EA030096B1 - Способы, композиции и нуклеиновые кислоты для стимуляции гуморального иммунного ответа - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к нуклеиновой кислоте и композиции для стимуляции гуморального иммунного ответа и/или увеличения продукции у субъекта по меньшей мере одного цитокина, к способам индукции продукции IL-6, интерферона-альфа или IP-10 и к способам индукции гуморального иммунного ответа у субъекта. Изобретение также относится к вакцине, содержащей указанную композицию, и применению указанной композиции для индукции у субъекта гуморального иммунного ответа против В-клеточного антигена или Т-клеточного антигена.

Description

Настоящая заявка заявляет приоритет заявки США с серийным номером 61/414194, поданной 16 ноября 2010. Содержимое предыдущей заявки включено посредством ссылки во всей полноте.

Уровень техники

Стимуляция иммунной системы, которая включает стимуляцию любой из двух или обоих вместе врожденного иммунитета и приобретенного иммунитета, представляет собой сложный феномен, который приводит либо к защитным, либо к нежелательным физиологическим последствиям для хозяина. В последние годы возрос интерес к механизмам, лежащим в основе врожденного иммунитета, который, как считают, запускает и поддерживает адаптивный иммунитет. Указанный интерес поддерживается в частности недавним открытием семейства высоко консервативных белков образраспознающих рецепторов, известных как То11-подобные рецепторы (ТЕК.), которые, как считают, вовлечены во врожденный иммунитет в качестве рецепторов для патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (РАМР). Композиции и способы, полезные для модулирования врожденного иммунитета, следовательно, представляют большой интерес, поскольку они могут повлиять на терапевтические подходы к состояниям, включающим аутоиммунитет, воспаление, аллергию, астму, отторжение трансплантата, реакцию "трансплантат против хозяина" (ΟνΗΌ), инфекцию, рак, и иммунодефицит и т.д.

В последнее время в ряде публикаций описан иммуностимулирующий эффект определенных типов молекул нуклеиновых кислот, включая нуклеиновые кислоты СрС, богатые СИ оцРНК и двухцепочечные РНК. Следует отметить, что сообщалось, что То11-подобный рецептор 9 (ТЬК9) распознает бактериальную ДНК и олигонуклеотиды, содержащие мотив СрС, в котором цитозин не метилирован. См., например, Нетт1 Η е! а1. (2000) Ыа1иге 408:740-5; Ваиег δ. е! а1. (2001) Ргос №0 Лсаб δει υδΑ 98:9237-42. Эффекты СрС-содержащих олигонуклеотидов на иммунную модуляцию описаны в патентах США, таких как патенты США № 6194388; 6207646; 6239116 и 6218371; и в опубликованных международных патентных заявках, таких как АО 98/37919, АО 98/40100, АО 98/52581 и АО 99/56755. Однако желательны дополнительные специфические последовательности нуклеиновых кислот, способных оказывать иммуностимулирующее действие, для обеспечения иммунной стимуляции в различных контекстах. Таким образом, существует потребность в композициях и связанных с ними способах, которые включают указанные новые иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты.

Сущность изобретения

Авторы изобретения утверждают, что проблемы и ограничения, указанные выше, могут быть преодолены путем применения изобретений, раскрытых здесь. В частности, авторы изобретения обнаружили, что возможно предоставление композиций и связанных с ними способов, которые содержат иммуностимулирующую выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность

в которой по меньшей мере один С не метилирован, и необязательно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут включать одну или более стабилизирующих модификаций, например, модификации групп 3'ОН или 5'ОН, модификации нуклеотидных оснований, модификации сахарных компонентов, и/или модификации фосфатных групп. Стабилизирующая модификация может включать использование фосфотиоатного скелета. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты не содержат стабилизирующую модификацию.

Композиции также могут включать антиген, например, В-клеточный антиген или Т-клеточный антиген. Т-клеточный антиген может включать антиген, распознаваемый хелперной Т-клеткой. Показательные В-клеточные антигены включают одно или более из перечисленного, белок, пептид, малая молекула и углевод.

Композиции также могут включать носитель (например, белковый носитель или синтетический наноноситель), связанный (например, ковалентно или нековалентно) с иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой. Синтетический наноноситель может быть дополнительно соединен (например, ковалентно или нековалентно) с антигеном. Композиции также могут включать дополнительный синтетический наноноситель, который не связан с иммуностимулирующей выделенной нуклеиновой кислотой.

Дополнительный синтетический наноноситель может быть связан, например, с антигеном (например, с антигеном, распознаваемым хелперной Т-клеткой). Раскрытие изобретения также предоставляет нуклеиновые кислоты, которые содержат последовательность δΕΟ ΙΌ ЫО: 1.

Раскрытие изобретения также предоставляет способы, которые включают введение субъекту композиции или нуклеиновой кислоты, раскрытых здесь.

Раскрытие изобретения также предоставляет способы индукции продукции 1Ь-6 у субъекта, которые включают введение субъекту композиции или нуклеиновой кислоты, раскрытой здесь, в количестве, достаточном для индукции 1Ь-6 у субъекта.

Раскрытие изобретения также предоставляет способы индукции интерферона-альфа у субъекта, которые включают введение субъекту композиции или нуклеиновой кислоты, раскрытой здесь, в количест- 1 030096

ве, достаточном для индукции интерферона-альфа у субъекта.

Раскрытие изобретения также предоставляет способы индукции ΣΡ-10 у субъекта, которые включают введение субъекту композиции или нуклеиновой кислоты, раскрытой здесь, в количестве, достаточном для индукции ΙΡ-10 у субъекта.

Раскрытие изобретения также предоставляет вакцины, которые содержат композиции и нуклеиновые кислоты, раскрытые здесь.

Раскрытие изобретения также предоставляет способы, которые включают введение субъекту композиции, раскрытой здесь, которая содержит антиген в количестве, достаточном для индукции гуморального иммунного ответа против антигена у субъекта. Раскрытие изобретения также предоставляет применение композиции, раскрытой здесь, которая включает антиген, для индукции гуморального иммунного ответа против антигена у субъекта. Раскрытие изобретения также предоставляет композиции, которые раскрыты здесь, которые содержат антиген, для применения с целью индукции гуморального иммунного ответа против антигена у субъекта.

Раскрытие изобретения также предоставляет иммуностимулирующие композиции и композиции для индукции гуморального иммунного ответа против антигена у субъекта, которые содержат композиции и нуклеиновые кислоты, раскрытые здесь.

Прежде чем настоящие изобретения будут подробно описаны, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными показательными материалами или параметрами процесса, которые, конечно, могут меняться. Также следует понимать, что терминология, применяемая в описании, используется только с целью описания конкретных вариантов осуществления изобретения, и не предназначена для ограничения применения альтернативной терминологии для описания настоящего изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в описании, как выше, так и ниже, включены посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Используемые в описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа английского языка "а", "ап" и "1Нс" включают определяемые объекты во множественном числе, если контекст не подразумевает иного. Например, ссылка на "полимер" включает смесь двух или более таких молекул или смесь отличающихся молекулярными массами полимеров одного вида, ссылка на "растворитель" включает смесь двух или более таких растворителей, ссылка на "связующее вещество" включает смеси двух или более таких веществ и т.п.

Подробности одного или более вариантов осуществления изобретения изложены в прилагаемых чертежах и в описании, приведенных ниже. Другие особенности, объекты и преимущества изобретения будут очевидны из описания и чертежей, и из формулы изобретения.

Описание чертежей

Фиг. 1А-1В представляют собой гистограммы, на которых изображены уровни цитокинов (1А, ΙΡΝα; 1В, 1Ь-6) которые измеряли с помощью ЕЫ8А с использованием мононуклеарных клеток периферической крови, стимулированных в присутствии указанных олигонуклеотидов СрО или в отсутствие (N8) олигонуклеотида.

Фиг. 1С-ГО представляют собой линейные графики, изображающие дозозависимый эффект уровней цитокинов (1С, ΙΡ-10; 1Ό, 1Ь-6), которые измеряли с помощью ЕЬ18А с использованием мононуклеарных клеток периферической крови, стимулированных в присутствии указанных концентраций олигонуклеотидов СрО.

Фиг. 2 представляет собой гистограмму, показывающую профили цитокинов мононуклеарных клеток периферической крови, стимулированных в присутствии 8с1сс1а-7 или К.848.

Фиг. 3 представляет собой гистограмму, описывающую титры антител у мышей, которым вводили наночастицы, содержащие никотин и 8с1сс1а-7 (ΝΡ-7) или смесь аналогичных наночастиц, которая не содержит адъювант (ΝΡ|ΝΙί'.’.0. 8-320|+ΝΡ|ΝΙί'.’.0.0|).

Фиг. 4 представляет собой гистограмму, описывающую титры антител у нечеловекообразных приматов в указанные даты при введении указанных доз наночастиц, содержащих никотин и 8с1сс1а-7 (ΝΡ7).

Подробное описание изобретения

Данное раскрытие изобретения предоставляет композиции и связанные с ними способы, которые включают иммуностимулирующую выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность

в которой по меньшей мере один С не метилирован, и необязательно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Установлены четко различимые функциональные классы иммуностимулирующих СрО-нуклеиновых кислот. СрО-нуклеиновые кислоты класса А (типа А) активируют естественные клетки-киллеры (ΝΚ) и стимулируют созревание дендритных клеток и вызывают продукцию ΙΡ-10 и интерферонов I типа (включая ΙΡΝα). СрО-нуклеиновые кислоты класса В (тип В) являются сильными стимуляторами созревания В-клеток и моноцитов человека, стимулируя продукцию ГЪ-б (но не интерферонов Ι типа).

- 2 030096

Указанные функциональные различия отражаются в определенных функциональных особенностях: полинуклеотиды класса А характеризуются последовательностью ро1у С на любом из двух или на обоих 5' и 3' концах с внутренней палиндромной последовательностью, содержащей динуклеотиды СС, тогда как полинуклеотиды класса В содержат один или более гексамерных мотивов: 5'-Ри Ру С С Ру Ри-3'.

Недавно были описаны СрС-нуклеиновые кислоты класса С (типа С), которые объединяют в себе свойства класса А и класса В. Полинуклеотиды класса С, таким образом, активируют ΝΚ-клетки и стимулируют продукцию 1Ь-6, ΙΡΝα и ΙΡ-10, а также созревание дендритных клеток, В-клеток и моноцитов.

Указанная широкая иммуностимуляция врожденного и адаптивного компонентов иммунной системы имеет исключительное клиническое значение, и в настоящее время существует потребность в новых иммуностимулирующих полинуклеотидах типа С.

В связи с этим сформулированы определенные правила (и установлены специфические структурные мотивы) для полинуклеотидов класса С. Например, в международном патенте АО 03/015711 указана комбинация стимулирующего мотива (такого как мотив СрС или последовательность ТССТСС) либо с СС-богатым (по меньшей мере две трети С и С) палиндромом, либо с нейтрализующим мотивом, и описан олигодеокинуклеотид длиной 22 мер (ΟΌΝ) 2395 (рассматриваемый в настоящее время как прототипный ΟΌΝ типа С). ΟΌΝ 2395 обладает следующей последовательностью с фосфотиоатными связями:

5’-ТССТССТТТТСССССССССССС-3’ [5Е0 Ю N0:8].

В недавно предпринятых попытках расширить ряд олигонуклеотидов типа С применяли различные правила и структурные модели. Например, международный патент АО 05/042018 описывает структурно отличающиеся СрС-олигонуклеотиды класса С с неполным палиндромом на 3' конце или рядом с ним, которые предусмотрены для образования дуплекса или структур более высокого порядка ίη νίνο.

Однако структурно-функциональные взаимосвязи, определяющие активность олигонуклеотидов типа С, остаются неясными, и сохраняется потребность в проведении экспериментального тестирования большого числа вариантов последовательностей.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что нуклеиновые кислоты, которые не соответствуют приведенным выше правилам и которые содержат последовательность

проявляют сильную иммуностимулирующую активность типа С.

Примеры иллюстрируют биологическую активность воплощений настоящего изобретения, и также некоторых других последовательностей нуклеиновых кислот и композиций, применяемых в настоящих изобретениях, описанных здесь. Пример 1, в частности, подтверждает классификацию нуклеиновых кислот, которые содержат ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 1, в качестве иммуностимулирующих нуклеиновых кислот типа С.

По первому аспекту настоящего изобретения предоставляются иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты типа С, содержащие последовательность

в которой по меньшей мере один С (например, один, два, три, четыре, пять, шесть или все семь С) не метилирован.

Нуклеиновые кислоты могут быть выделены.

Альтернативно или дополнительно нуклеиновые кислоты могут соответствовать условиям параметров длины, установленным в описании. Таким образом, нуклеиновые кислоты могут характеризоваться длиной в диапазоне от 24 до 100 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения длина находится в диапазоне 24-30, 24-40, 24-50, 24-60, 24-70, 24-80 или 24-90 нуклеотидов.

Нуклеиновые кислоты согласно вышеприведенному определению могут состоять или по существу состоять из последовательности

5’-ТССТССААССТТССССААССТТСС-3’ [ЗЕО Ю N0:1].

Нуклеиновые кислоты, как определено в любом из предыдущих параграфов, также могут содержать удлиняющий сегмент на 5'-конце. В таких вариантах осуществления нуклеиновые кислоты могут сохранять гексамер ТССТСС в качестве 5'-конца.

Нуклеиновые кислоты, как определено в любом из предыдущих параграфов, также могут содержать удлиняющий сегмент на 3'-конце.

Таким образом, нуклеиновые кислоты, как определено в любом из предыдущих параграфов, также могут содержать как 5'-, так и 3'-сегменты, удлиняющие последовательность.

По второму аспекту настоящего изобретения предоставляются композиции, содержащие нуклеиновые кислоты по первому аспекту изобретения, как определено в любом из предыдущих параграфов.

Композиции по второму аспекту могут представлять собой фармацевтические композиции, которые также включают одно или более фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества.

Композиции по второму аспекту также могут содержать один или более антигенов, например, антигены, указанные в данном документе.

Композиции по второму аспекту также могут содержать один или более носителей (например, указанных в данном документе), связанных с иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой.

- 3 030096

По третьему аспекту настоящего изобретения предоставляются вакцины, содержащие нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем документе. Вакцины также могут содержать один или более антигенов.

По четвертому аспекту настоящих изобретений предоставляются нуклеиновые кислоты, указанные в данном документе, и в любом из предыдущих параграфов, для применения в лечении и профилактике. По четвертому аспекту изобретений нуклеиновые кислоты, указанные в данном документе, и в любом из предыдущих параграфов используют для: (а) вакцинации (например, для профилактической или терапевтической вакцинации); (Ь) индукции продукции 1Ь-б у субъекта; (с) индукции продукции интерферона типа I (например, ΙΡΝα) у субъекта; (б) индукции продукции интерферона типа II (например, ΙΡΝγ) у субъекта; (е) индукции продукции ΙΡ-10 у субъекта; (ί) активации эндогенных ΝΚ-клеток у субъекта; (д) стимуляции эндогенных дендритных клеток у субъекта; (Ь) стимуляции эндогенных В-клеток у субъекта; (ί) стимуляции эндогенных моноцитов у субъекта; (]) лечения или профилактики инфекции, например, бактериальной, вирусной, грибковой или инфекции, вызванной многоклеточными организмами; (к) лечения или профилактики аллергического состояния (например, астмы); (1) лечения или профилактики рака; (т) индукции, усиления, модуляции, направления, или перенаправления иммунного ответа; (п) лечения или профилактики метаболических заболеваний; (о) лечения или профилактики дегенеративных заболеваний; (р) лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний; (с|) лечения или профилактики воспалительных заболеваний; (г) лечения или профилактики иммунологических заболеваний, нарушений и/или состояний; (8) лечения или профилактики зависимости (например, зависимости от никотина или наркотика); или (I) лечения или профилактики состояния, возникающего в результате воздействия токсина, вредного вещества, токсина окружающей среды, или другого токсичного вещества.

