JP4435412B2 - 改変された生物学的認識を示す変性多糖類 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の背景）
未変性多糖類は望ましくない生物学的特性を有することがある。例えば、血液循環からの消失が速い、劣化が速い、及び／又はアレルゲン性である。製薬組成物及び治療法通常用いられる２種類の多糖類は澱粉及びデキストランである。
【０００２】
澱粉は自然界で生じ、高度に生物適合性のポリマーである。澱粉が血流中に導入されると、それはアミラーゼにより速やかに消化される。消化産物の断片は糸球体ろ過及び／又は代謝により血管コンパートメントから速やかに除去される。このため（澱粉よりも）ヒドロキシエチル澱粉が、数例の臨床適応症のための長寿命血漿体積増量剤としてこれまで使用されてきた。澱粉分子をヒドロキシエチル化することによりこのポリマーの消化／排出の速度が遅くなる。
【０００３】
エチレンオキシド又は２−クロロエタノールを用いて澱粉をヒドロキシエチル化することはコロイド性血漿体積増量剤の製造のための通常の手法である。これらの方法には、高毒性のエチレンオキシドを使用すること、ヒドロキシエチル化の程度を制御することが困難であること、澱粉の水酸基の選択性が無いこと、副生成物が毒性であること、及びコストが高いこと等、種々の欠点がある。例えば、エチレンオキシドでのヒドロキシエチル化は、既にヒドロキシエチル化された位置、溶媒、残留水、及び反応混合物中の不純物又は副生成物を含むいずれのヒドロキシ位置でも生ずる。特定位置の変性は酵素分解からのより有効な保護を提供するけれども、澱粉分子上の位置の中で選択性が無いことにより、澱粉の高度なヒドロキシエチル化が必要である。
【０００４】
デキストランは過去４０〜５０年間種々の製薬的及び治療的調製に使用されてきた。デキストランの広範な用途には、血漿代替物／体積増量剤のための精製天然デキストラン、デキストラン活性コンジュゲート、鉄−デキストラン鉄補助剤、及びＭＲＩ造影剤のためのデキストラン被覆粒子等が含まれる。高度に精製された形態の殆どのデキストランは、患者人口の殆どに許容される。しかしながら、深刻なアナフィラキシー様の反応が起きることが知られており、死に至るほど深刻な場合がある。
【０００５】
製薬組成物及び治療法に用いられる多糖類のこれらの望ましくない特性は、天然もしくは未変性多糖類よりも望ましい生物学的特性を有する変性多糖類、例えば、変性澱粉及び変性デキストラン、に対する要求を示している。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、天然もしくは未変性多糖類よりも望ましい生物学的特性を有する変性多糖類、これらの変性多糖類を含有する製薬組成物、これらの変性多糖類を使用する方法、及びこれらの変性多糖類の望ましくない生物学的特性を低減する方法に関する。好ましくは、変性多糖類は酸化及び還元された多糖類である。好ましくは、多糖類は過ヨウ素酸塩で還元される。製薬組成物では、酸化及び還元された多糖類は製薬学的に許容されるビヒクル中で処方されうる。
【０００７】
本発明による変性のために好ましい多糖類は澱粉及び／又はデキストランである。酸化及び還元された澱粉は、好ましくは、未変性澱粉よりも長い血管半減期、未変性澱粉よりも遅いアミラーゼによる分解、及び／又は未変性澱粉よりも遅い動物からの消失を示す。酸化及び還元された溶解性デキストランは、好ましくは、デキストランと比べて低減されたアレルゲン性を示す。好ましくは、多糖類の酸化の程度が高まるほど血管半減期は長くなり、分解は遅くなり、消失は遅くなり、及び／又はアレルゲン性は小さくなる。
【０００８】
変性多糖類はキレート剤とのコンジュゲート（conjugate）のようなコンジュゲートの構成成分であってよく、又はこれを形成するために用いてよい。好ましいキレート剤はデフェロキサミン（ＤＦＯ）である。
【０００９】
発明の方法は、澱粉を酸化及び還元することにより澱粉の血管半減期を増加させること、及び哺乳類の血液循環中に酸化及び還元された澱粉を投与することにある。他の態様では、本発明の方法はデキストランを酸化及び還元することによりデキストランのアレルゲン性を低減し、酸化及び還元されたデキストランを哺乳類の血液循環中に投与することを包含する。投与されるデキストラン又は澱粉には、デキストラン又は澱粉のコンジュゲートが含まれる。
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、天然もしくは未変性多糖類よりも望ましい生物学的特性を有する変性多糖類、これらの変性多糖類を含有する製薬組成物、これらの変性多糖類を使用する方法、及びこれらの変性多糖類の望ましくない生物学的特性を低減する方法に関する。
【００１１】
未変性多糖類は、血液循環からの早急な消失、早急な分解、及び／又はアレルゲン性、のような望ましくない生物学的特性を有しうる。例えば、未変性澱粉は早急に分解し、哺乳類の血液循環から早急に消失する。未変性デキストランは、哺乳類の一部において強く、おそらくは致命的にアレルゲン性である。多糖類について好ましい特性には、血液循環からのより遅い消失、より遅い酵素消化、及び／又は低減されたアレルゲン性がある。本発明により変性された澱粉はより遅いアミラーゼによる分解、及び増大された血管半減期示す。本発明により変性されたデキストランは低減され、許容しうるアレルゲン性を示す。
【００１２】
（変性多糖類）
本発明に用いるのに好ましい多糖類にはデキストラン及びヒアルロン酸、澱粉、及び澱粉誘導体等が含まれる。デキストラン及び澱粉のような多糖類出発物質は水溶性調製物又は溶液として市販されている。「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、Ａ．オソル（Osol）編、マック出版（第１６版、１９８０年）、第７５９〜７６１頁を参照のこと。本発明の多糖類には米国特許第４，８６３，９６４号、同第５，２１７，９９８号、及び同第５，２６８，１６５号等に説明されているものが含まれる。これらに開示されている事項はここに説明として含める。
【００１３】
本発明には、酸化により、次いで還元により変性された多糖類、この変性多糖類の製薬組成物、酸化及び還元により多糖類を変成する方法、かかる変性により多糖類の生物学的特性を制御する方法が含まれる。酸化とその後の還元によって、得られる生体適合性多糖類の、消化が遅くされ、アレルゲン性が低減され、その他の生物学的特性の好ましい改変が提供される。多糖類上の水酸基が変性される度合又は程度は容易に制御することができ、生物学的特性の変性の程度を選択する方法を提供する。例えば、過ヨウ素酸塩の多糖類との反応は速く、定量的である。多糖類分子の酸化の程度は均質であり、容易且つ正確に制御できる。
【００１４】
得られる酸化及び還元された多糖類は、天然又は以前の変性多糖類が現在用いられている方法及び組成物に用いうる。かかる方法及び組成物には、コロイド性血漿体積増量剤、血液希釈、心肺バイパス装置のための初液、器官保存液、凍結防止液等がある。更に、本発明の方法及び変性多糖類は多糖類の酸化の程度を制御を提供し、そのことにより、異なるそれぞれの用途のための好適な生物学的特性を提供するために多糖類の変性を選択できる。例えば、多糖類上の水酸基の全て又はいずれかの部類の、例えば、約１０％〜１００％を酸化及び還元することによりその生物学的特性を改変できる。好ましくは、水酸基はビシナル水酸基であり、酸化は過ヨウ素酸塩を用いて行いうる。好ましくは、多糖類上の水酸基の全て又はいずれかの部類の約３０％〜約６０％が酸化及び還元されて、変性多糖類が動物から分解、消化、又は消失する速度が、未変性の多糖類と比べて遅くなる。好ましくは、多糖類上の水酸基の全て又はいずれかの部類の約２０％〜約８０％が酸化及び還元されて、未変性の多糖類と比べて変性多糖類のアレルゲン性が低減される。
【００１５】
変性される多糖類は多糖類−薬品コンジュゲートの構成成分であってよく、又は変性多糖類は多糖類−薬品コンジュゲートを形成するために用いてもよい。多糖類−薬品コンジュゲートにおける本発明による変性の効果は多糖類そのものの変性と同様であり、例えば、より遅い分解及び／又は低減されたアレルゲン性である。しかしながら、多糖類−薬品コンジュゲートの変性又は本発明により変性された多糖類から多糖類−薬品コンジュゲートを形成することは、それ以外に有利な効果を得ることができる。
【００１６】
例えば、多糖類−薬品コンジュゲートの血管半減期又は血漿残留時間は多糖類酸化を適度に行うことにより制御できる。多糖類又は多糖類コンジュゲートの分解が薬品の放出を制御する場合、本発明は、薬品の制御された薬物動態学の選択、又は持続した放出のための方法を提供する。この場合、多糖類酸化の程度は所望の血管半減期又はそれぞれ異なる多糖類−薬品コンジュゲート系及び特定の臨床的な適応症のために最適の効果を提供する放出速度のために選択される。
【００１７】
多糖類コンジュゲートの分解の速度の制御環境において、コンジュゲート又は放出される薬品の効果を改変できる：１）薬品−多糖類コンジュゲートは薬理学的に不活性であるが、薬品−多糖類コンジュゲートの断片の開裂の後は、薬理学的に活性になる。２）薬品−多糖類コンジュゲートは活性であり、断片（活性又は不活性）の開裂においてより迅速に排出される。３）薬品−多糖類コンジュゲート及び断片の両方が薬理学的に活性であるが、変性の結果、多糖類−薬品コンジュゲートの滞留時間、局在化又は区分化が増大する。４）多糖類主鎖の開裂によってポリマーに結合した活性成分の薬理学的プロファイルが変化する。５）多糖類のポリマーシェル中に薬品が包封されることによりカプセルからの薬品の放出が制御され、多糖類の変性によりシェルの分解が改変される。本発明による変性に効果がある他の多糖類及び多糖類コンジュゲートには、活性成分が栄養化合物、医薬品、酵素、造影剤、除草剤、殺虫剤等であるコンジュゲート；生物分解ポリマー、被覆、又は時間放出顆粒のような分解速度の制御が望まれる組成物に用いられる多糖類がある。
【００１８】
（変性澱粉）
本発明には、酸化により、次いで還元により変性された澱粉、この変性澱粉の製薬組成物、酸化及び還元により澱粉を変成する方法、かかる変性により澱粉の生物学的特性を制御する方法が含まれる。酸化とその後の還元工程によって、得られる生体適合性澱粉の、消化が遅くされ、動物から消失する速度が遅くされる。澱粉上の水酸基が変性される度合又は程度は容易に制御することができる。酸化の程度を制御及び選択することにより変性澱粉の酵素消化（及び得られる持続性又は消失−排出）の速度が決定される。従って、本発明は変性澱粉又は変性澱粉のコンジュゲートの血管半減期を決定及び選択する方法を提供する。過ヨウ素酸塩の澱粉との反応は速く（反応は数分の内に終了する。）、ビシナル水酸基の間の結合の開裂に特異的であり、そして定量的である。従って、澱粉分子の酸化の程度は均質であり、容易に制御できる。好ましくは酸化される水酸基はビシナル水酸基であり、酸化は過ヨウ素酸塩を用いて行われる。
【００１９】
澱粉の酸化／還元がアミラーゼで消化される速度を決定することが示されている。澱粉分子の酸化の度合が高いほど、消化の速度は遅くなる。同様に、澱粉の酸化／還元が動物から消失する速度を遅くことが示されている。澱粉分子の酸化の度合が高いほど、消失速度は遅くなる。適切な酸化の度合を選択することにより、消化又は消失の望ましい速度が得られる。例えば、澱粉上の水酸基の全て又はいずれかの部類の、例えば、約２０％〜９０％を酸化及び還元することにより、その消化速度又は動物からの消失のような、その生物学的特性を改変できる。好ましくは、澱粉上の水酸基の全て又はいずれかの部類の約３０％〜約６０％が酸化及び還元されて、変性澱粉が動物から分解、消化、又は消失する速度が、未変性の澱粉と比べて遅くなる。ある条件においては、澱粉上の水酸基の全て又はいずれかの部類の約３０％が酸化及び還元されて、未変性の澱粉と同程度の速さでアミラーゼにより消化される。またある条件においては、澱粉上の水酸基の全て又はいずれかの部類の約６０％が酸化及び還元されて、非常に遅い速さでアミラーゼにより消化され、この澱粉は消化にほぼ不活性となる。
【００２０】
得られる酸化及び還元された澱粉は、従来の澱粉が現在用いられている方法及び組成物に用いうる。かかる方法及び組成物には、コロイド性血漿体積増量剤、血液希釈、心肺バイパス装置のための初液、ドナー器官保存液、凍結防止液等がある。更に、本発明の方法及び変性澱粉は澱粉の酸化の程度の制御を提供し、そのことにより、異なるそれぞれの用途のための好適な血管半減期を提供するために澱粉の変性を選択できる。変性される澱粉は澱粉−薬品コンジュゲートの構成成分であってよく、又は変性澱粉は澱粉−薬品コンジュゲートを形成するために用いてもよい。澱粉−薬品コンジュゲートにおける本発明による変性の効果は澱粉そのものの変性と同様であり、例えば、より遅い分解及び／又は低減されたアレルゲン性である。しかしながら、澱粉−薬品コンジュゲートの変性又は本発明により変性された澱粉から澱粉−薬品コンジュゲートを形成することは、それ以外に有利な効果を得ることができる。
【００２１】
例えば澱粉ポリマー（澱粉ポリマーコンジュゲート(conjugate)）の排出（または放出）速度が特殊用途に対してコントロールされ、かつ選択され得る。化工澱粉が、例えば血管中半減期約２〜約４時間を有する医療用対照剤中のコンジュゲートとしての用途；薬剤が体内に約４〜24時間存続することが必要な金属中毒治療の用途；約12〜48時間持続する化工澱粉が必要なプラズマ体積膨張の用途；または化工澱粉が２〜約５日間の循環系中に存続することが必要な鉄分過負荷の用途；に対して選択される血管中持続性を有するように生成され得る。約30％を超えて、好ましくは約30〜約45％酸化還元された澱粉が、より短い半減期を必要とする用途に好適である。酸化還元されたヒドロキシル基の約60％、好ましくは約45〜約60％を有する澱粉が、より長い半減期を必要とする用途に好適である。
