C, hvoretter et likt volum av fenol ble tilsatt. Suspensjonen ble oppvarmet til 70 °C, og inkubert i 30 min under risting. Suspensjonen ble avkjølt til 10 °C, hvoretter faser ble separert med sentrifugering. Den øvre fase ble samlet, og ekstrahering ble repetert ved tilsetning av et likt volum destillert vann til den lavere fase. Etter påfølgende inkubering ved 70 °C, avkjøling, og sentrifugering, ble de to øvre faser blandet og dialysert mot springvann inntil fenolduften forsvant. Etter frysetørking av de dialyserte fraksjoner ble LPS oppløst i fosfatbufret saltløsning (pH 7,2) med en konsentrasjon av 1 mg/ml. For fettsyreanalyse med GC/MS ble et fem gangers (vol/vol) overskudd av aceton tilsatt til en alikvot av isolert LPS, hvoretter løsningen ble tørket ved 60° C under en strøm av nitrogen. Deretter ble 10 pg C12:0 (20H) (1 mg/ml i etanol) tilsatt som en indre standard, og likeledes 100 pl acetylklorid/etanol 1:9 (vol/vol), hvoretter prøvene ble derivatisert i 1 time ved 90° C. Etter avkjøling ble reaksjonen stoppet ved tilsetting av 200 pl i 1 M K2HP04(pH 8,0), etterfulgt av ekstrahering av acyletylesterene med 200 pl etylacetat. Et 1- pl volum av den øvre fase ble anvendt for analyse med GC/MS på et Finnigan MAT SSQ i elektron impact modus.

Biologisk aktivitet av LPS.

IL-6 og IL-10 induksjon av villtype- og PagL-modifisert B. Pertussis Tohama LPS ble testet med den humane makrofagcellelinje MM6 (49). MM6- cellene ble utsådd i mokrotiterplater (2.10<5>/brønn) i 400 pl IMDM (Gibco BRL) tilsatt 10 % føtalt kalveserum (Gibco BRL), og stimulert med 200 pl serielle fortynninger av LPS forrådsløsning, i 16-181 ved 37 °C i en humid atmosfære inneholdende 5 % C02. IL-6 og IL-10 nivåer i dyrkningssupernatantene ble kvantifisert med ELISA mot human IL-6 eller IL-10 i samsvar med instruksjonene fra leverandøren (PeliPair™ reagens sett, Sanquin Reagents, Amsterdam, The Netherlands).

Isolering av cellelommer

Cellene ble høstet med sentrifugering i 10 min ved 1500 x g, og vasket en gang i 50 ml kald 0,9 % natriumkloridløsning. Cellepelletene ble frosset i minst 15 min ved - 80 °C, og deretter suspendert i 20 ml 3mM EDTA, 10mM Tris-HCI (pH 8,0) inneholdende Complete Protease inhibitor coctail (Roche).

Cellene ble ødelagt ved sonikering, hvoretter ikke-ødelagte celler ble fjernet med sentrifugering i 10 min ved 1500x g. Cellelommene ble pelletert fra supernatanten ved sentrifugering i 1,51 ved 150 000x g, og resuspendert i 2mM Tris-HCI (pH 7,4). Cellelommene ble lagret ved - 80° C i alikvoter.

Isolering av inklusjonslegemer

For isolering av inklusjonslegemer, ble PagL(pa)(-) uttrykt i E. coli BL21 Star™ (DE3) fra pPagL(pa)(-) (Tabell 1). En toliter kultur fikk vokse ved 37 °C i LB medium tilsatt ampicillin til en OD6ooO,4 og 0,6. Deretter ble 1mM IPTG (sluttkonsentrasjon) tilsatt til kulturen for å indusere ekspresjon av det rekombinante gen, hvoretter kulturen ble inkubert ytterligere ved 37 °C, under risting. Etter ca 4 timer ble cellene høstet ved sentrifugering (15 min ved 4000 rpm (4 °C). Høstede celler ble vasket en gang i 400 ml 0,9 % NaCI og deretter resuspendert i 80 ml TE 50:40 (50mM Tris-HCI (pH 8,0), 40mM EDTA). Sukrose (0,25 g/ml) konsentrasjon og lysozym (0,2 mg/ml) konsentrasjon ble tilsatt, hvoretter suspensjonen ble inkubert i 30 min ved RT, under risting. Suspensjonen ble sonikert tre ganger på is (1,5 min, med 2 min pauser derimellom) ved anvendelse av en Branson 250 Sonfier med mikrotip (effekt 9, puls/pause-forhold 50 %). Etter sonikering ble 0,13 % (vekt/vol) Brij-35P (Fluka) tilsatt, og suspensjonen ble sonikert i ytterligere 2 min. Tett materiale (inklusjonslegemer) ble samlet med sentrifugering i 2 timer ved 4000 rpm (4 °C) hvoretter pellet ble vasket en gang i 40 ml TE 50:40, etterfulgt av et ytterligere vasketrinn ved anvendelse av 40 mMOmM Tris-HCI (pH 8,3). De oppnådde inklusjonslegemer ble solubilisert i 8 M urea tilsatt 10 mM glysin (pH 8,3), og presipitert med TCA. Til slutt ble de oppnådde proteiner solubilisert i 8 M urea tilsatt 10 mM glycin (pH 8,3) ved en proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml. Denne blanding ble sentrifugert i 2 timer ved 13000 rpm for å fjerne uløselige restmaterialer og membraner.