Другие профилактические и терапевтические применения нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе, приведены в деталях ниже.

В каждом из указанных выше аспектов, согласно предыдущим абзацам, нуклеиновые кислоты могут содержать модификации, например, стабилизирующие модификации. Такие стабилизирующие модификации могут включать модификации групп 3'ОН или 5'ОН, модификации нуклеотидных оснований, модификации сахарных компонентов, или модификации фосфатных групп. В некоторых вариантах осуществления изобретения стабилизирующая модификация включает фосфоротиоатный скелет.

Другие аспекты изобретений определены в прилагаемой формуле изобретения.

Далее изобретения будут описаны более подробно.

Определения

"Адъювант" обозначает агент, который не образует специфический антиген, но повышает силу и продолжительность иммунного ответа на вводимый совместно с ним антиген. Такие адъюванты могут включать, но без ограничения стимуляторы образ-распознающих рецепторов, таких как То11-подобные рецепторы, КЮ-1 и ΝΘΌ-подобные рецепторы (ΝΕΚ), минеральные соли, такие как квасцы, квасцы в сочетании с монофосфорил-липидом (МРЬ) А энтеробактерий, таких как Е8сНепс1йа сой, 8а1топе11а тшпе8о1а, 8а1топе11а 1ур1йтипит. или §Ыде11а Лехпеп или в особенности с МРЬ® (А804), МРЬ А упомянутых выше бактерий по отдельности, сапонины, такие как Οδ-21, Цш1-А, 18СОМ8, 18СОМАТК1Х™, эмульсии, такие как МР59™, Моп1ашбе®18А 51 и ΙδΑ 720, Αδ02 (Р821+сквален+МРЬ®), липосомы и препараты липосом, такие как Αδ01, синтезированные или специально приготовленные микрочастицы и микроносители, такие как везикулы из внешней мембраны бактерий (ОМУ) Ν. допоггЬеае, СЬ1атуб1а 1гасЬотаЙ8, и других, или частицы хитозана, депо-агенты, такие как блок-сополимеры Р1игошс®, специфически модифицированные или изготовленные пептиды, такие как мурамил-дипептид, аминоалкилглюкозаминид 4-фосфаты, такие как КС529, или белки, такие как бактериальные токсоиды или фрагменты токсинов.

В вариантах осуществления адъюванты включают агонисты образ-распознающих рецепторов (РКК), включая, но без ограничения То11-подобные рецепторы (ТЬК), в особенности ТЬК 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 и/или их комбинации. В других вариантах осуществления адъюванты включают агонисты То11-подобных рецепторов 3, агонисты То11-подобных рецепторов 7 и 8, или агонисты То11-подобного рецептора 9; предпочтительно указанные адъюванты включают имидазохинолины, такие как К8 48; производные аденина, такие как соединения, раскрытые в патенте США 6329381 (8итйото Рйагтасеибса1 Сотрапу); иммуностимулирующую ДНК; или иммуностимулирующую РНК. В конкретных вариантах осуществления композиции изобретения содержат в качестве адъювантов соединения, которые являются агонистами 1о11-подобных рецепторов (ТЬК) 7 и 8 ("ТЬК 7/8 адош818"). Полезны соединения агонистов ТЬК 7/8, раскрытые в патенте США 6696076, Тота1 е! а1., включая, но без ограничения, имидазохинолинамины, имидазопиридинамины, циклоалкилимидазопиридинамины, конденсированные в положениях 6 и 7, имидазохинолинамины с мостиковой связью между положениями 1 и 2.

Полезные адъюванты включают имиквимод и резиквимод (также известный как К848). В конкретных вариантах осуществления адъювант может представлять собой агонист поверхностной молекулы СИ40. В вариантах осуществления, чтобы стимулировать иммунитет, а не толерантность, композиция изобретения содержит адъювант, который вызывает созревание ИС (необходимых для примирования "необученных" Т-клеток) и продукцию цитокинов, таких как интерфероны I типа, которые способствуют

- 4 030096

гуморальным иммунным ответам. В вариантах осуществления адъюванты также могут включать иммуностимулирующие молекулы РНК, такие как, но без ограничения дсРНК или ро1у РС (стимулятор ТЬК3), и/или соединения, раскрытые в публикациях Р. Ней е! а1., "8рес1е8-8ресШс Кесодшбоп оГ 8шд1е8!гапбеб ΡΝΆ у1а То11-1тке Кесер!ог 7 апб 8" §шепсе 303(5663), 1526-1529 (2004); 1. Уо11тег е! а1., "1ттипе тоби1а!юп Ьу сЬетюа11у тобШеб пЪопис1ео81бе8 апб оПдопЪопис1еоОбе8" международный патент \УО 2008033432 А2; А. РогкЬасЬ е! а1., "1ттипо8бти1а!огу о11дог1Ьопис1еоббе8 сопййшпд вресШс хесщепсе то!тГ(8) апб !агдейпд (Не То11-Ьке гесерЮг 8 рабшау" международный патент \УО 2007062107 А2; Е. ИЫтапп е! а1., "МобШеб оНдопЪопис1еоббе апа1од8 \νί6ι епНапсеб 1ттипо8бти1а!огу асбуйу" опубликованная патентная заявка США И8 2006/0241076; С. ЫрГогб е( а1., "1ттипо8бти1а!огу У1га1 ΡΝΑ оНдопис1еоббе8 апб ихе Гог 1гсабпд сапсег апб тГесбощ" международный патент \УО 2005097993 А2; С. ЫрГогб е( а1., "1ттипо8йти1аЮгу С.и-соШаийпд оПдопЪопис1еойбе8. сотро8йюп8. апб 8сгеетпд тебюб8" международный патент \УО 2003086280 А2. В некоторых вариантах осуществления изобретения адъювант может представлять собой агонист ТЬК-4, например, бактериальный липополисахарид (ЬР§), У8У-С, и/или НМСВ1. В некоторых вариантах осуществления изобретения адъюванты могут включать агонисты ТЬК-5, например, флагеллин, или его части или, включая, но без ограничения соединения, раскрытые в патентах США 6130082, 6585980 и 7192725.

В конкретных вариантах осуществления композиции изобретения включают лиганд То11-подобного рецептора (ТЬК)-9, например, иммуностимулирующие молекулы ДНК, содержащие СрС, которые индуцируют секрецию интерферона I типа, и стимулируют Т- и В-клеточную активацию, приводящую к повышенной продукции антител и цитотоксическим Т-клеточным ответам (Кпед е( а1., СрС тобГ8 ш Ъас(епа1 ОЫА 1г1ддег б1гес1 В се11 асйуайоп. №Ииге. 1995. 374:546-549; СЬи е! а1. СрС оЬдобеохупис1еойбе8 ас! а8 абщуапй !На! 8\уПсЬ оп Т Ье1рег 1 (ТЫ) штипИу. 1. Ехр. Меб. 1997. 186: 1623-1631; ЫрГогб е! а1. СрСсоптййпд 8уп!Ьейс оНдопис1еоббе8 ргото(е В апб су!о!охю Т се11 ге8роп8е8 (о рго!ет апИдеп: а пей с1а88 оГ уассте абщуапК Еиг. 1. 1ттипо1. 1997. 27:2340-2344; Котап е! а1. "1ттипо8бти1а!огу ОЫА 8е₄непсе8 Гипсйоп а8 Т Ье1рег-1-рготобпд абщуапК" №й. Меб. 1997. 3:849-854; Эау18 е! а1. СрС ОЫА 18 а ро!еп! епЬапсег оГ 8ресШс пптипйу ш тюе йптиш/еб \νί6ι гесотЫпап! ЬерайЙ8 В 8шГасе апбдеп. 1. 1ттипо1. 1998. 160:870-876; ЫрГогб е! а1., "Вас!еба1 ПЫА а8 штипе се11 асбуаЮг," Тгепб8 М1сгоЪю1. 1998. 6:496-500; патент США № 6207646 Кпед е! а1.; патент США № 7223398 Тиск е! а1.; патент США № 7250403 Уаи №8! е! а1.; или патент США № 7566703 от Кпед е! а1. В предпочтительных вариантах осуществления, в которых адъювант включает лиганд То11-подобного рецептора (ТЬРу)-9, такой как иммуностимулирующие молекулы ДНК, содержащие СрС8, иммуностимулирующие молекулы ДНК не включают в себя нуклеиновые кислоты, которые содержат 8ЕС ГО ΝΌ: 1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения адъюванты могут представлять собой провоспалительные вещества, высвобождаемые из некротических клеток (например, кристаллы уратов). В некоторых вариантах осуществления изобретения адъюванты могут представлять собой активированные компоненты каскада реакций комплемента (например, СЭ21, СГО35 и т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения адъюванты могут представлять собой активированные компоненты иммунных комплексов. Адъюванты также включают агонисты рецептора комплемента, например, молекулы, которые связываются с СГО21 или СГО35. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист рецептора комплемента индуцирует опсонизацию эндогенным комплементом синтетического наноносителя. В некоторых вариантах осуществления изобретения адъюванты представляют собой цитокины, которые являются малыми молекулами, или биологическими факторами (в диапазоне 5-20 кДа), которые высвобождаются клетками и оказывают специфические эффекты на межклеточное взаимодействие, передачу информации и функциональные возможности других клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист цитокинового рецептора представляет собой малую молекулу, антитело, гибридный белок или аптамер.

В различных вариантах осуществления по меньшей мере часть дозы адъюванта может быть связана с синтетическими наноносителями, например, вся доза адъюванта может быть связана с синтетическими наноносителями. В других вариантах осуществления по меньшей мере часть дозы адъюванта не связана с синтетическими наноносителями. В определенных вариантах осуществления доза адъюванта включает два или более типов адъювантов. Например, и без ограничения, адъюванты которые воздействуют на различные ТЬК-рецепторы, могут сочетаться. В качестве примера, в варианте осуществления агонист ТЬК 7/8 можно объединить с агонистом ТЬК 9. В другом варианте осуществления агонист ТЬК 7/8 можно объединить с агонистом ТЬК 4. В еще одном варианте осуществления агонист ТЬК 9 можно объединить с агонистом ТЬК 3.

"Применение" или "введение" означает предоставление лекарства субъекту способом, который является фармакологически подходящим.

"Антиген" означает В-клеточный антиген или Т-клеточный антиген. В определенных вариантах осуществления антигены связаны с синтетическими наноносителями. В других вариантах осуществления антигены не связаны с синтетическими наноносителями. В вариантах осуществления антигены вводят совместно с синтетическими наноносителями. В других вариантах осуществления антигены не вводят совместно с синтетическими наноносителями. "Тип(ы) антигенов" обозначает молекулы, которые имеют

- 5 030096

одинаковые или по существу одинаковые антигенные характеристики.

"В-клеточный антиген" обозначает любой антиген, который вызывает или распознается В-клеткой и вызывает иммунный ответ в В-клетке (например, антиген, который специфически распознается Вклеточным рецептором на В-клетке). В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген, который представляет собой Т-клеточный антиген, также является В-клеточным антигеном. В других вариантах осуществления Т-клеточный антиген не является также В-клеточным антигеном. В-клеточные антигены включают, но без ограничения белки, пептиды, малые молекулы (обозначающие молекулы со средним молекулярным весом меньше 10000) и углеводы. В некоторых вариантах осуществления изобретения В-клеточный антиген является небелковым антигеном (т.е. небелковый или непептидный антиген). В некоторых вариантах осуществления изобретения В-клеточный антиген представляет собой углевод, связанный с инфекционным агентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения В-клеточный антиген представляет собой гликопротеин или гликопептид, связанный с инфекционным агентом. Инфекционный агент может представлять собой бактерию, вирус, грибок, представителя простейших или паразита. В некоторых вариантах осуществления изобретения В-клеточный антиген является слабо иммуногенным антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения В-клеточный антиген является наркотическим веществом или его частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения Вклеточный антиген является веществом, вызывающим зависимость, или его частью. Вещества, вызывающие зависимость, включают, но без ограничения, никотин, наркотик, средство от кашля, транквилизатор и успокаивающее средство. В некоторых вариантах осуществления изобретения В-клеточный антиген представляет собой токсин, например, токсин химического оружия или токсин из естественных источников. В-клеточный антиген также может представлять собой опасный агент окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления изобретения В-клеточный антиген представляет собой аутоантиген. В других вариантах осуществления В-клеточный антиген включает аллоантиген, аллерген, контактный аллерген, антиген дегенеративного заболевания, гаптен, антиген инфекционного заболевания, раковый антиген, антиген атопического заболевания, антиген аутоиммунного заболевания, вещество, вызывающее привыкание, ксеноантиген, или фермент метаболического заболевания или его ферментативный продукт.

"Носитель" обозначает вещество, которое можно вводить совместно с иммуностимулирующей выделенной нуклеиновой кислотой изобретения, и которое может изменять ίη νίνο характеристики иммуностимулирующей выделенной нуклеиновой кислоты изобретения, например, фармакокинетику, устойчивость и транспорт. Носители отличаются от фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ тем, что фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества включают фармакологически неактивные материалы, тогда как носители включают материалы, которые могут изменять ίη νίνο характеристики иммуностимулирующей выделенной нуклеиновой кислоты изобретения. В различных вариантах осуществления носители могут охватывать наноносители, включая РЬС, РЬСА, или диоксид кремния; перфторуглерод(ы); липиды; желатин; хитозан или циклодекстрин. В других вариантах осуществления носители также могут включать белки, такие как альбумин, коллаген или дифтерийный белок СРМ 197.

"Вводимый совместно" означает введение двух или более веществ субъекту связанным по времени способом. В вариантах осуществления совместное введение может осуществляться с помощью введения двух или более веществ в одной и той же лекарственной форме. В других вариантах осуществления совместное введение может включать введение двух или более веществ в различных лекарственных формах, но в течение определенного периода времени, например, в течение 1 месяца, в течение 1 недели, в течение 1 дня, или в течение 1 ч.

"Связь" или "связанный" или "пары" и т.п. обозначает одну структурную единицу (например, функциональную группу) химически соединенную с другой структурной единицей. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывание является ковалентным, что означает, что связывание происходит в контексте наличия ковалентной связи между двумя структурными единицами. В вариантах осуществления с нековалентными взаимодействиями нековалентное связывание опосредуется нековалентными взаимодействиями, включая, но без ограничения взаимодействия между зарядами, аффинные взаимодействия, металлокоординационные взаимодействия, физическую адсорбцию, взаимодействия матрицапримесь, гидрофобные взаимодействия, ТТ стэкинг-взаимодействия, водород-связывающие взаимодействия, ван-дер-ваальсовские взаимодействия, магнитные взаимодействия, электростатические взаимодействия, диполь-дипольные взаимодействия, и/или их комбинации. В вариантах осуществления инкапсулирование является формой связывания.

"Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота типа С" представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере один неметилированный СрС и которая может стимулировать продукцию в числе других 1Ь-6, ΙΡ-10, и ΙΡΝα ίη νίνο, и может стимулировать плазмацитоидные дендритные клетки.

"Инкапсулировать" означает заключать в синтетический носитель синтетический наноноситель, предпочтительно полностью заключать в синтетический наноноситель. Почти все или полностью все вещество, которое инкапсулируют, не подвергается воздействию местной среды, в которой находится синтетический наноноситель.

Инкапсулирование отличается от абсорбции, при которой почти все или полностью все вещество

- 6 030096

размещается на поверхности синтетического наноносителя, и при этом вещество подвергается воздействию местной среды, окружающей синтетический наноноситель.