【００２２】
澱粉薬剤コンジュゲート血管中半減期またはプラズマ抵抗時間は、適当な澱粉酸化度の選択によってコントロールしてもよい。澱粉コンジュゲートを有する澱粉の分解により上記薬剤の放出をコントロールする場合に、本発明はコントロールされたまたは持続された薬剤の放出を選択する方法を提供する。この場合、澱粉の酸化度は、それぞれ異なる澱粉薬剤コンジュゲート系および特殊な臨床適応に対する最適な有効性を提供する所望の血管中半減期（または放出速度）に対して選択される。
【００２３】
澱粉コンジュゲートの分解速度の制御が放出されるコンジュゲートまたは薬剤の効果を変化させ得る環境は以下を含む：1)上記薬剤‐澱粉コンジュゲートは薬理学的に活性でないが、主鎖の開裂後に上記薬剤‐澱粉コンジュゲートのフラグメント(fragment)が薬理学的に活性である。2)上記薬剤‐澱粉コンジュゲートが活性であり、開裂時に（活性またはそうでない）上記フラグメントが素早く排出される。3)上記薬剤‐澱粉コンジュゲートおよびフラグメントの両方が薬理学的に活性であるが、上記薬剤‐澱粉コンジュゲートおよびフラグメントの増加した滞留時間および局在化または区画化が修飾に起因する。4)上記ポリマーにコンジュゲートされる活性の薬理学的プロフィールは上記澱粉主鎖の開裂によって変化する。5)澱粉のポリマーシェル内への薬剤のカプセル化は、結果としてカプセルからの薬剤の放出を制御することになり、かつ上記シェルの崩壊は上記澱粉の修飾によって変化する。
【００２４】
修飾デキストラン
デキストランの化学的修飾により、天然デキストラン、デキストラン誘導コンジュゲート、またはデキストラン含有配合へのアレルゲン性反応を低減し、最小にし、または排除することができ、このことは数名のヒト（および他の定温種）において体験されている。ザ・フィジシャンズ・デスク・リファレンス・プロダクト・インフォメーション・フォー・「ＩＮＦｅＤ」(the Physicians Desk Reference product information for "INFeD")、第2478頁、第51版、1997年に記載のように、アナフィラキシー応答は死に至るほど激しく成り得る。
【００２５】
デキストランは、長い間、プラズマ体積膨張および血液希釈を含む様々な医療用治療および組成物に用いられてきた。デキストランは、一部製造者の特性、例えば粘度、平均分子量および分子量範囲、排出/除去速度、および分岐度等をコントロールする能力による、しばしばプラズマ体積膨張に用いられる他のコロイドに好ましい。本発明は、デキストラン、デキストラン配合物およびデキストランコンジュゲートの有用性を向上するために修飾(modification)およびコントロールされ得るデキストランの更に別の特性を提供する。
【００２６】
デキストラン分子を酸化してジアルデヒド‐デキストランを生成し、次いで還元工程を行うことにより、デキストランに対するアレルギー性応答を低減または排除する、修飾デキストラン、酸化および還元デキストランを生成する。例えば、デキストラン中のすべて、または１組のヒドロキシル基の約10％以上または100％以下を、生物学的特性を変化させるために、酸化および還元してもよい。好ましくは、上記ヒドロキシル基はビシナルヒドロキシル基であり、酸化はペルヨーデートを用いて行われる。酸化および還元前のデキストランに比較して、修飾デキストランのアレルギー性を低減するために、好ましくは、デキストラン中のすべて、または１組のヒドロキシル基の約20〜約80％を酸化および還元してもよい。
【００２７】
本発明は、天然デキストラン、公知の方法により、または公知の用途のために既に修飾したデキストラン（例えば前述のもの）、またはコンジュゲートを有するデキストラン成分に適用可能である。例えば、既に配合したデキストラン生成物（例えば、鉄補給用の鉄(III)デキストラン、ＭＲＩ強化用の鉄‐デキストラン）を、アレルゲン性応答を低減または排除するために、酸化および還元によって修飾してもよい。
【００２８】
アレルゲン性応答を低減または排除するためのデキストランの修飾には、酸化は好ましい方法であるが、化学的修飾の他の方法も有効である。例えば、好適な修飾には、ヒドロキシエチル化、アルキル化、還元、エステル化等を含んでもよい。
【００２９】
酸化および還元によって多糖類を修飾する方法
多糖類、例えば澱粉またはデキストランの修飾は、多糖類、例えば澱粉またはデキストランを約100ｇ/Ｌの濃度で水性媒体中に溶解することによって行ってもよい。撹拌しながら、好適な酸化剤、好ましくはペルヨーデート、好ましくはＮａＩＯ4の溶液、ＮａＩＯ4の固形またはＨＩＯ4を加えて多糖類、例えば澱粉またはデキストランを酸化する。用いられる酸化剤、例えばＮａＩＯ4の量は、多糖類、例えば澱粉またはデキストランの酸化または修飾の量をコントロールする。上記反応混合物を次いで従来の方法により精製して、上記酸化反応による塩を除去し、多糖類、例えば澱粉またはデキストランを酸化により精製されるジアルデヒドおよび他のアルデヒド部分を用いて回収する。次に、多糖類、例えば澱粉またはデキストランを酸化により生成されるジアルデヒドおよび他のアルデヒド部分を用いて還元する。好ましい還元剤はＮａＢＨ4である。ジアルデヒド官能基はそれらによってジアルコール基に変換され、アルデヒド類はなお還元される。最終的に、上記反応混合物は従来の方法によって再度精製して、上記反応混合物からの塩を除去する。
【００３０】
多糖類、例えば澱粉またはデキストランを酸化および還元する別の好適な方法が、1998年12月8日に米国特許第5,847,110号として発行された米国特許出願第08/911,991号に記載されており、その記載をここに挿入する。
【００３１】
上記酸化および還元された多糖類、例えば酸化および還元された澱粉または酸化および還元されたデキストランを次いで配合用として用意する。代わりに、酸化多糖類、例えば酸化澱粉または酸化デキストランの還元前に、上記酸化多糖類、例えば酸化澱粉または酸化デキストランのアルデヒド官能基を薬剤、キレート剤、または他の活性部分にコンジュゲートしてコンジュゲートを生成してもよい。
【００３２】
本発明の酸化および還元の方法は、多糖類を修飾してその生物学的特性を変える他の従来の有用な方法に比較して、様々な優位性を有する。例えばヒドロキシエチル化に比較して、酸化剤との反応が化学量論的であるため、酸化度が非常にコントロールし易い。酸化はより特定のものであって、通常グルコース、または他の糖類、サブユニットの１つのサイトに限定される。加えて、上記酸化反応の副生成物は毒性が低く、容易に除去される。酸化体、例えば過ヨウ素酸は電解法によって再生され得るため、酸化は費用効果を有する。
【００３３】
酸化および還元された多糖類を用いるコンジュゲート
キレート剤または他の分子を多糖類に共有結合することが、様々な理由で優位性を有するものであることを見出した。例えば、多糖類との結合は、患者におけるキレート剤または他の分子の分布を変えることができる。例えば、本発明を限定するものではないが、キレート剤および多糖類のコンジュゲートは、キレート剤単独より血管中で保持されると考えられている。コンジュゲートの別の優位な特徴には、溶液、配合物およびプラズマ中のキレート剤または他の分子の、変化した生分布（biodistribution）、低減された毒性、向上した安定性、およびキレート剤または他の分子のより大きな有効性を含んでもよい。
【００３４】
上記多糖類は、好ましくは酸化および還元された多糖類である。酸化および還元に好適な多糖類には、デキストランおよびヒアルロン酸、澱粉および澱粉誘導体等が挙げられる。多糖類出発材料、例えばデキストランおよび澱粉は、水溶性調製品または水溶液として市販されている。A. オーソル(Osol)のレミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンス(Remington's Pharmaceutical Sciences)、マック・パブリッシング(Mack Publishing)発行（第16版、1980年）第759〜761ページ参照。本発明の多糖類には、米国特許第4,863,964号、同5,217,998号および同5,268,165号に記載のものが挙げられ、その開示をここに挿入する。
【００３５】
上記酸化および還元された多糖類は、所望の生物学的または治療的用途に対して有効である十分な時間をかけて、上記キレート剤または他の分子を患者に運ぶのに十分な安定性を有する。加えて、上記多糖類は、患者が上記治療に対する不適切な有害な反応を有さない、十分に良好な寛容性を有し(well-tolerated)、かつ無毒性（例えば非アレルゲン性）である。
【００３６】
コンジュゲートの調製
キレート剤または他の分子が上記多糖類または酸化多糖類に共有結合してコンジュゲートを形成する様々な方法がある。上記キレート剤または他の分子は、インヴィトロで測定した所望の特性が実質的に好ましくはコンジュゲートしていないキレート剤のオーダーに維持されるように、上記多糖類または酸化多糖類に結合される。多糖類または酸化多糖類を用いてキレート剤または他の分子のコンジュゲートを形成する１つの好ましい方法は、アミノ基、例えばデフェロキサミン(deferoxamine)の３級アミノ基を上記多糖類または酸化多糖類に結合する方法である。そのようなアミノ基は多糖類のカルボキシル基と共有結合を形成してアミド結合を形成することができる。
【００３７】
好ましくは、上記キレート剤または他の分子のアミノ基はアルデヒド
部分と共有結合を形成する。初期反応において、上記キレート剤または他の分子のアミンはアルデヒドと反応してシッフ(Schiff)塩基を形成し、上記シッフ塩基は第２の反応において還元されてより安定な共有結合を得る。アルデヒド基は公知の方法、例えばナトリウムメタペルヨーデートを用いるカルボハイドレートまたは他のジオールのジアルデヒドへの酸化によって、上記多糖類に導入される。M.B.ウィルソン(Wilson)等のイミューノフルオレッセンス・アンド・リレイテッド・ステイニング・テクニークス(Immunofluorescence and Related Staining Techniques)、W.ナップ(Knapp)等のElsevier/North Holland Biomedical Press (1978年)、第215頁、フレミング(Flemming)等のActa Biol. Med. Ger.、第30巻、第177頁(1973年)、およびS.C.タム(Tam)等のP.N.A.S.USA、第73巻、第2128頁（1976年）参照。いくつかの用途では、キレート剤または他の分子の末端アミノ基は、ジアルデヒド結合剤、例えばグルタルアルデヒドの使用によって、ポリマーのアミノ基に直接結合していてもよく、例えばナトリウムボロハイドライドを用いて還元する。
【００３８】
より好ましいキレート剤コンジュゲートは、デフェロキサミンを薬理学的に適用可能な多糖類または酸化多糖類に共有結合することにより調製される。デフェロキサミン（Ｎ‐[5‐[3‐[(5‐アミノペンチル)ヒドロキシカルバモイル]プロピオンアミド]ペンチル]‐3‐[[5‐(Ｎ‐ヒドロキシアセトアミド)ペンチル]カルバモイル]プロピオノヒドロキサミン酸）およびその薬理学的に適用可能な塩の調製方法が、プレログ(Prelog)等の「Helv. Chim. Acta.」、第45巻、第631頁（1962年）；ビッケル(Bickel)等の「Helv. Chim. Acta.」、第46巻、第1385頁（1963年）；独国特許明細書第1,186,076号；および米国特許第4,419,365号、同4,987,253号および同5,493,053号に開示されており、それらの開示をここに挿入する。そのような塩には、メタンスルホン酸、リン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、クエン酸等の酸付加塩が挙げられる。他の好適なキレート剤には、2,3‐ジヒドロキシ安息香酸、ＤＴＰＡ、ロドトルイル酸、コリルヒドロキサム酸、エチレンジアミン‐Ｎ,Ｎ'‐ビス(2-ヒドロキシフェニル酢酸)、イソニアジド‐ピリドキサルヒドロゾン、1,2‐ジメチル‐3‐ヒドロキシピリド‐4‐オンおよびニトリロトリアセテートが挙げられる。これらのキレート剤は単独で用いても組合せて用いてもよい。
【００３９】
キレート剤コンジュゲートの作製方法には、米国特許第4,863,964号、同5,217,998号および同5,217,998号、および1998年12月8日に米国特許第5,847,110号として発行された米国特許出願第08/911,991号に記載されており、その記載をここに挿入する。
【００４０】
キレート剤または他の分子のカルボキシルまたはカルボニル基との反応により得られる多糖類に対するモル比は、ポリマー中の反応基数、立体障害、シッフ塩基またはアミド生成の速度および程度等のファクターに依存して広く変化可能である。キレート剤または他の分子の１を超える分子が多糖類の各分子に結合することができる。例として、デフェロキサミンのデキストランに導入されたアルデヒド基との反応、次いで還元によって、約0.7gのデフェロキサミンを約2.5gの反応デキストラン40に結合することができる。
