NO340331B1 - Deacylering av LPS i gramnegative bakterier - Google Patents
Deacylering av LPS i gramnegative bakterier Download PDFInfo
- Publication number
- NO340331B1 NO340331B1 NO20073088A NO20073088A NO340331B1 NO 340331 B1 NO340331 B1 NO 340331B1 NO 20073088 A NO20073088 A NO 20073088A NO 20073088 A NO20073088 A NO 20073088A NO 340331 B1 NO340331 B1 NO 340331B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- lps
- pagl
- lipid
- accordance
- deacylated
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 44
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 title claims description 15
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 title claims description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 167
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 167
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims description 103
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 34
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 claims description 10
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000018150 Bordetella infection Diseases 0.000 claims 2
- 241001135529 Bordetella sp. Species 0.000 claims 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 67
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 54
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 41
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 37
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 36
- 101150050459 pagL gene Proteins 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 21
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 21
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 14
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 13
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 11
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- ATRNZOYKSNPPBF-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxytetradecanoic acid Chemical group CCCCCCCCCCCC(O)CC(O)=O ATRNZOYKSNPPBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- -1 glucosamine disaccharide Chemical class 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- FYSSBMZUBSBFJL-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxydecanoic acid Chemical group CCCCCCCC(O)CC(O)=O FYSSBMZUBSBFJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 150000004712 monophosphates Chemical group 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 6
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 5
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 101150054449 pagP gene Proteins 0.000 description 5
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 4
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 4
- ATRNZOYKSNPPBF-CYBMUJFWSA-N (R)-3-hydroxytetradecanoic acid Chemical group CCCCCCCCCCC[C@@H](O)CC(O)=O ATRNZOYKSNPPBF-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 3
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 3
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- XVASUAIDEWZALR-UHFFFAOYSA-N n-methyl-n-[methyl(tridecyl)amino]oxytridecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCN(C)ON(C)CCCCCCCCCCCCC XVASUAIDEWZALR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000014133 Antimicrobial Cationic Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010050820 Antimicrobial Cationic Peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589149 Azotobacter vinelandii Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 2
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 2
- 241000589194 Rhizobium leguminosarum Species 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 101150024767 arnT gene Proteins 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 208000027096 gram-negative bacterial infections Diseases 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZGRZSHGRZYCQV-UHFFFAOYSA-N 4,6-dichloro-1,3-benzothiazol-2-amine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2SC(N)=NC2=C1Cl UZGRZSHGRZYCQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241001406043 Bordetella pertussis Tohama I Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 241001136175 Burkholderia pseudomallei Species 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 241000252867 Cupriavidus metallidurans Species 0.000 description 1
- 229940124847 Diphtheria-Tetanus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- WVTIBGWZUMJBFY-GUBZILKMSA-N Glu-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WVTIBGWZUMJBFY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710205900 Lipid A 1-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000032912 Local swelling Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000588649 Neisseria lactamica Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000930992 Paraburkholderia fungorum Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001496301 Rhizobium metallidurans Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241000531795 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124832 acellular pertussis vaccine Drugs 0.000 description 1
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N dodecyldimethylamine N-oxide Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 150000002190 fatty acyls Chemical group 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 description 1
- 102000045717 human TLR4 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 125000000400 lauroyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229960005037 meningococcal vaccines Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229940105132 myristate Drugs 0.000 description 1
- 125000001419 myristoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010014203 outer membrane phospholipase A Proteins 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 1
- KSSNXJHPEFVKHY-UHFFFAOYSA-N phenol;hydrate Chemical compound O.OC1=CC=CC=C1 KSSNXJHPEFVKHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000027086 plasmid maintenance Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000131 polyvinylidene Polymers 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- TXBNDGDMWKVRQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]azaniumyl]acetate;dodecyl sulfate Chemical compound [Na+].OCC(CO)(CO)NCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O TXBNDGDMWKVRQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 235000015041 whisky Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/099—Bordetella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Område for oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse vedrører området mikrobiologi, spesielt biologien for Gram-negativ LPS-syntese og modifisering. Oppfinnelsen vedrører også område medisin, spesielt området vaksinering mot bakterielle patogener. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre Gram-negative bakterier, Gram-negative bakterielle lipopolysakkarider (LPS) og sammensetninger omfattende LPS, som kan anvendes for farmasøytiske og/eller veterinæriske formål, spesielt for framstilling av vaksiner mot Gram-negative så som Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis og Bordetella bronchiseptica. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre vaksiner inneholdende deacylert LPS, og anvendelse av modifisert og detoksifisert LPS for framstilling av helcelle og acellulære vaksiner.
Bakgrunn for oppfinnelsen.
Bordetella pertussis infeksjon er et forårsakende agens for kikhoste, med et estimert antall på 60 millioner tilfeller hvert år, og som dreper ca 355000 personer verden over årlig (WHO), spesielt barn og immunkompromitterte individer. Selv om behandling med antibiotika er tilgjengelig (erytromycin), så har bakterielle toksiner ved det tidspunkt sykdommen diagnostiseres ofte forårsaket alvorlig skade. Hindring av sykdommen er derfor av stor viktighet. Det primære middel for regulering forblir vaksinering. Konvensjonelt har vaksiner mot pertussis ("kikhosteinfeksjoner") vert basert på helcelle av B. pertussis. Helcelle Bordetella pertussis vaksiner, omfattende hele bakterier som har blitt drept med varmebehandling, formalin eller andre midler, er blitt inkludert i generelle vaksineringsprogram siden tidlig 1950 tallet. Immunisering medd helcelle pertussis vaksine, idet den er effektiv i å hindre kikhoste i spedbarn, har vært assosiert med lokal, systemisk og nevrologiske reaksjoner, inkluderende feber, krampeanfall og hjernehinnebetennelse i barn. LPS er ansvarlig for hoveddelen av de skadelige reaksjoner i barn etter immunisering med pertussis. Under bakterielle infeksjoner av dyr, aktiverer LPS eller dets lipid A enhet det naturlige immunsystem igjennom interaksjon med Toll-lignende reseptorer, primært TLR-4. Vertresponsen til lipid A inkluderer produksjon av kationiske antimikrobielle peptider, cytokiner, kjemokiner og ytterligere immunstimulerende molekyler. I begrensede infeksjoner vil respons til lipid A fungere i å klarne bakteriene, men i overveldende sepsis kan høye nivåer av sirkulerende cytokiner og prokoagulant aktivitet medføre skade på mikrovaskulatur og presipitere syndrom av Gram negativ septisk sjokk med utbredt intravaskulær koagulering.
Ingen konkluderende bevis for en beskyttende rolle for LPS i pertussisvaksiner er tilgjengelig, selv om passive immuniseringseksperimenter i mus har vist at antistoff mot LPS kan gi en grad av beskyttelse. I tillegg, og mer viktig, nærvær av LPS i en vaksine tilveiebringer imidlertid adjuvansaktivitet med å forsterke immunresponsen mot andre antigener. (K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes og Infection 3: 655-677 (2001).
Bekymringer med hensyn til sikkerhet har skadelig påvirket vaksineopptak og har motivert utvikling av acellulære pertussisvaksiner, fremstilt med sterkt rensede antigener fra B. pertussis. I de siste år, har i tillegg til de såkalte "helcellevaksiner" eller "WCVer", også acellulære vaksiner eller "ACV er" nå blitt introdusert i mange land.
Acellulære vaksiner omfatter normalt fra 1 til 3 eller flere antigener av patogenisk organisme. I tilfelle B. pertussis er antigener som vanligvis benyttes: pertussistoksin (PT, normalt behandlet for å ødelegge dets toksisitet mens det opprettholder immunogenisiteten), filamentøst hemaglutinin (FHA), fimbriae, og 69 kD proteiner eller pertaktin (Prn). Generelt er reaktogenisiteten av acellulær vaksine langt lavere enn reaktogeniteten av helcellevaksiner. Acellulær vaksine er assosiert med en betydelig redusert frekvens av systemiske reaksjoner (feber, oppkast, irriterbarhet, anoreksi) og lokale reaksjoner (svelging, rødhet, varme, ømhet, stivhet, smerter). Imidlertid, de kliniske data er fremdeles kontroversielle med hensyn til om den beskyttende immunitet av acellulære vaksiner matcher den beskyttende effekt av helcellevaksiner. I mange studier er den beskyttende effekt av helcellevaksiner overlegen, og en debatt pågår om dette overveier risiko av sjeldne men alvorlige skadelige effekter av helcellevaksiner i spedbarn. For tiden testes forskjellige immuniseringsskjema, hvor opp til seks doseringer av acellulære vaksiner gis. Helcellevaksinen ble opprinnelig gitt 5 ganger, inkorporert med rutinevaksine tidsskjema hvor den siste booster ble gitt mellom 4-6 års alder. Den acellulære pertussis vaksine anbefales nå å bli gitt 6 ganger, inkluderende en siste dosering (kombinert med difteri- stivkrampevaksine) i løpet av tenårene. Den acellulære vaksine syntes å være sikrere enn den helcellebaserte vaksine, men skal ikke gis til barn med en tidlig allergisk reaksjon mot pertussisvaksine.
De skadelige bieffekter av pertussis helcellevaksiner har blitt godt dokumentert innen fagfeltet (oversikt: S.H. Yeh: Pertussis: persistent pathogen, imperfect vaccines. Expert Rev. Vaccines 2: 113-127 (2003)). Selv om for tiden anvendte acellulære vaksiner delvis overkommer disse skadelige bieffekter, er den beskyttende immunitet som tilveiebringes av disse vaksiner fremdeles kontroversiell og gir mye rom for forbedring. I en musemodell ble det funnet overlegen langtidsbeskyttelse med helcelle sammenlignet med acellulære vaksiner (K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001)). Videre, acellulære vaksinerer mer kostnadsdyre og vanskelig å produsere, krever isolering, utstrakt rensing og kvalitetskontroll av forskjellige antigener, og blanding og formulering av disse i optimale/ønskete mengder. Der har vært et klart, og i lang tid, et behov for bedre B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica og andre Gram negative vaksiner.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter og midler for fremstilling av forbedrede pertussisvaksiner. Foreliggende oppfinnelse beskriver nye Bordetella proteiner. Disse nye B. pertussis, B. parapertussis og B. brochiseptica proteiner og DNA-molekyler som koder for disse proteiner anvendes i samsvar med oppfinnelsen for å modifisere lipid A og dermed tilveiebringe nye B. pertussis, B. parapertussis og 8. brochiseptica bakterielle stammer og andre Gram-negative bakterielle celler, omfattende minst partielt 3-O-deacylert og detoksifisert LPS. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også forbedrete sammensetninger for vaksinering, omfattende Bordetella arter bakterielle celler omfattende partielt 3-O-deacylert LPS, farma-søytiske sammensetninger omfattende isolerte og minst partielt 3-O-deacylert LPS eller in vitro 3-O-deacylert LPS. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre antistoff som er rettet mot og som er spesifikke for 3-O-deacylert lipid A og/eller LPS-molekyler.
Lipopolysakkarid (LPS), en hovedkomponent i den Gram-negative bakterielle ytre membran, er kjent for å være viktig for funksjonering av denne membran som en permeabilitetsbarriere og for motstandsdyktighet mot komplementmediert celle-lysering (oversikt i 1). Den består av tre kovalent koblede domener: lipid A, kjernen, og O-antigen. Lipid A danner den hydrofobiske membranforankring og er ansvarlig for den endotoksiske aktivitet av LPS. I Escherichia coli, består den av en 1, 4'-bifosforylert (3-1,6-koblet glukosamin disakkarid, som er substituert med R- 3-hydroksymyristisk syreenheter ved posisjoner 2, 3, 2', og 3' via ester- eller amid-binding. Sekundære lauroyl- og myristoylgrupper substituerer hydroksylgruppen av R- 3 hydroksymyristoyl ved 2'- og 3'- posisjoner, respektivt (fig 1A). Tidligere forsøk har vist at fosfatgruppene, glukosamindisakkarider, og det korrekte antall og lengde av acylkjedene er viktige for den biologiske aktivitet av lipid A (1, 2, 3).
Hovedstrukturen til lipid A er bemerkelsesverdig godt konservert blant Gram-negative bakterier, selv om noe variasjon i mønsteret av substitueringer av de to fosfater og acylkjedenummeret og lengden er observert (4, 5). Ytterligere modifiseringer av lipid A (fig 1 B) er regulert i Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) av det tokomponent regulatoriske system PhoP/PhoQ (6, 7). I respons til lave Mg<2+->nivåer fosforyleres sensorkinase PhoQ og dermed aktiverer transkripsjonsaktivering PhoP, som fører til aktivering eller represjon av 40 forskjellige gener (6, 8). Et andre regulatorisk system involvert i lipid A modifisering er PmrA/PmrB tokomponent system, som i seg selv er PhoP/PhoQ regulert (9, 10). Mutanter med forandringer i PhoP/PhoQ-systemet oppviser redusert virulens og en øket mottagelighet for antimikrobielle peptider (11, 12). Homologer av PhoP/PhoQ og PmrA/PmrB systemene har blitt identifisert i andre Gram-negative bakterier, inkluderende E. coli, Yersinia pestis og Pseudomonas aemginosa (13,14).
Til nå har flere lipid A - modifiserende enzymer blitt identifisert. Substituering av 1 og 4' fosfatgruppene med en eller to 4-amino-4-deoksy-L-arabinose (L-Ara4N) enheter i S. Typhimurium blitt funnet å være avhengig av enzymet ArnT (15). Nylig ble PmrC-proteinet identifisert til å mediere tilføying av fosforetanolamin (pEtN) til lipid A i Salmonella enterica (16). Et annet enzym, benevnt LpxO, katalyserer den O2-avhengige hydroksyleringen av lipid A (17), og en lipid A 1 - fosfatase ble identifisert i Rhizobium leguminosarum (18). Alle disse enzymer er tenkt å befinne seg i den indre membran eller periplasmatisk rom (15,16,17,18). Nylig ble en ny klasse yttermembranlokaliserte lipid A - modifiserende enzymer oppdaget. En av disse er palmitoyl transferase PagP (19). Palmitoylering av lipid A fører til en øket motstand mot kationiske antimikrobielle peptider (7). Videre, palmitoylert lipid A antagoniserer LPS-indusert aktivering av humane celler (20). Homologer av PagP er funnet, blant annet i S. Typhimurium, Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Legionella pneumophila, E. coli og Y. pestis (19, 21).
