KR101715366B1 - 지질의 탈인산화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 탈인산화된 지질을 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

아퀴펙스(Aquifex) 속 세균의 LpxE 폴리펩티드를 포함하는 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 탈인산화된 지질을 생산하는 방법을 제공한다. 이에 의하면, 다양한 종류의 지질을 효율적으로 탈인산화시킬 수 있다.

Description

지질의 탈인산화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 탈인산화된 지질을 생산하는 방법{Composition and kit for dephosphorylating lipid, and method for the production of dephosphorylated lipid using the same}
지질의 탈인산화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 탈인산화된 지질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
그람-음성 세균의 막(envelope)은 지질 이중층으로 이루어진 막이 2개 존재하여 그람-양성 세균과 구별된다. 지질은 두 그룹으로 나누면 글리세로인지질(glycerophospholipid)과 사카로지질 지질 A(saccharolipid lipid A)로 나뉘고 이들은 막의 주요 지질 성분이다.
거의 예외 없이, 그람-음성 세균은 레츠(Raetz) 경로로 알려진 잘 보존된 7 종의 효소를 통해 테트라-아실화된 이인산화된(bisphosphorylated) 지질 A 전구체 Kdo2-lipid IVA를 생산한다. 지질 A 변형 효소는 Kdo2-lipid IVA 전구체를 각 종에 특징적인 지질 A 유도체로 전환한다. 프란시셀라, 리조비움(Rhizobium), 및 헬리코박터 속과 같은, 그람-음성 세균의 하위 그룹에서, 지질 A의 1-위치의 인산이 막에 포매된(embeded) 지질 A 1-포스파타아제 LpxE에 의해 제거된다. LpxE는 지질 포스파타아제/포스포트란스퍼라아제(lipid phosphatase/phosphotransferase; LPT) 수퍼패밀리에 속하고, 이전에 PAP2 포스파타아제 수퍼패밀리로 알려진 지질 전환 효소로 알려졌었다.
대장균은 천연 지질 A 1-포스파타제 활성을 함유하지 않는다는 것이 확인되었다. 한편, 리조비움 레구모사룸(Rhizobium legumosarum)의 지질 A 1- 포스파타제 LpxE는 포르파티딜 글리세롤 포스페이트(phosphatidylglycerol phosphate; PGP) 포스파타제 활성을 결여하는 것으로 보고되었다. 그러나, 아퀴펙스 아에올리쿠스의 LpxE 및 그의 기질에 대해서는 확인된 바가 없다.
지질의 탈인산화용 조성물을 제공한다.
지질의 탈인산화용 키트를 제공한다.
탈인산화된 지질을 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 아퀴펙스(Aquifex) 속 세균의 LpxE 폴리펩티드를 포함하는 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 조성물을 제공한다.
상기 용어 "세균(bacteria)"은 원핵 세균을 말한다. 상기 아퀴펙스(Aquifex) 속 세균은 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus) 또는 아퀴펙스 피로필루스(Aquifex pyrophilus)를 포함한다. 아퀴펙스 속 세균은 호열성 세균이고, 약 85℃ 내지 약 95℃의 온도에서도 잘 생장할 수 있다.
상기 LpxE 폴리펩티드는 3개 아미노산으로 이루어진(tripartite) 활성 부위와 6 개의 막 통과 헬릭스를 포함하는 지질 인산 포스파타아제에 속한다. 지질 인산 포스파타아제는 인산 모노에스테르 결합에 특이적으로 결합하는 가수분해 효소로서, 인산기를 포함하는 지질로부터 인산기(phosphate group)를 제거할 수 있다. 상기 LpxE 폴리펩티드는 아퀴펙스 아에올리쿠스 유래 LpxE 폴리펩티드(AaLpxE)일 수 있다. 상기 LpxE 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 LpxE 폴리펩티드는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기 지질은 중성지방, 글리세로인지질, 글리세로 당지질, 밀랍, 황지질, 스핑고인지질, 스핑고당 지질, 카로티노이드, 스테로이드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 지질은 예를 들어, 당지질(saccharolipid), 글리세로인지질(glycerophospholipid), 폴리프레닐 지질(polyprenyl lipid), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 당지질은 지질 A, 지질 A 유도체, Kdo2-지질 IVA, 지질 X, 디사카라이드-1-포스페이트(disaccharide-1-phosphate; DSMP), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 지질 A 유도체는 지질 A의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물일 수 있다. 예를 들어, 지질 A 유도체는 3-데옥시-D-만노-옥트-2-울로손산(3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid; Kdo), 아실 사슬, 또는 이들의 조합을 포함하는 화합물일 수 있다. 글리세로인지질은 포스파티딜글리세롤 포스페이트(Phosphatidylglycerol phosphate; PGP)일 수 있다. 폴리프레닐 지질은 언데카프레닐피로포스페이트(undecaprenylpyrophosphate)일 수 있다.
