ES2325005T3 - Polisacaridos modificados que muestran un reconocimiento biologico alterado. - Google Patents
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Abstract
Un polisacárido modificado obtenible mediante un proceso de oxidación y reducción de polisacárido soluble en agua, en el que dicho proceso incluye las etapas de: - oxidar el polisacárido con NaIO4 y - reducir la mezcla con NaBH 4, y en el que 20 a 90% de grupos hidroxilo vecinales del polisacárido se han oxidado.
Description
Polisacáridos modificados que muestran un
reconocimiento biológico alterado.
Los polisacáridos no modificados pueden tener
propiedades biológicas no deseables, como la eliminación rápida de
la circulación, degradación rápida, y/o alergenicidad. Dos
polisacáridos que se emplean comúnmente en las composiciones
farmacéuticas y procedimientos terapéuticos incluyen el almidón y
dextrano.
El almidón es un polímero de origen natural,
altamente biocompatible. Cuando el almidón se introduce en el
torrente sanguíneo, se digiere rápidamente por la amilasa. Los
fragmentos del producto digerido se eliminan rápidamente del
compartimiento vascular mediante filtración glomerular y/o
metabolismo. Por esta razón el hidroxietil almidón (más bien que
almidón) se ha usado durante mucho tiempo como sucedáneo del plasma
para varias indicaciones clínicas. La hidroxietilación de la
molécula de almidón sirve para ralentizar la velocidad de
digestión/excreción del polímero.
La hidroxietilación del almidón que usa óxido de
etileno o 2-cloroetanol ha sido una práctica común
para la producción de sucedáneo del plasma coloidal. Estos
procedimientos tienen numerosas desventajas que incluyen el empleo
de óxido de etileno altamente tóxico, dificultad en el control del
grado de la hidroxietilación, incapacidad para seleccionar entre
los grupos hidroxilo de almidón, subproductos tóxicos, y alto coste.
Por ejemplo, la hidroxietilación con óxido de etileno se produce en
cualquier sitio hidroxílico, incluyendo los sitios que ya se han
hidroxilado, y con disolvente, agua residual, e impurezas o
productos secundarios en la mezcla de reacción. La pérdida de
selectividad entre los sitios sobre la molécula de almidón requiere
la hidroxietilación extensiva del almidón, aunque la modificación
de ciertos sitios específicos ofrece un mayor grado de protección
de la degradación enzimática.
Se ha usado dextrano para una diversidad de
preparaciones farmacéuticas y terapéuticas durante los pasados 40 -
50 años. El amplio uso de dextranos ha incluido dextranos nativos
purificados para reemplazo/expansión de volumen de plasma,
conjugados de dextrano activos, suplementos de hierro de
hierro-dextrano, y partículas revestidas de
dextrano para agentes de contraste de MRI; véase por ejemplo, el
documento EP 304 183 A. Para la mayor parte, el dextrano en una
forma altamente purificada está bien tolerada por la mayoría de la
población de pacientes. Sin embargo, se conoce que se producen
graves respuestas anafilácticas, y son en algunos casos graves para
que den como resultado la muerte.
Estas propiedades no deseables de polisacáridos
empleados en las composiciones farmacéuticas y procedimientos
terapéuticos indican la necesidad de polisacáridos modificados,
tales como almidones modificados y dextranos modificados, que
tienen propiedades biológicas más deseables que los polisacáridos
nativos o no modificados.
La presente invención se refiere a polisacáridos
modificados que tienen propiedades biológicas más deseables que los
polisacáridos nativos o no modificados, composiciones farmacéuticas
que incluyen estos polisacáridos modificados, procedimientos que
emplean estos polisacáridos modificados, y procedimientos de
reducción de las propiedades biológicas no deseables de estos
polisacáridos modificados. Preferiblemente, el polisacárido
modificado es un polisacárido oxidado y reducido. Preferiblemente,
el polisacárido se reduce con peryodato. En una composición
farmacéutica el polisacárido oxidado y reducido se puede formular en
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los polisacáridos preferidos para la
modificación de acuerdo con la presente invención incluyen almidón
y/o dextrano. Un almidón oxidado y reducido preferiblemente muestra
una semivida vascular más larga que el almidón no modificado,
degradación más lenta por la amilasa que el almidón no modificado,
y/o eliminación más lenta de un animal que el almidón no
modificado. Un dextrano soluble oxidado y reducido preferiblemente
muestra alergenicidad reducida comparada con el dextrano.
Preferiblemente, cuanto mayor es el grado de la oxidación del
polisacárido, mayor es la semivida vascular, más lenta es la
degradación, más lenta es la eliminación, y/o menor es la
alergenicidad.
El polisacárido modificado puede ser un
componente de o emplearse para formar un conjugado, tal como un
conjugado con un quelante. Un quelante preferido es deferoxamina
(DFO). Los sacáridos de la invención incrementan la semivida
vascular de almidón mediante la oxidación y reducción de del
almidón.
En otro modo de realización, la invención
incluye la disminución de alergenicidad de dextrano mediante
oxidación y reducción del dextrano, y administración del dextrano
oxidado y reducido en la circulación de un mamífero. El dextrano o
almidón administrado puede incluir un conjugado del dextrano o
almidón.
La Figura 1 ilustra una representación gráfica
del cambio del Peso Molecular Medio de Peso (WAMW) en función del
tiempo para almidones modificados tras el tratamiento con
amilasa.
La Figura 2 muestra una representación gráfica
de los niveles medios en sangre de almidón modificado en función
del tiempo.
La Figura 3 proporciona una representación
gráfica del cambio en el WAMW en función del tiempo para cada uno
de los conjugados almidón oxidado y reducido - DFO tras tratamiento
con amilasa.
La Figura 4 muestra una representación gráfica
de los niveles medios en sangre de los conjugados almidón oxidado y
reducido - DFO en función del tiempo.
La presente invención se refiere a polisacáridos
modificados que tienen propiedades biológicas más deseables que los
polisacáridos nativos o no modificados, composiciones farmacéuticas
que incluyen estos polisacáridos modificados.
Los polisacáridos no modificados pueden tener
propiedades biológicas no deseables, tales como eliminación rápida
de la circulación, degradación rápida, y/o alergenicidad. El almidón
no modificado, por ejemplo, se degrada y elimina rápidamente de la
circulación de mamíferos. El dextrano no modificado es fuertemente
y quizás fatalmente alérgico en una proporción de mamíferos. Las
propiedades deseables para los polisacáridos incluyen eliminación
rápida de la circulación, digestión enzimática más lenta, y/o
disminución de la alergenicidad. El almidón modificado de acuerdo
con la presente invención muestra degradación más lenta por la
amilasa y aumento de la semivida vascular. El dextrano modificado
de acuerdo con la presente invención muestra disminución y
alergenicidad aceptable.
Los polisacáridos adecuados para uso en la
presente invención incluyen dextranos y ácido hialurónico, almidón
y derivados de almidón, y similares. Los materiales de partida de
polisacárido tales como dextranos y almidones están comercialmente
disponibles como preparaciones o soluciones solubles en agua. Véase
Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol., ed., Mack Publishing
(16ª ed. 1980) en las páginas 759 - 761. Los polisacáridos de la
invención incluyen aquellos descritos en las Patentes US Nº^{s}
4.863.964, 5.217.998 y 5.268.165, cuyas descripciones se incorporan
en el presente documento por referencia.