"Иммуностимулирующий" означает, что вещество оказывает стимулирующий эффект на иммунную систему. Указанные вещества можно легко идентифицировать с помощью стандартных тестов, в которых выявляют различные аспекты иммунного ответа, например, секреция цитокинов, образование антител, активация ΝΚ-клеток и Т-клеточная пролиферация. См., например, международные патенты АО 97/28259; АО 98/16247; АО 99/11275; публикации Кпед е! а1. (1995) Уинге 374:546-549; УататоЮ е! а1. (1992) 1. 1ттипо1. 148:4072-76; Ва11ак е! а1. (1996) 1. 1ттипо1. 157: 1840-45; Кйитаи е! а1. (1997) 1. 1ттипо1. 158:3635-39; 8а!о е! а1. (1996) 8с1епсе 273:352-354; Р1ке!кку (1996) 1. 1ттипо1. 156:421-423; 8Ытаба е! а1. (1986) 1рп. 1. Сапсег Кек. 77:808-816; Со^бегу е! а1. (1996) 1. 1ттипо1. 156:4570-75; Котап е! а1. (1997) Νη!. Меб. 3:849-854; ЫрГогб е! а1. (1997а) Еиг. 1. 1ттипо1. 27:2340-44; международный патент АО 98/55495 и международный патент АО 00/61151. Таким образом, указанные и другие методы можно использовать для установления, проверки и/или подтверждения иммуностимулирующих свойств веществ, таких как иммуностимулирующие нуклеотиды, предпочтительно иммуностимулирующие выделенные нуклеиновые кислоты.

"Выделенная нуклеиновая кислота" означает нуклеиновую кислоту, которую синтезируют или выделяют из ее естественного окружения и представляют в достаточном количестве, чтобы обеспечивать ее идентификацию или использование. Выделенная нуклеиновая кислота может быть нуклеиновой кислотой, которую (ί) амплифицируют ш уйго, например, с помощью полимеразной цепной реакции (РСК); (ίί) производят рекомбинантным путем с помощью клонирования; (ίίί) очищают, также как при расщеплении и разделении в геле; или (ΐν) синтезируют, например, путем химического синтеза. Выделенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, с которой легко проводить манипуляции в соответствии с технологиями рекомбинантных ДНК, хорошо известными в данной области техники. Таким образом, нуклеотидная последовательность, содержащаяся в векторе, в которой известны 5'- и 3'-сайты рестрикции или для которой раскрыты последовательности праймеров полимеразной цепной реакции (РСК) считается выделенной, но последовательность нуклеиновой кислоты, находящаяся в своем нативном состоянии в естественном хозяине не считается выделенной. Выделенные нуклеиновые кислоты могут быть выделены с применением общепринятых методик выделения полинуклеотидов.

Такие процедуры включают, но без ограничения гибридизацию зондов с геномными библиотеками или библиотеками кДНК для обнаружения общих нуклеотидных последовательностей, серологический анализ экспрессионных библиотек с целью обнаружения общих структурных особенностей и синтез отдельных нативных последовательностей с помощью полимеразной цепной реакции. Выделенная нуклеиновая кислота может быть, но не обязательно должна быть в основном очищенной. Например, нуклеиновая кислота, которую выделяют в векторе клонирования или экспрессии, не является чистой в том смысле, что она может содержать незначительный процент материала клетки, в которой она находится. Однако такая нуклеиновая кислота является выделенной согласно используемому здесь термину, поскольку ее легко использовать в соответствии со стандартными методиками, известными специалистам в данной области. Любая из предоставляемых здесь нуклеиновых кислот может быть выделена. В контексте настоящего изобретения термин "нуклеиновая кислота" используют взаимозаменяемо с термином "полинуклеиновая кислота", который охватывает соединения, содержащие многочисленные остатки нуклеиновых кислот.

"Максимальный размер синтетического наноносителя" означает наибольшее значение измерения наноносителя, произведенного вдоль любой оси синтетического наноносителя. "Минимальный размер синтетического наноносителя" означает наименьшее значение измерения наноносителя синтетического наноносителя, произведенного вдоль любой оси синтетического наноносителя. Например, в случае сфероидального синтетического наноносителя, максимальный и минимальный размер синтетического наноносителя будет по существу одинаковым, и будет равен размеру его диаметра.

Аналогично, в случае синтетического наноносителя кубической формы, минимальный размер синтетического наноносителя будет равен наименьшему значению, выбранному из его высоты, ширины или длины, тогда как максимальный размер синтетического наноносителя будет равен наибольшему значению, выбранному из его высоты, ширины или длины. В варианте осуществления минимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% синтетических нано носителей в образце, на основе общего числа синтетических наноносителей в образце, составляет больше 100 нм. В варианте осуществления максимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90%, синтетических наноносителей в образце, на основе общего числа синтетических наноносителей в образце, равен или меньше 5 мкм. Предпочтительно минимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90%, синтетических наноносителей в образце, на основе общего числа синтетических наноносителей в образце, составляет больше чем 110 нм, более предпочтительно больше чем 120 нм, более предпочтительно больше чем 130 нм и более предпочтительно больше чем 150 нм. Показатели характеристических отношений максимальных размеров и минимальных размеров синтетических наноносителей изобретения могут изменяться в зависимости от варианта осуществления. Например, показатели характеристических отношений максимальных размеров к мини- 7 030096

мальным размерам синтетических наноносителей могут изменяться от 1:1 до 1000000:1, предпочтительно от 1:1 до 100000:1, более предпочтительно от 1:1 до 1000:1, еще более предпочтительно от 1:1 до 100:1, и еще более предпочтительно от 1:1 до 10:1. Предпочтительно, максимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90%, синтетических наноносителей в образце, на основе общего числа синтетических наноносителей в образце равен или меньше 3 мкм, более предпочтительно равен или меньше 2 мкм, более предпочтительно равен или меньше 1 мкм, более предпочтительно равен или меньше 800 нм, более предпочтительно равен или меньше 600 нм и еще более предпочтительно равен или меньше 500 нм. В предпочтительных вариантах осуществления максимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90%, синтетических наноносителей в образце, на основе общего числа синтетических наноносителей в образце, равен или больше 100 нм, более предпочтительно равен или больше 120, более предпочтительно больше 130 нм, более предпочтительно больше 140 нм и еще более предпочтительно больше 150 нм. Измерение размеров синтетических наноносителей производят путем суспендирования синтетических наноносителей в жидкой (обычно водной) среде и с использованием метода динамического рассеяния света (например, с помощью устройства ВгоокНа\'еп 2еГаРЛЬ§).

"Нуклеиновая кислота" в контексте иммуностимулирующих нуклеиновых кислот изобретения означает цепь связанных нуклеотидов или модифицированных нуклеотидов. Сахарные части могут представлять собой рибозу, дезоксирибозу или любой из различных модифицированных сахаров, описанных здесь (включая их комбинации). Группировки оснований могут представлять собой любые пуриновые или пиримидиновые основания, включая С, А, Т, С, и и любые модифицированные основания, описанные здесь (включая их комбинации). Нуклеиновые кислоты могут быть связаны встречающимися в природе фосфодиэфирными связями, или любыми другими связями, описанными здесь (включая, например, фосфоротиоатные связи, демонстрируя при этом модифицированный скелет), включая их комбинации. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может иметь любую топологию/конформацию (включая "разветвленную" конформацию, кольцевую конформацию и конформацию "шпильки"). Модификации нуклеиновых кислот изобретения, содержащие указанные модифицированные сахара, основания и/или скелет, являются предпочтительно стабилизирующими модификациями, описанными в настоящем документе.

"Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество" означает фармакологически неактивное вещество, применяемое для создания композиции изобретения. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества включают ряд веществ, известных в данной области, включая, но без ограничения разбавители, окрашивающие вещества, физиологический раствор, неорганические или органические буферы (например, калиевые или натриевые соли фосфата, карбоната, ацетата или цитрата; включая забуференный фосфатом физиологический раствор), регуляторы рН (например, соляная кислота, гидроксид калия или натрия, соли цитрата или ацетата, аминокислоты и их соли), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол), сурфактанты (например, полисорбат 20, полисорбат 80, полиоксиэтилен(9-10)нонилфенол, дезоксихолат натрия), стабилизаторы раствора и/или криостабилизаторы/стабилизаторы для лиофилизированных препаратов (например, сахароза, лактоза, маннитол, трегалоза), агенты, регулирующие осмотичность, (например, соли или сахара), антибактериальные агенты (например, бензойная кислота, фенол, гентамицин), противопенные добавки (например, полидиметилсилоксан), консерванты (например, тимеросал, 2-феноксиэтанол, ΕΌΤΆ), стабилизаторы полимеров и агенты, регулирующие вязкость (например, поливинилпирролидон, полоксамер 488, карбоксиметилцеллюлоза) и вспомогательные растворители (например, глицерин, полиэтиленгликоль, этанол).

"Субъект" обозначает человека или животных, включая теплокровных млекопитающих таких как, например, приматы; птицы; домашние или сельскохозяйственные животные, такие как кошки, собаки, овцы, козы, крупный рогатый скот, лошади и свиньи; лабораторные животные, такие как мыши, крысы и морские свинки; рыбы; рептилии; дикие животные и животные, содержащиеся в зоопарке; и т.п.

"Синтетический наноноситель (наноносители)" означает дискретный объект, который не обнаруживается в природе, и который обладает по меньшей мере одним измерением, которое по величине меньше или равно 5 микрон.

Наночастицы на основе альбумина обычно включают в качестве синтетических наноносителей, однако в определенных вариантах осуществления синтетические наноносители не включают в себя наночастицы на основе альбумина. В вариантах осуществления синтетические наноносители изобретения не включают хитозан.

Синтетический наноноситель может представлять собой, но без ограничения одно или несколько из перечисленного: наночастицы на основе липидов, полимерные наночастицы, металлические наночастицы, эмульсии на основе сурфактантов, дендримеры, бакиболы, нанонити, вирусоподобные частицы, частицы на основе пептидов или белков (такие как альбуминовые наночастицы) и/или наночастицы которые создают с использованием комбинации наноматериалов, например, липид-полимерные наночастицы. Синтетические наноносители могут обладать различными формами, включая, но без ограничения сфероидальные, кубические, пирамидальные, овальные, цилиндрические, тороидальные наноносители и т.п. Синтетические наноносители согласно изобретению включают в себя одну или более поверхностей. По- 8 030096

казательные синтетические наноносители, которые могут быть применены при использовании на практике настоящего изобретения, включают: (1) биодеградируемые наночастицы, раскрытые в патенте США 5543158 Сте£ ек а1., (2) полимерные наночастицы опубликованной патентной заявки США 2006/0002852 δαίίζιηαη ек а1., (3) литографически сконструированные наночастицы опубликованной патентной заявки США 2009/0028910 ЭеЕитопе ек а1., (4) раскрытие международного патента АО 2009/051837 νοη Апбпап ек а1., или (5) наночастицы, раскрытые в опубликованной патентной заявке США 2008/0145441 Репабек ек а1. В вариантах осуществления синтетические наноносители могут иметь характеристическое отношение больше чем 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или больше чем 1:10.

Синтетические наноносители согласно изобретению, минимальный размер которых составляет 100 нм или меньше, предпочтительно составляет приблизительно 100 нм или меньше, не содержат поверхности с гидроксильными группами, которая активирует комплемент, или альтернативно включают в себя поверхность, которая в основном состоит из компонентов, которые не являются гидроксильными группами, которые активируют комплемент. В определенных вариантах осуществления синтетические наноносители, описанные здесь, которые имеют минимальный размер приблизительно 100 нм или меньше, например, приблизительно 100 нм или меньше, не включают в себя поверхность, которая по существу активирует комплемент или, альтернативно, включают в себя поверхность, которая в основном состоит из компонентов, которые по существу не активируют комплемент. В более предпочтительном варианте осуществления синтетические наноносители согласно изобретению, минимальный размер которых составляет приблизительно 100 нм или меньше, предпочтительно составляет приблизительно 100 нм или меньше, не включают в себя поверхность, которая активирует комплемент, или альтернативно включают в себя поверхность, которая в основном состоит из компонентов, которые не активируют комплемент. В вариантах осуществления синтетические наноносители исключают вирусоподобные частицы (УЪР). В вариантах осуществления, если синтетические наноносители включают в себя вирусоподобные частицы, вирусоподобные частицы содержат искусственный адъювант (то есть УЪР имеют в своем составе адъювант, отличающийся от естественной РНК, образующейся при производстве УЪР). В вариантах осуществления синтетические наноносители могут иметь характеристическое отношение больше чем 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или больше чем 1:10.

"Т-клеточный антиген" означает любой антиген, который распознается Т-клеткой и запускает иммунный ответ в Т-клетке (например, антиген, который специфически распознается Т-клеточным рецептором на Т-клетке или на ΝΚΤ-клетке с помощью представления антигена или его части, связанными с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС), класса I или класса II или связанными с комплексом СЭ1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген, который является Тклеточным антигеном, также является В-клеточным антигеном. В других вариантах осуществления Тклеточный антиген не является также В-клеточным антигеном. Т-клеточные антигены обычно представляют собой белки или пептиды. Т-клеточные антигены могут представлять собой антиген, который стимулирует СЭ8+Т-клеточный ответ, СЭ4+Т-клеточный ответ, или оба ответа. Таким образом, наночастицы в некоторых вариантах осуществления изобретения могут эффективно стимулировать оба типа ответов. В вариантах осуществления Т-клеточные антигены могут включать одно или более из следующего: столбняк: ТТ830-843, ТТ947-967; дифтерия ΌΤ331-350, аденовирус Н910-924; СМУ рр65, корь Р288-302, Р421-435, Р256-270, №335-345; НСУ А1248-1261, С1781-1800, Ό2571-2590; грипп НА91-108, НА307319, НА354-372.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Т-клеточный антиген представляет собой антиген Т-клеток хелперов (т.е. антиген, который может вызывать повышенный ответ на несвязанный Вклеточный антиген путем стимуляции хелперных Т-клеток). В вариантах осуществления антиген хелперных Т-клеток может включать один или более пептидов, полученных или выделенных из столбнячного анатоксина, вируса Эпштейна-Барра, вируса гриппа, респираторно-синцитиального вируса, вируса кори, вируса эпидемического паротита, вируса краснухи, цитомегаловируса, аденовируса, дифтерийного анатоксина, или пептида РАЭРЕ (известного из работы §екке ек а1., патент США № 7202351). В других вариантах осуществления антиген хелперных Т-клеток может включать один или более липидов или гликолипидов, включая, но без ограничения: α-галактозилцерамид (а-Са1Сет), α-связанные гликосфинголипиды (из БрЫпдотопак крр.), галактозилдиацилглицерины (из ВоггеПа ЬигдбогГеп). липофосфогликан (из ЬеккЬташа бопоуаш) и фосфатидилинозитол тетраманнозид (Р1М4) (из МусоЪаскетшт 1ергае). В отношении дополнительных липидов и/или гликолипидов, применяемых в качестве антигена Т-клеток хелперов, см. У. Сегипбо1о ек а1., "Натпеккшд туапаШ ΝΚΤ се11к ίη νасс^ηак^οη ккгакеДек." №ките Ρν 1ттип, 9:28-38 (2009). В вариантах осуществления СЭ4+ Т-клеточные антигены могут быть производными СЭ4+ Т-клеточного антигена, который получают из источника, такого как природный источник. В таких вариантах осуществления последовательности СЭ4+ Т-клеточного антигена, такие как пептиды, которые связываются с МНС II, могут обладать по меньшей мере 70%, 80%, 90%, или 95% идентичности с антигеном, полученным из источника. В вариантах осуществления Т-клеточный антиген, предпочтительно антиген хелперных Т-клеток, может быть связан или не связан с синтетическим наноносителем.