상기 용어 "탈인산화(dephosphorylation)"는 하나의 화합물에서 다른 화합물로 인산기를 전이시키는 반응을 말한다. 상기 LpxE 폴리펩티드는 인산기를 함유하는 지질로부터 1-인산기를 제거하여 지질을 탈인산화시키는 것일 수 있다.
일 양상은 아퀴펙스(Aquifex) 속 세균의 LpxE 폴리펩티드를 포함하는 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 키트를 제공한다.
상기 세균, 아퀴펙스 속 세균, LpxE 폴리펩티드, 지질, 및 탈인산화는 전술한 바와 같다.
상기 키트는 지질의 탈인산화에 필요한 완충액을 더 포함할 수 있다.
일 양상은 아퀴펙스(Aquifex) 속 세균의 LpxE 폴리펩티드와 인산기를 함유하는 지질을 인큐베이션하여 지질을 탈인산화시키는 단계; 및
탈인산화된 지질을 수득하는 단계를 포함하는, 탈인산화된 지질을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 아퀴펙스(Aquifex) 속 세균의 LpxE 폴리펩티드와 인산기를 함유하는 지질을 인큐베이션하여 지질을 탈인산화시키는 단계를 포함한다.
상기 세균, 아퀴펙스 속 세균, LpxE 폴리펩티드, 지질, 및 탈인산화는 전술한 바와 같다.
상기 인큐베이션은 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro)에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 탈인산화된 지질을 수득하는 단계를 포함한다.
지질을 수득하는 방법은 공지된 것일 수 있다. 지질은 물리적 또는 화학적 방법으로 수득될 수 있다. 물리적 방법은 예를 들어 초음파 또는 냉해동 반복을 수행할 수 있다. 화학적 방법은 유기 용매를 사용하여 추출하는 것일 수 있다. 유기 용매는 예를 들어, 클로로포름, 메탄올, 헥산, 이소프로필 알콜, 에틸 아세테이트, 에탄올, 또는 이들의 조합일 수 있다. 지질을 추출하는 방법은 예를 들어 블라이와 다이어(Bligh and Dyer) 추출법(Bligh,E.G. and Dyer,W.J., Can. J. Biochem. Physiol., 1959, vol.37, p.911-917)일 수 있다.
일 양상에 따른 아퀴펙스(Aquifex) 속 세균의 LpxE 폴리펩티드를 포함하는 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 탈인산화된 지질을 생산하는 방법에 따르면, 다양한 종류의 지질을 효율적으로 탈인산화시킬 수 있다.
도 1a는 지질 A의 생합성 경로 중 UDP-N-아세틸글루코사민(UDP-GlcNac)으로부터 Kdo2-IVA의 생합성 과정을 나타내는 그림이고, 도 1b는 LpxE 단백질이 Kdo2-지질 A에서 1-인산기를 제거하는 반응을 나타내는 그림이고, 도 1c는 아퀴펙스 아에올리쿠스의 지질 A의 화학식이고, 및 도 1d는 프란시셀라 노비시다 LpxE(FnLpxE), 대장균 PgpB(EcPgpB), 및 aq_1706 폴리펩티드의 BLAST 검색 결과를 나타내는 그림이다.
도 2a는 수득된 총 지질의 TLC 결과를 나타내는 사진이고(레인 1; pWSK29, 레인 2; pWSK29-FnLpxE, 레인 3; pWSK29-AaLpxE), 도 2b 및 도 2c는 각각 pWSK29를 형질전환한 대장균의 총 지질 및 pWSK29-AaLpxE를 형질전환한 대장균의 총 지질을 LC/MS 분석한 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 각각 AaLpxE 폴리펩티드에 의한 Kdo2-지질 IVA, 지질 X, 및 DSMP(disaccharide 1-phosphate)로부터 1-인산기의 제거를 보여주는 TLC 플레이트의 이미지이다.
도 4는 AaLpxE 폴리펩티드에 의한 PGP로부터 1-인산기의 제거를 보여주는 TLC 플레이트의 이미지이다.
도 5는 시간에 따른 AaLpxE 폴리펩티드에 의한 언데카프레닐피로포스페이트로부터 1-인산기의 제거율(전환율(%))을 나타내는 그래프이다(○; 음성대조군(pET21), ■; AaLpxE 폴리펩티드).
