JP2023525294A - クリックｏｍｖ - Google Patents

Abstract

本発明は、ＯＭＶ、脊椎動物の抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）、および抗原の複合体であって、ＡＭＰが非共有結合によってＯＭＶと複合体形成しており、かつ抗原がＡＭＰにコンジュゲートしている、複合体に関する。好ましくは、抗原は、ＡＭＰに共有結合している。本発明はさらに、本発明の複合体を使用する免疫応答の誘導、および本発明の複合体を産生するための方法に関する。

Description

本発明は、ワクチン学の分野におけるものである。本発明は、抗原に対する免疫応答を誘導するまたは増大させるための修飾された外膜小胞（ＯＭＶ）を使用するプラットフォーム技術であって、抗原が非共有結合によってＯＭＶに付着しているプラットフォーム技術に関する。本発明はさらに、本発明のＯＭＶを生産するための方法に関する。

外膜小胞（ＯＭＶ）は、多くの重要な細菌表面成分を、自然免疫（innate immune）応答を引き起こすことによって内部アジュバントとして機能する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と組み合わせて含有する、グラム陰性細菌によって放出される非複製性の構造である。このようなＰＡＭＰは、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４のうちの少なくとも１つを好ましくは活性化させる。ＯＭＶは、脂質、ＬＰＳ、および外膜タンパク質から主に構成される、球状のナノ構造体（５０～２５０ｎｍ）であり、これは、抗原を免疫系に効率的に提示して、強力なＩｇおよびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を生じさせる。髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のＯＭＶは、髄膜炎菌疾患に対する実験用ワクチンとしての使用の歴史が長い。ＯＭＶの使用は安全であることが証明されており、例えば、ＯＭＶを含有するＭｅｎＢワクチンは現在、市場に出ている。

遺伝的に毒性除去されたＬＰＳを有する操作された小胞過形成（hypervesiculating）株に基づく次世代ＯＭＶの概念が開発されており、これは、ＬＰＳを除去するための界面活性剤抽出の使用を不要にする。これらのネイティブな（ｎ）ＯＭＶは、多くの緩く付着した表面抗原を産生および保持することが容易であり、これら抗原をさらに免疫原性とする。異種の非髄膜炎菌抗原は、ｎＯＭＶの提示形態を利用することによって、さらに免疫原性となり得る。この目的のために、ＯＭＶの外膜にその後輸送される抗原の内因性発現に基づく異種表面提示のための方法が、当技術分野において開発されている。この方法は、髄膜炎菌ＯＭＶ上で異種ＯｓｐＡを発現させるために使用された。マウスをこのＯＭＶセットで免疫化すると、ＯｓｐＡが表面に発現しているＯＭＶによってＯｓｐＡ特異的抗体応答が引き起こされた（Salverda, Vaccine 34:1025-1033, 2016）。

ＯＭＶ担体は、実証済みの、かつ安全なワクチン成分である。ＯＭＶ産生プロセスは、規模拡大が可能であり、高い収量をもたらし、化学的に規定された培地を使用し、そしてＧＭＰに適合している。ＬＰＳを除去し、小胞の放出を増大させるために、界面活性剤抽出ステップを産生プロセスに組み込むことができる。界面活性剤抽出の欠点は、外膜からの潜在的な保護抗原の除去、例えば、より緩やかに付着した、表面に曝露されたリポタンパク質の除去、及び、ＯＭＶワクチンの長期安定性の低減である。界面活性剤抽出の代わりに、例えば、ＥＤＴＡなどのキレート剤、または外膜を緩めてＯＭＶの放出を増大させる遺伝子改変の使用などの、ＯＭＶを得るための他の技術が、当技術分野において公知である。

併せて、免疫応答を操作し、安全性を最適化するために、内因性アジュバントであるリポ多糖（ＬＰＳ）を遺伝的に毒性除去することができる。このような改変は、例えば、強力なアジュバント活性および低減したエンドトキシン活性を示すペンタアシル化されたリピドＡ種の産生であり得る（Zariri, Sci Rep 6:36575, 2016）。

ＯＭＶは、優れた固有の免疫刺激特性を有し、病原体模倣アジュバントとして作用し得る。異種抗原は、ＯＭＶ提示形態を取ることによって、さらに免疫原性となり得る。特に、ＯＭＶは、それらのサイズおよびそれらの様々なＰＡＭＰ含有量を理由として、抗原提示細胞によるそれらの取り込みおよびプロセシングを刺激することにおいて非常に効率的である。しかし、同時送達された抗原が同時に取り込まれることが重要であり、さもなければ、効率的な抗原の取り込みが起こる前に抗原提示細胞が活性化され移動性になってしまう。この理由から、最適な免疫応答を生じさせるためには、ＯＭＶへの抗原のカップリングが望ましい。これは、異種表面提示のための方法を要する。しかし、内因性発現の利用は、選択された抗原の効率的な発現およびＯＭＶへの取り込みを得る必要性によって制限され、前記発現および取込みは、多くの場合は得ることが困難であり得る。細菌外膜（ＯＭ）の生合成機構との適合性が必要であることは、多くの異種抗原の効率的な発現の制限となっている。

したがって、当技術分野において、抗原提示のための多用途のＯＭＶプラットフォームが依然として強く必要とされている。ＯＭＶ産生細胞内で抗原を発現させる必要性を要することなく広範な公知のおよび／または新規な抗原を提示させるために使用することができるＯＭＶプラットフォームが、特に必要とされている。

概要
一態様では、本発明は、外膜小胞（ＯＭＶ）、脊椎動物の抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）、および抗原の複合体であって、ＡＭＰが非共有結合によってＯＭＶと複合体形成しており、かつ抗原がＡＭＰにコンジュゲートしている、複合体に関する。

好ましくは、抗原は、抗原およびＡＭＰを単一のポリペプチド鎖に含む融合タンパク質中においてＡＭＰに共有結合している。

好ましくは、ＡＭＰは、カテリシジン、好ましくは非ヒトカテリシジン、さらに好ましくはｍＣＲＡＭＰである。

好ましくは、抗原は、感染性疾患および／または腫瘍に関連する抗原である。

好ましくは、ＯＭＶは、界面活性剤で抽出されたＯＭＶではなく、好ましくは、ＯＭＶは、自然に生じるＯＭＶまたはネイティブなＯＭＶ、好ましくはネイティブなＯＭＶである。

好ましくは、ＯＭＶは、少なくとも部分的に毒性除去されたＬＰＳを含む。

好ましくは、ＯＭＶはグラム陰性細菌から得ることができ、かつ、グラム陰性細菌は、
ａ）毒性が低減したＬＰＳを細菌に産生させる遺伝子改変であって、好ましくは、ｌｐｘＬ１、ｌｐｘＬ２、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＤ、およびｌｐｘＫ遺伝子、もしくはこれらのホモログのうちの少なくとも１つの発現を低減させるもしくはなくす、ならびに／または、ｌｐｘＰ、ｌｐｘＥ、ｌｐｘＦ、およびｐａｇＬ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を増大させる遺伝子改変、ならびに
ｂ）小胞の形成を増大させる遺伝子改変であって、好ましくは、ｏｍｐＡ遺伝子またはこれらのホモログ、さらに好ましくはｒｍｐＭ遺伝子またはこれらのホモログの発現を低減させるまたはなくす遺伝子改変
のうちの少なくとも１つを好ましくは含む。

好ましくは、ＯＭＶは、ナイセリア属（Neisseria）、ボルデテラ属（Bordetella）、大腸菌属（Escherichia）、およびサルモネラ属（Salmonella）からなる群から選択される属に属するグラム陰性細菌から得ることができ、好ましくは、細菌は、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、大腸菌（Escherichia coli）、およびサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）からなる群から選択される種に属している。

本発明はさらに、本明細書において定義される複合体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。

本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書において定義される複合体または本明細書において定義される医薬組成物に関する。

本発明はさらに、抗原に対する対象における免疫応答の誘導または刺激を含む処置において使用するための、本明細書において定義される複合体または本明細書において定義される医薬組成物に関する。

本発明は、本明細書において定義されるＡＭＰにコンジュゲートした抗原に関するものであり、好ましくは、ＡＭＰにコンジュゲートした抗原は、本明細書において定義される融合タンパク質である。

本発明は、本明細書において定義される融合タンパク質をコードする核酸に関する。

本発明はまた、本明細書において定義される融合タンパク質を発現する宿主細胞に関するものであり、好ましくは、宿主細胞は、本明細書において定義される核酸を含む。

本発明は、本明細書において定義される複合体を産生するための方法であって、
ｉ）本明細書において定義されるグラム陰性細菌の集団をＯＭＶの産生に有利な条件下で培養するステップ、
ｉｉ）ｉ）で産生されたＯＭＶを回収するステップ、
ｉｉｉ）ｉｉ）で回収されたＯＭＶを、本明細書において定義される抗原にコンジュゲートしたＡＭＰと、ＡＭＰとＯＭＶとの間の非共有結合複合体の形成に有利な条件下で接触させるステップ、および
ｖｉ）必要に応じて、複合体を回収するステップ
を含む方法に関する。

定義
方法、組成物、使用、および本発明の他の態様に関連する様々な用語が、明細書および特許請求の範囲の全体を通して使用される。このような用語は、別段の指示がない限り、本発明が関連する技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。他の具体的に定義された用語は、本明細書において提供される定義と合致する様式で解釈されるものとする。本明細書において記載されるものに類似のまたは同等の任意の方法および材料を、本発明を試験するための実施において使用することができるが、好ましい材料および方法が、本明細書において記載されている。

本発明の方法において使用される従来の技術を実行する方法は、当業者に明らかであろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、シーケンシング、および関連する分野における従来の技術の慣例は、当業者に周知であり、例えば以下の参考文献において論じられている：Sambrook et al. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989、Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates、およびthe series Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.。

「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」：これらの単数形の用語には、内容が別段のことを明らかに示していない限り、複数形の言及が含まれる。したがって、例えば、「細胞（a cell）」への言及には、２つ以上の細胞の組合せ、及びそれに類するものが含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「約」は、小さな変動を記載および説明するために使用される。例えば、この用語は、±１０％以下、例えば、±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０.５％以下、±０.１％以下、または±０.０５％以下を指し得る。さらに、量、比率、および他の数値は、時として、範囲の形式で本明細書において提示される。このような範囲の形式は利便性および簡潔さのために使用されることが理解され、また、範囲の限界として明確に特定された数値を含むだけではなく、その範囲内に包含される全ての個々の数値または部分範囲も各数値および部分範囲が明確に特定されているかのように含むように柔軟に理解されるべきである。例えば、約１～約２００の範囲の比率は、明確に言及された限界である約１および約２００を含むだけではなく、約２、約３、および約４などの個々の比率、ならびに約１０～約５０、約２０～約１００、およびその他などの部分範囲も含むと理解されるべきである。

「および／または」：用語「および／または」は、言及されたケースの１つまたは複数が単独で、または、言及されたケースのうちの少なくとも１つ、言及されたケースの最大で全てと組み合わせて生じ得る状況を指す。

「含む」：この用語は、包括的かつオープンエンドであり、排他的ではないと解釈される。具体的には、この用語およびその変形は、具体的な特徴、ステップ、または成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、または成分の存在を排除すると解釈されるものではない。

用語「相同性」、「配列同一性」、およびそれに類するものは、本明細書において区別せずに使用される。配列同一性は、本明細書において、配列の比較によって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」もまた、場合に応じて、一続きのこのような配列の間のマッチによって決定される、アミノ酸配列または核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。２つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存された置換アミノ酸を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」および「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。

「配列同一性」および「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じてグローバルまたはローカルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つのペプチド配列または２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。長さが類似している配列は、配列を長さ全体にわたって最適にアラインするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、ニードルマン・ブンシュ）を使用して好ましくはアラインされ、一方、長さが実質的に異なる配列は、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、スミス・ウォーターマン）を使用して好ましくはアラインされる。配列はこうして、これらが（デフォルトパラメータを使用して例えばＧＡＰプログラムまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって最適にアラインされた場合に）少なくともある特定の最小のパーセンテージの配列同一性（以下に定義する通りの）を有する場合、「実質的に同一」または「本質的に類似」と言うことができる。ＧＡＰは、２つの配列をそれらの全長（完全長）にわたってアラインし、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小にするために、ニードルマンおよびブンシュのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用する。グローバルアラインメントは、２つの配列が類似の長さを有している場合に配列同一性を決定するために適切に使用される。一般に、ＧＡＰのデフォルトパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）であり、ギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドでは、使用されるデフォルトのスコアリングマトリクスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質では、デフォルトのスコアリングマトリクスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919）。配列のアラインメントおよび配列同一性パーセンテージについてのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１～３７５２ ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ、バージョン１０.３などのコンピュータプログラムを使用して、または、上記のＧＡＰと同一のパラメータを使用して、もしくはデフォルト設定（「ニードル」および「ウォーター」の両方で、ならびにタンパク質アラインメントおよびＤＮＡアラインメントの両方で、デフォルトのギャップ開始ペナルティは１０．０であり、デフォルトのギャップ伸長ペナルティは０．５である；デフォルトのスコアリングマトリクスは、タンパク質ではＢｌｏｓｕｍ６２であり、ＤＮＡではＤＮＡＦｕｌｌである）を使用して、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮ、バージョン２．１０．０のプログラム「ニードル」（グローバルなニードルマン・ブンシュアルゴリズムを使用する）もしくは「ウォーター」（ローカルなスミス・ウォーターマンアルゴリズムを使用する）などのオープンソースソフトウェアを使用して、決定することができる。配列が、実質的に異なる全長を有する場合、スミス・ウォーターマンアルゴリズムを使用するものなどのローカルアラインメントが好ましい。

あるいは、類似性または同一性のパーセンテージは、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して公共データベースをサーチすることによって決定することができる。したがって、本発明の核酸配列およびタンパク質配列は、公共データベースのサーチを行って他のファミリーメンバーまたは関連する配列を例えば同定するための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。このようなサーチは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴｎプログラムおよびＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴｘプログラムで、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で行うことができる。比較の目的でギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402において記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘおよびＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/のアメリカ国立生物工学情報センターのホームページを参照されたい。

必要に応じて、アミノ酸の類似性の程度の決定において、当業者はまた、当業者には自明であるように、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。保存的なアミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、そして、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換の群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、アスパラギン酸－グルタミン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。本明細書において開示されているアミノ酸配列の置換バリアントは、開示されている配列内の少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその代わりに挿入されているものである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれについての好ましい保存的な置換は、以下の通りである：Ａｌａからｓｅｒ、ａｒｇからｌｙｓ、ａｓｎからｇｌｎまたはｈｉｓ、ａｓｐからｇｌｕ、ｃｙｓからｓｅｒまたはａｌａ、ｇｌｎからａｓｎ、ｇｌｕからａｓｐ、ｇｌｙからｐｒｏ、ｈｉｓからａｓｎまたはｇｌｎ、ｉｌｅからｌｅｕまたはｖａｌ、ｌｅｕからｉｌｅまたはｖａｌ、ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎ、またはｇｌｕ、ｍｅｔからｌｅｕまたはｉｌｅ、ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ、またはｔｙｒ、ｓｅｒからｔｈｒ、ｔｈｒからｓｅｒ、ｔｒｐからｔｙｒ、ｔｙｒからｔｒｐまたはｐｈｅ、およびｖａｌからｉｌｅまたはｌｅｕ。

本明細書で使用される場合、用語「選択的にハイブリダイズすること」、「選択的にハイブリダイズする」、および類似の用語は、ヌクレオチド配列が互いに少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、またはさらに好ましくは少なくとも９９％相同な、典型的には互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することを目的としている。つまり、このようなハイブリダイズしている配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、またはさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。

このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、その後の、約５０℃、好ましくは約５５℃、好ましくは約６０℃、またさらに好ましくは約６５℃での、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける１回または複数回の洗浄である。

高度にストリンジェントな条件には、例えば、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳにおける約６８℃でのハイブリダイゼーション、および室温での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける洗浄が含まれる。あるいは、洗浄は４２℃で行ってもよい。

当業者には、どの条件をストリンジェントなおよび高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に適用するべきかが分かる。このような条件に関するさらなるガイダンスは、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.、およびAusubel et al. (eds.), Sambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.)において、当技術分野において容易に入手可能である。

当然のことながら、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）に、または相補的なＴ（もしくはＵ）残基鎖にのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）鎖を有する任意の核酸分子またはこれらの相補体（例えば、実際にはあらゆる二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするため、本発明の核酸の一部分に特異的にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。