"Вакцина" означает композицию вещества, которая улучшает иммунный ответ к отдельному патогену или заболеванию. Вакцина обычно содержит факторы, которые стимулируют иммунную систему

- 9 030096

субъекта для распознавания специфического антигена как чужеродного и удаления его из организма субъекта. Вакцина также создает иммунологическую память, так что антиген будет быстро распознаваться и вызывать ответ в случае повторной сенсибилизации субъекта. Вакцины могут быть профилактическими (например, для предотвращения будущей инфекции, вызванной каким-либо патогеном), или терапевтическими (например, вакцина против опухоль-специфического антигена для лечения рака). В вариантах осуществления вакцина может включать лекарственные формы согласно изобретению.

Нуклеиновые кислоты

В вариантах осуществления изобретение охватывает композиции, включающие иммуностимулирующую выделенную нуклеиновую кислоту, содержащую

5’-ТССТССААССТТССССААССТТСС-3’ [5Е0 Ю N0:1].

В вариантах осуществления композиции изобретения содержат от 0,001 микрограмм до 100000 микрограмм указанных олигонуклеотидов; от 0,01 микрограмм до 10000 микрограмм указанных олигонуклеотидов; от 0,1 микрограмм до 1000 микрограмм указанных олигонуклеотидов; от 1 микрограмма до 500 микрограмм указанных олигонуклеотидов, или от 1 микрограмма до 200 микрограмм указанных олигонуклеотидов. В определенных вариантах осуществления ни один из указанных олигонуклеотидов не абсорбирован на поверхности синтетических наноносителей.

В вариантах осуществления иммуностимулирующие выделенные нуклеиновые кислоты настоящих изобретений вызывают профиль цитокинового ответа, характерный для СрО-содержащих нуклеиновых кислот "типа С". Указанный цитокиновый профиль можно отличить от цитокинового профиля СрОсодержащей нуклеиновой кислоты "типа В", поскольку оба типа В и С вызывают экспрессию 1Ь-6, тогда как только СрО-содержащие нуклеиновые кислоты типа С также вызывают экспрессию интерферонаальфа и ΙΡ-10. Соответственно, и как видно из Примеров, в различных вариантах осуществления указанные нуклеиновые кислоты индуцируют продукцию 1Ь-6 у субъекта, когда любую из композиций изобретения вводят субъекту в количестве, достаточном для индукции 1Ь-6 у субъекта. В определенных вариантах осуществления указанные нуклеиновые кислоты индуцируют интерферон-альфа у субъекта, когда любую из композиций изобретения вводят субъекту в количестве, достаточном для индукции продукции интерферона-альфа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные нуклеиновые кислоты индуцируют продукцию ΙΡ-10 у субъекта, когда композиции изобретения вводят субъекту в количестве, достаточном для индукции продукции ΙΡ-10 у субъекта. В определенных вариантах осуществления указанные нуклеиновые кислоты не содержат стабилизирующих модификаций, предпочтительно такие нуклеиновые кислоты включают в себя фосфодиэфирный скелет.

В вариантах осуществления указанные нуклеиновые кислоты могут содержать стабилизирующие модификации. Стабилизирующие модификации нуклеиновых кислот включают любые известные в данной области, но без ограничения модификации 3'ОН или 5'ОН групп, модификации нуклеотидного основания, модификации сахарного компонента и модификации фосфатной группы. Различные стабилизирующие модификации описаны в настоящем документе, и также их можно найти в опубликованной патентной заявке США 2008/0207550 Реагоп е! а1., или в патенте США 6239116 Кпед е! а1.

Указанные нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочеными или двухцепочечными ДНК, и/или могут содержать дополнительные фланкирующие последовательности. Указанные нуклеиновые кислоты могут содержать естественные или модифицированные, не встречающиеся в природе основания, и могут содержать модифицированные сахар, фосфат, и/или концы. Например, фосфатные модификации включают, но без ограничения метилфосфонат, фосфотиоат, алкилфосфонотиоат, например, -О-Р=О (-8СН₂СО₂-), фосфорамидат (с образованием мостика или без образования мостика), фосфотриэфир и фосфодитиоат, и алкилфосфодитиоат, как указано выше, и могут использоваться в любой комбинации. Другие нефосфатные связи также можно использовать. В полезном варианте осуществления модифицированные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения включают фосфотиоатные скелеты. Модификации Сахаров известны в данной области, например, 2'-алкокси-РНК аналоги, 2'-амино-РНК аналоги и 2'алкокси- или химеры амино-РНК/ДНК и другие аналоги, описанные здесь, также могут быть созданы и объединены с любой фосфатной модификацией. Примеры модификаций оснований (обсуждаемые дополнительно ниже) включают, но без ограничения добавление электроноакцепторного агента к С-5 и/или С-6 цитозина нуклеиновой кислоты (например, 5-бромцитозин, 5-хлорцитозин, 5-фторцитозин, 5иодцитозин) и С-5 и/или С-6 урацила нуклеиновой кислоты (например, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5фторурацил, 5-иодурацил). См., например, международную патентную заявку № ΥΟ 99/62923.

Синтез нуклеиновых кислот, содержащих модифицированные фосфатные связи или нефосфатные связи, известен в данной области. Для обзора см. Майеиес1 (1997) "ОНдопис1еоййе Апа1од§: ап Оуег\ае\у" ίη Ойдопис1еойбе8 а§ Тйегареийс АдепЬ. (Ό. 1. Сйайуюк апб О. Сагйеу, ей.) 1оЬп ХУПеу апб 8оп§, №у Уогк, Ν.Υ. Производное фосфора (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к сахарной части или к аналогу сахарной части в молекуле нуклеиновой кислоты настоящих изобретений, может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфонат, фосфотиоат, фосфодитионат, фосфоамидат или т.п. Получение упомянутых выше фосфатных аналогов и включение их в нуклеиновые кислоты, по существу, также известно, и нет необходимости подробно описывать

- 10 030096

их здесь. Реуго!!ек е! а1. (1996) Ыис1е1с Аабк Кек. 24:1841-1848; СЬа!итуеб1 е! а1. (1996) Ыис1е1с Аабк Кек. 24:2318-2323; и 8с1ш11/ е! а1. (1996) Ыис1е1с Ас1бк Кек. 24:2966-2973. Например, синтез фосфоротиоатной нуклеиновой кислоты сходен с синтезом, описанным выше, для природных нуклеиновых кислот за исключением того, что стадия окисления заменена стадией сульфирования (Ζοη (1993) "ОПдописКочбе РйокрйогоШюа!ек" в Рго!осо1к ίοτ ОПдогшс1еоОбек апб Апа1одк, 8уп!йек1к апб Рторетбек (Лдга\уа1, ей.) Нитапа Ргекк, рр. 165-190).

Аналогичным образом также был описан синтез других аналогов фосфатов, таких как фосфотриэфир (Мб1ет е! а1. (1971) 1АС8 93:6657-6665), фосфорамидаты, не содержащие мостиковых связей (бадег е! а1. (1988) ВюсНет. 27:7247-7246), Ы3'Р5'-фосфорамидаты (\е1коп е! а1. (1997) ГОС 62:7278-7287) и фосфодитионаты (патент США № 5453496). Другие модифицированные нуклеиновые кислоты, не содержащие фосфор, также могут быть использованы (80гсНак е! а1. (1989) №с1ею Аабк Кек. 17:61296141). Нуклеиновые кислоты с фосфоротиоатным скелетом могут быть более устойчивыми, при некоторых обстоятельствах, к разрушению после инъекции в организм хозяина. Вгаип е! а1. (1988) 1. 1ттипо1. 141:2084-2089; и Ьабтег е! а1. (1995) Мо1. 1ттипо1. 32: 1057-1064.

Нуклеиновые кислоты, применимые в изобретениях, описанных здесь, могут включать один или более рибонуклеотидов (содержащих рибозу в качестве единственного или главного сахарного компонента) или, как известно в данной области, модифицированные сахара или аналоги сахаров могут быть включены в нуклеиновые кислоты. Таким образом, кроме рибозы, сахарный компонент может представлять собой один из классов сахаров, такой как пентоза, деоксипентоза, гексоза или деоксигексоза; определенный сахар, такой как глюкоза, арабиноза, ксилоза, ликсоза; или аналог сахара, такой как циклопентильная группа. Сахар может находиться в пиранозильной или в фуранозильной форме. В указанных нуклеиновых кислотах, сахарная группа предпочтительно представляет собой фуранозид рибозы, арабинозу или 2'-О-алкилрибозу, и сахар может быть прикреплен к соответствующим гетероциклическим основаниям или в альфа- или в бета-аномерной конфигурации. Получение указанных сахаров или аналогов сахаров и соответствующих "нуклеозидов", в которых такие сахара или аналоги присоединены к гетероциклическому основанию (нуклеиновому основанию), по существу известно, нет необходимости подробно описывать их здесь, кроме случаев, когда указанное получение имеет отношение к какому-либо конкретному примеру. Модификации сахаров также могут быть проведены и объединены с любой модификацией фосфата при получении указанной нуклеиновой кислоты.

Г етероциклические основания или основания нуклеиновых кислот, которые включены в указанные нуклеиновые кислоты, могут представлять собой встречающиеся в природе главные пуриновые и пиримидиновые основания (а именно урацил, тимин, цитозин, аденин и гуанин, как указано выше), а также природные и синтетические модификации указанных главных оснований.

Специалистам в данной области известно, что большое число "синтетических" искусственных нуклеозидов, содержащих различные гетероциклические основания и различные сахарные группы (и аналоги Сахаров), доступно в данной области, и что при условии соответствия другим критериям настоящего изобретения указанные нуклеиновые кислоты могут включать одно или несколько гетероциклических оснований, отличающихся от главных пяти компонентов оснований природных нуклеиновых кислот. В определенных вариантах осуществления гетероциклическое основание в указанных нуклеиновых кислотах включает, но без ограничения группы урацил-5-ил, цитозин-5-ил, аденин-7-ил, аденин-8-ил, гуанин7-ил, гуанин-8-ил, 4-аминопирроло[2,3-б]пиримидин-5-ил, 2-амино-4-оксопироло[2,3-б]пиримидин-5-ил, 2-амино-4-оксопирроло[2,3-б]пиримидин-3-ил, где пурины присоединены к сахарной группе нуклеиновой кислоты в положении 9, пиримидины в положении 1, пирролопиримидины в положении 7 и пиразолопиримидины в положении 1.

Указанные нуклеиновые кислоты могут включать по меньшей мере одно модифицированное основание. В данном контексте термин "модифицированное основание" является синонимом "аналог основания", например, "модифицированный цитозин" является синонимом термина "аналог цитозина." Аналогично, "модифицированные" нуклеозиды или нуклеотиды определяют в настоящем документе, как синонимы нуклеозидных или нуклеотидных "аналогов". Примеры модификаций оснований включают, но без ограничения добавление электроноакцепторной группы к С-5 и/или С-6 цитозина нуклеиновой кислоты.

Предпочтительно электроноакцепторная группа представляет собой галоген. Такие модифицированные цитозины могут включать, но без ограничения азацитозин, 5-бромцитозин, бромурацил, 5хлорцитозин, хлорированный цитозин, циклоцитозин, цитозина арабинозид, 5-фторцитозин, фторпиримидин, фторурацил, 5,6-дигидроцитозин, 5-йодцитозин, гидроксимочевина, йодурацил, 5-нитроцитозин, урацил, и любой другой аналог пиримидина или модифицированный пиримидин. Другие примеры модификаций оснований включают, но без ограничения введение электроноакцепторной группы в положении С-5 и/или С-6 урацила указанной нуклеиновой кислоты. Предпочтительно электроноакцепторная группа представляет собой галоген. Такие модифицированные урацилы могут включать, но без ограничения 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-фторурацил, 5-йодурацил.

Другие примеры модификаций оснований включают, но без ограничения введение одной или более тиольных групп в основание, включая, но без ограничения 6-тио-гуанин, 4-тио-тимин и 4-тиоурацил.

Указанные нуклеиновые кислоты можно синтезировать с применением технологий и оборудования

- 11 030096

для синтеза нуклеиновых кислот, которые хорошо известны в данной области, включая, но без ограничения ферментные методы, химические методы, и метод деградации более крупных последовательностей нуклеиновой кислоты. См., например, АикиЬе1 е! а1. (1987); и ЗатЬгоок е! а1. (1989). При сборке ферментным методом отдельные единицы могут быть сшиты, например, лигазой, такой как Т4 ΌΝΆ или РНКлигазой согласно патенту США № 5124246. Разрушение нуклеиновой кислоты может быть осуществлено путем воздействия нуклеазы на нуклеиновую кислоту, как проиллюстрировано в патенте США № 4650675.

Кольцевые нуклеиновые кислоты, используемые в настоящем изобретении, могут быть выделены, синтезированы рекомбинантными методами или синтезированы химическим путем. Если кольцевую нуклеиновую кислоту получают с помощью выделения или рекомбинантными методами, нуклеиновая кислота предпочтительно будет представлять собой плазмиду. Химический синтез кольцевых нуклеиновых кислот меньшего размера может быть осуществлен с применением любого метода, описанного в литературе. См., например, Сао е! а1. (1995) ШсШс Аибк Кек. 23:2025-2029; апб Аапд е! а1. (1994) Νυс1е1с Лс1бк Кек. 22:2326-2333.

Технологии создания указанных нуклеиновых кислот известны в данной области. Природную ДНК, содержащую фосфодиэфирные связи, обычно синтезируют путем последовательного присоединения соответствующего фосфорамидит нуклеозида к 5'-гидроксильной группе растущей нуклеиновой кислоты, прикрепленной к твердой подложке 3'-концом, с последующим окислением промежуточного соединения с фосфитной триэфирной связью до соединения с фосфатной триэфирной связью. После того, как желаемая последовательность нуклеиновой кислоты синтезирована, нуклеиновую кислоту снимают с подложки, депротектируют фосфатные триэфирные группы с образованием фосфатдиэфирых связей и нуклеозидные основания депротектируют с применением водного раствора аммиака или других оснований. См., например, Веаисаде (1993) "ОНдобеохупЬопис1еоббе Зуййеык" в Рго1осо1к Юг ОНдопис1еоббек апб Апа1одк, ЗуШЪеык апб Ргорегбек (Адгата1, еб.) Нитапа Ргекк, ТоЮ\\а. Ν.Ι; Аагпег е! а1. (1984) ΌΝΆ 3:401 и патент США № 4458066.

Предпочтительно цитозины в СС-мотивах, представленных в указанных нуклеиновых кислотах, не метилированы, хотя предусмотрены другие модификации и/или дополнения.

Однако в определенных вариантах осуществления указанные нуклеиновые кислоты могут содержать один или более метилированных цитозинов, которые не являются СС-мотива.

Получение нуклеозидов с модифицированными основаниями и синтез модифицированных нуклеиновых кислот с использованием указанных нуклеозидов с модифицированными основаниями в качестве предшественников, описан, например, в патентах США № 4910300, 4948882 и 5093232. Указанные нуклеозиды с модифицированными основаниями разработаны таким образом, что они могут быть включены с помощью химического синтеза либо в концевые, либо во внутренние положения нуклеиновой кислоты. Такие нуклеозиды с модифицированными основаниями, представленные либо в концевых, либо во внутренних положениях нуклеиновой кислоты, могут служить участками прикрепления пептида или другого антигена. Нуклеозиды, модифицированные по сахарной составляющей, также описаны (включая, но без ограничения, например, патенты США № 4849513, 5015733, 5118800, 5118802) и могут быть использованы аналогичным образом.

Параметры длины нуклеиновых кислот

В некоторых вариантах осуществления изобретения длина указанной нуклеиновой кислоты меньше любого из нижеперечисленных значений длины (в основаниях или парах оснований): 10000; 5000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 50; 25. В некоторых вариантах осуществления изобретения длина иммуномодулирующего полинуклеотида больше любого из нижеперечисленных значений длины (в основаниях или парах оснований): 24; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 50000. Альтернативно, иммуномодулирующий полинуклеотид может соответствовать любому из диапазонов размеров, характеризующемуся верхним пределом 10000; 5000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 50; или 25; и независимо выбранный нижний предел 24; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500, где значение нижнего предела меньше значения верхнего предела.

