JP2011527671A - ペプチド及び癌細胞中へのキャリヤーとしてのその使用 - Google Patents

Abstract

癌細胞中に分子又は放射性同位体を輸送するためのキャリヤーとしてのペプチドの使用が記載されており；また、前記ペプチドの修飾及びその使用も記載されている。

Description

本発明は、癌細胞の解析又は治療における診断又は治療目的に使用可能な製品の分野に関するものである。

腫瘍の発達における染色体異常の関連性は、前世紀から知られている。

しかしながら、ここ２０年以内で初めて、細胞遺伝学及び分子生物学の発達により、腫瘍遺伝学の原理が明確に確認され、染色体変化がヒトにおける腫瘍の発生に重要なものとして認識された。

最近の研究では、脂肪肉腫の細胞株を調べて、その培地中において様々なタンパク質を生成して分泌することを見出した。その中でも、特に、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＬＳＡ−タイプ−ＭｎＳＯＤとして知られる）を同定し、遊離ラジカルを過酸化水素に変換することを目的とした酵素活性（全てのＳＯＤに共通する）に加えて、それを骨髄性白血病の細胞株Ｕ９３７で表される対応ＭｎＳＯＤと区別するような構造的及び機能的特性を実証した。

この点において、ＬＳＡ−タイプ−ＭｎＳＯＤはＬＳＡ細胞により分泌され、一方、天然のＭｎＳＯＤはミトコンドリアマトリックスに局在しており、前者は、天然のＭｎＳＯＤ（２４ｋＤａ）より有意に大きな分子量（３０ｋＤａ）を有する。

更に、ＬＳＡ−タイプ−ＭｎＳＯＤを生体内又は生体外に注入する場合には、それは、全細胞に達することができ、そこに存在する遊離ラジカルと反応するとき、過酸化水素を生成する。しかしながら、腫瘍細胞は、十分な量のカタラーゼを有しておらず、この過酸化物を代謝することができないため、腫瘍細胞においては、正常細胞と比べて容易に毒性閾値に達する。これは、優先的な増殖の抑制及び腫瘍細胞死のみの増加をもたらす。この側面は、ＬＳＡ−タイプ−ＭｎＳＯＤが腫瘍細胞に対して特異的で且つ選択的に細胞毒性を示すことを確認する。

また、特異的ｃＤＮＡクローンにより作られるＬＳＡ−タイプ−ＭｎＳＯＤの組換え形態（ｒＭｎＳＯＤ）は、天然タンパク質の構造的特性及びオンコ毒性（oncotoxic properties）を保持することが分かっており、その上、抽出ＬＳＡ−タイプ−ＭｎＳＯＤ及びｒＭｎＳＯＤの両方は、ＭｎＳＯＤのリーダー配列に正確に対応する２４残基のペプチドをＮ−末端に有している。
(発明の概要)

（ａ−ｄ）は、シスプラチン単独（ｄ）、ｒＭｎＳＯＤのリーダーペプチドに結合したシスプラチン（ｃ）、及び負の対照（ａ）と比較したｒＭｎＳＯＤのリーダーペプチド単独（ｂ）の各種細胞株に対する作用を示す。 アポトーシスＢａｘ遺伝子は、ｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣの存在下で処理した腫瘍細胞においてのみ活性があることを示す。

現在、ｒＭｎＳＯＤのリーダーペプチドを表し、また上記との類似点を考慮してＬＳＡ−タイプ−ＭｎＳＯＤのリーダーペプチドをも表す配列：
ＭＬＳＲＡＶＣＧＴＳＲＱＬＡＰＡＬＧＹＬＧＳＲＱ（配列番号１）
のペプチドが、癌細胞に侵入することができ、それ故に、前記細胞中に、治療又は診断目的に使用可能な分子又は放射性同位体を輸送するキャリヤーとして作用することができることを驚くべきことに見出した。

更なる実施態様によれば、本発明はまた、上記ペプチド（配列番号１）と同様にキャリヤーとして作用することもできる配列：
ＭＬＳＲＡＶＣ（配列番号２）
のペプチドに関するものである。