Et annet yttermembranlokalisert lipid A - modifiserende enzym er 3-O-deacylase PagL (22). Dette enzym ble oppdaget i S. Typhimurium og vist å hydrolysere esterbindingen ved 3-posisjon til lipid A, og dermed frigjøre den primære 3-hydroksymyristoyl enhet (22). Så langt kan ingen åpenbar homolog for pagL blitt funnet i ikke-overflødige eller uferdige mikrobielle databaser, med unntak av den nær beslektete art Salmonella typhi og Salmonella paratyphi (22). Likeledes, noen andre Gram-negative bakterier, inkluderende P. aeruginosa (14), R. leguminosarum (23), Helicobacterpylori (24), og Porhyromonas gingivalis (25) inneholder 3-O-deasylert lipid A arter, noe som antyder at disse organismer inneholder enzymer med en lignende aktivitet som PagL.
Foreliggende oppfinnelse beskriver identifiseringen av PagL homologer i en rekke Gram-negative bakterier. Begrenset sekvenslikhet mellom de forskjellige proteiner og avanserte bioinformatikkverktøy ble anvendt for å identifisere disse homologer og deres aktive sete enheter. I denne beskrivelse beskrives nærvær og anvendelse av pagL homologer for heterolog ekspresjon i en rekke Gram-negative bakterier. Selv om den totale sekvenslikhet med kjente pagL-gener fra Salmonella spp er ganske lav, kan et konservert PagL-domene skilles i den C-terminale region.
Teknikkens stilling beskriver kun PagL proteiner fra Salmonella spp og beskriver kun heterolog ekspresjon av pagL i E. coli (22), resulterende i deacylert LPS. Ingen data er tilgjengelig innen fagfeltet om nærvær av pagL homologer i andre Gram-negativer. Heterolog pagL ekspresjon i andre Gram-negative, og om PagL er funksjonell i andre Gram-negativer, effekten av PagL på lipid A/LPS sammensetning, bakteriell levedyktighet, toksisitet og immunogenisitet i andre Gram negative er alle ukjente faktorer. Kun begrenset data for heterolog Salmonella pagL ekspresjon i E. coli er tilgjengelig, hvor en TLR-respons ble målt i celler som uttrykker rekombinant humant TLR4, noe som ikke reflekterer en naturlig situasjon for Gram-negative infeksjoner.
(Kawasaki et al., J Biol Chem. 2004).
Beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse viser aktivitet av Pseudomonas aeruginosa og Bordetella bronchiseptica pagL homologer, som ble bekreftet ved heterolog ekspresjon i Escherichia coli og Bordetella spp, som resulterte i fjerning av en R- 3-hydroksymyristoyl gruppe fra lipid A. Effekten på biologisk aktivitet av LPS ble undersøkt med humane makrofagceller. Ved deacylering med PagL, undergikk E. coli lipid A (men ikke B. pertussis Lipid A) en annen modifisering, som var resultatet av aktiviteten av den endogene palmitoyl transferase PagP. Videre, et konservert histidin-serin-par som aktiv sete enheter ble identifisert, noe som antyder en katalytisk mekaniske tilsvarende til serin hydrolaser. Til slutt, in vitro aktivitet av PagL for LPS-substrater vises. Den biologiske funksjon for PagL kan appliseres i samsvar med foreliggende oppfinnelse for å modifisere Gram-negativ patogenisitet, toksisitet og immunogenisitet. Denne modifisering kan foregå på bakterielle helceller eller deler, fraksjoner eller forbindelser som er avledet derfra. Oppfinnelsen tilveiebringer til slutt nye vaksiner mot Gram-negative bakterielle infeksjoner, omfattende helceller av Gram-negative bakterier i samsvar med foreliggende oppfinnelse eller modifisert lipid A/LPS som kan oppnås, og/eller isoleres fra disse bakterier, eller in vitro modifisert LPS/lipid A molekyler.
Detaljert beskrivelse
Definisjoner:
"Sekvensidentitet" defineres heri som forholdet mellom to eller flere aminosyre (polypeptid eller protein) sekvenser, eller to eller flere nukleinsyresekvenser (polynukleotid), som bestemt ved å sammenligne sekvensene. Innen fagfeltet angir "identitet" også grad av sekvenslikhet mellom aminosyrer eller nukleinsyresekvenser, slik det i tilfellet kan bestemmes med matching mellom strenger av slike sekvenser. "Likhet" mellom to aminosyresekvenser bestemmes ved å sammenligne aminosyre-sekvensen og dets konserverte aminosyresubstitueringer av en polypeptid i forhold til sekvensen av et andre polypeptid. "Identitet" og "likhet" kan enkelt beregnes med kjente metoder, inkluderende men ikke begrenset til de som er beskrevet i (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics og Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I,
Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; og Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. og Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; og Carillo, H., og Lipman, D., SIAM J. Applied Matn., 48:1073 (1988).
Foretrukne fremgangsmåter for å bestemme identitet er konstruert for å gi den største match mellom sekvensene som testes. Fremgangsmåter for å bestemme identitet og likhet er kodet i offentlig tilgjengelige datamaskinprogrammer. Foretrukne datamaskinprogrammetoder for å bestemme identitet og likhet mellom to sekvenser inkluderer for eksempel GCG-programpakken (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, og FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990).BLAST X programmet tilgjengelig offisielt fra NCBI og andre kilder (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Den kjente Smith Waterman algoritme kan også anvendes for å bestemme identitet.
Foretrukne parametere for polypeptidsekvens sammenligning inkluderer følgende: Algoritme: Needelman og Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453 (1970); Sammenligningsmatriks:BLOSSUM62 fra Hentikoff og Hentikoff, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 89:10915-10919 (1992); Gap straff: 12; og Gap lengde straff: 4. Et program som er nyttig med disse parametere er offentlig tilgjengelig som "Ogap"- programmer fra Genetics Computer Group, lokalisert i Madison, Wl. De ovenfor nevnte parametere er default-parametere for aminosyre sammenligninger (sammen med ingen straff for ende gap). Foretrukne parametere for nukleinsyresammenligning inkluderer følgende: Algoritme: Needleman og Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Sammenligningsmatriks: matches=+10, mismatch=0; Gap Penalty: 50; Gap Length Penalty: 3. Tilgjengelig som Gap program fra Genetics Computer Group, lokalisert i Madison, Wisconsin. Det som er gitt over er default-parametere for nukleinsyre sammenligninger.
Valgfritt, ved bestemmelse av graden av aminosyrelikhet kan den fagkyndige også ta hensyn til såkalte "konservative" aminosyresubstitueringer, slik det vil være åpenbart for fagkyndige. Konservative aminosyresubstitueringer refererer til ombyttbare enheter som har lignende sidekjeder. For eksempel, en gruppe av aminosyrer som har alifatiske sidekjeder er glycin, alanin, valin, leucin, og isoleucin: en gruppe aminosyrer som har alifatiske hydroksylsidekjeder er serin og treonin; en gruppe aminosyrer som har amidinneholdende sidekjeder er asparagin og glutamin; en gruppe aminosyrer som har aromatiske sidekjeder er fenylalanin, tyrosin og tryptofan; en gruppe aminosyrer som har basiske sidekjeder er lysin, arginin og histidin; en gruppe aminosyrer som har sure sidekjeder er asparaginsyre og glutaminsyre og en gruppe aminosyrer som har svovelinneholdende sidekjeder er cystein og metionin. Foretrukne konservative aminosyresubstitueringsgrupper er: valin-leucin-isoleucin, fenylalanin-tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, og asparagin-glutamin. Substitueringsvarianter av aminosyresekvensene beskrevet heri er de hvor minst en enhet i de beskrevne sekvenser har blitt fjernet og en forskjellig enhet er blitt innsatt i stedet. Fortrinnsvis er aminosyreforandringen konservativ. Foretrukne konservative substitueringer for hver av de naturlig forekommende aminosyrer er som følger: Ala til ser; Arg til lys; Asn til gin eller his; Asp til glu; Cys til ser eller ala; Gin til asn; Glu til asp; Gly til pro; His til asn eller gin; Ile til leu eller val; Leu til ile eller val; Lys til arg; Gin eller glu; Met til leu eller ile; Phe til met, leu eller tyr; Ser til thr; Thr til ser; Trp til tyr; Tyr til trp eller Phe; og Val til ile eller leu.
Et DNA-segment i samsvar med foreliggende oppfinnelse er "funksjonelt koblet" idet det er plassert i et funksjonelt forhold med et annet DNA-segment. For eksempel, en promoter eller enhancer er funksjonelt koblet til en kodesekvens dersom den stimulerer transkripsjon av sekvensen. DNA for en signalsekvens er funksjonelt koblet til DNA som koder for et polypeptid dersom det uttrykkes som et preprotein som tar del i sekresjon av polypeptidet. Generelt, DNA-sekvenser som er funksjonelt koblet er kontigøse, og i tilfelle en signalsekvens, både kontigøs og i lesefase. Imidlertid, enhancere trenger ikke være kontigøse med kodesekvensene hvis transkripsjon de regulerer. Linking utføres ved ligering av hensiktsmessige restriksjonsseter eller ved adaptere eller linkere innsatt i stedet derfor.
Seleksjon av en egnet promotersekvens er generelt avhengig av vertscellen som er utvalgt for ekspresjon av DNA-segmentet. Eksempler på egnete promotorsekvenser inkluderer prokariote og eukariote promoter som er godt kjent innen fagfeltet (se for eksempel Sambrook og Russell, 2001, supra). Transkripsjonsregulatoriské sekvenser inkluderer typisk en heterolog enhancer eller promoter som gjenkjennes av verten. Seleksjon av en egnet promoter avhenger av verten, men promotere så som promoterne av typen trp, lac og fag, tRNA promotere og glykolytiske enzym-promotere er kjente og tilgjengelige (se for eksempel Sambrook og Russell, 2001, supra). Ekspresjonsvektorer inkluderer replikasjonssystemet og transkripsjons- og transalasjonsregulatoriske sekvenser sammen med innskuddssetet for det poly-peptidkodende segment kan benyttes. Eksempler på kombinasjoner av cellelinjer og ekspresjonsvektorer er beskrevet i Sambrook og Russell (2001, supra) og i Metzger et al. (1988) Nature 334: 31- 36. For eksempel kan egnete ekspresjonsvektorer være uttrykt i gjær, for eksempel S. cerevisiae, insektsceller, for eksempel Sf9-celler, mammalske celler, for eksempel CHO-celler og bakterielle celler, for eksempel E. coli eller Bordetella spp.
I en første utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nye polypeptider omfattende lipid A 3-O-deacylase aktivitet, hvor polypeptidet oppviser minst 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 eller 99 % aminosyreidentitet med SEQ ID No. 1 og polypeptidet oppviser lipid A 3-0- deacylaseaktivitet som bestemt med analysene beskrevet i denne beskrivelse, in vivo som eksemplifisert i eksempel 3 eller in vitro i samsvar med eksempel 9. Fortrinnsvis er polypeptidet som har lipid A 3-0 deacylaseaktivitet polypeptidet i samsvar med SEQ ID No. 1, PagL-proteinet av Bordetella bronchiseptica og Bordetella parapertussis, eller en del derav, en mutant derav, eller et fusjonsprotein omfattende minst en del av SEQ ID No. 1 omfattende lipid A 3-0-deacylaseaktivitet. 1 en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en nukleinsyresekvens som koder for polypeptidet som oppviser minst 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 eller 99 % aminosyreidentitet med SEQ ID No.1. Fortrinnsvis oppviser nukleinsyresekvensen i samsvar med foreliggende oppfinnelse minst 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 eller 99 % identitet med nukleinsyresekvensen i samsvar med SEQ ID No. 2 eller SEQ ID No. 3, pagL-genene fra B. bronchiseptica og B. parapertussis, respektivt. Nukleinsyresekvensen kan være en fullengde kodende sekvens eller kan være kodende eller ikke-kodende (eller komplementære) gener, fragmenter eller også oligonukleotider avledet derav.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre DNA-vektorer omfattende nukleinsyre-sekvensene i samsvar med oppfinnelsen og/eller som koder for polypeptider som oppviser minst 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 eller 99 % aminosyreidentitet med SEQ ID No. 1. DNA-vektorer i samsvar med oppfinnelsen kan være enhver vektor kjent innen fagfeltet, så som, men ikke begrenset til, plasmider, fag, fagemider, kosmider, artifisielle kromosomer, vektorer for (homolog) genomisk integrasjon. Vektorene kan inneholde markører, så som selekterbare markører, som tilveiebringer antibiotisk resistens, fluoriserende markører, molekylære tags, etc. Fremgangsmåter for kloning av nukleinsyrer, og ekspresjon av kodete proteiner i samsvar med oppfinnelsen er kjent for fagkyndige og kan for eksempel finnes i Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989 og Ausubel F. et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 2004. Fortrinnsvis er vektoren i samsvar med foreliggende oppfinnelse en vektor hvor nukleinsyresekvensen er funksjonelt koblet til regulatoriske sekvenser så som promotorer, enhancere og terminatorer, som tilveiebringer ekspresjon av genet og translasjon av messeger til lipid A 3-0- deacylaseprotein. Mest fortrinnsvis er vektoren i stand til å besørge ekspresjon og lipid A 3-0- deacylaseaktivitet til en Gram-negativ bakteriell vertscelle, valgfritt på en induserbar måte, for eksempel med den induserbare tac-promotor på plasmid pMMB67.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også antistoff i stand til å binde seg til polypeptidet i samsvar med SEQ ID No. 1. Antistoff i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan være monoklonale antistoff eller polyklonale antistoff, som er dannet i en vert ved å injisere polypeptidet i samsvar med oppfinnelsen, som vist i eksemplet. Antistoff kan anvendes for diagnostiske formål, for eksempel for å analysere ekspresjon av PagL-proteiner og mutanter eller homologer derav i Gram-negative bakterier. Antistoff kan også anvendes ved isolering og/eller rensing av proteiner som oppviser lipid A 3-O-deacylaseaktivitet.
Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører Gram-negative bakterier som omfatter en nukleinsyremolekyl i samsvar med oppfinnelsen og/eller som koder for et polypeptidmolekyl i samsvar med oppfinnelsen. Fortrinnsvis, nukleinsyre-molekylet er arrangert i en DNA-vektor i samsvar med oppfinnelsen, som tilveiebringer ekspresjon av det kodete protein i Gram-negative bakterielle celler og som tilveiebringer en kilde av lipid A 3-0- deacylaseaktivitet til cellen. Fortrinnsvis er nevnte Gram-negative bakterie en bakterie som ikke omfatter i dets genom et gen som koder for et funksjonelt protein som oppviser lipid A 3-0- deacylaseaktivitet så som et protein som har en betydelig (mer enn 40 %) identitet med et PagL-protein som i SEQ ID No.1. Mest fortrinnsvis, å tilveiebringe en kilde av lipid A 3-0- deacylaseaktivitet vil forandre sammensetningen av LPS i den ytre membran i celleveggen til den Gram-negative bakterielle celle. Den Gram-negative bakterie som skal tilveiebringes med en kilde av lipid A 3-0- deacylaseaktivitet kan også være en bakterie omfattende et ikke-funksjonelt gen, som har betydelig homologi med en nukleinsyresekvens som tilveiebrakt i SEQ ID No.2 eller 3, for eksempel med en mutasjon, rammeskift eller deletering, så som Bordetella pertussis.
imidlertid, også en Gram-negativ bakterie som ikke omfatter et (partiell) funksjonelt gen i dets genom som koder for et protein som har lipid A 3-O-deacylaseaktivitet, kan tilveiebringes med en ytterligere kilde for dets aktivitet innen rammen av foreliggende oppfinnelse. Gram-negative bakterier kan ha et visst nivå av lipid A 3-O-deacylaseaktivitet men nevnte aktivitet kan forsterkes ved å tilveiebringe ytterligere og/eller forsterket ekspresjon av et polypeptid i samsvar med oppfinnelsen. Fortrinnsvis vil dette resultere i en temporær eller permanent økning i lipid A 3-O-deacylaseaktivitet i bakterien i slik grad at lipid A og/eller LPS sammensetningen til bakterien midlertidig eller permanent forandres eller modifiseres, sammenlignet med villtypebakterien. En slik Gram-negativ bakterie kan for eksempel være Bordetella parapertussis eller en Bordetella bronchiseptica bakterie, men enhver annen Gram negativ bakterie, fortrinnsvis en patogen Gram-negativ bakterie kan velges, for eksempel Neisseria spp, så som N. meningitidis, N. gonorrhoeae, N. lactamica.
En Gram negativ bakterie i samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatter lipid A 3-0 deacylaseaktivitet eller forhøyete nivåer av lipid A 3-0 deacylaseaktivitet fortrinnsvis minst partielt 3-O-deacylert lipid A og/eller LPS-former i den ytre membran i den bakterielle cellevegg. Alternativt kan den Gram negativ bakterie i samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatte LPS eller lipid A former som bærer en sekundær modifisering etter 3-0-deacylering i lipid A, så som palmitoylering, defosforylering eller en hver annen sekundær modifisering etter 3-0-deacylering av lipid A. Den bakterielle celle i samsvar med oppfinnelsen kan omfatte minst 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 eller 90 % av dets totale LPS/lipid A i 3-O-deacylert form, eller kan alternativt omfatte minst 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 eller 90 % av dets lipid A/LPS i en form som bærer en sekundær modifisering, så som for eksempel, men ikke begrenset til, palmitoylering eller defosforylering.
1 et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for å produsere partielt 3-O-deacylert LPS. I en første utførelse omfatter en slik fremgangsmåte trinnet å dyrke den Gram negative bakterie i samsvar med oppfinnelse under betingelser som fører til syntese av deacylert LPS, eller valgfritt gjenvinning av deacylert LPS. Fremgangsmåter for å dyrke forskjellige Gram negative bakterier er kjent innen fagfeltet og kan for eksempel finnes i Methods for General and Molecular Bacteriology. P. Gerhardt et al., Eds. American Society for Microbiology, Washington DC, 1994. Fremgangsmåter for gjenvinning, isolering og/eller rensing av LPS er også kjent innen fagfeltet (Meningococcal Vaccines, Methods and Protocols. A.J. Pollard and M.C.J. Maiden, Eds. Chapter 12: Construction of LPS mutants, pp.155- 165. Humana Press, Totowa, New Jersey, 2001 )og kan for eksempel utføres I samsvar med eksemplene som gis i denne beskrivelse.
Alternativt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å produsere
i det minste partielt 3-O-deacylert LPS eller lipid A in vitro, hvor fremgangsmåten omfatter trinnene å tilveiebringe en sammensetning omfattende LPS eller lipid A i ubehandlet eller (partielt) renset form, og bringe denne sammensetning i kontakt med et polypeptid eller protein i samsvar med oppfinnelsen under betingelser som bidrar til enzymatisk 3-O-deacylering in vitro. Slike betingelser kan finnes i gjeldende beskrivelse, i eksempel 9 og i fremgangsmåteavsnittet.
I en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse sammensetninger omfattende minst partielt 3-O-deacylert LPS og/eller lipid A, fortrinnsvis omfattende minst 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 eller 99 % av det totale LPS eller lipid A i dets 3-0- deacylerte form eller i en annen form som bærer en sekundær modifisering etter 3-0 deacylering, så som palmitoylert form.
Sammensetninger i samsvar med oppfinnelsen, omfattende partielt 3-O-deacylert LPS og/eller lipid A, og som valgfritt bærer sekundære modifiseringer, enten i den ytre membran i celleveggen i de bakterielle celler, eller i ubehandlet form eller rensete former, kan anvendes for fremstilling av farmasøytiske sammensetninger. I en spesielt foretrukket utførelse kan slike farmasøytiske sammensetninger i samsvar med oppfinnelsen kan være sammensetninger som er egnet for vaksineringsformål. Slike farmasøytiske sammensetninger er i stand til å utløse et immunforsvar i en vertsorganisme, fortrinnsvis et pattedyr, mer fortrinnsvis et menneske, mot en Gram-negativ bakterie. Nærvær av mjnst partielt 3-O-deacylert LPS og/eller lipid A eller alternativt LPS som bærer sekundære modifiseringer etter 3-O-deasylering, tilveiebringer flere muligheter, så som fordelen med en redusert toksisitet, et redusert antall og redusert alvorlighet av bi-effekter i individene og en høyere tolerert dosering av sammensetningen i individet som skal behandles eller vaksineres. Den farma-søytiske sammensetning kan inneholde en eller flere eksipienter og/eller adjuvanser. Farmasøytisk akseptable eksipienter og adjuvanser er kjent innen fagfeltet og kan fritt velges av den fagkyndige, for eksempel fra Current protocols in Immunology, Wiley Interscience 2003 eller Remmington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990.
I en første utførelse kan den farmasøytiske sammensetning være en helcelle-vaksine, omfattende levende eller levende attenuerte bakterielle celler eller ikke-levedyktige bakterielle celler, som kan ha blitt inaktivert med frysing, varmebehandling, mekanisk ødeleggelse, kjemisk behandling eller andre fremgangsmåter kjent innen fagfeltet farmasi og vaksinering (J.L. Pace, H.A. Rossi, V.M. Esposito, S.M. Frey, K.D. Tucker, R.l. Walker. Inactivated whole-cell bacterial vaccines: current status and novel strategies. Vaccine 16:1563-1574 (1998)). Fortrinnsvis er den bakterielle celle en Gram-negativ patogen bakteriell celle, mer fortrinnsvis er den bakterielle celle av genus Bordetella, Salmonella, Shigella, Neisseria, Klebsiella, Pseudomonas, Haemophilus, Escherichia, Proteus og mest fortrinnsvis Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis eller Bordetella bronchiseptica.
I en andre foretrukket utførelse kan den farmasøytiske sammensetning i samsvar med oppfinnelsen være en acellulær vaksine, omfattende 1, 2, 3 eller flere immuno-geniske komponenter fra den Gram-negative patogene bakterie og omfattende minst partielt 3-O-deacylert LPS eller lipid A, eller nevnte LPS bærer sekundære modifiseringer etter 3-O-deacylering. Fortrinnsvis er den partielle 3-0- deacylerte lipid A og/eller LPS opptatt fra en Gram negativ, patogen bakteriell celle i samsvar med oppfinnelsen, hvor den bakterielle celle fortrinnsvis er av genus Bordetella, og mest fortrinnsvis er Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis eller Bordetella bronchiseptica. Den minst partielt 3-0-deacylerte lipid A og/eller LPS, som valgfritt bærer sekundære modifiseringer etter deacylering, kan anvendes for å utløse en beskyttende immunrespons mot bakterien som produserer den, men kan alternativt også anvendes og samblandes med andre sammensetninger ved anvendelse som en egnet adjuvanssubstans. LPS er kjent innen fagfeltet å være en egnet adjuvans for vaksineringsformål, aktiverende Toll-lignende reseptorer og stimulerer en naturlig immunrespons. Partielt 3-O-deacylert og minst partielt detoksifisert LPS og/eller lipid A i samsvar med oppfinnelsen bibeholder i stor grad sin immunstimulerende (adjuvans) aktivitet, mens den forårsaker mindre toksisitetsrelaterte skadelige bieffekter, så som lokal svelging, rødhet, smerte og feber.
Farmasøytisk akseptable sammensetninger og vaksiner i samsvar med oppfinnelsen kan anvendes i fremgangsmåter for behandling av individer som lider, eller som har risiko for å erverve en patogen, Gram-negativ bakteriell infeksjon, omfattende å administrere den farmasøytiske sammensetning, en helcelle eller en acellulær vaksine i samsvar med oppfinnelsen. Anvendelse av spesifikke adjuvanser, de relative og absolutte mengder av substansene i sammensetningene og doserings regimer for administrering er kjent eller kan bestemmes av fagkyndige og kan tilpasses for forhold så som bestemt patogen infeksjon eller status til det bestemte individ som skal behandles. Doseringsregimet kan omfatte en enkelt dosering, men kan også omfatte flere doseringer, for eksempel booster doseringer, og kan administreres oralt, intranasalt eller parenteralt. Forskjellige doseringsregimer for vaksineringsformål er kjent innen fagfeltet og kan hensiktsmessig tilpasses av den fagkyndige.
Figurbeskrivelser
Fig. 1. Lipid A arkitektur. A, E. coli lipid A består av en bifosforylert glukosamin disakkarid substituert med fire P-3-hydroksymyristoyl enheter, av hvilke 2' - og 3' fettasylkjedene er esterifisert med laurat og myristat, respektivt. B, Regulerte modifiseringer av Salmonella lipid A. Substituering av fosfatenhetene med L-Ara4N eller pEtN er mediert av ArnT og PmrC, respektivt, dannelse av en 2-hydroksy-myristat-modifisert lipid A av LpxO, tilføying av en sekundær palmitoylkjede ved 2-posisjon av PagP, og fjerning av 3-hydroksymyristoylenhet ved 3-posisjon av PagL. Fig. 2. Multippel sekvens alignment av PagL proteiner. Sekvensene ble tilordnet ved anvendelse av ClustalW (http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html). Bindestrek indikerer mellomrom introdusert for optimal alignment. Absolutt konserverte enheter er markert med stjerner. Angitt med kolonner eller punktum er sterkt og svakt konserverte enheter, respektivt. pagL ORF i 8. pertussis er splittet av et rammeskift, som ble reparert for denne alignment ved tilføying av to nukleotider i kodon 33. Genbank proteinkatalognummer for PagL homologer er: S. Typhimurium AAL21147, 8. bronchiseptica NP_890306, 8. parapertussis NP_885487, 8. pertussis BX470248<5>, P. aeruginosa NP_253350, P. fluorescens NZ_AAAT03000006§, P. putida NC_002947<§>, P. syringae ZP_00125465, 8. fungorum NZ_AAAJ03000003<§>, 8. mallei NC_002970<§>, 8. pseudomallei NC_002930<§>, R. metallidurans ZP_00274744, R. solanacearum NP_522762, and A. vinelandii ZP_00089534. The symbolet § indikerer GenBank katalognummer av hele (uferdige) genomer, hvor PagL homologer manuelt ble identifisert. Fig3. Ekspresjon og membranlokalisering av PagL i E. coli BL21 Star™ (DE3). Membraner fra E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende tom pET-11a eller pPagL plasmider ble isolert og analysert med SDS-PAGE. Proteiner ble farget med Coomassie Brilliant Blue. Stjerner indikerer bånd som ble underlagt mikro sekvensering og ble funnet å korrespondere med modne PagL proteiner. Båndet som er angitt med en dobbel stjerne korresponderer til PagL(Bb) forløper protein. Molekylvekt standardproteiner er gitt på venstre side. Fig 4. Analyse med Tricin-SDS-PAGE av LPS modifisering in vivo. Eksponentielt voksende E- coli BL21 STAR™ (DE3) celler inneholdende pET-11a eller pPagL konstrukter ble indisert med IPTG i den angitte tid, hvoretter 1 OD6ooenhet dyrkningsprøver ble samlet og analysert med Tricin-SDS-PAGE. Fig 5. GC/MS analyse av villtype og PagL-modifisert E. coli BL21 Star™ (DE3) LPS. GC/MS analyse av renset E. coli BL21 Star™ (DE3) villtype LPS (WT), PagL(St) - modifisert LPS (L(St)), PagL(Bb)-modifisert LPS (L(Bb)), og PagL(pa)-modifisert LPS (L(Pa)) (t= tid etter induksjon). Angitt er de normaliserte C14/C14-30H-forhold med villtype LPS innstilt med 100 (verdier vist over stolper). Fig 6. Strukturanalyse med ESI-MS med villtype PagL modifisert E. coli BL21 Star™ (DE3) LPS. Lipid A former fra villtype E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende tom pET-11a (A), og lipid A former modifisert med PagL(st), (B), PagL(Pa) (C) og PagL(Bb) (D)ble analysert med ESI-MS. Hovertopper ved m/ z 1797,1928, 1622, og 1490 ble tolket som de karakteristiske heksaacylerte 6/s-fosfat former som typisk finnes i E. coli, en heksaacylert b/s-fosfater arter substituert med en L-Ara4N enhet, en 3-O-deacylert monofosfatform substituert med en L-Ara4N enhet, og en 3-O-deacylert monofosfatform, respektivt. Hovedtoppene ved m/ z 1716 og 1847 representerer sannsynligvis fragmentioner av formene ved m/ z 1797 og 1928. Fig 7. In vivo re- modifisering av deasylert LPS og funksjonen til endogent PagP. A, eksponentielt voksende E. coli BL21 Star™ (DE3) celler inneholdende den tomme pET-11a vektor eller PagL(Bb) plasmid ble indusert med IPTG for angitt tidsperiode. Prøvene korresponderende til 1 OD6ooenhet ble samlet og analysert med Tricin-SDS-PAGE. B og C, fettsyreinnhold i renset E. coli BL21 Star™ (DE3) villtype LPS (WT) og PagL(Bb) modifisert LPS (LBB), isolert ved den angitte tid etter induksjon av PagL ekspresjon, ble analysert med GC/MS. Angitt er de normaliserte C14/C14-30H- B og C14/C14(C) forhold med villtype LPS satt til 100 (verdier vist overstolpene). D, eksponentielt voksende villtype E. coli BL21 Star™ (DE3) eller E. coli BL21 Star™ (DE3) og dets pagP mutant derivat JG101, inneholdende Ppagl (Pa), ble indusert med IPTG for den angitte tidsperiode, hvoretter 1 OD6ooenhet dyrkningsprøver ble samlet og analysert på Tricin-SDS-PAGE gel. Fig 8. Topologimodell for PagL fra P aeruginosa. En modell for topologi av Pagl (Pa), ble konstruert ved anvendelse av generelle regler for ytre membranprotein-arkitektur som beskrevet i (44). Den foreslåtte modell består av en åttetrådet p-barell med fire sløyfer (L1-4) som strekker seg til det eksterne miljø. Enheter i de postulerte (3-tråder er vist i en ruter, som er skygget for enheter som eksponert til lipidbisjiktene. His-ugog Ser-151(markert i rødt; posisjon i Pagl(pa), forløper) er absolutt konservert (fig 2) og er antatt å være en del av en "klassisk" katalytisk triade av en serin hydrolase. Potensielle kandidater for syreenheten av den katalytiske triade er angitt med gult. Tallene refererer til posisjonen av enhetene i forløpersekvensen. Fig. 9. Identifisering av Pagl (pa), aktiv seteenheter med aminosyre-substituering. Eksponentielt voksende E. coli BL21 Star™ (DE3) celler inneholdende den tomme pET-11A vektor, pPagL(pa), plasmidet, eller mutant pPagL(Pa)iplasmidene ble indusert med IPTG i 75 min, hvoretter 1 OD6ooenheter dyrkningsprøver ble samlet og analysert med SDS-PAGE etterfulgt av immunoblotting med primære antistoff mot Pagl(pa)i(A) og Tricin-SDS-PAGE for å visualisere
LPS (B).