Композиции

Композиции изобретения могут включать различные материалы и вещества в дополнение к указанным нуклеиновым кислотам. Как отмечается везде в настоящем документе, такие материалы и вещества могут включать адъюванты, антигены, носители, фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и т.п.

В определенных вариантах осуществления носители, используемые при осуществлении на практике настоящих изобретений, включают белки-носители или синтетические наноносители. В вариантах осуществления синтетические наноносители, содержащие композицию изобретения, могут быть соединены с антигеном. В дополнительных вариантах осуществления такие синтетические наноносители также могут содержать дополнительный синтетический наноноситель, не связанный с иммуностимулирующей выделенной нуклеиновой кислотой, и в предпочтительных вариантах осуществления дополнительный

- 12 030096

синтетический наноноситель связан с антигеном.

В определенных вариантах осуществления композиции изобретения могут быть введены вместе с конъюгированными или неконъюгированными вакцинами. В вариантах осуществления композиции изобретения могут содержать пептидный или белковый носитель или другой тип носителя. Полезные носители включают белки-носители, которые, как известно, применяют в конъюгированных вакцинах, включая, но без ограничения анатоксин столбняка (ТТ), дифтерийный анатоксин (ЭТ). нетоксичный мутант дифтерийного токсина, СИМ 197, белковый комплекс внешней мембраны N. шешпдЙ1б15 группы В, и гемоцианин лимфы улитки (КЬН). Другие носители могут включать синтетические наноносители, описанные в другом месте в настоящем документе, и другие носители, которые могут быть традиционно известными.

Связывание антигена или указанных нуклеиновых кислот с носителями можно осуществить с применением общепринятых методик ковалентного или нековалентного связывания. Полезные методики для создания конъюгированных вакцин включают, но без исключения методики, в целом описанные в публикациях ΜΌ Ьа1гшоге е! а1., "Нитап Т-1утрко1гор1с νίπΐδ 1уре 1 рерйбек ίη сЫтейс апб ти1Цуа1еп1 еоп81гис18 χνίΐΠ ргот18сиои8 Т-се11 ерПорез епкапсе штиподетсйу апб оуегсоте депейс ге51г1с11оп." 1. VIго1. Ос!; 69 (10):6077-89 (1995); С\У Ктйегекаше е! а1., ’^ассше-шбисеб апйЬоб1е5 ибиЬк СЕТР аскубу ш У1уо апб гебисе аогйс 1е5юп5 ш а гаЬЬй тобе1 о! а1кего5с1его515." Лпегю5с1ег ТкготЬ Vа5е Вю1. 8ер; 20(9):2106-12 (2000); Μν Скепда1уа1а е! а1., "Епкапсеб иптиподешсбу о! кераОО5 В 5шТасе апбдеп Ьу ш5егйоп о! а Пе1рег Т се11 ерборе Ггот 1е1апи5 Юхо1б." νη^ίικ. Маг 5; 17(9-10): 1035-41 (1999). ΝΚ Эакаррадап е! а1., "А с1бтепс ти1й-китап ер1бегта1 дго\\1к ГасЮг гесерЮг-2 В се11 ерборе рерПбе уассте теб1а1е5 5ирегюг апШитог ге5роп5е5." 1 1ттипо1. Арг 15; 170 (8):4242-53 (2003); ТТ Саггей е! а1. "№уе1 епдтеегеб 1га51и/итаЬ соиГогтайопа1 ерборе5 бетоп51га1е ш уйго апб ш у1уо апШитог ргорегйе5 адаиъ! НЕК-2/пеи". 1. 1ттипо1. 1ип 1; 178 (11): 7120-31 (2007).

В других вариантах осуществления композиции изобретения могут быть объединены с антигеном или с обычно применяемой вакциной, в среде для лекарства для создания инъекционной смеси. Смеси можно получить с применением общепринятых технологий фармацевтического производства и создания смесей для введения в удобных лекарственных формах. Технологии, подходящие для применения на практике настоящего изобретения можно найти в ряде источников, включая, но без ограничения М.Р. Ро\\е11 е! а1., Vасс^пе Пе51дп, 1995 8рйпдег^ейад риЬ1; ог Ь. С. Рао1ей1 е! а1. еб5., Vасс^пе5: Ггот Сопсер! Ю СИтс. А Сшбе Ю 1йе Оеуе1ортеп1 апб СИтса1 Те5Йпд о! Vасс^пе5 Гог Нитап И5е 1999 СКС Рге55 риЬ1.

В вариантах осуществления синтетические наноносители могут использоваться в качестве носителей. Широкий спектр синтетических наноносителей можно использовать согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители представляют собой сферы или сфероиды. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители являются плоскими или имеют пластинчатую форму. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители представляют собой кубики или имеют кубическую форму. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители представляют собой овалы или эллипсы. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители представляют собой цилиндры, конусы или пирамиды.

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательно использовать популяцию синтетических наноносителей, которая относительно однородна в терминах размера, формы, и/или композиции, так что каждый синтетический наноноситель обладает сходными свойствами. Например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% синтетических наноносителей, на основе общего числа синтетических наноносителей, могут иметь минимальный размер или максимальный размер, который находится в пределах 5%, 10% или 20% от среднего значения диаметра или среднего значения размера синтетических наноносителей. В некоторых вариантах осуществления изобретения популяция синтетических наноносителей может быть гетерогенной в отношении размера, формы и/или композиции.

Синтетические наноносители могут быть твердотельными или полыми и могут включать один или более слоев. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый слой имеет особую композицию и особые свойства по сравнению с другим слоем (слоями). В качестве одного примера, синтетические наноносители могут иметь структуру ядро/оболочка, в которой ядро представляет собой один слой (например, полимерное ядро) и оболочка является вторым слоем (например, липидный бислой или монослой). Синтетические наноносители могут включать несколько различных слоев.

В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители необязательно могут включать один или более липидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетический наноноситель может включать липосому. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетический наноноситель может включать липидный бислой. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетический наноноситель может включать липидный монослой. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетический наноноситель может включать мицеллу. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетический наноноситель может включать ядро, состоящее из полимерной матрицы, окруженное липидным слоем (например, липидный бислой, липидный монослой и

- 13 030096

т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетический наноноситель может включать неполимерое ядро (например, металическая частица, квантовая точка, керамическая частица, костная частица, вирусная частица, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и т.д.), окруженное липидным слоем (например, липидным бислоем, липидным монослоем и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители могут включать один или более полимеров. В некоторых вариантах осуществления изобретения такой полимер может быть окружен слоем покрытия (например, липосома, липидный монослой, мицелла, и т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения различные элементы синтетических наноносителей могут быть связаны с полимером.

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунокомпетентная поверхность, направляющая группа, и/или нуклеиновая кислота может быть ковалентно присоединена к полимерной матрице. В некоторых вариантах осуществления ковалентное присоединение опосредуется линкером. В некоторых вариантах осуществления изобретения, иммунокомпетентная поверхность, направляющая группа, и/или олигонуклеотид могут быть нековалентно присоединены к полимерной матрице. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, иммунокомпетентную поверхность, направляющую группу, и/или нуклеиновую кислоту можно заключить в капсулу из полимерной матрицы, окружить полимерной матрицей, и/или диспергировать в полимерной матрице. Альтернативно или дополнительно, иммунокомпетентную поверхность, направляющую группу, и/или нуклеотид можно присоединить к полимерной матрице с помощью гидрофобных взаимодействий, взаимодействий зарядов, сил Ван-дерВаальса и т.д.

Известен широкий спектр полимеров и способов создания из них полимерных матриц традиционным способом. В целом, полимерная матрица включает один или более полимеров. Полимеры могут представлять собой природные или неприродные (синтетические) полимеры. Полимеры могут быть гомополимерами или сополимерами, включающими в себя два или более мономеров. В терминах последовательности сополимеры могут представлять собой статистический полимер, блок или включать в себя комбинацию статистических последовательностей и блоков. Обычно полимеры согласно настоящему изобретению являются органическими полимерами.

Примеры полимеров, подходящих для применения в настоящем изобретении включают, но без ограничения полиэтилены, поликарбонаты (например, поли(1,3-диоксан-2-он)), полиангидриды (например, поли(себациновый ангидрид)), полипропилфумараты, полиамиды (например, поликапролактам), полиацетали, полиэфиры, полимеры сложных эфиров (например, полилактид, полигликолид, полилактид-согликолид, поликапролактон, полигидроксикислота (например, поли(Р-гидроксиалканоат)), поли(ортоэфиры), полицианоакрилаты, поливиниловые спирты, полиуретаны, полифосфазены, полиакрилаты, полиметакрилаты, полиураты, полистиролы и полиамины, полилизин, сополимеры м-ΡΕΟ, и поли(этиленимин), сополимеры поли(этиленимин)-ГЕО.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры согласно настоящему изобретению включают полимеры, которые были одобрены для применения управлением по контролю за продуктами и лекарствами (ΡΌΑ) в соответствии с положениями 21 С.Р.К. § 177.2600, включая, но без ограничения полиэфиры (например, полимолочная кислота, сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, поликапролактон, поливалеролактон, поли(1,3-диоксан-2он)); полиангидриды (например, поли(себациновый ангидрид)); полиэфиры (например, полиэтиленгликоль); полиуретаны; полиметакрилаты; полиакрилаты и полицианоакрилаты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут быть гидрофильными. Например, полимеры могут содержать анионные группы (например, фосфатная группа, сульфатная группа, карбоксилатная группа); катионные группы (например, четвертичная аминогруппа); или полярные группы (например, гидроксильная группа, тиольная группа, аминогруппа). В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетический наноноситель, содержащий гидрофильную полимерную матрицу, создает гидрофильную среду внутри синтетического наноносителя. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут быть гидрофобными. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетический наноноситель, содержащий гидрофобную полимерную матрицу, создает гидрофобную среду внутри синтетического наноносителя. Выбор гидрофильности или гидрофобности полимера может влиять на природу материалов, которые включают (например, связывают) в синтетический наноноситель.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут быть модифицированы одной или более составляющими и/или функциональными группами. Ряд составляющих или функциональных групп можно использовать согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут быть модифицированы полиэтиленгликолем (ΡΕΟ), углеводом, и/или ациклическими полиацеталями, полученными из полисахаридов (Гарйоу, 2001, АС8 8утро§шт 8спс5, 786:301). Определенные варианты осуществления могут быть выполнены с применением основных идей патента США № 5543158 ОгсГ с1 а1., или международной публикации АО 2009/051837 Уоп Апбпап с1 а1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут быть модифицированы липидной группой или группой жирной кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения

- 14 030096

группа жирной кислоты может представлять собой одну или более из таких кислот как масляная, капроновая, каприловая, декановая, лауриновая, миристиновая, пальмитиновая, стеариновая, арахидиновая, бегеновая или лигноцериновая кислота. В некоторых вариантах осуществления изобретения группа жирной кислоты может представлять собой одну или более из следующих кислот: пальмитолеиновая кислота, олеиновая кислота, вакценовая кислота, линолевая кислота, альфа-линолевая кислота, гаммалинолевая кислота, арахидоновая кислота, гадолиновая кислота, арахидоновая кислота, эйкозапентаеновая кислота, докозагексаеновая кислота или эруковая кислота.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут представлять собой сложные полиэфиры, включая сополимеры, содержащие звенья молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как поли(молочная кислота-со-гликолевая кислота) и поли(лактид-со-гликолид), в совокупности обозначаемые здесь как "РЬСА"; и гомополимеры, состоящие из звеньев гликолевой кислоты, обозначаемые здесь как "РСА," и звеньев молочной кислоты, такие как поли-Ь-молочная кислота, поли-Э-молочная кислота, поли-Э,Ь-молочная кислота, поли-Ь-лактид, поли-Э-лактид, и поли-Э,Ь-лактид, в совокупности обозначаемые здесь как "РЬА". В некоторых вариантах осуществления изобретения показательные полиэфиры включают, например, полигидроксикислоты; сополимеры РЕС и сополимеры лактида и гликолида (например, сополимеры РЬА-РЕС, сополимеры РСА-РЕС, сополимеры РЬСА-РЕС и их производные.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сложные полиэфиры включают, например, поли(капролактон), поли(капролактон)-РЕС сополимеры, поли(Ь-лактид-со-Ь-лизин), поли(сложный эфир серина), поли(сложный эфир 4-гидрокси-Ь-пролина), поли [а-(4-аминобутил)-Ь-гликолевая кислота] и их производные.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер может представлять собой РЬСА. РЬСА представляет собой биологически совместимый и биодеградируемый сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, и различные формы РЬСА характеризуются отношением молочная кислота:гликолевая кислота. Молочная кислота может представлять собой Ь-молочную кислоту, Ό-молочную кислоту или Ό, Ь-молочную кислоту. Скорость разрушения полимера РЬСА можно регулировать изменением отношения молочная кислота:гликолевая кислота. В некоторых вариантах осуществления изобретения РЬСА, который используют согласно настоящему изобретению, характеризуется отношением молочная кислота:гликолевая кислота приблизительно 85:15, приблизительно 75:25, приблизительно 60:40, приблизительно 50:50, приблизительно 40:60, приблизительно 25:75, или приблизительно 15:85.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут представлять собой один или более акриловых полимеров. В определенных вариантах осуществления акриловые полимеры включают, например, сополимеры акриловой кислоты и метакриловой кислоты, сополимеры метилметакрилата, этоксиэтилметакрилаты, цианоэтилметакрилат, сополимер аминоалкилметакрилата, поли(акриловая кислота), поли(метакриловая кислота), сополимер алкиламида метакриловой кислоты, поли(метилметакрилат), поли(ангидрид метакриловой кислоты), метилметакрилат, полиметакрилат, сополимер поли(метилметакрилат), полиакриламид, сополимер аминоалкилметакрилата, сополимеры глицидилметакрилата, полицианоакрилаты и комбинации, включающие один или более из указанных выше полимеров. Акриловый полимер может включать полностью полимеризованные сополимеры сложных эфиров акриловой и метакриловой кислоты с низким содержанием четвертичных аммониевых групп.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут представлять собой катионные полимеры. В целом, катионные полимеры способны конденсировать и/или защищать отрицательно заряженные цепи нуклеиновых кислот (например, ДНК или производные ДНК). Аминосодержащие полимеры, такие как поли(лизин) Ыаипег е! а1., 1998, Λύν. Эгид Ьс1. Ре\л 30:97; и КаЬапоу е! а1., 1995, Βίοсоп)ида1е СЬет., 6:7), полиэтиленимин) (РЕ1; ΒοιίδδίΓ е! а1., 1995, Ргос. Ν;·ι11. Асаб. δά., И8А, 1995, 92:7297), и дендримеры поли(амидоамин) (Κикον8ка-^а!а11ο е! а1., 1996, Ргос. №И. Асаб. δΰ., И8А, 93:4897; Тапд е! а1., 1996, Β^οсοη^ида!е СЬет., 7:703; и Наеп51ег е! а1., 1993, Β^οсοη^ида!е СЬет., 4:372) являются положительно заряженными при физиологических значениях рН, образуют ионные пары с нуклеиновыми кислотами, и опосредуют трансфекцию различных клеточных линий. В вариантах осуществления синтетические наноносители изобретения могут не содержать (или могут исключать) катионные полимеры.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут представлять собой деградируемые сложные полиэфиры, несущие катионные боковые цепи (Ри!пат е! а1., 1999, Мастот-юКснЬ^ 32:3658; Ваггега е! а1., 1993, I. Ат. СЬет. δο^, 115:11010; Κ\νοη е! а1., 1989, Масготο1еси1е8, 22:3250; Ыт е! а1., 1999, I. Ат. СЬет. δο^, 121:5633; и ΖΙιοιι е! а1., 1990, Масготο1еси1е8, 23:3399). Примеры указанных полиэфиров включают поли(Ь-лактид-со-Ь-лизин) (Ваггега е! а1., 1993, ί. Ат. СЬет. δοα, 115:11010), поли (сложный эфир серина) (ΖΙιοιι е! а1., 1990, Мастот-юКснЬ^ 23:3399), поли(сложный эфир 4гидрокси-Ь-пролина) (Ри!пат е! а1., 1999, Масготο1еси1е8, 32:3658; и Ыт е! а1., 1999, I. Ат. СЬет. δο^ 121:5633), и поли (сложный эфир 4-гидрокси-Ь-пролин) (Ри!пат е! а1., 1999, Масготο1еси1е8, 32:3658; и Ыт е! а1., 1999, I. Ат. СЬет. δοα, 121:633).