その上、本発明はまた、先に記載したヘプタペプチド中にシステインを挿入するか（Ｎ−末端メチオニンに結合させるか）又は前記メチオニンをシステインで置換し、環化させ、挿入された前記システインと既に存在しているシステインとの間にジスルフィド架橋を形成させることによって得られるペプチドに関するものであり；従って、前記ペプチドは、以下の配列：
ＣＭＬＳＲＡＶＣ（配列番号３）
ＣＬＳＲＡＶＣ（配列番号４）
をそれぞれ有しており、ここで、二つの末端システインは、ジスルフィド架橋により結合している。

また、本発明は、上記のようなリーダーペプチドの、放射性同位体を結合することが可能なキレート基（ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＯＴＡ、ＨＹＮＩＣ等）と、フルオレセイン、ローダミン等の色素、即ち、シスプラチン、タキソール、ファルモルビシン等の細胞増殖抑制作用を有する分子、又は有糸分裂シグナルの伝達を防止することが可能なキナーゼ阻害剤等の酵素活性を有する分子と、またアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ｏ．ｎ．）との複合体に関するものである。

更に、必要であれば、シスプラチンに既に結合しているリーダーペプチド（配列番号１）（以下、ｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣという錯体）を更に生体高分子に又はリポソームと共に結合でき、経口投与又は皮下投与によって抗腫瘍治療を行うのに使用することができる。

従って、本発明はまた、ｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣの放出制御のための製剤に関するものである。前記製剤は、例えば、ヒアルロン酸、ＰＥＧ、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、並びに医薬品業界において十分に確立された使用の他の生分解性及び生体適合性コポリマーのような生分解性物質のミクロスフェアを含むことができる。

ＰＬＧＡを使用する場合、異なる乳酸−グリコール酸比（７５：２５及び５０：５０）及び異なる分子量を有し、親水性を変化させるＰＬＧＡｓを、ポリマーの特性がどのようにミクロスフィアの特性に影響を及ぼすのかを評価する目的で利用することができ；例えば、Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ ５０４ Ｈ及びＲｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ ７５６（又はそれらの等価物）を使用でき、それぞれは固有粘度が０．５及び０．８ｄｌ／ｇであり、分子量（Ｍｗ）が２０，０００及び８９，０００Ｄａである。

上記したものと同様に、ＤＯＴＡに結合し、生体高分子又はリポソームに結合しているリーダーペプチドは、ナノ技術プロセス用の分子キャリヤーとして使用することもでき、その方法は、ＵＳ ＦＤＡにより既に承認されている。

更に、ｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣは、ｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣを用いた抗腫瘍治療が腫瘍に効果を及ぼすかどうかを理解するため、（免疫細胞化学的技術による）予測試験を行うのに使用できる。

この点において、腫瘍の組織学的クリオスタット切片をｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣで６０分間処理し、ザンボニ液で固定した後、ｒＭｎＳＯＤに対する抗体で処理する場合、腫瘍組織細胞がｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣを取り込んだかどうかを確認し得る。

肯定的な結果は、ｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣを腫瘍に冒された生物中に注入する場合、それが腫瘍に達し、それを破壊することを意味する。

その上、腫瘍細胞に侵入するｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣの能力及び該細胞のエストロゲン受容体の存在を比較することによって、記載した免疫細胞化学的解析を用い、かかる腫瘍のエストロゲン受容体の発現の程度を決定することが可能である。

従って、本発明は、上記したような複合体を少なくとも一種含む、腫瘍疾患を治療するための医薬組成物と診断方法とに関するものである。

以下に示す例を踏まえて、本発明を更に理解することになる。

例１
配列ＭＬＳＲＡＶＣＧＴＳＲＱＬＡＰＡＬＧＹＬＧＳＲＱ（配列番号１）のペプチドの合成
マニュアル反応器において、標準的なＦｍｏｃ方法論による固相合成技術を用いて、２４個のアミノ酸のペプチドリーダー（配列番号１）を合成した。Ｃ１８−結合シリカカラム（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ１０１０）を用いた半調製ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行った。ペプチドは純度が９９％であり；該ペプチドの分子量を質量スペクトル及びアミノ酸解析により確認した。