Refolding og rensing av PagL(pa)(-)

PagL(Pa)(-) ble refoldet in vitro med to gangers fortynning av 10 mg/ml protein-løsningen (se over) i 10 % (vekt/vol) lauryldimetylaminooksid (LDAO) og deretter sonikert i 10 min. Refoldet PagL(Pa)(-) ble renset med Fast Protein Liquid Chromatografi (FPLC) ved anvendelse av 1 ml MonoQ (Amersham Biosiences) ioneutbyttekolonne. Proteinløsningen ble fortynnet 4 ganger i buffer A (20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 0,08 % (w/v) C10E5). Løsningen ble applisert på kolonnen, som ble preekvilibrert med buffer A og vasket en gang med buffer A, og proteinene ble eluert med en lineær gradient av 0-1 M NaCI i buffer A. Fraksjoner ble analysert med SDS-PAGE for nærvær av det refoldete PagL (pa) (-) protein. De som inneholdt proteinet ble samlet og konsentrert til en proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml ved anvendelse av Centricon konsentrasjoner med en molekylmasse cut-off på 3 kDa (Amicon). Protein-løsningen ble deretter dealysert tre ganger natten over mot 10 ml 2 mM Tris-HCI (pH 8,0), 0,06 % (w/v) Ci0E5ved anvendelse av en membran med en molekylmasse cut-off av 3,5 kDa.

In vitro modifiseringsanalyse

Refoldet PagL(Pa)(-) (10 mg/ml) av cellelommer isolert fra E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende den tomme vektor pET-11A eller pPagL-plasmidene ble fortynnet 10 ganger i dobbelt destillert vann. 4 pl av fortynnet refoldet protein eller cellelomme-løsning ble inkubert i 50 mM Hepes (pH 8,0), 0,1 % Triton X-100, 0,5 M NaCI, og 0,75 mmol N. meningitidis L3- LPS i et finalt volum av 10 pl ved 37° C i 16 timer. For å teste om reaksjonen var avhengig av divalente kation ble 5 mM EDTA tilsatt til reaksjonen med det refoldete PagL (Pa) (-). Reaksjonene ble terminert ved koking i prøvebuffer (28), hvoretter prøvene ble behandlet med 0,5 mg/ml proteinase K i 1 time ved 55° C, etterfulgt av 10 min inkubering ved 95° C. Prøvene ble fortynnet 25 ganger ved tilsetting av prøvebuffer, hvoretter 2 pl av prøvene ble analysert med Tricin-SDS-PAGE (se over).

Isolering av LPS og analyse med elektrospray ioniseringmassespektrometri (ESI-MS).

LPS ble isolert ved anvendelse av varm fenol/vann ekstraheringsmetode Westphal and Jann, Methods Carbohydr. Chem. 5; 83-91,1965) med noen modifiseringer. Kort forklart, bakteriene fikk vokse i THIJS medium i nærvær av 1 mM IPTG (sluttkonsentrasjon) i 641. Cellene ble høstet med sentrifugering, og resuspendert i 40 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 5mM EDTA. Cellene ble behandlet natten over med lysozym ved 4° C, hvoretter et likt volum av fenol ble tilsatt. Suspensjonen ble oppvarmet ved 70° C, inkubert i 30 min under risting, og deretter avkjølt til 10° C, hvoretter faser ble seponert med sentrifugering i 10 min ved 8000x g. Den øvre fasen ble samlet, og ekstraheringen ble repetert etter tilsetning av et likt volum av destillert vann til den lavere fase. De to øvre faser ble kombinert, dialysert mot springvann inntil fenolduften forsvant, frysetørket, og deretter opptatt i destillert vann. LPS ble deretter pelletert med sentrifugering i 31 ved 150000 x g og oppløst i destillert vann, hvoretter LPS-konsentrasjonen ble bestemt ved analysering av 3-hydroksytetradekanoisk syreinnhold, ved anvendelse av 6890 Agilent gasskromato-grafi, som beskrevet (Welch, Clin. Microbiol. Rev. 1991). For ESI-MS ble 200 pl alikvot av isolert LPS (50nmol/ml) frysetørket og opptatt i 0,1 ml 2 % eddiksyre. Blandingen ble oppvarmet i 21 ved 95° C for å hydrolysere LPS og frigjøre lipid A enheten. Deretter ble blandingen avkjølt i romtemperatur, og sentrifugert i 10 min ved 16100 x g. Pellet ble vasket to ganger i 0,1 ml dobbelt destillert vann, opptatt i 0,1 ml dobbelt destillert vann, og 0,3 ml kloroform/metanol (2:1, v/v) ble tilsatt. Etter kraftig vorteksing ble fasene separert med sentrifugering i 10 min ved 16100 x g. Den øvre fase ble deretter anvendt for strukturanalyse av renset lipid A med nano-elektrospray tandem MS på et Finnigan LCQ i negativ ionemodus (Wilm amd Mann, Anal. Chem. 1996).

Eksempel 1: Identifisering av PagL homologer i forskjellig Gram negative bakterier.