【００４１】
酸化および還元多糖類の投与
酸化および還元多糖類は、所望の生物学的または治療効果を提供するのに十分な血管および局部量を得るのに有効な様々なルートにより投与することができる。通常の投与ルートは非経口、例えば静脈または皮下である。酸化および還元多糖類は、好ましくは患者、例えば４足獣、哺乳動物またはヒトへの投与に適した水性溶媒中の溶液または懸濁液として投与される。好ましい医薬組成物は非発熱性である。好ましくは、酸化および還元多糖類は、溶液として、非経口的に、例えば筋内、腹膜内、皮下、眼内または静脈注射または点滴、または頬、経口、肺、直腸または膣ルートにより投与される。適当な投与量は、治療される疾患；患者または患者の年齢、身長および体重；投与モード；特定酸化および還元多糖類の特性等を含む、治療医師の判断による適当な臨床ファクターに従って調節される。
【００４２】
本発明は以下の実施例の記載により更に詳細に説明される。これらの実施例は、本発明の特定の態様を表すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４３】
実施例
実施例１ 用いた元の澱粉は未修飾ワックス状メイズ澱粉（ＭＷ126,000）であり、Laevosan（Linz、Austria）から得られ、ロット43572,PN 1021Bである。これらの修飾多糖類の調製に用いたすべての水は脱パイロジェン水であり、すべての他の容器/器具を使用前に脱パイロジェン化した。可能であれば、反応およびごみを層流フードして静脈および他の非経口投与用のこれら溶液の純度保護した。反応は周囲温度で行い、いくつかの場合反応混合物が温まらないように冷却を行った。
【００４４】
実験１：過ヨウ素酸塩 175 ｍＭを含む化工澱粉の調製
清浄なガラス容器内で、澱粉粉末）30ｇを水300ｍＬに溶解した。これに、ＮａＩＯ411.23ｇ（175ｍＭ）を除々に加えて、この混合物を105分間攪拌した。得られた混合物は、濾液の導電率が25μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーション（メンブラン：ペリコン２ミニ、５Ｋ ＭＷＣＯ、0.1ｍ2）に付した。その後、酸化澱粉濃度を100ｇ／Ｌに調節した。得られた溶液を濾液の導電率が58μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーションに付した。その後、ｐＨをＨＣｌで6.3に調節し、塩化物濃度を最終濃度が154ｍＭとなるように調節し、そしてポリマー濃度を102ｇ／Ｌに調節した。最後に、溶液をガラスバイアルに滅菌濾過し、止め栓をして、４℃で貯蔵した。これにより、グルコース・サブユニットの約28％が修飾された、化工澱粉生成物約192ｍＬを得た。
【００４５】
実験２：２２２ m Ｍ過ヨウ素酸塩での変性澱粉の調製
洗浄したガラス容器中で澱粉粉３０gを３００mLの水に溶解した。これにＮaＩＯ4１４.２５g（２２２mＭ）をゆっくり添加し、混合物を６０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電性が２７μSになるまで水に対する透析濾過（膜：ペリコン（Ｐellicon）２, ５Ｋ ＭＷＣＯ，０.５m2）を行った。オキシ澱粉の濃度は１００g／Lに調製した。攪拌下にＮaＢＨ4（２.２７g）をオキシ澱粉溶液（１８０mL）に添加し、３３３mＭのＮaＢＨ4濃度を得た。反応物を９０分間攪拌した。得られた溶液を濾液の導電率が３５μSに達するまで水に対して透析濾過した。溶液のpＨは塩酸で６.５に調整し、ポリマー濃度は１００g／Lに調整した。最後に、クロライド濃度を１５４mＭに調整した。ついで溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓をして４℃で保存した。これにより、約３６％のグルコースサブユニットが変性された変性澱粉生成物約１３３mLを得た。
【００４６】
実験３：２７８ m Ｍ過ヨウ素酸塩での変性澱粉の調製
洗浄したガラス容器中で澱粉粉３０gを３００mLの水に溶解した。これにＮaＩＯ4１７．８４g（２７８mＭ）をゆっくり添加し、混合物を９０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電性が１３μSになるまで水に対する透析濾過（膜：ペリコン（Ｐellicon）２, ５Ｋ ＭＷＣＯ，０.５m2）を行った。オキシ澱粉の濃度は１００g／Lに調製した。攪拌下にＮaＢＨ4（３．０９g）をオキシ澱粉溶液（１９６mL）に添加し、４１７mＭのＮaＢＨ4濃度を得た。反応物を１８５分間攪拌した。得られた溶液を濾液の導電率が４５μSに達するまで水に対して透析濾過した。溶液のpＨは塩酸で５.５に調整し、ポリマー濃度は１００g／Lに調整した。最後に、クロライド濃度を１５４mＭに調整した。ついで溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓をして４℃で保存した。これにより、約４５％のグルコースサブユニットが変性された変性澱粉生成物約１５１mLを得た。
【００４７】
実験４：３３４ m Ｍ過ヨウ素酸塩での変性澱粉の調製
洗浄したガラス容器中で澱粉粉３０gを３００mLの水に溶解した。これにＮaＩＯ4２１．４３g（３３４mＭ）をゆっくり添加し、混合物を１０５分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電性が４３μSになるまで水に対する透析濾過（膜：ペリコン（Ｐellicon）２, ５Ｋ ＭＷＣＯ，０.５m2）を行った。オキシ澱粉の濃度は１００g／Lに調製した。攪拌下にＮaＢＨ4（３．６６g）をオキシ澱粉溶液（１９３mL）に添加し、５０１mＭのＮaＢＨ4濃度を得た。反応物を１８５分間攪拌した。得られた溶液を濾液の導電率が３５μSに達するまで水に対して透析濾過した。溶液のpＨは塩酸で４．４に調整し、ポリマー濃度は１００g／Lに調整した。最後に、クロライド濃度を１５４mＭに調整した。ついで溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓をして４℃で保存した。これにより、約５４％のグルコースサブユニットが変性された変性澱粉生成物約１２７mLを得た。
【００４８】
実施例２−澱粉の酸化および還元がアミラーゼ消化を減速する
上記実験２、３および４において得られた変性澱粉生成物を屈折率およびレーザ光散乱検索を有するゲル・パミエーション・クロマトグラフィーを用いてα−アミラーゼによる消化率を測定した。
【００４９】
α−アミラーゼ溶液（豚の膵臓からのシグマＡ−６２５５、ロット３３Ｈ８０７５、タイプ１・Ａ DFP処理３０mlタンパク質／mＬ、７９０ユニット／mgタンパク質）はストック溶液１：５０を０.９％ＮaＣl水溶液で希釈することにより調製した。以下の方法によりガラス試験管中に消化サンプルを調製した：試験管中に０.９％NaCl水溶液０.５mL、５０mＭＣaＣl2０.１mL、ＨＥＰＥＳ（pＨ７）０.１mLおよび（前記）α−アミラーゼ溶液１０mLを加え、よく混合した。次いで、１０.０mLの変性（酸化および還元）澱粉（１００g／L）を試験管中に加え、それをボーテックス（ｖｏｒｔｅｘ）して室温で保持した。所定時間後に、２００μLのアミラーゼ／澱粉溶液をサンプルし、０.８mLのＧＰＣ溶出液で希釈した後、十分に混合する。次いで、サンプルの分子量分布を測定するためＧＰＣカラムにインジェクトした。
【００５０】
図１は各々の変性澱粉生成物の時間の関数に対する平均分子量の変化をプロットしたものである。これらのデータは表１に与えられる。
【００５１】
【表１】
表１−初期ＷＡＭＷ％の時間に対する変化
【００５２】
各々の実験において、澱粉の酸化および還元がそのアミラーゼによる分解を減少した。
【００５３】
実施例３−酸化および還元澱粉が動物中でより徐々にクリアーされる
いくつかの変性（酸化および還元）澱粉のラット中での生体内血液クリアランスを測定した。上記実験２〜４で調製した変性澱粉生成物をスプラーギュウ−ドウレイ（Ｓprague−Ｄawley）ラットに動物用丸薬として与えられる１０mL／kgの投与量で（大腿部静脈）から投与した。２２２mＭおよび２７８mＭのＮaＩＯ4で変性された澱粉サンプルを各々３匹の動物に注射した。２匹の動物には３３４mＭのＮaＩＯ4で変性した澱粉を注射した。血液サンプルを３０分、１時間、２時間、４時間および８時間で大腿静脈から取り出した。これらのサンプルを変性澱粉濃度毎にアッセイを行った。
図２に変性澱粉の平均血球濃度を時間の関数としてプロットしたものを示す。これらのデータを表２に示す。
【００５４】
【表２】
表２−血漿中に残存する初期投与量（％）の変性澱粉生成物の平均血中レベル
【００５５】
各々の実験において、澱粉の酸化および還元がその動物中からのクリアランスを減少した。
【００５６】
実施例４−澱粉デフェロキサミンコンジュケートの合成における澱粉の変性
次のいくつかの実験はＤＦＯ−澱粉生成物および該澱粉またはそのコンジュケートの酸化および還元を説明する。各々未変性ワックス化トウモロコシ澱粉（澱粉）ＭＷ１２６０００または４６０００およびデフェロキサミンメシレート（ＤＦＯ）を原料物質として用いた。澱粉はレポザン（Laevosan)（オーストリアのリンツ）から得た。ＤＦＯはマルマシア・アンド・アップジョン（ミシガン州カラマズウ）ロット２２ＡＤＦ、ＰＮ１００１Ｂから得た。これらのバッチに使用したすべての水はデピロジェネイテット水（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｗａｔｅｒ）であり、すべての他の容器（道具）は使用前に滅菌された。可能な場合には、反応および処理は層流フード内で、これらの溶液の純度を保つために行う。すべての反応は常温（実験室温度）よりも少し下の温度で行った。
【００５７】
実験１：３４ m Ｍキレート化剤および１５０ m Ｍ過ヨウ素酸とのＤＦＯ−澱粉コンジュケートの調製
洗浄されたガラス容器中に、澱粉粉（ＭＷ４６,０００）９９.８ｇを水１０００mL中に溶解した。次いで、ＮaＩＯ4３２.０g（１５０mＭ）を混合物中に添加し、９０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電率が１０３μSになるまで水で透析濾過した（膜：バイオマックス（Ｂｉｏｍａｘ）５ＫＭＷＣＯ）。オキシ澱粉濃度を２４５g／Lに調製した。反応体容積は水とエタノールで２８８mLにして、３０容量％エタノールの混合物を得た。ＤＦＯ（２２.２６ｇ）を攪拌下に添加した。攪拌を１時間継続し、その後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）５.６５mLを反応混合物中に添加した。次いで混合物を２０時間攪拌した。反応時間終了時に水１４４mLを混合物中に添加し、更にＮaＢＨ4３.８７g（２２５mＭ）をゆっくりと添加した。攪拌を１時間継続し、その後反応混合物を濾液の導電率が３０μSになるまで水で透析濾過した。PＨを塩酸で６.０に調整し、クロライド濃度を最終濃度１５４mＭになるように調整し、ポリマー濃度を１００g／Lに調整した。最後に溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓を詰めて４℃で保存した。これにより約５１５mLの澱粉ＤＦＯ生成物、即ちグルコースサブユニットの約２４％が変性され、澱粉ＤＦＯ濃度１００ｇ／Lで３４mＭのキレート化剤濃度を有するものを得た。
【００５８】
実験２：４５ m Ｍキレート化剤および５５０ m Ｍ過ヨウ素酸とのＤＦＯ−澱粉コンジュケートの調製
洗浄されたガラス容器中に、澱粉粉（ＭＷ４６,０００）１００ｇを水９７０mL中に溶解した。次いで、ＮaＩＯ4１１７．７g（５５０mＭ）を混合物中に添加し、６０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電率が１６７μSになるまで水で透析濾過した（膜：ペリコン２バイオマックス５Ｋ ＭＷＣＯ）。オキシ澱粉濃度を１６６g／Lに調製した。反応体容積は水とエタノールで５４０mLにして、３０容量％エタノールの混合物を得た。ＤＦＯ（２７．０９ｇ）を攪拌下に添加した。攪拌を１時間継続し、その後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）１３．８mLを反応混合物中に添加した。次いで混合物を１８時間攪拌し、そのとＢＰＣ７ｍＭを加えて、さらに２時間攪拌を続けた。反応時間終了時に水５２７mLを混合物中に添加し、更にＮaＢＨ4１７．１７g（８２５mＭ）をゆっくりと添加した。攪拌を３時間継続し、その後反応混合物を濾液の導電率が１２４μSになるまで水で透析濾過した。PＨを塩酸で６.０に調整し、クロライド濃度を最終濃度１５４mＭになるように調整し、ポリマー濃度を１００g／Lに調整した。最後に溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓を詰めて４℃で保存した。これにより約５１５mLの澱粉ＤＦＯ生成物、即ちグルコースサブユニットの約８９％が変性され、澱粉ＤＦＯ濃度１００ｇ／Lで４５mＭのキレート化剤濃度を有するものを得た。
【００５９】
実験３：３６ m Ｍキレート化剤および１５０ m Ｍ過ヨウ素酸とのＤＦＯ−澱粉コンジュケートの調製