La presente invención incluye un polisacárido
que se ha modificado mediante oxidación seguido de reducción,
incluye una composición farmacéutica del polisacárido modificado,
incluye la modificación de un polisacárido mediante oxidación y
reducción, e incluye el control de las propiedades biológicas de un
polisacárido mediante tal modificación. La oxidación seguida de
reducción puede ralentizar la digestión, reducir alergenicidad y
proporcionar alteraciones deseables de las propiedades biológicas
del polisacárido biocompatible resultante. El grado o extensión al
que los grupos hidroxilo sobre el polisacárido se modifican se puede
controlar fácilmente, lo cual proporciona un procedimiento para
seleccionar el grado de modificación de la propiedad biológica. Por
ejemplo, la reacción de peryodato con los polisacáridos es rápida y
estequiométrica. El grado de oxidación de la molécula de
polisacárido es homogéneo y se puede controlar fácil y
precisamente.
El polisacárido oxidado y reducido resultante se
puede emplear en composiciones que actualmente emplean polisacáridos
nativos o polisacáridos modificados de manera convencional. Tales
composiciones incluyen un sucedáneo del plasma coloidal,
hemodilución, una solución de cebado para una máquina de desviación
de corazón/pulmón, una solución de conservación de órganos, una
solución crioprotectora y similares. Además, el presente
procedimiento y polisacárido modificado proporcionan el control del
grado de oxidación del polisacárido, de manera que la modificación
del polisacárido se puede seleccionar para proporcionar propiedades
biológicas para cada uno de los diferentes usos. Como poco
aproximadamente el 20% o como mucho el 90% de todos, o una clase de,
grupos hidroxilo sobre un polisacárido se pueden oxidar y reducir
para alterar sus propiedades biológicas. Preferiblemente los grupos
hidroxilo son grupos hidroxilo vecinales, y la oxidación se lleva a
cabo empleando peryodato. Preferiblemente, aproximadamente 30% a
aproximadamente 60% de todo, o de una clase de, grupos hidroxilo
sobre un polisacárido se puede oxidar y reducir para ralentizar la
velocidad a la que el polisacárido modificado se degrada, se
digiere, o se elimina de un animal comparado con el polisacárido no
modificado. Preferiblemente, aproximadamente 20% a aproximadamente
80% de todo, o de una clase de, grupos hidroxilo sobre un
polisacárido se puede oxidar y reducir para reducir la
alergenicidad del polisacárido modificado comparado con el
polisacárido no modificado.
El polisacárido a modificar puede ser un
componente de un conjugado polisacárido-fármaco, o
el polisacárido modificado se puede emplear para formar un
conjugado de polisacárido-fármaco. Los efectos de
modificación de acuerdo con la invención sobre un conjugado de
polisacárido-fármaco puede ser el mismo, por
ejemplo, degradación más lenta y/o reducción de la alergenicidad,
como modificación del propio polisacárido. Sin embargo, la
modificación de un conjugado polisacárido-fármaco o
formación de un conjugado polisacárido-fármaco de
un polisacárido modificado de acuerdo con la invención puede tener
efectos beneficiosos adicionales también.
Por ejemplo, la semivida vascular o el tiempo de
residencia en plasma de un conjugado
polisacárido-fármaco se puede controlar mediante
selección de un grado apropiado de oxidación de polisacárido. Cuando
la degradación del polisacárido o de un conjugado de polisacárido
controla la liberación del fármaco, esta invención proporciona un
procedimiento para seleccionar la farmacocinética controlada o
liberación sostenida del fármaco. En este caso, el grado de
oxidación del polisacárido se selecciona para que la semivida
vascular deseada o velocidad de liberación proporcione la eficacia
óptima para cada sistema diferente conjugado
polisacárido-fármaco e indicación clínica.
Las circunstancias en las que el control de la
velocidad de degradación de un conjugado de polisacárido pueden
alterar el efecto del conjugado o el fármaco liberado incluyen: 1)
El conjugado fármaco-polisacárido no es
farmacológicamente activo, pero después de la escisión de la
estructura central los fragmentos del conjugado
fármaco-polisacárido se hacen farmacológicamente
activos. 2) El conjugado fármaco-polisacárido es
activo, y tras la escisión los fragmentos (activos o no) se
excretan más rápidamente. 3) Tanto el conjugado
fármaco-polisacárido como los fragmentos son
farmacológicamente activos pero incrementan el tiempo de residencia,
localización o aislamiento en compartimientos estancos del
conjugado polisacárido-fármaco y fragmentos se
produce a partir de la modificación. 4) El perfil farmacológico del
conjugado activo al polímero cambia tras la escisión de la
estructura central del polisacárido. 5) La encapsulación de un
fármaco dentro de una envoltura polimérica del polisacárido da como
resultado el control de la liberación del fármaco desde la cápsula,
y la degradación de la envoltura se altera mediante modificación
del polisacárido. Otros polisacáridos y conjugados de polisacárido
que pueden beneficiarse de la modificación de acuerdo con la
presente invención incluyen: conjugados en los que el componente
activo es un compuesto nutricional, un compuesto farmacéutico, una
enzima, un agente de contraste, un herbicida, un insecticida o
similares; los polisacáridos empleados en las composiciones en las
que se desea el control de la velocidad de degradación, tal como
polímeros biodegradables, revestimientos, o gránulos liberados con
el tiempo.
La presente invención incluye almidón que se ha
modificado mediante oxidación seguido de reducción, incluye una
composición farmacéutica del almidón modificado, incluye un
procedimiento para modificar el almidón mediante oxidación y
reducción, e incluye un procedimiento de controlar las propiedades
biológicas del almidón mediante tal modificación. La oxidación
seguida de una etapa de reducción ralentiza la digestión del almidón
biocompatible resultante y también puede ralentizar la velocidad de
eliminación de un animal. El grado o extensión al que los grupos
hidroxilo sobre el almidón están modificados se puede controlar
fácilmente. El control y selección del grado de oxidación determina
la velocidad de la digestión enzimática (y persistencia resultante o
eliminación - excreción) del almidón modificado. De este modo, la
presente invención proporciona un procedimiento para determinar y
seleccionar la semivida vascular de un almidón modificado o de un
conjugado de un almidón modificado.
La reacción de peryodato con almidón es rápida
(la reacción llega a la finalización en cuestión de minutos),
específica para la escisión del enlace entre grupos hidroxilo
vecinales y estequiométrica. Por lo tanto el grado de oxidación de
la molécula de almidón es homogéneo y fácilmente controlado.
Preferiblemente los grupos hidroxilo oxidados son grupos hidroxilo
vecinales y la oxidación se lleva a cabo empleando peryodato.
Se ha demostrado que la oxidación/reducción de
almidón limita la velocidad a la que se digiere por la amilasa. Los
grados mayores de oxidación de la molécula de almidón da como
resultado velocidades más lentas de digestión. De manera similar,
se ha demostrado que la oxidación/reducción de almidón ralentiza la
velocidad a la que se elimina de un animal. Los grados mayores de
oxidación de la molécula de almidón da como resultado velocidades
más lentas de eliminación. Mediante la selección del grado apropiado
de oxidación, se puede obtener una velocidad deseada de digestión o
eliminación. Por ejemplo, tan pocos como aproximadamente 20% o
tantos como 90% de todos, o de una clase de, grupos hidroxilo sobre
un almidón se pueden oxidar y reducir para alterar las propiedades
biológicas, tal como su velocidad de digestión o eliminación de un
animal. Preferiblemente, aproximadamente 30% a aproximadamente 60%,
de todos, o de una clase de, grupos hidroxilo sobre un almidón se
pueden oxidar y reducir para ralentizar la velocidad a la que el
almidón modificado se degrada, digiere, o elimina de un animal
comparado con el almidón no modificado. En ciertas condiciones, el
almidón en el que aproximadamente 30% de todos, o una clase de,
grupos hidroxilo sobre un almidón están oxidadas y reducidas se
digiere por la amilasa a una velocidad casi tan rápida como el
almidón no modificado. En estas ciertas condiciones, el almidón en
el que aproximadamente 60% de todos, o una clase de, grupos
hidroxilo sobre un almidón están oxidados y reducidos se digiere
solamente muy lentamente por la amilasa, y el almidón puede ser casi
inerte para tal digestión.