Den 187 aminosyresekvens av S. Typhimurium PagL forløperprotein (genbank katalognummer AAL21147, SEQ ID No. 17) ble anvendt som en ledetråd for å identifisere putative PagL homologer i andre Gram negative bakterier, ved å søke alle komplette og uferdige genomer av Gram negative bakterier som foreligger i NCBI databasen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi). BLAST-søk (34) viste nærvær av putative homologer i Bordetella spp. B. pertussis, B. bronchiseptica og B. parapertussis (Fig 2). PagL-homologer av B. bronchiseptica og B. parapertussis er to gjensidig identiske 178 aminosyre polypeptider (Fig 2) med, som predikert av signalP-serveren (35), en 25 aminosyre N-terminalt signalpeptid. Et gen for en PagL homolog ble også funnet i genomet fra B. pertussis Tohama I stamme (36), men denne åpne leseramme (ORF) var ødelagt av et rammeskift (SEQ ID No. 4), som kunne repareres som i SEQ ID No. 5 for å kode for et protein som i SEQ ID No. 1. Nukleotidsekvensering av PagL ORF er fra B. pertussis stamme B509 og B134 viste også nærvær av det samme rammeskift<2>, som indikerte at ødeleggelse av PagL ORF kan være et felles trekk i B. pertussis stammer. Ved anvendelse av den nylig identifiserte B. bronchiseptica PagL homolog som et probe for ytterligere BLAST analyse, ble ytterligere putativ pagL homologer identifisert i genomene av P. aeruginosa (SEQ ID No. 6, 30 % identitet), Pseudomonas fluorescens (SEQ ID No. 7, 29 % identitet), Pseudomonas syringae (SEQ ID No. 8, 31 % identitet), Pseudomonas putida, 2x (SEQ ID No. 9 + 10, 32/33%), Ralstonia metallidurans (SEQ ID No. 15, 28 %). Ralstonia solonacearum (SEQ ID No 16, 29 %), Burkholderia matlei (SEQ ID No12, 28 %), Burkholderia pseudomallei (SEQ ID No 13, 28 %), Burkholderia fungorum (SEQ ID No 11, 29 %) og Azotobacter vinelandii (SEQ ID No 14, 27 %). Alignment er vist i Fig 2. Totalt, alle PagL homologer utviste en lav total gjensidig sekvensidentitet, om enn høyere enn med S. typhimurium (24 % identitet), men inneholdt et klart homologt domene nær C terminus. Våre funn av dette konserverte motiv muliggjør identifisering av PagL homologer i andre (baktrerielle) arter og muliggjør anvendelse av egnet PagL homologi for enhver vert baktere og/eller ethvert LPS som 3-O-deacyleres.

Eksempel 2: Kloning av pagL og heterolog ekspresjon i E. coli.

For å verifisere deres putative lipid A deacylaseaktivitet klonet vi pagL homologer av P. Aeruginosa ( PagL( paj) og B. bronchiseptica ( PagL( Bbj). Vi inkluderte i disse studier pagL(st)Som en referanse. Disse pagL-gener ble mangfoldiggjort fra kromosomene med PCR og til slutt klonet i pET-11a under kontroll av T7-promoter, resulterende i plasmidene pPagL(Pa), pPagL(Bb) og pPagL(St).

For å undersøke ekspresjon og membranlokalisering av PagL i E. coli, ble E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende tom vektor pET-11a eller pPagL-plasmidene dyrket natten over i LB, hvoretter cellelommene ble isolert. Analyse av SDS-PAGE viste nærvær av prominente ytterligere bånd med Mrerpå 15000-18000 i cellelommene i cellene som utrykker PagL (Fig 3). Dette var i samsvar med forventede molekyl-masser av de modne PagL proteiner, det vil si PagL(Pa), 16,1 kDa, PagL(Bb), 17,2 kDa, og PagL(st), 18,2 kDa. For å identifisere de ytterligere proteinbånd ble de underlagt mikrosekvensering. Sekvensene av de første 5 aminosyreenheter av PagL(pa), PagL(Bb), og PagL(St), ble ADVSA, QPTQG, og NDNVF, respektivt, noe som indikerer at spalting av signalpeptidet med lederpeptidase foregår mellom aminosyreenheter 23 og 24 (AQA-ADV), 25 og 26 (AQA-QPT), og mellom 20 og 21 (CSA-NDN), respektivt. Spesielt i tilfelle ekspresjon av PagL(Bb) var et ytterligere bånd med en høyere Mr synlig på gelen (Fig 2). Den N-terminale sekvens av dette bånd, MQFLK, korresponderer med det til forløper Pagl_(Bb).

Eksempel 3: In vivo modifisering av E. coli LPS med PagL.

For å studere om de klonete PagL homologer var aktive på E. coli LPS ble IPTG tilsatt til eksponentielt voksende E. coli BL21 Star™ (DE3) celler inneholdende den tomme vektor pET-11a eller pPagL-plasmidene og etter forskjellige inkuberings-perioder ble prøvene ekvivalent til en OD6ooenhet samlet, og deres LPS innhold ble analysert med Tricin-SDS-PAGE. I samsvar med den forventede hydrolyse av R- 3-hydroksymyristat ved 3-posisjon av lipid A, ble ekspresjon av enhver av de tre pagL homologer omdannet LPS til en form med en høyere elektroforetisk mobilitet (Fig 4). Omdanningen var omtrent fullstendig innen 75 min etter PagL (pa) eller PagL(Bb>ble indusert, men tok noe lengre tid i tilfelle av PagL(st)