洗浄されたガラス容器中に、澱粉粉（ＭＷ１２６,０００）５０ｇを水４６５mL中に溶解した。次いで、ＮaＩＯ4１６.０g（１５０mＭ）を混合物中に添加し、６０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電率が１３６μSになるまで水で透析濾過した（膜：ペリコン２ミニ５ＫＭＷＣＯ）。オキシ澱粉濃度を１６５g／Lに調製した。反応体容積は水とエタノールで３８５mLにして、３０容量％エタノールの混合物を得た。ＤＦＯ（１９．５１ｇ）を攪拌下に添加した。攪拌を５分間継続し、その後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）４．９５mLを反応混合物中に添加した。次いで混合物を１９時間攪拌した。反応時間終了時にＮaＢＨ4３.３９g（２２５mＭ）を攪拌下にゆっくりと添加した。攪拌を９０分間継続し、その後反応混合物を濾液の導電率が９７μSになるまで水で透析濾過した。PＨを塩酸で６.０に調整し、クロライド濃度を最終濃度１５４mＭになるように調整し、ポリマー濃度を１００g／Lに調整した。最後に溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓を詰めて４℃で保存した。これにより約４７０mLの澱粉ＤＦＯ生成物、即ちグルコースサブユニットの約２４％が変性され、澱粉ＤＦＯ濃度１００ｇ／Lで３６mＭのキレート化剤濃度を有するものを得た。
【００６０】
実験４：４７ m Ｍキレート化剤および５５０ m Ｍ過ヨウ素酸とのＤＦＯ−澱粉コンジュケートの調製
洗浄されたガラス容器中に、澱粉粉（ＭＷ１２６,０００）５０ｇを水に溶解し５００ｍＬの容積にした。次いで、ＮaＩＯ4５８．８g（５５０mＭ）を混合物中に添加し、６０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電率が１６７μSになるまで水で透析濾過した（膜：ペリコン２ミニ５ＫＭＷＣＯ）。オキシ澱粉濃度を１６０g／Lに調製した。反応体容積は水とエタノールで３９５mLにして、３０容量％エタノールの混合物を得た。ＤＦＯ（１９．２８ｇ）を攪拌下に添加した。攪拌を６０分間継続し、その後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）１４．７mLを反応混合物中に添加した。次いで混合物を２０時間攪拌した。反応時間終了時にＮaＢＨ4１２．２g（８２５mＭ）を攪拌下にゆっくりと添加した。攪拌を１８０分間継続し、その後反応混合物を濾液の導電率が１４４μSになるまで水で透析濾過した。PＨを塩酸で６.０に調整し、クロライド濃度を最終濃度１５４mＭになるように調整し、ポリマー濃度を１００g／Lに調整した。最後に溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓を詰めて４℃で保存した。これにより約５１７mLの澱粉ＤＦＯ生成物、即ちグルコースサブユニットの約８９％が変性され、澱粉ＤＦＯ濃度１００ｇ／Lで４７mＭのキレート化剤濃度を有するものを得た。
【００６１】
実験５：４０ m Ｍキレート化剤および２２２ m Ｍ過ヨウ素酸とのＤＦＯ−澱粉コンジュケートの調製
洗浄されたガラス容器中に、澱粉粉（ＭＷ１２６,０００）５０ｇを水４７３mL中に溶解した。次いで、ＮaＩＯ4２３．７４g（２２２mＭ）を混合物中に添加し、６５分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電率が９０μSになるまで水で透析濾過した（膜：バイオマックス（Ｂｉｏｍａｘ）ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）２ミニ５ＫＭＷＣＯ）。オキシ澱粉濃度を１６３g／Lに調製した。反応体容積は水とエタノールで３８８mLにして、３０容量％エタノールの混合物を得た。ＤＦＯ（１９．４７ｇ）を攪拌下に添加した。攪拌を１５分間継続し、その後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）７．４２mLを反応混合物中に添加した。次いで混合物を２０時間攪拌した。反応時間終了時にＮaＢＨ4４．９９g（３３３mＭ）を攪拌下にゆっくりと添加した。攪拌を２００分間継続し、その後反応混合物を濾液の導電率が９６μSになるまで水で透析濾過した。PＨを塩酸で６.０に調整し、クロライド濃度を最終濃度１５４mＭになるように調整し、ポリマー濃度を１００g／Lに調整した。最後に溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓を詰めて４℃で保存した。これにより約５２９mLの澱粉ＤＦＯ生成物、即ちグルコースサブユニットの約３６％が変性され、澱粉ＤＦＯ濃度１００ｇ／Lで４０mＭのキレート化剤濃度を有するものを得た。
【００６２】
実験６：キレート剤 42 ｍＭおよび過ヨウ素酸塩 278 ｍＭを含むＤＦＯ−澱粉コンジュゲートの調製
清浄なガラス容器内で、澱粉粉末（ＭＷ126,000）50ｇを水445ｍＬに溶解した。次いで、ＮａＩＯ429.71ｇ（278ｍＭ）を混合物に加えて、65分間攪拌した。得られた混合物は、濾液の導電率が107μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーション（メンブラン：バイオマックス・ペリコン２ミニ、５Ｋ ＭＷＣＯ）に付した。その後、酸化澱粉濃度を169ｇ／Ｌに調節した。反応容積は、エタノール30体積％の混合物となるように、水とエタノールで393ｍＬに調節した。ＤＦＯ（19.72ｇ）を攪拌しながら添加した。18分間攪拌を続けた後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）10.00ｍＬを反応混合物に添加した。次に、混合物を20時間攪拌した。20時間の反応の後、攪拌しながら、ＮａＢＨ46.39ｇ（417ｍＭ）をゆっくりと反応溶液に添加した。180分間攪拌を続けた後、反応混合物を、濾液の導電率が91μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーションに付した。その後、ｐＨをＨＣｌで6.0に調節し、塩化物濃度を最終濃度が154ｍＭとなるように調節し、そしてポリマー濃度を100ｇ／Ｌに調節した。最後に、溶液をガラスバイアルに滅菌濾過し、止め栓をして、４℃で貯蔵した。これにより、グルコース・サブユニットの約45％が修飾され、澱粉−ＤＦＯ濃度100ｇ／Ｌにおける高分子量のキレート剤濃度が42ｍＭの澱粉−ＤＦＯ生成物約558ｍＬを得た。
【００６３】
実験７：キレート剤 43 ｍＭおよび過ヨウ素酸塩 334 ｍＭを含むＤＦＯ−澱粉コンジュゲートの調製
清浄なガラス容器内で、澱粉粉末（ＭＷ126,000）50ｇを水450ｍＬに溶解した。次いで、ＮａＩＯ435.72ｇ（334ｍＭ）を混合物に加えて、60分間攪拌した。得られた混合物は、濾液の導電率が110μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーション（メンブラン：バイオマックス・ペリコン２ミニ、５Ｋ ＭＷＣＯ）に付した。その後、酸化澱粉濃度を181ｇ／Ｌに調節した。反応容積は、エタノール30体積％の混合物となるように、水とエタノールで335ｍＬに調節した。ＤＦＯ（16.98ｇ）を攪拌しながら添加した。15分間攪拌を続けた後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）10.80ｍＬを反応混合物に添加した。次に、混合物を20時間攪拌した。20時間の反応の後、攪拌しながら、ＮａＢＨ46.54ｇ（501ｍＭ）をゆっくりと反応溶液に添加した。170分間攪拌を続けた後、反応混合物を、濾液の導電率が108μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーションに付した。その後、ｐＨをＨＣｌで6.0に調節し、塩化物濃度を最終濃度が154ｍＭとなるように調節し、そしてポリマー濃度を100ｇ／Ｌに調節した。最後に、溶液をガラスバイアルに滅菌濾過し、止め栓をして、４℃で貯蔵した。これにより、グルコース・サブユニットの約54％が修飾され、澱粉−ＤＦＯ濃度100ｇ／Ｌにおける高分子量のキレート剤濃度が43ｍＭの澱粉−ＤＦＯ生成物約474ｍＬを得た。
【００６４】
実施例５−−澱粉の酸化および還元がＤＦＯ−澱粉コンジュゲートのアミラーゼ消化を低下させる
前記実施例４の実験３および４で調製したＤＦＯ−澱粉コンジュゲートのα−アミラーゼによる消化速度を、屈折率とレーザ光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィーを用いて試験した。
実施例２に記載の手順と同様にして、消化試料を調製した。消化された試料を、試料の分子量分布を測定するためにＧＰＣカラムに注入した。
【００６５】
図３は、化工澱粉生成物それぞれについての、時間の関数としての重量平均分子量（ＷＡＭＷ）の変化のプロットを示す。これらのデータを表３にまとめる。
【００６６】
【表３】
n/a−検出不可
【００６７】
各実験において、澱粉の酸化および還元の度合いの高いものは、澱粉−ＤＦＯコンジュゲートのアミラーゼによる消化速度を低下させた。
【００６８】
実施例６−−澱粉−ＤＦＯコンジュゲートの酸化および還元を高めることが動物におけるクリアランスを低下させる
数種のＤＦＯ−酸化および還元された澱粉コンジュゲートのラットにおける生体内での血中クリアランスを試験した。前記実施例４の実験１〜７で調製した数種のＤＦＯ−酸化および還元された澱粉コンジュゲートを、スプレーグ−ドーリー(Sprangue-Dawley)ラットに、30分注入により投与量10ｍＬ／ｋｇで静脈注射（大腿深静脈）投与した。いずれの場合も、この実験について２または３体の動物を使用した。血液試料は、種々の時間点において大腿深静脈から採取した。その後、これら試料のＤＦＯ−澱粉コンジュゲート濃度を検査した。
【００６９】
図４は、時間の関数としての、ＤＦＯ−澱粉コンジュゲートの平均血中濃度のプロットを示す。実験１および２では、分子量46,000の澱粉を用いた。実験３〜７では、分子量126,000の澱粉を用いた。これらのデータを表４にまとめる。
【００７０】
【表４】
n/a−検出不可
【００７１】
澱粉の酸化および還元の度合いの高いものは、動物からの澱粉−ＤＦＯコンジュゲートクリアランスを低下させた。
【００７２】
実施例７−−デキストランの修飾
デキストラン修飾は、澱粉の酸化に関する実施例１に記載の方法を少し変更して行なった。簡単には、デキストランを約100ｇ／Ｌの濃度で攪拌しながら水性媒体に溶解した後、ＮａＩＯ4溶液（または固体のＮａＩＯ4）を加えてデキストランを酸化した。使用したＮａＩＯ4の量が、デキストラン酸化の量を支配した。次いで、反応混合物を精製し、酸化反応系から塩を除去した。次に、得られたジアルデヒド基（酸化反応により形成されたもの）を、ＮａＢＨ4を用いてアルコール基に還元した。最後に、反応混合物を再度精製して、反応混合物から塩を除去した。「修飾したデキストラン」は、その後、処方または更なる修飾のために準備された。
【００７３】
実施例８――酸化および還元されたデキストランの低下したアレルゲン性
酸化および還元されたデキストランを、スプレーグ−ドーリー(Sprangue-Dawley)ラットに、30分かけて投与量40ｍＬ／ｋｇで静脈注射（大腿深静脈）投与した。デキストランのビシナル水酸基の約100％を、過ヨウ素酸塩塩で酸化し、還元した。（後肢ではなく）前肢の僅かな膨張により、非常に少量のアレルギー反応が観られた。その後、動物は完全に麻酔から覚めた。
対照して、当量の投与量の天然デキストランをラットに注入すると、15分後、投与量のおよそ半分で、四肢（前肢および後肢）が膨潤する非常に強いアレルギー反応が観られて、投与を停止した。投与停止後すぐに動物の尾および全身に激しい浮腫ができて、動物はこの時点で死亡した。死亡は、デキストランに対するアレルギー反応によって引き起こされた気道の緊縮に起因する窒息により生じたものと考えられる。このラットの緊張は、デキストランに対するアレルギーにかかったことが分かる。
【００７４】
本発明は、種々の具体的でかつ好ましい態様および技術を参照して記載している。しかし、多数の変更および改良は、本発明の精神および範囲内に有る限り、成され得るものと解されるべきである。本明細書中の刊行物および特許は全て、本発明の属する分野において通常の知識を有する者の基準を示すものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 変性デンプンのアミラーゼ処理における重量平均分子量（ＷＡＭＷ）の経時変化のプロットである。
【図２】 変性デンプンの平均血中レベルの経時プロットである。
【図３】 酸化及び還元されたデンプン−ＤＦＯ結合体それぞれのアミラーゼ処理におけるＷＡＭＷの経時変化のプロットである。
【図４】 酸化及び還元されたデンプン−ＤＦＯ結合体の平均血中レベルの経時プロットである。
（発明の背景）
未変性多糖類は望ましくない生物学的特性を有することがある。例えば、血液循環からの消失が速い、劣化が速い、及び／又はアレルゲン性である。製薬組成物及び治療法通常用いられる２種類の多糖類は澱粉及びデキストランである。
【０００２】
澱粉は自然界で生じ、高度に生物適合性のポリマーである。澱粉が血流中に導入されると、それはアミラーゼにより速やかに消化される。消化産物の断片は糸球体ろ過及び／又は代謝により血管コンパートメントから速やかに除去される。このため（澱粉よりも）ヒドロキシエチル澱粉が、数例の臨床適応症のための長寿命血漿体積増量剤としてこれまで使用されてきた。澱粉分子をヒドロキシエチル化することによりこのポリマーの消化／排出の速度が遅くなる。