도 6a는 시간에 따른 pNPPP의 탈인산화된 산물의 농도(mM)를 나타내는 그래프이고, 도 6b는 시간에 따른 글루코사민-1-포스페이트로부터 유리된 포스페이트의 농도(μM)를 나타내는 그래프이다(◇; CIP, ○; 음성대조군(pET21), ■; AaLpxE 폴리펩티드).
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 아퀴펙스 아에올리쿠스( Aquifex aeolicus )에서 LpxE 의 확인
1.1. 아퀴펙스 아에올리쿠스에서 지질 A 1-포스파타아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 검색
아퀴펙스 아에올리쿠스 지질다당류(lipopolysaccharide)의 지질 A 모이어티는 1'- 및 4'-위치에서 인산기의 위치에 갈락투론산(galacturonic acid) 모이어티를 함유한다(도 1c). 또한, 지질 생합성 경로에서 1-인산기는 LpxI 단백질에 의해 UDP-디아실-글루코사민의 UMP 모이어티의 가수분해에 의해 초기에 생성되기 때문에, 아퀴펙스 속에서 지질 A에서 D-갈락투론산 모이어티의 도입은 지질 A로부터 1-인산기의 제거를 요구하고 아퀴펙스 속에서 지질 A 1-포스파타아제(phosphotase) 활성의 효소가 존재하는 것을 의미한다. 따라서, 아퀴펙스 아에올리쿠스에서 지질 A 1-포스파타아제 활성을 갖는 유전자를 검색하였다.
BLAST(http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 검색하여, 아퀴펙스 아에올리쿠스 VF5 게놈에 존재하고, 프란시셀라 노비시다 LpxE(Francisella novicida LpxE; FnLpxE) 단백질과 대장균 PgpB(Escherichia coli PgpB; EcPgpB) 단백질에 상동성이 있는 aq_1706 폴리펩티드(GenBank Accession No. NP_214169.1, 서열번호 1)를 확인하였다(도 1d). aq_1706 폴리펩티드는 아미노산 서열에서 대장균 PgpB 유전자와 16.5% 동일성이 있고 프란시셀라 노비시다 LpxE 유전자와 13.5% 동일성이 있었다.
1.2. AaLpxE 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드의 준비
AaLpxE 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 T7lac 프로모터를 포함하는 pET21 벡터에 클로닝하였다.
구체적으로, 아퀴펙스 아에올리쿠스 VF5 게놈(GenBank Accession No. NC_000918.1)(ATCC)으로부터 하기 프라이머 쌍을 사용하여 aq_1706 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(GenBank Accession No. NC_000918.1:1199317..1199841, 서열번호 2)를 증폭하였다.
정방향 프라이머: 5'-GCATGCCATATGATGGTAATAGAAGACTTTGCTCTAAAC-3' (서열번호 3)
역방향 프라이머: 5'-ATTAGCCTCGAGATTTCTCTCATACACACCTCCCTT-3' (서열번호 4)
폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)을 위해, KOD 핫 스타트 DNA 폴리머라제(Novagen)를 사용하였고, T3000 thermocycler(Biometra)에서 수행하였다.
증폭된 산물을 QIAquick PCR purification kit(Qiagen)를 사용하여 정제하고, 정제된 산물을 pET21 플라스미드(Novagen)에 도입하였다. 클로닝된 플라스미드를 대장균 C41(DE3)에 형질전환시키고, LB-암피실린 플레이트에서 선별하였다. 클로닝된 플라스미드를 pET21-AaLpxE로 명명하였다.
1.3. aq _1706 폴리펩티드의 기능 확인
aq_1706 폴리펩티드가 인 비보(in vivo)에서 1-인산기를 제거하는지 여부를 확인하기 위해, 헵토스(heptose)-결핍 대장균 스트레인 WBB06에서, 로우-카피(low-copy) 플라스미드 pWSK29에 기초한 컨스트럭트를 사용하여 aq_1706 폴리펩티드를 과발현시켰다.
실시예 1.2에서 준비된 pET21_Aq1706으로부터 하기 프라이머 쌍을 사용하여 리보좀 결합 서열 (Ribosome binding sequence)을 포함한 aq_1706 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하였다.
정방향 프라이머: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (서열번호 5)
역방향 프라이머: 5'-ATTAGCCTCGAGCTAATTTCTCTCATACACACCTCCC-3' (서열번호 6)
PCR을 위해, KOD 핫 스타트 DNA 폴리머라제(Novagen)를 사용하였고, T3000 thermocycler(Biometra)에서 수행하였다.