Strukturanalyse av PagL-modifisert LPS: for å bestemme dets fettsyreinnhold ble LPS isolert fra bakterier som fikk vokse i nærvær av 10 mM MgCfefor å undertrykke PhoP/PhoQ- regulerte modifiseringer av lipid A og analysert med GC/MS. C14:0/C14:0(3OH)-forholdet i PagL-modifiserte LPS-prøver økte sammenlignet med tilsvarende for villtype LPS (Fig 5), i samsvar med den forventede fjerning av en C14-30H fra lipid A. For å bekrefte disse data ble lipid A enhetene isolert og analysert med ESI-MS i positiv ionemodus, som viste nærvær av fire hovedlipid A former i villtype LPS (Fig 6A). Toppen ved m/ z 1797 representerer de karakteristiske heksa-acylerte b/s-fosfatformene som typisk finnes i E. coli, mens toppen ved m/ z 1928 korresponderer til en heksaacylert b/s-fosfatform substituert med en L-Ara4N enhet. De to resterende topper ved m/ z 1716 og m/ z 1847 representerer mest sannsynlig fragmentioner av de to tidligere former som mangler en fosfatgruppe. Ved uttrykking av PagL(St) (Fig. 6B), PagL(Pa) (Fig. 6C), eller PagL(Bb) (Fig. 6D), forelå hovedlipid A formene ved m/ z 1622 og m/ z 1490, som korresponderer til tap av en |3-hydroksymyristat enhet og en fosfatgruppe fra hovedformene ved m/ z 1928 og m/ z 1797 som foreligger i den tomme vektor kontroll, respektivt. Også her er tap av fosfatgruppen sannsynligvis et artefakt av ioniseringsprosedyren. Basert på GC/MS og ESI-MS data kan det konkluderes at de identifiserte PagL homologer av P. aeruginosa og B. bronchiseptica, som for S. Typhimurium, er aktive lipid A deacylase. Dataene antyder at deacylering ikke er avhengig av fravær eller nærvær av en L-Ara4N enhet, siden begge former ble deacylert effektivt.

Eksempel 4: Påfølgende in vivo modifisering av PagL deacylert LPS.

Under forløpet av disse eksperimentene ble det observert at etter prolongert PagL ekspresjon var PagL modifisert LPS ikke lenger detekterbar på Tricin-SDS-PAGE geler, og at LPS igjen migrerte ved posisjonen til villtype LPS, som illustrert for stammen som utrykker PagL(Bb) (Fig 7A). PagL-proteinet var fremdeles til stede i stor mengde ved dette tidspunkt, slik det fremkommer på SDS-PAGE geler (data ikke vist). Videre, analyser med GC/MS viste at C14:0/C14:0(3OH)-forholdet ikke var redusert igjen for det LPS som ble isolert etter 51 induksjon av PagL(Bb) (Fig 7B). Således, den sekundære modifisering observert på Tricin-SDS-PAGE-gelen (Fig 7A) var ikke konsekvens av restorering av PagL-modifiseringen, men resultatet av (en) ytterligere modifisering (er) som restaurerte den elektroforetiske mobilitet til den for villtype LPS. Derfor, andre fettsyreforhold ble sammenlignet. En bemerkelsesverdig økning i C16:0/C14:0-forholdet ble funnet i LPS av celler indusert i 51 for PagL-produksjon (Fig 7C), noe som antyder at PagL-deacylert LPS deretter ble palmitoylert.

Et protein som tilføyer palmitat til lipid A er yttermembranproteinet PagP (19) (Fig 1). Derfor var hypotesen at den sekundære modifisering av PagL-modifisert LPS kan ha vært resultatet av endogen PagP aktivitet. For å undersøke denne mulighet ble villtype E. coli BL21 Star™ (DE3) transformert og dets pagP mutant derivat JG101 med pPagL(Pa) plasmid. Den sekundære modifisering av PagL-modifisert LPS ble igjen observert i tilfelle av villtypestammen, men ikke i den mutante stamme (Fig 7D). Dette resultat antyder sterkt at den sekundære modifisering av PagL- modifisert LPS (Fig 7A) faktisk er en konsekvens av endogen PagP-aktivitet.

Eksempel 5: Identifisering av PagL aktiv seteenheter.

Den felles sekvens identitet mellom de identifiserte PagL homologer er svært lav (Fig 2). Blant de få totalt konserverte enheter er en histidin og en serin, som, vi antar, kan være en del av en "klassisk" Asp/Glu-His-Ser katalytisk triade av serin hydrolaser. Disse putative aktive seteenheter er lokalisert ved den lipid-eksponerte side nær toppen av en (3-tråd i en topologimodell vi foreslår (Fig 8). Det er interessant at i ytre membran fosfolipase A, er aktivt sete His og Ser er lokalisert i en tilsvarende posisjon (37). For å teste om disse enheter, lokalisert ved posisjoner 149 og 151 av Pagl (Pa), forløperproteinet, respektivt, faktisk er viktig for den katalytiske aktivitet ble de substituert av alanin og asparagin, og med alanin eller cystein, respektivt. Som en kontroll ble de samme substitueringer utført for en ikke-konservert histidin og serinenhet, lokalisert ved posisjoner 81 og 84 av Pagl (Pa) forløpere, respektivt. Proteinet og LPS-profilene av E. coli BL21 Star™ (DE3) cellene som bærer de relevante plasmider og som var indusert i 75 min med IPTG ble analysert med immunoblotting (Fig 9A) og Tricin-SDS-PAGE (Fig 9B), respektivt. Mens substituering av de ikke-konserverte His81 og Ser84 ikke påvirket LPS deacylering, ble deacylering av LPS ikke lenger observert idet de konserverte His149 og Ser151 var substituert (Fig 9B), selv om ekspresjon av disse mutante proteiner ikke var påvirket (Fig 9A). Disse resultater støtter sterkt hypotesen om at den konserverte histidin ved posisjon 149 og serin ved posisjon 151 av forløperen PagL (pa) proteinet er aktive seteenheter og at PagL mekanistisk fungerer som en serin hydrolase.

Eksempel 6: Kloning av PagL(Bb)Og heterolog ekspresjon i B. pertussis.