El almidón oxidado y reducido resultante se
puede emplear en los procedimientos y composiciones que actualmente
emplean almidones convencionales, tal como hidroxietil almidón.
Tales procedimientos y composiciones incluyen un sucedáneo del
plasma coloidal, para la hemodilución, una solución de cebado para
una máquina de desviación cardíaca/pulmonar, una solución de
conservación de órganos donantes y similares. Además, el presente
procedimiento y almidón modificado proporcionan el control del
grado de oxidación del almidón, de manera que la modificación del
almidón se puede seleccionar para proporcionar la semivida vascular
óptima para cada uno de estos usos diferentes. El almidón a
modificar puede ser un componente de un conjugado
almidón-fármaco, o el almidón modificado se puede
emplear para formar un conjugado almidón-fármaco.
Los efectos de la modificación de acuerdo con la invención sobre un
conjugado almidón-fármaco puede ser el mismo, por
ejemplo, degradación más lenta y/o alergenicidad reducida, como la
modificación del propio polisacárido. Sin embargo, la modificación
de un conjugado almidón-fármaco o formación de un
conjugado almidón-fármaco desde un almidón
modificado de acuerdo con la invención puede tener efectos
beneficiosos adicionales también.
Por ejemplo, la velocidad de excreción (o
liberación) de polímero de almidón (o conjugado de polímero de
almidón) se puede controlar y seleccionar para un uso particular.
El almidón modificado se puede producir con persistencia vascular
seleccionada, por ejemplo, para uso como un conjugado en un agente
de contraste médico con una semivida vascular de aproximadamente 2
a aproximadamente 4 horas; para la terapia por envenenamiento por
metal, que requiere que el fármaco permanezca en el cuerpo durante
aproximadamente 4 a aproximadamente 24 horas; para la expansión de
volumen de plasma, que requiere un almidón modificado que dura
aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas; o para una
sobrecarga de hierro, que requiere que el almidón modificado
permanezca en circulación durante aproximadamente 2 a
aproximadamente 5 días. Un almidón que está más de aproximadamente
30% oxidado y reducido, preferiblemente aproximadamente 30% a
aproximadamente 45% es adecuado para las aplicaciones que requieren
una semivida más corta. Un almidón que tiene cerca de
aproximadamente 60% de sus grupos hidroxilos oxidados y reducidos,
preferiblemente aproximadamente 45% a aproximadamente 60% es
adecuado para las aplicaciones que requieren una semivida más
larga.
La semivida vascular o tiempo de residencia en
plasma de un conjugado almidón-fármaco se puede
controlar mediante la selección de un grado apropiado de oxidación
de almidón. Cuando la degradación del almidón de un conjugado de
almidón controla la liberación del fármaco, esta invención
proporciona un procedimiento para seleccionar la liberación
controlada o sostenida del fármaco. En este caso, el grado de
oxidación de almidón se selecciona para la semivida vascular (o
velocidad de liberación) deseada proporcionando la eficacia óptima
para cada sistema conjugado almidón- fármaco diferente e indicación
clínica específica.
Las circunstancias en las que el control de la
velocidad de degradación de un conjugado de almidón puede alterar
el efecto del conjugado o el fármaco liberado incluyen: 1) El
conjugado fármaco-almidón no es farmacológicamente
activo pero, después de la escisión de la estructura central, los
fragmentos del conjugado fármaco-almidón se vuelven
farmacológicamente activos. 2) El conjugado
fármaco-almidón es activo, y tras la escisión los
fragmentos (activos o no) se secretan rápidamente. 3) Tanto el
conjugado fármaco-almidón como los fragmentos son
farmacológicamente activos pero el tiempo de residencia
incrementado y localización o aislamiento en compartimientos
estancos del conjugado almidón-fármaco y fragmentos
se produce a partir de la modificación. 4) El perfil farmacológico
del conjugado activo al polímero cambia tras la escisión de la
estructura central del almidón. 5) La encapsulación de un fármaco
dentro de una envoltura polimérica del almidón da como resultado el
control de la liberación del fármaco desde la cápsula, y la
degradación de la envoltura se altera mediante la modificación del
almidón.
La modificación química de dextrano puede
reducir, minimizar, o eliminar una reacción alérgica al dextrano
nativo, a conjugados derivados de dextrano, o a formulaciones que
contienen dextrano, que se experimenta en algunos humanos (y otras
especies de sangre caliente). La respuesta anafiláctica puede ser lo
suficientemente grave para provocar la muerte, como se indica en la
información de producto Physicians Desk Reference para "INFeD"
(Página 2478, Edición 51, 1997).
El dextrano se ha usado durante muchos años para
varias terapias y composiciones médicas, que incluyen expansión del
volumen de plasma y hemodilución. El dextrano se prefiere a menudo a
otros coloides para la expansión del volumen de plasma debido en
parte a la capacidad desde la fabricación para controlar las
propiedades tales como viscosidad, peso molecular medio e intervalo
de peso molecular, velocidad de excreción/eliminación, y grado de
ramificación, y similares. La presente invención ofrece todavía otra
propiedad de dextrano que se puede modificar y controlar para
incrementar la utilidad del dextrano, formulaciones de dextrano, y
conjugados de dextrano.
La oxidación de la molécula de dextrano para
producir dialdehído- dextrano, seguido de una etapa de reducción
produce un dextrano modificado, un dextrano oxidado y reducido, que
disminuye o elimina una respuesta alérgica a dextrano. Por ejemplo,
tan pocos como aproximadamente 10% o tantos como 100% de todos, o
una clase de, grupos hidroxilo sobre un dextrano se pueden oxidar y
reducir para alterar sus propiedades biológicas. Preferiblemente
los grupos hidroxilo son grupos hidroxilo vecinales, y la oxidación
se lleva a cabo empleando peryodato. Preferiblemente,
aproximadamente 20% a aproximadamente 80% de todos, o una clase de,
grupos hidroxilo sobre un dextrano se puede oxidar y reducir para
reducir la alergenicidad del dextrano modificado comparada con el
dextrano antes de la oxidación y reducción.
La presente invención se puede aplicar a
dextrano nativo, dextrano que ya se ha modificado mediante
procedimientos conocidos o para propósitos conocidos (tales como
los descritos anteriormente), o para el componente de dextrano de
un conjugado. Por ejemplo, un producto de dextrano ya formulado
(como Hierro (III) Dextrano para suplemento de hierro, o
Hierro-Dextrano para potenciación de MRI) se puede
modificar mediante oxidación y reducción para reducir o eliminar
una respuesta alérgica.
Aunque la oxidación es el procedimiento
preferido para la modificación de dextrano para eliminar o reducir
la respuesta alérgica, son también eficaces otros procedimientos de
modificación química. Por ejemplo, las modificaciones adecuadas
pueden incluir la hidroxietilación, alquilación, reducción,
esterificación y similares.