「核酸構築物」または「核酸ベクター」は、本明細書において、組換えＤＮＡ技術の使用の結果得られる人為的な核酸分子を意味すると理解される。用語「核酸構築物」にはしたがって、天然に存在する核酸分子は含まれないが、核酸構築物は、天然に存在する核酸分子（の一部分）を含み得る。用語「発現ベクター」または「発現構築物」は、ヌクレオチド配列であって、このような配列と適合する宿主細胞または宿主生物において遺伝子の発現をもたらし得るヌクレオチド配列を指す。これらの発現ベクターには、典型的には、少なくとも適切な転写調節配列、および必要に応じて３’転写終結シグナルが含まれる。発現エンハンサーエレメントなどの、発現をもたらすために必要なまたは有用なさらなる因子もまた存在し得る。発現ベクターは適切な宿主細胞に導入され、宿主細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物においてコード配列の発現をもたらし得る。発現ベクターは、本発明の宿主細胞または宿主生物における複製に適している。

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」または「転写調節配列」は、１つまたは複数のコード配列の転写を制御するために機能し、また、転写方向に関してコード配列の転写開始部位の上流に位置し、ＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼの結合部位と、転写開始部位と、限定はしないが転写因子結合部位、リプレッサー、およびアクチベータータンパク質結合部位を含むあらゆる他のＤＮＡ配列と、また、プロモーターからの転写の量を調節するように直接的にまたは間接的に作用することが当業者に知られているあらゆる他のヌクレオチド配列との存在によって構造的に同定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的および発生的条件下で、ほとんどの細胞、好ましくは細菌細胞において活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば化学的誘導因子の適用によって生理学的にまたは発生的に調節されるプロモーターである。

用語「選択マーカー」は、当業者によく知られた用語であり、発現すると選択マーカーを有する１つまたは複数の細胞を選択するために使用され得る任意の遺伝子実体を説明するために、本明細書において使用される。用語「レポーター」はマーカーと区別せずに使用され得るが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの可視的マーカーを指すために主に使用される。選択マーカーは、優性または劣性または双方向性であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結した」は、機能的関係でのポリヌクレオチドエレメントの結合を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結している」。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結している。作動可能に連結したとは、連結しているＤＮＡ配列が典型的には連続しており、２つのタンパク質コード領域を繋ぐことが必要な場合には、連続しておりかつリーディングフレーム内にあることを意味する。

用語「ペプチド」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸残基鎖として定義され、規定された配列を通常は有するが、具体的な作用態様、サイズ、３次元構造、または由来源への言及はない。本明細書で使用される場合、ペプチドという用語は、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」と置き換え可能である。本発明の文脈において、用語「ペプチド」は、修飾されたまたは未修飾のペプチド結合によって連結している少なくとも２つのアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質であると定義される。用語「ペプチド」は、オリゴペプチドもしくはオリゴマーなどの短鎖分子を、またはタンパク質などの長鎖分子を指す。

タンパク質／ペプチドは、線状、分枝鎖状、または環状であり得る。ペプチドには、Ｄアミノ酸、Ｌアミノ酸、またはこれらの組合せが含まれ得る。本発明に従ったペプチドは、修飾されたアミノ酸を含み得る。したがって、本発明のペプチドは、転写後修飾などの天然のプロセスによって、または化学的プロセスによって修飾されていてもよい。これらの修飾の一部の例は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンとの共有結合、ヘムとの共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体との共有結合、修飾されたまたは未修飾の糖質部分への共有結合、脂質または脂質誘導体との結合、ホスファチジルイノシトールとの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、システイン分子の形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、酸化、リン酸化、ラセミ化などである。したがって、ペプチドの免疫原性を排除する効果を有さないペプチドのあらゆる修飾が、本発明の範囲に含まれる。

用語「遺伝子」は、適切な調節領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結した、細胞内でＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含む、ＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は通常、いくつかの作動可能に連結した断片、例えば、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域、およびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）を含む。「遺伝子の発現」は、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡ領域が、生物学的に活性なＲＮＡ、すなわち、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドに翻訳され得るＲＮＡに転写される、プロセスを指す。用語「相同な」は、所与の（組換え）核酸またはポリペプチド分子と所与の宿主生物または宿主細胞との間の関係を指すために使用される場合、本来は、核酸またはポリペプチド分子が、同一種の、好ましくは同一の変種または株の宿主細胞または宿主生物によって産生されることを意味すると理解される。宿主細胞に相同であれば、ポリペプチドをコードする核酸配列は、典型的には（必ずしもそうではないが）、その天然の環境以外の（異種の）プロモーター配列に作動可能に連結し、該当する場合には、その天然の環境以外の（異種の）分泌シグナル配列および／またはターミネーター配列に作動可能に連結する。調節配列、シグナル配列、ターミネーター配列などもまた、宿主細胞に相同であり得ることが理解される。

用語「異種」および「外因性」は、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはタンパク質に関して使用される場合、それを有する生物、細胞、ゲノム、ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列の一部として天然には生じない核酸またはタンパク質を、あるいは、それが天然で見られるものとは異なる細胞でまたはゲノムもしくはＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列内の１つもしくは複数の位置で見られる核酸またはタンパク質を指す。異種および外因性の核酸またはタンパク質は、それが導入される細胞に対して内因性ではないが、例えば、別の細胞から得られているか、または合成的にもしくは組換えによって産生されている。一般に、しかし必ずしもそうではないが、このような核酸は、ＤＮＡが転写または発現される細胞によって通常は産生されないタンパク質、すなわち外因性タンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは、外因性ＲＮＡが存在する細胞では通常は発現されないタンパク質をコードし得る。異種／外因性の核酸およびタンパク質はまた、外来の核酸またはタンパク質とも呼ぶことができる。それが発現される細胞に対して外来であると当業者が認識するあらゆる核酸またはタンパク質が、本明細書において、異種または外因性の核酸またはタンパク質という用語に包含される。異種および外因性という用語はまた、核酸配列またはアミノ酸配列の非天然の組合せ、すなわち、組み合わされた配列のうちの少なくとも２つが互いに外来である組合せにも適用される。

用語「免疫応答」は、本明細書で使用される場合、その表面に抗原および／または抗原性エピトープを有しているおよび／または発現もしくは提示している特定の抗原性実体に対する、ならびに／あるいは当該実体の分解および／または阻害を促進する、抗体および／または細胞（Ｔリンパ球など）の産生を指す。表現「効果的な免疫防御応答」、「免疫防御」、および類似の用語は、本発明の目的では、ワクチン接種した対象における、病原体による感染からまたはがんから防御するための、病原体、病原体に感染した細胞、またはがん細胞の１つまたは複数の抗原性エピトープに対して向けられている免疫応答を意味する。本発明の目的では、病原体による感染に対する防御またはがんに対する防御には、感染またはがんの完全な予防だけではなく、ワクチン接種した対象における、例えばワクチン接種していない感染した対象と比較した、病原体による感染またはがんの程度または速度の何らかの検出可能な低減、あるいは、病原体による感染またはがんの結果生じる疾患または何らかの症候もしくは状態の重症度の何らかの検出可能な低減も含まれる。がんのケースにおける効果的な免疫防御応答には、がん細胞を排除すること、これによってがんのサイズを低減させること、またはさらにはがんをなくすことも含まれる。これを達成するためのワクチン接種はまた、治療的ワクチン接種とも呼ばれる。あるいは、効果的な免疫防御応答は、これまでに病原体に感染したことがない対象、および／またはワクチン接種の時点では病原体に感染していないもしくはがんにまだ罹患していない対象において誘導され得、このようなワクチン接種は、予防的ワクチン接種と呼ぶことができる。

本発明に従うと、用語「抗原」の本明細書における一般的な使用は、抗体に特異的に結合するあらゆる分子を指す。この用語はまた、ＭＨＣ分子が結合し得、Ｔ細胞受容体に提示され得る、あらゆる分子または分子断片を指す。抗原は、例えば、糖質部分および／もしくは脂質部分などの非タンパク質基を場合によって含むタンパク質性分子、すなわちポリアミノ酸配列であり得るか、または、抗原は、例えば、糖質などの非タンパク質性の分子であり得る。抗原は、例えば、特定の対象において抗原特異的な免疫応答（液性および／または細胞性免疫応答）を引き起こすことができる、天然に存在しているもしくは合成由来のタンパク質（ペプチド、部分タンパク質、完全長タンパク質）の任意の部分、細胞組成物（細胞全体、細胞溶解物、もしくは破壊された細胞）、生物（生物全体、溶解物、もしくは破壊された細胞）、または糖質もしくは他の分子、またはこれらの一部分であり得、前記免疫応答は、好ましくは、アッセイまたは方法を介して測定可能である。

用語「抗原」は、本明細書において、適応免疫応答の受容体の標的として機能する構造物質として理解される。抗原はしたがって、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）またはＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または分泌された形態のＢＣＲ、すなわち抗体の標的として機能する。抗原はしたがって、タンパク質、ペプチド、糖質、または、通常は例えば細胞もしくはビリオンなどのより大きな構造の一部である他のハプテンであり得る。抗原は、体内に（「自己」）または外部環境に（「非自己」）由来し得る。免疫系は通常、胸腺内でのＴ細胞の負の選択に起因して、正常な状態の下では「自己」抗原に対して非反応性であり、外界からの「非自己」侵入者、または例えば疾患状態の下で体内に存在する修飾された／有害な物質のみを同定および攻撃すると考えられる。細胞性免疫応答の標的である抗原構造は、組織適合分子を介して、プロセシングされた抗原性ペプチドの形態で抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって適応免疫系のＴ細胞に提示される。提示される抗原および組織適合分子のタイプに応じて、いくつかのタイプのＴ細胞が活性化され得る。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の認識のためには、抗原は細胞内で小さなペプチド断片にプロセシングされ、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってＴ細胞受容体に提示される。

用語「免疫原」は、抗原の少なくとも１つのエピトープを含むかまたはコードし、その結果、適切なアジュバントと好ましくは共に対象に投与されると、エピトープおよびエピトープを含む抗原に対して特異的な液性および／または細胞性免疫応答を対象において引き起こす実体を説明するために、本明細書において使用される。免疫原は、抗原に対して同一であり得るか、または抗原の一部分、例えば抗原のエピトープを含む部分を少なくとも含む。したがって、特定の抗原に対して対象にワクチン接種するとは、一実施形態では、抗原の少なくとも１つのエピトープを含む免疫原の投与の結果、免疫応答が抗原またはその免疫原性部分に対して引き起こされることを意味する。ワクチン接種は、抗原（または抗原の由来源）へのその後の曝露が抗原（または由来源）に対する免疫応答を引き起こし、これが対象における疾患または状態を低減させるまたは予防する、防御効果または治療効果を好ましくはもたらす。ワクチン接種の概念は、当技術分野において周知である。本発明の予防用または治療用組成物の投与によって引き起こされる免疫応答は、免疫状態のいずれかの側面（例えば、細胞応答、液性応答、サイトカイン産生）における、ワクチン投与の不存在下と比較した、あらゆる検出可能な変化であり得る。

「エピトープ」は、本明細書において、対象において免疫応答を引き起こすために十分な、所与の抗原内の単一の免疫原性部位として定義される。当業者には、Ｔ細胞エピトープのサイズおよび組成がＢ細胞エピトープと異なること、ならびにクラスＩ ＭＨＣ経路を介して提示されるＴ細胞エピトープがクラスＩＩ ＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープと異なることが認識されよう。エピトープは、免疫応答のタイプに応じて、線状配列または立体構造のエピトープ（保存された結合領域）であり得る。抗原は、単一のエピトープほどに小さくても、またはそれより大きくてもよく、また、複数のエピトープを含んでいてもよい。このように、抗原のサイズは、約５～１２アミノ酸（例えばペプチド）ほどに小さくてよく、また、多量体タンパク質、タンパク質複合体、ビリオン、粒子、細胞全体、微生物全体、またはこれらの一部分（例えば、細胞全体の溶解物もしくは微生物の抽出物）を含む、完全長のタンパク質ほどに大きくてもよい。

アジュバントは、本明細書において、対象内の抗原に対する免疫応答を生じさせるためにヒト対象または動物対象に抗原と組み合わせて投与されると、好ましくはアジュバント自体に対する特異的免疫応答は必ずしも生じさせることなく、免疫系を刺激し、これによって抗原に対する免疫応答を引き起こす、増強する、または促進する実体であると理解される。好ましいアジュバントは、同一の条件下であるがアジュバントが不存在の場合に抗原に対して生じる免疫応答と比較して少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、または２０倍、所与の抗原に対する免疫応答を増強する。動物対象またはヒト対象の群においてアジュバントによって生じた所与の抗原に対する免疫応答の、対応する対照群に対する増強の統計上の平均を決定するための試験は、当技術分野において利用可能である。アジュバントは、好ましくは、少なくとも２つの異なる抗原に対する免疫応答を増強することができる。

ＯＭＶ（「ブレブ」とも呼ばれる）は、グラム陰性細菌の外膜からつまみ取られる、直径が２０～２５０ｎｍ（時として１０～５００ｎｍ）の範囲の、通常は球状の二層の膜構造である。ＯＭＶ膜は、様々な位置で膜タンパク質と混合した状態で、内側にリン脂質（ＰＬ）を、そして外側にリポ多糖（ＬＰＳ）およびＰＬを含有し、ＯＭＶ膜がつまみ取られた元である細菌の外膜の構造を大きく反映している。ＯＭＶの内腔は、ペリプラズムまたは細胞質に由来する様々な化合物、例えばタンパク質、ＲＮＡ／ＤＮＡ、およびペプチドグリカン（ＰＧ）を含有し得るが、細菌細胞とは異なり、ＯＭＶは自己複製する能力は有していない。本発明の文脈では、３つのタイプのＯＭＶが、それらの産生方法に応じて区別可能である。ｓＯＭＶは、既に形成されたＯＭＶから無傷細胞を分離することによって培養上清から精製および濃縮される、自然発生的なまたは天然のＯＭＶである。界面活性剤ＯＭＶであるｄＯＭＶは、デオキシコレートなどの界面活性剤を用いて細胞から抽出され、界面活性剤はまた、反応原性ＬＰＳの含有量も低減させる。界面活性剤での抽出の後、ｄＯＭＶが細胞および細胞デブリから分離され、さらに精製および濃縮される。最後に、ネイティブなｎＯＭＶという用語は、これらを野生型の自然に生じるＯＭＶおよび界面活性剤で抽出されたｄＯＭＶから明らかに区別できるようにするために、濃縮された死細胞から非界面活性剤細胞破壊技術を用いて生成された、または、他の（非破壊性の）界面活性剤を使用しない方法（例えば、ＥＤＴＡなどのキレート剤を使用する）を用いて細胞から抽出されたＯＭＶについて、本明細書において使用される。

本明細書における、公共配列データベースでアクセス可能なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列へのあらゆる言及は、この明細書の出願日に利用可能な配列登録のバージョンを指す。

詳細な説明
本発明者らは、公知の抗原、および、例えば新たに出現した病原体からの、新たに同定された抗原を、確立されたおよび免疫原性のＯＭＶプラットフォーム上で端的に提示するための方法を開発した。ＯＭＶはあらかじめ備蓄することができ、例えばバイオインフォマティクスを介して同定された新たな標的抗原を、本発明の方法を使用して産生し、付着させ、こうして、迅速な応答プラットフォームを提供することができる。

この技術を使用することで、ＯＭＶプラットフォームを、例えばエピデミックのケースで迅速に配備することができる。本発明のプラットフォームの強みは、ＯＭＶおよび抗原という２つの構成要素からなる戦略である。抗原およびＯＭＶは別々に産生され、抗原およびＯＭＶをただ混合するだけで、抗原は非共有結合によってＯＭＶに付着する。この目的のために、抗原は、ＯＭＶへの付着を容易にするための「タグ」または「アンカー」として抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）を有する。本発明の典型的な実施形態を図１に示す。

第１の態様では、本発明はしたがって、外膜小胞（ＯＭＶ）、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）、および抗原の複合体に関する。好ましくは、ＡＭＰは非共有結合によってＯＭＶと複合体形成しており、抗原はＡＭＰにコンジュゲートしている。本発明の複合体において、ＡＭＰは、ＯＭＶの膜と相互作用している。好ましくは、ＡＭＰは、ＯＭＶの脂質層に挿入されている。ＡＭＰにコンジュゲートした抗原は、ＯＭＶの表面に少なくとも部分的に曝露されたままである。本明細書において、ＡＭＰはこうしてアンカー部分として機能する、すなわち、ＯＭＶの表面に抗原を固定することが理解される。

抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）
好ましくは、ＡＭＰは脊椎動物のＡＭＰである。ＡＭＰは、脊椎動物の自然免疫系の一部であり、細菌、エンベロープを有するウイルス、および真菌に対して広範な抗微生物活性スペクトルを有することが知られている（Kosciuczuk et al, Mol Biol Rep (2012) 39:10957-10970）。ＡＭＰは、病原体の負に荷電した膜に入り込むかまたはこれに「穴をあける」ことができる。この目的のために、本発明において使用するためのＡＭＰは、好ましくは、アルギニン、リシン、または酸性の環境ではヒスチジンによって例えば提供されるいくつかの正に荷電した残基を有しており、好ましくは、大部分（例えば＞５０％）が疎水性の残基である。

ＡＭＰは、自由溶液中では構造化されていなくてもよく、ＯＭＶの膜に区分されると、最終立体構造にフォールディングする。これは、例えばヘリックス状分子の一方の側に沿ってアラインした親水性アミノ酸残基と、前記分子の反対側に沿ってアラインした疎水性アミノ酸残基とを有し得る。抗微生物ペプチドが両親媒性であることによって、抗微生物ペプチドが膜脂質二重層に区分されることが可能となる。本発明において使用するためのＡＭＰは、好ましくは、両親媒特性を有する陽イオン性のペプチドであり、ＯＭＶの膜に入り込むことができる。好ましくは、ＡＭＰはＯＭＶ膜内に留まり、すなわち、ＯＭＶ膜を部分的にまたは完全に通過することはない。ＡＭＰは、好ましくは、形成されたＯＭＶを破壊することはないか、または著しく破壊することはない。

好ましくは、本発明において使用するためのＡＭＰは、哺乳動物のＡＭＰである。好ましくは、ＡＭＰは、カテリシジン、アルファ－ディフェンシン、ベータ－ディフェンシン、およびｒｅｇＩＩＩペプチドのうちの少なくとも１つの、活性形態である。好ましくは、ＡＭＰは、カテリシジンの活性形態である。本明細書において、用語「カテリシジン」、「アルファ－ディフェンシン」、「ベータ－ディフェンシン」、および「ｒｅｇＩＩＩペプチド」などのタンパク質名がヒトペプチドに限定されず、他の脊椎動物の、好ましくは他の哺乳動物のオルソログペプチドも含むことが理解される。非限定的な例として、用語「カテリシジン」は、ヒトカテリシジンＬＬ－３７、およびマウスにおけるオルソログの「カテリシジン関連」ペプチドｍＣＲＡＭＰを含意する。

ＡＭＰは不活性な形態で産生され得、これは切断で活性化される。例えば、哺乳動物のカテリシジンは、シグナルペプチド、カテリンドメイン、および抗微生物ドメインという３つのドメインから構成される。シグナルペプチドは、顆粒への細胞内標的化に必要であり、シグナルペプチダーゼによって切断除去される。保存されたカテリンドメインは、機能があまり分かっていないが、顆粒の保存の際に抗微生物ドメインに付着したままである。カテリンドメインと抗微生物ドメインとの間の切断によって、生物学的に活性な抗微生物ペプチドが放出される。本明細書において、ＡＭＰという用語は、活性形態、すなわち生物学的に活性な抗微生物ペプチドを指すことが理解される。

本発明において使用するためのＡＭＰは、天然に存在するペプチド、組換えペプチド、または化学合成ペプチドであり得る。組換えのまたは合成のＡＭＰは、天然に存在するＡＭＰに同一であり得る。あるいは、本発明において使用するための組換え（または合成）ＡＭＰは、その天然に存在する対応物のアミノ酸配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸の変更を含み得る。アミノ酸の変更は、好ましくは、１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換のうちの少なくとも１つである。

本発明のＡＭＰは、その天然に存在する対応物と比較して、好ましくは天然に存在するカテリシジンと比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失を含み得る。ＡＭＰは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または１０個のアミノ酸残基の欠失を含み得る。好ましくは、１つまたは複数のアミノ酸の欠失を含むＡＭＰは、非共有結合によってＯＭＶに結合する（またはＯＭＶと複合体形成する）能力を維持している。好ましくは、非共有結合によってＯＭＶに結合する前記能力は、その天然に存在する対応物のＯＭＶに結合する能力に等しいかまたは好ましくはそれよりも高い。

あるいは、またはさらに、ＡＭＰは、その天然に存在する対応物と比較して、好ましくは天然に存在するカテリシジンと比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加を含み得る。ＡＭＰは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または１０個のアミノ酸残基の付加を含み得る。好ましくは、１つまたは複数のアミノ酸の付加を含むＡＭＰは、非共有結合によってＯＭＶに結合する（またはＯＭＶと複合体形成する）能力を維持している。好ましくは、非共有結合によってＯＭＶに結合する前記能力は、その天然に存在する対応物のＯＭＶに結合する能力に等しいかまたは好ましくはそれよりも高い。

あるいは、またはさらに、ＡＭＰは、その天然に存在する対応物と比較して、好ましくは天然に存在するカテリシジンと比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含み得る。ＡＭＰは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、１５個、または２０個のアミノ酸残基の置換を含み得る。好ましくは、ＡＭＰは、１つまたは複数の保存的なアミノ酸置換、好ましくは、本明細書において定義される１つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含む。好ましくは、組換えＡＭＰは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、１５個、または２０個の保存的なアミノ酸置換を含む。好ましくは、１つまたは複数のアミノ酸の置換を含むＡＭＰは、非共有結合によってＯＭＶに結合する（またはＯＭＶと複合体形成する）能力を維持している。好ましくは、非共有結合によってＯＭＶに結合する前記能力は、その天然に存在する対応物のＯＭＶに結合する能力に等しいかまたは好ましくはそれよりも高い。

ＡＭＰの、ＯＭＶに結合する（またはＯＭＶと複合体形成する）能力は、当技術分野において公知の任意の従来の方法を使用して決定することができる。限定はしないが実施例１で詳述される定量的ドットブロットなどの典型的な方法が、以下の実施例の節で提供されている。ＡＭＰの、ＯＭＶに結合する能力は、例えば、ＰＲＮペプチドまたはあらゆる他の検出可能な部分をＡＭＰにカップリングし、その後、例えばドットブロット上でＡＭＰをＯＭＶと結び付けることによって、決定することができる。ＰＲＮペプチドまたはあらゆる他の検出可能な部分はその後、定量的様式で、例えば定量的な抗ＰＲＮ抗体検出方法を使用して、検出することができる。

本発明において使用するためのＡＭＰのサイズは、好ましくは約１０～１００アミノ酸残基、約１２～８０アミノ酸残基、約１２～５０アミノ酸、約１２～１８アミノ酸残基、約３９～８０アミノ酸残基、約２０～４０アミノ酸残基、または約２３～３５アミノ酸残基である。

ＡＭＰは、アミノ酸配列同一性があまり保存されていないことが当技術分野において知られている。その代わり、ＡＭＰは、アミノ酸の特性および／または細菌膜に入り込む際に形成される構造に基づいて主にグループ分けされる。加えて、ＡＭＰは、広範な構造を有することが当技術分野において知られている。したがって、当業者には、本発明が何らかの具体的なＡＭＰ配列または構造に限定されないことが理解される。好ましくは、本発明において使用するためのＡＭＰは、０～＋７の正味電荷および３０～７０％の間の疎水性パーセンテージを有する。

ＡＭＰは、両親媒性のαヘリックスにフォールディングする線状ペプチド、またはベータヘアピン構造を有する低分子であり得、また、１つ、２つ、またはそれを超えるジスルフィド結合によって安定化されていてよい。あるいは、またはさらに、ＡＭＰは、伸長したポリプロリンタイプの構造を形成する反復プロリンモチーフを含み得る。本発明において使用するための好ましいＡＭＰは、両親媒性のヘリックス構造を有する。好ましくは、本発明において使用するためのＡＭＰは、両親媒性の陽イオン性のαヘリックスペプチドを含む。

好ましくは、本発明において使用するためのＡＭＰは、天然に存在するタンパク質であり得るかまたはそれに由来し得、ここで、不活性な形態のタンパク質はカテリンドメインを含む。好ましくは、カテリンドメインは、ＡＭＰ活性化を生じさせるために切断除去される。

本発明において使用するためのＡＭＰは、カテリシジン、好ましくはヒトカテリシジン、またはそのオルソログであり得る。ヒトカテリシジンＬＬ－３７は、多くの異なるタイプの微生物に対する直接的な毒性効果、および局所的な免疫調節効果の両方を含む、広範な抗微生物活性を有するペプチドである（Xhindoli et al BBA 1858 (2016) 546-566）。これは、その多くの異なる活性を、小さな両親媒性のヘリックス構造で行う。これは、上皮細胞および免疫細胞によって前駆プレプロ形態として形成される。その抗菌効果は、グラム陰性細菌の外膜を含む膜との直接的な相互作用の結果生じる。この相互作用の第１のステップは、主要な外膜リピドＡであるＬＰＳのリピドＡ／内部中心領域への結合である。例えばネイティブなＯＭＶはそのＬＰＳを保持しているため、本発明者らは、ＬＬ－３７が、多様な抗原に付着し得、これによってこれら抗原をＯＭＶと会合させる、適切なタグを形成し得ることを発見した。

ＬＬ－３７はヒト抗原であるため、免疫刺激性ＯＭＶとの組合せは、抗自己免疫応答を生じさせる可能性がある。したがって、好ましくは、ＡＭＰは、非ヒトカテリシジンである。非ヒトカテリシジンはヒトカテリシジンに由来し得、例えば、１つまたは複数のアミノ酸の変更を含むヒトカテリシジンであり得る。非ヒトカテリシジンはこうして、変更型のヒトカテリシジンを含み得る。非ヒトカテリシジンは、好ましくは、マウス、ウシ、バッファロー、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ニワトリ、魚類、アカゲザル、ラット、モルモット、またはヘビに由来するカテリシジンである。好ましくは、カテリシジンは、マウスまたはラットのカテリシジンであり、好ましくはマウスカテリシジンである。必要に応じて、マウスカテリシジンは、１つまたは複数のアミノ酸の変更を含む。

本発明において使用するためのカテリシジンは、参照により本明細書に組み込まれるＫｏｓｃｉｕｃｚｕｋら（上記の）の表１において特定されているタンパク質、または上記のＫｏｓｃｉｕｃｚｕｋらの表１において特定されているカテリシジンであり得、１つまたは複数のアミノ酸の変更を有する。

本発明において使用するためのＡＭＰは、ｍＣＲＡＭＰ（ＣＲＡＭＰ－１／２）、ＬＬ－３７、ＦＡＬＬ－３９、ＲＬ－３７、ｒＣＲＡＭＰ、ＣＡＰ－１８、ＣＡＰ－１１、ＰＲ－３９、プロフェニン、ＰＭＡＰ－２３、ＰＭＡＰ－３６、ＰＭＡＰ－３７、ＢＭＡＰ－２７、ＢＭＡＰ－２８、ＢＭＡＰ－３４、Ｂａｃ５、Ｂａｃ７、カテリシジン－ＡＬ、フォウリシジン（fowlicidin）１、フォウリシジン２、フォウリシジン３、カテリシジンベータ－１、Ｓａｈａ－ＣＡＴＨ５、ＣＡＴＨ１、およびＣＡＴＨ２からなる群から選択されるタンパク質であり得る。好ましくは、ＡＭＰはｍＣＲＡＭＰであり、場合によって、１つまたは複数のアミノ酸の変更を含む。

天然に存在するＡＭＰの配列は非常に多様である。したがって、本発明は、特定の配列を有する任意のＡＭＰには限定されない。本発明において使用するためのＡＭＰは、上記のＫｏｓｃｉｕｃｚｕｋらの図１において開示されている配列を有するカテリシジン、好ましくは上記のＫｏｓｃｉｕｃｚｕｋらの図１において開示されている成熟ペプチド配列であり得る。一実施形態では、ＡＭＰの配列は、配列番号１（ｍＣＲＡＭＰ）に対して少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有し得る。ｍＣＲＡＭＰは、好ましくは、
ＧＬＬＲＫＧＧＥＫＩＧＥＫＬＫＫＩＧＱＫＩＫＮＦＦＱＫＬＶＰＱＰＥＱ（配列番号１）
の配列を有する。

一実施形態では、ＡＭＰの配列は、配列番号１３（ＬＬ－３７）に対して少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有し得る。ＬＬ－３７は、好ましくは、
ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ（配列番号１３）
の配列を有する。

ＡＭＰは、好ましくは、ＯＭＶの膜に入り込むことができ、非共有結合によって、ＡＭＰにコンジュゲートしている抗原をＯＭＶに付着させることができる。

ＡＭＰ－抗原のコンジュゲーション
好ましい実施形態では、ＡＭＰは抗原に、好ましくは本明細書において記載される抗原にコンジュゲートしている。ＡＭＰへの抗原のコンジュゲーションによって、ＡＭＰがＯＭＶの膜に入り込んだ際のＯＭＶへの抗原のカップリングまたは「固定」を可能にするコンジュゲートが生じる。

抗原は、当技術分野において公知の任意の従来の手段を使用してＡＭＰにコンジュゲートさせることができる。コンジュゲーションには、共有結合および非共有結合が含まれる。好ましくは、抗原はＡＭＰに共有結合している。

抗原は、ＡＭＰがＯＭＶ膜に挿入されるとＯＭＶの表面で曝露されたままであるＡＭＰの一部分にコンジュゲートさせることができる。好ましくは、抗原は、ＡＭＰのＯＭＶに結合する能力に干渉しない様式でＡＭＰにコンジュゲートしている。好ましくは、したがって、抗原は、ＡＭＰの親水性残基に、さらに好ましくは、ＡＭＰが（例えばＯＭＶの）膜に入り込んだ際に曝露される溶媒である親水性残基に、コンジュゲートしている。抗原は、ＡＭＰの１つまたは複数の陽イオン性アミノ酸残基にコンジュゲートまたは接近していてよい。あるいは、またはさらに、抗原は、ＡＭＰのＣ末端またはＮ末端にコンジュゲートしている。好ましくは、抗原は、ＡＭＰペプチドのＮ末端にコンジュゲートしている。一実施形態では、２つ以上の抗原分子が、ＡＭＰ上の前述の部位の組合せにコンジュゲートしている。これらの２つ以上の抗原分子は、同一のまたは異なる抗原分子であり得る。

抗原は、任意の従来の化学的コンジュゲーションプロセスを使用してＡＭＰにコンジュゲートさせることができ、これによって、好ましくは共有結合である結合は、ＯＭＶに入り込むおよび抗原をＯＭＶに固定するＡＭＰの能力を（顕著には）低減させない。この目的のために、ＡＭＰおよび抗原はまず別々に産生され、その後、ＡＭＰを抗原に好ましくは共有結合によってカップリングする。このような共有結合によるカップリングは、当業者に公知の任意の従来の手段を使用して行うことができる。この方法は、ＡＭＰおよび抗原が単一のポリペプチドとして発現され得ないケースで、例えば、抗原がオリゴ糖または多糖であるケースで、および／または抗原が限定はしないが環化などの化学的修飾を必要とするケースで、好ましい場合がある。

好ましい化学的コンジュゲーション方法は、アミド結合の形成（例えば、活性なエステルおよび遊離アミンを使用する）、選択的なＮ末端のライゲーション、ネイティブな化学的ライゲーション、および生体直交型のライゲーションである。生体直交型のライゲーション方法の例は、マイケル付加（例えば、マレイミドおよびチオールを使用し、チオールはトラウト試薬を介して場合によって導入され得る）、ディールス・アルダー環化付加、ヒュスゲン環化付加、テトラジンまたはアジドまたはトランスシクロオクテンまたは歪みシクロオクチンまたはオキソノルボルナジエンを使用する環化付加である。このような方法は広く知られており（例えば、Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2, 176-192、ならびにdoi.org/10.1016/j.cbpa.2013.07.031およびdoi.org/10.1016/j.chembiol.2014.09.002を参照）、所要の試薬は市販されていることが多く、さらには、使用説明書を含むキットの形態であることもある。