Fig 10. In vivo modifisering av B. pertussis LPS. A, LPS fra villtype B. pertussis stamme Tohama eller B. pertussis stamme Tohama som bærer pMMB67EH-PagL(Bb) plasmidet ble isolert og analysert med Tricine-SDS-PAGE. B, fettsyreinnhold i renset B. pertussis stamme Tohama villtype LPS (WT) og PagL(Bb)-modifisert LPS (PagL) ble analysert med GC/MS. Indikert er det normaliserte C14-3OH/C10-3OH forhold med villtype LPS innstilt ved 100 (verdier vist over stolpene). Fig 11. Biologisk aktivitet av isolert LPS. IL-6 (A) eller IL-10 (B) induksjon i MM6-celler med renset LPS. De horisontale akser gir LPS konsentrasjonen i mg/ml og de vertikale akser gir ELISA- avlesning ved 450nm. Fig 12. Varmemodifiserbarhet av renset, refoldet Pagl(Pa),(-) analysert med seminativ SDS-PAGE. Coomassie Brilliant blue fargete seminative SDS- PAGE gel viser varmemodifisrbarheten av renset, refoldet Pagl (pa)(-). Prøvene ble behandlet i prøvebuffere inneholdende 0,1 % SDS ved romtemperatur (RT) eller 2 % SDS ved 100° C (15 min), før elektroforese. Molekylvekt standardproteiner foreligger på venstre side. Fig 13. In vitro LPS modifisering av membranbunnet eller in vitro refoldet PagL. Sølvfarget Tricin-SDS-PAGE geler viser in vitro PagL aktivitet. A, renset N. meningitidis L3- LPS ble inkubert i en detergent inneholdende buffer i 18T ved 37° C med eller uten cellelommer fremstilt fra E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende tom pET-11 A, eller pPagL plasmidene. B, renset N. meningitidis L3-LPS ble inkubert i en detergentinneholdende buffer i fravær eller nærvær av 5mM EDTA i 181 ved 37° C med eller uten 4 ug in vitro refoldet Pagina), uten dets signalsekvens (Pagl(pa)(-)). Tilsvarende mengde av analyseblandinger ble applisert i alle spor. Fig 14. Analyse med Tricin-SDS-PAGE av in vivo LPS modifisering. LPS ble isolert fra villtype- og Pag P/Pag L-uttykkende B. pertussis stamme Tohama ved varm fenol/vann-ekstrahering, og analysert med Tricin-SDS-PAGE. Fig 15. Strukturanalyse med ESI-MS av villtype PagL/PagP- modifisert 8. pertussis LPS. Lipid A former av villtype B. pertussis stamme Tohama (A) og lipid A former modifisert med PagL(Bb) (B), PagP(Ec) (C), og PagL(Bp) (D) ble analysert med ESI-MS. Hovedtopper ved m/ z 1557, 1477, 1387, 1307, 1251 og 1081 ble tolket som det karakteristiske pentaacylerte 6/s-fosfat formene som typisk finnes i B. pertussis, de korresponderende pentaacylerte monofosfatformene, de deacylerte lipid A formene av molekylionet ved m/ z 1557 som mangler den primære 3-hydroksydekanoisk syreenhet ved 3- posisjon, den deacylerte lipid A form av det molekylære ion ved m/ z 1477 som mangler den primære 3-hydroksy dekanoisk syreenhet ved 3-posisjon, den deacylerte lipid A form av molekyl ion ved m/ z 1477 som mangler en primær 3-hydroksy tetradekanoisk syreenhet, og de deacylerte lipid A former av molekylion ved m/ z 1477 som mangler både primær 3-hydroksy dekanoisk syreenhet ved 3-posisjon og en primær 3-hydroksy tetradekanoisk syreenhet, respektivt. Toppene ved m/ z 1320,1490,1545,1625,1715 og 1796 korresponderer til PagP-mediert palmitoylering av molekylionene foreliggende ved m/ z 1081,1251,1307, 1387, 1477 og 1557, respektivt.
Eksempler.
Eksperimentelle prosedyrer.
Bakterielle stammer og vekstbetingelser.
Alle bakterielle stammer anvendt i dette forsøk er beskrevet i tabell I. Typisk, E. coli og P. aeruginosa stammene fikk vokse ved 37° C på modifisert Luria-Bertani buljong agar, benevnt LB agar (26), eller i LB-buljong, ristende ved 200 rpm. For E. coli ble medium tilsatt 0,2 % glukose. Dersom hensiktsmessig fikk bakteriene vokse i nærvær av 100 ug/ml ampicillin, 50 ug/ml kanamycin, 50 ug/ml naladixic syre, eller 100 ug/ml streptomycin, for plasmid opprettholdelse eller stammeseleksjon. S. Typhimurium SR11 fikk vokse på LB agarplater ved 37° C. B. Bronchiseptica og B. pertussis stammene fikk vokse ved 35° C på Borduet-Gengou agar (Difco) tilsatt 15 % defibrinert saueblod. For å indisere ekspresjon av pagL(Bb) genet i B. pertussis fikk bakteriene vokse i syntetisk Thisj medium (48) tilsatt 1 med mer isopropyl-1-thio-p-D-galaktopyranosid (IPTG) (slutt konsentrasjon) ved 35° C, under risting (180 rpm).
Rekombinante DNA- teknikker
Plasmid DNA ble isolert ved anvendelse av Promega Wizard<®>Plus SV Minipreps system. Alkalisk fosfatase fra kalvetarm og restriksjonsendonuklease ble anvendt i samsvar med restriksjonene fra leverandøren (Fermentas). DNA- fragmenter ble isolert fra agarosegeler ved anvendelse av Quiagen hurtiggel ekstraheringskitt. Ligering ble utført ved anvendelse av hurtig DNA ligeringskitt (Roche).
pagL genene fra S. Typhimurium SR 11 (pagL(st), B. bronchiseptica B505 (pagL(Bb) og pagL genet, med eller uten dets signalsekvenskodende del, fra P. aeruginosa PA025 (pagL(Pa), pagL(Pa)(-)) ble klonet inn i pET-11a (Novagen) bak T7-promotoren. Genene ble mangfoldiggjort med PCR ved anvendelse av kromosomalt DNA som templat. Templat DNA ble fremstilt ved å respondere~10<9>bakterier i 50 pl destillert vann, hvoretter suspensjonen ble oppvarmet i 15 min ved 95 °C. Suspensjonen ble deretter sentrifugert i 1 min ved 16100x g, hvoretter supernatanten ble anvendt som templat DNA. Sekvensene av forward primere som inneholdt et A/del sete (understreket), inkluderende et ATG startkodon, var
Sekvensene av de reverse primere, som inneholdt en BamHI sete (understreket) og inkluderende et stoppkodon, var 5'-AA GGATCCTCAGAAATTATAACTAATT-3'
(pagL(st)), 5'-A AGGATCCCTAGATCGGGATCTTGTAG-3' ( pagL{ Pa), pagL{ Pa)(-)), og 5'-A AGGATCCTCAGAACTGGTACGTATAG-3' ( pagLm).
PCRene ble utført under følgende betingelser; 50 pl totalt reaksjonsvolum, 25 pmol av hver primer, 0,2 med mer dNTPer, 3 pl templat DNA- løsning, 1,5 % dimetyl-sulfoksid, 1,75 enheter av Expand High Fidelity enzymblanding med buffer levert av leverandør (Roche). Temperaturprogrammet var som følger: 95 °C i 3 min, en syklus på 1 min ved 95 °C, 1 min ved 60 °C, og 1 min 30 s ved 72 °C repetert 30 °C, etterfulgt av 10 min ved 72° C og deretter avkjøling til 4 °C. PCR- produktene ble renset fra agarosegel og deretter klonet inn i pCRII-TOPO. Plasmid DNA fra korrekte kloner ble oppkuttet med Nde\/ BamH\, og PagL-kodende fragmenter ble ligert inn i Nde\ IBamH\- oppkuttet pET-11a. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli DH5a ved anvendelse av CaCI2metoden, (27). Plasmid DNA fra transformanter ble kontrollert for nærvær av det korrekte PagL-dekodende innskudd ved oppkutting med A/del og BamHI. Plasmidene som gav en korrekt oppkuttingsprofil ble angitt pPagL(Pa), pPagl_(Pa)(-), pPagL(Bb) og pPagL(St) (tabell I). De korrekte kodesekvenser av de klonete pagL gener ble bekreftet med nukleotidsekvensering i begge retninger. For å subklone pagL{ Bb) genet inn i bred vert, lavkopi pMMB67EH vektoren, ble pPagL(Bb)-plasmid DNA oppkuttet med Xbal og H/nDIII, og Pagl_(Bb)-kodende fragment ble ligert inn i Xba\ IHinD\\\- oppkuttet pMMB67EH. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E-coli DH5 a. Plasmid DNA fra transformanter ble kontrollert for nærvær av det korrekte PagL-kodende innskudd med oppkutting med Xba\ og H/nDIII. Et plasmid som gav en korrekt oppkuttingsprofil ble angitt som pMMB67EH- PagL(Bb) (tabell I). Det siste plasmid ble anvendt for å transformere E. coli SM10, som muliggjorde påfølgende overføring av pMMB67EH- PagL(Bb)til B. pertussis ved konjungering på faststoffmedium som beskrevet av Stibitz et al (52). Mutasjoner ble introdusert i pagL med anvendelse av QuikChange<®>seterettet mutagenesekitt (Stratagene), og primerene angitt i tabell II. Plasmid pPagL(Pa) ble anvendt som templatet hvor mutasjonene ble etablert. Nærvær av de korrekte mutasjoner ble bekreftet med nukleotidsekvensering i begge retninger.
SDS-PAGE og immunoblotting
Proteiner ble analysert med natriumdodesylsulfat polyakrylamidgel elektroforese
(SDS-PAGE) (28), med 0,2 % SDS i den kjørende gel, ved anvendelse av Bio-Rad Mini-Protean<®>3 apparatur. Prøvene ble applisert på en 13 % polyakrylamidgel med en 4 % stacking gel og underlagt elektroforese ved 150 V. Proteinet ble farget med Coomassie Brilliant Blue. Prefargete eller refargete Precision Plus Protein™ Standard fra Bio-Rad ble anvendt for å bestemme den relative molekylmasse (Mr). For Western blotting ble proteinene overført fra SDS-PAGE geler til nitrocellulose-membraner. Membranene ble blokkert natten over i fosfatbufret saltløsning ((PBS)
(pH 7,6), 0,5 % ikke- fett tørket melk, 0,1 % Tween-20 og inkubert med primære antistoff rettet mot PagL(Pa) i blokkeringsbuffer, etterfulgt av inkubering med pepper-rot peroksidasekonjungert kanin antimarsvin IgG antistoff (Sigma) i blokkeringsbuffer. Blottenne ble utviklet ved anvendelse av SuperSignal<®>WestPico Chemiluminiscent Substrat (Pierce).
Semi-Nativ SDS-PAGE.
Proteiner ble analysert med natrium dodesyl sulfatpolyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) (28) med 0,2 % SDS i kjøregelen, ved anvendelse av Bio-Rad Mini-Protean<®>3 apparatur. For seminativ SDS-PAGE ble ingen SDS tilsatt til kjøregel og stacking gel, og prøvene ble ikke oppvarmet før elektroforese. Prøvene ble applisert på en 13 % polyakrylamid gel med en 4 % stacking gel og underlagt elektroforese ved 150 V. For seminativ SDS-PAGE ble elektroforese utført med en konstant strøm på 15 mA på is. Proteinene ble farget med Coomassie Brilliant Blue. Prefargete eller ufargete Precision Plus Protein™ Standard fra Bio-Rad ble anvendt for å bestemme den relative molekylmasse (Mr).