La modificación de un polisacárido, tal como
almidón o dextrano, se puede llevar a cabo mediante la disolución
del polisacárido, tal como almidón o dextrano, en un medio acuoso a
una concentración de aproximadamente 100 g/l. Con agitación, un
agente de oxidación adecuado, preferiblemente peryodato,
preferiblemente una solución de NaIO_{4}, NaIO_{4} sólido o
HIO_{4}, se añade para oxidar el polisacárido, tal como almidón o
dextrano. La cantidad de agente oxidante, tal como NaIO_{4},
usado controlará la cantidad de oxidación o modificación del
polisacárido, tal como almidón o dextrano. La mezcla de reacción
después se purifica mediante procedimientos convencionales para
eliminar las sales de la reacción de oxidación y para recuperar el
polisacárido, tal como almidón o dextrano, con dialdehído y otros
restos de aldehído formados por oxidación. A continuación, el
polisacárido, tal como almidón o dextrano, con dialdehído y otros
restos de aldehído formados mediante la oxidación se reducen. Un
agente reductor preferido es NaBH_{4}. Los grupos dialdehído
funcionales se convierten por lo tanto en grupos dialcohol, y
aldehídos se reducen también. Finalmente la mezcla de reacción se
purifica de nuevo mediante procedimientos convencionales para
eliminar las sales de la mezcla de reacción.
Los procedimientos adicionales adecuados para la
oxidación y reducción de polisacáridos, tal como almidón y
dextrano, se describen en la Solicitud de Patente US Nº de serie
08/911.991, por conceder como la Patente US Nº 5.847.110 el 8 de
diciembre de 1998, cuya descripción se incorpora en el presente
documento por referencia.
El polisacárido oxidado y reducido, tal como
almidón oxidado y reducido o dextrano oxidado y reducido, está por
lo tanto listo para la formulación. Como alternativa, antes de la
reducción del polisacárido oxidado, tal como almidón oxidado o
dextrano oxidado, los grupos funcionales aldehído sobre el
polisacárido oxidado, tal como almidón oxidado o dextrano oxidado,
se pueden conjugar a un fármaco, un quelante, u otro resto activo
para producir un conjugado.
El presente procedimiento de oxidación y
reducción tiene varias ventajas comparado con otros procedimientos
disponibles previamente para la modificación de polisacáridos con el
fin de alterar las propiedades biológicas. Comparado con, por
ejemplo, la hidroxietilación, el grado de oxidación es mucho más
fácil de controlar ya que la reacción con oxidante es
estequiométrica. La oxidación es más específica, estando típicamente
limitada a solamente un sitio sobre una subunidad de glucosa u otro
sacárido. Además, los subproductos de reacción de la oxidación
tienen baja toxicidad y se eliminan fácilmente. La oxidación es
rentable ya que un oxidante tal como ácido peryódico se puede
regenerar mediante un procedimiento electrolítico.
La unión covalente de un quelante, u otra
molécula, a un polisacárido se ha descubierto que es ventajosa por
varias razones. Por ejemplo, la unión al polisacárido puede alterar
la distribución del quelante, u otra molécula, en el paciente. Por
ejemplo, aunque no limitante a la presente invención, se cree que el
conjugado de un quelante y un polisacárido se retienen en la
circulación hasta un grado mayor que el quelante solo. Las
características ventajosas adicionales de un conjugado pueden
incluir biodistribución alterada, toxicidad disminuida, estabilidad
aumentada del quelante, u otra molécula, formulaciones y plasma, y
mayor eficacia del quelante, u otra molécula.
El polisacárido es preferiblemente un
polisacárido oxidado y reducido. Los polisacáridos adecuados para
oxidación y reducción incluyen dextranos y ácido hialurónico,
almidón y derivados de almidón y similares. Los materiales de
partida de polisacárido tales como dextranos y almidones están
comercialmente disponibles en forma de preparaciones solubles en
agua o emulsiones. Véase Remington's Pharmaceutical Sciences, A.
Osol., ed., Mack Publishing (16ª ed. 1980) en las páginas 759 -
761. Los polisacáridos de la invención incluyen aquellos descritos
en las Patentes US Nº^{s} 4.863.964, 5.217.998 y 5.268.165, cuyas
descripciones se incorporan en el presente documento por
referencia.
El polisacárido oxidado y reducido es
suficientemente estable para llevar el quelante, u otra molécula, en
el paciente durante un tiempo suficiente que es eficaz para el
propósito biológico o terapéutico deseado. Además, el polisacárido
es suficientemente bien tolerado y no tóxico (por ejemplo, no
alérgica) que el paciente no tiene reacciones adversas inaceptables
al tratamiento.
Existen diferentes maneras en las que un
quelante, u otra molécula, se puede unir de manera covalente al
polisacárido o polisacárido oxidado para formar un conjugado. El
quelante, u otra molécula, está unida al polisacárido o
polisacárido oxidado de una manera que sus propiedades deseadas,
medidas in vitro, permanezcan sustancialmente, y
preferiblemente en el orden del quelante no conjugado u otra
molécula. Una forma preferida para formar conjugados de un
quelante, u otra molécula, con un polisacárido o polisacárido
oxidado es unirse a un grupo amino, tal como un grupo amino
terminal de deferoxamina, al polisacárido o polisacárido oxidado.
Tal grupo amino puede formar un enlace covalente con un grupo
carboxilo sobre un polisacárido para formar un enlace amida.
Preferiblemente, un grupo amino del quelante, u
otra molécula, formarán un enlace covalente con un resto de
aldehído. En una reacción inicial, la amina sobre el quelante, u
otra molécula, reacciona con el aldehído para formar una base de
Schiff, y la base de Schiff se reduce en una segunda reacción para
producir un enlace covalente más estable. Los grupos aldehído se
pueden introducir en el polisacárido mediante técnicas conocidas,
por ejemplo, mediante la oxidación de carbohidratos u otros dioles a
dialdehídos con metaperyodato de sodio. Véase, por ejemplo, M.B.
Wilson, et al. en "Immunofluorescence and Related Staining
Techniques", W. Knapp et al., eds., Elsevier/North
Holland Biomedical Press (1978) en la página 215, Flemming et
al., Acta Biol. Med. Ger., 30, 177 (1973); y, S.-C. Tam et
al., en P.N.A.S. USA, 73, 2128 (1976). En algunas aplicaciones,
el grupo amino terminal sobre un quelante, u otra molécula, también
se puede unir a un grupo amino sobre el polímero directamente,
mediante el uso de un agente de unión de dialdehído tal como
glutaraldehído, seguido de reducción, por ejemplo, con borohidruro
de sodio.
Los conjugados de quelante más preferidos se
preparan mediante la unión covalente de deferoxamina a un
polisacárido o polisacárido oxidado farmacéuticamente aceptable.
Los procedimientos para la preparación de deferoxamina (ácido
N-[5-[3[(5-aminopentil)hidroxicarbamoil]
propionamido]
pentil]-3-[[5-(N-hidroxiacetamido)
pentil] carbamoil]propionohidroxámico) y sus sales
farmacéuticamente aceptables se han descrito, por ejemplo, por
Prelog et al., en Helv. Chim. Acta., 45, 631 (1962); Bickel
et al., Helv. Chim. Acta, 46 1385 (1963); en la Patente DE
1.186.076 y en las Patentes US Nº^{s} 4.419.365, 4.987.253 y
5.493.053, cuyas descripciones se incorporan en el presente
documento por referencia. Tales sales incluyen las sales de adición
de ácido de ácido metano sulfónico, ácido fosfónico, ácido acético,
ácido láctico, ácido tartárico, ácido cítrico y similares. Otros
quelantes adecuados incluyen ácido
2,3-dihidroxibenzoico, DTPA, ácido rodotorúlico,
ácido colilhidroxámico, ácido
etilendiamino-N,N'-bis((2-hidroxifenil)acético),
isoniazid-piridoxal hidrozona,
1,2-dimetil-3-hidroxipirid-4-ona
y nitrilotriacetato. Estos quelantes se pueden usar solos o en
combinación.