Свойства указанных и других полимеров и способы их получения хорошо известны в данной области (см., например, патенты США № 6123727; 5804178; 5770417; 5736372; 5716404; 6095148; 5837752; 5902599; 5696175; 5514378; 5512600; 5399665; 5019379; 5010167; 4806621; 4638045 и 4946929; публика- 15 030096

ции Аапд е! а1., 2001, I. Ат. СЬет. 8ос., 123:9480; Пт е! а1., 2001, I. Ат. СЬет. 8ос., 123:2460; Ьапдег, 2000, Асе. СЬет. Ке8., 33:94; Ьапдег, 1999, I. СойгоЬ Ке1еа§е, 62:7; и ИЬгюЬ е! а1., 1999, СЬет. Ке\'.. 99:3181). В более общем смысле, ряд способов синтеза определенных подходящих полимеров описан в публикациях СопсЬе Епсус1ореб1а о£ Ро1утег 8аепсе апб Ро1утепс Аттек апб Аттотит δ;·ι1ΐ5, Εά. Ьу Сое!Ьак, Регдатоп Рге88, 1980; Ргшс1р1е8 о£ Ро1утеп/а0оп Ьу Об1ап, 1оЬп АЬеу & 8опх, РоийЬ ЕбШоп, 2004; Соп!етрогагу Ро1утег С’ЬетПгу Ьу А11соск е! а1., РгепЬсе-На11, 1981; Эеттд е! а1., 1997, Ыа!иге, 390:386; и в патентах США № 6506577, № 6632922, № 6686446 и № 6818732.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры представляют собой линейные или разветвленные полимеры. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут быть дендримерами. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут быть в основном сшиты один с другим. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут в основном не содержать поперечных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимеры могут быть использованы согласно настоящему изобретению без проведения стадии поперечного "сшивания". Также следует понимать, что синтетические наноносители изобретения могут включать блоксополимеры, привитые сополимеры, смеси, сочетания, и/или продукты присоединения любого из упомянутых выше и других полимеров. Специалистам в данной области понятно, что полимеры, перечисленные в настоящем документе, представляют собой пример, не исчерпывающий список полимеров, которые могут иметь применение согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители могут не содержать полимерный компонент. В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители могут включать металлические частицы, квантовые точки, керамические частицы и т.д. В некоторых вариантах осуществления изобретения, неполимерный синтетический наноноситель представляет собой агрегат неполимерных компонентов, например, агрегат атомов металлов (например, атомов золота). В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители необязательно могут включать одно или более амфифильное соединение. В некоторых вариантах осуществления изобретения амфифильное соединение может обеспечивать продукцию синтетических наноносителей с улучшенной стабильностью, повышенной однородностью или повышенной вязкостью. В некоторых вариантах осуществления изобретения амфифильные соединения могут быть ассоциированы с внутренней поверхностью липидной мембраны (например, с липидным бислоем, липидным монослоем и т.д.). Многие амфифильные соединения, известные в данной области, пригодны для использования при создании синтетических наноносителей согласно настоящему изобретению. Такие амфифильные соединения включают, но без ограничения фосфоглицериды; фосфатидилхолины; дипальмитоилфосфатидилхолин (ЭРРС); диолеилфосфатидилэтаноламин (ПОРЕ); диолеилоксипропилтриэтиламмоний (ООТМА); диолеилфосфатидилхолин; холестерин; сложный эфир холестерина; диацилглицерин; диацилглицеринсукцинат; дифосфатидилглицерин (ЭРРС); гексанедеканол; жирные спирты, такие как полиэтиленгликоль (РЕС); простой эфир полиоксиэтилен-9-лаурила; поверхностно-активную жирную кислоту, такую как пальмитиновая кислота или олеиновая кислота; жирные кислоты; моноглицериды жирных кислот; диглицериды жирных кислот; амиды жирных кислот; сорбитан триолеат (8рап®85) гликохолат; сорбитан монолаурат (8рап®20); полисорбат 20 (Туееп®20); полисорбат 60 (Туееп®60); полисорбат 65 (Туееп®65); полисорбат 80 (Туееп®80); полисорбат 85 (Туееп®85); полиоксиэтиленмоностеарат; сурфактин; полоксамер; сложный эфир сорбитана и жирной кислоты, такой как сорбитан триолеат; лецитин; лизолецитин; фосфатидилсерин; фосфатидилинозит; сфингомиелин; фосфатидилэтаноламин (кефалин); кардиолипин; фосфатидную кислоту; цереброзиды; дицетилфосфат; дипальмитоилфосфатидилглицерин; стеариламин; додециламин; гексадециламин; ацетилпальмитат; рицинолеат глицерина; гексадецилстеарат; изопропилмиристат; тилоксапол; поли(этиленгликоль)5000-фосфатидилэтаноламин; поли(этиленгликоль)400моностеарат; фосфолипиды; синтетические детергенты и/или природные детергенты, обладающие сильными сурфактантными свойствами; деоксихолаты; циклодекстрины; хаотропные соли; агенты для образования пары ионов; и их комбинации. Компонент амфифильного соединения может представлять собой смесь различных амфифильных соединений. Специалисту в данной области понятно, что это показательный неполный перечень веществ, обладающих сурфактантной активностью. Любое амфифильное соединение можно использовать при получении синтетических наноносителей, которые можно использовать согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители необязательно могут включать один или более углеводов. Углеводы могут быть естественными или синтетическими. Углевод может представлять собой производное природного углевода. В определенных вариантах осуществления углевод представляет собой моносахарид или дисахарид, включая, но без ограничения такие соединения как глюкоза, фруктоза, галактоза, рибоза, лактоза, сахароза, мальтоза, трегалоза, целлобиоза, манноза, ксилоза, арабиноза, глюкороновая кислота, галактуроновая кислота, маннуроновая кислота, глюкозамин, галактозамин и нейраминовая кислота. В определенных вариантах осуществления углевод представляет собой полисахарид, включая, но без ограничения пуллулан, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), гидроксицеллюлозу (НС), метилцеллюлозу

- 16 030096

(МС), декстран, циклодекстрин, гликоген, гидроксиэтилкрахмал, каррагинан, гликон, амилозу, хитозан, Ν,Ο-карбоксиметилхитозан, альгин и альгиновую кислоту, крахмал, хитин, инулин, конджак, глюкоманнан, пустулан, гепарин, гиалуроновую кислоту, курдлан и ксантан. В вариантах осуществления изобретения синтетические наноносители изобретения не содержат (или специфически исключают) углеводы, такие как полисахарид. В определенных вариантах осуществления углевод может включать производное углевода, такое как сахарный спирт, включая, но без ограничения маннит, сорбит, ксилит, эритрит, мальтит, и лактитол.

В вариантах осуществления при создании носителей для применения с композициями изобретения могут применяться методы ковалентного связывания указанных нуклеиновых кислот или других элементов композиции изобретения с носителями. В вариантах осуществления указанные нуклеиновые кислоты или другие элементы композиций изобретения могут быть нековалентно связаны с носителями. Если элемент, который нужно присоединить, состоит из малой молекулы, может быть полезным присоединение элемента к полимерному носителю перед сборкой синтетических наноносителей. В вариантах осуществления может быть полезным (при производстве или по другим причинам) создание носителей, особенно синтетических наноносителей, с поверхностными группами, которые используются для связывания адъюванта с носителем за счет использования указанных поверхностных групп.

В определенных вариантах осуществления нековалентное связывание может быть проведено с помощью адсорбции. Адсорбция нуклеиновых кислот на поверхности наночастицы может осуществляться с помощью солеобразования. При использовании указанного метода наночастицы получают таким образом, что наночастица содержит материал, который придает заряд наночастице. Часто применение заряженного сурфактанта, например, катионного сурфактанта, который используют для адсорбции отрицательно заряженных нуклеиновых кислот во время получения наночастиц, является достаточным для обеспечения поверхностного заряда наночастицы. Взаимодействие заряженных наночастиц с раствором нуклеиновых кислот вызывает адсорбцию нуклеиновых кислот. Указанный способ описан в опубликованной международной патентной заявке \ЕО 00/06123 О'Надеп е1 а1. Инкапсулирование нуклеиновых кислот можно осуществить путем растворения нуклеиновых кислот в водном буфере и последующего использования указанного раствора в процессе одинарного или двойного эмульгирования для образования наночастиц путем самосборки. Данный процесс описан в публикации Тзе, е1 а1. 1п1егпаЦопа1 1оигпа1 о£ РЬагшасеийсз, 370 (1-2), 33 (2009). Дополнительные методы инкапсулирования описаны в другом месте настоящего документа.

Ковалентное связывание можно осуществить с помощью ряда методов. Указанные методы подробно описаны в руководстве ВюсоищдаГе ТесЬтциез, 2^пС ебГОоп, ЕПеНег (2008) Ьу Иегшапзоп. Один метод, который особенно подходит для связывания нуклеиновых кислот с полимерами или наночастицами, несущими функциональные аминогруппы заключается в активации 5'-фосфата нуклеиновой кислоты 1-(3диметиламино)пропил-3-этилкарбодиимида метиодидом (ЕИС) и имидазолом и последующей реакции активированной нуклеиновой кислоты с аминозамещенным полимером или наночастицей [ЗЬаЬагоуа е1 а1., ЕЕВ8 ГеИегз, 154 288, (1983)]. Данный процесс представлен ниже для наночастиц с аминофункционализированной поверхностью.

В определенных вариантах осуществления ковалентное связывание может быть осуществлено с помощью ковалентного линкера. В вариантах осуществления ковалентный линкер может включать

- 17 030096

амидный линкер, дисульфидный линкер, тиоэфирный линкер, гидразоновый линкер, гидразидный линкер, иминовый или оксиминовый линкер, мочевой или тиомочевой линкер, амидиновый линкер, аминолинкер, и сульфонамидый линкер.

Амидный линкер получают путем образования амидной связи между амином одного элемента и функциональной группой карбоновой кислоты второго элемента, такого как наноноситель. Амидная связь в линкере может быть образована с помощью любой из общепринятых реакций образования амидной связи с использованием соответствующим образом защищенных аминокислот или антигенов или адъювантов и активированной карбоновой кислоты, такой как активированный сложный эфир Νгидроксисукцинимид.

Дисульфидный линкер получают путем образования дисульфидной связи (δ-δ) между двумя атомами серы в виде, например, Κ₁-δ-δ-Κ₂. Дисульфидная связь может быть образована путем обмена тиола в составе антигена или адъюванта, содержащего тиоловую/меркаптановую группу (-δΗ) с другой активированной тиольной группой в составе элемента, содержащего тиоловые/меркаптановые группы, в составе элемента, содержащего активированную тиоловую группу.

Триазоловый линкер, в особенности 1,2,3-триазол в форме ¹⁴ - в котором К! и К₂ могут представлять собой любые химические соединения, получают с помощью реакции 1,3-биполярного циклоприсоединения азида, прикрепленного к первому элементу, с концевым алкином, прикрепленным ко второму элементу. Реакцию 1,3-биполярного циклоприсоединения осуществляют с применением или без применения катализатора, предпочтительно Си(1)-катализатора, который связывает два элемента с помощью действия 1,2,3-триазола. Указанный химический процесс подробно описан в публикациях δ1ι;·ΐΓρ1θ55 е! а1., Ануем. СЬет. Ιη!. Ей. 41(14), 2596, (2002) и Ме1йа1, е! а1., СЬет. Кеу., 2008, 108(8), 2952-3015 и часто обозначается как "клик-реакция" или СиААС.

Тиоэфирный линкер получают путем образования сероуглеродной (тиоэфирной) связи в форме, например, Κ₁-δ-Κ₂.

Тиоэфир можно получить либо с помощью алкилирования тиоловой/меркаптановой группы (-δΗ) на одном компоненте, таком как элемент с алкилирующей группой, такой как галид, либо с помощью эпоксида на втором элементе. Тиоэфирные линкеры также могут быть получены присоединением по Михаэлю тиоловой/меркаптановой группы одного элемента к электрон-дефицитной алкеновой группе второго элемента, такого как полимер, содержащий малеимидную группу в качестве акцептора в реакции Михаэля. В другом способе тиоэфирные линкеры могут быть получены с помощью еновой реакции тиол-радикала с участием тиоловой/меркаптановой группы одного элемента и алкеленовой группы второго элемента, такого как полимер или наноноситель.

Гидразоновый линкер получают с помощью реакции между гидразидной группой одного элемента и альдегидной/кетоновой группой второго элемента.

Гидразидный линкер получают в результате реакции с участием гидразиновой группы одного элемента и функциональной группы карбоновой кислоты второго элемента. Такую реакцию обычно осуществляют с применением химического процесса, сходного с образованием амидной связи, в случае, когда карбоновую кислоту активируют активирующим реагентом.

Иминовый или оксимовый линкер получают с помощью реакции группы амина или Ν-алкоксиамина (или аминоокси) первого элемента с альдегидной группой или кетоновой группой второго элемента.

Мочевой или тиомочевой линкер получают с помощью реакции аминогруппы первого элемента с изоцианатной или тиоизоцианатной группой второго элемента.

Амидиновый линкер получают с помощью реакции аминогруппы первого элемента с группой имидоэфира второго элемента.

Аминолинкер получают с помощью реакции алкилирования с участием аминогруппы одного элемента и алкилирующей группы, такой как галогенсодержащая, эпоксидная группа, или группа эфира сульфокислоты, второго элемента. Альтернативно, аминолинкер также можно получить с помощью восстановительного аминирования аминогруппы одного элемента альдегидной или кетоновой группой второго элемента с подходящим восстанавливающим агентом, таким как цианоборогидрид натрия или триацетоксиборогидрид натрия.

Сульфонамидный линкер получают в результате реакции между амигруппой одного элемента и сульфонилгалогенидой группы (такой как сульфонилхлорид) второго элемента.

Элементы также можно соединить с помощью нековалентных методов связывания. Например, отрицательно заряженный антиген или адъювант может быть связан с положительно заряженным носителем с помощью электростатической адсорбции. Антиген или адъювант, содержащий металлолиганд, также может быть связан с носителем, содержащим комплексное соединение металла с помощью металлолигандного комплекса.

В определенных вариантах осуществления элемент, такой как указанные нуклеиновые кислоты, ан- 18 030096

тиген или адъювант, можно присоединить к полимеру, такому как блок-сополимер полиэтиленгликоля и полимолочной кислоты, перед сборкой синтетического наноносителя, или можно получить синтетический наноноситель, содержащий на поверхности реакционно-способные или активируемые группы. В последнем случае можно получить антиген или адъювант, содержащий группу, совместимую со связывающей химической структурой, присутствующей на поверхности синтетического наноносителя. В других вариантах осуществления пептидный антиген может быть присоединен к УЪР или к липосомам с помощью подходящего линкера.