증폭된 산물을 QIAquick PCR purification kit(Qiagen)를 사용하여 정제하고, 정제된 산물을 pWSK29 플라스미드(Wang, R. F., and Kushner, S. R., Gene(1991),vol.100, p.195-199)에 도입하였다. 클로닝된 플라스미드를 헵토스(heptose)-결핍 대장균 스트레인 WBB06(Brabetz, W., Muller-Loennies, S., Holst, O., and Brade, H. FEBS(1997), vol.247, p.716-724)에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 형질전환시키고, 클로닝된 플라스미드를 pWSK29-AaLpxE로 명명하였다. WBB06는 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)의 합성에서 돌연변이 때문에 Kdo2-지질 A가 유일한 형태의 LPS이다.
pWSK29-AaLpxE가 형질전환된 헵토스(heptose)-결핍 대장균 스트레인 WBB06을 600 nm의 파장에서 흡광도가 1.0에 도달할 때까지 30℃에서 배양하고, 배양된 대장균을 원심분리하여 수득하였다. 수득된 대장균을 PBS로 세척하고, 대장균에 부피비 1:2:0.8의 클로로포름:메탄올:0.1N HCl의 용액을 첨가하여 총 지질을 추출하였다. 낮은 속도의 원심분리하여 침전된 단백질과 세포 잔해를 제거하고, 총 지질을 포함하는 상층액을 수득하였다. 상층액에 각각 동량의 클로로포름과 0.1N HCl을 첨가하여 2개 층으로 만들었다. 클로로포름에 용해되는 지질을 포함하는 아래층을 수득하고, 수득된 용액에 피리딘을 첨가하여 중성화시키고, 질소 가스 하에서 건조시켰다. 건조된 지질을 부피비 4:1의 클로로포름:메탄올에 재현탁시켰다. 양성 대조군으로 프란시셀라 노비시다 LpxE 유전자(FnLpxE)가 도입된 pWSK29를 형질전환시킨 대장균을 사용하여 총 지질을 수득하였다.
얇은 막 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC)를 수행하기 위해, 재현탁시킨 지질을 10 x 10 cm HPTLC 플레이트(EMD Chemicals)에 스폿팅(spotting)하고, 부피비 25:15:4:2의 클로로포름:메탄올:아세트산:물의 용매에서 전개하고 10%(v/v) 황산(에탄올 중)으로 분무하여 시각화하고, 핫 플레이트에서 그을렸다. 지질의 TLC 결과를 도 2a에 나타내었다(레인 1:pWSK29, 레인 2: pWSK29-FnLpxE, 레인 3: pWSK29-AaLpxE). 도 2a에 나타난 바와 같이, pWSK29-FnLpxE가 형질전환된 대장균에서와 마찬가지로, pWSK29-AaLpxE가 형질전환된 대장균에서 1-인산기가 제거된 Kdo2-지질 A가 검출되었다.
한편, 인산기의 제거를 확인하기 위해 LC/MS 분석을 수행하였다. LC/전기분무 이온화-MS/MS 분석을 위해 Ascentis 실리카 HPLC 컬럼(5 ㎛, 25 cm x 2.1 mm)(Sigma-Aldrich)을 Agilent 1200 Quatenary LC system에 사용하여 정상 액체 크로마토그래피를 수행하였다(이동상 A: 부피비 800:195:5의 클로로포름:메탄올:수성 암모니아, 이동상 B: 부피비 600:340:50:5의 클로로포름:메탄올:물:수성 암모니아, 및 이동상 C: 부피비 450:450:95:5의 클로로포름:메탄올:물:수성 암모니아). 용출(300 ㎕/분)은 100% 이동상 A에서 2 분; 100% 이동상 B의 선형 농도 구배에서 14 분; 100% 이동상 B에서 홀딩(holding)하여 11 분; 100% 이동상 C의 선형 농도 구배에서 3 분; 및 100% 이동상 C에서 홀딩하여 3 분을 수행하였다. 컬럼을 각 시료 사이에 이동상 A로 5 분 동안 세척하였다. 10%의 용출액을 충돌(collision) 가스로 질소를 사용하는 QSTAR XL quadropole time-of-flight tandem mass spectrometer에서 분석하였다. 데이터를 Analyst QS 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. pWSK29가 형질전환된 대장균의 지질을 도 2b에 나타내고, pWSK29-AaLpxE가 형질전환된 대장균의 지질을 도 2c에 나타냈다. 도 2b 및 도 2c에 나타난 바와 같이, pWSK29-AaLpxE가 도입된 대장균은 1-인산기가 제거된 지질 A를 생산함을 확인하였다.
따라서, AaLpxE 폴리펩티드는 지질 A의 1-인산기를 제거하는 포스파타아제임을 확인하였다.