抗原はＡＭＰに直接コンジュゲートし得るか、またはリンカー、好ましくは本明細書において以下で定義されるリンカーによって離されていてもよい。単一の融合タンパク質として発現しない場合は、リンカーは、それに特化したアミノ酸配列、単一のアミノ酸、またはａｈｘなどの別の部分であり得る。３文字コードａｈｘは６－アミノヘキサン酸を表し、これはアミノカプロン酸としても知られており、アミノカプロン酸はＡｃｐと省略される。Ａｈｘは、２つのさらなる部分を繋げるリンカー部分であると考えられる。ａｈｘに加えて、限定はしないが、ベータアラニン（ベータ－アミノプロピオン酸、ｂＡｌａとしても知られている）、４－アミノ酪酸（ピペリジン酸、４Ａｂｕとしても知られている）、３－アミノイソ酪酸（ｂＡｉｂ）、または当技術分野において公知の他の結合部分などの、他のリンカーも使用することができる。リンカーのさらなる例は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはオリゴ（エチレングリコール）などのエチレングリコールに基づく。ＰＥＧベースのリンカーは、水または他の関連する溶媒中でのそれらの良好な溶解度およびそれらの扱いやすさから、好ましい。ＰＥＧリンカーは、ペプチドの腎臓クリアランスを改善するために使用されることが多い（Lang et al., Bioconjug. Chem. 2011 22(12): 2415-2422. doi: 10.1021/bc200197h）。リンカーは、２つのさらなる部分を互いに接続してそれらの空間的近位性を確実にするまたはそれらのそれぞれの空間的位置を制限する、その機能によって規定されることが多い。リンカーは機械的結合を提供する。当業者には、適切なリンカーを選択することが可能であろう。例えば、ペプチドへのＮ末端コンジュゲーションでは、遊離カルボン酸部分を有するアルキル鎖またはＰＥＧが適している。このようなケースでは、ＰＥＧの他の末端は、例えば、保護されたアミン、または別の直交反応性部分であり得る。適切なＰＥＧ末端の非限定的な例は、アミン、カルボン酸、チオール、アルコール、アルデヒド、アジド、アルキン、またはこれらの部分のいずれかの保護された形である。

あるいは、ＡＭＰおよび抗原は、単一のポリペプチドまたは「融合タンパク質」として産生され得、場合によって、ＡＭＰと抗原との間にリンカーが存在する。したがって、好ましくは、抗原は、抗原およびＡＭＰを単一のポリペプチド鎖に含む融合タンパク質中においてＡＭＰに共有結合している。好ましくは、融合タンパク質のＮ末端融合パートナーは抗原であり、融合タンパク質のＣ末端融合パートナーはＡＭＰである。好ましくは、融合タンパク質は、ＡＭＰおよび抗原および本明細書において後に定義される必要に応じたリンカーの外側にアミノ酸残基を含まない。

本発明はしたがって、融合タンパク質を含むＯＭＶであって、第１に、好ましくはＮ末端の融合パートナーが抗原であり、第２に、好ましくはＣ末端の融合パートナーが、抗原をＯＭＶに固定させることができるＡＭＰである、ＯＭＶにも関する。好ましくは、ＯＭＶおよび融合タンパク質は、場合によって異なる（微）生物において、別々に産生される。第１および第２の融合パートナーは、リンカーによって離されていてよい。

抗原は、リンカー（またはスペーサー）、好ましくは可動性リンカーによってＡＭＰに結合し得る。当技術分野において公知の任意の従来のリンカーを、ＡＭＰを抗原にカップリングするために使用することができる。好ましくは、リンカーは、ＡＭＰがＯＭＶ膜に入り込む能力に干渉しないか、または実質的に干渉しない。さらに、またはあるいは、リンカーは、抗原が免疫応答を引き起こす能力に干渉しないか、または実質的に干渉しない。

リンカーは、堅固なリンカーまたは可動性のリンカーであり得る。リンカーは、好ましくは可動性リンカーである。リンカーがまず、ＡＭＰにコンジュゲート、好ましくは共有結合され得、その後、抗原がリンカーにコンジュゲート、好ましくは共有結合される。あるいは、リンカーがまず抗原にコンジュゲート、好ましくは共有結合され得、その後、ＡＭＰがリンカーにコンジュゲート、好ましくは共有結合される。あるいは、リンカーの一部分がＡＭＰにコンジュゲート、好ましくは共有結合され得、リンカーの別の部分が抗原にコンジュゲート、好ましくは共有結合され得、その後、リンカーの両部分が共にコンジュゲート、好ましくは共有結合される。あるいは、リンカーは、融合タンパク質の一部分として産生され得る。

好ましくは、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーは、グリシンに富んだ可動性リンカーであり得る。好ましくは、リンカーの長さは、２～５０の間、３～４０の間、４～３０の間、または５～２０の間のアミノ酸残基である。リンカーは、参照によって本明細書に組み込まれるＣｈｉｃｈｉｌｉら（Protein Sci. 2013 Feb; 22(2): 153-167）の表１に特定されているリンカーであり得る。

リンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ配列を有し得る。当業者には、リンカーをＡＭＰおよび抗原に応じて選択する方法が公知である。リンカーは、例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１２）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０）、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳ）ｎ、および（Ｇ）ｎの形態の非常に可動性のリンカーから、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号１１）、（ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ）ｎ（配列番号２）、もしくは（ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ）ｎ（配列番号３）、もしくは（ＫＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ）ｎ（配列番号４）、またはこれらの任意のバリアントの形態の、より堅固なリンカーまでであり得、式中、ｎは、好ましくは、１～１０の間、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。

場合によって、抗原とＡＭＰとの間に、限定はしないが１つまたは複数のタグおよび／またはプロテアーゼ切断部位などの、さらなるアミノ酸残基が位置している。必要に応じて、ｈｉｓタグおよび／またはＴｗｉｎ ｓｔｒｅｐタグが、抗原とＡＭＰとの間に存在している。あるいは、またはさらに、抗原とＡＭＰとの間に位置するＨＲＶ ３Ｃ認識部位などのプロテアーゼ切断部位が存在する。

別の実施形態では、抗原とＡＭＰとの間、タグおよび／またはプロテアーゼ切断部位は位置しない。

抗原
本発明は、任意の特異的な抗原に限定されない。本発明において使用するための抗原は、ＡＭＰへのコンジュゲーションおよびその後のＯＭＶの表面上での提示に好ましくは適している。抗原は、糖類またはペプチドのうちの少なくとも１つであり得る。糖類は、例えばオリゴ糖または多糖であり得る。同様に、ペプチドは、例えば、タンパク質などのオリゴペプチドまたは長鎖分子であり得る。好ましくは、抗原はペプチドである。

抗原性ペプチドは、天然に存在するタンパク質またはその断片、好ましくはその抗原性断片であり得る。抗原性ペプチドは、１つまたは複数の修飾を含み得る。非限定的な例として、抗原性ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端のシステインを含み得る。

抗原は、エピトープデータベースｉｅｄｂ．ｏｒｇ（Vita et al, Nucleic Acids Res. 2015; 43(Database issue): D405-D412 and periodic updates）から得られる１つもしくは複数のエピトープを含み得るか、またはあらゆる他の抗原、例えば新たに発見された抗原であり得る。好ましくは、抗原は、感染性疾患または腫瘍に関連する抗原の１つまたは複数のエピトープを含む。例えば、ＡＭＰに融合した抗原は、ウイルス、細菌、真菌、および原生動物などの病原体および感染性物質の抗原に由来する１つまたは複数のエピトープを含み得る。

抗原のエピトープが由来する元であり得る、感染または腫瘍の原因となる病原性ウイルスの一部の例としては、肝炎（Ａ、Ｂ、またはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－Ｉ、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩ、およびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、ＳＶ４０ウイルス（中皮腫の原因となる）、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、おたふく風邪ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルス脳炎ウイルス、ならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶウイルス、例えば、Ｉ型およびＩＩ型）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が含まれ得る。好ましくは、本発明において使用するための抗原は、コロナウイルスまたはエンテロウイルスの１つまたは複数のエピトープを含む。好ましくは、本発明において使用するための抗原は、コロナウイルスの１つまたは複数のエピトープを含む。コロナウイルスは、アルファコロナウイルス属またはベータコロナウイルス属のウイルス、好ましくはベータコロナウイルス属のウイルスであり得る。亜属は、好ましくはサルベコウイルスまたはメルベコウイルスである。好ましくは、本発明において使用するための抗原は、ＣＯＶＩＤ－１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、およびＨＣｏＶ－ＮＬ６３からなる群から選択されるコロナウイルスの１つまたは複数のエピトープを含む。本発明において使用するための抗原は、エンテロウイルスの１つまたは複数のエピトープを含み得る。エンテロウイルスは、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、およびライノウイルスのうちの好ましくは少なくとも１つである。好ましくは、エンテロウイルスはエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）であり、好ましくは、エピトープはエンテロウイルスＶＰ１またはＶＰ２のものである。

抗原のエピトープが由来し得る元である、感染の原因となる病原性細菌の一部の例としては、ボルデテラ属（Bordetella）、ナイセリア属（Neisseria）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、ボレリア属（Borrelia）、リステリア属（Listeria）、大腸菌属（Escherichia）、クラミジア属（Chlamydia）、コクシエラ属（Coxiella）、リケッチア菌（Rickettsial bacteria）、マイコバクテリア（Mycobacteria）、ブドウ球菌（Staphylococci）、レンサ球菌（Streptococci）、肺炎球菌（Pneumonococci）、髄膜炎菌（Meningococci）、淋菌（Gonococci）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、セラチア属（Serratia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、レジオネラ属（Legionella）、ジフテリア（Diphtheria）、サルモネラ属（Salmonella）、バシラス綱（Bacilli）、コレラ、破傷風、ボツリヌス症、炭疽、ペスト、レプトスピラ症、百日咳、およびライム病の原因となる細菌が含まれる。好ましいボルデテラ属（Bordetella）抗原は、パータクチンタンパク質またはその抗原性断片であり得、パータクチンタンパク質は、好ましくは、配列番号１８に対して少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する。

抗原のエピトープが由来し得る元である、感染の原因となる病原性真菌の一部の例としては、カンジダ属（Candida）（例えば、カンジダ・アルビカンス（albicans）、カンジダ・クルセイ（krusei）、カンジダ・グラブラータ（glabrata）、カンジダ・トロピカリス（tropicalis））、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、コウジカビ属（Aspergillus）（例えば、アスペルギルス・フミガーツス（fumigatus）、アスペルギルス・ニガー（niger））、ケカビ目（Mucorales）の属の真菌（ケカビ属（Mucor）、ユミケカビ属（Absidia）、クモノスカビ属（Rhizopus））、スポロトリックス・シェンキイ（Sporothrix schenkii）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、およびヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）が含まれる。

抗原のエピトープが由来し得る元である、感染の原因となる病原性寄生体の一部の例としては、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、大腸バランチジウム（Balantidium coli）、ネグレリア属（Naegleria）、フォーラー（Fowleri）、アカントアメーバ属の種（Acanthamoeba sp.）、ランブル鞭毛虫（Giardia lambia）、クリプトスポリジウム属の種（Cryptosporidium sp.）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、ネズミバベシア（Babesia microti）、ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、ドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、および熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparis）が含まれる。

さらに、またはあるいは、本発明において使用するための抗原は、例えばＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＴ抗原、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ｐ５３、ＸＡＧＥ、およびＰＲＡＭＥを含む、広範な腫瘍抗原の１つまたは複数のエピトープだけではなく、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によって誘導されるリンパ腫を含む、ウイルスによって誘導される悪性腫瘍も含まれ得る。本発明において使用するためのエピトープが誘導され得る元である腫瘍抗原の他の例は、様々な遍在的に発現した、がんに関連することが分かっている自己抗原であり得、これら自己抗原としては、例えば、ｐ５３、ＭＤＭ－２、ＨＤＭ２、およびｐ５３経路において役割を有する他のタンパク質、サバイビング（surviving）、テロメラーゼ、シトクロムＰ４５０アイソフォーム１Ｂ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、およびＣＤ１９などの分子、ならびに全てのいわゆるハウスホールド（house hold）タンパク質が含まれる。本発明に従って処置または予防され得るがんは、以下のリストの中から選択される：肺がん、結腸がん、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、皮膚がん、胃がん、頭頚部がん、膀胱がん、肉腫、前立腺がん、肝細胞がん、脳腫瘍、副腎がん、乳がん、子宮内膜がん、中皮腫、腎臓がん、甲状腺がん、血液のがん、カルチノイド、黒色腫、副甲状腺がん、子宮頚がん、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、精巣がん、下垂体がん、および褐色細胞腫。

ＡＭＰにコンジュゲートした抗原は、１つまたは複数の、表面に曝露された、感染性物質または腫瘍のタンパク質抗原のエピトープを含み得るかまたはこれからなり得る。ＡＭＰにコンジュゲートした抗原は、例えば、細胞外のおよび／または表面に曝露された、感染性物質または腫瘍のタンパク質抗原のドメインを含み得るかまたはこれからなり得る。

好ましくは、ＡＭＰにカップリングされた抗原は、表面に曝露されたウイルスのタンパク質またはリポタンパク質の表面に曝露されたドメインの１つまたは複数のエピトープを含むかまたはこれからなる。好ましくは、１つまたは複数のエピトープは、コロナウイルスまたはエンテロウイルス、好ましくはＣＯＶＩＤ－１９またはＥＶ７１の、表面に曝露されたウイルスタンパク質またはリポタンパク質の表面に曝露されたドメインのものであり、例えば、限定はしないが、ＣＯＶＩＤ－１９の表面の糖タンパク質もしくは「スパイク」またはＥＶ７１ウイルスのタンパク質ＶＰ１もしくはＶＰ２である。

抗原は、ウイルススパイクタンパク質の１つまたは複数のエピトープを含み得る。抗原は、ウイルススパイクタンパク質、またはその抗原性断片であり得る。好ましいスパイクタンパク質またはその抗原性断片は、コロナウイルス、好ましくは、ＣＯＶＩＤ－１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ならびにＨＣｏＶ－ＮＬ６３からなる群から選択されるコロナウイルスから得られる。好ましいスパイクタンパク質またはその抗原性断片は、ＣＯＶＩＤ－１９から得られるかまたはそれに由来する。

本発明の複合体における抗原として使用され得るスパイクタンパク質、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、融合前または融合後の立体構造であり得る。好ましくは、スパイクタンパク質は、融合前の立体構造である。本発明の複合体における抗原として使用されるスパイクタンパク質は、ネイティブなタンパク質、または修飾された、例えばその安定性が増大するように修飾されたタンパク質であり得る。本発明の複合体における抗原として使用されるスパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のいずれかから得られるかまたはそれに由来するネイティブなまたは修飾されたスパイクタンパク質であり得、好ましくは、スパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１、ＧｅｎＢａｎｋ ＭＮ９０８９４７から得られるかまたはそれに由来するネイティブなまたは修飾されたスパイクタンパク質である。

好ましくは、スパイクタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する、修飾されたタンパク質である。好ましくは、スパイクタンパク質は、１つまたは複数のプロリン置換を有する、修飾されたタンパク質である。好ましくは、スパイクタンパク質は、融合前の立体構造の修飾されたタンパク質であり、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのプロリン置換を含む。好ましくは、本発明の複合体における抗原は、Ｈｓｉｅｈら（Science. 2020 Sep 18;369(6510):1501-1505）において開示されているスパイクタンパク質の１つまたは複数のエピトープを含む。好ましくは、本発明の複合体における抗原は、Ｈｓｉｅｈら（上記の）において開示されているスパイクタンパク質を含むかまたはこれからなる。

好ましくは、本発明の複合体における抗原は、配列番号４１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質である。好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、配列番号４６とも少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされている。スパイクタンパク質は、１つまたは複数の置換を含み得る。好ましくは、スパイクタンパク質は、Ｆ８１６、Ａ８９１、Ａ８９８、およびＡ９４１からなる群から選択される位置での置換を含み得る。好ましくは、スパイクタンパク質は、Ｆ８１６Ｐ、Ａ８９１Ｐ、Ａ８９８Ｐ、およびＡ９４１Ｐからなる群から選択される置換を含む。好ましくは、スパイクタンパク質は、置換Ｆ８１６Ｐ、Ａ８９１Ｐ、Ａ８９８Ｐ、およびＡ９４１Ｐを含む。

好ましくは、本発明の複合体における抗原は、配列番号４４と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質である。好ましくは、本発明の複合体における抗原は、配列番号４９と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされている、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質である。