Линкер представляет собой соединение или реагент, который способен связывать две молекулы вместе. В варианте осуществления линкер может представлять собой гомобифункциональный или гетеробифункциональный реагент, как описано в Негтапзоп 2008. Например, синтетический наноноситель в виде УЪР или липосомы, содержащий карбоксильную группу на поверхности, можно обработать гомобифункциональным линкером, дигидразидом адипиновой кислоты (АНН), в присутствии ЕЭС с образованием соответствующего синтетического наноносителя с ΑΌΗ-линкером. Получаемый АНН-связанный синтетический наноноситель затем конъюгируют с пептидным антигеном, содержащим кислотную группу, с помощью другого конца АНН-линкера на ЫС для получения соответствующего пептидного конъюгата УЪР или липосомы.

Способы получения и применения композиций и родственные способы

Синтетические наноносители могут быть получены с помощью широкого спектра способов, известных в данной области. Например, синтетические наноносители могут быть созданы такими способами, как нанопреципитация, фокусирование потока с использованием флюидных каналов, сушка распылением, выпаривание растворителя из простой и двойной эмульсии, жидкостная экстракция, разделение фаз, измельчение, процедуры микроэмульгирования, микротехнология, нанопроизводство, защитные слои, простая и сложная коацервация, и другими способами, хорошо известными специалистам в данной области. Альтернативно или дополнительно описаны синтезы в водных и органических растворителях для монодисперсных, полупроводниковых, проводящих магнитных, органических и других наноматериалов (Ре11едтшо е! а1., 2005, §та11, 1:48; Миггау е! а1., 2000, Апп. Кеу. Ма!. δοΐ., 30:545; апй Тппйайе е! а1., 2001, СНет. Ма!., 13:3843). Дополнительные методы описаны в литературе (см., например, НоиНтоу, Ей., "М1сгосарзи1ез апй ЫапорагНЛез ίη Мейюше апй РНагтасу," СКС Ргезз, Воса Ка!оп, 1992; Ма1Ню\\Ц/ е! а1., 1987, 1. Сойго1. Ке1еазе, 5:13; Ма1Ню\уЦ/ е! а1., 1987, Кеасйуе Ро1утегз, 6:275; апй Ма1Ню\уЦ/ е! а1., 1988, 1. Арр1. Ро1утег δс^., 35:755, и также патенты США 5578325 и 6007845).

Различные вещества могут быть заключены в синтетические наноносители, по желанию с применением различных методов, включая, но без ограничения С. Аз!е!е е! а1., '^уп!Нез1з апй сНагасЮп/аНоп оГ РЪСА папораШс1ез" 1. Вюта!ет. δ^. Ро1утег Ейп, Уо1. 17, Ыо. 3, рр. 247-289 (2006); К. Аудоиз1а1йз "Реду1а!ей Ро1у(Ъас!1Йе) апй Ро1у(ЪасНйе-Со-01усоНйе) ЫапораШс1ез: РтератаНоп, РтореШез апй Розз1Ые АррНсаНопз щ Эгид НеНуету" Ситтеп! Эгид НеНуету 1:321-333 (2004); С. Ке1з е! а1., "Ыапоепсарзи1аНоп I. Ме!Нойз Гог ртератаНоп оГ йгид-1оайей ро1утеНс папораШс1ез" Ыапотейюше 2:8-21 (2006). Другие способы, подходящие для инкапсулирования веществ, таких как нуклеиновые кислоты, в синтетические наноносители могут быть использованы, включая, но без ограничения методы, раскрытые в патенте США 6632671 Ипдег, зарегистрированном 14 октября, 2003; в публикациях Н. МаШтртеу е! а1., "Ро1утег папосатегз Гог !Не йеНуегу оГ зта11 Ггадтеп!з оГ пис1ею аайз: ОНдопис1еоНйез апй з|КЫА" Еигореап 1оигпа1 оГ РНагтасеиНсз апй ВюрНагтасеийсз 71:490-504 (2009); или Р. Ма1уа1а, е! а1., "ЕпНапсшд !Не !Негареийс еГПсасу оГ СрС оНдопис1еоНйез изшд ЫойедтайаЫе тюгорагйс1ез" Айуапсей Эгид НеНуету Ре\ае\уз 61:218-225 (2009).

В определенных вариантах осуществления синтетические наноносители получают с помощью процесса нанопреципитации или сушки распылением. Условия, используемые при создании синтетических наноносителей, могут быть изменены для получения частиц желаемого размера или с желаемым свойством (например, гидрофобность, гидрофильность, внешняя морфология, "сцепляемость", форма и т.д.). Способ получения синтетических наноносителей и применяемые условия (например, растворитель, температура, концентрация, скорость воздушного потока и т.д.) могут зависеть от веществ, которые соединяют с синтетическими наноносителями, и/или от композиции полимерной матрицы.

Если частицы, полученные любым из указанных выше способов, характеризуются колебаниями размеров вне желаемого диапазона, частицы могут быть отсортированы по размеру, например, с помощью сита.

Элементы композиций изобретения (такие как группы, из которых состоит иммунокомпетентная поверхность, направляющие группы, полимерные матрицы, антигены и т.п.) можно соединить с общим носителем, например, одной или более ковалентными связями, или можно соединить посредством одного или более линкеров. Можно применить методы функционализирования синтетических наноносителей из опубликованной патентной заявки США 2006/0002852 δа1!ζтаη е! а1., опубликованной патентной заявки США 2009/0028910 ^еδ^тоηе е! а1., или опубликованной международной патентной заявки \УО 2008/127532 А1 !о МшЕНу е! а1. Альтернативно или дополнительно, носители могут быть соединены с указанными нуклеиновыми кислотами, иммунокомпетентными поверхностями, направляющими группами, адъювантами, различными антигенами, и/или другими элементами непосредственно или опосре- 19 030096

дованно с помощью нековалентных взаимодействий. В вариантах осуществления с нековалентными взаимодействиями нековалентное связывание опосредуется нековалентными взаимодействиями, включая, но без ограничения взаимодействия между зарядами, аффинные взаимодействия, металлокоординационные взаимодействия, физическую адсорбцию, взаимодействия матрица-примесь, гидрофобные взаимодействия, ТТ стэкинг-взаимодействия, водород-связывающие взаимодействия, ван-дер-ваальсовские взаимодействия, магнитные взаимодействия, электростатические взаимодействия, диполь-дипольные взаимодействия, и/или их комбинации. Указанные взаимодействия могут осуществляться на части носителя, например, на внешней поверхности или на внутренней поверхности синтетического наноносителя изобретения. В определенных вариантах осуществления инкапсулирование и/или абсорбция является формой связывания.

В различных вариантах осуществления композиции изобретения, описанные здесь, могут содержать определенные адъюванты, в дополнение к иммуностимулирующим выделенным нуклеиновым кислотам изобретения, в результате добавления в ту же самую среду для лекарства или систему доставки. Указанные адъюванты могут включать, но без ограничения, минеральные соли, такие как квасцы, квасцы в сочетании с монофосфорил-липидом (МРЬ) А энтеробактерий, таких как ЕксЬеЬсЫа сой, 8а1топе11а М1ппеко!а, 8а1топе11а 1урЫтигшт, или 8Ы§е11а Лехпеп или в особенности с МРЬ® (А804), МРЬ А упомянутых выше бактерий в отдельности, сапонины, такие как 08-21. 0ш1-А. 18СОМк, 18СОМАТК1Х™, эмульсии, такие как МР59™, Мойатбе®18А 51 и 18А 720, А802 (0821+сквален+МРЬ®), липосомы и препараты липосом, такие как А801, синтезированные или специально приготовленные микрочастицы и микроносители, такие как везикулы из внешней мембраны бактерий (ОМУ) Ν. допоггЬеае, СЬ1атуб1а !гасЬотаЬк, и других, или частицы хитозана, депо-агенты, такие как блок-сополимеры Р1иготс®, специфически модифицированные или изготовленные пептиды, такие как мурамилдипептид, аминоалкилглюкозаминид 4фосфаты, такие как КС529, или белки, такие как бактериальные токсоиды или фрагменты токсинов. Дозы указанных других адъювантов можно установить с помощью общепринятых исследований с целью определения оптимальной дозы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции изобретения, описанные здесь, могут быть объединены с антигеном. Такой антиген может отличаться или быть сходным или идентичным с антигенами, связанными с наноносителем (с адъювантом или без него, с применением или без применения другого средства доставки), может быть введен отдельно в другой момент времени и/или в другую область организма и/или с помощью другого пути иммунизации или с композицией, содержащей другой антиген и/или адъювант, вводимой отдельно, в другой момент времени и/или в другую область организма и/или с помощью другого пути иммунизации.

Композиции изобретения можно создать с применением общепринятых технологий традиционного фармацевтического производства и создания композиций для введения в удобных лекарственных формах. Технологии, подходящие для осуществления на практике настоящего изобретения, можно найти в руководстве НапбЬоок о£ 1пби5Ьта1 М1хшд: 8с1епсе апб РгасЬсе, Ебйеб Ьу Еб\\агб Ь. Раи1, Ук!ог А. АЬето-ОЬепд, апб 8иζаиие М. Кгек!а, 2004 1оЬп Абеу & 8опк, 1пс.; апб РЬаттасеиЬск: ТЬе 8с1епсе о£ Эокаде Рогт Пек1дп, 2^пб Еб. Ебйеб Ьу М. Е. Аи!еп, 2001, СЬигсЬЫ Ыутдк!опе. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции изобретения создают в стерильном физиологическом растворе для инъекций вместе с консервантом.

Следует понимать, что композиции изобретения могут быть получены любым подходящим способом, и изобретение никоим образом не ограничивается композициями, которые могут быть созданы с применением способов, описанных здесь. Выбор подходящего способа может потребовать внимания к характеристикам конкретных материалов и веществ, которые применяются.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции изобретения производят в стерильных условиях или стерилизуют на конечном этапе получения. При этом можно гарантировать, что получаемые композиции являются стерильными и неинфекционными, увеличивая, таким образом, безопасность по сравнению с нестерильными композициями. Стерилизация обеспечивает важные меры безопасности, особенно если субъекты, получающие композиции изобретения, имеют дефекты иммунной системы, страдают от инфекции, и/или восприимчивы к инфекции. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции изобретения можно лиофилизировать и хранить в суспензии или в виде лиофилизированного порошка в зависимости от стратегии разработки композиции в течение продолжительных периодов времени без потери активности.

Композиции изобретения, описанные здесь, могут быть введены различными путями, включая, но без ограничения подкожный, внутримышечный, внутрикожный, пероральный, интраназальный, трансмукозальный, сублингвальный, ректальный, глазной, трансдермальный, чрескожный или с помощью комбинации указанных путей введения.

Количество перечисленных нуклеиновых кислот, представленных в лекарственные формах изобретения, может меняться в соответствии со свойствами перечисленных нуклеиновых кислот, терапевтическим эффектом, который нужно достичь, и другими определенными параметрами. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут быть проведены исследования по выбору диапазона доз для опре- 20 030096

деления оптимального терапевтического количества перечисленных нуклеиновых кислот, и количества различных антигенов, которые могут быть представлены в композициях изобретения. В различных вариантах осуществления перечисленные нуклеиновые кислоты представлены в композиции в количестве, достаточном для создания иммунного ответа к перечисленным нуклеиновым кислотам после введения субъекту.

Возможно определение количеств перечисленных нуклеиновых кислот, достаточных для создания иммунного ответа, с использованием общепринятых исследований и методик с целью определения оптимальной дозы у субъектов. Композиции изобретения можно вводить с различной частотой. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно введение композиции изобретения является достаточным для образования фармакологически значимого ответа. В более предпочтительном варианте осуществления используют по меньшей мере два введения, по меньшей мере три введения или по меньшей мере четыре введения композиции изобретения, чтобы обеспечить фармакологически значимый ответ.

Композиции и способы, описанные здесь, можно применять для индукции, усиления, модулирования, нацеливания или переориентации иммунного ответа. Композиции и способы, описанные здесь, можно использовать в диагностике, профилактике и/или лечении состояний, таких как рак, инфекционные заболевания, болезни обмена веществ, дегенеративные заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, иммунологические заболевания или другие нарушения и/или состояния. Композиции и способы, описанные здесь, также могут быть использованы для профилактики или лечения зависимости, такой как зависимость от никотина или наркотика. Композиции и способы, описанные здесь, также могут быть использованы для профилактики и/или лечения состояния, обусловленного воздействием токсина, вредного вещества, токсина окружающей среды или другого вредного вещества.

Примеры

Пример 1. Нуклеиновые кислоты

Существует три типа молекул СрО-нуклеиновых кислот (типы А, В и С). СрО-нуклеиновые кислоты типа А являются сильными индукторами ΓΡΝ-α. СрО-нуклеиновые кислоты типа В являются сильными активаторами В-клеток, и вызывают экспрессию ^-6, но являются слабыми индукторами ΓΡΝ-α. СрО-нуклеиновые кислоты типа С обладают характеристиками СрО-нуклеиновых кислот типа А и типа В. СрО-нуклеиновые кислоты типа С вызывают экспрессию ^-6 и вызывают экспрессию ΣΡΝ-α. ΣΡΝ-α активирует АРС и запускает В-клеточную активацию и дифференцировку. СрО-нуклеиновые кислоты типа С также стимулируют плазмацитоидные дендритные клетки, которые усиливают развитие В-клеток и плазматических клеток. Характеристики молекул СрО-нуклеиновых кислот типа С, таким образом, позволяют потенциально считать их лучшим адъювантом по сравнению с типами А и В.

8е1ес!а-7, иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту, характеризующуюся нуклеотидной последовательностью

5'-ТССТССААССТТССССААССТТСС-3' [5Е<2 Ю N0:1] и обладающую фосфоротиоатным скелетом, конструировали с наличием характеристик молекул

СрО-нуклеиновых кислот типа С и синтезировали с применением стандартных методик синтеза олигомеров (Веаисаде, δ.; йег, К. (1992). Тейайебгоп 48: 2223. бог 10.1016/80040-4020(01)88752-4; Вготеп, Ό. М. А Ь[^ 1и81огу оί ойдопис1еойбе 8уп1Не818. Ме11юб8 ш Мо1еси1аг Вю1оду (ТоЮтеа, М, Ипйеб 31а1е8) (1993), 20 (Рго1осо18 йг Ойдопис1еойбе8 апб Апа1од8), 1-17; Кее8е, Сойп В. (2005). "ОПдо- апб ро1упис1еойбе8: 50 уеаг8 оί сЬетюа1 8уп1Пе818". Огдатс & Вюто1еси1аг СЬет18йу 3: 3851. бог 10.1039/Ь510458к; [уег, К. Р.; Веаисаде, 8. Ь. 7.05. ОПдопис1еоПбе 8упИе818. Ш: СотргеПешйе Йа1ига1 Ргобис!8 СПет181гу, Уо1. 7: ЭЙА апб А8рес!8 оί Мо1еси1аг Вю1оду. Коо1, Епс Т.; Ебйог. №ΐ1ι. (1999), 733 рр. РиЬ118Йег: (Е18еу1ег, Ат8!егбат, №Πι.), 105-152).

8е1ес!а-7 сравнивали с ранее известными иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами 7 90 9 с фосфоротиоатным скелетом (тип В - см., например, Соорег е! а1. (2004) 1 С1ийса1 Iттиηо1о§у 24(6): 693-701) и 2395 (тип С - см. описание выше) в отношение их способности индуцировать экспрессию ΣΡΝα, ЕР-10 и ^-6 с помощью метода ЕЫ8А (фиг. 1А-Ш). Мононуклеарные клетки периферической крови человека выделяли и культивировали в присутствии или в отсутствие СрО. Через 24 ч супернатанты собирали и оценивали с помощью ЕЫЗА. Все тестируемые СрО обеспечивали возможность активации экспрессии ^-6 (фиг. 1В, 1Ό). Однако СрО 7909 типа В не увеличивала экспрессию ШЫ-а (фиг. 1А), или ТР-10 (фиг. 1С), тогда как 8е1ес1а-7 и 2395 увеличивали экспрессию ШИ-а (фиг. 1А, 1С). В целом, результаты позволяют предположить, что 8е1ес!а-7 является новой СрО нуклеиновой кислотой типа С.