실시예 2. AaLpxE 의 기질 확인
2.1. AaLpxE 폴리펩티드의 준비
AaLpxE 폴리펩티드를 과발현시키기 위해 실시예 1.2에서 준비된 pET21-AaLpxE가 형질전환된 대장균 C41(DE3)을 상온에서 24 시간 동안 배양하면서, 자가-유도 방법(Studier, F. W., Prot. Express. Purif., 2005, vol.41, p.207-234)을 이용하여 배양하였다. 음성 대조군으로 pET21 플라스미드가 형질전환된 대장균 C41(DE3)을 사용하였다.
각각 pET21 플라스미드와 pET21-AaLpxE가 형질전환된 대장균 C41(DE3)을 37℃에서 18 시간 동안 배양하고, 1 ㎖의 배양액을 암피실린이 첨가된 1 L의 ZYM-5052 자가-유도 배지에 접종하였다. 배양액을 200 rpm으로 진탕하면서 약 25℃에서 24 시간 동안 배양하고, 6,500x g에서 15 분 동안 원심분리하여 세포를 수득하였다. 수득된 세포를 냉장 PBS 완충액으로 세척하고 세포를 6 ㎖의 용해 완충액(20 mM HEPES (pH 8), 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, 및 1X 프로테아제 저해제 칵테일 세트(Calbiochem))에 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 18,000 psig 에서 cell cracker (Microfluidics Corp.)를 사용하여 용해시키고, 8,000x g에서 20 분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 상층액을 150,000x g에서 1 시간 동안 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 펠렛을 20 mM HEPES (pH 8.0) 및 300 mM NaCl에 재현탁하여 AaLpxE 폴리펩티드를 포함하는 막 추출물을 수득하였다. 수득된 막 추출물은 사용시까지 -80℃에서 보관하였다.
2.2. 지질 A 전구체로부터 1- 인산기의 제거 확인
이당류(disaccharide) 1-인산기 전구체와 [γ-32P]ATP로부터 [4'-32P] 지질 IVA를 준비하고, 정제된 대장균 KdtA 효소를 이용하여 [4'-32P] 지질 IVA를 Kdo2-[4'-32P] 지질 IVA로 전환시켰다(Karbarz, M. J., Six, D. a, and Raetz, C. R. H., J. Biol. Chem., 2009, vol. 284, p.414-425).
실시예 2.1에서 수득된 막 추출물과 Kdo2-[4'-32P] 지질 IVA를 사용하여 지질 A 1-포스파타아제 활성을 확인하였다. 수득된 막을 사용하기 전에 초음파 수조(Laboratory Supplies Co.)에서 1 분 동안 소니케이션하였다. 50 mM MES (pH 6.0), 0.1% n-도데실-β말토피라노시드(DDM)(Anatrace), 0.5 ㎎/㎖ BSA, 10 μM Kdo2-지질 IVA, 및 700 cpm/㎕ Kdo2-[4'-32P] 지질 IVA의 반응 혼합물을 준비하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 미리 평형화시키고, 반응 혼합물에 20 ㎍/㎖의 수득된 막 추출물을 첨가하고 상온에서 10 분 내지 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 반응물을 실리카 겔 TLC 플레이트에 스폿팅(spotting)하여 반응을 종료시키고, TLC 플레이트를 상온에서 건조시켰다. TLC 플레이트를 부피비 30:70:16:8 클로로포름:피리딘:88% 포름산:물의 용매 시스템에서 전개하고, 뜨거운 공기 흐름 하에서 건조시켰다. TLC 플레이트를 Phosphorimager로 분석하고, 그 이미지를 도 3a에 나타내었다. 도 3a는 막 추출물을 첨가하지 않은 경우, pET21 플라스미드가 형질 전환된 대장균으로부터 수득된 막 추출물을 첨가한 경우(대조군(pET21)), 및 pET21-AaLpxE가 형질전환된 대장균 C41(DE3)으로부터 수득된 막 추출물을 첨가한 경우(AaLpxE)에, 반응 시간에 따른 막 추출물 중 AaLpxE 폴리펩티드에 의한 Kdo2-지질 IVA로부터 1-인산기의 제거를 보여준다.
도 3a에 나타난 바와 같이, 막 추출물을 첨가하지 않거나, pET21 플라스미드만 도입된 경우에는 Kdo2-지질 IVA로부터 1-인산기가 제거되지 않았으나, pET21-AaLpxE로부터 과발현된 AaLpxE 폴리펩티드는 Kdo2-지질 IVA로부터 1-인산기를 제거하였다. 이때, 비 활성(specific activity)은 총 단백질의 mg 당 41.5 nmol/분이었다. 따라서, AaLpxE 폴리펩티드는 Kdo2-지질 IVA를 기질로 하고, 지질 A 1-포스파타아제 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.