Los procedimientos para preparar conjugados de
quelante incluyen los procedimientos descritos en las Patentes US
Nº^{s} 4.863.964, 5.217.998 y 5.268.165, y en la Solicitud de
Patente US Nº de serie 08/911,991, por conceder como la Patente US
Nº 5.847.110 el 8 de diciembre de 1998, cuyas descripciones se
incorporan en el presente documento por referencia.
Las relaciones de moles de quelante u otra
molécula a polisacárido obtenible mediante reacciones con grupos
carboxilo o carbonilo pueden variar de manera amplia, dependiendo de
factores tal como el número de grupos reactivos sobre el polímero,
impedimento estérico, velocidad y extensión de formación de la base
de Schiff o amida, y similares. Más de una molécula de quelante u
otra molécula se puede unir a cada molécula de polisacárido. Como
ejemplo, aproximadamente 0,7 g de deferoxamina se pueden unir a
aproximadamente 2,5 g de Dextrano 40 que reacciona, mediante la
reacción de la deferoxamina con grupos aldehído introducidos en el
dextrano, seguido de reducción.
El polisacárido oxidado y reducido se puede
administrar mediante una diversidad de vías eficaces para alcanzar
los niveles circulantes y locales suficientes para proporcionar el
efecto biológico o terapéutico deseado. Las vías típicas de
administración serían parenteral, tal como intravenosa o subcutánea.
El polisacárido oxidado y reducido se administra preferiblemente en
forma de una solución o suspensión en un disolvente acuoso que es
compatible con la administración a pacientes tal como animales,
mamíferos o humanos. Una composición farmacéutica preferida es no
pirógena. Preferiblemente el polisacárido oxidado y reducido se
administra, en forma de soluciones, por vía parenteral, tal como
mediante inyección o infusión intramuscular, intraperitoneal,
subcutánea, intraocular, o intravenosa, o mediante vías bucales,
orales, pulmonares, rectales o vaginales. La dosis apropiada se
ajustará de acuerdo con los factores clínicos apropiados según el
juicio del médico que efectúa el tratamiento incluyendo: el
trastorno a tratar; el paciente o edad, tamaño y peso del paciente;
el modo de administración; propiedades del polisacárido oxidado y
reducido, y
similares.
similares.
La presente invención se puede entender mejor
con referencia a los siguientes ejemplos. Se pretende que estos
ejemplos sean representativos de los modos de realización
específicos de la invención, y no se pretende que sean limitantes
del ámbito de la invención.
Ejemplo
1
El almidón nativo empleado era almidón de maíz
ceroso no modificado (PM 126.000), que se obtuvo a través de
Laevosan (Linz, Austria) y es el lote 43572, PN 1021B. Toda el agua
usada para la preparación de estos polisacáridos modificados era
agua sin pirógenos, y todos los otros recipientes/utensilios se
despirogenaron antes de uso. Cuando fue posible, las reacciones y
procesamientos se realizaron en la campana de flujo laminar para
conservar la pureza de estas soluciones, para la administración
intravenosa y otra parenteral. Las reacciones se realizaron a
temperatura ambiente y se aplicó enfriamiento en algunos casos para
evitar el calentamiento de la mezcla de reacción.
Experimento
1
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 30 g de polvo de almidón en 300 ml de agua. A esto se
añadieron lentamente 11,23 g de NaIO_{4} (175 mM) y esta mezcla
se agitó durante 105 minutos. La mezcla resultante se diafiltró
(membrana: Pellicon 2 mini, 5K MWCO, 0,1 m^{2}) contra agua hasta
que la conductividad del filtrado fue de 25 \muS. La
concentración de oxialmidón se ajustó después a 100 g/l. Se añadió
con agitación NaBH_{4} (2,38 g) a la solución de oxialmidón (239
ml) para obtener una concentración de NaBH_{4} de 263 mM. La
reacción se agitó durante 2 horas. La solución resultante se
diafiltró contra agua hasta que la conductividad del filtrado
alcanza 58 \muS. El pH de la solución se ajustó después a 6,3 con
HCl, y se ajustó la concentración de polímero a 102 g/l. Finalmente
la concentración de cloruro se ajustó a 154 mM. La solución después
se filtró de manera estéril en viales de vidrio, se taparon y se
almacenaron a 4ºC. Esto produjo aproximadamente 192 ml de producto
de almidón modificado en el que estaban modificadas aproximadamente
el 28% de las subunidades de glucosa.
\newpage
Experimento
2
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 30 g de polvo de almidón en 300 ml de agua. A esto se
añadieron lentamente 14,25 g de NaIO_{4} (222 mM), y la mezcla se
agitó durante 60 minutos. La mezcla resultante se diafiltró
(membrana: Pellicon 2, 5K MWCO, 0,5 m^{2}) contra agua hasta que
la conductividad del filtrado fue de 27 \muS. La concentración de
oxialmidón se ajustó después a 100 g/l. Se añadió con agitación
NaBH_{4} (2,27 g) a la solución de oxialmidón (180 ml) para
obtener una concentración de NaBH_{4} de 333 mM. La reacción se
agitó durante 190 minutos. La solución resultante se diafiltró
contra agua hasta que la conductividad del filtrado alcanza 35
\muS. El pH de la solución se ajustó después a 6,5 con HCl, y se
ajustó la concentración de polímero a 100 g/l. Finalmente la
concentración de cloruro se ajustó a 154 mM. La solución después se
filtró de manera estéril en viales de vidrio, se taparon y se
almacenaron a 4ºC. Esto produjo aproximadamente 133 ml de producto
de almidón modificado en el que estaban modificadas aproximadamente
el 36% de las subunidades de glucosa.
Experimento
3
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 30 g de polvo de almidón en 300 ml de agua. A esto se
añadieron lentamente 17,84 g de NaIO_{4} (278 mM), y la mezcla se
agitó durante 90 minutos. La mezcla resultante se diafiltró
(membrana: Pellicon 2, 5K MWCO, 0,5 m^{2}) contra agua hasta que
la conductividad del filtrado fue de 13 \muS. La concentración de
oxialmidón se ajustó después a 100 g/l. Se añadió con agitación
NaBH_{4} (3,09 g) a la solución de oxialmidón (196 ml) para
obtener una concentración de NaBH_{4} de 417 mM. La reacción se
agitó durante 185 minutos. La solución resultante se diafiltró
contra agua hasta que la conductividad del filtrado alcanza 45
\muS. El pH de la solución se ajustó después a 5,5 con HCl, y se
ajustó la concentración de polímero a 100 g/l. Finalmente la
concentración de cloruro se ajustó a 154 mM. La solución después se
filtró de manera estéril en viales de vidrio, se taparon y se
almacenaron a 4ºC. Esto produjo aproximadamente 151 ml de producto
de almidón modificado en el que estaban modificadas aproximadamente
el 45% de las subunidades de glucosa.
Experimento
4
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 30 g de polvo de almidón en 300 ml de agua. A esto se
añadieron lentamente 21,43 g de NaIO_{4} (334 mM), y la mezcla se
agitó durante 105 minutos. La mezcla resultante se diafiltró
(membrana: Pellicon 2, 5K MWCO, 0,5 m^{2}) contra agua hasta que
la conductividad del filtrado fue de 43 \muS. La concentración de
oxialmidón se ajustó después a 100 g/l. Se añadió con agitación
NaBH_{4} (3,66 g) a la solución de oxialmidón (193 ml) para
obtener una concentración de NaBH_{4} de 501 mM. La reacción se
agitó durante 185 minutos. La solución resultante se diafiltró
contra agua hasta que la conductividad del filtrado alcanzó 35
\muS. El pH de la solución se ajustó después a 4,4 con HCl, y se
ajustó la concentración de polímero a 100 g/l. Finalmente la
concentración de cloruro se ajustó a 154 mM. La solución después se
filtró de manera estéril en viales de vidrio, se taparon y se
almacenaron a 4ºC. Esto produjo aproximadamente 127 ml de producto
de almidón modificado en el que estaban modificadas aproximadamente
el 54% de las subunidades de glucosa.