Tricin-SDS-PAGE
LPS-inneholdende prøver 0,5 mg/ml proteinase K (sluttkonsentrasjon) ble tilsatt til prøvebuffer (28). Prøvene ble inkubert i 60 min ved 55 °C, etterfulgt av 10 min ved 95 °C for å inaktivere proteinase K. Prøvene ble deretter fortynnet 10 ganger ved tilsetning av prøvebuffer, hvoretter 2 pl av prøvene ble applisert til en Tricin-SDS-PAGE gel (30). Bromfenol blått fikk kjøre inn i den separerende gel ved 35 V, hvoretter spenningen ble økt til 105V. Etter at fronten hadde nådd bunnen av gelen ble prøvene satt til henstand på kjøring for ytterligere 45 min. Gelene ble fiksert natten over i vann/etanol/eddiksyre 11:8:1 (v/v/v) og deretter farget med sølv som beskrevet (31).
Polyklonale antistoff
For antistoffproduksjon ble pPagL(Pa)(-) anvendt for å transformere E. coli BL21 Star™ (DE3) for å muliggjøre ekspresjon av det trunkerte pagL gen. PagL(Pa) protein, akkumulerende i inklusjonslegemer, ble isolert (29), renset fra en preperativ SDS-PAGE gel, og anvendt for immunisering av marsvin ved Eurogentec.
Mikrosekvensering
Proteiner ble overført fra SDS-PAGE geler til et lmmobilon™-P polyvinyliden difluormembran (Millipore Corp.) i 192mM glysin, 25mM Tris,(pH 8,3), 10 % metanol (v/v) ved 100 V i 1 time ved anvendelse av Bio-Rad Mini-PROTEAN<®>2 blottings- apparatur. Etter overføring ble membranen vasket tre ganger i 15 min med destillert vann. Overførte proteiner ble farget med Coomassie Brilliant Blue. Membranen ble tørket i luft, og diputative PagL bånd ble utkuttet og underlagt mikrosekvensering ved Sequencing Center Facility, Utrecht University, the Netherlands.
Isolering av LPS og analyse med gasskromatografi/massespektrometri (GC/MS).
LPS ble isolert ved anvendelse av varm fenol/vann ekstraheringsmetode (3). Kort forklart, B. pertussis stamme Tohama, med eller uten plasmid pMMB67EH- PagL(Bb), fikk vokse i 3 liter Thijs medium (48) i nærvær av 1mM IPGT (sluttkonsentrasjon). Cellene ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i 40mM natriumfosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 5mM EDTA. Cellene ble behandlet natten over med lysozym ved 4 °C, hvoretter et likt volum av fenol ble tilsatt. Suspensjonen ble oppvarmet til 70 °C, og inkubert i 30 min under risting. Suspensjonen ble avkjølt til 10 °C, hvoretter faser ble separert med sentrifugering. Den øvre fase ble samlet, og ekstrahering ble repetert ved tilsetning av et likt volum destillert vann til den lavere fase. Etter påfølgende inkubering ved 70 °C, avkjøling, og sentrifugering, ble de to øvre faser blandet og dialysert mot springvann inntil fenolduften forsvant. Etter frysetørking av de dialyserte fraksjoner ble LPS oppløst i fosfatbufret saltløsning (pH 7,2) med en konsentrasjon av 1 mg/ml. For fettsyreanalyse med GC/MS ble et fem gangers (vol/vol) overskudd av aceton tilsatt til en alikvot av isolert LPS, hvoretter løsningen ble tørket ved 60° C under en strøm av nitrogen. Deretter ble 10 pg C12:0 (20H) (1 mg/ml i etanol) tilsatt som en indre standard, og likeledes 100 pl acetylklorid/etanol 1:9 (vol/vol), hvoretter prøvene ble derivatisert i 1 time ved 90° C. Etter avkjøling ble reaksjonen stoppet ved tilsetting av 200 pl i 1 M K2HP04(pH 8,0), etterfulgt av ekstrahering av acyletylesterene med 200 pl etylacetat. Et 1- pl volum av den øvre fase ble anvendt for analyse med GC/MS på et Finnigan MAT SSQ i elektron impact modus.
Biologisk aktivitet av LPS.
IL-6 og IL-10 induksjon av villtype- og PagL-modifisert B. Pertussis Tohama LPS ble testet med den humane makrofagcellelinje MM6 (49). MM6- cellene ble utsådd i mokrotiterplater (2.10<5>/brønn) i 400 pl IMDM (Gibco BRL) tilsatt 10 % føtalt kalveserum (Gibco BRL), og stimulert med 200 pl serielle fortynninger av LPS forrådsløsning, i 16-181 ved 37 °C i en humid atmosfære inneholdende 5 % C02. IL-6 og IL-10 nivåer i dyrkningssupernatantene ble kvantifisert med ELISA mot human IL-6 eller IL-10 i samsvar med instruksjonene fra leverandøren (PeliPair™ reagens sett, Sanquin Reagents, Amsterdam, The Netherlands).
Isolering av cellelommer
Cellene ble høstet med sentrifugering i 10 min ved 1500 x g, og vasket en gang i 50 ml kald 0,9 % natriumkloridløsning. Cellepelletene ble frosset i minst 15 min ved - 80 °C, og deretter suspendert i 20 ml 3mM EDTA, 10mM Tris-HCI (pH 8,0) inneholdende Complete Protease inhibitor coctail (Roche).
Cellene ble ødelagt ved sonikering, hvoretter ikke-ødelagte celler ble fjernet med sentrifugering i 10 min ved 1500x g. Cellelommene ble pelletert fra supernatanten ved sentrifugering i 1,51 ved 150 000x g, og resuspendert i 2mM Tris-HCI (pH 7,4). Cellelommene ble lagret ved - 80° C i alikvoter.
Isolering av inklusjonslegemer
For isolering av inklusjonslegemer, ble PagL(pa)(-) uttrykt i E. coli BL21 Star™ (DE3) fra pPagL(pa)(-) (Tabell 1). En toliter kultur fikk vokse ved 37 °C i LB medium tilsatt ampicillin til en OD6ooO,4 og 0,6. Deretter ble 1mM IPTG (sluttkonsentrasjon) tilsatt til kulturen for å indusere ekspresjon av det rekombinante gen, hvoretter kulturen ble inkubert ytterligere ved 37 °C, under risting. Etter ca 4 timer ble cellene høstet ved sentrifugering (15 min ved 4000 rpm (4 °C). Høstede celler ble vasket en gang i 400 ml 0,9 % NaCI og deretter resuspendert i 80 ml TE 50:40 (50mM Tris-HCI (pH 8,0), 40mM EDTA). Sukrose (0,25 g/ml) konsentrasjon og lysozym (0,2 mg/ml) konsentrasjon ble tilsatt, hvoretter suspensjonen ble inkubert i 30 min ved RT, under risting. Suspensjonen ble sonikert tre ganger på is (1,5 min, med 2 min pauser derimellom) ved anvendelse av en Branson 250 Sonfier med mikrotip (effekt 9, puls/pause-forhold 50 %). Etter sonikering ble 0,13 % (vekt/vol) Brij-35P (Fluka) tilsatt, og suspensjonen ble sonikert i ytterligere 2 min. Tett materiale (inklusjonslegemer) ble samlet med sentrifugering i 2 timer ved 4000 rpm (4 °C) hvoretter pellet ble vasket en gang i 40 ml TE 50:40, etterfulgt av et ytterligere vasketrinn ved anvendelse av 40 mMOmM Tris-HCI (pH 8,3). De oppnådde inklusjonslegemer ble solubilisert i 8 M urea tilsatt 10 mM glysin (pH 8,3), og presipitert med TCA. Til slutt ble de oppnådde proteiner solubilisert i 8 M urea tilsatt 10 mM glycin (pH 8,3) ved en proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml. Denne blanding ble sentrifugert i 2 timer ved 13000 rpm for å fjerne uløselige restmaterialer og membraner.
Refolding og rensing av PagL(pa)(-)
PagL(Pa)(-) ble refoldet in vitro med to gangers fortynning av 10 mg/ml protein-løsningen (se over) i 10 % (vekt/vol) lauryldimetylaminooksid (LDAO) og deretter sonikert i 10 min. Refoldet PagL(Pa)(-) ble renset med Fast Protein Liquid Chromatografi (FPLC) ved anvendelse av 1 ml MonoQ (Amersham Biosiences) ioneutbyttekolonne. Proteinløsningen ble fortynnet 4 ganger i buffer A (20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 0,08 % (w/v) C10E5). Løsningen ble applisert på kolonnen, som ble preekvilibrert med buffer A og vasket en gang med buffer A, og proteinene ble eluert med en lineær gradient av 0-1 M NaCI i buffer A. Fraksjoner ble analysert med SDS-PAGE for nærvær av det refoldete PagL (pa) (-) protein. De som inneholdt proteinet ble samlet og konsentrert til en proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml ved anvendelse av Centricon konsentrasjoner med en molekylmasse cut-off på 3 kDa (Amicon). Protein-løsningen ble deretter dealysert tre ganger natten over mot 10 ml 2 mM Tris-HCI (pH 8,0), 0,06 % (w/v) Ci0E5ved anvendelse av en membran med en molekylmasse cut-off av 3,5 kDa.
In vitro modifiseringsanalyse
Refoldet PagL(Pa)(-) (10 mg/ml) av cellelommer isolert fra E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende den tomme vektor pET-11A eller pPagL-plasmidene ble fortynnet 10 ganger i dobbelt destillert vann. 4 pl av fortynnet refoldet protein eller cellelomme-løsning ble inkubert i 50 mM Hepes (pH 8,0), 0,1 % Triton X-100, 0,5 M NaCI, og 0,75 mmol N. meningitidis L3- LPS i et finalt volum av 10 pl ved 37° C i 16 timer. For å teste om reaksjonen var avhengig av divalente kation ble 5 mM EDTA tilsatt til reaksjonen med det refoldete PagL (Pa) (-). Reaksjonene ble terminert ved koking i prøvebuffer (28), hvoretter prøvene ble behandlet med 0,5 mg/ml proteinase K i 1 time ved 55° C, etterfulgt av 10 min inkubering ved 95° C. Prøvene ble fortynnet 25 ganger ved tilsetting av prøvebuffer, hvoretter 2 pl av prøvene ble analysert med Tricin-SDS-PAGE (se over).
Isolering av LPS og analyse med elektrospray ioniseringmassespektrometri (ESI-MS).
LPS ble isolert ved anvendelse av varm fenol/vann ekstraheringsmetode Westphal and Jann, Methods Carbohydr. Chem. 5; 83-91,1965) med noen modifiseringer. Kort forklart, bakteriene fikk vokse i THIJS medium i nærvær av 1 mM IPTG (sluttkonsentrasjon) i 641. Cellene ble høstet med sentrifugering, og resuspendert i 40 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 5mM EDTA. Cellene ble behandlet natten over med lysozym ved 4° C, hvoretter et likt volum av fenol ble tilsatt. Suspensjonen ble oppvarmet ved 70° C, inkubert i 30 min under risting, og deretter avkjølt til 10° C, hvoretter faser ble seponert med sentrifugering i 10 min ved 8000x g. Den øvre fasen ble samlet, og ekstraheringen ble repetert etter tilsetning av et likt volum av destillert vann til den lavere fase. De to øvre faser ble kombinert, dialysert mot springvann inntil fenolduften forsvant, frysetørket, og deretter opptatt i destillert vann. LPS ble deretter pelletert med sentrifugering i 31 ved 150000 x g og oppløst i destillert vann, hvoretter LPS-konsentrasjonen ble bestemt ved analysering av 3-hydroksytetradekanoisk syreinnhold, ved anvendelse av 6890 Agilent gasskromato-grafi, som beskrevet (Welch, Clin. Microbiol. Rev. 1991). For ESI-MS ble 200 pl alikvot av isolert LPS (50nmol/ml) frysetørket og opptatt i 0,1 ml 2 % eddiksyre. Blandingen ble oppvarmet i 21 ved 95° C for å hydrolysere LPS og frigjøre lipid A enheten. Deretter ble blandingen avkjølt i romtemperatur, og sentrifugert i 10 min ved 16100 x g. Pellet ble vasket to ganger i 0,1 ml dobbelt destillert vann, opptatt i 0,1 ml dobbelt destillert vann, og 0,3 ml kloroform/metanol (2:1, v/v) ble tilsatt. Etter kraftig vorteksing ble fasene separert med sentrifugering i 10 min ved 16100 x g. Den øvre fase ble deretter anvendt for strukturanalyse av renset lipid A med nano-elektrospray tandem MS på et Finnigan LCQ i negativ ionemodus (Wilm amd Mann, Anal. Chem. 1996).
Eksempel 1: Identifisering av PagL homologer i forskjellig Gram negative bakterier.
Den 187 aminosyresekvens av S. Typhimurium PagL forløperprotein (genbank katalognummer AAL21147, SEQ ID No. 17) ble anvendt som en ledetråd for å identifisere putative PagL homologer i andre Gram negative bakterier, ved å søke alle komplette og uferdige genomer av Gram negative bakterier som foreligger i NCBI databasen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi). BLAST-søk (34) viste nærvær av putative homologer i Bordetella spp. B. pertussis, B. bronchiseptica og B. parapertussis (Fig 2). PagL-homologer av B. bronchiseptica og B. parapertussis er to gjensidig identiske 178 aminosyre polypeptider (Fig 2) med, som predikert av signalP-serveren (35), en 25 aminosyre N-terminalt signalpeptid. Et gen for en PagL homolog ble også funnet i genomet fra B. pertussis Tohama I stamme (36), men denne åpne leseramme (ORF) var ødelagt av et rammeskift (SEQ ID No. 4), som kunne repareres som i SEQ ID No. 5 for å kode for et protein som i SEQ ID No. 1. Nukleotidsekvensering av PagL ORF er fra B. pertussis stamme B509 og B134 viste også nærvær av det samme rammeskift<2>, som indikerte at ødeleggelse av PagL ORF kan være et felles trekk i B. pertussis stammer. Ved anvendelse av den nylig identifiserte B. bronchiseptica PagL homolog som et probe for ytterligere BLAST analyse, ble ytterligere putativ pagL homologer identifisert i genomene av P. aeruginosa (SEQ ID No. 6, 30 % identitet), Pseudomonas fluorescens (SEQ ID No. 7, 29 % identitet), Pseudomonas syringae (SEQ ID No. 8, 31 % identitet), Pseudomonas putida, 2x (SEQ ID No. 9 + 10, 32/33%), Ralstonia metallidurans (SEQ ID No. 15, 28 %). Ralstonia solonacearum (SEQ ID No 16, 29 %), Burkholderia matlei (SEQ ID No12, 28 %), Burkholderia pseudomallei (SEQ ID No 13, 28 %), Burkholderia fungorum (SEQ ID No 11, 29 %) og Azotobacter vinelandii (SEQ ID No 14, 27 %). Alignment er vist i Fig 2. Totalt, alle PagL homologer utviste en lav total gjensidig sekvensidentitet, om enn høyere enn med S. typhimurium (24 % identitet), men inneholdt et klart homologt domene nær C terminus. Våre funn av dette konserverte motiv muliggjør identifisering av PagL homologer i andre (baktrerielle) arter og muliggjør anvendelse av egnet PagL homologi for enhver vert baktere og/eller ethvert LPS som 3-O-deacyleres.