例２
配列ＭＬＳＲＡＶＣＧＴＳＲＱＬＡＰＡＬＧＹＬＧＳＲＱ（配列番号１）のペプチドのＤＯＴＡとの複合体、及びその錯体の^６８Ｇａによる標識化
次に、ヘペス緩衝液中１２０℃にて１５分間、放射性^６８Ｇａと共に、例１で得た合成リーダーペプチドをＤＯＴＡ２０μｇに結合させた。次いで、標識化されたペプチドを小さなＣ１８カラムの逆相クロマトグラフィーにより精製し、水で洗浄し、エアフローにより乾燥させた。

次いで、９６％エタノール４００μｌ中にペプチドを再び溶解させた。

酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液又はゲンチシン酸緩衝液中において、同一のペプチドを、^９０Ｙ、^１７７Ｌｕ、^１１１Ｉｎにより９０℃で３０分間標識化させた。

ＤＯＴＡに結合しているｒＭｎＳＯＤのリーダーペプチドに関する解析を行い、その生理溶液中での安定性を決定した。該ペプチドは、その物理化学的構造の変化を示さずに４８時間安定していることが分かった。

例３
配列ＭＬＳＲＡＶＣＧＴＳＲＱＬＡＰＡＬＧＹＬＧＳＲＱ（配列番号１）のペプチドのフルオレセインとの複合体
親ペプチドＭＬＳＲＡＶＣＧＴＲＱＬＡＰＡＬＧＹＬＬＧＳＲＱ及びより短いその類似体ＭＬＳＲＡＶＣのＮ−末端での標識化を、固相において、５(６)-カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を用いた標準的なカップリング手順によって行った。

例４
配列ＭＬＳＲＡＶＣ（配列番号２）のペプチドの合成
マニュアル反応器において、標準的なＦｍｏｃ方法論による固相合成技術を用い、例１で得られるペプチド配列の初めの７個のアミノ酸から形成されるペプチドを合成した。Ｃ１８結合シリカカラム（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ１０１０）を用いた半調製ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製を行った。ペプチドは純度が９９％であり；該ペプチドの分子量を質量スペクトル及びアミノ酸解析により確認した。

例５
ペプチド配列番号２の環化
ペプチド配列ＭＬＳＲＡＶＣから、第二のシステイン残基を導入することで、２種類の環状類似体を得た：
類似体１ ＣＭＬＳＲＡＶＣ（配列番号３）
類似体２ ＣＬＳＲＡＶＣ （配列番号４）

類似体１は、最初のペプチド配列に追加されるシステインとメチオニンで結合することにより得られる。

類似体２は、最初のペプチドのＮ−末端メチオニンをシステイン残基で置換することにより得られる。

末端システインの２個のＳＨ間の結合により、ジスルフィド架橋を形成した。

環化は、０．１ＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液をペプチド鎖に加え（ペプチド１０ｍｇ当たり溶液１０ｍｌ）、その後の周囲温度にて約４８時間の単純な空気酸化により達成された。

得られた２種類の環状ペプチドをキレート剤に結合し、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液又はゲンチシン酸緩衝液中において、^９０Ｙ、^１７７Ｌｕ、^１１１Ｉｎにより９０℃で３０分間標識化させた。

例６
例２で得られた標識化複合体１ｍＣｉを、多発性乳房腫瘍に冒された１３歳の雌犬に注入した。

注入の約３０分後に、ＥＣＡＴ ４７ ＰＥＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によりスキャニングを始め、軸横断面、冠状面及び矢状面に従って画像を作成した。

例７
ＭＣＦ−７細胞は、例３で得られた複合体、及び同様に標識化され、対照として使用される、同一のアミノ酸組成を有するが配列の異なる「スクランブル」ペプチドにより、周囲温度にて１時間別々に処理された。

処理後、共焦点顕微鏡を用いて、細胞を調べた。

例３の複合体と共にインキュベートした細胞中では、著しい細胞質の発光が見えるものの、スクランブルペプチドで処理した対照中には、発光が見られなかった；これは、標識化したペプチドは細胞中に入ることができたが、スクランブルペプチドは、細胞に侵入する前記能力を示さなかったことを実証する。