AaLpxE 폴리펩티드에 의한 지질 X 및 DSMP(disaccharide 1-phosphate)의 탈인산화를 확인하기 위해, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.1%(w/v) TRITON X-100(Thermo Scientific), 및 100 μM 1000 cpm/㎕ [32P]-지질 X 또는 100 μM 1000 cpm/㎕ 이당류-1-[32P]-인산의 반응 혼합물을 준비하였다. 반응 혼합물에 20 ㎍/㎖의 실시예 2.1에서 수득된 막 추출물을 첨가하고 30℃에서 5 분 내지 20 분 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 TLC 실리카 겔 60 플레이트에 스폿팅하고 TLC 플레이트를 부피비 25:15:4:2 클로로포름:메탄올:아세트산:물의 용매 시스템에서 전개하고, 뜨거운 공기 흐름 하에서 건조시켰다. TLC 플레이트를 Phosphorimager로 분석하고, 그 이미지를 도 3b 및 도 3c에 나타내었다. 도 3b 및 도 3c는 pET21 플라스미드가 형질 전환된 대장균으로부터 수득된 막 추출물을 첨가한 경우(대조군(pET21)), 및 pET21-AaLpxE가 형질전환된 대장균 C41(DE3)으로부터 수득된 막 추출물을 첨가한 경우(AaLpxE)에, 반응 시간에 따른 막 추출물 중 AaLpxE 폴리펩티드에 의한 지질 X 및 DSMP로부터 1-인산기의 제거를 보여준다.
도 3b 및 도 3c에 나타난 바와 같이, pET21 플라스미드만 도입된 경우에는 지질 X 및 DSMP로부터 1-인산기가 제거되지 않았으나, pET21-AaLpxE로부터 과발현된 AaLpxE 폴리펩티드는 지질 X 및 DSMP로부터 1-인산기를 제거하였다. 이때, 비 활성(specific activity)은 각각 총 단백질의 ㎎ 당 122 nmol/분 및 21.5 nmol/분이었다. 따라서, AaLpxE 폴리펩티드는 Kdo2-지질 IVA 뿐만 아니라 지질 X 및 DSMP도 기질로 하는 지질 A 1-포스파타아제임을 확인하였다.
2.3. AaLpxE 폴리펩티드의 대사성 지질로부터 인산기의 제거 확인
일부 지질 포스파타아제는 그람 음성 세균에서 포스파티딜글리세롤 포스페이트(phosphatidylglycerol phosphate; PGP) 및 언데카프레닐피로포스페이트(undecaprenylpyrophosphate)를 포함한 다양한 대사성 중간체를 기질로 하기 때문에, AaLpxE 폴리펩티드가 언데카프레닐피로포스페이트 또는 PGP를 기질로 하는지 확인하였다.
AaLpxE 폴리펩티드에 의한 PGP의 탈인산화를 확인하기 위해, 50 mM Tris 클로리드 (pH 7.5), 0.1% TRITON X-100(Thermo Scientific), 1 mM DTT, 0.5 ㎎/㎖ BSA, 100 μM PGP 및 500 cpm/㎕ 포스파티딜[U-14C ]글리세롤 포스페이트(Lu, Y.-H., Guan, Z., Zhao, J., and Raetz, C. R. H., J. Biol. Chem., 2011, vol. 286, p.5506-5518)를 포함하는 반응 혼합물을 준비하였다. 반응 혼합물에 20 ㎍/㎖의 실시예 2.1에서 수득된 막 추출물을 첨가하고 30℃에서 5 분 내지 20 분 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 TLC 실리카 겔 60 플레이트에 스폿팅하고 TLC 플레이트를 부피비 50:50:16:5의 클로로포름:피리딘:88% 포름산:물의 용매 시스템에서 전개하고, 뜨거운 공기 흐름 하에서 건조시켰다. TLC 플레이트를 Phosphorimager로 분석하고, 그 이미지를 도 4에 나타내었다. 도 4는 막 추출물을 첨가하지 않은 경우, pET21 플라스미드가 형질 전환된 대장균으로부터 수득된 막 추출물을 첨가한 경우(대조군(pET21)), 및 pET21-AaLpxE가 형질전환된 대장균 C41(DE3)으로부터 수득된 막 추출물을 첨가한 경우(AaLpxE)에, 반응 시간에 따른 막 추출물 중 AaLpxE 폴리펩티드에 의한 PGP로부터 1-인산기의 제거를 보여준다.