Eksempel 2: Kloning av pagL og heterolog ekspresjon i E. coli.
For å verifisere deres putative lipid A deacylaseaktivitet klonet vi pagL homologer av P. Aeruginosa ( PagL( paj) og B. bronchiseptica ( PagL( Bbj). Vi inkluderte i disse studier pagL(st)Som en referanse. Disse pagL-gener ble mangfoldiggjort fra kromosomene med PCR og til slutt klonet i pET-11a under kontroll av T7-promoter, resulterende i plasmidene pPagL(Pa), pPagL(Bb) og pPagL(St).
For å undersøke ekspresjon og membranlokalisering av PagL i E. coli, ble E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende tom vektor pET-11a eller pPagL-plasmidene dyrket natten over i LB, hvoretter cellelommene ble isolert. Analyse av SDS-PAGE viste nærvær av prominente ytterligere bånd med Mrerpå 15000-18000 i cellelommene i cellene som utrykker PagL (Fig 3). Dette var i samsvar med forventede molekyl-masser av de modne PagL proteiner, det vil si PagL(Pa), 16,1 kDa, PagL(Bb), 17,2 kDa, og PagL(st), 18,2 kDa. For å identifisere de ytterligere proteinbånd ble de underlagt mikrosekvensering. Sekvensene av de første 5 aminosyreenheter av PagL(pa), PagL(Bb), og PagL(St), ble ADVSA, QPTQG, og NDNVF, respektivt, noe som indikerer at spalting av signalpeptidet med lederpeptidase foregår mellom aminosyreenheter 23 og 24 (AQA-ADV), 25 og 26 (AQA-QPT), og mellom 20 og 21 (CSA-NDN), respektivt. Spesielt i tilfelle ekspresjon av PagL(Bb) var et ytterligere bånd med en høyere Mr synlig på gelen (Fig 2). Den N-terminale sekvens av dette bånd, MQFLK, korresponderer med det til forløper Pagl_(Bb).
Eksempel 3: In vivo modifisering av E. coli LPS med PagL.
For å studere om de klonete PagL homologer var aktive på E. coli LPS ble IPTG tilsatt til eksponentielt voksende E. coli BL21 Star™ (DE3) celler inneholdende den tomme vektor pET-11a eller pPagL-plasmidene og etter forskjellige inkuberings-perioder ble prøvene ekvivalent til en OD6ooenhet samlet, og deres LPS innhold ble analysert med Tricin-SDS-PAGE. I samsvar med den forventede hydrolyse av R- 3-hydroksymyristat ved 3-posisjon av lipid A, ble ekspresjon av enhver av de tre pagL homologer omdannet LPS til en form med en høyere elektroforetisk mobilitet (Fig 4). Omdanningen var omtrent fullstendig innen 75 min etter PagL (pa) eller PagL(Bb>ble indusert, men tok noe lengre tid i tilfelle av PagL(st)
Strukturanalyse av PagL-modifisert LPS: for å bestemme dets fettsyreinnhold ble LPS isolert fra bakterier som fikk vokse i nærvær av 10 mM MgCfefor å undertrykke PhoP/PhoQ- regulerte modifiseringer av lipid A og analysert med GC/MS. C14:0/C14:0(3OH)-forholdet i PagL-modifiserte LPS-prøver økte sammenlignet med tilsvarende for villtype LPS (Fig 5), i samsvar med den forventede fjerning av en C14-30H fra lipid A. For å bekrefte disse data ble lipid A enhetene isolert og analysert med ESI-MS i positiv ionemodus, som viste nærvær av fire hovedlipid A former i villtype LPS (Fig 6A). Toppen ved m/ z 1797 representerer de karakteristiske heksa-acylerte b/s-fosfatformene som typisk finnes i E. coli, mens toppen ved m/ z 1928 korresponderer til en heksaacylert b/s-fosfatform substituert med en L-Ara4N enhet. De to resterende topper ved m/ z 1716 og m/ z 1847 representerer mest sannsynlig fragmentioner av de to tidligere former som mangler en fosfatgruppe. Ved uttrykking av PagL(St) (Fig. 6B), PagL(Pa) (Fig. 6C), eller PagL(Bb) (Fig. 6D), forelå hovedlipid A formene ved m/ z 1622 og m/ z 1490, som korresponderer til tap av en |3-hydroksymyristat enhet og en fosfatgruppe fra hovedformene ved m/ z 1928 og m/ z 1797 som foreligger i den tomme vektor kontroll, respektivt. Også her er tap av fosfatgruppen sannsynligvis et artefakt av ioniseringsprosedyren. Basert på GC/MS og ESI-MS data kan det konkluderes at de identifiserte PagL homologer av P. aeruginosa og B. bronchiseptica, som for S. Typhimurium, er aktive lipid A deacylase. Dataene antyder at deacylering ikke er avhengig av fravær eller nærvær av en L-Ara4N enhet, siden begge former ble deacylert effektivt.
Eksempel 4: Påfølgende in vivo modifisering av PagL deacylert LPS.
Under forløpet av disse eksperimentene ble det observert at etter prolongert PagL ekspresjon var PagL modifisert LPS ikke lenger detekterbar på Tricin-SDS-PAGE geler, og at LPS igjen migrerte ved posisjonen til villtype LPS, som illustrert for stammen som utrykker PagL(Bb) (Fig 7A). PagL-proteinet var fremdeles til stede i stor mengde ved dette tidspunkt, slik det fremkommer på SDS-PAGE geler (data ikke vist). Videre, analyser med GC/MS viste at C14:0/C14:0(3OH)-forholdet ikke var redusert igjen for det LPS som ble isolert etter 51 induksjon av PagL(Bb) (Fig 7B). Således, den sekundære modifisering observert på Tricin-SDS-PAGE-gelen (Fig 7A) var ikke konsekvens av restorering av PagL-modifiseringen, men resultatet av (en) ytterligere modifisering (er) som restaurerte den elektroforetiske mobilitet til den for villtype LPS. Derfor, andre fettsyreforhold ble sammenlignet. En bemerkelsesverdig økning i C16:0/C14:0-forholdet ble funnet i LPS av celler indusert i 51 for PagL-produksjon (Fig 7C), noe som antyder at PagL-deacylert LPS deretter ble palmitoylert.
Et protein som tilføyer palmitat til lipid A er yttermembranproteinet PagP (19) (Fig 1). Derfor var hypotesen at den sekundære modifisering av PagL-modifisert LPS kan ha vært resultatet av endogen PagP aktivitet. For å undersøke denne mulighet ble villtype E. coli BL21 Star™ (DE3) transformert og dets pagP mutant derivat JG101 med pPagL(Pa) plasmid. Den sekundære modifisering av PagL-modifisert LPS ble igjen observert i tilfelle av villtypestammen, men ikke i den mutante stamme (Fig 7D). Dette resultat antyder sterkt at den sekundære modifisering av PagL- modifisert LPS (Fig 7A) faktisk er en konsekvens av endogen PagP-aktivitet.
Eksempel 5: Identifisering av PagL aktiv seteenheter.
Den felles sekvens identitet mellom de identifiserte PagL homologer er svært lav (Fig 2). Blant de få totalt konserverte enheter er en histidin og en serin, som, vi antar, kan være en del av en "klassisk" Asp/Glu-His-Ser katalytisk triade av serin hydrolaser. Disse putative aktive seteenheter er lokalisert ved den lipid-eksponerte side nær toppen av en (3-tråd i en topologimodell vi foreslår (Fig 8). Det er interessant at i ytre membran fosfolipase A, er aktivt sete His og Ser er lokalisert i en tilsvarende posisjon (37). For å teste om disse enheter, lokalisert ved posisjoner 149 og 151 av Pagl (Pa), forløperproteinet, respektivt, faktisk er viktig for den katalytiske aktivitet ble de substituert av alanin og asparagin, og med alanin eller cystein, respektivt. Som en kontroll ble de samme substitueringer utført for en ikke-konservert histidin og serinenhet, lokalisert ved posisjoner 81 og 84 av Pagl (Pa) forløpere, respektivt. Proteinet og LPS-profilene av E. coli BL21 Star™ (DE3) cellene som bærer de relevante plasmider og som var indusert i 75 min med IPTG ble analysert med immunoblotting (Fig 9A) og Tricin-SDS-PAGE (Fig 9B), respektivt. Mens substituering av de ikke-konserverte His81 og Ser84 ikke påvirket LPS deacylering, ble deacylering av LPS ikke lenger observert idet de konserverte His149 og Ser151 var substituert (Fig 9B), selv om ekspresjon av disse mutante proteiner ikke var påvirket (Fig 9A). Disse resultater støtter sterkt hypotesen om at den konserverte histidin ved posisjon 149 og serin ved posisjon 151 av forløperen PagL (pa) proteinet er aktive seteenheter og at PagL mekanistisk fungerer som en serin hydrolase.
Eksempel 6: Kloning av PagL(Bb)Og heterolog ekspresjon i B. pertussis.
For å modifisere B. pertussis LPS in vivo ble pagL-genet av B. bronchiseptica (PagL(Bb)) klonet. PagL-genet ble mangfoldiggjort fra kromosomet med PCR og til slutt klonet inn i pMMB67EH under kontroll av Tac-promoter, resulterende i plasmid pMMB67EH- PagL(Bb), som ble overført til B. pertussis stamme Tohama ved konjugasjon.
For å undersøke modifisering av B. pertussis LPS in vivo ble villtype B. pertussis stamme Tohama, eller B. pertussis stamme Tohama inneholdende plasmidet pMMB67EH-PagL(Bb) dyrket i Thijs medium tilsatt 1mM IPTG (sluttkonsentrasjon). LPS ble isolert med varm fenol-vann-ekstraheringsmetode og analysert med Tricin-SDS-PAGE (Fig 10 A) og GC-MS (Fig 10 B). Analyser av Tricin-SDS-PAGE-gel viste at LPS isolert fra PagL(Bb)-uttrykkende stamme migrerte noe hurtigere sammenlignet med villtype B. pertussis LPS. Overraskende, LPS isolert fra PagL(Bb)- uttrykkende stamme viste to distinkte LPS-populasjoner. En populasjon migrerte rundt høyden av villtype Tohama LPS, og en populasjon migrerte hurtigere. Denne siste LPS-populasjon kan også sees i villtype LPS preparat, imidlertid er mengden av den mye lavere. For å verifisere at LPS fra PagL-uttrykkende stamme faktisk var deacylert ved dets 3-posisjon, ble den analysert med GC-MS. Forholdet C14:0(3OH)/ C10:0(3OH) i PagL-modifisert LPS-prøve ble øket sammenligning med villtype LPS (Fig 10B), som er i samsvar med den forventede fjerning av en C10-3OH fra 3-posisjon av B. pertussis lipid A.
Eksempel 7: Biologisk aktivitet av PagL-modifisert LPS.
For å undersøke den endotoksiske aktivitet av PagL-modifisert og villtype B. pertussis LPS ble deres evne til å stimulere produksjon av IL-6 og IL-10 i human makrofagcellelinjen MM6 målt. Som det fremgår av Fig 2, for villtype LPS var produksjonen av både IL-6 (Fig 11A) og IL-10 (Fig 11B) av MM6-cellene øket sammenlignet med idet cellene var stimulert med tilsvarende mengde PagL-modifisert LPS. Således kan det konkluderes at in vivo deacylering av B. pertussis LPS med PagL resulterer i en reduksjon i endotoksisk aktivitet av denne LPS.
Eksempel 8: Kloning, ekspresjon, rensing og refolding av PagL (pa).
PagL-genet fra P aeruginosa PA025 uten dets signalsekvenskodende del ble klonet inn i pET-11a, resulterende i plasmid pPagl(pa)(-). For å oppnå inklusjonslegemer ble PagL uten dets signalsekvens uttrykt i E. coli BL21 Star™ (DE3). Inklusjonslegemer ble isolert og solubilisert i urea, etter at proteinet ble refoldet med fortynning to ganger i 10 % lauryldimetylamin oksid (LDAO) og ytterligere renset med Fast Protein Liquid kromatografi (FPLC). Korrekt refolding ble bekreftet med SDS-PAGE (Fig 12) og sirkulær dikroisme (CD) målinger (Data ikke vist). På SDS-PAGE-gelen hadde det refoldede protein en lavere elektroforetisk mobilitet sammenlignet med den denaturerte form, mens CD-målingene viste at det refoldete protein i hovedsak hadde en p-ark konformasjon.
Eksempel 9: In vitro LPS modifisering med membranlokalisert og refoldet PagL.
For å teste om membranlokalisert eller in vitro refoldet PagL var i stand til å modifisere eksternt tilsatt LPS in vitro, ble refoldet PagL(Pa)(-) eller isolerte cellelommer fra E. coli BL21 Star™ (DE3) inneholdende den tomme vektor pET-11a, eller pPagL-plasmidene inkubert sammen med renset LPS av N. meningitidis. Modifisering av LPS ble undersøkt med Tricin-SDS-PAGE (Fig 13). I samsvar med den forventede hydrolyse av R-3-hydroksymyristat ved 3-posisjon av lipid A ble LPS omdannet til en form med en høyere elektroforetisk mobilitet idet membran-lokalisert PagL (Fig 13), eller refoldet Pagl(pa)(-) (Fig 13B) forelå. Reaksjonen med den refoldete PagL(pa)(-) var uavhengig av nærvær av divalente kationer, idet deacylering av LPS fremdeles ble observert i nærvær av 5 mM EDTA (Fig 13B).