【０００３】
エチレンオキシド又は２−クロロエタノールを用いて澱粉をヒドロキシエチル化することはコロイド性血漿体積増量剤の製造のための通常の手法である。これらの方法には、高毒性のエチレンオキシドを使用すること、ヒドロキシエチル化の程度を制御することが困難であること、澱粉の水酸基の選択性が無いこと、副生成物が毒性であること、及びコストが高いこと等、種々の欠点がある。例えば、エチレンオキシドでのヒドロキシエチル化は、既にヒドロキシエチル化された位置、溶媒、残留水、及び反応混合物中の不純物又は副生成物を含むいずれのヒドロキシ位置でも生ずる。特定位置の変性は酵素分解からのより有効な保護を提供するけれども、澱粉分子上の位置の中で選択性が無いことにより、澱粉の高度なヒドロキシエチル化が必要である。
【０００４】
デキストランは過去４０〜５０年間種々の製薬的及び治療的調製に使用されてきた。デキストランの広範な用途には、血漿代替物／体積増量剤のための精製天然デキストラン、デキストラン活性コンジュゲート、鉄−デキストラン鉄補助剤、及びＭＲＩ造影剤のためのデキストラン被覆粒子等が含まれる。高度に精製された形態の殆どのデキストランは、患者人口の殆どに許容される。しかしながら、深刻なアナフィラキシー様の反応が起きることが知られており、死に至るほど深刻な場合がある。
【０００５】
製薬組成物及び治療法に用いられる多糖類のこれらの望ましくない特性は、天然もしくは未変性多糖類よりも望ましい生物学的特性を有する変性多糖類、例えば、変性澱粉及び変性デキストラン、に対する要求を示している。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、天然もしくは未変性多糖類よりも望ましい生物学的特性を有する変性多糖類、これらの変性多糖類を含有する製薬組成物、これらの変性多糖類を使用する方法、及びこれらの変性多糖類の望ましくない生物学的特性を低減する方法に関する。好ましくは、変性多糖類は酸化及び還元された多糖類である。好ましくは、多糖類は過ヨウ素酸塩で還元される。製薬組成物では、酸化及び還元された多糖類は製薬学的に許容されるビヒクル中で処方されうる。
【０００７】
本発明による変性のために好ましい多糖類は澱粉及び／又はデキストランである。酸化及び還元された澱粉は、好ましくは、未変性澱粉よりも長い血管半減期、未変性澱粉よりも遅いアミラーゼによる分解、及び／又は未変性澱粉よりも遅い動物からの消失を示す。酸化及び還元された溶解性デキストランは、好ましくは、デキストランと比べて低減されたアレルゲン性を示す。好ましくは、多糖類の酸化の程度が高まるほど血管半減期は長くなり、分解は遅くなり、消失は遅くなり、及び／又はアレルゲン性は小さくなる。
【０００８】
変性多糖類はキレート剤とのコンジュゲート（conjugate）のようなコンジュゲートの構成成分であってよく、又はこれを形成するために用いてよい。好ましいキレート剤はデフェロキサミン（ＤＦＯ）である。
【０００９】
発明の方法は、澱粉を酸化及び還元することにより澱粉の血管半減期を増加させること、及び哺乳類の血液循環中に酸化及び還元された澱粉を投与することにある。他の態様では、本発明の方法はデキストランを酸化及び還元することによりデキストランのアレルゲン性を低減し、酸化及び還元されたデキストランを哺乳類の血液循環中に投与することを包含する。投与されるデキストラン又は澱粉には、デキストラン又は澱粉のコンジュゲートが含まれる。
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、天然もしくは未変性多糖類よりも望ましい生物学的特性を有する変性多糖類、これらの変性多糖類を含有する製薬組成物、これらの変性多糖類を使用する方法、及びこれらの変性多糖類の望ましくない生物学的特性を低減する方法に関する。
【００１１】
未変性多糖類は、血液循環からの早急な消失、早急な分解、及び／又はアレルゲン性、のような望ましくない生物学的特性を有しうる。例えば、未変性澱粉は早急に分解し、哺乳類の血液循環から早急に消失する。未変性デキストランは、哺乳類の一部において強く、おそらくは致命的にアレルゲン性である。多糖類について好ましい特性には、血液循環からのより遅い消失、より遅い酵素消化、及び／又は低減されたアレルゲン性がある。本発明により変性された澱粉はより遅いアミラーゼによる分解、及び増大された血管半減期示す。本発明により変性されたデキストランは低減され、許容しうるアレルゲン性を示す。
【００１２】
（変性多糖類）
本発明に用いるのに好ましい多糖類にはデキストラン及びヒアルロン酸、澱粉、及び澱粉誘導体等が含まれる。デキストラン及び澱粉のような多糖類出発物質は水溶性調製物又は溶液として市販されている。「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、Ａ．オソル（Osol）編、マック出版（第１６版、１９８０年）、第７５９〜７６１頁を参照のこと。本発明の多糖類には米国特許第４，８６３，９６４号、同第５，２１７，９９８号、及び同第５，２６８，１６５号等に説明されているものが含まれる。これらに開示されている事項はここに説明として含める。
【００１３】
本発明には、酸化により、次いで還元により変性された多糖類、この変性多糖類の製薬組成物、酸化及び還元により多糖類を変成する方法、かかる変性により多糖類の生物学的特性を制御する方法が含まれる。酸化とその後の還元によって、得られる生体適合性多糖類の、消化が遅くされ、アレルゲン性が低減され、その他の生物学的特性の好ましい改変が提供される。多糖類上の水酸基が変性される度合又は程度は容易に制御することができ、生物学的特性の変性の程度を選択する方法を提供する。例えば、過ヨウ素酸塩の多糖類との反応は速く、定量的である。多糖類分子の酸化の程度は均質であり、容易且つ正確に制御できる。
【００１４】
得られる酸化及び還元された多糖類は、天然又は以前の変性多糖類が現在用いられている方法及び組成物に用いうる。かかる方法及び組成物には、コロイド性血漿体積増量剤、血液希釈、心肺バイパス装置のための初液、器官保存液、凍結防止液等がある。更に、本発明の方法及び変性多糖類は多糖類の酸化の程度を制御を提供し、そのことにより、異なるそれぞれの用途のための好適な生物学的特性を提供するために多糖類の変性を選択できる。例えば、多糖類上の水酸基の全て又はいずれかの部類の、例えば、約１０％〜１００％を酸化及び還元することによりその生物学的特性を改変できる。好ましくは、水酸基はビシナル水酸基であり、酸化は過ヨウ素酸塩を用いて行いうる。好ましくは、多糖類上の水酸基の全て又はいずれかの部類の約３０％〜約６０％が酸化及び還元されて、変性多糖類が動物から分解、消化、又は消失する速度が、未変性の多糖類と比べて遅くなる。好ましくは、多糖類上の水酸基の全て又はいずれかの部類の約２０％〜約８０％が酸化及び還元されて、未変性の多糖類と比べて変性多糖類のアレルゲン性が低減される。
【００１５】
変性される多糖類は多糖類−薬品コンジュゲートの構成成分であってよく、又は変性多糖類は多糖類−薬品コンジュゲートを形成するために用いてもよい。多糖類−薬品コンジュゲートにおける本発明による変性の効果は多糖類そのものの変性と同様であり、例えば、より遅い分解及び／又は低減されたアレルゲン性である。しかしながら、多糖類−薬品コンジュゲートの変性又は本発明により変性された多糖類から多糖類−薬品コンジュゲートを形成することは、それ以外に有利な効果を得ることができる。
【００１６】
例えば、多糖類−薬品コンジュゲートの血管半減期又は血漿残留時間は多糖類酸化を適度に行うことにより制御できる。多糖類又は多糖類コンジュゲートの分解が薬品の放出を制御する場合、本発明は、薬品の制御された薬物動態学の選択、又は持続した放出のための方法を提供する。この場合、多糖類酸化の程度は所望の血管半減期又はそれぞれ異なる多糖類−薬品コンジュゲート系及び特定の臨床的な適応症のために最適の効果を提供する放出速度のために選択される。
【００１７】
多糖類コンジュゲートの分解の速度の制御環境において、コンジュゲート又は放出される薬品の効果を改変できる：１）薬品−多糖類コンジュゲートは薬理学的に不活性であるが、薬品−多糖類コンジュゲートの断片の開裂の後は、薬理学的に活性になる。２）薬品−多糖類コンジュゲートは活性であり、断片（活性又は不活性）の開裂においてより迅速に排出される。３）薬品−多糖類コンジュゲート及び断片の両方が薬理学的に活性であるが、変性の結果、多糖類−薬品コンジュゲートの滞留時間、局在化又は区分化が増大する。４）多糖類主鎖の開裂によってポリマーに結合した活性成分の薬理学的プロファイルが変化する。５）多糖類のポリマーシェル中に薬品が包封されることによりカプセルからの薬品の放出が制御され、多糖類の変性によりシェルの分解が改変される。本発明による変性に効果がある他の多糖類及び多糖類コンジュゲートには、活性成分が栄養化合物、医薬品、酵素、造影剤、除草剤、殺虫剤等であるコンジュゲート；生物分解ポリマー、被覆、又は時間放出顆粒のような分解速度の制御が望まれる組成物に用いられる多糖類がある。
【００１８】
（変性澱粉）
本発明には、酸化により、次いで還元により変性された澱粉、この変性澱粉の製薬組成物、酸化及び還元により澱粉を変成する方法、かかる変性により澱粉の生物学的特性を制御する方法が含まれる。酸化とその後の還元工程によって、得られる生体適合性澱粉の、消化が遅くされ、動物から消失する速度が遅くされる。澱粉上の水酸基が変性される度合又は程度は容易に制御することができる。酸化の程度を制御及び選択することにより変性澱粉の酵素消化（及び得られる持続性又は消失−排出）の速度が決定される。従って、本発明は変性澱粉又は変性澱粉のコンジュゲートの血管半減期を決定及び選択する方法を提供する。過ヨウ素酸塩の澱粉との反応は速く（反応は数分の内に終了する。）、ビシナル水酸基の間の結合の開裂に特異的であり、そして定量的である。従って、澱粉分子の酸化の程度は均質であり、容易に制御できる。好ましくは酸化される水酸基はビシナル水酸基であり、酸化は過ヨウ素酸塩を用いて行われる。
【００１９】
澱粉の酸化／還元がアミラーゼで消化される速度を決定することが示されている。澱粉分子の酸化の度合が高いほど、消化の速度は遅くなる。同様に、澱粉の酸化／還元が動物から消失する速度を遅くことが示されている。澱粉分子の酸化の度合が高いほど、消失速度は遅くなる。適切な酸化の度合を選択することにより、消化又は消失の望ましい速度が得られる。例えば、澱粉上の水酸基の全て又はいずれかの部類の、例えば、約２０％〜９０％を酸化及び還元することにより、その消化速度又は動物からの消失のような、その生物学的特性を改変できる。好ましくは、澱粉上の水酸基の全て又はいずれかの部類の約３０％〜約６０％が酸化及び還元されて、変性澱粉が動物から分解、消化、又は消失する速度が、未変性の澱粉と比べて遅くなる。ある条件においては、澱粉上の水酸基の全て又はいずれかの部類の約３０％が酸化及び還元されて、未変性の澱粉と同程度の速さでアミラーゼにより消化される。またある条件においては、澱粉上の水酸基の全て又はいずれかの部類の約６０％が酸化及び還元されて、非常に遅い速さでアミラーゼにより消化され、この澱粉は消化にほぼ不活性となる。
【００２０】
得られる酸化及び還元された澱粉は、従来の澱粉が現在用いられている方法及び組成物に用いうる。かかる方法及び組成物には、コロイド性血漿体積増量剤、血液希釈、心肺バイパス装置のための初液、ドナー器官保存液、凍結防止液等がある。更に、本発明の方法及び変性澱粉は澱粉の酸化の程度の制御を提供し、そのことにより、異なるそれぞれの用途のための好適な血管半減期を提供するために澱粉の変性を選択できる。変性される澱粉は澱粉−薬品コンジュゲートの構成成分であってよく、又は変性澱粉は澱粉−薬品コンジュゲートを形成するために用いてもよい。澱粉−薬品コンジュゲートにおける本発明による変性の効果は澱粉そのものの変性と同様であり、例えば、より遅い分解及び／又は低減されたアレルゲン性である。しかしながら、澱粉−薬品コンジュゲートの変性又は本発明により変性された澱粉から澱粉−薬品コンジュゲートを形成することは、それ以外に有利な効果を得ることができる。
【００２１】
例えば澱粉ポリマー（澱粉ポリマーコンジュゲート(conjugate)）の排出（または放出）速度が特殊用途に対してコントロールされ、かつ選択され得る。化工澱粉が、例えば血管中半減期約２〜約４時間を有する医療用対照剤中のコンジュゲートとしての用途；薬剤が体内に約４〜24時間存続することが必要な金属中毒治療の用途；約12〜48時間持続する化工澱粉が必要なプラズマ体積膨張の用途；または化工澱粉が２〜約５日間の循環系中に存続することが必要な鉄分過負荷の用途；に対して選択される血管中持続性を有するように生成され得る。約30％を超えて、好ましくは約30〜約45％酸化還元された澱粉が、より短い半減期を必要とする用途に好適である。酸化還元されたヒドロキシル基の約60％、好ましくは約45〜約60％を有する澱粉が、より長い半減期を必要とする用途に好適である。
【００２２】
澱粉薬剤コンジュゲート血管中半減期またはプラズマ抵抗時間は、適当な澱粉酸化度の選択によってコントロールしてもよい。澱粉コンジュゲートを有する澱粉の分解により上記薬剤の放出をコントロールする場合に、本発明はコントロールされたまたは持続された薬剤の放出を選択する方法を提供する。この場合、澱粉の酸化度は、それぞれ異なる澱粉薬剤コンジュゲート系および特殊な臨床適応に対する最適な有効性を提供する所望の血管中半減期（または放出速度）に対して選択される。