スパイクタンパク質は、本明細書において定義されるＡＭＰに好ましくはコンジュゲートしており、好ましくは、ＡＭＰは、本明細書において定義されるカテリシジンである。スパイクタンパク質は、本明細書において定義されるｍＣＲＡＭＰに好ましくはコンジュゲートしている。好ましくは、スパイクタンパク質は、リンカー、好ましくはリンカーＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１２）を使用して、ｍＣＲＡＭＰにコンジュゲートしている。

さらに、またはあるいは、スパイクタンパク質のアミノ酸配列の前または後ろに、タグ配列および／またはプロテアーゼ切断部位があってよい。スパイクタンパク質は、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ認識部位、Ｈｉｓタグ、およびＴｗｉｎ ｓｔｒｅｐタグのうちの少なくとも１つにコンジュゲートしていてよい。１つまたは複数のタグおよびプロテアーゼ認識部位にコンジュゲートしたスパイクタンパク質は、配列番号４３と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。１つまたは複数のタグおよびプロテアーゼ認識部位にコンジュゲートしたスパイクタンパク質は、配列番号４８と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列によって好ましくはコードされている。

（場合によってリンカーおよび）ＡＭＰにコンジュゲートしているタンパク質の配列は、好ましくは、配列番号４４と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。

本発明の好ましいコンジュゲートは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質とｍＣＲＡＭＰとの間のコンジュゲーションである。好ましくは、コンジュゲートは、スパイクタンパク質とｍＣＲＡＭＰとの間にリンカーを含む。必要に応じて、コンジュゲートは、ＨｉｓタグおよびＴｗｉｎ ｓｔｒｅｐタグなどの１つまたは複数のタグをさらに含む。さらに、またはあるいは、コンジュゲートは、１つまたは複数のＨＲＶ ３Ｃ認識部位などの１つまたは複数のプロテアーゼ切断部位を含む。本発明の好ましいコンジュゲートは、配列番号４２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。本発明の好ましいコンジュゲートは、配列番号４７と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされている。

好ましくは、本発明のコンジュゲートは、タグおよび／またはプロテアーゼ認識部位を含まない。コンジュゲートは、本明細書において定義される抗原、リンカー、およびＡＭＰを含み得るかまたはそれからなり得る。好ましくは、リンカーはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１２）である。好ましくは、スパイクタンパク質は配列番号４４を有する。好ましくは、ＡＭＰは、配列番号１を有するｍＣＲＡＭＰである。本発明の好ましいコンジュゲートは、配列番号４５と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。本発明の好ましいコンジュゲートは、配列番号５０と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされている。

ＥＶ７１ ＶＰ１タンパク質は、配列番号１４（ＥＶ７１ ＶＰ１）と少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有し得る。ＶＰ１またはＶＰ２の好ましい、好ましくは抗原性の断片は、配列番号１５、１６、および１７のうちの少なくとも１つに対して少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する。

ＡＭＰにカップリングされた抗原は、表面に曝露された細菌のタンパク質またはリポタンパク質の表面に曝露されたドメインの１つまたは複数のエピトープを含み得るかまたはこれからなり得る。好ましくは、表面に曝露された、ボルデテラ属（Bordetella）、ナイセリア属（Neisseria）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、ボレリア属（Borrelia）、コクシエラ属（Coxiella）、および上記の他の病原性細菌属のいずれかからなる属から選択される細菌のタンパク質またはリポタンパク質の、表面に曝露されたドメイン。

ＡＭＰ－抗原の産生
抗原およびＡＭＰは、別々に産生し、産生の後にコンジュゲートすることができる。抗原および／またはＡＭＰは、無細胞系を使用して産生することができる。このような無細胞系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのペプチド合成、例えば限定はしないが、液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）または固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）であり得る。あるいは、またはさらに、ＡＭＰおよび／または抗原は、前記抗原または前記ＡＭＰを天然に含む細胞、組織、または体液から精製することができる。あるいは、またはさらに、抗原および／またはＡＭＰは、抗原および／またはＡＭＰを発現または過剰発現するように修飾された組換え細胞内で産生することができる。ＡＭＰは、好ましくは、本明細書において上記で定義されるＡＭＰである。好ましくは、ＡＭＰは、配列番号１に対して少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する配列を有する。

あるいは、ＡＭＰおよび抗原は、単一のポリペプチドとして、すなわち、第１の融合パートナーおよび第２の融合パートナーを含む融合タンパク質であって、第１の融合パートナーがＡＭＰであり、第２の融合パートナーが抗原である融合パートナーとして、産生することができる。必要に応じて、融合パートナーは、リンカーによって離されている。本明細書において、用語「第１の」および「第２の」は融合タンパク質内でのそれぞれの融合パートナーがＮ末端またはＣ末端に位置していることを特に特定しているわけではないことが理解される。用語「第１の」および「第２の」は単に、融合タンパク質が少なくとも２つの融合パートナー、すなわちＡＭＰおよび抗原を含むことを示すためのものである。好ましくは、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＡＭＰ、必要に応じたリンカー、および抗原を含む。あるいは、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、抗原、必要に応じたリンカー、およびＡＭＰを含む。融合タンパク質のＡＭＰは、好ましくは、本明細書において上記で定義されるＡＭＰである。好ましくは、融合タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を有する配列を有するＡＭＰを含む。

融合タンパク質は、無細胞系を使用して産生することができる。このような無細胞系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのペプチド合成、例えば限定はしないが、液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）または固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）であり得る。あるいは、またはさらに、融合タンパク質は、組換え細胞内で産生することができる。本明細書において記載されるＡＭＰ、抗原、または融合タンパク質のうちの少なくとも１つを発現する組換え細胞または「宿主細胞」は、任意の適切な宿主細胞であり得る。本明細書において、ＡＭＰを発現する細胞が、抗原を発現する細胞とは異なる細胞であり得る、すなわち、抗原を発現する細胞とは異なる生物または異なる細胞型に由来し得ることが理解される。宿主細胞は、本明細書において定義されるＡＭＰ、抗原、または融合タンパク質をコードする核酸構築物で形質転換、トランスフェクト、形質導入などをされていてよい。したがって、用語「宿主細胞」は、前記核酸構築物での形質転換、トランスフェクション、形質導入、などを受けやすいあらゆる細胞型を意味する。

あるいは、またはさらに、宿主細胞のゲノムは、内因的にコードされるＡＭＰまたは抗原を発現または過剰発現するように修飾されていてよい。あるいは、またはさらに、宿主細胞のゲノムは、限定はしないがＣＲＩＳＲ－Ｃａｓ技術などの部位特異的編集技術を例えば使用して、内因的にコードされるＡＭＰまたは抗原の突然変異型を発現または過剰発現するように修飾されていてよい。用語「宿主細胞」は、複製の際に生じる突然変異に起因して親細胞とは同一ではない、親細胞のあらゆる子孫をさらに包含する。

宿主細胞の選択は、ＡＭＰ、抗原、および／または融合タンパク質のタイプに応じ得る。宿主細胞は、ＡＭＰ、抗原、および／または融合タンパク質の組換え産生において有用なあらゆる細胞、例えば、原核細胞または真核細胞であり得る。

原核宿主細胞は、あらゆるグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。グラム陽性細菌としては、限定はしないが、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オセアノバチルス属（Oceanobacillus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、およびストレプトマイセス属（Streptomyces）が含まれる。グラム陰性細菌としては、限定はしないが、ナイセリア属（Neisseria）、ボルデテラ属（Bordetella）、大腸菌（E. coli）、シュードモナス属（Pseudomona）、カンピロバクター属（Campylobacter）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、イリオバクター属（Ilyobacter）、サルモネラ属（Salmonella）、およびウレアプラズマ属（Ureaplasma）が含まれる。好ましいグラム陰性細菌は、ナイセリア属（Neisseria）、ボルデテラ属（Bordetella）、または大腸菌（E. coli）である。好ましいナイセリア属（Neisseria）は、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、またはナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）のうちの少なくとも１つである。好ましいボルデテラ属（Bordetella）は、ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ボルデテラ・パラパーツシス（Bordetella parapertussis）、および気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）のうちの少なくとも１つである。好ましい原核宿主細胞は、大腸菌（E. coli）である。

好ましい真核宿主細胞は、動物細胞、好ましくは脊椎動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。好ましくは、細胞は、細胞系、好ましくは不死化細胞系に由来する細胞である。

宿主細胞は、抗原、ＡＭＰ、および融合タンパク質のうちの少なくとも１つをコードする核酸構築物で形質転換、トランスフェクト、形質導入などをされていてよい。好ましくは、核酸構築物は、ＡＭＰ、抗原、および融合タンパク質のうちの少なくとも１つの発現を制御する１つまたは複数の調節エレメントを含む。好ましくは、調節エレメントは、少なくとも１つのプロモーター配列を含む。当業者には、選択された宿主細胞における発現に適した任意のプロモーター配列が使用され得ることが理解される。好ましくは、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターまたは誘導性プロモーターのうちの少なくとも１つである。宿主細胞が、ＡＭＰおよび融合タンパク質のうちの少なくとも１つの発現に使用される細菌宿主細胞であるケースでは、プロモーターは、限定はしないが化学誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターである。

産生されたＡＭＰ、抗原、および／または融合タンパク質は、限定はしないが１つまたは複数の透析ステップ、濾過ステップ、または精製ステップなどの任意の従来の手段を使用して精製することができる。

ＯＭＶ
ＡＭＰにコンジュゲートした抗原は、任意の好適なＯＭＶと複合体を形成することができる。ＯＭＶは、グラム陰性細菌によって自然に産生される外膜（ＯＭ）の球状の出芽である。

ワクチンにおいて使用するためのＯＭＶ（「ブレブ」としても公知）は、デオキシコール酸塩などの界面活性剤がＬＰＳを除去して小胞放出を増加させるために使用される界面活性剤抽出法（ｄＯＭＶ精製プロセス）によって伝統的に調製される。髄膜炎菌（N. meningitidis）などの大半のグラム陰性細菌のＬＰＳは高度に毒性であるが、小胞構造を維持するために、およびアジュバント活性のために、残留量（およそ１％）がＯＭＶにおいて必要とされる。ＡＭＰとＯＭＶとの間の相互作用において推定される最初のステップは、ＡＭＰとＬＰＳのリピドＡ／内部コア領域との結合である。したがって、ＯＭＶはそのＬＰＳの少なくとも一部を維持することが好ましい。したがって、本明細書において定義される複合体におけるＯＭＶは、好ましくは界面活性剤で抽出されたＯＭＶではない。しかしながら、界面活性剤で抽出されたＯＭＶではないＯＭＶを調製するためのプロセスは、いかなる界面活性剤の使用も除外しないということが理解される。低濃度の界面活性剤の使用および／または弱い（mild）界面活性剤の使用は、ＡＭＰが抗原を抽出ＯＭＶに依然として固定可能である限り、例えば、自然に生じるＯＭＶまたは上清ＯＭＶと複合体形成するＡＭＰコンジュゲート抗原の量と比較して少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、９５または９９％のＡＭＰコンジュゲート抗原が抽出ＯＭＶと複合体形成する限り、除外されない。

好ましくは、抗原およびＡＭＰと複合体を形成するＯＭＶは、自然に生じるＯＭＶまたはネイティブなＯＭＶである。ＯＭＶは、好ましくはネイティブなＯＭＶである。ネイティブなＯＭＶの産生は当技術分野で周知であり、例えばSaunders et al. (1999, Infect Immun, 67, 113-119)、van de Waterbeemd et al. (2012, Vaccine, 30: 3683-3690)、および国際公開第２０１３００６０５５号パンフレットに記載されている。ｓＯＭＶを調製するための方法は、例えば、van de Waterbeemd et al. (2013, PLoS ONE, 8(1): e54314. doi:10.1371/journal.pone.0054314)およびLee et al. (2007, Proteomics, 7: 3143-3153)に記載されており、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載されるＯＭＶのＬＰＳは、少なくとも部分的に毒性除去されたＬＰＳを含み得る。例えば、ＬＰＳは、自己免疫応答を引き起こすと考えられる、ならびに／または樹状細胞への結合およびアジュバント活性を増加させると考えられる、生じ得るエピトープを除去するために、改変オリゴ糖構造を有し得る。さらにまたは代替的に、ＬＰＳは、例えば１つまたは複数のアシル鎖が野生型リピドＡ部分と比較して短縮されているかまたは存在しない、改変リピドＡ部分を有し得る。

本発明の複合体におけるＯＭＶは好ましくは、（ｉ）好ましくは内毒素および反応原性がより少ないバリアントを得るためにリポ多糖（ＬＰＳ）生合成経路を変更する遺伝子改変、（ｉｉ）外膜アンカータンパク質を除去することによってＯＭＶ産生を増加させる遺伝子改変、ならびに（ｉｉｉ）望ましくない種類の免疫応答を惹起し得る免疫調節成分を除去する遺伝子改変からなる群から選択される遺伝子改変を有するグラム陰性細菌から得ることができる。さらにまたは代替的に、グラム陰性細菌は、（ｉｖ）正常に分泌される抗原の外膜保持を引き起こす遺伝子改変、および（ｖ）宿主ＯＭＶ産生株以外の病原体由来の異種抗原の発現を導入する遺伝子改変のうちの少なくとも１つを含み得る。

好ましくは、ＯＭＶはグラム陰性細菌から得ることができ、グラム陰性細菌は、低減した（内）毒性を有するＬＰＳを細菌に産生させる１つまたは複数の遺伝的突然変異を含む。好ましくは、ＬＰＳはそのアジュバント活性の少なくとも一部を保持する。好ましくは、改変は、ｌｐｘＬ１、ｌｐｘＬ２、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＤおよびｌｐｘＫ遺伝子またはこれらのホモログのうちの少なくとも１つの発現を低減させるまたはなくす。好ましくは、改変は、内因性ｌｐｘＬ１、ｌｐｘＬ２、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＤおよびｌｐｘＫ遺伝子またはこれらのホモログのうちの少なくとも１つの発現を低減させるまたはなくす。

好ましくは、グラム陰性細菌は、ｌｐｘＬ１遺伝子またはこのホモログの発現を低減させるまたはなくす遺伝子改変を有し、ｌｐｘＬ１遺伝子またはこのホモログは好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。

さらにまたは代替的に、ＯＭＶはグラム陰性細菌から得ることができ、グラム陰性細菌は、低減した（内）毒性を有するＬＰＳを細菌に産生させる１つまたは複数の遺伝的突然変異を含み、好ましくは、改変は、ｌｐｘＰ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＤ、ｌｐｘＥ、ｌｐｘＦおよびｐａｇＬ遺伝子、またはこれらのホモログのうちの少なくとも１つの発現を増大させる。好ましくは、改変は、異種ｌｐｘＰ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＤ、ｌｐｘＥ、ｌｐｘＦおよびＰａｇＬ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を増大させる。

好ましくは、グラム陰性細菌は、ｌｐｘＰ遺伝子またはこのホモログの発現を導入または増大させる遺伝子改変を有し、ｌｐｘＰ遺伝子またはこのホモログは好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。

好ましくは、グラム陰性細菌は、ｌｐｘＡ遺伝子またはこのホモログの発現を導入または増大させる遺伝子改変を有し、ｌｐｘＡ遺伝子またはこのホモログは好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。

好ましくは、グラム陰性細菌は、ｌｐｘＤ遺伝子またはこのホモログの発現を導入または増大させる遺伝子改変を有し、ｌｐｘＤ遺伝子またはこのホモログは好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。

必要に応じて、改変グラム陰性細菌は、内因性ｌｐｘＰ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＤ、ｌｐｘＥ、ｌｐｘＦおよびｐａｇＬ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低減させるまたはなくすように改変されている。

本発明の複合体のＯＭＶが取得可能であるグラム陰性細菌は、小胞形成を増加させ、それによってＯＭＶ収率を増加させるために、外膜とペプチドグリカンとの間のアンカータンパク質をコードする遺伝子の発現を低減させるまたはなくす遺伝子改変を含んでもよい。

この目的に好適な遺伝子改変は、例えば、グラム陰性細菌に一般的に見出されるＯｍｐＡホモログ、例えばナイセリア属（Neisseria）におけるＲｍｐＭタンパク質の発現を低減させるまたはなくす（Steeghs et al., 2002 Cell Microbiol, 4:599-611；van de Waterbeemd et al., 2010 Vaccine, 28:4810 - 4816）。したがって、好ましくは、遺伝子改変は、ｏｍｐＡ遺伝子またはこのホモログ、より好ましくはｒｍｐＭ遺伝子またはこのホモログの発現を低減させるまたはなくす。好ましくは、グラム陰性細菌は、ｒｍｐＭ遺伝子またはこのホモログの発現を低減させるまたはなくす遺伝子改変を有し、ｒｍｐＭ遺伝子またはこのホモログは好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。ＲｍｐＭ発現をなくすことは、好ましくはＯＭＶ放出を増加させる。