Ejemplo
2
Los productos de almidón modificados preparados
anteriormente en los Experimentos 2, 3 y 4 del Ejemplo 1 se
examinaron para la velocidad de digestión por la
\alpha-amilasa usando cromatografía de exclusión
molecular con detección por índice de refracción y dispersión de
luz láser.
Una solución de \alpha-amilasa
(Sigma A-6255, Lote 33H8075, de páncreas porcino,
Tipo 1-A DFP tratado, 30 mg de proteína/ml, 790
unidades/mg de proteína) se preparó mediante la dilución de la
solución madre 1:50 con 0,9% de solución acuosa de NaCl. Las
muestras de digestión se prepararon en un tubo de ensayo de vidrio
de la siguiente manera: en el tubo se colocaron 0,5 ml de NaCl
acuoso al 0,9%, 0,1 ml de 50 mM de CaCl_{2}, 0,1 ml de HEPES (pH
7) y 10 \mul de solución de \alpha-amilasa
(preparada anteriormente) y se mezcló bien. A continuación se
añadieron 10,0 ml de almidón modificado (oxidado y reducido) (100
g/l) al tubo de ensayo, que se agitó en un aparato Vortex y se dejó
en reposo a temperatura ambiente. En momentos puntuales determinados
se tomaron muestras de 200 \mul de solución de amilasa/almidón,
se diluyeron con 0,88 ml de eluyente de cromatografía de exclusión
molecular (GPC) y se mezclaron bien. Después esto se inyectó sobre
una columna de GPC para la medición de la distribución del peso
molecular de las muestras.
La Figura 1 ilustra una representación gráfica
del cambio en el Peso Molecular Medio de Peso (WAMW) en función del
tiempo para cada uno de los productos de almidón modificado. Estos
datos se proporcionan en la Tabla 1.
En cada experimento, la oxidación y reducción de
almidón ralentizó su degradación por la amilasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se examinó in vivo la eliminación en
sangre de varios almidones modificados (oxidados y reducidos) en
ratas. Los productos de almidón modificados preparados
anteriormente en los Experimentos 2 a 4 se administraron i.v. (vena
femoral) a ratas Sprague-Dawley a una dosificación
de 10 ml/kg proporcionada en forma de una inyección de bolo. Se
inyectaron muestras de almidón modificado con 222 mM y 278 mM
NaIO_{4} en tres animales. Dos animales se inyectaron con almidón
modificado con 334 mM de NaIO_{4}. Se extrajeron muestras de
sangre de la vena femoral a los 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4
horas y 8 horas. Después se ensayaron estas muestras para determinar
la concentración de almidón modificado.
La Figura 2 muestra una representación gráfica
de los niveles medios en sangre de almidón modificado en función
del tiempo. Estos datos se proporcionan en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En cada experimento, la oxidación y reducción de
almidón ralentizó su eliminación del animal.
\newpage
Ejemplo
4
Los diversos experimentos siguientes detallan la
preparación de productos DFO-almidón y oxidación y
reducción del almidón o conjugado. Cada uno usó almidón de maíz
ceroso degradado no modificado (almidón) PM 126.000 o 46.000 y
deferoxamina mesilato (DFO) como materias primas. El almidón se
obtuvo de Laevosan (Linz, Austria). El DFO se obtuvo de Pharmacia
& Upjohn (Kalamazoo, MI) Lote 22ADF, PN 1001B. Todo el agua
usada para la preparación de estos lotes es agua despirogenada, y
todos los recipientes/utensilios se despirogenaron antes de uso.
Cuando fue posible, las reacciones y procesamientos se realizaron en
la campana de flujo laminar para conservar la pureza de estas
soluciones. Todas las reacciones se realizaron a o ligeramente por
debajo de la temperatura ambiente (laboratorio).
Experimento
1
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 99,8 g de polvo de almidón (PM 46.000) en 1000 ml de
agua. A continuación se añadieron a la mezcla 32,0 g de NaIO_{4}
(150 mM) y se agitó durante 90 minutos. La mezcla resultante se
diafiltró (membrana: Biomax 5K MWCO) contra agua hasta que la
conductividad del filtrado fue de 103 \muS. La concentración de
oxialmidón se ajustó después a 245 g/l. El volumen de reacción se
ajustó a 288 ml con agua y etanol proporcionando una mezcla que
tenía 30% de etanol en volumen. Se añadió con agitación DFO (22,26
g). Se continuó la agitación durante 1 hora, después de lo cual se
añadieron 5,65 ml de complejo borano piridina (BPC) 8 M a la mezcla
de reacción. Después la mezcla se agitó durante 20 horas. Al final
de este período de reacción, se añadieron 144 ml adicionales de
agua a la mezcla seguido de una adición lenta de 3,87 g de
NaBH_{4} (225 mM). Se continuó la agitación durante 1 hora,
después de lo cual la mezcla de reacción se diafiltró contra agua
hasta que la conductividad del filtrado fue de 30 \muS. El pH se
ajustó después a 6,0 con HCl, se ajustó la concentración de cloruro
proporcionando una concentración final de 154 mM y la concentración
de polímero se ajustó a 100 g/l. Finalmente, la solución se filtró
de manera estéril en viales de vidrio, se taparon y se almacenaron
a 4ºC. Esto produjo aproximadamente 515 ml de producto de
almidón-DFO en el que estaban modificadas
aproximadamente el 24% de las subunidades de glucosa, y tenían una
concentración de quelante de alto peso molecular de 34 mM a una
concentración de almidón-DFO de
100 g/l.
100 g/l.
Experimento
2
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 100 g de polvo de almidón (PM 46.000) en 970 ml de agua.
A continuación se añadieron a la mezcla 117,7 g de NaIO_{4} (550
mM) y se agitó durante 60 minutos. La mezcla resultante se
diafiltró (membrana: Pellicon 2 Biomax 5K MWCO) contra agua hasta
que la conductividad del filtrado fue de 167 \muS. La
concentración de oxialmidón se ajustó después a 166 g/l. El volumen
de reacción se ajustó a 540 ml con agua y etanol proporcionando una
mezcla que tenía 30% de etanol en volumen. Se añadió con agitación
DFO (27,09 g). Se continuó la agitación durante 1 hora, después de
lo cual se añadieron 13,8 ml de complejo borano piridina (BPC) 8 M
a la mezcla de reacción. Después la mezcla se agitó durante 18
horas, después de lo cual se añadieron 7 ml de BPC y se continuó la
agitación durante otras 2 horas. Al final de este período de
reacción, se añadieron 572 ml adicionales de agua a la mezcla
seguido de una adición lenta de 17,17 g de NaBH_{4} (825 mM). Se
continuó la agitación durante 3 horas, después de lo cual la mezcla
de reacción se diafiltró contra agua hasta que la conductividad del
filtrado fue de 124 \muS. El pH se ajustó después a 6,0 con HCl,
se ajustó la concentración de cloruro proporcionando una
concentración final de 154 mM y la concentración de polímero se
ajustó a 100 g/l. Finalmente, la solución se filtró de manera
estéril en viales de vidrio, se taparon y se almacenaron a 4ºC.
Esto produjo aproximadamente 515 ml de producto de
almidón-DFO en el que estaban modificadas
aproximadamente el 89% de las subunidades de glucosa, y tenían una
concentración de quelante de alto peso molecular de 45 mM a una
concentración de almidón-DFO de
100 g/l.
100 g/l.
Experimento
3
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 50 g de polvo de almidón (PM 126.000) en 465 ml de agua.
A continuación se añadieron a la mezcla 16,0 g de NaIO_{4} (150
mM) y se agitó durante 60 minutos. La mezcla resultante se
diafiltró (membrana: Pellicon 2 mini, 5K MWCO) contra agua hasta que
la conductividad del filtrado fue de 136 \muS. La concentración
de oxialmidón se ajustó después a 165 g/l. El volumen de reacción se
ajustó a 385 ml con agua y etanol proporcionando una mezcla que
tenía 30% de etanol en volumen. Se añadió con agitación DFO (19,51
g). Se continuó la agitación durante 5 minutos, después de lo cual
se añadieron 4,95 ml de complejo borano piridina (BPC) 8 M a la
mezcla de reacción. Después la mezcla se agitó durante 19 horas. Al
final de este período de reacción, se añadieron lentamente 3,39 g
de NaBH_{4} (225 mM) al recipiente de reacción con agitación. Se
continuó la agitación durante 90 minutos, después de lo cual la
mezcla de reacción se diafiltró contra agua hasta que la
conductividad del filtrado fue de 97 \muS. El pH se ajustó después
a 6,0 con HCl, se ajustó la concentración de cloruro proporcionando
una concentración final de 154 mM y la concentración de polímero se
ajustó a 100 g/l. Finalmente, la solución se filtró de manera
estéril en viales de vidrio, se taparon y se almacenaron a 4ºC.
Esto produjo aproximadamente 470 ml de producto de
almidón-DFO en el que estaban modificadas
aproximadamente el 24% de las subunidades de glucosa, y tenían una
concentración de quelante de alto peso molecular de 36 mM a una
concentración de almidón-DFO de
100 g/l.
100 g/l.
Experimento
4
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 50 g de polvo de almidón (PM 126.000) en agua hasta un
volumen final de 500 ml. A continuación se añadieron a la mezcla
58,8 g de NaIO_{4} (550 mM) y se agitó durante 60 minutos. La
mezcla resultante se diafiltró (membrana: Pellicon 2 mini, 5K MWCO)
contra agua hasta que la conductividad del filtrado fue de 167
\muS. La concentración de oxialmidón se ajustó después a 160 g/l.
El volumen de reacción se ajustó a 395 ml con agua y etanol
proporcionando una mezcla que tenía 30% de etanol en volumen. Se
añadió con agitación DFO (19,28 g). Se continuó la agitación durante
60 minutos, después de lo cual se añadieron 14,7 ml de complejo
borano piridina (BPC) 8 M a la mezcla de reacción. Después la mezcla
se agitó durante 20 horas. Al final de este período de reacción, se
añadieron lentamente 12,2 g de NaBH_{4} (825 mM) al recipiente de
reacción con agitación. Se continuó la agitación durante 180
minutos, después de lo cual la mezcla de reacción se diafiltró
contra agua hasta que la conductividad del filtrado fue de 144
\muS. El pH se ajustó después a 6,0 con HCl, se ajustó la
concentración de cloruro proporcionando una concentración final de
154 mM y la concentración de polímero se ajustó a 100 g/l.
Finalmente, la solución se filtró de manera estéril en viales de
vidrio, se taparon y se almacenaron a 4ºC. Esto produjo
aproximadamente 517 ml de producto de almidón-DFO
en el que estaban modificadas aproximadamente el 89% de las
subunidades de glucosa, y tiene una concentración de quelante de
alto peso molecular de 47 mM a una concentración de
almidón-DFO de 100 g/l.
Experimento
5
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 50 g de polvo de almidón (PM 126.000) en 473 ml de agua.
A continuación se añadieron a la mezcla 23,74 g de NaIO_{4} (222
mM) y se agitó durante 65 minutos. La mezcla resultante se
diafiltró (membrana: Biomax Pellicon 2 mini, 5K MWCO) contra agua
hasta que la conductividad del filtrado fue de 90 \muS. La
concentración de oxialmidón se ajustó después a 163 g/l. El volumen
de reacción se ajustó a 388 ml con agua y etanol proporcionando una
mezcla que tenía 30% de etanol en volumen. Se añadió con agitación
DFO (19,47 g). Se continuó la agitación durante 15 minutos, después
de lo cual se añadieron 7,42 ml de complejo borano piridina (BPC) 8
M a la mezcla de reacción. Después la mezcla se agitó durante 20
horas. Al final de este período de reacción, se añadieron lentamente
4,99 g de NaBH_{4} (333 mM) al recipiente de reacción con
agitación. Se continuó la agitación durante 200 minutos, después de
lo cual la mezcla de reacción se diafiltró contra agua hasta que la
conductividad del filtrado fue de 96 \muS. El pH se ajustó después
a 6,0 con HCl, se ajustó la concentración de cloruro proporcionando
una concentración final de 154 mM y la concentración de polímero se
ajustó a 100 g/l. Finalmente, la solución se filtró de manera
estéril en viales de vidrio, se taparon y se almacenaron a 4ºC.
Esto produjo aproximadamente 529 ml de producto de
almidón-DFO en el que estaban modificadas
aproximadamente el 36% de las subunidades de glucosa, y tenían una
concentración de quelante de alto peso molecular de 40 mM a una
concentración de almidón-DFO de
100 g/l.
100 g/l.
Experimento
6
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 50 g de polvo de almidón (PM 126.000) en 445 ml de agua.
A continuación se añadieron a la mezcla 29,71 g de NaIO_{4} (278
mM) y se agitó durante 65 minutos. La mezcla resultante se
diafiltró (membrana: Biomax Pellicon 2 mini, 5K MWCO) contra agua
hasta que la conductividad del filtrado fue de 107 \muS. La
concentración de oxialmidón se ajustó después a 169 g/l. El volumen
de reacción se ajustó a 393 ml con agua y etanol proporcionando una
mezcla que tenía 30% de etanol en volumen. Se añadió con agitación
DFO (19,72 g). Se continuó la agitación durante 18 minutos, después
de lo cual se añadieron 10,00 ml de complejo borano piridina (BPC)
8 M a la mezcla de reacción. Después la mezcla se agitó durante 20
horas. Al final de este período de reacción, se añadieron lentamente
6,39 g de NaBH_{4} (417 mM) al recipiente de reacción con
agitación. Se continuó la agitación durante 180 minutos, después de
lo cual la mezcla de reacción se diafiltró contra agua hasta que la
conductividad del filtrado fue de 91 \muS. El pH se ajustó
después a 6,0 con HCl, se ajustó la concentración de cloruro
proporcionando una concentración final de 154 mM y la concentración
de polímero se ajustó a 100 g/l. Finalmente, la solución se filtró
de manera estéril en viales de vidrio, se taparon y se almacenaron
a 4ºC. Esto produjo aproximadamente 558 ml de producto de
almidón-DFO en el que estaban modificadas
aproximadamente el 45% de las subunidades de glucosa, y tenía una
concentración de quelante de alto peso molecular de 42 mM a una
concentración de almidón-DFO de
100 g/l.
100 g/l.
\newpage
Experimento
7
En un recipiente limpio, de vidrio se
disolvieron 50 g de polvo de almidón (PM 126.000) en 450 ml de agua.