例８
シスプラチンに結合したｒＭｎＳＯＤのリーダーペプチド錯体の合成

ｒＭｎＳＯＤのリーダーペプチドは、２４個のアミノ酸からなり、配列：ＭＬＳＲＡＶＣＧＴＳＲＱＬＡＰＡＬＧＹＬＧＳＲＱを有しており、適切な反応管中での固相Ｆｍｏｃ法により合成された。

次いで、Ｃ１８−結合シリカカラム（Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ１０１０）を用いた半調製ＨＰＬＣにより、得られたサンプルを精製した。

ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により確認したところ、ペプチドは純度が９９％であった。

次いで、ジアミノ−エチル−グリシンを、２個の遊離アミノ官能基が適切な距離（４個の共有結合）で存在するために白金（ＩＩ）イオンをＰＴＣｌ_２の形で錯体化させることのできるＮ−末端位置（Ｍ）にて、ペプチド残基に結合させた。質量分析及びアミノ酸配列解析によって、Ｓｔｅｗａｒｔ Ｊｍ，Ｙｏｕｎｇ ＪＤの方法（固相ペプチド合成）に従い、正確な分子量及びペプチド質量を調べて確認した。

例９
免疫細胞化学
ヒト由来の乳房腫瘍から得られた、連続培養中の標的細胞（ＭＣＦ−７）を、（ａ）他の分子に結合していない２４個のアミノ酸からなるｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣのリーダーペプチド、（ｂ）シスプラチンに結合している２４個のアミノ酸からなるリーダーペプチドの存在又は不在下において３時間インキュベートした。

インキュベーション後、該細胞を、ザンボニ固定液（４％パラホルムアルデヒド＋１５％ピクリン酸からなる溶液）で６０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、内在性ペルオキシダーゼをブロックする目的で、０．３％過酸化水素を含有するＰＢＳ中に該細胞を維持した。次いで、１／２００に希釈した、ポリクローナル抗体（ウサギから得られたｒＭｎＳＯＤの抗リーダーペプチド）を細胞に加え、１時間周囲温度にて置いておいた。反応を進展させるため、ＤＡＫＯ ＳＬＡＢ ペルオキシダーゼ Ｋ０６７９キットを用いた。

例１０
ｒＭｎＳＯＤ−リーダーペプチドにより腫瘍細胞中に輸送されたシスプラチンの原子吸光分析による定量的決定
標的細胞ＭＣＦ−７をトリプシン処理し、緩衝した溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、３５％ＨＮＯ_３５０μｌにより１６時間処理した。前処理温度１３００℃及び原子化温度２２００℃のパラメータを用い、マトリックス修飾因子としてＰｔ０．０１５ｍｇのＭｇ(ＮＯ_３)_２０．０１ｍｇとの組成物を用いた、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ノーウォーク，ＣＴ，ＵＳＡからのＡｎａｌｙｓｔ８００機器による原子吸光をサンプルに受けさせることによって、白金含量を決定した。

熱分解グラファイト被覆したＴＨＧＡ管（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）による「ゼーマン効果の背景」補正システムを用いて測定を行い、金属定量のため、統合的Ｌｖｏｖ型プラットホームを使用した。標準溶液として、我々は、較正曲線上に３つの基準点を得るため、２．５％のＨＮＯ_３溶液（Ｓｐｅｃｔｒａｓｃａｎ）を使用した。

図１は、左から右へ、各種正常細胞株（ＭＣＨ１０）及び腫瘍細胞株（ＭＣＦ７、Ｍ１７３５、ＭＲＣ５及びＡ２７８０）の細胞をｒＭｎＳＯＤのリーダーペプチド（ｂ）で処理して得た結果、シスプラチンに結合しているリーダーペプチド（ｃ）で該細胞を処理して得た結果、最後にはシスプラチン単独（ｄ）で該細胞を処理して得た結果を、それぞれの未処理対照細胞（ａ）と比較しながら示す。免疫組織化学反応は、ペプチド自体は細胞を損傷せずに腫瘍細胞に侵入するものの、シスプラチンに結合しているペプチドは、たった３時間のインキュベーションの後に強力なアポトーシス反応を生じることを実証した。

以下に示す表１から分かるように、ｒＭｎＳＯＤのリーダーペプチドは、細胞中に、多量のシスプラチンを輸送することができ、シスプラチンを単独で腫瘍細胞に加えた場合に細胞に入る量を２倍にする。

図２は、各種細胞株に対するｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣ錯体のアポトーシス作用を確認する。

明らかなように、ｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣ存在下での全正常細胞の処理は、アポトーシス反応の発現であるＢａｘ遺伝子発現の欠如により実証されたように、いずれの毒性作用も誘発しない。これは、ｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣの存在下で処理された腫瘍細胞中で起こる、同一の遺伝子が強く発現することと対照的である。実験では、定量的なＤＮＡ発現の対照としてアクチンｃＤＮＡを挿入した；この場合にも、（ａ）は未処理細胞を示し、（ｂ）はｒＭｎＳＯＤのリーダーペプチド（ｂ）で処理した細胞を示し、（ｃ）はシスプラチンに結合しているリーダーペプチドで処理した細胞を示す。

Claims (19)

1. 癌細胞を標的にするキャリヤーとしての、配列ＭＬＳＲＡＶＣ（配列番号２）を含有するペプチドの使用。
2. 前記ペプチドが、配列ＭＬＳＲＡＶＣＧＴＳＲＱＬＡＰＡＬＧＹＬＧＳＲＱ（配列番号１）を有することを特徴とする請求項１に記載の使用。
3. 癌細胞を標的にするキャリヤーとしての、配列ＭＬＳＲＡＶＣ（配列番号２）からなるペプチドの使用。
4. 配列ＭＬＳＲＡＶＣ（配列番号２）を有するペプチド。
5. 配列ＣＭＬＳＲＡＶＣ（配列番号３）及びＣＬＳＲＡＶＣ（配列番号４）を有してなり、二つの末端システインがジスルフィド架橋により結合していることを特徴とするペプチド。
6. 配列ＭＬＳＲＡＶＣＧＴＳＲＱＬＡＰＡＬＧＹＬＧＳＲＱ（配列番号１）のペプチド又は請求項４若しくは５に記載のペプチド、及び放射性同位体に結合可能なキレート基を持つ分子、色素、細胞増殖抑制作用を有する分子、酵素活性を有する分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ｏ．ｎ．）を備える複合体。
7. 前記キレート基を持つ分子が、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＯＴＡ又はＨＹＮＩＣであることを特徴とする請求項６に記載の複合体。
8. 前記色素が、フルオレセイン又はローダミンであることを特徴とする請求項６に記載の複合体。
9. 前記細胞増殖抑制作用を有する分子が、シスプラチン、タキソール及びファルモルビシンから選択されることを特徴とする請求項６に記載の複合体。
10. 前記細胞増殖抑制作用を有する分子がシスプラチンであることを特徴とする請求項９に記載の複合体。
11. 前記酵素活性を有する分子が、有糸分裂シグナルの伝達を防止することが可能なキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項６に記載の複合体。
12. 診断薬としての、請求項６〜８のいずれかに記載の複合体の使用。
13. 腫瘍疾患を治療するための医薬組成物を調製するための、請求項６〜１１のいずれかに記載の複合体の使用。
14. 生体高分子又はリポソームと共にＤＯＴＡに結合している可能性があるｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣ錯体からなる複合体。
15. ｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣ複合体の放出制御のための製剤であって、前記複合体が配合された生分解性物質のミクロスフェアを備える製剤。
16. 前記生分解性物質が、ヒアルロン酸、ＰＥＧ、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、並びに医薬品業界において十分に確立された使用の他の生分解性及び生体適合性コポリマーから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の製剤。
17. ナノ技術プロセス用の分子キャリヤーとしての、請求項１４に記載の複合体の使用。
18. 抗腫瘍治療の作用による予知診断のためのｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣ複合体の使用。
19. 腫瘍のエストロゲン受容体の発現の程度を決定するためのｒＭｎＳＯＤ−Ｌｐ−ＣＣ複合体の使用。