【００２３】
澱粉コンジュゲートの分解速度の制御が放出されるコンジュゲートまたは薬剤の効果を変化させ得る環境は以下を含む：1)上記薬剤‐澱粉コンジュゲートは薬理学的に活性でないが、主鎖の開裂後に上記薬剤‐澱粉コンジュゲートのフラグメント(fragment)が薬理学的に活性である。2)上記薬剤‐澱粉コンジュゲートが活性であり、開裂時に（活性またはそうでない）上記フラグメントが素早く排出される。3)上記薬剤‐澱粉コンジュゲートおよびフラグメントの両方が薬理学的に活性であるが、上記薬剤‐澱粉コンジュゲートおよびフラグメントの増加した滞留時間および局在化または区画化が修飾に起因する。4)上記ポリマーにコンジュゲートされる活性の薬理学的プロフィールは上記澱粉主鎖の開裂によって変化する。5)澱粉のポリマーシェル内への薬剤のカプセル化は、結果としてカプセルからの薬剤の放出を制御することになり、かつ上記シェルの崩壊は上記澱粉の修飾によって変化する。
【００２４】
修飾デキストラン
デキストランの化学的修飾により、天然デキストラン、デキストラン誘導コンジュゲート、またはデキストラン含有配合へのアレルゲン性反応を低減し、最小にし、または排除することができ、このことは数名のヒト（および他の定温種）において体験されている。ザ・フィジシャンズ・デスク・リファレンス・プロダクト・インフォメーション・フォー・「ＩＮＦｅＤ」(the Physicians Desk Reference product information for "INFeD")、第2478頁、第51版、1997年に記載のように、アナフィラキシー応答は死に至るほど激しく成り得る。
【００２５】
デキストランは、長い間、プラズマ体積膨張および血液希釈を含む様々な医療用治療および組成物に用いられてきた。デキストランは、一部製造者の特性、例えば粘度、平均分子量および分子量範囲、排出/除去速度、および分岐度等をコントロールする能力による、しばしばプラズマ体積膨張に用いられる他のコロイドに好ましい。本発明は、デキストラン、デキストラン配合物およびデキストランコンジュゲートの有用性を向上するために修飾(modification)およびコントロールされ得るデキストランの更に別の特性を提供する。
【００２６】
デキストラン分子を酸化してジアルデヒド‐デキストランを生成し、次いで還元工程を行うことにより、デキストランに対するアレルギー性応答を低減または排除する、修飾デキストラン、酸化および還元デキストランを生成する。例えば、デキストラン中のすべて、または１組のヒドロキシル基の約10％以上または100％以下を、生物学的特性を変化させるために、酸化および還元してもよい。好ましくは、上記ヒドロキシル基はビシナルヒドロキシル基であり、酸化はペルヨーデートを用いて行われる。酸化および還元前のデキストランに比較して、修飾デキストランのアレルギー性を低減するために、好ましくは、デキストラン中のすべて、または１組のヒドロキシル基の約20〜約80％を酸化および還元してもよい。
【００２７】
本発明は、天然デキストラン、公知の方法により、または公知の用途のために既に修飾したデキストラン（例えば前述のもの）、またはコンジュゲートを有するデキストラン成分に適用可能である。例えば、既に配合したデキストラン生成物（例えば、鉄補給用の鉄(III)デキストラン、ＭＲＩ強化用の鉄‐デキストラン）を、アレルゲン性応答を低減または排除するために、酸化および還元によって修飾してもよい。
【００２８】
アレルゲン性応答を低減または排除するためのデキストランの修飾には、酸化は好ましい方法であるが、化学的修飾の他の方法も有効である。例えば、好適な修飾には、ヒドロキシエチル化、アルキル化、還元、エステル化等を含んでもよい。
【００２９】
酸化および還元によって多糖類を修飾する方法
多糖類、例えば澱粉またはデキストランの修飾は、多糖類、例えば澱粉またはデキストランを約100ｇ/Ｌの濃度で水性媒体中に溶解することによって行ってもよい。撹拌しながら、好適な酸化剤、好ましくはペルヨーデート、好ましくはＮａＩＯ4の溶液、ＮａＩＯ4の固形またはＨＩＯ4を加えて多糖類、例えば澱粉またはデキストランを酸化する。用いられる酸化剤、例えばＮａＩＯ4の量は、多糖類、例えば澱粉またはデキストランの酸化または修飾の量をコントロールする。上記反応混合物を次いで従来の方法により精製して、上記酸化反応による塩を除去し、多糖類、例えば澱粉またはデキストランを酸化により精製されるジアルデヒドおよび他のアルデヒド部分を用いて回収する。次に、多糖類、例えば澱粉またはデキストランを酸化により生成されるジアルデヒドおよび他のアルデヒド部分を用いて還元する。好ましい還元剤はＮａＢＨ4である。ジアルデヒド官能基はそれらによってジアルコール基に変換され、アルデヒド類はなお還元される。最終的に、上記反応混合物は従来の方法によって再度精製して、上記反応混合物からの塩を除去する。
【００３０】
多糖類、例えば澱粉またはデキストランを酸化および還元する別の好適な方法が、1998年12月8日に米国特許第5,847,110号として発行された米国特許出願第08/911,991号に記載されており、その記載をここに挿入する。
【００３１】
上記酸化および還元された多糖類、例えば酸化および還元された澱粉または酸化および還元されたデキストランを次いで配合用として用意する。代わりに、酸化多糖類、例えば酸化澱粉または酸化デキストランの還元前に、上記酸化多糖類、例えば酸化澱粉または酸化デキストランのアルデヒド官能基を薬剤、キレート剤、または他の活性部分にコンジュゲートしてコンジュゲートを生成してもよい。
【００３２】
本発明の酸化および還元の方法は、多糖類を修飾してその生物学的特性を変える他の従来の有用な方法に比較して、様々な優位性を有する。例えばヒドロキシエチル化に比較して、酸化剤との反応が化学量論的であるため、酸化度が非常にコントロールし易い。酸化はより特定のものであって、通常グルコース、または他の糖類、サブユニットの１つのサイトに限定される。加えて、上記酸化反応の副生成物は毒性が低く、容易に除去される。酸化体、例えば過ヨウ素酸は電解法によって再生され得るため、酸化は費用効果を有する。
【００３３】
酸化および還元された多糖類を用いるコンジュゲート
キレート剤または他の分子を多糖類に共有結合することが、様々な理由で優位性を有するものであることを見出した。例えば、多糖類との結合は、患者におけるキレート剤または他の分子の分布を変えることができる。例えば、本発明を限定するものではないが、キレート剤および多糖類のコンジュゲートは、キレート剤単独より血管中で保持されると考えられている。コンジュゲートの別の優位な特徴には、溶液、配合物およびプラズマ中のキレート剤または他の分子の、変化した生分布（biodistribution）、低減された毒性、向上した安定性、およびキレート剤または他の分子のより大きな有効性を含んでもよい。
【００３４】
上記多糖類は、好ましくは酸化および還元された多糖類である。酸化および還元に好適な多糖類には、デキストランおよびヒアルロン酸、澱粉および澱粉誘導体等が挙げられる。多糖類出発材料、例えばデキストランおよび澱粉は、水溶性調製品または水溶液として市販されている。A. オーソル(Osol)のレミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンス(Remington's Pharmaceutical Sciences)、マック・パブリッシング(Mack Publishing)発行（第16版、1980年）第759〜761ページ参照。本発明の多糖類には、米国特許第4,863,964号、同5,217,998号および同5,268,165号に記載のものが挙げられ、その開示をここに挿入する。
【００３５】
上記酸化および還元された多糖類は、所望の生物学的または治療的用途に対して有効である十分な時間をかけて、上記キレート剤または他の分子を患者に運ぶのに十分な安定性を有する。加えて、上記多糖類は、患者が上記治療に対する不適切な有害な反応を有さない、十分に良好な寛容性を有し(well-tolerated)、かつ無毒性（例えば非アレルゲン性）である。
【００３６】
コンジュゲートの調製
キレート剤または他の分子が上記多糖類または酸化多糖類に共有結合してコンジュゲートを形成する様々な方法がある。上記キレート剤または他の分子は、インヴィトロで測定した所望の特性が実質的に好ましくはコンジュゲートしていないキレート剤のオーダーに維持されるように、上記多糖類または酸化多糖類に結合される。多糖類または酸化多糖類を用いてキレート剤または他の分子のコンジュゲートを形成する１つの好ましい方法は、アミノ基、例えばデフェロキサミン(deferoxamine)の３級アミノ基を上記多糖類または酸化多糖類に結合する方法である。そのようなアミノ基は多糖類のカルボキシル基と共有結合を形成してアミド結合を形成することができる。
【００３７】
好ましくは、上記キレート剤または他の分子のアミノ基はアルデヒド
部分と共有結合を形成する。初期反応において、上記キレート剤または他の分子のアミンはアルデヒドと反応してシッフ(Schiff)塩基を形成し、上記シッフ塩基は第２の反応において還元されてより安定な共有結合を得る。アルデヒド基は公知の方法、例えばナトリウムメタペルヨーデートを用いるカルボハイドレートまたは他のジオールのジアルデヒドへの酸化によって、上記多糖類に導入される。M.B.ウィルソン(Wilson)等のイミューノフルオレッセンス・アンド・リレイテッド・ステイニング・テクニークス(Immunofluorescence and Related Staining Techniques)、W.ナップ(Knapp)等のElsevier/North Holland Biomedical Press (1978年)、第215頁、フレミング(Flemming)等のActa Biol. Med. Ger.、第30巻、第177頁(1973年)、およびS.C.タム(Tam)等のP.N.A.S.USA、第73巻、第2128頁（1976年）参照。いくつかの用途では、キレート剤または他の分子の末端アミノ基は、ジアルデヒド結合剤、例えばグルタルアルデヒドの使用によって、ポリマーのアミノ基に直接結合していてもよく、例えばナトリウムボロハイドライドを用いて還元する。
【００３８】
より好ましいキレート剤コンジュゲートは、デフェロキサミンを薬理学的に適用可能な多糖類または酸化多糖類に共有結合することにより調製される。デフェロキサミン（Ｎ‐[5‐[3‐[(5‐アミノペンチル)ヒドロキシカルバモイル]プロピオンアミド]ペンチル]‐3‐[[5‐(Ｎ‐ヒドロキシアセトアミド)ペンチル]カルバモイル]プロピオノヒドロキサミン酸）およびその薬理学的に適用可能な塩の調製方法が、プレログ(Prelog)等の「Helv. Chim. Acta.」、第45巻、第631頁（1962年）；ビッケル(Bickel)等の「Helv. Chim. Acta.」、第46巻、第1385頁（1963年）；独国特許明細書第1,186,076号；および米国特許第4,419,365号、同4,987,253号および同5,493,053号に開示されており、それらの開示をここに挿入する。そのような塩には、メタンスルホン酸、リン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、クエン酸等の酸付加塩が挙げられる。他の好適なキレート剤には、2,3‐ジヒドロキシ安息香酸、ＤＴＰＡ、ロドトルイル酸、コリルヒドロキサム酸、エチレンジアミン‐Ｎ,Ｎ'‐ビス(2-ヒドロキシフェニル酢酸)、イソニアジド‐ピリドキサルヒドロゾン、1,2‐ジメチル‐3‐ヒドロキシピリド‐4‐オンおよびニトリロトリアセテートが挙げられる。これらのキレート剤は単独で用いても組合せて用いてもよい。
【００３９】
キレート剤コンジュゲートの作製方法には、米国特許第4,863,964号、同5,217,998号および同5,217,998号、および1998年12月8日に米国特許第5,847,110号として発行された米国特許出願第08/911,991号に記載されており、その記載をここに挿入する。
【００４０】
キレート剤または他の分子のカルボキシルまたはカルボニル基との反応により得られる多糖類に対するモル比は、ポリマー中の反応基数、立体障害、シッフ塩基またはアミド生成の速度および程度等のファクターに依存して広く変化可能である。キレート剤または他の分子の１を超える分子が多糖類の各分子に結合することができる。例として、デフェロキサミンのデキストランに導入されたアルデヒド基との反応、次いで還元によって、約0.7gのデフェロキサミンを約2.5gの反応デキストラン40に結合することができる。
【００４１】
酸化および還元多糖類の投与
酸化および還元多糖類は、所望の生物学的または治療効果を提供するのに十分な血管および局部量を得るのに有効な様々なルートにより投与することができる。通常の投与ルートは非経口、例えば静脈または皮下である。酸化および還元多糖類は、好ましくは患者、例えば４足獣、哺乳動物またはヒトへの投与に適した水性溶媒中の溶液または懸濁液として投与される。好ましい医薬組成物は非発熱性である。好ましくは、酸化および還元多糖類は、溶液として、非経口的に、例えば筋内、腹膜内、皮下、眼内または静脈注射または点滴、または頬、経口、肺、直腸または膣ルートにより投与される。適当な投与量は、治療される疾患；患者または患者の年齢、身長および体重；投与モード；特定酸化および還元多糖類の特性等を含む、治療医師の判断による適当な臨床ファクターに従って調節される。