ある実施形態では、本明細書において定義される複合体のＯＭＶの産生のためのグラム陰性細菌は、外膜におけるＰｒｎ９３（９３ｋＤａのパータクチン）の保持をもたらす突然変異を含む。

本発明の複合体のＯＭＶを産生するためのグラム陰性細菌宿主細胞は、ｃｐｓ、ｃｔｒＡ、ｃｔｒＢ、ｃｔｒＣ、ｃｔｒＤ、ｅｘｂＢ、ｅｘｂＤ、ｆｒｐＢ、ｇａｌＥ、ｈｔｒＢ、ｍｓｂＢ、ｌｐｂＢ、ｌｐｘＫ、ｌｐｘＬ１、ｎｍｂ００３３、ｏｐＡ、ｏｐＣ、ｒｍｐＭ、ｐｈｏＰ、ｐｉｌＣ、ｐｍｒＥ、ｐｍｒＦ、ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｓｉａＡ、ｓｉａＢ、ｓｉａＣ、ｓｉａＤ、ｓｙｎＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎｃ、ｔｂｐＡおよびｔｂｐＢ、またはこれらのホモログ、好ましくはｃｐｓおよびｐｏｒＢまたはこれらのホモログからなる群から選択される遺伝子の発現を低減させるまたはなくす１つまたは複数の遺伝子改変をさらに有し得る。これらの突然変異の多くは国際公開第０２／０９７４６号パンフレットにおいて概観される。

発現の低減は好ましくは、遺伝子改変を含まない、その他の点では同一の細菌宿主細胞と比較した発現の低減である。好ましくは、本明細書において定義される遺伝子改変は、発現を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％低減させる。１００％の低減は、本明細書において、発現の消失として理解される。

グラム陰性細菌は、ｃｐｓ座位に位置する遺伝子、例えば、参照により本明細書に組み込まれるHarrison et al (Emerg Infect Dis. 2013 Apr; 19(4): 566-573)の表２および３に明記されている遺伝子の発現を好ましくは低減させるまたはなくす遺伝子改変をｃｐｓ座位に含み得る。好ましくは、ｃｐｓ座位における遺伝子改変は、少なくともｓｉａＤ発現の低減または消失をもたらす。

好ましくは、本発明の複合体のＯＭＶを産生するためのグラム陰性細菌宿主細胞は、ｌｐｘＬ１、ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｒｍｐＭ、およびｓｉａＤからなる群から選択される遺伝子の発現を低減させるまたはなくす１つまたは複数の遺伝子改変を有し得る。好ましくは、本発明の複合体のＯＭＶを産生するためのグラム陰性細菌宿主細胞は、ｌｐｘＬ１、ｐｏｒＡ、ｒｍｐＭおよびｓｉａＤからなる群から選択される遺伝子の発現を低減させるまたはなくす１つまたは複数の遺伝子改変を有する。

好ましくは、グラム陰性細菌は、ｓｉａＤ遺伝子またはこのホモログの発現を低減させるまたはなくす遺伝子改変を有し、ｓｉａＤ遺伝子またはこのホモログは好ましくは、配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。ｓｉａＤ発現の低減、好ましくは、欠失は、好ましくは莢膜多糖の除去をもたらし、細菌の侵襲性を低下する。

好ましくは、グラム陰性細菌は、ｐｏｒＡ遺伝子またはこのホモログの発現を低減させるまたはなくす遺伝子改変を有し、ｐｏｒＡ遺伝子またはこのホモログは好ましくは、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。

好ましくは、グラム陰性細菌は、ｐｏｒＢ遺伝子またはこのホモログの発現を低減させるまたはなくす遺伝子改変を有し、ｐｏｒＢ遺伝子またはこのホモログは好ましくは、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。

さらにまたは代替的に、ＯＭＶの産生のためのグラム陰性細菌は、百日咳毒素（Ｐｔｘ）の毒性を低減させるまたはなくす突然変異を含み得る。

本明細書において定義される複合体の一部を形成するＯＭＶを産生するためのグラム陰性細菌は好ましくは、ナイセリア属（Neisseria）、ボルデテラ属（Bordetella）、大腸菌属（Escherichia）およびサルモネラ属（Salmonella）からなる群から選択される属に属する。好ましいナイセリア属（Neisseria）は、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）またはナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）のうちの少なくとも１つである。好ましいボルデテラ属（Bordetella）は、ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ボルデテラ・パラパーツシス（Bordetella parapertussis）および気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）のうちの少なくとも１つである。好ましくは、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、大腸菌（Escherichia coli）およびサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）からなる群から選択される種に属する細菌宿主細胞である。好ましい髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）血清型は、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｘ、およびＹ、好ましくは血清型Ｂである。好ましい髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）株はＨ４４／７６である。

ＯＭＶ産生のための好ましいグラム陰性細菌細胞は、本明細書で実施例の節において明記されるナイセリア属（Neisseria）またはボルデテラ属（Bordetella）の細胞である。

好ましくは、ＯＭＶ産生細胞は、ｐｏｒＢ、ｒｍｐＭおよびｌｐｘＬ１遺伝子のうちの少なくとも１つに突然変異を有する髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）である。好ましくは、ＯＭＶ産生細胞は、ｐｏｒＡ、ｒｍｐＭおよびｌｐｘＬ１遺伝子のうちの少なくとも１つに突然変異を有する髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）である。好ましくは、ＯＭＶ産生細胞は、ｐｏｒＢ、ｒｍｐＭ、ｌｐｘＬ１およびｃｐｓ遺伝子のうちの少なくとも１つに突然変異を有する髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）である。好ましくは、ＯＭＶ産生細胞は、ｐｏｒＡ、ｒｍｐＭ、ｌｐｘＬ１およびｃｐｓ遺伝子のうちの少なくとも１つに突然変異を有する髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）である。好ましくは、ＯＭＶ産生細胞は、ｐｏｒＡ、ｒｍｐＭ、ｌｐｘＬ１およびｓｉａＤ遺伝子のうちの少なくとも１つに突然変異を有する髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）である。好ましくは、ＯＭＶ産生細胞は、ｐｏｒＢ、ｒｍｐＭ、ＬｐｘＬ１およびｓｉａＤ遺伝子のうちの少なくとも１つに突然変異を有する髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）である。

さらなる態様では、本発明は、本明細書において定義される複合体と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。組成物は好ましくは、当技術分野で従来から公知の薬学的に許容可能な担体、媒体または送達ビヒクルを含む（例えば"Handbook of Pharmaceutical Excipients", Rowe et al eds. 7th edition, 2012, www.pharmpress.comを参照のこと）。薬学的に許容可能な安定化剤、浸透圧剤、緩衝剤、分散剤などもまた、医薬組成物に組み込まれ得る。好ましい形態は所期の投与様式および治療用途に依存する。薬学的担体は、有効成分、すなわち本発明の複合体を患者に送達するのに好適な任意の適合性かつ非毒性の物質であり得る。非経口送達のための薬学的に許容可能な担体は、必要に応じて２０％アルブミンを補充した滅菌緩衝０．９％ＮａＣｌまたは５％グルコースによって例示される。あるいは、ＡＭＰ－抗原コンジュゲートを含むＯＭＶは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁されてもよい。非経口投与のための調製物は滅菌されていなければならない。本発明のＯＭＶ複合体の非経口投与経路は、公知の方法と一致しており、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、動脈内または病巣内経路による注射または注入である。

ＯＭＶ複合体は好ましくは鼻腔内投与される。この実施形態では、ＯＭＶ複合体を含む医薬組成物は好ましくは鼻腔内投与に好適である。経鼻または鼻腔内投与は、本明細書において、製剤が好ましくは鼻を介して吹き込まれる投与経路として理解される。本発明のＯＭＶ複合体を含む組成物は、少なくとも一方の鼻孔、好ましくは両方の鼻孔に噴霧または滴下され得る。組成物は、本明細書で以下に定義される点鼻器を使用して投与され得る。

複合体または医薬組成物は、注入またはボーラス注射によって連続的に投与され得る。筋肉内注射のための典型的な医薬組成物は、例えば、有効投薬量の本発明のＯＭＶ複合体を含む１～１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水を含有するように作製され得る。非経口投与可能な組成物を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (Ed. Allen, L. V. 22nd edition, 2012, www.pharmpress.com)を含む様々な情報源に、より詳細に記載されている。医薬組成物は、好ましくはワクチン、好ましくは無細胞ワクチンである。

組成物は、例えば免疫応答をさらにブーストするための１つまたは複数の追加のアジュバントを含み得る。アジュバントは、有機または無機アジュバントであり得る。好ましい無機アジュバントはアルミニウム塩、例えば、これらに限定されないが、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムである。好ましい有機アジュバントは、改変ＬＰＳ、好ましくは改変ナイセリア（Neisserial）もしくはボルデテラ（Bordetella）ＬＰＳ、改変ＬＯＳ、スクアレン、ＱＳ２１、またはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）であり得る。アジュバントは、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、パラフィン油、スクアレン、界面活性剤（例えばＱｕｉｌ Ａ）、（植物）サポニン、サイトカイン（例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、またはＩＬ－１２）、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバントからなる群から選択され得る。特定のアジュバントの使用、組成物中の物質の相対および絶対量、ならびに投与の用量レジメンは、当業者によって公知または決定可能であり、処置される特定の対象の特定の病原体感染または持続状態などの状況に適合させることができる。用量レジメンは、単回用量を含み得るが、複数回用量、例えばブースター用量を含んでもよく、好ましくは経口、鼻腔内または非経口、好ましくは鼻腔内または筋肉内投与され得る。ワクチン接種を目的とした様々な用量レジメンは、当技術分野で公知であり、当業者によって好適に適合させることができる。

ある態様では、本発明は、医薬として使用するための本明細書において定義される複合体または本明細書において定義される医薬組成物に関する。したがって、換言すれば、本発明は、本発明の複合体および医薬組成物のうちの少なくとも１つの医薬としての使用に関する。本発明はさらに、本明細書において定義されるＯＭＶ複合体および医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する処置の方法に関する。

別の態様では、本発明は、本明細書において上で定義された抗原に関連する疾患、好ましくは感染性疾患、または腫瘍の防止または処置のための、本発明の複合体または前記複合体を含む医薬組成物に関する。したがって、この態様では、本発明は、治療または予防有効量の本発明の複合体（を含む医薬組成物）の、予防または療法を必要とする対象への投与による、疾患、好ましくは感染性疾患、もしくは腫瘍に対するワクチン接種、またはそれらの予防もしくは治療のためのワクチン接種のための方法に関する。本発明はまた、医薬、好ましくは、疾患、好ましくは感染性疾患、もしくは腫瘍に対するワクチン接種、またはそれらの予防もしくは治療のためのワクチン接種のための医薬としての複合体または医薬組成物の使用に関する。さらなる態様では、本発明は、抗原に対する対象における免疫応答の誘導または刺激を含む処置において使用するための、本明細書において定義される複合体または本明細書において定義される医薬組成物に関する。好ましくは、処置は、本発明の複合体に存在する抗原に関連する感染性疾患または腫瘍を防止または処置するためのものであり、抗原は好ましくは、本明細書において上で定義された抗原である。

ある態様では、本発明は、免疫療法において使用するための本明細書において定義される複合体に関する。好ましくは、免疫療法は、がん、または例えばアルツハイマー病もしくはパーキンソン病を含む神経変性疾患の免疫療法である。

ある態様では、本発明の複合体は、細菌またはウイルス感染などの感染の拡大を防止および／または抑制することにおいて使用するためのものである。本発明の複合体は、ワクチン、例えば、これに限定されないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンとして使用され得る。

さらなる態様では、本発明は、本明細書において定義される抗原にコンジュゲートした本明細書において定義されるＡＭＰに関する。好ましくは、ＡＭＰは、必要に応じてリンカーを使用して、抗原に共有結合している。リンカーは、本明細書において定義されるリンカーであり得る。抗原にコンジュゲートしたＡＭＰは、好ましくは単一ポリペプチドである。したがって、本発明はまた、第１の融合パートナーがＡＭＰ、好ましくは本明細書において定義されるＡＭＰであり、第２の融合パートナーが好ましくは抗原、好ましくは本明細書において定義される抗原である、融合タンパク質に関する。

本発明はさらに、本明細書において定義されるＡＭＰを発現する組換え宿主細胞に関する。同じ宿主細胞は、抗原、好ましくは本明細書において定義される抗原をさらに発現し得る。宿主細胞は、本明細書において上で定義された宿主細胞であり得る。ＡＭＰおよび抗原は、本明細書において定義される単一融合タンパク質の一部であり得る。

本発明はさらに、ＡＭＰをコードする核酸と抗原をコードする核酸との組合せに関する。核酸の前記組合せは、単一核酸構築物の一部であり得る。核酸は、ＡＭＰおよび抗原の発現を制御する１つまたは複数の調節エレメントをさらに含み得る。ＡＭＰおよび抗原は、本明細書において定義される単一融合タンパク質の一部であり得る。本明細書において定義される宿主細胞中でのタンパク質の発現のための発現構築物を構築するための手段および方法は、一般に当技術分野で周知である。

本発明はまた、本明細書において定義される複合体を産生するための方法に関する。好ましくは、方法は、ｉ）本明細書において定義されるグラム陰性細菌の集団をＯＭＶの産生に有利な条件下で培養するステップ、ｉｉ）ｉ）で産生されたＯＭＶを回収するステップ、ｉｉｉ）ｉｉ）で回収されたＯＭＶを、本明細書において定義される抗原にコンジュゲートしたＡＭＰと、ＡＭＰとＯＭＶとの間の非共有結合複合体の形成に有利な条件下で接触させるステップ、およびｖｉ）必要に応じて、複合体を回収するステップを含む。ＯＭＶの産生および精製／抽出は、当技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して実施することができる。同様に、ＡＭＰ／抗原／融合タンパク質の産生および精製／抽出も、当技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して実施することができる。本発明の複合体のＯＭＶを産生するための方法は、さらに好ましくは、本明細書において上で定義および記載された、界面活性剤を使用しない方法である。

ある態様では、本発明はＯＭＶとＡＭＰとの組合せに関し、ここで、ＡＭＰは抗原にコンジュゲートしている。

さらなる態様では、本発明は、１つのバイアルがＯＭＶ、好ましくは本明細書において定義されるＯＭＶと、好ましくは本明細書において上で定義された抗原にコンジュゲートしたＡＭＰとを含むキットオブパーツに関する。キットは、例えば薬学的緩衝液を有する第２のバイアルを備えてもよい。代替的にまたはさらに、キットオブパーツは、ＯＭＶ、好ましくは本明細書において定義されるＯＭＶを含む１つのバイアルと、好ましくは本明細書において上で定義された抗原にコンジュゲートしたＡＭＰを含む第２のバイアルとを備えてもよい。代替的にまたはさらに、キットオブパーツは、ＯＭＶ、好ましくは本明細書において定義されるＯＭＶを含む１つのバイアルと、ＡＭＰ、好ましくは本明細書において定義されるＡＭＰを含む１つのバイアルと、抗原、好ましくは本明細書において定義される抗原を含む１つのバイアルとを備えてもよい。

好ましくは、キット内のバイアルの容量は、１００ｍＬ、５０ｍＬ、２０ｍＬ、１０ｍＬ、５ｍＬ、４ｍＬ、３ｍＬ、２ｍＬまたは１ｍＬを超えない。

試薬は、凍結乾燥形態、または適切な緩衝液において存在し得る。キットはまた、緩衝液、ピペット、マイクロタイタープレート、注射針および／または書面の使用説明書などの本発明を実行するために必要な任意の他の構成要素を含有し得る。本発明のキットのそのような他の構成要素は当業者に公知である。

本明細書で明記される医学的状態の処置における組成物の使用には、対応する医学的処置のための医薬の製造のための、およびそのような医学的状態に罹患している対象を、有効量の組成物を対象に投与することによって処置する方法のための、組成物の使用も含まれることがさらに理解される。