한편, AaLpxE 폴리펩티드에 의한 언데카프레닐피로포스페이트의 탈인산화를 확인하기 위해, 50 mM Tris 클로리드 (pH 7.5), 0.1%(w/v) β-DDM, 0.5 ㎎/㎖ BSA, 및 45 nM 1000 cpm/㎕ 언데카프레닐-[1-3H] 피로포스페이트(American Radiolabeled Chemicals, Inc. (Saint Louis, MO))를 포함하는 반응 혼합물을 준비하였다. 반응 혼합물에 20 ㎍/㎖의 실시예 2.1에서 수득된 막 추출물을 첨가하고 30℃에서 5 분 내지 20 분 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 TLC 실리카 겔 60 플레이트에 스폿팅하고 TLC 플레이트를 부피비 6:3:1의 이소프로판올:암모니아:물의 용매 시스템에서 전개하고, 뜨거운 공기 흐름 하에서 건조시켰다. TLC 플레이트를 Phosphorimager로 분석하고, 그 이미지를 도 5에 나타내었다. 도 5는 막 추출물을 첨가하지 않지 않은 경우, pET21 플라스미드가 형질 전환된 대장균으로부터 수득된 막 추출물을 첨가한 경우(대조군(pET21)), 및 pET21-AaLpxE가 형질전환된 대장균 C41(DE3)으로부터 수득된 막 추출물을 첨가한 경우(AaLpxE)에, 반응 시간에 따른 막 추출물 중 AaLpxE 폴리펩티드에 의한 언데카프레닐피로포스페이트로부터 1-인산기의 제거를 보여주는 그래프이다(○; 음성대조군(pET21), ■; AaLpxE 폴리펩티드).
따라서, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, pET21 플라스미드만 도입된 경우에는 PGP 및 언데카프레닐피로포스페이트로부터 1-인산기가 제거되지 않았으나, pET21-AaLpxE로부터 과발현된 AaLpxE 폴리펩티드는 PGP 및 언데카프레닐피로포스페이트로부터 1-인산기를 제거하였다. 따라서, AaLpxE 폴리펩티드는 대사성 지질도 기질로 하는 포스파타아제임을 확인하였다.
2.4. 비-지질( non - lipid )로부터 인산기의 제거 여부의 확인
AaLpxE 폴리펩티드가 지질이 아닌 다양한 기질로부터 인산기를 제거하는지 여부를 확인하기 위해, 파라-니트로페닐포스페이트(para-nitrophenyl phosphate; pNPP)와 글루코사민-1-포스페이트를 준비하였다.
AaLpxE 폴리펩티드 또는 글루코사민-1-포스페이트에 의한 pNPP의 탈인산화를 확인하기 위해, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.1%(w/v) TRITON X-100(Thermo Scientific), 10 mM 마그네슘 아세테이트, 및 10 mM pNPP를 포함하는 반응 혼합물을 준비하였다. 반응 혼합물에 100 ㎍/㎖의 실시예 2.1에서 수득된 막 추출물을 첨가하고 30℃에서 5 분 내지 20 분 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로, 0.01 유닛의 송아지 장 알카라인 포스파타제(calf intestinal alkaline phosphatase; CIP)(NEB)를 사용하였다. 반응은 405 nm에서 마이크로타이터 분광광도계를 사용하여 모니터링하였다. 18.75 mM-1cm-1의 흡광 계수를 기초로 측정된 흡광도로부터 생성물의 농도를 산출하고 그 결과를 도 6a에 나타내었다(◇; CIP, ○; 음성대조군(pET21), ■; AaLpxE 폴리펩티드).
한편, 글루코사민-1-포스페이트가 기질인지 확인하기 위해, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.1%(w/v) TRITON X-100(Thermo Scientific), 10 mM 마그네슘 아세테이트, 및 10 mM 글루코사민-1-포스페이트(Sigma)를 포함하는 반응 혼합물을 준비하였다. 반응 혼합물에 100 ㎍/㎖의 실시예 2.1에서 수득된 막 추출물을 첨가하고 30℃에서 5 분 내지 20 분 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로, 0.1 유닛의 CIP(NEB)를 사용하였다. 반응은 100 ㎕의 Biomol Green(Enzo Life Sciences)를 첨가하여 종료시키고, 상온에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 유리된 포스페이트은 표준 곡선과 비교하여 620 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하고, 그 결과를 도 6b에 나타내었다(◇; CIP, ○; 음성대조군(pET21), ■; AaLpxE 폴리펩티드).