【００４２】
本発明は以下の実施例の記載により更に詳細に説明される。これらの実施例は、本発明の特定の態様を表すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４３】
実施例
実施例１ 用いた元の澱粉は未修飾ワックス状メイズ澱粉（ＭＷ126,000）であり、Laevosan（Linz、Austria）から得られ、ロット43572,PN 1021Bである。これらの修飾多糖類の調製に用いたすべての水は脱パイロジェン水であり、すべての他の容器/器具を使用前に脱パイロジェン化した。可能であれば、反応およびごみを層流フードして静脈および他の非経口投与用のこれら溶液の純度保護した。反応は周囲温度で行い、いくつかの場合反応混合物が温まらないように冷却を行った。
【００４４】
実験１：過ヨウ素酸塩 175 ｍＭを含む化工澱粉の調製
清浄なガラス容器内で、澱粉粉末）30ｇを水300ｍＬに溶解した。これに、ＮａＩＯ411.23ｇ（175ｍＭ）を除々に加えて、この混合物を105分間攪拌した。得られた混合物は、濾液の導電率が25μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーション（メンブラン：ペリコン２ミニ、５Ｋ ＭＷＣＯ、0.1ｍ2）に付した。その後、酸化澱粉濃度を100ｇ／Ｌに調節した。得られた溶液を濾液の導電率が58μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーションに付した。その後、ｐＨをＨＣｌで6.3に調節し、塩化物濃度を最終濃度が154ｍＭとなるように調節し、そしてポリマー濃度を102ｇ／Ｌに調節した。最後に、溶液をガラスバイアルに滅菌濾過し、止め栓をして、４℃で貯蔵した。これにより、グルコース・サブユニットの約28％が修飾された、化工澱粉生成物約192ｍＬを得た。
【００４５】
実験２：２２２ m Ｍ過ヨウ素酸塩での変性澱粉の調製
洗浄したガラス容器中で澱粉粉３０gを３００mLの水に溶解した。これにＮaＩＯ4１４.２５g（２２２mＭ）をゆっくり添加し、混合物を６０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電性が２７μSになるまで水に対する透析濾過（膜：ペリコン（Ｐellicon）２, ５Ｋ ＭＷＣＯ，０.５m2）を行った。オキシ澱粉の濃度は１００g／Lに調製した。攪拌下にＮaＢＨ4（２.２７g）をオキシ澱粉溶液（１８０mL）に添加し、３３３mＭのＮaＢＨ4濃度を得た。反応物を９０分間攪拌した。得られた溶液を濾液の導電率が３５μSに達するまで水に対して透析濾過した。溶液のpＨは塩酸で６.５に調整し、ポリマー濃度は１００g／Lに調整した。最後に、クロライド濃度を１５４mＭに調整した。ついで溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓をして４℃で保存した。これにより、約３６％のグルコースサブユニットが変性された変性澱粉生成物約１３３mLを得た。
【００４６】
実験３：２７８ m Ｍ過ヨウ素酸塩での変性澱粉の調製
洗浄したガラス容器中で澱粉粉３０gを３００mLの水に溶解した。これにＮaＩＯ4１７．８４g（２７８mＭ）をゆっくり添加し、混合物を９０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電性が１３μSになるまで水に対する透析濾過（膜：ペリコン（Ｐellicon）２, ５Ｋ ＭＷＣＯ，０.５m2）を行った。オキシ澱粉の濃度は１００g／Lに調製した。攪拌下にＮaＢＨ4（３．０９g）をオキシ澱粉溶液（１９６mL）に添加し、４１７mＭのＮaＢＨ4濃度を得た。反応物を１８５分間攪拌した。得られた溶液を濾液の導電率が４５μSに達するまで水に対して透析濾過した。溶液のpＨは塩酸で５.５に調整し、ポリマー濃度は１００g／Lに調整した。最後に、クロライド濃度を１５４mＭに調整した。ついで溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓をして４℃で保存した。これにより、約４５％のグルコースサブユニットが変性された変性澱粉生成物約１５１mLを得た。
【００４７】
実験４：３３４ m Ｍ過ヨウ素酸塩での変性澱粉の調製
洗浄したガラス容器中で澱粉粉３０gを３００mLの水に溶解した。これにＮaＩＯ4２１．４３g（３３４mＭ）をゆっくり添加し、混合物を１０５分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電性が４３μSになるまで水に対する透析濾過（膜：ペリコン（Ｐellicon）２, ５Ｋ ＭＷＣＯ，０.５m2）を行った。オキシ澱粉の濃度は１００g／Lに調製した。攪拌下にＮaＢＨ4（３．６６g）をオキシ澱粉溶液（１９３mL）に添加し、５０１mＭのＮaＢＨ4濃度を得た。反応物を１８５分間攪拌した。得られた溶液を濾液の導電率が３５μSに達するまで水に対して透析濾過した。溶液のpＨは塩酸で４．４に調整し、ポリマー濃度は１００g／Lに調整した。最後に、クロライド濃度を１５４mＭに調整した。ついで溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓をして４℃で保存した。これにより、約５４％のグルコースサブユニットが変性された変性澱粉生成物約１２７mLを得た。
【００４８】
実施例２−澱粉の酸化および還元がアミラーゼ消化を減速する
上記実験２、３および４において得られた変性澱粉生成物を屈折率およびレーザ光散乱検索を有するゲル・パミエーション・クロマトグラフィーを用いてα−アミラーゼによる消化率を測定した。
【００４９】
α−アミラーゼ溶液（豚の膵臓からのシグマＡ−６２５５、ロット３３Ｈ８０７５、タイプ１・Ａ DFP処理３０mlタンパク質／mＬ、７９０ユニット／mgタンパク質）はストック溶液１：５０を０.９％ＮaＣl水溶液で希釈することにより調製した。以下の方法によりガラス試験管中に消化サンプルを調製した：試験管中に０.９％NaCl水溶液０.５mL、５０mＭＣaＣl2０.１mL、ＨＥＰＥＳ（pＨ７）０.１mLおよび（前記）α−アミラーゼ溶液１０mLを加え、よく混合した。次いで、１０.０mLの変性（酸化および還元）澱粉（１００g／L）を試験管中に加え、それをボーテックス（ｖｏｒｔｅｘ）して室温で保持した。所定時間後に、２００μLのアミラーゼ／澱粉溶液をサンプルし、０.８mLのＧＰＣ溶出液で希釈した後、十分に混合する。次いで、サンプルの分子量分布を測定するためＧＰＣカラムにインジェクトした。
【００５０】
図１は各々の変性澱粉生成物の時間の関数に対する平均分子量の変化をプロットしたものである。これらのデータは表１に与えられる。
【００５１】
【表１】
表１−初期ＷＡＭＷ％の時間に対する変化
各々の実験において、澱粉の酸化および還元がそのアミラーゼによる分解を減少した。
【００５３】
実施例３−酸化および還元澱粉が動物中でより徐々にクリアーされる
いくつかの変性（酸化および還元）澱粉のラット中での生体内血液クリアランスを測定した。上記実験２〜４で調製した変性澱粉生成物をスプラーギュウ−ドウレイ（Ｓprague−Ｄawley）ラットに動物用丸薬として与えられる１０mL／kgの投与量で（大腿部静脈）から投与した。２２２mＭおよび２７８mＭのＮaＩＯ4で変性された澱粉サンプルを各々３匹の動物に注射した。２匹の動物には３３４mＭのＮaＩＯ4で変性した澱粉を注射した。血液サンプルを３０分、１時間、２時間、４時間および８時間で大腿静脈から取り出した。これらのサンプルを変性澱粉濃度毎にアッセイを行った。
図２に変性澱粉の平均血球濃度を時間の関数としてプロットしたものを示す。これらのデータを表２に示す。
【００５４】
【表２】
表２−血漿中に残存する初期投与量（％）の変性澱粉生成物の平均血中レベル
各々の実験において、澱粉の酸化および還元がその動物中からのクリアランスを減少した。
【００５６】
実施例４−澱粉デフェロキサミンコンジュケートの合成における澱粉の変性
次のいくつかの実験はＤＦＯ−澱粉生成物および該澱粉またはそのコンジュケートの酸化および還元を説明する。各々未変性ワックス化トウモロコシ澱粉（澱粉）ＭＷ１２６０００または４６０００およびデフェロキサミンメシレート（ＤＦＯ）を原料物質として用いた。澱粉はレポザン（Laevosan)（オーストリアのリンツ）から得た。ＤＦＯはマルマシア・アンド・アップジョン（ミシガン州カラマズウ）ロット２２ＡＤＦ、ＰＮ１００１Ｂから得た。これらのバッチに使用したすべての水はデピロジェネイテット水（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｗａｔｅｒ）であり、すべての他の容器（道具）は使用前に滅菌された。可能な場合には、反応および処理は層流フード内で、これらの溶液の純度を保つために行う。すべての反応は常温（実験室温度）よりも少し下の温度で行った。
【００５７】
実験１：３４ m Ｍキレート化剤および１５０ m Ｍ過ヨウ素酸とのＤＦＯ−澱粉コンジュケートの調製
洗浄されたガラス容器中に、澱粉粉（ＭＷ４６,０００）９９.８ｇを水１０００mL中に溶解した。次いで、ＮaＩＯ4３２.０g（１５０mＭ）を混合物中に添加し、９０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電率が１０３μSになるまで水で透析濾過した（膜：バイオマックス（Ｂｉｏｍａｘ）５ＫＭＷＣＯ）。オキシ澱粉濃度を２４５g／Lに調製した。反応体容積は水とエタノールで２８８mLにして、３０容量％エタノールの混合物を得た。ＤＦＯ（２２.２６ｇ）を攪拌下に添加した。攪拌を１時間継続し、その後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）５.６５mLを反応混合物中に添加した。次いで混合物を２０時間攪拌した。反応時間終了時に水１４４mLを混合物中に添加し、更にＮaＢＨ4３.８７g（２２５mＭ）をゆっくりと添加した。攪拌を１時間継続し、その後反応混合物を濾液の導電率が３０μSになるまで水で透析濾過した。PＨを塩酸で６.０に調整し、クロライド濃度を最終濃度１５４mＭになるように調整し、ポリマー濃度を１００g／Lに調整した。最後に溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓を詰めて４℃で保存した。これにより約５１５mLの澱粉ＤＦＯ生成物、即ちグルコースサブユニットの約２４％が変性され、澱粉ＤＦＯ濃度１００ｇ／Lで３４mＭのキレート化剤濃度を有するものを得た。
【００５８】
実験２：４５ m Ｍキレート化剤および５５０ m Ｍ過ヨウ素酸とのＤＦＯ−澱粉コンジュケートの調製
洗浄されたガラス容器中に、澱粉粉（ＭＷ４６,０００）１００ｇを水９７０mL中に溶解した。次いで、ＮaＩＯ4１１７．７g（５５０mＭ）を混合物中に添加し、６０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電率が１６７μSになるまで水で透析濾過した（膜：ペリコン２バイオマックス５Ｋ ＭＷＣＯ）。オキシ澱粉濃度を１６６g／Lに調製した。反応体容積は水とエタノールで５４０mLにして、３０容量％エタノールの混合物を得た。ＤＦＯ（２７．０９ｇ）を攪拌下に添加した。攪拌を１時間継続し、その後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）１３．８mLを反応混合物中に添加した。次いで混合物を１８時間攪拌し、そのとＢＰＣ７ｍＭを加えて、さらに２時間攪拌を続けた。反応時間終了時に水５２７mLを混合物中に添加し、更にＮaＢＨ4１７．１７g（８２５mＭ）をゆっくりと添加した。攪拌を３時間継続し、その後反応混合物を濾液の導電率が１２４μSになるまで水で透析濾過した。PＨを塩酸で６.０に調整し、クロライド濃度を最終濃度１５４mＭになるように調整し、ポリマー濃度を１００g／Lに調整した。最後に溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓を詰めて４℃で保存した。これにより約５１５mLの澱粉ＤＦＯ生成物、即ちグルコースサブユニットの約８９％が変性され、澱粉ＤＦＯ濃度１００ｇ／Lで４５mＭのキレート化剤濃度を有するものを得た。
【００５９】
実験３：３６ m Ｍキレート化剤および１５０ m Ｍ過ヨウ素酸とのＤＦＯ−澱粉コンジュケートの調製
洗浄されたガラス容器中に、澱粉粉（ＭＷ１２６,０００）５０ｇを水４６５mL中に溶解した。次いで、ＮaＩＯ4１６.０g（１５０mＭ）を混合物中に添加し、６０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電率が１３６μSになるまで水で透析濾過した（膜：ペリコン２ミニ５ＫＭＷＣＯ）。オキシ澱粉濃度を１６５g／Lに調製した。反応体容積は水とエタノールで３８５mLにして、３０容量％エタノールの混合物を得た。ＤＦＯ（１９．５１ｇ）を攪拌下に添加した。攪拌を５分間継続し、その後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）４．９５mLを反応混合物中に添加した。次いで混合物を１９時間攪拌した。反応時間終了時にＮaＢＨ4３.３９g（２２５mＭ）を攪拌下にゆっくりと添加した。攪拌を９０分間継続し、その後反応混合物を濾液の導電率が９７μSになるまで水で透析濾過した。PＨを塩酸で６.０に調整し、クロライド濃度を最終濃度１５４mＭになるように調整し、ポリマー濃度を１００g／Lに調整した。最後に溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓を詰めて４℃で保存した。これにより約４７０mLの澱粉ＤＦＯ生成物、即ちグルコースサブユニットの約２４％が変性され、澱粉ＤＦＯ濃度１００ｇ／Lで３６mＭのキレート化剤濃度を有するものを得た。