For å modifisere B. pertussis LPS in vivo ble pagL-genet av B. bronchiseptica (PagL(Bb)) klonet. PagL-genet ble mangfoldiggjort fra kromosomet med PCR og til slutt klonet inn i pMMB67EH under kontroll av Tac-promoter, resulterende i plasmid pMMB67EH- PagL(Bb), som ble overført til B. pertussis stamme Tohama ved konjugasjon.

For å undersøke modifisering av B. pertussis LPS in vivo ble villtype B. pertussis stamme Tohama, eller B. pertussis stamme Tohama inneholdende plasmidet pMMB67EH-PagL(Bb) dyrket i Thijs medium tilsatt 1mM IPTG (sluttkonsentrasjon). LPS ble isolert med varm fenol-vann-ekstraheringsmetode og analysert med Tricin-SDS-PAGE (Fig 10 A) og GC-MS (Fig 10 B). Analyser av Tricin-SDS-PAGE-gel viste at LPS isolert fra PagL(Bb)-uttrykkende stamme migrerte noe hurtigere sammenlignet med villtype B. pertussis LPS. Overraskende, LPS isolert fra PagL(Bb)- uttrykkende stamme viste to distinkte LPS-populasjoner. En populasjon migrerte rundt høyden av villtype Tohama LPS, og en populasjon migrerte hurtigere. Denne siste LPS-populasjon kan også sees i villtype LPS preparat, imidlertid er mengden av den mye lavere. For å verifisere at LPS fra PagL-uttrykkende stamme faktisk var deacylert ved dets 3-posisjon, ble den analysert med GC-MS. Forholdet C14:0(3OH)/ C10:0(3OH) i PagL-modifisert LPS-prøve ble øket sammenligning med villtype LPS (Fig 10B), som er i samsvar med den forventede fjerning av en C10-3OH fra 3-posisjon av B. pertussis lipid A.

Eksempel 7: Biologisk aktivitet av PagL-modifisert LPS.

For å undersøke den endotoksiske aktivitet av PagL-modifisert og villtype B. pertussis LPS ble deres evne til å stimulere produksjon av IL-6 og IL-10 i human makrofagcellelinjen MM6 målt. Som det fremgår av Fig 2, for villtype LPS var produksjonen av både IL-6 (Fig 11A) og IL-10 (Fig 11B) av MM6-cellene øket sammenlignet med idet cellene var stimulert med tilsvarende mengde PagL-modifisert LPS. Således kan det konkluderes at in vivo deacylering av B. pertussis LPS med PagL resulterer i en reduksjon i endotoksisk aktivitet av denne LPS.

Eksempel 8: Kloning, ekspresjon, rensing og refolding av PagL (pa).

PagL-genet fra P aeruginosa PA025 uten dets signalsekvenskodende del ble klonet inn i pET-11a, resulterende i plasmid pPagl(pa)(-). For å oppnå inklusjonslegemer ble PagL uten dets signalsekvens uttrykt i E. coli BL21 Star™ (DE3). Inklusjonslegemer ble isolert og solubilisert i urea, etter at proteinet ble refoldet med fortynning to ganger i 10 % lauryldimetylamin oksid (LDAO) og ytterligere renset med Fast Protein Liquid kromatografi (FPLC). Korrekt refolding ble bekreftet med SDS-PAGE (Fig 12) og sirkulær dikroisme (CD) målinger (Data ikke vist). På SDS-PAGE-gelen hadde det refoldede protein en lavere elektroforetisk mobilitet sammenlignet med den denaturerte form, mens CD-målingene viste at det refoldete protein i hovedsak hadde en p-ark konformasjon.

Eksempel 9: In vitro LPS modifisering med membranlokalisert og refoldet PagL.

For å teste om membranlokalisert eller in vitro refoldet PagL var i stand til å modifisere eksternt tilsatt LPS in vitro, ble refoldet PagL(Pa)(-) eller isolerte cellelommer fra E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende den tomme vektor pET-11a, eller pPagL-plasmidene inkubert sammen med renset LPS av N. meningitidis. Modifisering av LPS ble undersøkt med Tricin-SDS-PAGE (Fig 13). I samsvar med den forventede hydrolyse av R-3-hydroksymyristat ved 3-posisjon av lipid A ble LPS omdannet til en form med en høyere elektroforetisk mobilitet idet membran-lokalisert PagL (Fig 13), eller refoldet Pagl(pa)(-) (Fig 13B) forelå. Reaksjonen med den refoldete PagL(pa)(-) var uavhengig av nærvær av divalente kationer, idet deacylering av LPS fremdeles ble observert i nærvær av 5 mM EDTA (Fig 13B).

Eksempel 10: Forandret lipid A struktur etter ekspresjon av PagP og PagL i 8. pertussis.