도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, AaLpxE 폴리펩티드는 지질이 아닌 pNPP와 글루코사민-1-포스페이트로부터 인산을 제거하지 않는 것을 확인하였다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Composition and kit for dephosphorylating lipid, and method for the production of dephosphorylated lipid using the same <130> PN106463 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aquifex aeolicus LpxE polypeptide <400> 1 Met Val Ile Glu Asp Phe Ala Leu Asn Leu Glu Leu Phe Arg Leu Ile 1 5 10 15 Asn Asn Ala Arg His Pro Leu Leu Asp Val Phe Phe Thr His Phe Ala 20 25 30 Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Val Leu Phe Pro Leu Leu Ile Phe Leu Phe 35 40 45 Ile Phe Arg Lys Glu Lys Val Lys Pro Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu 50 55 60 Glu Thr Val Leu Val Ile Ser Leu Lys Thr Phe Phe Asn Gln Pro Arg 65 70 75 80 Pro Ala Ile Leu Leu Glu Asp Val Asn Leu Leu Phe Pro Leu His Trp 85 90 95 Arg Ser Phe Pro Ser Gly Asp Thr Ala Met Ala Phe Thr Ile Ala Thr 100 105 110 Val Leu Ser His Gly Glu Lys Leu His Ile Lys Ala Ile Leu Phe Leu 115 120 125 Tyr Ala Phe Leu Ile Gly Tyr Glu Arg Ile Tyr Ala Gly Val His Phe 130 135 140 Pro Leu Asp Val Phe Val Gly Ala Leu Ile Gly Ile Ile Cys Gly Ile 145 150 155 160 Ile Ser Leu Lys Tyr Ser Lys Gly Gly Val Tyr Glu Arg Asn 165 170 <210> 2 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding Aquifex aeolicus LpxE polypeptide <400> 2 atggtaatag aagactttgc tctaaacctt gaactttttc gtttgataaa caatgcgagg 60 catccacttc tggacgtttt ctttactcac tttgcttacc tcggttcggg ctatgtactg 120 tttcctttat taatctttct ttttattttc agaaaggaaa aagtaaagcc tttgatttta 180 gcgataattt tggaaacagt tttagtgatc tctctaaaaa catttttcaa ccagccgaga 240 cctgcaattt tactcgagga tgtaaactta ctttttcctt tacactggcg ttcctttccc 300 tcaggagaca ccgctatggc ttttacgata gcaactgtac tgtcacatgg tgaaaaactc 360 catataaagg caatactctt cttatacgct ttcctaatag ggtatgagag gatttacgcg 420 ggtgttcact ttcctctgga cgtttttgta ggagctctga ttggaattat ttgcggtatt 480 atttctttaa aatattccaa gggaggtgtg tatgagagaa attag 525 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 gcatgccata tgatggtaat agaagacttt gctctaaac 39 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 attagcctcg agatttctct catacacacc tccctt 36 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 taatacgact cactataggg 20 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 attagcctcg agctaatttc tctcatacac acctccc 37

Claims (12)

  1. 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus)의 LpxE 폴리펩티드를 포함하는 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 조성물로서,
    상기 LpxE 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이고,
    상기 지질은 Kdo2-지질 IVA, 지질 X, 디사카라이드-1-포스페이트(disaccharide-1-phosphate; DSMP), 또는 이들의 조합인 당지질(saccharolipid), 또는 폴리프레닐 지질(polyprenyl lipid)인 것인, 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 LpxE 폴리펩티드는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리프레닐 지질은 언데카프레닐피로포스페이트(undecaprenylpyrophosphate)인 것인 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 LpxE 폴리펩티드는 인산기를 함유하는 지질로부터 1-인산기를 제거하는 것인 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 조성물.
  10. 아퀴펙스 아에올리쿠스의 LpxE 폴리펩티드를 포함하는 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 키트로서,
    상기 LpxE 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이고,
    상기 지질은 Kdo2-지질 IVA, 지질 X, DSMP, 또는 이들의 조합인 당지질, 또는 폴리프레닐 지질인 것인, 인산기를 함유하는 지질의 탈인산화용 키트.
  11. 아퀴펙스 아에올리쿠스의 LpxE 폴리펩티드와 인산기를 함유하는 지질을 인큐베이션하여 지질을 탈인산화시키는 단계; 및
    탈인산화된 지질을 수득하는 단계를 포함하고,
    상기 LpxE 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이고,
    상기 지질은 Kdo2-지질 IVA, 지질 X, DSMP, 또는 이들의 조합인 당지질, 또는 폴리프레닐 지질인 것인, 탈인산화된 지질을 생산하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 방법은 인 비트로(in vitro)에서 수행되는 것인 방법.
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