Eksempel 10: Forandret lipid A struktur etter ekspresjon av PagP og PagL i 8. pertussis.
For å utrykke PagP og PagL i B. pertussis stamme Tohama, ble pagL-genet av B. bronchiseptica PagL^) og pagP-genet av B. pertussis PagL(BP) uttrykt fra bred-vert lavkopiantall ekspresjonsvektor pMMB67EH. Som en kontroll ble en stamme som utrykker pagP-genet av E. coli pagP(Ec) også konstruert. LPS ble isolert fra villtype, PagP uttrykkende eller PagL uttrykkende B. pertussis stamme Tohama og analysert med Tricin-SDS-PAGE. LPS isolert fra PagL(Bb) uttrykkende stamme syntes ikke påvirket på gelen, mens den fra PagP utrykkende syntes potensielt modifisert, siden et bånd med en lavere elektroforetisk mobilitet enn for villtype B. pertussis LPS ble detektert (Fig 14). Videre, som sammenlignet med PagP(bP) uttrykkende stamme, modifiseringseffektiviteten syntes høyere i PagP(eC) uttrykkende stamme (Fig 14). For å evaluere mulige LPS modifiseringer i ytterligere detalj, ble lipid A enheter av stammene analysert med ESI-MS i negativ ionemodus. Denne analyse viste nærvær av fire hoved lipid A former i villtype LPS (Fig 15A). Toppen ved m/ z 1557 representerer den karakteristiske pentaacylerte b/s-fosfatformene som typisk finnes i B. pertussis (Caroff et al., Mocrobes. Infect., 1994), mens toppen ved m/ z 1477 korresponderer til en pentaacylert momofosfatform. De to resterende topper ved m/ z 1307 og 1251 representerer deacylert lipid A former av molekylion ved m/ z 1477, som mangler den primære 3-hydroksydekanoisk syreenhet ved 3-posisjon eller en primær 3-hydroksytetradekanoisk syreenhet (enten ved 2-eller 3' -posisjon), relativt. Disse resultater indikerer en høy heterogenisitet blant lipid A formene i villtype 8. pertussis, som ikke ble oppløst i gelanalysene (Fig 14). Interessant, beregning av de relative mengder av de individuelle lipid A former fra de korresponderende topphøyder viste at i villtype 8. pertussis LPS var en stor mengde lipid A former 50 %) bestående av tetraacylerte former. Videre, den store hovedandelen av lipid A former er monofosfatformer (~80 %). For å ekskludere den mulighet at den høye hyppighet av under-acylert og hypo-fosforylerte lipid A former var et artefakt av hydroksyleringsprosedyren anvendt for å isolere lipid A ble det testet om kortere eller lengre perioder av hydroksylering (varierende mellom 1 og 41) påvirket den relative hyppighet av lipid A formene, som imidlertid viser seg ikke å være tilfelle (data ikke vist). Videre, det totale fosfatinnhold av en løsning med en kjent konsentrasjon av renset villtype 8. pertussis LPS ble bestemt. I samsvar med den høye hyppighet av monofosfat lipid A formene detektert med ESI-MS, ble, kun forsiktig noe mer enn halvparten av fosfatinnholdet som var forventet, idet LPS ville ha blitt fullstendig fosforylert, detektert (data ikke vist).
Ved ekspresjon av PagL(Bb) (Fig 15B), ble tre lipid A former, ved m/ z 1081,1307og 1387, respektivt, tilstede. Hovedtoppen ved m/ z 1307 korresponderer til mono-fosfatet deacylert fra den manglende 3-hydroksydekanoisk syrerest ved 3-posisjon mens toppen ved m/ z 1387 korresponderer til den b/'s-fosforylerte form ved molekylion ved m/ z 1307. Toppen ved m/ z 1081 korresponderer til en monofosfatform som mangler både en 3-hydroksydekanoisk og en 3-hydroksytetradekanoisk syreenhet. Det relative innhold av lipid A formene som mangler 3-hydroksydekanoisk syreenhet ved deres 3-posisjon var øket fra ca 37 % i villtype B. pertussis LPS til mer enn 92 % i stammen som utrykker PagL(Bb) Således, selv om den elektroforetiske mobilitet av LPS ikke var påvirket (Fig 14, spor 2), var det PagL(Bb)-kodete lipid A 3-0 deacylase aktiv i B. pertussis.
Ved ekspresjon av PagP(EC) (Fig 15C) og PagP(Bp) (Fig 15D), ble flere nye lipid A former detektert (Tabell III). Toppene ved m/ z 1320, 1490, 1545, 1625, 1715 og 1796 korresponderer til den forventede PagP-medierte palmitoylering av molekylionene foreliggende ved m/ z 1081, 1251,1307,1387,1477, og 1557, respektivt. Forskjellen i modifiseringseffektivitet mellom E. coli og B. pertussis PagP, som fremkom etter analyse med Tricin-SDS-PAGE (Fig 14), ble også påvist i den massespektrometrikale analyse. I stammen som utrykker E. coli PagP, var~47 % av det totale lipid A populasjon palmitoylert, i motsetning til kun~9 % i stammen som utrykker PagP (Bp). Interessant, i stammen som utrykker PagP(Bp), i motsetning til den som utrykker PagP (eC), ble lipid A former som mangler en 3-hydroksytetradekanoisk syreenhet ikke funnet å være palmitoylert. En mulig forklaring for denne forskjell er forskjellen i spesifisitet i de to PagP-enzymer. Mens E. coli PagP tilføyer en acylkjede ved 2-posisjonen av lipid A, tilføyer B. pertussis PagP et palmitat ved 3'- posisjon (Bishop et al., EMBO J., 2000; Preston et al., Mol. Microbiol., 2003). Således, det fullstendige fravær av palmitoylerte lipid A former som mangler en 3-hydroksytetradekanoisk syreenhet i stammen som utrykker B. pertussis PagP antyder at lipid A molekylene som mangler en 3-hydroksytetradekanoisk syreenhet mangler denne spesifikt ved deres 3'- posisjon. Dette kan således delvis forklare forskjellen i modifiseringseffektivitet som ble observert mellom de to PagP-enzymer, idet substratpolen for E. coli PagP ville være større enn for B. pertussis PagP. Videre, denne hypotese er i samsvar med forekomst av hypo-asylert lipid A former in vivo.
Referanser:
1. Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700
2. Loppnow, H., Brade, H., Durrbaum, I., Dinarello, C. A., Kusumoto, S., Rietschel, E. T., and Flad, H. D. (1989) J. Immunol. 142, 3229-3238 3. Steeghs, L., Berns, M., ten Hove, J., de Jong, A., Roholl, P., van Alphen, L, Tommassen, J., and van der Ley, P. (2002) Cell. Microbiol. 4, 599-611 4. Nikaido, H., and Vaara, M. (1987) in Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C, ed) Vol. 1, pp. 7-22, American Society for Microbiology, Washington, D. C. 5. Caroff, M., Karibian, D., Cavaillon, J-M., and Haeffner-Cavaillon, N. (2002) Microbes Infect. 4, 915-926 6. Guo, L, Lim, K. B., Gunn, J. S., Bainbridge, B., Darveau, R. P., Hackett, M., and Miller, S. I. (1997) Science 276, 250-253 7. Guo, L., Lim, K. B., Poduje, C. M., Daniel, M., Gunn, J. S., Hackett, M., and Miller, S. I. (1998) Cell 95,189-198
8. Gunn, J. S., Belden, W. J., Miller, S. I. (1998) Microb. Pathog. 25, 77-90
9. Gunn, J. S., Lim, K. B., Krueger, J., Kim, K., Guo, L., Hackett, M., and Miller, S. I. (1998) Mol. Microbiol. 27,1171-1182 10. Gunn, J. S., Ryan, S. S., Van Velkinburgh, J. C, Ernst, R. K., and Miller, S. I.
(2000) Infect. Immun. 68, 6139-6146 11. Miller, S. I., Kukral, A. M., and Mekalanos, J. J. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 86, 5054-5058
12. Gunn, J. S., and Miller, S. I. (1996) J. Bacteriol. 178, 6857-6864
13. Ernst, R. K., Guina, T., and Miller, S. I. (1999) J. Infect. Dis. 179, Suppl. 2, 326-330 14. Ernst, R. K., Yi, E. C, Guo, L, Lim, K. B., Burns, J. L, Hackett, M., and Miller, S. I. (1999) Science 286, 1561-1565 15. Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001) J. Biol. Chem. 276, 43122-43131 16. Lee, H., Hsu, F. F., Turk, J., and Groisman, E. A. (2004) J. Bacteriol. 186, 4124-4133 17. Gibbons, H. S., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz C. R. H. (2000) J. Biol. Chem. 275, 32940-32949 18. Karbarz, M. J., Kalb, S. R., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2003) J. Biol. Chem. 278, 39269-39279 19. Bishop, R. E., Gibbons, H. S., Guina, T., Trent, M. S., Miller, S. I., and Raetz, C. R. H. (2000) EMBOJ. 19, 5071-5080
20. Tanamoto, K., and Azumi, S. (2000) J. Immunol. 164, 3149-3156
21. Robey, M., 0'Connell, W., and Cianciotto, N. P. (2001) Infect. Immun. 69, 4276-4286 22. Trent, M. S., Pabich, W., Raetz, C. R. H., and Miller, S. I. (2001) J. Biol. Chem. 276, 9083-9092 23. Bhat, U. R., Forsberg, L. S., and Carlson, R. W. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14402-14410 24. Moran, A. P., Lindner, B., and Walsh, E. J. (1997) J. Bacteriol. 179,6453-6463 25. Kumada, H., Haishima, Y., Umemoto, T., and Tanamoto, K. (1995) J. Bacteriol. 177, 2098-2106 26. Tommassen, J., van Tol, H., and Lugtenberg, B. (1983) EMBO J. 2,1275-1279 27. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour
(NY)
28. Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685
29. Dekker, N., Merck, K., Tommassen, J., and Verheij, H. M. (1995) Eur. J. Biochem. 232,214-219 30. Lesse, A. J., Campagnari, A. A., Bittner, W. E., and Apicella, M. A. (1990) J. Immunol. Methods 126,109-117
31. Tsai, C. M., and Frasch, C. E. (1982) Anal. Biochem. 119,115-119
32. Westphal, O., and Jann, J.K. (1965) Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91
33. Wilm, M., and Mann, M. (1996) Anal. Chem. 68,1-8
34. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. (1990) J. Mol. Biol. 215,403-410
35. Nielsen, H., Brunak, S., and von Heijne, G. (1999) Protein Eng. 12, 3-9
36. Parkhill, J., Sebaihia, M., Preston, A., Murphy, L. D., Thomson, N., Harris, D. E., Holden, M. T., Churcher, C. M., Bentley, S. D., Mungall, K. L, Cerdeno-Tarraga, A. M., Temple, L, James, K., Harris, B., Quail, M. A., Achtman, M., Atkin, R., Baker, S., Basham, D., Bason, N., Cherevach, I., Chillingworth, T., Collins, M., Cronin, A., Davis, P., Doggett, J., Feltwell, T., Goble, A., Hamlin, N., Hauser, H., Holroyd, S., Jagels, K., Leather, S., Moule, S., Norberczak, H., 0'Neil, S., Ormond, D., Price, C, Rabbinowitsch, E., Rutter, S., Sanders, M., Saunders, D., Seeger, K., Sharp, S., Simmonds, M., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Stevens, K., Unwin, L, Whitehead, S., Barrell, B. G., and Maskell, D. J. (2003) Nat. Genet. 35, 32-40 37. Snijder, H. J., Ubarretxena-Belandia, I., Blaauw, M., Kalk, K. H., Verheij, H.
M., Egmond, M. R., Dekker, N., and Dijkstra, B. W. (1999) Nature 401, 717-721
38. McClelland, M., Sanderson, K. E., Spieth, J., Clifton, S. W., Latreille, P., Courtney, L., Porwollik, S., Ali, J., Dånte, M., Du, F., Hou, S., Layman, D., Leonard, S., Nguyen, C, Scott, K., Holmes, A., Grewal, N., Mulvaney, E., Ryan, E., Sun, H., Florea, L, Miller, W., Stoneking, T., Nhan, M., Waterston, R., and Wilson, R. K.
(2001) Nature 413, 852-856 39. Basu, S. S., White, K. A., Que, N. L, and Raetz, C. R. H. (1999) J. Biol. Chem. 274,11150-11158 40. Kulshin, V. A., Zahringer, U., Lindner, B., Jager, K. E., Dmitriev, B. A., and Rietschel, E. T. (1991) Eur. J. Biochem. 198, 697-704 41. Hwang, P. M., Choy, W. Y., Lo, E. I., Chen, L, Forman-Kay, J. D., Raetz, C. R., Prive, G. G., Bishop, R. E., and Kay, L. E. (2002) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 99, 13560-13565 42. Kol, M. A., van Dalen, A., de Kroon, A. I., and de Kruijff, B. (2003; J. Biol. Chem. 278, 24586-24593
43. von Heijne, G. (1983) Eur. J. Biochem. 133,17-21
44. Tommassen, J. (1988) in Membrane Biogenesis (Op den Kamp, J.A.F., ed) NATO ASI series, Vol. H16, pp. 351-373. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.
45. Haas, D., and Holloway, B.W. (1976) Mol. Gen. Genet. 144, 243-251
46. Pace, J., Hayman, M. J., and Galan, J. E. (1993) Cell 72, 505-514
47. Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580
48. Thaien, M., van den Ussel, J., Jiskoot, W., Zomer, B., Roholl, P., de Gooijer,
C, Beuvery, C, and Trampen, J. (1999) J. Biotechnol. 75,147-159.
49. Ziegler-Heitbrock, H. W., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) J. Cancer41,456-461
50. Simon, R., Priefer, U., and Puhler, A. A. (1983) Bio/ Technol. 1, 784-791
51. Furste, J. P., Pansegrau, W., Frank, R., Blocker, H., Scholz, P., Bagdasarian, M., and Lanka, E. (1986) Gene 48,119-131
52. Stibitz, S., Black, W., and Falkow, S. (1986) Gene 50, 133-140
Claims (18)
1. Polypeptid,karakterisert vedat det oppviser minst 25 % aminosyreidentitet med SEQ ID No 1 og oppviser lipid A 3-0-deacylase aktivitet.