For å utrykke PagP og PagL i B. pertussis stamme Tohama, ble pagL-genet av B. bronchiseptica PagL^) og pagP-genet av B. pertussis PagL(BP) uttrykt fra bred-vert lavkopiantall ekspresjonsvektor pMMB67EH. Som en kontroll ble en stamme som utrykker pagP-genet av E. coli pagP(Ec) også konstruert. LPS ble isolert fra villtype, PagP uttrykkende eller PagL uttrykkende B. pertussis stamme Tohama og analysert med Tricin-SDS-PAGE. LPS isolert fra PagL(Bb) uttrykkende stamme syntes ikke påvirket på gelen, mens den fra PagP utrykkende syntes potensielt modifisert, siden et bånd med en lavere elektroforetisk mobilitet enn for villtype B. pertussis LPS ble detektert (Fig 14). Videre, som sammenlignet med PagP(bP) uttrykkende stamme, modifiseringseffektiviteten syntes høyere i PagP(eC) uttrykkende stamme (Fig 14). For å evaluere mulige LPS modifiseringer i ytterligere detalj, ble lipid A enheter av stammene analysert med ESI-MS i negativ ionemodus. Denne analyse viste nærvær av fire hoved lipid A former i villtype LPS (Fig 15A). Toppen ved m/ z 1557 representerer den karakteristiske pentaacylerte b/s-fosfatformene som typisk finnes i B. pertussis (Caroff et al., Mocrobes. Infect., 1994), mens toppen ved m/ z 1477 korresponderer til en pentaacylert momofosfatform. De to resterende topper ved m/ z 1307 og 1251 representerer deacylert lipid A former av molekylion ved m/ z 1477, som mangler den primære 3-hydroksydekanoisk syreenhet ved 3-posisjon eller en primær 3-hydroksytetradekanoisk syreenhet (enten ved 2-eller 3' -posisjon), relativt. Disse resultater indikerer en høy heterogenisitet blant lipid A formene i villtype 8. pertussis, som ikke ble oppløst i gelanalysene (Fig 14). Interessant, beregning av de relative mengder av de individuelle lipid A former fra de korresponderende topphøyder viste at i villtype 8. pertussis LPS var en stor mengde lipid A former 50 %) bestående av tetraacylerte former. Videre, den store hovedandelen av lipid A former er monofosfatformer (~80 %). For å ekskludere den mulighet at den høye hyppighet av under-acylert og hypo-fosforylerte lipid A former var et artefakt av hydroksyleringsprosedyren anvendt for å isolere lipid A ble det testet om kortere eller lengre perioder av hydroksylering (varierende mellom 1 og 41) påvirket den relative hyppighet av lipid A formene, som imidlertid viser seg ikke å være tilfelle (data ikke vist). Videre, det totale fosfatinnhold av en løsning med en kjent konsentrasjon av renset villtype 8. pertussis LPS ble bestemt. I samsvar med den høye hyppighet av monofosfat lipid A formene detektert med ESI-MS, ble, kun forsiktig noe mer enn halvparten av fosfatinnholdet som var forventet, idet LPS ville ha blitt fullstendig fosforylert, detektert (data ikke vist).

Ved ekspresjon av PagL(Bb) (Fig 15B), ble tre lipid A former, ved m/ z 1081,1307og 1387, respektivt, tilstede. Hovedtoppen ved m/ z 1307 korresponderer til mono-fosfatet deacylert fra den manglende 3-hydroksydekanoisk syrerest ved 3-posisjon mens toppen ved m/ z 1387 korresponderer til den b/'s-fosforylerte form ved molekylion ved m/ z 1307. Toppen ved m/ z 1081 korresponderer til en monofosfatform som mangler både en 3-hydroksydekanoisk og en 3-hydroksytetradekanoisk syreenhet. Det relative innhold av lipid A formene som mangler 3-hydroksydekanoisk syreenhet ved deres 3-posisjon var øket fra ca 37 % i villtype B. pertussis LPS til mer enn 92 % i stammen som utrykker PagL(Bb) Således, selv om den elektroforetiske mobilitet av LPS ikke var påvirket (Fig 14, spor 2), var det PagL(Bb)-kodete lipid A 3-0 deacylase aktiv i B. pertussis.

Ved ekspresjon av PagP(EC) (Fig 15C) og PagP(Bp) (Fig 15D), ble flere nye lipid A former detektert (Tabell III). Toppene ved m/ z 1320, 1490, 1545, 1625, 1715 og 1796 korresponderer til den forventede PagP-medierte palmitoylering av molekylionene foreliggende ved m/ z 1081, 1251,1307,1387,1477, og 1557, respektivt. Forskjellen i modifiseringseffektivitet mellom E. coli og B. pertussis PagP, som fremkom etter analyse med Tricin-SDS-PAGE (Fig 14), ble også påvist i den massespektrometrikale analyse. I stammen som utrykker E. coli PagP, var~47 % av det totale lipid A populasjon palmitoylert, i motsetning til kun~9 % i stammen som utrykker PagP (Bp). Interessant, i stammen som utrykker PagP(Bp), i motsetning til den som utrykker PagP (eC), ble lipid A former som mangler en 3-hydroksytetradekanoisk syreenhet ikke funnet å være palmitoylert. En mulig forklaring for denne forskjell er forskjellen i spesifisitet i de to PagP-enzymer. Mens E. coli PagP tilføyer en acylkjede ved 2-posisjonen av lipid A, tilføyer B. pertussis PagP et palmitat ved 3'- posisjon (Bishop et al., EMBO J., 2000; Preston et al., Mol. Microbiol., 2003). Således, det fullstendige fravær av palmitoylerte lipid A former som mangler en 3-hydroksytetradekanoisk syreenhet i stammen som utrykker B. pertussis PagP antyder at lipid A molekylene som mangler en 3-hydroksytetradekanoisk syreenhet mangler denne spesifikt ved deres 3'- posisjon. Dette kan således delvis forklare forskjellen i modifiseringseffektivitet som ble observert mellom de to PagP-enzymer, idet substratpolen for E. coli PagP ville være større enn for B. pertussis PagP. Videre, denne hypotese er i samsvar med forekomst av hypo-asylert lipid A former in vivo.

Referanser:

1. Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700

2. Loppnow, H., Brade, H., Durrbaum, I., Dinarello, C. A., Kusumoto, S., Rietschel, E. T., and Flad, H. D. (1989) J. Immunol. 142, 3229-3238 3. Steeghs, L., Berns, M., ten Hove, J., de Jong, A., Roholl, P., van Alphen, L, Tommassen, J., and van der Ley, P. (2002) Cell. Microbiol. 4, 599-611 4. Nikaido, H., and Vaara, M. (1987) in Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C, ed) Vol. 1, pp. 7-22, American Society for Microbiology, Washington, D. C. 5. Caroff, M., Karibian, D., Cavaillon, J-M., and Haeffner-Cavaillon, N. (2002) Microbes Infect. 4, 915-926 6. Guo, L, Lim, K. B., Gunn, J. S., Bainbridge, B., Darveau, R. P., Hackett, M., and Miller, S. I. (1997) Science 276, 250-253 7. Guo, L., Lim, K. B., Poduje, C. M., Daniel, M., Gunn, J. S., Hackett, M., and Miller, S. I. (1998) Cell 95,189-198

8. Gunn, J. S., Belden, W. J., Miller, S. I. (1998) Microb. Pathog. 25, 77-90

9. Gunn, J. S., Lim, K. B., Krueger, J., Kim, K., Guo, L., Hackett, M., and Miller, S. I. (1998) Mol. Microbiol. 27,1171-1182 10. Gunn, J. S., Ryan, S. S., Van Velkinburgh, J. C, Ernst, R. K., and Miller, S. I.

(2000) Infect. Immun. 68, 6139-6146 11. Miller, S. I., Kukral, A. M., and Mekalanos, J. J. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 86, 5054-5058

12. Gunn, J. S., and Miller, S. I. (1996) J. Bacteriol. 178, 6857-6864

13. Ernst, R. K., Guina, T., and Miller, S. I. (1999) J. Infect. Dis. 179, Suppl. 2, 326-330 14. Ernst, R. K., Yi, E. C, Guo, L, Lim, K. B., Burns, J. L, Hackett, M., and Miller, S. I. (1999) Science 286, 1561-1565 15. Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001) J. Biol. Chem. 276, 43122-43131 16. Lee, H., Hsu, F. F., Turk, J., and Groisman, E. A. (2004) J. Bacteriol. 186, 4124-4133 17. Gibbons, H. S., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz C. R. H. (2000) J. Biol. Chem. 275, 32940-32949 18. Karbarz, M. J., Kalb, S. R., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2003) J. Biol. Chem. 278, 39269-39279 19. Bishop, R. E., Gibbons, H. S., Guina, T., Trent, M. S., Miller, S. I., and Raetz, C. R. H. (2000) EMBOJ. 19, 5071-5080

20. Tanamoto, K., and Azumi, S. (2000) J. Immunol. 164, 3149-3156

21. Robey, M., 0'Connell, W., and Cianciotto, N. P. (2001) Infect. Immun. 69, 4276-4286 22. Trent, M. S., Pabich, W., Raetz, C. R. H., and Miller, S. I. (2001) J. Biol. Chem. 276, 9083-9092 23. Bhat, U. R., Forsberg, L. S., and Carlson, R. W. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14402-14410 24. Moran, A. P., Lindner, B., and Walsh, E. J. (1997) J. Bacteriol. 179,6453-6463 25. Kumada, H., Haishima, Y., Umemoto, T., and Tanamoto, K. (1995) J. Bacteriol. 177, 2098-2106 26. Tommassen, J., van Tol, H., and Lugtenberg, B. (1983) EMBO J. 2,1275-1279 27. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour

(NY)

28. Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685

29. Dekker, N., Merck, K., Tommassen, J., and Verheij, H. M. (1995) Eur. J. Biochem. 232,214-219 30. Lesse, A. J., Campagnari, A. A., Bittner, W. E., and Apicella, M. A. (1990) J. Immunol. Methods 126,109-117

31. Tsai, C. M., and Frasch, C. E. (1982) Anal. Biochem. 119,115-119

32. Westphal, O., and Jann, J.K. (1965) Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91

33. Wilm, M., and Mann, M. (1996) Anal. Chem. 68,1-8

34. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. (1990) J. Mol. Biol. 215,403-410

35. Nielsen, H., Brunak, S., and von Heijne, G. (1999) Protein Eng. 12, 3-9

36. Parkhill, J., Sebaihia, M., Preston, A., Murphy, L. D., Thomson, N., Harris, D. E., Holden, M. T., Churcher, C. M., Bentley, S. D., Mungall, K. L, Cerdeno-Tarraga, A. M., Temple, L, James, K., Harris, B., Quail, M. A., Achtman, M., Atkin, R., Baker, S., Basham, D., Bason, N., Cherevach, I., Chillingworth, T., Collins, M., Cronin, A., Davis, P., Doggett, J., Feltwell, T., Goble, A., Hamlin, N., Hauser, H., Holroyd, S., Jagels, K., Leather, S., Moule, S., Norberczak, H., 0'Neil, S., Ormond, D., Price, C, Rabbinowitsch, E., Rutter, S., Sanders, M., Saunders, D., Seeger, K., Sharp, S., Simmonds, M., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Stevens, K., Unwin, L, Whitehead, S., Barrell, B. G., and Maskell, D. J. (2003) Nat. Genet. 35, 32-40 37. Snijder, H. J., Ubarretxena-Belandia, I., Blaauw, M., Kalk, K. H., Verheij, H.

M., Egmond, M. R., Dekker, N., and Dijkstra, B. W. (1999) Nature 401, 717-721

38. McClelland, M., Sanderson, K. E., Spieth, J., Clifton, S. W., Latreille, P., Courtney, L., Porwollik, S., Ali, J., Dånte, M., Du, F., Hou, S., Layman, D., Leonard, S., Nguyen, C, Scott, K., Holmes, A., Grewal, N., Mulvaney, E., Ryan, E., Sun, H., Florea, L, Miller, W., Stoneking, T., Nhan, M., Waterston, R., and Wilson, R. K.

(2001) Nature 413, 852-856 39. Basu, S. S., White, K. A., Que, N. L, and Raetz, C. R. H. (1999) J. Biol. Chem. 274,11150-11158 40. Kulshin, V. A., Zahringer, U., Lindner, B., Jager, K. E., Dmitriev, B. A., and Rietschel, E. T. (1991) Eur. J. Biochem. 198, 697-704 41. Hwang, P. M., Choy, W. Y., Lo, E. I., Chen, L, Forman-Kay, J. D., Raetz, C. R., Prive, G. G., Bishop, R. E., and Kay, L. E. (2002) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 99, 13560-13565 42. Kol, M. A., van Dalen, A., de Kroon, A. I., and de Kruijff, B. (2003; J. Biol. Chem. 278, 24586-24593

43. von Heijne, G. (1983) Eur. J. Biochem. 133,17-21

44. Tommassen, J. (1988) in Membrane Biogenesis (Op den Kamp, J.A.F., ed) NATO ASI series, Vol. H16, pp. 351-373. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.

45. Haas, D., and Holloway, B.W. (1976) Mol. Gen. Genet. 144, 243-251

46. Pace, J., Hayman, M. J., and Galan, J. E. (1993) Cell 72, 505-514

47. Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580

48. Thaien, M., van den Ussel, J., Jiskoot, W., Zomer, B., Roholl, P., de Gooijer,

C, Beuvery, C, and Trampen, J. (1999) J. Biotechnol. 75,147-159.

49. Ziegler-Heitbrock, H. W., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) J. Cancer41,456-461

50. Simon, R., Priefer, U., and Puhler, A. A. (1983) Bio/ Technol. 1, 784-791

51. Furste, J. P., Pansegrau, W., Frank, R., Blocker, H., Scholz, P., Bagdasarian, M., and Lanka, E. (1986) Gene 48,119-131

52. Stibitz, S., Black, W., and Falkow, S. (1986) Gene 50, 133-140

Claims

1. Polypeptid,karakterisert vedat det oppviser minst 25 % aminosyreidentitet med SEQ ID No 1 og oppviser lipid A 3-0-deacylase aktivitet.

2. Polypeptid,karakterisert vedat det oppviser en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No 1.

3. DNA-sekvens,karakterisert vedat det koder for et polypeptid med en aminosyresekvens som definert i krav 1 eller 2.

4. DNA-vektor,karakterisert vedat det omfatter en DNA-sekvens i samsvar med krav 3.

5. DNA-vektor i samsvar med krav 4,karakterisert vedåt DNA-sekvensen som koder for polypeptidet er funksjonelt koblet til transkripsjons-regulerende sekvenser.

6. Antistoff,karakterisert vedat det er i stand til å bindes til polypeptidet i samsvar med krav 1 eller 2.

7. Gram negativ bakterie,karakterisert vedat den omfatter en DNA-vektor i samsvar med krav 4 eller 5.

8. Bordetella pertussis bakterie,karakterisert vedat den omfatter en DNA-sekvens som koder for et polypeptid ifølge krav 1 eller 2.

9. Bordetella pertussis bakterie i samsvar med krav 8,karakterisertve d a t den partielt eller fullstendig omfatter 3-O-deacylert lipopolysakkarid (LPS) former i sin ytre membran.

10. Bordetella pertussis bakterie i samsvar med krav 9,karakterisertv ed at den omfatter palmitoylert LPS i sin ytre membran.

11. Framgangsmåte for å produsere partielt 3-O-deacylert LPS, karakteris ert ved at fremgangsmåten omfatter trinnet å dyrke en bakterie som definert i krav 7-10 under betingelser som fører til syntese av 3-O-deacylert LPS, og valgfritt å gjennvinne det 3-0 deasylerte LPS.

12. Sammensetning,karakterisert vedat den omfatter LPS som kan oppnås fra Bordetella sp. inneholdende minst partielt 3-O-deacylert LPS.

13. Anvendelse av bakterie i samsvar med krav 7-10 for fremstilling av et medikament for behandling eller hindring av Bordetella infeksjoner, fortrinnsvis B. pertussis infeksjoner.

14. Anvendelse av isolert Bordetella LPS omfattende minst partielt 3-O-deacylert LPS for fremstilling av et medikament for behandling eller hindring av Bordetella infeksjoner.

15. Helcelle vaksine,karakterisert vedat den omfatter bakterie i samsvar med et av kravene 7-10.

16. Acellulær vaksine,karakterisert vedat den omfatter en sammensetning i samsvar med krav 12.

17. En in vitro fremgangsmåte for deacylering av Gram negativ LPS eller sammensetning av omfattende Gram negativ LPS,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnet å sette LPS eller sammensetningen i kontakt med et polypeptid i samsvar med krav 1, under betingelse som fører til enzymatisk deacylering av Gram negativ LPS.

18. Fremgangsmåte for å fremkalle en immunrespons mot Bordetella,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter å administrere til et individ en kilde av 3-O-deacylert lipid A, 3-O-deacylert LPS eller palmitoylert LPS fra Bordetella sp.