さらなる態様では、本発明は、本発明の組成物を含む容器を構成する点鼻用ボトルに関する。点鼻用ボトルは、当技術分野に記載されている任意の点鼻用ボトルであり得る。典型的には、点鼻用ボトルは、ピペット（両端が開口している）、圧縮球、液体を含有するための容器、およびボトルキャップを備え得る。ピペットの一方の端部は、好ましくは容器中に配置され、圧縮球は、好ましくはピペットの他方の端部に取り付けられる。ピペットの自由端が本発明の組成物を含む容器中に保持され、圧縮球が圧縮されると、球の内部の空気が容器内に排出される。その後、圧縮球にかかる圧力が解放されると、球の弾性により、球は初期の体積に戻り、球内に真空を生み出し、ピペットに本発明の組成物を充填させる。球を新たに圧縮することで、好ましくは、ピペットから液滴の組成物を放出することができる。ピペットは、通例ボトルキャップに付属しており、通例キャップの中央部に密封関係で取り付けられている。ピペットを備えるボトルキャップは容器に螺合することができ、それによって液体の溢流を防止可能な気密液体容器を実現することができる。

さらに別の態様では、本発明は、本発明の組成物を含むボトルまたは同等の入れ物を構成する経鼻スプレーを提供する。経鼻スプレーは、先行技術に記載されている任意の経鼻スプレーであり得る。典型的には、経鼻スプレーは、本発明の組成物を含有するボトルを構成する。ボトルはさらに好ましくは、組成物を鼻孔に投薬するための部分を備える。その場合、溶液は、一実施形態では、任意の好適な手段によって、例えばポンプによって、ボトルの変形によってまたは好適な噴霧剤を使用することによって鼻孔に噴出させることができる。

本文書およびその特許請求の範囲において、「含む（comprise）」という動詞およびその活用形は、非限定的な意味で使用され、その単語に続く項目は含まれるが、具体的に言及されていない項目が除外されるわけではないことを意味する。

本明細書に引用される全ての特許および参考文献は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。

以下の例は、例示的な目的としてのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。

本発明のある実施形態の例示的な概略図。Ａ）ＯＭＶと抗原とは別々に調製され、ＡＭＰを使用して一緒にタグを付加される。Ｂ）ＯＭＶ、ｍＣＲＡＭＰおよび例示的な抗原（ＥＶ７１ ＶＰ１またはパータクチン）。 Ａ）ドットブロット：リンカーｍＣＲＡＭＰまたはＬＬ３７を介したパータクチンとＯＭＶとの会合。Ｂ．ドットブロット：ｍＣＲＡＭＰリンカーを使用した、ＰＲＮと３種の異なる細菌由来のＯＭＶとの結合。Ｃ．ＯＭＶに結合するＰＲＮの定量分析。 （上記の通り。） ＥＶ７１ ＶＰ１タンパク質に対する総ＩｇＧ抗体価。マウスを、０日目および２８日目にペプチドおよびタンパク質ベースのワクチン候補で免疫化した。４２日目に血清を採取し、ＥＶ７１ ＶＰ１タンパク質に対するＩｇＧ抗体の存在について試験した。記載されている記号は、個々のマウスの血清の抗体価を表す。 ＥＶ７１ワクチン候補での免疫化後のマウスの抗体応答。マウスを、０日目および２８日目にペプチドおよびタンパク質ベースのワクチン候補で免疫化した。４２日目に血清を採取し、ＥＶ７１ ＶＰ１タンパク質に対する（Ａ）ＩｇＧ１および（Ｂ）ＩｇＧ２Ａ抗体の存在について試験した。群１つ当たり合計で１０匹のマウスから５匹のマウスの血清をプールした。データは平均±ＳＤとして表した。結果は、群１つ当たり２つのプールした血清からの２連でのものである。 ＥＶ７１ウイルスＣ４遺伝子型に対する総ＩｇＧ抗体価。マウスを、０日目および２８日目にペプチドおよびタンパク質ベースのワクチン候補で免疫化した。４２日目に血清を採取し、ＥＶ７１ウイルスに対するＩｇＧ抗体の存在について試験した。記載されている記号は、個々のマウスの血清の抗体価を表す。 血清中の抗Ｐｒｎ抗体価。個々の力価と平均±標準偏差とを示す。＊＝プラセボ処置群との統計的に有意な差。 ＯＭＶ－スパイクを用いた鼻腔内（Ａ）および筋肉内（Ｂ）ワクチン接種は、マウス血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を中和する能力を強力に誘導する。ＶＮＴ＝ウイルス中和価、ｉ．ｎ．＝鼻腔内、およびｉ．ｍ．＝筋肉内。 Ａ）ＯＭＶ－スパイクを用いた鼻腔内ワクチン接種は、ハムスター血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を中和する能力を強力に誘導し、Ｂ）ワクチン接種されたハムスターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２での攻撃後、肺病変をほとんど生じない。 Ａ）ＯＭＶ－スパイクを用いた筋肉内（ｉ．ｍ．）ワクチン接種は、鼻腔内（ｉ．ｎ．）ワクチン接種ほど効率的ではないが、ハムスター血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を中和する能力を誘導し、Ｂ）ワクチン接種されたハムスターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２での攻撃後、肺病変をほとんど生じない。

[実施例１]
ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）由来の病原因子であるパータクチン（ＰＲＮ）を、ヒト抗微生物ペプチドであるＬＬ－３７（配列番号２２）、またはｍＣＲＡＭＰと呼ばれるそのマウスバリアント（配列番号２０）にカップリングした。カップリングしたペプチドは、ＰＲＮをＯＭＶに、それらの単純な混合後に結合させると予期される。対照タンパク質として、ＰＲＮ単独（配列番号１９）、およびＯＭＶに結合するはずのないｍＣＲＡＭＰのスクランブル型（配列番号２１）に連結したＰＲＮを使用した。全てのタンパク質は、Ｈｉｓタグと共に提供され、組換えタンパク質として産生される。使用されるＯＭＶは髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）由来のものである（ΔＰｏｒＢ ΔＲｍｐＭ ΔｌｐｘＬ１ Δｃｐｓ）。

材料および方法
ドットブロットストック
ｐ６９ ０．３５ｍｇ／ｍｌ
Ｐ６９ ｍＣＲＡＭＰ ０．５４ｍｇ／ｍｌ
ｐ６９ スクランブルｍＣＲＡＭＰ １．１９ｍｇ／ｍｌ
ＯＭＶ（ＭｅｎＢ） １．２３ｍｇ／ｍｌ

ドットブロット
２つの１．５μｌのドットをニトロセルロースの切断片に載せた。ＰＲＮ、ＰＲＮ－ＬＬ３７、ＰＲＮ－ｍＣＲＡＭＰまたはＰＲＮ－スクランブルｍＣＲＡＭＰの１つのドット、およびＯＭＶの１つのドット。その後、ニトロセルロース片を１ｍｌのＷｓｔ緩衝液（０．１Ｍトリス、１．５４Ｍ ＮａＣｌ、５％Ｔｗｅｅｎ－８０、ｐＨ＝７．４）で５分間、３回洗浄した。次に、ニトロセルロース片を第１のドットと同じタンパク質５μｌと共にインキュベートした。染色手順は、Ｗｓｔ緩衝液での洗浄、抗ｈｉｓ ＡｂとのＷｓｔ緩衝液中でのインキュベーション、Ｗｓｔ緩衝液での洗浄、抗マウスＩｇＧ－ＡＰとのｗｓｔ－０．５％中でのインキュベーション、Ｗｓｔ緩衝液での洗浄、ＭｉｌｉＱでの洗浄、ＡＰミックスとのインキュベーション、およびＭｉｌｉＱでの再洗浄からなった。結合タンパク質の量を、ＣＬＩＱＳソフトウェアを使用して、必要に応じてＢｉｏ－Ｒａｄドットブロット装置と組み合わせて決定した。ＯＭＶ結合タンパク質の量を決定するために、染色されたドットの強度を、標準手順を使用して、対照タンパク質およびＯＭＶの希釈系列と比較した。

結果
ドットブロットを使用して、他のｍＣＲＡＭＰ／ＬＬ－３７融合タンパク質の結合を実証した。図２ＡおよびＢは、ＬＬ－３７またはｍＣＲＡＭＰに連結したＰＲＮはＯＭＶに結合するが、ＰＲＮのみまたはスクランブルｍＣＲＡＭＰに連結したＰＲＮはＯＭＶに結合しないことを示す。図２Ｃは、ドットブロットに存在するＯＭＶの量と結合したＰＲＮ－ｍＣＲＡＭＰの量との間の強力な相関を示す。

[実施例２]
本発明者らは、ＯＭＶに結合したエンテロウイルス－７１に由来する抗原に応答する（中和）抗体の誘導を評価した。抗原を、Ｃ末端タグＬＬ－３７またはヒト抗微生物ペプチドＬＬ－３７のマウスオルソログ（ｍＣＲＡＭＰ）と共に産生した。これらのタンパク質またはペプチドを精製ＯＭＶと個々に組み合わせて、ＯＭＶ－抗原複合体を形成した。

材料および方法
外膜小胞（Ｎｏｎａｍｅｎ）
天然髄膜炎菌ＯＭＶワクチンは、過去にＤｕｔｃｈ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＶＩ）／Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｔｒａｖａｃｃ）によって開発されており、高度なブレブ形成（ｒｍｐＭ突然変異）、ＬＰＳの毒性除去（ｌｐｘＬ１突然変異）、莢膜の喪失（座位全体の欠失）およびＰｏｒＢの喪失（遺伝子欠失）、ならびに株１つ当たり３つの異なるｐｏｒＡ遺伝子の発現のために操作された３つの髄膜炎菌株由来のＯＭＶからなる。本実験では、１つの株由来のＯＭＶ（ＰｏｒＡ亜型１４、１および３を発現する）を担体として使用した。

抗原標的
ＥＶ７１ウイルスを第１の候補として評価した。ＥＶ７１のウイルスタンパク質（ＶＰ１およびＶＰ２）の直鎖エピトープは、文献に十分に記載されている。ＥＶ７１は、手足口病（ＨＦＭＤ）の主な原因であり、アジアでは大きな問題である。ＥＶ７１粒子は、４つのウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１～ＶＰ４によって保護されている単一のＲＮＡ分子から構成され、これらのうちＶＰ１は多くの中和エピトープを含有し、主要な免疫原性カプシドタンパク質として振る舞うため、ＥＶ７１－ＶＰ１がワクチン開発の理想的な標的となる。

ＥＶ７１ウイルスタンパク質１
この研究では、ＥＶ７１－Ｃ４の完全ＶＰ１タンパク質（ＮＣＢＩ受託番号ＪＮ２５６０６２）をＯＭＶにカップリングさせて、ＯＭＶをウイルスワクチン開発のためのプラットフォームとして使用することに関する実現可能性を調査した。ＶＰ１をＮ末端において、精製のための６×ＨＩＳタグに連結し（配列番号２３）、ヒトの抗微生物ペプチド（ＬＬ－３７）またはマウスの抗微生物ペプチド（ｍＣＲＡＭＰ）をＣ末端に結合した。組換えタンパク質の配列をそれぞれ配列番号２４（ＶＰ１－ｍＣＲＡＭＰ）および配列番号２５（ＶＰ１－ＬＬ３７）に示す。完全タンパク質は、Ｃ末端に連結したＬＬ－３７またはｍＣＲＡＭＰを介してＯＭＶと会合すると考えられる。タンパク質の発現を２９３細胞（哺乳動物での発現）および大腸菌（E. Coli）において評価した。

ＨＩＳ－ＶＰ１－ＬＬ－３７タンパク質は２９３－６Ｅ細胞によって首尾良く産生される。約５０ｋＤａの推定分子量が、還元条件下のウェスタンブロット解析によって細胞培養上清および細胞デブリにおいて検出された（データは示していない）。ＬＬ－３７の発現レベルは約０．１～０．５ｍｇ／Ｌであった。ＨＩＳ－ＶＰ１－ＬＬ３７タンパク質のより高い収率が大腸菌（E. Coli）における発現によって達成された。タンパク質は、変性とそれに続くＮｉカラムを使用した１ステップでの精製との後に封入体から得た。概ね０．１４～０．２０ｍｇ／ｍｌの７０～８５％純粋タンパク質が１リットルスケールから回収された。

ペプチド
複数の論文において、マウスにおける免疫化後に抗体を誘導する、ＥＶ７１のＶＰ１およびＶＰ２由来の直鎖ペプチドエピトープ（１～３、５）が記載されている。選ばれたこれらのペプチドを認識する抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもウイルスを中和することができる。ＥＶ７１のいくつかの遺伝子型が公知であるため、本発明者らは選択を行った。この目的に関し、Ｃ４およびＢ４遺伝子型は、過去１０年で生じたアウトブレイクにおいて最も蔓延している。直鎖エピトープのＣ４遺伝子型とＢ４遺伝子型との間のペプチド配列における相違を、この研究で用いたペプチドと共に表１に示す。

これらのペプチドの、末端システイン、ＧＳリンカー、Ｈｉｓタグ、ｍＣＲＡＭＰおよび／またはＬＬ３７と組み合わせた種々の形態を開発した。全てのペプチド（表１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成（Ｐｅｐｓｃａｎ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して合成した。

ペプチドを、ＬＬ３７（またはｍＣＲＡＭＰ）配列を介してＯＭＶに会合させた。ペプチドおよびＶＰ１タンパク質の、２回の免疫化後に中和抗体を誘導する能力（ＯＭＶとの組合せまたはＯＭＶの非存在下）をマウスにおいて評価した。

マウスモデル
ＡＣ５７ＢＬ／６マウスを、クリック－ＯＭＶワクチンのパネルで免疫化した。各群について、１０匹のマウスに、構築したワクチンのそれぞれを用いて２回ワクチン接種し、陽性対照群を不活化ＥＶ７１ウイルスで免疫化した。ワクチン（陽性対照を除く）をＰＢＳ中で混合し、一晩３７℃に保った。翌日（約１８時間）、全てのマウスを免疫化した。この免疫化を４週間後に繰り返した。２回目の免疫化の２週間後に、マウスを屠殺し、血清を全てのマウスから採取した。ワクチン接種スキームおよび実験設定については表２を参照のこと。

結果
ＥＶ７１ ＶＰ１タンパク質に対する抗体のレベル
免疫化したマウスが抗原に対する抗体を産生したか否かを決定するために、初期ＥＬＩＳＡを、ワクチンに存在するＥＶ７１ ＶＰ１タンパク質およびＯＭＶに対して、プールされた血清において実施した。ＯＭＶに対する高いＩｇＧ価は、ＯＭＶで免疫化した群においてのみ検出された（データは示していない）。ＥＶ７１ ＶＰ１タンパク質に対する抗体もまた検出することができた（データは示していない）。ＥＶ７１ ＶＰ１タンパク質コーティングを用いるＥＬＩＳＡを、個々のマウス血清を用いて繰り返した（図３）。ＥＶ７１ ＶＰ１タンパク質に対する総ＩｇＧ応答は、陰性群（ＰＢＳおよびＯＭＶ）がＥＶ７１に対するＩｇＧ抗体を産生しなかったことを示した。陽性群（不活化ＥＶ７１）はＩｇＧ抗体を明確に誘導した。ｍＣＲＡＭＰの存在によってタンパク質をＯＭＶに連結させることは、連結していないタンパク質－ＯＭＶ混合物と比較して、ＶＰ１特異的抗体産生の増加を示した。この増加は、マウスを、タンパク質に連結した、より少ない量のＯＭＶで免疫化した場合、低減した。

ＶＰ１に対する特異的ＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ａのレベルを、誘発された免疫応答の種類に対するさらなる洞察のためにＥＬＩＳＡにおいて決定した。典型的には、ＩｇＧ２Ａ対ＩｇＧ１比の変化は、よりＴｈ１様の応答への変化を表す。大半の群において、サブクラスの抗体価の変化は、ｍＣＲＡＭＰによってＯＭＶに連結させたＶＰ１タンパク質で免疫化したマウスを除いて存在しなかった。これらの群では、ＩｇＧ２Ａ：ＩｇＧ１比の増加が観察された（図４Ａ＋Ｂ）。

ＥＶ７１ウイルス（Ｃ４遺伝子型）に対する抗体のレベル
ＥＬＩＳＡプレートを完全ＥＶ７１ウイルスでコーティングしてＥＬＩＳＡを行って、血清中のウイルス特異的抗体の量を決定した。図５に示す結果から、ウイルスに対する抗体が産生され、同じ全体的パターンの抗体応答が見出されたことが確認される。最も高い力価はＶＰ１ ｍＣＲＡＭＰタンパク質－ＯＭＶワクチンによって誘導された。したがって、マウスにおけるＥＶ７１ウイルスに対する抗体応答の増大は、タンパク質またはペプチドクリック－ＯＭＶワクチンによって誘導することができる。

結論
－ ＯＭＶに結合したペプチドまたはタンパク質は、マウスにおいて抗体応答を増大させる。
－ ｍＣＲＡＭＰを介してＯＭＶに結合したＶＰ１（ＥＶ７１）タンパク質は、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する。

したがって、この動物研究は、ＥＶ７１抗原をＯＭＶプラットフォームにカップリングさせることがＥＶ７１抗原およびウイルスに対する抗体応答を増大させることを実証する。抗微生物ペプチドｍＣＲＡＭＰを介して連結したＶＰ１タンパク質は、結合していないＶＰ１－ＯＭＶワクチンと比較して、ＶＰ１タンパク質および生ウイルスに対する抗体の産生を増加させた。

[実施例３]
本発明者らは、リンカーペプチドを介してＰｒｎをＯＭＶに結合させることによってＰｒｎの免疫原性が増強され得るか否かを調査した。マウスを、抗原単独、ＯＭＶと混合した抗原、またはＯＭＶにカップリングさせた抗原で２回免疫化した。その後、血清中の抗原に対する抗体レベルを測定した。髄膜炎菌（N. meningitidis）ＯＭＶにカップリングさせたＰｒｎにおいて、２つの異なるカップリングペプチド、すなわちマウスｍＣＲＡＭＰおよびヒトＬＬ－３７ペプチドを使用した。

材料および方法
研究物質の投与
ワクチンをｓ．ｃ．注射によりマウスの鼠径部に投与した（総容量２００μＬ）。ワクチン接種は２回とも針およびシリンジを使用して右手側に行った。

血液試料採取
４２日目に、血液を、安楽死の間に網膜動脈を介して個々に標識したチューブに採取した。血液試料を少なくとも３０分間（ただし２４時間以下）室温で放置し、その後、チューブのサイズに応じて、室温でエッペンドルフ遠心機において３５００ｒｐｍで、または室温でＳＬ ４０Ｒ遠心機において１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。血清を個々に標識したチューブに移し、解析まで－２０℃未満で保存した。

抗Ｐｒｎ抗体価の解析
抗Ｐｒｎ抗体の血清レベルを、マルチプレックスフローサイトメトリーイムノアッセイを使用して測定した。

結果の統計解析
群間の統計的有意性の検定を抗Ｐｒｎ抗体価について実施した。群間で生じ得る差を検出するために、クラスカル・ウォリス検定およびダンの検定を使用して実験群をプラセボ処置群と比較して、平均間の有意差を決定した。抗原と混合したＯＭＶで処置した群と、抗原にカップリングしたＯＭＶで処置した群との間で生じ得る差を検出するために、マン・ホイットニーのＵ検定を使用し、結果として得られたｐ値を、多重検定のためにベンジャミニ・ホッホバーグ（Benjamini-Hochberg）法を使用して補正した。ＦＡＣＳデータについては統計解析を実施しなかった。全ての結果は、ｐ＜０．０５の場合に有意とみなした。

結果
血清中の抗Ｐｒｎ価
ＯＭＶを伴わないＰｒｎタンパク質の投与は、抗Ｐｒｎ ＩｇＧの誘導を引き起こさなかった（図６）。Ｐｒｎタンパク質を、ＯＭＶと混合するかまたはｍＣＲＡＭＰを介してＯＭＶとカップリングして投与した場合、抗Ｐｒｎ ＩｇＧレベルは有意に上昇し、これは、カップリング方法が抗原の免疫原性に影響を及ぼさないことを示した。

結論
マウスを、単独か、ＯＭＶと混合したか、またはＯＭＶにカップリングしたボルデテラ・パーツシス（B. pertussis）抗原で免疫化した。ＯＭＶとのＰｒｎタンパク質の投与はすでに抗Ｐｒｎ ＩｇＧの産生を誘導した。ｍＣＲＡＭＰを介したＰｒｎとＯＭＶとのカップリングは、ＯＭＶと混合したＰｒｎと比較して、抗Ｐｒｎ抗体レベルのさらなる上昇をもたらさなかった。これは、髄膜炎菌（N. meningitidis）ＯＭＶのＰｒｎへの付加それ自体がすでにＰｒｎの免疫原性を増加させることを示す。これはまた、カップリング方法が抗原の免疫原性に負に干渉しないことも示す。

[実施例４]
抗原として、Hsieh et al (2020)による論文のＨｅｘａＰｒｏスパイクタンパク質に基づく、６つのプロリン置換を有する融合前状態のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を使用した。ｍＣＲＡＭＰ配列をＣ末端に付加した。ｍＣＲＡＭＰ配列は、一緒に混合した後のスパイクタンパク質とＯＭＶとの自発的会合を可能にする。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンコンセプトの免疫原性を、鼻腔内経路、さらに比較のために筋肉内経路を介した投与後のマウスモデルにおいて試験した。マウスモデルは、これらのＯＭＶワクチンの免疫原性に対する良好な読出しを実現する。防御を測定するために、シリアンハムスターモデルを使用した。シリアンハムスターを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を研究するための種々の動物モデルがこれまでに試験されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モデル開発研究の結果を使用して、本研究における攻撃感染プロトコールを、攻撃経路、用量、および攻撃後の追跡に関して規定し、新規ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン候補の有効性を確立するためにシリアンハムスターモデルの選択を規定した。この場合も、鼻腔内経路と筋肉内経路の両方を比較した。

方法（マウス研究）
免疫化
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、鼻腔内（ｉ．ｎ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）経路を介して０および２１日目に免疫化した。０、２１および３５日目に、血液を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的中和抗体の誘導の評価のために採取した。群はそれぞれ１０匹のマウスからなった。

以下の群を含めた：
１．トリススクロース ｉ．ｎ．
２．ＯＭＶ ｉ．ｎ．
３．スパイク ｉ．ｎ．
４．スパイクｍＣＲＡＭＰ ｉ．ｎ．
５．ＯＭＶ＋スパイク ｉ．ｎ．
６．ＯＭＶ＋スパイクｍＣＲＡＭＰ ｉ．ｎ．
７．トリススクロース ｉ．ｍ．
８．スパイク ｉ．ｍ．
９．スパイクｍＣＲＡＭＰ ｉ．ｍ．
１０．ＯＭＶ＋スパイク ｉ．ｍ．
１１．ＯＭＶ＋スパイクｍＣＲＡＭＰ ｉ．ｍ．

鼻腔内免疫化の場合、２０μｌの接種源を、ピペットを使用して両方の鼻孔に分割した。筋肉内免疫化の場合、５０μｌの接種源を外側大腿に注射した。

使用したＯＭＶ用量は免疫化１回当たり１５μｇのタンパク質であった。使用したスパイクおよびスパイクｍＣＲＡＭＰ用量もまた免疫化１回当たり１５μｇのタンパク質であった。

ＯＭＶを、van de Waterbeemd et al (2013)によって記載されているようにＥＤＴＡ抽出によって単離した。スパイクタンパク質をＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞において発現させ、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐカラムを用いて精製した。

血清学的解析
ウイルス中和（ＶＮ）アッセイを、研究中に採取した試料に対して以下の通り実施した。手短に述べると、試料を３０分間５６度で熱失活した。その後、試料の連続２倍希釈液を、感染培地中、１：５の希釈率で出発して９６ウェルプレートにおいて３連で作製した。次いで、試料希釈液を固定量のウイルス（２００ＴＣＩＤ５０／ウェルまたは４０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）と共に１時間３７度でインキュベートし、アッセイにおける血清の１：１０の出発希釈率を得た。次に、ウイルス－抗体混合物をＶｅｒｏ Ｅ６細胞培養単層を有するプレートに移し、この後に５～６日の３７度でのインキュベーション期間が続いた。その後、プレートを、生存マーカー（vitality marker）ＷＳＴ８を使用してスコア化した。

結果（マウス研究）
ウイルス中和価は、スパイクタンパク質またはスパイクｍＣＲＡＭＰタンパク質のいずれかと組み合わせたＯＭＶを投与された群においてのみ検出され、後者の群は、最も高い力価と最も多い数のレスポンダーとを示した。力価は、スパイクまたはスパイクｍＣＲＡＭＰ単独を投与された群では検出されなかった。全体的な結果は、ｉ．ｎ．およびｉ．ｍ．経路の免疫化後で類似した（図７）。

方法（ハムスター研究）
免疫化
シリアンハムスターを、鼻腔内（ｉ．ｎ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）経路を介して０および２１日目に免疫化した。研究中、動物の体重を測定し、血液を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的中和抗体の誘導の評価のために採取した。２回目の免疫化の３週間後（４２日目）に全ての動物を、ＢｅｔａＣｏＶ／Ｍｕｎｉｃｈ／ＢａｖＰａｔ１／２０２０株の、１０＾４．０ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内攻撃した。

以下の群を含めた：
１．トリススクロース ｉ．ｎ．
２．ＯＭＶ ｉ．ｎ．
３．スパイク ｉ．ｎ．
４．スパイクｍＣＲＡＭＰ ｉ．ｎ．
５．ＯＭＶ＋スパイク ｉ．ｎ．
６．ＯＭＶ＋スパイクｍＣＲＡＭＰ ｉ．ｎ．
７．トリススクロース ｉ．ｍ．
８．ＯＭＶ ｉ．ｍ．
９．スパイク ｉ．ｍ．
１０．スパイクｍＣＲＡＭＰ ｉ．ｍ．
１１．ＯＭＶ＋スパイク ｉ．ｍ．
１２．ＯＭＶ＋スパイクｍＣＲＡＭＰ ｉ．ｍ．

攻撃後４日目に、群１つ当たり半数の動物をイソフルラン麻酔下での放血により屠殺し、剖検を実施し、残りの半数の動物は、攻撃後７日目にそれに続いた。

病理学
剖検時に肉眼所見を実施した。全ての肺葉を検査し、冒された肺組織のパーセンテージを背側から推定し、肉眼所見診断を記載し、左肺葉を１０％ホルマリンで膨らませ、保存した。気管および鼻甲介を肉眼で評価し、ウイルス学および組織病理学のために試料採取した。相対肺重量を算出した。選択した組織の組織病理学的解析を全ての動物に対して実施した。１０％ホルマリンでの固定後、左肺および左鼻甲介の切片ならびに消化管組織の切片をパラフィンに包埋し、組織片を組織学的検査のために染色した。組織病理学的評価には、うっ血、肺気腫、異物の存在、出血、細気管支肺胞の過形成および炎症、ならびに浮腫などの態様が含まれた。４連の１０倍段階希釈液を使用して、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のコンフルエント層におけるウイルス力価を決定した。この目的のために、試料（咽頭スワブおよび組織ホモジネート）の段階希釈液を作製し、Ｖｅｒｏ Ｅ６単層上において１時間３７度でインキュベートした。単層を洗浄し、５または６日間３７度でインキュベートし、生存マーカーＷＳＴ８を使用してＣＰＥについてスコア化した。咽頭スワブおよびホモジナイズ組織試料を使用して、ウイルスＲＮＡをＰＣＲによって検出した。上でマウス血清について記載したように、ウイルス中和価を決定した。

結果（ハムスター研究）
ウイルス中和価は主に、スパイクタンパク質またはスパイクｍＣＲＡＭＰタンパク質のいずれかと組み合わせたＯＭＶを投与された群において検出された。ＯＭＶ＋スパイクｍＣＲＡＭＰを投与された群は、ＯＭＶ＋スパイクよりも高い力価を示した。力価は、ＯＭＶまたはスパイク単独を投与された群では検出されず、ＯＭＶ群を伴わないスパイクｍＣＲＡＭＰ群の一部のマウスにおいて低力価が検出されたのみであった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２での攻撃後、肺病変は、ＯＭＶ＋スパイクおよびＯＭＶ＋スパイクｍＣＲＡＭＰ群ではほとんど検出されなかった。全体的な結果は、ｉ．ｎ．およびｉ．ｍ．経路の免疫化後で類似した（図８および９）。

結論
マウスモデルとハムスターモデルの両方において、ウイルス中和抗体は、スパイクタンパク質がＯＭＶと組み合わされる場合に誘導される。ハムスターモデルでは、ＯＭＶと組み合わせたスパイクタンパク質を用いてワクチン接種を行った場合、肺病変は攻撃後ほとんど見出されない。Ｃ末端ｍＣＲＡＭＰタグの付加は両方のモデルにおいて防御応答を増大させる。全体として、これらのデータは、（ｉ）ナイセリア（Neisseria）ＯＭＶがＣｏｖｉｄ－１９スパイクタンパク質に効果的なアジュバント／送達系であること、および（ｉｉ）ｍＣＲＡＭＰタグによるＯＭＶ会合の増加が防御応答を向上させることを示す。

参考文献

Claims (16)

1. 外膜小胞（ＯＭＶ）、脊椎動物の抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）、および抗原の複合体であって、前記ＡＭＰが非共有結合によって前記ＯＭＶと複合体形成しており、かつ、前記抗原が前記ＡＭＰにコンジュゲートしている、前記複合体。
2. 前記抗原が、前記抗原および前記ＡＭＰを単一のポリペプチド鎖に含む融合タンパク質中において前記ＡＭＰに共有結合している、請求項１に記載の複合体。
3. 前記ＡＭＰが、カテリシジン、好ましくは非ヒトカテリシジン、さらに好ましくはｍＣＲＡＭＰである、請求項１または２に記載の複合体。
4. 前記抗原が、感染性疾患および／または腫瘍に関連する抗原である、請求項１～３のいずれか一項に記載の複合体。
5. 前記ＯＭＶが、界面活性剤で抽出されたＯＭＶではなく、好ましくは、前記ＯＭＶが、自然に生じるＯＭＶまたはネイティブなＯＭＶであり、好ましくはネイティブなＯＭＶである、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体。
6. 前記ＯＭＶが、少なくとも部分的に毒性除去されたＬＰＳを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の複合体。
7. 前記ＯＭＶがグラム陰性細菌から得ることができ、かつ、前記グラム陰性細菌が、
   ａ）毒性が低減したＬＰＳを前記細菌に産生させる遺伝子改変であって、好ましくは、ｌｐｘＬ１、ｌｐｘＬ２、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＤ、およびｌｐｘＫ遺伝子、もしくはこれらのホモログのうちの少なくとも１つの発現を低減させるもしくはまたはなくす、ならびに／または、ｌｐｘＰ、ｌｐｘＥ、ｌｐｘＦ、およびｐａｇＬ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を増大させる遺伝子改変、ならびに
   ｂ）小胞の形成を増大させる遺伝子改変であって、好ましくは、ｏｍｐＡ遺伝子またはこれらのホモログ、さらに好ましくはｒｍｐＭ遺伝子またはこれらのホモログの発現を低減させるまたはなくす遺伝子改変
   のうちの少なくとも１つを好ましくは含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の複合体。
8. 前記グラム陰性細菌が、ナイセリア属（Neisseria）、ボルデテラ属（Bordetella）、大腸菌属（Escherichia）、およびサルモネラ属（Salmonella）からなる群から選択される属に属し、好ましくは、前記細菌が、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、大腸菌（Escherichia colｉ）、およびサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）からなる群から選択される属に属する、請求項７に記載の複合体。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の複合体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
10. 医薬として使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の複合体または請求項９に記載の医薬組成物。
11. 抗原に対する対象における免疫応答の誘導または刺激を含む処置において使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載に記載の複合体または請求項９に記載の医薬組成物。
12. 鼻腔内にまたは筋肉内に投与される、請求項１０または１１に記載の使用のための複合体。
13. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＭＰにコンジュゲートした抗原であって、好ましくは、前記ＡＭＰにコンジュゲートした前記抗原が、請求項２～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質である、前記抗原。
14. 請求項２～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
15. 請求項２～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する宿主細胞であって、好ましくは請求項１４に記載の核酸を含む、前記宿主細胞。
16. 請求項１～８のいずれか一項に記載の複合体を産生するための方法であって、
    ｉ）請求項７または８に記載のグラム陰性細菌の集団をＯＭＶの産生に有利な条件下で培養するステップ、
    ｉｉ）ｉ）で産生された前記ＯＭＶを回収するステップ、
    ｉｉｉ）ｉｉ）で回収された前記ＯＭＶを、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原にコンジュゲートしたＡＭＰと、前記ＡＭＰと前記ＯＭＶとの間の非共有結合複合体の形成に有利な条件下で接触させるステップ、および
    ｖｉ）必要に応じて、前記複合体を回収するステップ
    を含む、前記方法。
    

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