【００６０】
実験４：４７ m Ｍキレート化剤および５５０ m Ｍ過ヨウ素酸とのＤＦＯ−澱粉コンジュケートの調製
洗浄されたガラス容器中に、澱粉粉（ＭＷ１２６,０００）５０ｇを水に溶解し５００ｍＬの容積にした。次いで、ＮaＩＯ4５８．８g（５５０mＭ）を混合物中に添加し、６０分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電率が１６７μSになるまで水で透析濾過した（膜：ペリコン２ミニ５ＫＭＷＣＯ）。オキシ澱粉濃度を１６０g／Lに調製した。反応体容積は水とエタノールで３９５mLにして、３０容量％エタノールの混合物を得た。ＤＦＯ（１９．２８ｇ）を攪拌下に添加した。攪拌を６０分間継続し、その後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）１４．７mLを反応混合物中に添加した。次いで混合物を２０時間攪拌した。反応時間終了時にＮaＢＨ4１２．２g（８２５mＭ）を攪拌下にゆっくりと添加した。攪拌を１８０分間継続し、その後反応混合物を濾液の導電率が１４４μSになるまで水で透析濾過した。PＨを塩酸で６.０に調整し、クロライド濃度を最終濃度１５４mＭになるように調整し、ポリマー濃度を１００g／Lに調整した。最後に溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓を詰めて４℃で保存した。これにより約５１７mLの澱粉ＤＦＯ生成物、即ちグルコースサブユニットの約８９％が変性され、澱粉ＤＦＯ濃度１００ｇ／Lで４７mＭのキレート化剤濃度を有するものを得た。
【００６１】
実験５：４０ m Ｍキレート化剤および２２２ m Ｍ過ヨウ素酸とのＤＦＯ−澱粉コンジュケートの調製
洗浄されたガラス容器中に、澱粉粉（ＭＷ１２６,０００）５０ｇを水４７３mL中に溶解した。次いで、ＮaＩＯ4２３．７４g（２２２mＭ）を混合物中に添加し、６５分間攪拌した。得られた混合物を濾液の導電率が９０μSになるまで水で透析濾過した（膜：バイオマックス（Ｂｉｏｍａｘ）ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）２ミニ５ＫＭＷＣＯ）。オキシ澱粉濃度を１６３g／Lに調製した。反応体容積は水とエタノールで３８８mLにして、３０容量％エタノールの混合物を得た。ＤＦＯ（１９．４７ｇ）を攪拌下に添加した。攪拌を１５分間継続し、その後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）７．４２mLを反応混合物中に添加した。次いで混合物を２０時間攪拌した。反応時間終了時にＮaＢＨ4４．９９g（３３３mＭ）を攪拌下にゆっくりと添加した。攪拌を２００分間継続し、その後反応混合物を濾液の導電率が９６μSになるまで水で透析濾過した。PＨを塩酸で６.０に調整し、クロライド濃度を最終濃度１５４mＭになるように調整し、ポリマー濃度を１００g／Lに調整した。最後に溶液をガラス瓶中に滅菌濾過し、栓を詰めて４℃で保存した。これにより約５２９mLの澱粉ＤＦＯ生成物、即ちグルコースサブユニットの約３６％が変性され、澱粉ＤＦＯ濃度１００ｇ／Lで４０mＭのキレート化剤濃度を有するものを得た。
【００６２】
実験６：キレート剤 42 ｍＭおよび過ヨウ素酸塩 278 ｍＭを含むＤＦＯ−澱粉コンジュゲートの調製
清浄なガラス容器内で、澱粉粉末（ＭＷ126,000）50ｇを水445ｍＬに溶解した。次いで、ＮａＩＯ429.71ｇ（278ｍＭ）を混合物に加えて、65分間攪拌した。得られた混合物は、濾液の導電率が107μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーション（メンブラン：バイオマックス・ペリコン２ミニ、５Ｋ ＭＷＣＯ）に付した。その後、酸化澱粉濃度を169ｇ／Ｌに調節した。反応容積は、エタノール30体積％の混合物となるように、水とエタノールで393ｍＬに調節した。ＤＦＯ（19.72ｇ）を攪拌しながら添加した。18分間攪拌を続けた後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）10.00ｍＬを反応混合物に添加した。次に、混合物を20時間攪拌した。20時間の反応の後、攪拌しながら、ＮａＢＨ46.39ｇ（417ｍＭ）をゆっくりと反応溶液に添加した。180分間攪拌を続けた後、反応混合物を、濾液の導電率が91μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーションに付した。その後、ｐＨをＨＣｌで6.0に調節し、塩化物濃度を最終濃度が154ｍＭとなるように調節し、そしてポリマー濃度を100ｇ／Ｌに調節した。最後に、溶液をガラスバイアルに滅菌濾過し、止め栓をして、４℃で貯蔵した。これにより、グルコース・サブユニットの約45％が修飾され、澱粉−ＤＦＯ濃度100ｇ／Ｌにおける高分子量のキレート剤濃度が42ｍＭの澱粉−ＤＦＯ生成物約558ｍＬを得た。
【００６３】
実験７：キレート剤 43 ｍＭおよび過ヨウ素酸塩 334 ｍＭを含むＤＦＯ−澱粉コンジュゲートの調製
清浄なガラス容器内で、澱粉粉末（ＭＷ126,000）50ｇを水450ｍＬに溶解した。次いで、ＮａＩＯ435.72ｇ（334ｍＭ）を混合物に加えて、60分間攪拌した。得られた混合物は、濾液の導電率が110μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーション（メンブラン：バイオマックス・ペリコン２ミニ、５Ｋ ＭＷＣＯ）に付した。その後、酸化澱粉濃度を181ｇ／Ｌに調節した。反応容積は、エタノール30体積％の混合物となるように、水とエタノールで335ｍＬに調節した。ＤＦＯ（16.98ｇ）を攪拌しながら添加した。15分間攪拌を続けた後、８Ｍボランピリジン錯体（ＢＰＣ）10.80ｍＬを反応混合物に添加した。次に、混合物を20時間攪拌した。20時間の反応の後、攪拌しながら、ＮａＢＨ46.54ｇ（501ｍＭ）をゆっくりと反応溶液に添加した。170分間攪拌を続けた後、反応混合物を、濾液の導電率が108μＳとなるまで、水に対するダイアフィルトレーションに付した。その後、ｐＨをＨＣｌで6.0に調節し、塩化物濃度を最終濃度が154ｍＭとなるように調節し、そしてポリマー濃度を100ｇ／Ｌに調節した。最後に、溶液をガラスバイアルに滅菌濾過し、止め栓をして、４℃で貯蔵した。これにより、グルコース・サブユニットの約54％が修飾され、澱粉−ＤＦＯ濃度100ｇ／Ｌにおける高分子量のキレート剤濃度が43ｍＭの澱粉−ＤＦＯ生成物約474ｍＬを得た。
【００６４】
実施例５−−澱粉の酸化および還元がＤＦＯ−澱粉コンジュゲートのアミラーゼ消化を低下させる
前記実施例４の実験３および４で調製したＤＦＯ−澱粉コンジュゲートのα−アミラーゼによる消化速度を、屈折率とレーザ光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィーを用いて試験した。
実施例２に記載の手順と同様にして、消化試料を調製した。消化された試料を、試料の分子量分布を測定するためにＧＰＣカラムに注入した。
【００６５】
図３は、化工澱粉生成物それぞれについての、時間の関数としての重量平均分子量（ＷＡＭＷ）の変化のプロットを示す。これらのデータを表３にまとめる。
【００６６】
【表３】
【００６７】
各実験において、澱粉の酸化および還元の度合いの高いものは、澱粉−ＤＦＯコンジュゲートのアミラーゼによる消化速度を低下させた。
【００６８】
実施例６−−澱粉−ＤＦＯコンジュゲートの酸化および還元を高めることが動物におけるクリアランスを低下させる
数種のＤＦＯ−酸化および還元された澱粉コンジュゲートのラットにおける生体内での血中クリアランスを試験した。前記実施例４の実験１〜７で調製した数種のＤＦＯ−酸化および還元された澱粉コンジュゲートを、スプレーグ−ドーリー(Sprangue-Dawley)ラットに、30分注入により投与量10ｍＬ／ｋｇで静脈注射（大腿深静脈）投与した。いずれの場合も、この実験について２または３体の動物を使用した。血液試料は、種々の時間点において大腿深静脈から採取した。その後、これら試料のＤＦＯ−澱粉コンジュゲート濃度を検査した。
【００６９】
図４は、時間の関数としての、ＤＦＯ−澱粉コンジュゲートの平均血中濃度のプロットを示す。実験１および２では、分子量46,000の澱粉を用いた。実験３〜７では、分子量126,000の澱粉を用いた。これらのデータを表４にまとめる。
【００７０】
【表４】
【００７１】
澱粉の酸化および還元の度合いの高いものは、動物からの澱粉−ＤＦＯコンジュゲートクリアランスを低下させた。
【００７２】
実施例７−−デキストランの修飾
デキストラン修飾は、澱粉の酸化に関する実施例１に記載の方法を少し変更して行なった。簡単には、デキストランを約100ｇ／Ｌの濃度で攪拌しながら水性媒体に溶解した後、ＮａＩＯ4溶液（または固体のＮａＩＯ4）を加えてデキストランを酸化した。使用したＮａＩＯ4の量が、デキストラン酸化の量を支配した。次いで、反応混合物を精製し、酸化反応系から塩を除去した。次に、得られたジアルデヒド基（酸化反応により形成されたもの）を、ＮａＢＨ4を用いてアルコール基に還元した。最後に、反応混合物を再度精製して、反応混合物から塩を除去した。「修飾したデキストラン」は、その後、処方または更なる修飾のために準備された。
【００７３】
実施例８――酸化および還元されたデキストランの低下したアレルゲン性
酸化および還元されたデキストランを、スプレーグ−ドーリー(Sprangue-Dawley)ラットに、30分かけて投与量40ｍＬ／ｋｇで静脈注射（大腿深静脈）投与した。デキストランのビシナル水酸基の約100％を、過ヨウ素酸塩塩で酸化し、還元した。（後肢ではなく）前肢の僅かな膨張により、非常に少量のアレルギー反応が観られた。その後、動物は完全に麻酔から覚めた。
対照して、当量の投与量の天然デキストランをラットに注入すると、15分後、投与量のおよそ半分で、四肢（前肢および後肢）が膨潤する非常に強いアレルギー反応が観られて、投与を停止した。投与停止後すぐに動物の尾および全身に激しい浮腫ができて、動物はこの時点で死亡した。死亡は、デキストランに対するアレルギー反応によって引き起こされた気道の緊縮に起因する窒息により生じたものと考えられる。このラットの緊張は、デキストランに対するアレルギーにかかったことが分かる。
【００７４】
本発明は、種々の具体的でかつ好ましい態様および技術を参照して記載している。しかし、多数の変更および改良は、本発明の精神および範囲内に有る限り、成され得るものと解されるべきである。本明細書中の刊行物および特許は全て、本発明の属する分野において通常の知識を有する者の基準を示すものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 変性デンプンのアミラーゼ処理における重量平均分子量（ＷＡＭＷ）の経時変化のプロットである。
【図２】 変性デンプンの平均血中レベルの経時プロットである。
【図３】 酸化及び還元されたデンプン−ＤＦＯ結合体それぞれのアミラーゼ処理におけるＷＡＭＷの経時変化のプロットである。
【図４】 酸化及び還元されたデンプン−ＤＦＯ結合体の平均血中レベルの経時プロットである。
Claims (9)
- 水溶性多糖類をＮａＩＯ ４ で酸化して得られる反応混合物をＮａＢＨ ４ で還元する工程を包含する方法によって製造される変性多糖類であって、該水溶性多糖類のビシナル水酸基の２０％〜９０％が酸化されている、変性多糖類。
- 前記反応混合物にキレート剤を添加して、前記の酸化された多糖類のコンジュゲートを形成する、請求項１に記載の変性多糖類。
- 前記方法において、前記水溶性多糖類が、澱粉またはデキストランである、請求項１または２に記載の変性多糖類。
- 前記ビシナル水酸基の２０％〜８０％が酸化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変性多糖類。
- 前記ビシナル水酸基の３０％〜６０％が酸化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変性多糖類。
- 前記キレート剤がデフェロキサミンを含む、請求項１記載の変性多糖類。
- 澱粉よりも長い血管半減期、あるいは、デキストランに比べて低いアレルゲン性を提供する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変性多糖類。
- 澱粉の血管半減期を高めるか、あるいは、デキストランのアレルゲン性を低減させる薬剤として使用する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の変性多糖類。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載の変性多糖類と、薬剤上容認できる媒体とを含む、薬剤組成物。
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