A continuación se añadieron a la mezcla 35,72 g de NaIO_{4} (334
mM) y se agitó durante 60 minutos. La mezcla resultante se
diafiltró (membrana: Biomax Pellicon 2 mini, 5K MWCO) contra agua
hasta que la conductividad del filtrado fue de 110 \muS. La
concentración de oxialmidón se ajustó después a 181 g/l. El volumen
de reacción se ajustó a 335 ml con agua y etanol proporcionando una
mezcla que tenía 30% de etanol en volumen. Se añadió con agitación
DFO (16,98 g). Se continuó la agitación durante 15 minutos, después
de lo cual se añadieron 10,80 ml de complejo borano piridina (BPC)
8 M a la mezcla de reacción. Después la mezcla se agitó durante 20
horas. Al final de este período de reacción, se añadieron lentamente
6,54 g de NaBH_{4} (501 mM) al recipiente de reacción con
agitación. Se continuó la agitación durante 170 minutos, después de
lo cual la mezcla de reacción se diafiltró contra agua hasta que la
conductividad del filtrado fue de 108 \muS. El pH se ajustó
después a 6,0 con HCl, se ajustó la concentración de cloruro
proporcionando una concentración final de 154 mM y la concentración
de polímero se ajustó a 100 g/l. Finalmente, la solución se filtró
de manera estéril en viales de vidrio, se taparon y se almacenaron
a 4ºC. Esto produjo aproximadamente 474 ml de producto de
almidón-DFO en el que estaban modificadas
aproximadamente el 54% de las subunidades de glucosa, y tenía una
concentración de quelante de alto peso molecular de 43 mM a una
concentración de almidón-DFO de
100 g/l.
100 g/l.
Ejemplo
5
Los conjugados DFO-almidón
preparados anteriormente en los Experimentos 3 y 4 del Ejemplo 4 se
examinaron para determinar la velocidad de digestión por la
\alpha-amilasa usando cromatografía de exclusión
molecular con detección por índice de refracción y dispersión de
luz láser.
Las muestras de digestión se prepararon de una
manera similar al procedimiento indicado en el Ejemplo 2. Las
muestras digeridas se inyectaron sobre la columna de GPC para la
medición de la distribución del peso molecular de la muestra.
La Figura 3 proporciona una representación
gráfica del cambio en el Peso Molecular Medio de Peso (WAMW) en
función del tiempo para cada uno de los productos de almidón
modificado. Estos datos se proporcionan en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
En cada experimento, una extensión aumentada de
oxidación y reducción de almidón ralentizaba la velocidad de
degradación por la amilasa del conjugado
almidón-DFO.
Ejemplo
6
Se examinó la eliminación en sangre
in-vivo en ratas de varios conjugados de
DFO-almidón oxidado y reducido. Varios conjugados
de DFO-almidón oxidado y reducido preparados como
antes en los Experimentos 1 a 7 del Ejemplo 4 se administraron por
vía i.v. (vena femoral) a ratas Sprague-Dawley a una
dosificación de 10 ml/kg proporcionada en forma de infusión de 30
minutos. En todos los casos o bien dos o tres animales se usaron
para el experimento. Se extrajeron muestras de sangre de la vena
femoral en diferentes momentos. Estas muestras después se ensayaron
para determinar la concentración de conjugado de
DFO-Almidón.
La Figura 4 muestra una representación gráfica
de los niveles en sangre medios del Conjugado de
DFO-Almidón en función del tiempo. Los experimentos
1 y 2 emplearon almidón que tenía un peso molecular de 46.000. Los
experimentos 3-7 emplearon almidón que tenía un peso
molecular de 126.000. Estos datos se proporcionan en la Tabla
4.
Una extensión aumentada de oxidación y reducción
del almidón ralentizaba la eliminación del conjugado
almidón-DFO desde el animal.
Ejemplo
7
La modificación de dextrano se llevó a cabo
mediante una ligera modificación del procedimiento descrito en el
Ejemplo 1 para la oxidación del almidón. En resumen, se disolvió
dextrano en un medio acuoso a una concentración de aproximadamente
100 g/l y con agitación, después se añadió una solución de
NaIO_{4} (o NaIO_{4} en forma sólida) para oxidar el dextrano.
La cantidad de NaIO_{4} usado controlaba la cantidad de la
oxidación de dextrano. La mezcla de reacción se purificó después
para eliminar las sales de la reacción de oxidación. A
continuación, los grupos dialdehído resultantes (formados por la
reacción de oxidación) se redujeron a grupos alcohol usando
NaBH_{4}. Finalmente la mezcla de reacción se purificó de nuevo
para eliminar las sales de la mezcla de reacción. El "dextrano
modificado" estaba después listo para formulación o modificación
posterior.
Ejemplo
8
Se administró dextrano oxidado y reducido por
vía i.v. a ratas Sprague- Dawley a una dosificación de 40 ml/kg
durante 30 minutos. Aproximadamente 100% de los hidroxilos vecinales
sobre el dextrano se han oxidado con peryodato y reducido. Se
observó una reacción alérgica muy pequeña como se demuestra por la
ligera inflamación de las almohadillas de las patas delanteras
(pero no de las almohadillas de las patas traseras). Después de la
dosificación el animal se recuperó completamente de la
anestesia.
Por el contrario, cuando se administró por
infusión una dosis equivalente de dextrano nativo en una rata se
observó una reacción alérgica muy grave después de 15 minutos,
aproximadamente a mitad de camino de la dosis, las almohadillas de
las patas (delanteras y traseras) se inflamaron y se detuvo la
dosificación. Inmediatamente después de la terminación de la
dosificación la cola y cuerpo del animal se volvió gravemente
edematosa y el animal murió en ese momento. Se cree que la muerte
fue provocada por asfixia debida a la constricción del paso de aire
debido a una reacción alérgica al dextrano. Esta raza de rata se
sabe que es alérgica al dextrano.
La invención se ha descrito con referencia a
diversos modos de realización y técnicas específicos y preferidos.
Sin embargo, se debe entender que muchas variaciones y
modificaciones se pueden realizar manteniéndose dentro del espíritu
y alcance de la invención. Todas las publicaciones y solicitudes de
patente en esta memoria descriptiva son indicadoras del nivel de
los expertos en la técnica a la que la invención pertenece.
Claims (9)
1. Un polisacárido modificado obtenible mediante
un proceso de oxidación y reducción de polisacárido soluble en
agua, en el que dicho proceso incluye las etapas de:
- -
- oxidar el polisacárido con NaIO_{4} y
- -
- reducir la mezcla con NaBH_{4}, y
en el que 20 a 90% de grupos hidroxilo vecinales
del polisacárido se han oxidado.
2. El polisacárido modificado de la
reivindicación 1, en el que se añade un quelante a la mezcla de
reacción para formar un conjugado de dicho polisacárido
oxidado.
3. El polisacárido modificado de la
reivindicación 1 ó 2, en el que el polisacárido soluble en agua en
el proceso es almidón o dextrano.
4. El polisacárido modificado de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que entre 20 y 80% de dichos
grupos hidroxilo se han oxidado.
5. El polisacárido modificado de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en el que entre 30 y 60% de dichos
grupos hidroxilo se han oxidado.
6. El polisacárido modificado de la
reivindicación 1, en el que el quelante comprende deferoxamina.
7. El polisacárido modificado de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que la extensión de oxidación y
reducción del almidón soluble es eficaz para proporcionar una
semivida vascular más larga.
8. El polisacárido modificado de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 para uso como un medicamento que se
administra en la circulación del mamífero.
9. Una composición farmacéutica comprendiendo el
polisacárido modificado definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
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