2. Polypeptid,karakterisert vedat det oppviser en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No 1.
3. DNA-sekvens,karakterisert vedat det koder for et polypeptid med en aminosyresekvens som definert i krav 1 eller 2.
4. DNA-vektor,karakterisert vedat det omfatter en DNA-sekvens i samsvar med krav 3.
5. DNA-vektor i samsvar med krav 4,karakterisert vedåt DNA-sekvensen som koder for polypeptidet er funksjonelt koblet til transkripsjons-regulerende sekvenser.
6. Antistoff,karakterisert vedat det er i stand til å bindes til polypeptidet i samsvar med krav 1 eller 2.
7. Gram negativ bakterie,karakterisert vedat den omfatter en DNA-vektor i samsvar med krav 4 eller 5.
8. Bordetella pertussis bakterie,karakterisert vedat den omfatter en DNA-sekvens som koder for et polypeptid ifølge krav 1 eller 2.
9. Bordetella pertussis bakterie i samsvar med krav 8,karakterisertve d a t den partielt eller fullstendig omfatter 3-O-deacylert lipopolysakkarid (LPS) former i sin ytre membran.
10. Bordetella pertussis bakterie i samsvar med krav 9,karakterisertv ed at den omfatter palmitoylert LPS i sin ytre membran.
11. Framgangsmåte for å produsere partielt 3-O-deacylert LPS, karakteris ert ved at fremgangsmåten omfatter trinnet å dyrke en bakterie som definert i krav 7-10 under betingelser som fører til syntese av 3-O-deacylert LPS, og valgfritt å gjennvinne det 3-0 deasylerte LPS.
12. Sammensetning,karakterisert vedat den omfatter LPS som kan oppnås fra Bordetella sp. inneholdende minst partielt 3-O-deacylert LPS.
13. Anvendelse av bakterie i samsvar med krav 7-10 for fremstilling av et medikament for behandling eller hindring av Bordetella infeksjoner, fortrinnsvis B. pertussis infeksjoner.
14. Anvendelse av isolert Bordetella LPS omfattende minst partielt 3-O-deacylert LPS for fremstilling av et medikament for behandling eller hindring av Bordetella infeksjoner.
15. Helcelle vaksine,karakterisert vedat den omfatter bakterie i samsvar med et av kravene 7-10.
16. Acellulær vaksine,karakterisert vedat den omfatter en sammensetning i samsvar med krav 12.
17. En in vitro fremgangsmåte for deacylering av Gram negativ LPS eller sammensetning av omfattende Gram negativ LPS,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnet å sette LPS eller sammensetningen i kontakt med et polypeptid i samsvar med krav 1, under betingelse som fører til enzymatisk deacylering av Gram negativ LPS.
18. Fremgangsmåte for å fremkalle en immunrespons mot Bordetella,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter å administrere til et individ en kilde av 3-O-deacylert lipid A, 3-O-deacylert LPS eller palmitoylert LPS fra Bordetella sp.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP04078445 | 2004-12-17 | ||
PCT/NL2005/050081 WO2006065139A2 (en) | 2004-12-17 | 2005-12-16 | Deacylation of lps in gram negative bacteria |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20073088L NO20073088L (no) | 2007-09-17 |
NO340331B1 true NO340331B1 (no) | 2017-04-03 |
Family
ID=34928754
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20073088A NO340331B1 (no) | 2004-12-17 | 2007-06-18 | Deacylering av LPS i gramnegative bakterier |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8048433B2 (no) |
EP (1) | EP1828378B1 (no) |
JP (1) | JP5378685B2 (no) |
CN (1) | CN101203605B (no) |
AU (1) | AU2005317304B2 (no) |
BR (1) | BRPI0519923A8 (no) |
CA (1) | CA2590906C (no) |
DK (1) | DK1828378T3 (no) |
ES (1) | ES2493440T3 (no) |
MX (1) | MX2007007288A (no) |
NO (1) | NO340331B1 (no) |
NZ (1) | NZ555889A (no) |
PL (1) | PL1828378T3 (no) |
PT (1) | PT1828378E (no) |
WO (1) | WO2006065139A2 (no) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101667551B1 (ko) * | 2007-03-26 | 2016-10-19 | 드 슈타트 데르 네덜란덴, 베르테겐부어디그트 두어 드 미니스터 반 베이웨이에스, 미니스테리 반 폭스겐트존하이트, 벨지인 엔 스포츠 | Lps 글리코실트랜스퍼레이즈 돌연변이에 기초한 보르데텔라 페르투시스에 대한 개선된 백신 |
US20140037680A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-06 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Novel method |
CA2879939A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-13 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Novel method |
US11052142B2 (en) | 2013-06-04 | 2021-07-06 | Petr G. Aparin | Modified endotoxic bacteria lipopolysaccharide (variants), combination of modified lipopolysaccharides (variants) and, containing same, a vaccine (variants) and a pharmaceutical composition (variants) |
ES2828373T3 (es) | 2013-06-04 | 2021-05-26 | Aparin Petr Gennadievich | Lipopolisacárido modificado (variantes) de bacterias endotóxicas, combinación de lipopolisacáridos modificados (variantes) y una vacuna (variantes), que los contiene, y una composición farmacéutica (variantes) |
BR112016002354A2 (pt) | 2013-08-05 | 2017-09-12 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | composição imunogênica, métodos para proteger um bebê contra infecção ou doença e para evocar uma resposta imune, regime de vacinação, e, kit |
US10420833B2 (en) | 2014-05-19 | 2019-09-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combinatorial platform for the display of surface adjuvants and antigens |
CN104388368B (zh) * | 2014-10-30 | 2017-02-15 | 四川农业大学 | 一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法 |
KR20180103167A (ko) * | 2016-01-28 | 2018-09-18 | 드 슈타트 데르 네덜란덴, 베르테겐부어디그트 두어 드 미니스터 반 베이웨이에스, 미니스테리 반 폭스겐트존하이트, 벨지인 엔 스포츠 | 변형된 테트라-아실화된 나이세리아 lps |
CN105567620B (zh) * | 2016-01-29 | 2019-03-19 | 江南大学 | 一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用 |
CN105695540A (zh) * | 2016-03-18 | 2016-06-22 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种革兰氏阴性菌胞壁抗原的制备方法 |
CA3055757A1 (en) * | 2017-03-13 | 2018-09-20 | De Staat Der Nederlanden, Vert. Door De Minister Van Vws, Ministerie Van Volksgezondheid, Welzijn En Sport | Bordetella vaccines comprising lps with reduced reactogenicity |
US11744884B2 (en) * | 2017-05-15 | 2023-09-05 | University Of Maryland, Baltimore | Live Salmonella typhi vectors engineered to express heterologous outer membrane protein antigens and methods of use thereof |
AU2018379236A1 (en) * | 2017-12-04 | 2020-06-18 | Intravacc B.V. | An improved process for producing outer membrane vesicles |
CN116438193A (zh) | 2020-09-04 | 2023-07-14 | Intravacc有限责任公司 | OmpA突变增强百日咳博德特氏菌中OMV产生 |
EP4169513A1 (en) | 2021-10-19 | 2023-04-26 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Adjuvant composition comprising sting agonists |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH650681A5 (en) * | 1981-08-14 | 1985-08-15 | Dso Pharmachim | Whooping cough vaccine |
JP2918895B2 (ja) * | 1987-09-04 | 1999-07-12 | アムジエン・インコーポレーテツド | 組換え型dna由来ボルデテラ毒素サブユニット類似体 |
EP0484621A3 (en) * | 1990-07-11 | 1992-08-26 | American Cyanamid Company | Efficacious vaccines against bordetella pertussis comprising a combination of individually purified pertussis antigens |
HU219819B (hu) * | 1992-08-18 | 2001-08-28 | Dimminaco Ag/Sa/Ltd. | Izolált polinukleotidok, ezeket tartalmazó Bordetella bronchiseptica törzs, és Bordetella bronchiseptica elleni vakcina |
DE69622555T2 (de) * | 1995-05-04 | 2003-03-27 | Aventis Pasteur Ltd., Toronto | Azelluläre pertussis-impfstoffe und verfahren zu deren herstellung |
US6887483B2 (en) | 1995-12-01 | 2005-05-03 | University Of Iowa Research Foundation | Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria |
PT971739E (pt) * | 1997-04-01 | 2004-12-31 | Corixa Corp | Composicoes aquosas de adjuvante imunologico de monofosforil lipido a |
CA2264970A1 (en) * | 1998-03-10 | 1999-09-10 | American Cyanamid Company | Antigenic conjugates of conserved lipolysaccharides of gram negative bacteria |
NZ511438A (en) * | 1998-11-03 | 2003-03-28 | Nederlanden Staat | A lipopolysaccharide (LPS) with reduced toxicity from genetically modified gram negative bacteria |
US6531131B1 (en) * | 1999-08-10 | 2003-03-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Conjugate vaccine for Neisseria meningitidis |
US20030113742A1 (en) * | 2001-04-20 | 2003-06-19 | University Of Iowa Research Foundation | Methods and compositions for the modulation of biofilm formation |
-
2005
- 2005-12-16 WO PCT/NL2005/050081 patent/WO2006065139A2/en active Application Filing
- 2005-12-16 PL PL05815467T patent/PL1828378T3/pl unknown
- 2005-12-16 ES ES05815467.5T patent/ES2493440T3/es active Active
- 2005-12-16 CA CA2590906A patent/CA2590906C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-16 PT PT58154675T patent/PT1828378E/pt unknown
- 2005-12-16 NZ NZ555889A patent/NZ555889A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-12-16 CN CN200580048420.6A patent/CN101203605B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-16 BR BRPI0519923A patent/BRPI0519923A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2005-12-16 EP EP05815467.5A patent/EP1828378B1/en not_active Not-in-force
- 2005-12-16 AU AU2005317304A patent/AU2005317304B2/en not_active Ceased
- 2005-12-16 JP JP2007546589A patent/JP5378685B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-16 US US11/722,034 patent/US8048433B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-16 DK DK05815467.5T patent/DK1828378T3/da active
- 2005-12-16 MX MX2007007288A patent/MX2007007288A/es active IP Right Grant
-
2007
- 2007-06-18 NO NO20073088A patent/NO340331B1/no not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
CAROFF et al; Structural variability and originality of the Bordetella endotoxins; J. of Endotox. Res, vol. 7, nr. 1, 2001, s. 63-68, ISSN 0968-0519, Dated: 01.01.0001 * |
PARKHILL et al: Comparative analysis of the genome sequences of Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica; Nature Genetic, vol 35, nr 1, 2003, s 32-40, ISSN 1061-4036, Dated: 01.01.0001 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO20073088L (no) | 2007-09-17 |
PL1828378T3 (pl) | 2014-10-31 |
WO2006065139A2 (en) | 2006-06-22 |
MX2007007288A (es) | 2008-02-25 |
US20080274145A1 (en) | 2008-11-06 |
CA2590906C (en) | 2017-01-03 |
EP1828378A2 (en) | 2007-09-05 |
AU2005317304A1 (en) | 2006-06-22 |
DK1828378T3 (da) | 2014-09-01 |
JP5378685B2 (ja) | 2013-12-25 |
US8048433B2 (en) | 2011-11-01 |
ES2493440T3 (es) | 2014-09-11 |
CA2590906A1 (en) | 2006-06-22 |
JP2008523805A (ja) | 2008-07-10 |
AU2005317304B2 (en) | 2011-06-23 |
CN101203605A (zh) | 2008-06-18 |
BRPI0519923A2 (pt) | 2009-08-11 |
BRPI0519923A8 (pt) | 2018-01-23 |
WO2006065139A3 (en) | 2006-10-19 |
NZ555889A (en) | 2009-07-31 |
CN101203605B (zh) | 2016-01-27 |
PT1828378E (pt) | 2014-10-10 |
EP1828378B1 (en) | 2014-06-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO340331B1 (no) | Deacylering av LPS i gramnegative bakterier | |
US5330754A (en) | Membrane-associated immunogens of mycobacteria | |
Muryoi et al. | Cloning and expression of afpA, a gene encoding an antifreeze protein from the arctic plant growth-promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 | |
CA2413045C (en) | Expression system | |
DK2248822T3 (en) | MENINGOCOKKER ADHESIONS | |
AU2012328146B2 (en) | Vaccine | |
JPH10513349A (ja) | 微生物蛋白質と、この蛋白質を産生する微生物と、該蛋白質のワクチンおよび結核検出での利用 | |
AU5586499A (en) | (ehrlichia canis) 120-kda immunodominant antigenic protein and gene | |
CA2894951A1 (en) | Immunogenic composition comprising elements of c. difficile cdtb and/or cdta proteins | |
AU2018285857B2 (en) | Immunogenic compositions comprising Staphylococcus aureus leukocidin lukA and lukB derived polypeptides | |
JP3072345B1 (ja) | 豚丹毒菌の組換えサブユニットワクチン | |
CN111787943A (zh) | 作为疫苗的来自产气荚膜梭菌的ε毒素 | |
CN106536544B (zh) | 艰难梭菌免疫原性组合物 | |
Haghi et al. | Cloning, expression and purification of outer membrane protein PorA of Neisseria meningitidis serogroup B | |
AU2022204585A1 (en) | Vaccine constructs and uses thereof against staphylococcus infections | |
CA2478277A1 (en) | Expec-specific proteins, genes encoding them and uses thereof | |
Yu et al. | Immunogenicity of the Non-toxic Form of Staphylococcus aureus α-hemolysin using a chimeric fusion in mice | |
Lee et al. | Development and characterization of a catalytically inactive cysteine protease domain of RtxA1/MARTXVv as a potential vaccine for Vibrio vulnificus | |
EP3616717A1 (en) | Recombinant antigen inducing antibodies for neutralization of bordetella adenylate cyclase toxin | |
Jang et al. | Comparative structural and immunological analysis of outer membrane proteins and dermonecrotic toxin in Bordetella bronchiseptica canine isolate | |
US10174086B2 (en) | Vaccine | |
KR101713635B1 (ko) | 비브리오 패혈증균의 시스테인 단백질 분해효소 도메인 유래 재조합 단백질 및 이의 용도 | |
WO2005034841A2 (en) | Anthrax vaccine | |
Oliver | Structure/function studies of the Bordetella pertussis autotransporter protein BrkA | |
Tidhar et al. | The NlpD Lipoprotein Is a Novel Yersinia pestis Virulence Factor Essential for the |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |