CN1697841A - 具有改善的水中稳定性的修饰的糖类 - Google Patents
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Abstract
一种修饰的多糖，尤其是修饰的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A多糖，它保留了免疫原性但具有提高的稳定性。通常，该修饰的多糖是通过使荚膜多糖或其寡糖片段与双功能试剂如CDI反应，接着与氨基化合物如二甲基胺反应而制备。还叙述了修饰的多糖－蛋白质缀合物和从这样的缀合物制备的疫苗。
Description
所有引述在此的文件都全部结合引为参考。
发明领域
本发明属于多糖化学领域，涉及修饰的糖类、其制备的方法和缀合的衍生物。具体地，本发明涉及具有改善的水中稳定性的修饰的糖类。
发明背景
多糖是重要的生物分子，它们已经广泛应用在制药工业中，用于疾病的预防和治疗。例如，多年来荚膜多糖已经应用在对抗荚膜细菌，如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)和Hib(B型流感嗜血杆菌)(Haemophilus influenzae type B)的疫苗中。
为了提高这些多糖的免疫原性，尤其是在儿童中提高这些多糖的免疫原性，已开发了缀合疫苗。它们包含缀合在载体蛋白质上的荚膜多糖[如，参考文献1、2、3]。缀合作用能使得T-非依赖性的抗原转变为T-依赖性的抗原。
许多类型的多糖的问题是其在水中的稳定性差。多糖在水中的稳定性取决于连接糖单元的O-糖苷键的性质。水中的稳定性差是由于O-糖苷键在酸或糖苷酶存在下容易发生水解。血型A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖是水中稳定性差的多糖的一个例子。
多糖的稳定性是在生产缀合疫苗中的一个特殊问题。为了制备多糖-蛋白质缀合物，需要对多糖的官能团进行化学操作，使得多糖能被连接到蛋白质上。多糖或者可以直接连接到蛋白质上[2、4]，或者可通过连接基来连接。已经提出了许多不同类型的连接基用来将多糖连接到蛋白质上[如3、5]。
将多糖暴露于化学试剂，特别是酸，可能导致不希望的糖苷键断裂，接着发生多糖的片段化。这样的片段化是极不希望发生的，它降低了多糖-蛋白质缀合物合成的产率。
在这种情况下不稳定的多糖一般需要小心选择试剂和反应条件以克服上述的问题。然而，这限制了可用于操作多糖的试剂，因而限制了多糖和载体蛋白质之间的可能形成的键联的范围。此外，这些多糖的不稳定性意味着难以开发出有效的可用于工业规模制备疫苗的操作程序。
本发明公开的内容
本发明基于以下的发现：荚膜糖的单糖单元上的羟基的修饰可提高其稳定性。用本发明方法得到的修饰的糖较其相应的未修饰的糖对水解更稳定。
本发明的修饰的糖
本发明提供经修饰的荚膜糖，它在相应的未经修饰的荚膜糖至少一个单糖单元羟基位置上包含封闭基团(blocking group)。
术语“修饰的荚膜糖”指通过适当的修饰可以从未修饰的荚膜糖得到的糖。因此，在本发明的修饰的荚膜糖中保留了未修饰的荚膜糖的重复单糖单元的基本序列。
术语“糖”包括寡糖(如含有2-39个单糖单元)和多糖(如含有40个或更多单糖单元)。如在细菌中天然发现的，未修饰的荚膜糖一般采取多糖的形式。多糖经过操作可以产生比较短的寡糖。寡糖可通过天然多糖的纯化和/或剪裁(如温和酸水解、加热、分级色谱等)得到。
通常，本发明修饰的糖类是寡糖。寡糖可通过上述的任何一个剪裁方法从多糖得到。
本发明修饰的荚膜糖可从天然荚膜糖得到。然而，本发明不限于从天然荚膜糖得到的修饰糖。本发明修饰的荚膜糖可通过其它方法如全合成或部分合成得到。
在本发明中，具有封闭基团的单糖单元的数目是可变的。例如，相应荚膜糖的全部或基本上全部单糖单元可以具有封闭集团。或者，相应荚膜糖的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的单糖单元可具有封闭基团。相应荚膜糖的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个单糖单元可具有封闭基团。
同样，在单糖单元上的封闭基团的数目也是可以变化的。例如，单糖单元上的封闭基团的数目可以是1、2、3、4、5或6个，优选1-4个，更优选1-2个。
在一个实施方案中，具有封闭基团的至少一个单糖单元是非末端单糖单元。术语“非末端单糖单元”指在寡糖/多糖链中不是末端单糖单元之一的单糖单元。
本发明包含修饰的荚膜糖，其中末端和非末端单糖单元的全部羟基位置都有封闭基团。然而，优选的是在本发明的修饰的荚膜糖中至少有一个自由的羟基或氨基。有一个自由的羟基或氨基是有利的，因为它为修饰的荚膜糖提供了进一步反应(如缀合到载体分子上)的反应点。当修饰的糖含有自由羟基时，优选它是异头羟基，更优选是末端异头羟基。当修饰的糖含有氨基时，优选它是由异头羟基衍生的。通过还原性胺化反应(例如用NaBH3CN/NH4Cl)容易从异头羟基得到氨基。
术语“氨基”包括式-NH2或-NH-E(其中E是氮保护基(protecting group))的基团。典型的氮保护基的例子在下面叙述。
术语“封闭基团”指任何能封闭羟基的反应性的基团。熟练人员应知道许多不同类型的封闭基团。对羟基的优选的封闭基团是那些可通过用另一个基团取代羟基氢原子，即通过羟基的衍生化反应直接得到的基团。合适的作为封闭基团的羟基衍生物是例如氨基甲酸酯、磺酸酯、碳酸酯、酯、醚(如硅基醚或烷基醚)和缩醛。这种封闭基团的一些具体例子是烯丙基、Aloc、苄基、BOM、叔丁基、三苯甲基、TBS、TBDPS、TES、TMS、TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、H和THP。
然而，封闭基团不一定要通过羟基的衍生化反应得到。封闭基团可以完全取代羟基。例如，封闭基团可以是C1-12烷基、C3-12烷基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基、NR1R2(R1和R2如下定义)、H、F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3、CCl3等。
优选的是，封闭基团是吸电子基团。不希望被理论束缚，但相信糖苷键对水解不稳定是由于受到糖羟基对糖苷键的分子内亲核进攻(即形成环状中间体)的帮助。羟基的亲核性越大，分子内亲核进攻的倾向就越大。吸电子的封闭基团具有使氧孤对电子离域化的作用，因此降低氧的亲核性，降级分子内亲核进攻的倾向。
优选的，封闭基团具有下式：
-O-X-Y或-OR3
其中
X是C(O)、S(O)或SO2；
Y是C1-12烷基、C1-12烷氧基、C3-12环烷基、C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基，它们的每一个都可任选被1、2或3个选自F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3、CCl3的基团取代；或Y是NR1R2；
R1和R2独立选自H、C1-12烷基、C3-12环烷基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基；或R1和R2结合在一起形成C3-12饱和杂环基团；
R3是C1-12烷基或C3-12环烷基，各可任选被1、2或3个选自F、Cl、Br、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3的基团取代；或R3是C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基，各可任选被1、2、3、4或5个选自F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3、CCl3的基团取代；
优选，当R3是C1-12烷基或C3-12环烷基时，它被1、2或3个如上定义的基团取代。
式-O-X-Y或OR3的封闭基团可通过标准的衍生化程序从羟基制备，如羟基与酰卤、烷基卤化物、磺酰卤等反应。因此，-O-X-Y中的氧原子羟基的氧原子，同时-O-X-Y中的-X-Y基团较好取代羟基的氢原子。
或者，封闭基团可通过取代反应得到，如Mitsunobu取代。从羟基制备封闭基团的这些和其它方法是公知的。
更优选的是，封闭基团是-OC(O)CF3[6]或-OC(O)NR1R2。
更优选的是，封闭基团是式-OC(O)NR1R2的氨基甲酸酯基团，其中R1和R2独立选自C1-6烷基。更优选R1和R2都是甲基，即封闭基团是-OC(O)NMe2。
氨基甲酸酯封闭基团对糖苷键有稳定化作用，并可在温和的条件下制备。然而，本发明不限于通过在此举例的方法制备的修饰的糖，其它用于制备本发明修饰的糖的方法对熟练人员也是显而易见的。
术语“烷基”在此用来表示直链和分支形式的烷基基团。烷基中可以插入1、2或3个选自-O-、-NH-或-S-的杂原子。烷基中也可以插入1、2或3个双键和/或三键。但是，术语“烷基”通常表示没有杂原子插入或没有双键或三键插入的烷基。当说到C1-12烷基时，它是指可以含有在1和12之间的任何数目的碳原子的烷基(如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。同样，当说到C1-6烷基时，它是指可以含有在1和6之间的任何数目的碳原子的烷基(如C1、C2、C3、C4、C5、C6)。
术语“环烷基”包括环烷基、多环烷基和环烯基，以及这些基团与烷基的组合，如环烷基烷基。烷基可被1、2或3个选自-O-、-NH-或-S-的杂原子插入。但是，术语“环烷基”通常表示没有杂原子插入的环烷基。环烷基的例子包括环戊基、环己基、环己烯基、环己基甲基和金刚烷基。当说到C3-12环烷基时，它是指环烷基可含有3和12之间的任何数目的碳原子(如C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。
术语“芳基”在此指芳族基团，如苯基或萘基。当说到C5-12芳基时，它是指芳基可以含有5和12之间的任何数目的碳原子(如C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。
术语“C5-12芳基-C1-6烷基”指如苄基、苯乙基和萘甲基的基团。
当R1和R2结合起来形成C3-12饱和杂环基团时，它是指R1和R2与氮原子一起形成含有3和12之间的任何数目的碳原子(如C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)饱和的杂环基团。杂环基团可含有1或2个氮原子以外的杂原子(如N、O或S)。C3-12饱和杂环基团的例子是吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、咪唑烷基、氮杂环丁烷基和氮杂环丙烷基。
在上述所有的实施方案中，修饰的荚膜糖优选是具有磷酸二酯键的修饰的荚膜糖。更优选的，修饰的荚膜糖是修饰的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A糖。脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A糖对水解是特别不稳定的。
当修饰的荚膜糖是修饰的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A糖时，封闭基团优选是在相应的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A糖的4和/或3位，更优选4位。封闭基团在4-和/或3位的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A糖已经显示出对于提高对水解稳定性特别有效。
本发明还提供下式的糖：
其中
T有如式(A)或(B)：
n是1-100的整数；
各个Z独立选自-OH或如上定义的封闭基团；
各个Q独立选自-OH或如上定义的封闭基团；
W选自-OH或如上定义的封闭基团；
V选自-NH2、-NHE、-NE1E2、-OH或-O-D，其中E、E1和E2是氮保护基，它们可以相同或不同，D是氧保护基；
其中约7％以上(如8％、9％、10％或更多)的Q是封闭基团；
优选n是15-25的整数；
各个n+2个Z基团可以相同或彼此不同。同样，各个n+2个Q基团可以相同或彼此不同；
V优选是-NH2-或NHE。
合适的氮保护基是硅烷基(如TMS、TES、TBS、TIPS)、酰基衍生物(如三氟乙酰胺、甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Z或Cbz)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、2-(三甲基硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧基羰基(Alloc)、2，2，2-三氯乙氧基羰基(Troc))、磺酰基衍生物(如a-三甲基硅烷基乙烷磺酰基(SES))、亚磺酰基衍生物、C1-12烷基、苄基、二苯甲基、三苯甲基、烯丙基、9-苯基芴基等。优选的氮保护基是Fmoc。
二价的蛋保护基可表示为E1E2，包括环酰亚胺衍生物(如N-邻苯二甲酰亚胺、N-二杂杂琥珀酰亚胺、N-2，3-二苯基马来酰亚胺)、亚胺衍生物(如N-1，1-二夹击硫代亚甲基胺、N-亚苄基胺、N-对甲氧基亚苄基胺、N-二苯基亚甲基胺)、烯胺衍生物(如N-(5，5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺)等。优选的二价氮保护基是N-邻苯二甲酰亚氨基。
合适的氧保护基包括酯、醚(如硅基醚或烷基醚)和缩醛。具体例子包括烯丙基、乙酰基、Aloc、苄基、苄氧基甲基(BOM)、叔丁基、三苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基(TBS)、叔丁基二苯基硅烷基(TBDPS)、三乙基硅烷基(TES)、三甲基硅烷基(TMD)、三异丙基硅烷基(TIPS)、对甲氧基苄基(PMB)、MEM、甲氧基甲基(MOM)、MTM和四氢吡喃基(THP)。
所有的Z可以是OH。或者，至少10％、20％、30％、40％、50％或60％的Z基团可以是OAc。优选约70％的Z是OAc，其它的Z基团是OH或上面定义的封闭基团。
至少7％的Q基团是封闭基团。优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的Q基团是封闭基团。或者所有的Q基团可以是封闭基团。
本发明还提供包含下式糖的分子：
其中
T是式(A)或(B)：
n、Z、Q和W如上定义，L是O、NH、NE、S或Se。
L的自由共价键可与任何合适的部分连接，如与-H、-E、连接基、蛋白质载体等。L优选是N或O。L也可能是N，连接到二价连接基、二价保护基或二价蛋白质载体上。
产生修饰的糖的方法
本发明提供修饰荚膜糖的方法，包含下列步骤：
(a)提供在单糖单元上具有至少一个羟基的荚膜糖；
(b)将所述至少一个羟基转化为封闭基团。
封闭基团可以是上面定义的任何封闭基团。
荚膜糖可以是天然的荚膜糖(寡糖或多糖)。作为替代，荚膜糖可以是例如脱-O-乙酰基的荚膜糖和/或具有末端氨基的荚膜糖(如通过还原性胺化得到的)。
一种优选的修饰糖的方法(其中封闭基团是-OC(O)NR1R2)是步骤(b)包含下列步骤：
(b1)使荚膜糖在有机溶剂中与双功能试剂反应；
(b2)使步骤(b1)的产物式(I)的氨基化合物反应：
HNR1R2 (I)
其中R1和R2如上定义。
术语“双功能试剂“指能够发挥双重功能的任何试剂：(i)在步骤(b1)提供第一亲电碳原子，用于与糖的羟基偶合；(ii)提供第二亲电碳原子，用于在步骤(b2)中与氨基偶合。一般，第二亲核碳原子在步骤(b)中从第一亲核碳原子再生。双功能试剂在多糖和氨基化合物之间提供-C(O)-键连。
本发明使用的双功能试剂包括但不限于1，1’-羰基二咪唑(CDI)、羰基二-1，2，4-三唑(CDT)、羰基二-1，2，3-苯并三唑(CDB)、碳酸二苯酯、溴化氰、光气或三光气。熟练人员应知道能够起相同作用的其它双功能试剂。
优选的双功能试剂是CDI。CDI的优点是比例如光气或溴化氰温和。特别是，使用DCI的偶合反应不会产生氢卤酸气体如HCl或HBr。HCl或HBr气体的产生是不利的，因为这些气体要求净化反应室出口以避免它们逃逸入大气中。而且，HCl或HBr的产生可能影响糖的敏感官能团，发生糖的分解或片段化，引起产率下降。
用于步骤(b1)的有机溶剂优选是非质子溶剂。非质子溶剂是本领域技术人员熟知的，不包含任何可离解的氢原子。这些溶剂是有利的，因为它们通过增强羟基的亲核性而促进糖羟基与双功能试剂的反应。合适的非质子溶剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、六甲基磷三酰胺(HMPT)、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)、二甲基乙酰胺(DMAC)或六甲基磷酰胺(HMPA)。DMSO是优选的。
在本发明方法的步骤(b2)中，步骤(b1)的产物与氨基化合物反应，形成修饰的多糖。用于本发明方法的氨基化合物是式(I)化合物，如上定义。在式(I)中，R1和R2独立选自C1-6烷基。更优选R1和R2都是甲基。
可用于本发明的合适的只能机化合物是甲基胺、二甲基胺、乙基胺、N-乙基甲基胺、二乙基胺、N-甲基丙基胺、N-乙基丙基胺、异丙基胺、丁基胺、N-甲基丁基胺、N-乙基丁基胺、N-丙基丁基胺、N-甲基环戊基胺、N-乙基环戊基胺、环己基胺、N-甲基环己基胺、N-乙基环己基胺、苄基胺、N-乙基苄基胺、N-甲基苄基胺、异丁基胺、叔丁基胺、环戊基胺、二苄基胺、吡咯烷、哌啶、吗啉、哌嗪、咪唑烷、氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、苯胺、N-甲基苯胺和N-乙基苯胺。它们可以以盐的形式使用(如盐酸盐)。
本发明使用的氨基化合物优选是仲胺，更优选二甲基胺。
本发明的优选方法示例如下图：
流程1
在该图中，用DCI在DMSO溶剂中通过单糖单元上的至少一个羟基使糖(如MenA多糖或寡糖)首先活化。生成的咪唑氨基甲酸酯中间体用胺R1R2NH(如二甲基胺)捕获，产生修饰的糖。
或者，修饰的糖可以通过使荚膜糖的一个或多个羟基与式XC(O)NR1R2的试剂反应用一步方法制备，其中X是离去基团，R1和R2如上定义。合适的离去基团包括但不限于-Cl、-Br、-CF3、-OC6F5或CCl3。
或者，本发明的修饰的荚膜糖可以通过合成方法，例如，从合适的单糖单元制备。通常，修饰的荚膜糖的全合成包含在合适的单糖单元之间形成糖苷键连(如磷酸二酯键)，然后用上述的任何方法修饰得到的糖。或者，可在形成糖苷键连之前修饰单糖单元，得到相同的修饰的荚膜糖。
本发明的修饰的荚膜糖优选是寡糖。从天然的荚膜多糖开始，可通过以下两个方法之一得到修饰的荚膜寡糖：(1)修饰荚膜多糖，接着裁剪修饰的多糖，形成修饰的寡糖；(2)裁剪荚膜多糖，接着修饰得到的寡糖，形成修饰的寡糖。两种方法都包括在本发明中。但是，第一种方法是优选的，因为该方法确保得到末端羟基，以便用于随后将修饰的寡糖与载体分子如蛋白质进行缀合。
本发明还提供修饰脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A多糖的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A多糖；
(b)裁剪所述多糖，以提供寡糖；和
(c)将寡糖的至少一个羟基转化为封闭基团，如上述。
本方法的步骤(b)可在步骤(c)之前任选进行已知的衍生化步骤。已知的衍生化步骤包括，例如，还原性胺化接着保护生成的氨基和/或脱-O-乙酰基。
本发明还提供修饰脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A多糖的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A多糖；
(b)将多糖的至少一个羟基转化为封闭基团，如上所述；和
(c)裁剪所述多糖，以提供寡糖。
本方法的步骤(c)可任选进行已知的衍生化步骤。已知的衍生化步骤包括，例如，还原性胺化接着保护生成的氨基和/或脱-O-乙酰基。
上述方法的任何一个可接着进行除去污染物(如低分子量污染物)的步骤。
荚膜糖起始材料
本发明修饰的荚膜糖可从天然的荚膜糖得到。术语“天然的荚膜糖”指含糖的聚合物(如糖的聚合物、糖酸、氨基糖、多羟基醇、糖醇和糖磷酸酯等)，它们可从细菌的荚膜中发现。细菌包括格兰氏阳性菌和格兰氏阴性菌，如脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)，肺炎链球菌(S.pneumoniae)和流感嗜血杆菌H.influenzea。而且，“天然的荚膜糖”既包括多糖也包括寡糖。天然的荚膜寡糖可通过剪裁天然多糖得到。
天然荚膜糖的“羟基位置”是天然荚膜糖具有羟基的位置。然而，它不包括苷键的位置，或其具有羟基的残基的位置(如作为磷酸酯键一部分的羟基不占据羟基位置)。它也不包括末端单糖单元异头羟基所占的位置。天然荚膜糖上存在乙酰氧基(AcO)的位置也不是羟基位置。
天然荚膜糖可包含通过磷酸二酯键连接的糖单元。包含磷酸二酯键的糖对水解是不稳定的。
天然荚膜糖和本发明修饰的荚膜糖优选在哺乳动物(如人)中是致免疫的。哺乳动物可以是成年人或儿童。
天然荚膜糖优选是从以下细菌得到的多糖(或其寡糖片段)：脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningotidis)(包括血清组A、B、C、W135和Y)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)(包括血清型1、4、5、6B、9V、14、18C、19F和23F)、B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)、淋病双球菌(Neisseria gonorrhoeae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、伤寒杆菌(Salmonella typhi)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和/或绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginisa)。
虽然本发明可应用于任何血清型的脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)，但优选使用从血清型A(“MenA”)得到的荚膜糖。MenA荚膜糖在水溶液中特别不稳定，这意味着对这个分子进行化学操作(如缀合到载体蛋白质上)需要用特殊的操作程序。但是，按照本发明修饰的MenA糖在水溶液中是很稳定的。
MenA荚膜多糖{→6-D-ManpNAc(3/4OAc)-α(1→OPO3)→}是由N-乙酰基甘露糖胺残基通过α1-6磷酸二酯键连接在一起而构成的，具有如下所示的重复单元。
按照上面的定义，93％的4-位是羟基位置，30％的3-位是羟基位置。末端1-羟基也占据一个羟基位置。该末端1-位羟基是个末端异头羟基。作为-OP(O)(OH)O-的一部分的羟基不是羟基位置。
糖-蛋白质缀合物
本发明修饰的糖可以进行任何对于糖类常见的下游加工(如衍生化、缀合、片段化等)。为了提高免疫原性，本发明修饰的糖优选与载体蛋白质缀合。与载体蛋白质的缀合对于儿科疫苗特别有用[7]并且是公知的技术[如参考文献8-16等所综述的]。
因此本发明提供蛋白质和本发明修饰的糖的缀合物。蛋白质可直接与糖缀合，或可使用连接基。可以使用任何合适的连接基化学。修饰的多糖的改善了的稳定性有利地允许使用各种各样的联接。
如上所述，优选修饰的荚膜糖具有至少一个自由的羟基或氨基，可用作随后与载体蛋白质连接的连接点。
具有自由羟基的修饰的荚膜糖可通过选择性地封闭荚膜糖上的羟基得到，或通过使所有的羟基都被封闭的修饰的荚膜糖选择性地脱封闭而得到。或者，可通过剪裁修饰的荚膜糖得到自由羟基。优选的是，至少一个羟基是末端异头羟基。末端异头羟基优选作为自由羟基，是因为末端异头羟基可通过剪裁修饰的荚膜糖而释放。
具有自由氨基的修饰的荚膜糖可通过末端异头羟基的还原性胺化而得到，任选接着保护生成的-NH2。还原性胺化反应可在本发明的修饰步骤之前或之后进行。还原性胺化反应优选在本发明的修饰步骤之前进行，因为生成的羟基可羟基/封闭基团的存在下选择性地保护/去保护。
与蛋白质的直接连接可包含多糖的氧化，接着与蛋白质进行还原性胺化，如在参考文献2和4中叙述的。
通过连接基的连接可用任何已知的程序进行，例如，在参考文献3和5中叙述的程序。优选的连接类型是羰基连接基，它可通过修饰的糖的自由羟基与DCI[17，18]反应，接着与蛋白质反应，形成氨基甲酸酯键连。另一个优选的连接类型是己二酸连接基，它可通过使修饰的糖上的自由氨基与己二酸偶合而形成(例如，用二酰亚胺活化)，然后使蛋白质与生成的糖-己二酸中间体偶合[12，19，20]。其它连接基包括B-丙酰氨基[21]、硝基苯基-乙基胺[22]、卤代酰卤[23]、苷键[24]、6-氨基己酸[25]、ADH[26]、C4-C12链段[27]等。
缀合反应可涉及：异头碳端基还原为伯羟基，伯羟基的任选保护/去保护；伯羟基与CDI反应，形成CDI氨基甲酸酯中间体；CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质的氨基偶合。
图2表示两个不同的例子，说明按照本发明荚膜糖如何与载体蛋白质缀合。在第一个例子总，蛋白质通过末端羟基缀合。在第二个例子中，蛋白质通过末端氨基连接。
流程2
优选的蛋白质是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。这些是在缀合疫苗中常用的。CRM197白喉类毒素是特别优选的[28]。其它合适的载体蛋白质包括脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)外膜蛋白[29]、合成的肽[30，31]、热休克蛋白质[32，33]、百日咳蛋白质[34，35]、从流感嗜血杆菌得到的蛋白质D[36]、细胞因子[37]、淋巴因子[37]、激素[37]、生长因子[37]、从C difficile得到的毒素A或B[38]、铁-摄入蛋白[39]等。
缀合后，可分离游离的和缀合的糖。有许多合适的方法，包括疏水性色谱、切线超过滤、渗滤等。[见参考文献40，41等]
一个载体蛋白质可以携带多个不同的糖[42]。
药物组合物和方法
本发明提供药物组合物，它包含(a)本发明修饰的糖和/或本发明的缀合物，和(b)药学上可接受的载体。
当存在缀合物时，组合物还可包含游离的载体蛋白质[43]。
“药学上可接受的载体”包括任何载体，它本身不会诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体。合适的载体通常是大的缓慢代谢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖[44]、脂质聚集体(如油的小滴或脂质体)和灭活的病毒粒子。这些载体是本领域技术人员公知的。疫苗还可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。另外，还可含有辅助物质，如润饰剂或乳化剂、pH缓冲物质等。在Remington的《制药科学》(Pharmaceutical Sciences)中对药学上可接受的赋形剂有详细的讨论。
通常，组合物被配制为可注射物(液体溶液或悬浮液)；也可制成固体形式，适用于在注射前溶解于或悬浮于液体载体中。制剂也可乳化或包封在脂质体中以提高佐剂的作用。组合物的直接输送一般是胃肠外的(如通过皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内的注射，或输送到组织的间隙空间)。组合物也可施用到伤口。其它的给药方式包括口服和肺给药、直肠(栓剂)和透皮或透表皮应用[如参考文献45]、针和下舌喷雾(hypospray)。药剂治疗可以是单剂或多剂方案(如包括加强剂量)。
本发明组合物优选是灭菌的、缓冲的和/或无热源的。
组合物优选是致免疫组合物(如疫苗)。基于糖类或糖-蛋白质缀合物的疫苗在本领域是公知的。
致免疫组合物包含免疫学有效量的糖抗原，以及(如果需要的话)任何其它特定的组分。“免疫学有效量”是指将该量给予个体(以单剂或作为一系列的部分)时，对于治疗或预防是有效的。该量根据要治疗的个体的健康和身体状况、年龄、要治疗的个体的生物学分类(如非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、需要保护的程度、疫苗的配方、治疗医生的医学状况的评价、以及其它因素而变化。希望的是该量能有相对广大的范围并能通过日常的试验来确定。药剂治疗可以是单剂方案或多剂方案(如包括加强剂量)。疫苗可以和其它免疫调节剂联合给予。致免疫组合物可包括佐剂。优选的提高组合物功效的佐剂包括但不限于：(A)铝化合物，如氢氧化铝(如氢氧化合物)、磷酸铝(如羟磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸铝等[如见参考文献46的第8和9章]或不同的铝化合物的混合物，优选这些化合物具有任何合适的形式(如凝胶、结晶、无定形等)，并优选吸附的；(B)MF59(5％角鲨烯、0.5％Tween80和0.5％Span 85，用微量流化器配制成亚微米颗粒)[见参考文献46的第10章；也见参考文献47]；(C)脂质体[见参考文献46的第13、14章]；(D)ISCOM[见参考文献46的第23章]，它可以其它的洗涤剂[48]；(E)SAF，含10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％pluronic-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流化为亚微米乳液或涡旋产生较大粒度的乳液[见参考文献46的第12章]；(F)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)，含2％角鲨烯、0.2％Tween 80和一种或多种细菌细胞壁组分，选自单磷脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；(G)皂苷佐剂，如quiA或QS21[见参考文献46的第22章]，也称为StimulonTM；(H)脱乙酰几丁质[如49]；(I)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(J)细胞因子如白细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如干扰素-α)、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子等[见参考文献46的第27和28章]；(K)微颗粒(即直径为约lOOnm到约150im，更优选约200nm到30im，最优选约500nm到约lOim)，它是从可生物降解的无毒的材料(如聚α-羟基酸、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)制成；(L)单磷脂A(MPL)或3-O-脱酰基的MPL(3dMPL)[如参考文献46的第2l章]；(M)3dMPL与例如QS2l和/或油包水乳液的组合[50]；(N)包含CpG基元的，即含至少一个CG二核苷酸的寡核苷酸[51]，任选用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，和/或CI基元；(O)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯[52]；(P)聚氧乙烯失水山梨糖酯表面活性剂与辛苯昔醇[53]的组合，或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯昔醇的组合[54]；(Q)免疫刺激的寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)和皂苷[55]；免疫刺激剂和金属盐的颗粒[56]；(S)皂苷和水包油乳液[57]；(T)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+甾醇)[58]；(U)大肠杆菌热不稳定的内毒素(”LT”)，或其去毒化的变异株，如K63或R72变异株[如参考文献59的第5章]；和(W)单磷脂A模拟物，如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[60]；(X)聚磷腈(PCPP)；(Y)生物黏合剂[61]如酯化的透明质酸微球[62]或粘黏合剂(选自聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、多糖或羧甲基纤维素的交链衍生物；或(Z)起免疫刺激剂的作用提高组合物效力的其它物质[如见参考文献46的第7章]。矾(特别是磷酸铝和/或氢氧化铝)是优选的佐剂。
胞壁酰肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基-乙基胺MTP-PE)等。
配制好了以后，本发明组合物可直接给予受试者。要治疗的受试者可以是动物；特别是可以治疗人受试者。本疫苗对于免疫儿童和少年是特别有用的。
本发明疫苗可用于预防(即预防感染)或治疗(即治疗感染后的疾病)，但通常用于预防。
除了修饰的糖以外，本组合物还可包含其它抗原性组分。例如，组合物可包括一种或多种其它糖类(无论是否按照本发明进行修饰)。例如，组合物可包含脑膜炎奈瑟氏球菌的血清组C、W135和Y的糖类(如除了修饰的MenA糖以外)。这些通常缀合到载体蛋白质上，并且从脑膜炎奈瑟氏球菌的不同血清型得到的糖类可以缀合到相同的或不同的载体蛋白质上。当混合物包含从血清组A和C得到的荚膜糖时，优选MenA糖∶MenC糖的比(w/w)大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。当MenA组分对MenC组分以过量(质量/剂)存在时，观察到了MenA组分提高免疫原性的作用[63]。
组合物还可包含蛋白质抗原。
可包括在本发明组合物中的抗原包括：
—从幽门螺旋杆菌Helicobacter pylori得到的抗原，如CagA[64-67]、VacA[68，69]、NAP[70，71，72]、HopX[如73]、HopY[如73]和/或尿素酶。
—从脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清组B得到的蛋白质抗原，如在参考文献74-80中的那些，特别优选蛋白质‘287’(见下)和衍生物(如‘AG287’)。
—从脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清组B制备的外膜囊泡(OMV)制剂，如在参考文献81，82，83，84中公开的那些，等等。
—从脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清组C得到的糖抗原，如公开在参考文献85从血清组C的寡糖[也见参考文献86]。
—从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[如87，88，89]。
—从甲型肝炎病毒的抗原，如灭活的病毒[如90，91]。
—从乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或芯核抗原[如91，92]。
—从丙型肝炎的抗原[如93]。
—从百日咳杆菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳全毒素(PT)和从百日咳杆菌的丝状血凝素(FHA)，任选还与pertactin和/或凝集原2和3组合[如参考文献94，95]。
—白喉抗原，如白喉类毒素[如参考文献96的第3章]如CRM197变异株[如97]。
—破伤风抗原，如破伤风类毒素[如参考文献96的第4章]。
—从流感嗜血杆菌B(Hemophilus influenzae B)得到的糖抗原[如86]。
—从淋病双球菌(N.gonorrhoeae)得到的抗原[如74，75，76]。
—从肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)得到的抗原[如98，99，100，101，102，103，104]。
—从沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)得到的抗原[如105]。
—从牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)得到的抗原[如106]。
—脊椎灰质炎抗原[如107，108]如IPV或OPV。
—狂犬病抗原[如109]如冷冻干燥的灭活病毒9如10，RabAvertTM]。
—麻疹、流行性腮腺炎和/或风疹抗原[见参考文献96的第9，10，11章]。
—流感抗原[如参考文献96的第19章]，如血凝素和/或神经酰胺酶表面蛋白质。
—从黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)得到的抗原[如111]。
—从无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B类链球菌)得到的抗原[如112，113]。
—从无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B类链球菌)的得到糖抗原。
—从酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A类链球菌)得到的抗原[如113，114，115]。
—从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)得到的抗原[如116]。
—从炭疽杆菌(Bacillus anthracis(得到的抗原[如117，118，119]。
—从黄热病病毒家族(黄热病病毒属)得到的病毒的抗原，如从黄热病病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒的四个血清型、蜱传染的脑炎病毒、西尼罗病毒。
—瘟病毒属抗原，如从经典的猪的热病毒、牛的病毒性腹泻病毒和/或边界病(border disease)病毒。
—细小病毒抗原，如从细小病毒B19。
—朊病毒蛋白质(如CJD朊病毒蛋白质)。
—淀粉样蛋白质，如β肽[120]。
—癌抗原，如列在参考文献121的表1或参考文献122的表3和4的那些。
组合物可包含一种或多种这些抗原。
当需要时，毒性蛋白质抗原可被去毒(如通过化学和/或遗传学方法[95]将百日咳病毒脱毒)。
当白喉抗原包括在组合物中时，优选还包括破伤风抗原和百日咳抗原。同样，包括破伤风抗原时，也优选包括白喉抗原和百日咳抗原。同样，当包括百日咳抗原时，优选也包括白喉和破伤风抗原。
优选将抗原吸附在铝盐上。
组合物中的抗原通常存在的浓度为各至少1微克/毫升。一般，任何给定抗原的浓度应足够产生针对该抗原的免疫应答。
作为在本发明组合物中使用蛋白质抗原的一种替代，可使用编码抗原的核酸[如参考文献123-131]。本发明组合物的蛋白质组分因此可用编码该蛋白质的核酸代替(优选质粒形式的DNA)。
本发明还提供在哺乳动物中引起抗体应答的方法，包含向哺乳动物给予本发明的药物组合物。哺乳动物优选是人。人可以是成年人，或优选是儿童。优选的抗体应答是保护性的，针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A的感染。
本发明还提供本发明修饰的糖，或本发明的缀合物，在制造用于预防或治疗由荚膜细菌引起的疾病的药物中的应用。由奈瑟菌属引起的疾病包括脑膜炎、败血症和淋病。由流感嗜血杆菌引起的疾病包括中耳炎、支气管炎、肺炎、蜂窝组织炎、心包炎和脑膜炎。由肺炎球菌引起的疾病包括脑膜炎、脓毒症和肺炎。因此细菌性脑膜炎的预防和/或治疗是优选的。
定义
术语“包含”意指“包括”以及“组成”，如，组合物“包含”X可只由X组成，或可包括其它的成分，如X+Y。
术语“约”当与数值关联时意指，例如，x±10％。
应理解，糖环可以开链或闭链形成存在，当在此处的结构式中用闭链形式表示时，开链形式也包括在本发明中。
附图的简要说明
图1表示MenA样品在37、49和57℃培育后对时间(h)作图的avDP。
图2表示MenA-CDI-DMA样品在37、49和57℃培育后对时间(h)作图的avDP。
图3表示MenA-CDI-DMA样品在57℃培育0、24、48、96小时后的31P NMR 242.9MHz谱的重叠图。标出了一些信号。
图4表示avDP对时间的图，与比色和31P NMR分析方法比较。
图5表示天然的和修饰的MenA糖在2-8℃随时间的avDP。
图6表示MenA-CDI-DMA在298K的标记的1H NMR 600MHz谱。标出一些归属。
图7表示用MenA，MenA-CDI和Men-CDI-DMA寡糖为包衣剂进行竞争性ELISA试验的结果。竞争剂的浓度范围为100-10-7毫克/毫升。
图8说明用于MenA寡糖的缀合的反应式。
图9表示活化的修饰MenA在25℃的600MHz 1H NMH谱。标出了一些信号。
图10A和10B表示活化的修饰MenA在25℃的杂-相关1H，13C NMR谱。在图10A和10B中，X轴在左边从大约5.7ppm读到在右边大约1.8ppm。在图10A中，Y轴在上端从大约145ppm读到在下端185ppm；在图10B中，它在上端从大约5ppm到在下端105ppm。
图11表示活化的修饰MenA DP4和活化的天然MenA DP4(没有用CDI和DMA进行化学修饰)的重叠的1H MNR谱。
图12表示活化的修饰MenA在25℃的243MHz 31P NMR谱。
图13和14表示由于缀合物保存在37℃四星期由于水解引起游离糖的出现。修饰的糖用正方表示，天然糖用空心三角表示。
图15表示由于缀合物保在37℃不同的pH保存四星期由于水解引起游离糖的出现。修饰的糖用正方表示，天然糖用空心三角表示。
图16表示由(从左到右)批号3、批号5和批号002011缀合物诱导的抗-MenA-pSIgG滴度。条形表示95％置信限度。
图17表示从用MenA修饰的和未修饰的缀合物(批号3，5和002011)免疫的集合的血清的IgG子类分子。数值为OD405nm乘1000。
图18表示用MenA pS为竞争剂的竞争ELISA结果。Y轴表示OD405nm×1000。X轴表示倒数血清稀释度。未修饰的MenA寡糖用圆圈表示；修饰的糖用正方形(批号3)和三角形(批号5)表示。空心符号表示没有竞争剂多糖；实心符号表示存在竞争剂多糖的数据。
实施本发明的方式
MenA寡糖的修饰
从MenA纯化荚膜多糖，水解产生MenA寡糖。多糖(2克)在50℃在50mM乙酸钠缓冲液(pH4.75)中，以多糖浓度为10毫克/毫升水解约4小时[86]。水解后，用旋转蒸发使溶液干燥。
用表示于上式1的反应式活化寡糖。将寡糖溶解在DMSO中，得到糖浓度为10毫克/毫升。按照寡糖∶CDI的摩尔比为1∶20，加入21.262克CDI(SigmaTM)，反应混合物室温搅拌16小时。产生的MenA-CDI化合物通过在80∶20(v/v)丙酮∶DMSO混合物中的选择性沉淀来纯化，接着离心。通过测定游离咪唑对结合咪唑的比计算活化反应的效率。
在第二个反应步骤中，MenA-CDI寡糖溶解于DMSO，糖浓度约为10毫克/毫升。按照MenA-CDI单元：DMA为1∶100的摩尔比，加入36.288克的99％盐酸二甲基胺(Sigma)，反应混合物在室温搅拌16小时。冷冻干燥反应产物，重新溶解在10毫克/毫升水溶液中。
为了从寡糖制品中除去低分子量的反应试剂(特别是二甲基胺)，通过3.5kDaMWCO膜(Spectra/Por)进行透析。进行四个透析步骤：(i)16小时对2升1M氯化钠(透析因子1∶20)，(ii)16小时对2升0.5M氯化钠(透析因子1∶20)，(iii)和(iv)16小时对2升WFI(透析因子1∶20)。为了提高纯度，还进行一个通过1kDa MWCO膜(ContriconTM)的渗滤步骤。
纯化的MenA-CDI-DMA产物在25mM L-组氨酸(Fluka)，在pH6.5缓冲。
MenA和MenA-CDI-DMA产物的稳定性通过比色和NMR方法评价，以测定它们的平均聚合度(avDP)。样品在玻璃小瓶中在25mM His缓冲液(pH6.5)中在三个温度(37、49或57℃)之一培育96小时，培育结束是，将样品储存在4℃。
比色稳定性研究
化学avDP用[Pt][Pme]表示，其中[Pt]是总磷酸浓度，[Pme]是末端单磷酸酯浓度。[Pt]用比色法测定，如参考文献132所述。[Pme]通过测量由马铃薯酸性磷酸酶的酶促反应释放的无机磷酸盐Pi测定[133]。
图1和2表示MenA和MenA-CDI-DMA的avDP随时间的变化。
糖水解的动力学常数(k)(见图1和2中作为avDP的落差(drop)如参考文献134所述进行分析。分析k的2个不同的方面：
—在标准的动力学方程式中k作为avDP和t的函数；然后
—在Arrhenius方程式中，k作为频率因子(A)、活化能(ΔGa)和温度(T)的函数。
假定水解以良好的一级动力学进行到完全：
对数形式为：
lnavDP＝lnavDP0-kt
k由lnavDP＝f(t)曲线的斜率定义。
Arrhenius方程式表明在不同温度值的动力学常数与水解反应活化能之间的关联：
k＝Aexp(-ΔGa/RT)
lnk＝lnA-ΔGa/RT
ΔGa从通过将lnk作为温度倒数(1/T)的函数作图得到的直线的斜率计算。
在这个研究中，我们只分析了水解反应的总活化能，而没有将活化焓和活化熵的各自的贡献(ΔGa＝ΔHa+TΔSa)分开。
表1总结了闭塞的avDP数据和在不同温度的水解反应的动力学常数
| T(K) | avDP | k(s-1) | |||||
| 0h | 24h | 48h | 72h | 96h | |||
| MenA | 310 | 21.453 | 17.452 | 14.197 | 11.550 | 9.396 | 2.4×10-6 |
| 322 | 21.453 | 14.028 | 9.173 | 5.998 | 3.922 | 4.9×10-6 | |
| 330 | 21.453 | 10.956 | 5.595 | 2.857 | 1.459 | 7.8×10-6 | |
| MenA-CDI-DMA | 310 | 21.453 | 21.192 | 20.994 | 19.524 | 18.640 | 1.9×10-7 |
| 322 | 21.453 | 22.410 | 19.127 | 17.472 | 15.491 | 9.2×10-7 | |
| 330 | 21.453 | 20.227 | 16.555 | 16.864 | 11.600 | 1.8×10-6 | |
在37、49和57℃得到的速度常数的Arrhenius曲线表明，在25mM His缓冲液(pH6.5)的水解反应的活化能对MenA是50.1KJ/mol(12.0Kcal/mol)，对MenA-CDI-DMA是94.9KJ/mol(22.7Kcal/mol)。通过Arrhenius曲线的线性最小二乘法回归估计的标准差对于ΔGa是±5.0KJ/mol(±1.2Kcal/mol)。因此，本发明修饰的多糖的稳定性是其未修饰的相应多糖的近两倍。
NMR稳定性研究
为了证实从比色法得到的avDP，进行了31P NMR分析实验。avDP数据通过P单磷酸酯(Pme)和P链中(Pin chain)信号之间的积分比计算(见图3)。
1H和31P NMR样品通过将冷冻干燥的寡糖溶解在0.75毫升99.9％D20(Aldrich)至10-15mM浓度的溶液制备。在所有的实验中，使用5mmWimadTM管子。NMR谱在298K在带有BGU单元的Brucker NMR谱仪Avance DRX 600MHz上记录。使用带有自屏蔽的z-梯度的5mm TB1三重共振探头。为了处理数据，使用Brucker XWINNMR 3.0软件。1H标准谱的采集条件是以4次扫描在6000Hz的谱窗口收集32k数据点。在应用了0.1Hz谱线增宽功能后，对1H NMR谱进行傅立叶变换，并相对于在1.91ppm的乙酸阴离子共振或在4.72ppm的单氘化水的共振进行参照。31P标准谱的采集条件是以128次扫描在3000Hz的谱窗口收集32k数据点。使用2.0Hz谱线增宽功能。
如在图4所表示的，在所有的温度值，比色法和31P NMR法都一致，仅稍有向下的平移(对lnavDP＝f(t)无影响)。
比色法和31P NMR法的分析结果总结在表2中。
| 分析方法 | T(K) | avDP | k(s-1) | ||||
| Oh | 24h | 48h | 72h | 96h | |||
| 比色测定 | 310 | 21.453 | 21.192 | 20.994 | 19.524 | 18.640 | 1.9×10-7 |
| 322 | 21.453 | 22.410 | 19.127 | 17.472 | 15.491 | 9.2×10-7 | |
| 330 | 21.453 | 20.227 | 16.555 | 13.864 | 11.600 | 1.8×10-6 | |
| 31p-NMR测定 | 310 | 20.407 | 19.573 | 19.170 | 18.450 | 18.253 | 3.3×10-7 |
| 322 | 20.407 | 16.986 | 14.836 | 12.556 | 10.051 | 2.0×10-6 | |
| 330 | 20.407 | 15.984 | 12.123 | 9.860 | 8.079 | 2.7×10-6 | |
通过用Pme的谱形改进分析，可以看到出现了两种不同的分子(见图3)。对于高场信号较低的动力学常数率是明显的。
通过在低温(如2-8℃的通常储藏温度)获得的数据的外推，有可能将这些数据外推到2年的时间尺度(见图5)。
将在MenA和MenA-CDI-DMA的稳定性研究中得到的数据进行比较，观察到了该修饰的产物的稳定性有显著提高。外推到更长的时间尺度表明，MenA-CDI-DMA的降解已充分降低到允许该产品在2年中销售。
结构表征
图6表示MenA-CDI-DMA样品在298K的1H NMR谱，指出了信号归属。该NMR图提示在MenA寡糖和MenA-CDI-DMA寡糖之间的高度相似性。在2.6-3ppm谱区看到了1H-甲基DMA。2.73ppm峰相应于游离DMA的1H-甲基，是溶液中的残留溶剂。2.91ppm峰暂时指定为与寡糖链连接的1H-甲基DMA。
31P NMR图与MenA寡糖类似。只观察到了Pme信号稍向低场移动(见图3)。
本发明修饰的糖因此在结构上与其相应的天然糖相似，这应当意味着抗原性和免疫原性未受影响。
竞争性ELISA测定
用竞争性ELISA测定按理将MenA、MenA-CDI和MenA-CDI-DMA寡糖与它们替代特定抗体的能力进行关联。作为竞争剂浓度(毫克/毫升)的函数绘图的抑制％示于图7。所有的样品显示相似的行为，在10-1毫克/毫升竞争剂浓度达到约100％的抑制。
这证实了用本发明的糖的修饰不会导致抗原性的丢失。
缀合
修饰的MenA糖(MenA-CDI-DMA)通过总结在图8的过程与CRM197蛋白质缀合。在缀合过程中基本的步骤是：
—水解MenA多糖，产生寡糖片段
—将寡糖片段按大小分类
—分类的寡糖上的末端醛基的还原性胺化
—在CDI反应之前用Fmoc保护末端氨基
—在DMA反应过程中-NH2基固有的去保护
—用SIDEA(N-羟基琥珀酰亚胺己二酸)活化末端-NH2基
—共价连接到CRM197蛋白质上
a)
水解
MenA多糖在50mM乙酸钠缓冲液(pH4.75)中在73℃水解约3小时。控制水解，以便得到大约15的平均聚合度(DP)，由总有机磷和单酯磷酸之间的(w/w)比测定。
b)按大小分类
该步骤选择一定数量的在水解中产生的寡糖。得到的上述水解物通过30kDa截留膜(12个5mM乙酸缓冲液，pH 6.5的渗滤体积)超过滤，除去在保留物中的长链。
c)在还原性末端引入伯氨基
乙酸铵加到分类的寡糖溶液中，达到最后浓度为300克/升，加入氰基硼氢化钠，最终浓度为73克/升。调节pH到6.5±0.2，混合物在37℃培育5天。
然后氨基-寡糖通过3kDa截留膜用13体积的0.5M NaCl渗滤液。这一步除去短链糖(DP＜6-7)，得到的最后聚合度为约15。
保留物部分用4个体积的10mM TAB(溴化四丁基铵)渗滤液，然后用7个体积的水将Na+交换为TAB+。有机正离子提高糖在DMSO中的溶解度(下一步衍生化需要)到约10克/升。
纯化的寡糖用旋转蒸发仪干燥，除去水，然后溶解在DMSO溶剂中，浓度为约10克/升。
纯化的氨基-寡糖溶液用Chen[132]的方法分析磷含量，用Habbeb[135]的方法分析引入的氨基量。
作为用超过滤除去短链糖方法的替代，可用Q-Sepharose Fast Flow column(Q-琼脂糖快速流动柱)，但是需要另一步在SP-Sepharose(Pharmacia)柱上的交换，以进行Na+/TAB+转换。
d)用Fmoc保护末端氨基
氨基-寡糖与Fmoc-Osu(N-9-芴基甲氧基羰氧基)(Sigma)按-NH2∶Fmoc-Osu＝1∶20的摩尔比进行反应。混合物在室温搅拌下培育过夜，用丙酮(80％v/v最终浓度)沉淀。离心收集沉淀，用丙酮西司数次，除去未反应的Fmoc-Osu试剂。
e)用CDI和DMA试剂使反应稳定化
保护的氨基-寡糖溶解于DMSO中，浓度为10克/升，以CDI∶总磷＝20∶1的摩尔比加到CDI中。混合物搅拌下室温培育过夜，用丙酮(80％v/v最终浓度)沉淀。离心收集沉淀，用丙酮洗涤数次，除去未反应的CDI试剂。
上面得到的产物溶解在DMSO中(10克/升)，加到DMA在乙醇的溶液中(约5.6M)，摩尔比为DMA∶总磷＝20∶1。混合物室温搅拌培育过夜，用丙酮(80％v/v最终浓度)沉淀。离心收集沉淀，用丙酮洗涤数次，除去未反应的DMA试剂。
纯化的寡糖然后真空干燥，除去痕量的有机溶剂。
f)离子交换色谱
干燥的寡糖溶解在水中(10克/升)，进样在用1M NaCl平衡的SP-Sepharose快速流动柱(Pharmacia)上，进行TAB+/Na+交换。柱然后用5个柱体积(CV)的水洗涤，回收吸附在树脂上的痕量产物。然后用旋转蒸发仪干燥产物，除去水。
g)衍生化为活性酯
干燥的产物溶解在水中，达到40mM氨基浓度，然后加入9体积的DMSO，接着加入TEA(三乙基胺)，最终浓度为200mM。向形成的溶液中加入己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯(SIDEA)，最终浓度为480mM。
室温搅拌下维持反应2小时，然后用丙酮(80％v/v最终浓度)沉淀活化的寡糖。离心收集沉淀，用病听洗涤数次，除去未反应的SIDEA。
纯化的寡糖然后真空干燥，除去溶剂。
引入寡糖结构的活性酯基的量通过比色法测定，如参考文献136所述。
活化的寡糖如上述用1H NMR分析，以证实化学修饰。在早先的实验中建立的质子NMR图用来评价各批产品。通过考察1D(图9)和2D杂合-关联(1H，13C；图10A和10B)NMR谱指认糖信号，表示确是修饰的MenA的特征。
每个样品约5毫克溶解在750微升D2O中，在Bruker Avance 600MHz谱仪上记录谱图。
考察CH3 DMA基和H1 糖环的比得到稳定的反应产率在70％-75％之间。
修饰的糖的质子图继续保持，但关于O-乙酰基的真实的修饰状况和结构的构象从NMR分析还不明显。然而，氨基甲酸酯基团改变了局部的磁场，因此1H NMR谱的指认是复杂化了。
图11表示修饰的和天然的MenA寡糖的重叠的谱图。H3、H4和H2信号的低场位移显然可见，因为在C3和C4环位置的氨基甲酸酯基团比其它核如H1靠近。谱图也提示了其它位移，但它们的指认还不完全确定。
图12表示化学衍生化在31P NMR谱中没有产生任何改变。
h)缀合到CRM197上
干燥的活化寡糖加到45毫克/毫升CRM197在10mM磷酸缓冲液(pH 7.2)的溶液中，摩尔比为酯基∶蛋白质＝12∶1。反应在室温搅拌下保持过夜，得到的缀合物用切线超过滤通过30kDa截留膜，用50个体积的磷酸缓冲液(10mM，pH 7.2)纯化。产物灭菌过滤并储藏在-20℃直到疫苗配制。
纯化的缀合物进行蛋白质含量(微量BCA蛋白质测定，microBCA Protein Assay)、糖含量(磷的比色测定)、游离糖含量(色谱分析)、HPLC图形(用TSK凝胶G4000SWXL7.5mm ID×30cm)、NMR图形和SDS-PAGE分析。
缀合物的时间依赖性稳定性
MenA-CDI-DMA寡糖的CRM197缀合物的稳定性通过监测在4个星期的在37℃的储藏时间里由于水解而在溶液中的游离糖的出现，同时与未修饰的MenA寡糖的CRM197缀合物作比较。
游离(即非缀合的)糖用反相色谱在ISOLUTETM C4筒形柱(ISTTM)分离非缀合的链，然后通过用HPAE-PAD色谱渗透的糖测定。
总糖(即缀合的和非缀合的)通过用来定量分析N-乙酰基甘露糖胺磷酸酯的方法测定，使用带有脉冲安培计检测器(HPAE-PAD)的高效阴离子交换色谱。[137]
未缀合的糖对总糖的比表示为百分数(％FS)。
在第一个实验中，％FS如下(图13)：
| 时间(天) | 0 | 7 | 14 | 21 | 28 |
| 修饰的 | 16.8 | 14.7 | 23.8 | 21.7 | 23.3 |
| 天然的 | 11.0 | - | 27.0 | 36.6 | 39.5 |
在第二个实验中，结果如下(图14)：
| 时间(天) | 0 | 7 | 14 | 21 | 28 |
| 修饰的 | 1.8 | 1.5 | 4.2 | 4.9 | 8.2 |
| 天然的 | 4.8 | 5.5 | 19.3 | 22.7 | 28.3 |
在高温下，修饰的MenA寡糖缀合物明显地要比其相应的天然物更耐水解。例如，在37℃经过28天后，修饰的糖的糖释放百分数为6.4％，而天然的糖则是23.5％。
在用修饰的MenA糖进一步试验各批之间的一致性的工作中，从缀合物产生的游离糖在37℃监测8周。三批的结果如下：
| 时间(天) | 0 | 7 | 14 | 21 | 28 |
| LotA | 1.7 | 2.9 | 3.2 | 5.8 | 8.7 |
| LotB | 1.0 | 4.2 | 4.5 | 6.5 | 10.9 |
| LotC | 2.2 | 4.5 | 5.4 | 8.2 | 11.4 |
由此看到，修饰的缀合物经过长时间仍是稳定的。低于12％的游离糖水平是在可接受的限度中的，即使是在高于正常的温度。
缀合物的pH-依赖性的稳定性
通过在37℃，在6.0-8.0之间的不同pH条件下储藏28天后，检测游离糖的出现来试验修饰的和未修饰的MenA寡糖的缀合物的稳定性。比较修饰的(批号5)和未修饰的(批号RS040101)寡糖，0-28天之间的游离糖的增加(A％FS)如下：
| pH* | 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 | 8.0 |
| 修饰的 | 10.3 | 5.4 | 8.9 | 8.3 | 26.1 |
| 天然的 | 43.5 | 30.1 | 36.1 | 20.3 | 30.5 |
在6.5-7.5的pH范围内，修饰的MenA缀合物显示出比天然MenA寡糖缀合物低得多的水解反应速度，在脱除氨基甲酸酯稳定化基团后，效果就不那么明显。
修饰的缀合物的免疫原性
修饰的MenA寡糖的纯化的CRM197缀合物用来免疫小鼠，以便证明修饰并没有使糖的免疫原性失去。
配制疫苗，得到10微克糖在0.5毫升体积的人单剂(SHD)。制备2个制剂：液体制剂和冷冻干燥制剂。各在最终剂型中含0.6毫克Al3+/毫升水平的磷酸铝佐剂，冷冻干燥制剂用该佐剂的水悬浮液重建。
修饰的寡糖缀合物的液体制剂与天然(即未修饰)寡糖缀合物的冷冻干燥制剂作比较。
小鼠用1/5的SHD免疫，每次免疫前疫苗用盐水稀释。每个免疫组10只Balb/c小鼠(雌性，6-8周龄)用0.5毫升疫苗在0时间和4周后皮下注射。在第一次免疫前和在第6周(前-、后-II血清)进行放血，血清储藏在-70℃。
抗多糖滴度
按照CDC用于MenA人血清分析的程序[138]测定免疫动物血清中的专一性抗MenA多糖总IgG抗体，为了用于动物的血清分析，该程序作了小的改变。
每只小鼠的血清用滴定曲线一式两份进行分析。对免疫组计算GMT。抗MenA多糖滴度用小鼠Elisa单位(MEU)表示，用基于参照线测定法(Reference Line AssayMethod)的软件进行MEU计算。
IgG子类分析用免疫组收集的后-II血清进行，在ELISA程序中用碱性磷酸酶-抗小鼠IgGl或IgG2a或IgG2b或IgG3(Zymed)作为次级缀合物。滴度表示为OD405nm，该值是在底物发育30分钟后以收集的后-II血清的1∶3200的稀释度得到的。
图16表示通过使用磷酸铝佐剂的两个批次的MenA修饰的缀合物(批号3和5)诱导的抗-MenA-pS IgG滴度(GMT)与冷冻干燥的未修饰的MenA缀合物(批号002011)进行比较。两批修饰的缀合物所诱导的滴度都与由未修饰的MenA缀合物诱导的滴度极为相似。
图17表示从用修饰的和未修饰的MenA缀合物免疫得到的收集的血清(稀释度1∶3200)的IgG子类分析。在所有血清中最有代表性的子类是IgG1，在小鼠中由T-依赖性的抗原(当以蛋白质存在时)主要诱导该子类。因为MenA荚膜糖本质上是不能诱导免疫记忆的T-非依赖性抗原，这表示缀合达到了它的目的。
抗-MenA pS滴度专一性通过竞争性ELISA，用最终浓度为25微克/毫升的MenA pS作为竞争剂测定。如图18所示，存在极为良好的由修饰的和未修饰的缀合物诱导的滴度抑制，表明所有的缀合物都能诱导抗-MenA pS-专一性的滴度。
针对脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清型A的血清杀菌测定(SBA)
通过对用各缀合物免疫诱导产生的抗体在体外的杀菌测定中的功能进行分析，以测量细菌的补体-介导的溶解。
使用各免疫组的收集的后-II血清。在用于测定前在56℃灭活30分钟。使用25％仔兔补体作为补体源(Pel Freeze)。杀菌滴度表示为产生50％细菌杀灭的血清稀释度的倒数。试验了对抗2个血清型A菌株的活性：F8238和F6124。
滴度如下：
| 靶菌株 | Lot3 | Lot5 | Lot002011 |
| F8238 | 2048-4096 | 2048 | 4096-8192 |
| F6124 | 4096 | 2048 | 4096 |
因此，三个缀合物都对2个菌株诱导良好的杀菌滴度，并且由修饰的寡糖诱导的滴度并不显著低于用天然糖结构诱导的滴度。然而，有利的是，修饰的寡糖是显著地比天然寡糖更稳定。因此本发明提供的抗原保留了天然MenA荚膜糖的免疫原性强度，而且在储藏过程中具有更高的水解耐性。
要理解的是，本发明只是用举例的方式进行了叙述，在保留在本发明范围和精神之内的同时可以进行修改。
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Claims (51)
1.一种修饰的荚膜糖，所述荚膜糖包含位于相应的天然荚膜糖至少一个单糖单元羟基位置上的封闭基团。
2.如权利要求1所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述至少一个单糖单元为非末端单糖单元。
3.如权利要求1或2所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，它包含至少一个自由羟基或氨基。
4.如权利要求3所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述至少一个自由的羟基是末端异头羟基。
5.如权利要求1所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述封闭基团是吸电子基团。
6.如权利要求1或2所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述封闭基团具有以下化学式：
-O-X-Y 或 -OR3
其中，
X是C(O)、S(O)或SO2；
Y是C1-12烷基、C1-12烷氧基、C3-12环烷基、C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基，各可任选地被1、2或3个独立选自F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3的基团取代；或Y是NR1R2；
R1和R2独立选自H、C1-12烷基、C3-12环烷基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基；或R1和R2结合在一起形成C3-12饱和杂环基；
R3是C1-12烷基或C3-12环烷基，各可任选被1、2或3个独立选自F、Cl、Br、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3的基团取代；或R3是C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基，各可任选被1、2、3、4或5个选自F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3的基团取代。
7.如权利要求3所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述封闭基团是
-OC(O)NR1R2或-OC(O)CF3。
8.如权利要求4所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述封闭基团是-OC(O)NR1R2，R1和R2独立选自C1-6烷基。
9.如权利要求5所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，R1和R2都是甲基。
10.如上述任一权利要求所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，至少10％的单糖单元包含封闭基团。
11.如上述任一权利要求所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，相应的荚膜糖包含由磷酸二酯键连接的单糖单元。
12.如权利要求11所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述相应的荚膜糖是脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清型A糖。
13.如权利要求12所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述封闭基团位于相应的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清型A糖的4-和/或3-位的任何一位。
14.如权利要求12所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，所述封闭基团位于相应的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清型A糖的4-位的任何一位。
15.如权利要求1-14所述的修饰的荚膜糖，其特征在于，它是寡糖。
16.一种下式的糖：
其中，
T具有式(A)或(B)：
n是1-100的整数；
各个Z基团独立选自OH或如权利要求5-9所定义的封闭基团；和
各个Q基团独立选自OH或如权利要求5-9所定义的封闭基团；
W选自OH或如权利要求5-9所定义的封闭基团；
V选自-NH2或-NH-E，其中E是氮保护基；
其中超过约7％的Q基团是封闭基团。
17.如权利要求16所述的糖，其特征在于，至少50％的Z基团是OAc。
18.如权利要求16或17所述的糖，其特征在于，n是15-25的整数。
19.如权利要求16-18所述的糖，其特征在于，至少10％的Q基团是封闭基团。
20.一种修饰荚膜糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)提供在一个单糖单元具有至少一个羟基的荚膜糖；以及
(b)将所述至少一个羟基转化为封闭基团。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述封闭基团如权利要求5-9中任一项所定义。
22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于，所述封闭基团是-OC(O)NR1R2，步骤(b)包括以下步骤：
(b1)使所述荚膜糖在有机溶剂中与双功能试剂反应；和
(b2)使步骤(b1)的产物与式(I)的氨基化合物反应：
HNR1R2 (I)
其中R1和R2如权利要求3、5和6中任一项所定义。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为非质子溶剂。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述非质子溶剂选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、六甲基磷酰胺(HMPA)、六甲基磷三酰胺(HMPT)、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)或二甲基乙酰胺(DMAC)。
25.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述非质子溶剂是DMSO。
26.如权利要求22-25所述的方法，其特征在于，所述双功能试剂选自1，1’-羰基二咪唑(CDI)、羰基二-1，2，4-三唑(CDT)、羰基二-1，2，3-苯并三唑(CDB)、碳酸二苯酯、溴化氰、光气或三光气。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述双功能试剂是CDI。
28.如权利要求20-27所述的方法，其特征在于，所述修饰的荚膜糖是修饰的荚膜寡糖。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的荚膜糖是可通过剪裁相应的天然荚膜多糖得到的荚膜寡糖。
30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的荚膜糖是天然荚膜多糖，所述方法进一步包含步骤(c)，其中，步骤(b)的产物被剪裁，从而提供修饰的荚膜寡糖。
31.一种修饰脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A多糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)提供天然的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A多糖；
(b)剪裁所述多糖以提供寡糖；和
(c)按照权利要求21-27中任一项，将所述寡糖的至少一个羟基转化为封闭基团。
32.一种修饰脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A多糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)提供天然的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组A多糖；
(b)按照权利要求21-27中任一项，将所述多糖的至少一个羟基转化为封闭基团；和
(c)剪裁产生的多糖。
33.一种制备如权利要求1-19所述的修饰的荚膜糖的方法，其特征在于，所述方法是一种全合成方法，它包括在两个或多个单糖单元之间形成糖苷键。
34.一种修饰的荚膜糖，其特征在于，它可用权利要求20-33中任一项的方法得到。
35.一种修饰的荚膜糖，其特征在于，它是用权利要求20-33中任一项的方法得到。
36.如权利要求1-19、34或35中任一项所述修饰的糖的糖-蛋白质缀合物。
37.如权利要求36所述的缀合物，其特征在于，所述蛋白质是细菌毒素或类毒素。
38.如权利要求37所述的缀合物，其特征在于，所述细菌毒素或类毒素是白喉毒素或类毒素。
39.如权利要求37所述的缀合物，其特征在于，所述细菌毒素或类毒素是CRM197。
40.一种分子，所述分子包含下式的糖部分：
其中
T具有式(A)或(B)：
n是1-100的整数；
各个Z基团独立选自OH或如权利要求5-9所定义的封闭基团；和
各个Q基团独立选自OH或如权利要求5-9所定义的封闭基团；
W选自OH或如权利要求5-9所定义的封闭基团；
V选自-NH2或-NH-E，其中E是氮保护基；
L是O、NH、NE、S或Se；
其中超过约7％的Q基团是封闭基团。
41.一种药物组合物，其特征在于，它包含(a)如权利要求1-19、34或35中任一项所述的修饰的糖和/或如权利要求36-39中任一项所述的糖-蛋白质缀合物和/或如权利要求40所述的分子，和(b)药学上可接受的载体。
42.如权利要求41所述的组合物，其特征在于，它还包含从脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清组C、W135和Y中一种或多种得到的糖抗原，所述糖任选是寡糖并任选被缀合到载体蛋白质上。
43.如权利要求41或42所述的组合物，其特征在于，它还包含疫苗佐剂。
44.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述佐剂是硫酸铝。
45.如权利要求41-44中任一项所述的组合物，其特征在于，它是针对由脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)引起的疾病的疫苗。
46.一种在哺乳动物中引起抗体应答的方法，其特征在于，所述方法包括给予哺乳动物如权利要求41-45中任一项所述的药物组合物。
47.如权利要求1-18中任一项所述的修饰的糖，其特征在于，它被用作药物。
48.如权利要求36-39中任一项所述的缀合物，其特征在于，它被用作药物。
49.如权利要求40所述的分子，其特征在于，它被用作药物。
50.如权利要求1-19、34或35中任一项所述的修饰的多糖，或如权利要求36-39中任一项所述的缀合物，或如权利要求40所述的分子，在制造用于预防或治疗由一种或多种荚膜细菌引起的疾病的药物中的应用。
51.如权利要求50所述的应用，其特征在于，所述疾病是细菌性脑膜炎。
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