Молекулы СрО-нуклеиновых кислот стимулируют клетки через ТЬК9, тогда как малая молекула агонист К848 передает сигнал с помощью ТЬК 7 и 8. Поскольку ТЬК 7 и 9 экспрессируются на плазмацитоидных дендритных клетках, тогда как ТЬК8 экспрессируется на миелоидных дендритных клетках, ответ при сравнении К848 (Ке81цштоб) и 8е1ес1а-7 должен отличаться. Для проверки данного предположения мононуклеарные клетки периферической крови человека выделяли и культивировали в присутствии или в отсутствие К848 или 8е1ес1а-7. Через 24 ч супернатанты собирали и оценивали с помощью множественного анализа определения цитокинов и хемокинов. Аналиты представляли собой цитокины:

- 21 030096

1Ь-6, ΤΝΡ-α, 1Ь-13, ΙΡ-10, ГО-2, 1Ь-13, ΙΡΝγ, 1Ь-12р40, 1Ь23, 1Ь-5, ΙΡ-10, ΚΑΝΚΡ, 1Ь-4; и хемокины: МЭС, ΚΑΝΤΕ8, ΙΡ-10, и Μίρ1α. Результаты показывают дифференциальный ответ при сравнении К848 и 8е1ес1а-7. К848 является сильным индуктором провоспалительных цитокинов, таких как 1Ь-6, ΜΙΡ-1α, ΚΑΝΤΕ8, ΙΡΝγ, ΙΠ-1β, 1Ь-12р40, ΤΝΡ-α, и 1Ь-23, тогда как 8е1ес1а-7 являлся сильным индуктором ΙΡΝ-α, ΙΡ-10 и ΙΡ-5 (фиг. 2). Результаты показывают, что К848 и 8е1ес1а-7 обладают по существу различным клеточным ответом с различными профилями цитокинов стимулированных РВМС.

Пример 2. Синтетические наноносители связанные с нуклеиновыми кислотами

Композицию изобретения, содержащую синтетические наноносители, которые содержат указанную иммуностимулирующую выделенную нуклеиновую кислоту 8е1ес1а-7, получают следующим образом: 8е1ес1а-7, новую иммуностимулирующую выделенную одноцепочечную нуклеиновую кислоту, характеризующуюся деоксирибонуклеотидной последовательностью:

5'-ТССТССААССТТССССААССТТСС-3' [5Е0 Ю N0:1] с противоионом натрия приобретают в О1що РасЮгу (Ηοΐΐίδΐοη, ΜΑ).

ΡΡΟΑ с содержанием 76% лактида и 24% гликолида и с характеристической вязкостью 0,49 дл/г приобретают в 8итМоДю5 Ρ1ι;·ιπη;·^ιιΐΕ;·ιΐ5 (ВиштдЬаш, АЬ; ΡιΜιιΠ СоДе 7525 ΌΡΟ 5Α.) Блок-сополимер ΡΡΑ-ΡΕΟ, состоящий из блока ΡΕΟ приблизительно 5000 Да и блока ΡΡΑ приблизительно 20000 Да, приобретают в 8е1ес1а Вю5аепсе5 (\Уа1ег1о\уп МА). Поливиниловый спирт (Мте=11000-31000, гидролизованный на 87-89%) приобретают в ΤΤ. Вакег (БаП ШтЬег И232-08).

Растворы готовят следующим образом.

Раствор 1: иммуностимулирующей выделенной нуклеиновой кислоты |8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:1] в концентрации 100 мг/мл готовят в очищенной воде.

Раствор 2: 0,49-Ιν 7525 ΡΡΟΑ при 75 мг/мл и ΡΡΑ-ΡΕΟ при 25 мг/мл в дихлорметане. Раствор получают путем приготовления вначале двух отдельных растворов при комнатной температуре: 0.49-Ιν 7525 ΡΡΟΑ при 100 мг/мл в чистом дихлорметане и ΡΡΑ-ΡΕΟ при 100 мг/мл в чистом дихлорметане. Конечный раствор получают путем добавления 3 частей раствора ΡΡΟΑ к каждой части раствора ΡΡΑ-ΡΕΟ.

Раствор 3: поливиниловый спирт при 50 мг/мл в 100 мМ рН 8 фосфатном буфере.

Раствор 4: 70 мМ фосфатный буфер, рН 8

Первичную эмульсию (^1/0) вначале создавали с применением раствора 1 и раствора 2.

Раствор 1 (0,1 мл) и раствор 2 (1,0 мл) объединяли в небольшой стеклянной трубке для работы в условиях высокого давления и диспергировали с помощью ультразвука при 50% амплитуде в течение 40 с с использованием ультразвукового дезинтегратора Вгап5оп Όί§ίΙ;·ι1 8ошйет 250.

Затем получали вторичную эмульсию (^1/0/^2) путем добавления раствора 3 (3,0 мл) к первичной эмульсии и обработки ультразвуком при 30% амплитуде в течение 60 с с использованием ультразвукового дезинтегратора Вгап5оп П1дйа1 8ошйет 250.

Вторичную эмульсию добавляли в лабораторный химический стакан, содержащий 70 мМ фосфатный буфер раствор (30 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы обеспечить выпаривание дихлорметана и образование наноносителей в суспензии. Часть суспендированных наноносителей отмывали путем переноса суспензии наноносителей в центрифужную пробирку, центрифугирования со скоростью 21000 тс! в течение 45 мин, удаления супернатанта и ресуспендирования осадка в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Указанную процедуру отмывки повторяли и затем осадок повторно суспендировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе для получения конечной суспензии наноносителя с номинальной концентрацией 10 мг/мл в расчете на полимер.

Количество олигонуклеотида в наноносителе определяли с помощью анализа ОФ ВЭЖХ. Общую массу сухого наноносителя на мл суспензии определяли гравиметрическим методом. Конечная концентрация наноносителей достигается путем разведения до 5 мг/мл дополнительным количеством забуференного фосфатом физиологического раствора.

Пример 3. Белковые носители с ковалентно связанными нуклеиновыми кислотами

Нуклеиновую кислоту, модифицированную сульфгидрильными группами, с фосфоротиоатным скелетом с последовательностью 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 получают твердофазным синтезом. Овальбумин (ΟνΑ, яичный альбумин, категория V от 8щта (8ΐ. Ьош5, МО)) активируют 20-кратным молярным избытком сложного эфира ш-малеимидобензоил-Мгидроксисульфосукцинимида (5и1!о-МВ8, Е1егсе) в 5-мМ буфере ΕΌΤΑ-ΡΒ8 рН 7,0 в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Аминогруппы остатков Ь-лизина в ΟνΑ модифицируют малеимидными группами. Несвязанный сульфо-МВ8 удаляют хроматографически на колонке Вю-Бсопо Ρ6 де1 (Вю-КаД, МишсЬ, Οе^шаηу). Модифицированную нуклеиновую кислоту, содержащую сульфгидрильные группы, с последовательностью 8ΕΟ ГО ΝΟ: 1 затем восстанавливают в 50 мМ растворе 1,4-дитиотреитол-ΡВ8 при комнатной температуре в течение 2 ч, и оставшиеся реагенты удаляют с помощью хроматографии на колонке Вю-Ьсопо Ρ6 де1.

Полученную нуклеиновую кислоту затем инкубируют с модифицированным ΟνΑ в молярном отношении 5:1 в течение 3 ч при комнатной температуре и Ь-цистеин затем добавляют для блокирования реактивных малеимидных групп. Несвязанную нуклеиновую кислоту удаляют с помощью диализа против ΡВ8 (МХУСЮ 10000, Ь|егсе). Диализированный продукт обессоливают с помощью хроматографии на

- 22 030096

колонке для обессоливания ΡΌ-10, с последующей лиофилизацией. Полученные конъюгаты нуклеиновой кислоты-Оуа анализируют с помощью 6-20% градиента δΌδ-РАСЕ (окрашивание серебром) и 4-15% градиента в неденатурирующих невосстанавливающих условиях РАСЕ (бромид этидия). Концентрацию белка определяют по методу Лоури (Р1егсе).

Пример 4. Нуклеиновые кислоты

Дополнительные иммуностимулирующие выделенные нуклеиновые кислоты, которые содержат следующие последовательности, синтезируют с применением общеупотребительных технологий твердофазного синтеза. Скелеты последовательностей представляют собой фосфодиэфирные скелеты.

5’ - ТССТССААССТТССССААССТТССААССТТ - 3’ [δΕζ> ГО N0:2]

5’ - ТСОТСОААСОТТСОСОААСОТТСОААСОТТААСОТТ - 3’ [δΕζ> ГО N0:3]

5’ - ТСОТСОААСОТТСОСОААСОТТСОТСОТСОААСОТТСОСОААСОТТСО - 3’

[8Е<2 ГО N0:4]

5’ - ТСОТСОААСОТТСОСОААСОТТСОТТСОАА- 3’ [δΕζ> ГО N0:5]

5’ - ТСОТСОААСОТТСОСОААСОТТСООАСОТС - 3’ [δΕζ> ГО N0:6]

5’ - ТСОТСОААСОТТСОСОААСОТТСОАТСОАТ - 3’ [8Е<3 ГО N0:7]

Приведенные выше последовательности также синтезировали с фосфоротиоатными скелетами для стабилизации ДНК. Любую из приведенных выше последовательностей объединяют с вспомогательным веществом (веществами) для создания композиции изобретения.

Пример 5. Получение наноносителей с нуклеиновыми кислотами Композицию, включающую синтетические наноносители, которые содержат раскрытую иммуностимулирующую выделенную нуклеиновую кислоту, получали следующим образом:

8е1ес1а-7, новую иммуностимулирующую выделенную одноцепочечную нуклеиновую кислоту, характеризующуюся дезоксинуклеотидной последовательностью

5'-ТССТССААССТТССССААССТТСС-З' [5Е0 ΙΌ N0: 1]

приобретали в Ойдо Рас1огу (Ηοΐΐΐδΐοη, МА.)

Растворы готовили следующим образом:

Раствор 1: иммуностимулирующая выделенная нуклеиновая кислота с 8ЕО ГО N0: 1 в концентрации 40 мг/мл в 150 мМ КС1.

Раствор 2: 0,50 мл 7525 РЬСА (Ьакезйоге Вюта1епа15) при 100 мг/мл, 0,25 мл 5050 РЬСА (Ьакезйоге Вюта1епа15) при 100 мг/мл, и 0,25 мл РЬА-РЕО-никотин (8е1ес1а Вюзшепсез) при 100 мг/мл в дихлорметане.

Раствор 3: поливиниловый спирт (Ьакезйоге Вюта1епа1з) при 5% в 100 мМ рН 8 фосфатном буфере.

Раствор 4: 70 мМ фосфатный буфер, рН 8

Первичную эмульсию вначале создавали с применением раствора 1 и раствора 2. Раствор 1

(0,25 мл) и раствор 2 (1,0 мл) объединяли в небольшой стеклянной трубке для работы в условиях высокого давления и диспергировали с помощью ультразвука при 50% амплитуде в течение 40 с с использованием ультразвукового дезинтегратора Вгапзоп Ι)ίμίΗι1 8ошйег 250.

Затем получали вторичную эмульсию (Ж/0Ж2) путем добавления раствора 3 (3,0 мл) к первичной эмульсии и обработки ультразвуком при 30% амплитуде в течение 60 с с использованием ультразвукового дезинтегратора Вгапзоп 1ЛдПа1 8ошйег 250.

Вторичную эмульсию добавляли в лабораторный химический стакан, содержащий 70 мМ фосфатный буфер раствор (30 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы обеспечить выпаривание дихлорметана и образование наноносителей в суспензии. Часть суспендированных наноносителей отмывали путем переноса суспензии наноносителей в центрифужную пробирку, центрифугирования со скоростью 21000 гс£ в течение 45 мин, удаления супернатанта и ресуспендирования осадка в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Указанную процедуру отмывки повторяли и затем осадок повторно суспендировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе для получения конечной суспензии наноносителя с номинальной концентрацией 8,1 мг/мл в расчете на полимер.

Наночастицы, содержащие нуклеиновые кислоты, смешивали с наночастицами, содержащими пептид, распознаваемый хелперными Т-клетками (ТСНР; 8ЕР ГО N0: 13 в патенте США 2011/0110965) изготовленными следующим образом:

Растворы получали, как указано ниже

Раствор 1: ТСНР (Васйет) в концентрации 30 мг/мл получали в 60% об./об. растворе молочной кислоты.

- 23 030096

Раствор 2: 0,75 мл ΡΕΑ (ЬакекЬоге ВютаЮпай) при 100 мг/мл и 0,25 мл ΡΕΑ-ΡΕΟ-никотин (8с1сс1а В1о5с1спсс5) при 100 мг/мл в дихлорметане.

Раствор 3: Поливиниловый спирт ЦТ Ваксг) при 5% в 100 мМ фосфатном буфере рН8.

Раствор 4: 70 мМ фосфатный буфер, рН 8

Первичную эмульсию (А1/0) сначала получали с применением раствора 1 и раствора 2. Раствор 1 (0,25 мл) и раствор 2 (1,0 мл) объединяли в небольшой стеклянной трубке для работы в условиях высокого давления и диспергировали с помощью ультразвука при 50% амплитуде в течение 40 с с использованием ультразвукового дезинтегратора Вгапзоп ОщПа1 8ошйсг 250.

Затем получали вторичную эмульсию (А1/0/А2) путем добавления раствора 3 (3,0 мл) к первичной эмульсии и диспергирования с помощью ультразвука при 30% амплитуде в течение 60 с с использованием ультразвукового дезинтегратора Вгапзоп Όίβίΐηΐ 8ошйсг 250.

Вторичную эмульсию добавляли лабораторный химический стакан, содержащий 70 мМ фосфатный буферный раствор (30 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы обеспечить выпаривание дихлорметана и образование наноносителей в суспензии. Часть суспендированных наноносителей отмывали путем переноса суспензии наноносителей в центрифужную пробирку, центрифугирования со скоростью 21000 гсГ в течение 45 мин, удаления супернатанта и ресуспендирования осадка в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Указанную процедуру отмывки повторяли и затем осадок повторно суспендировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе для получения конечной суспензии наноносителя с номинальной концентрацией 8,1 мг/мл в расчете на полимер.

Две суспензии наночастиц, в количестве 8,1 мг/мл каждая, смешивали 1:1 с образованием смеси синтетических наноносителей (ΝΡ-7) для дальнейших исследований.

Пример 6. Нуклеиновые кислоты увеличивают гуморальный иммунный ответ ш νί\Ό

Иммунизацию смесью ΝΡ никотина, содержащими 8с1сс1а-7 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1), смесь синтетических наноносителей ΝΡ-7, которую получали в Примере 5, сравнивали с иммунизацией со сходной смесью ΝΡ никотина, которая не содержала адъювант (№[№С,0,0 ]+ΝΡ[ΝΙΟ0,8-320]). Мышей иммунизировали подкожно в дни 0, 14, и 28 100 мкг ΝΡ-7 или контрольными ΝΡ ΝΡ[ΝΙΟ0,0]+ΝΡ[ΝΙΟ0,8-320]. В случае каждой дозы иммунизации, ΝΡ-7 содержали 7,4 мкг 8с1сс1а-7. Сывороточные титры антител к никотину измеряли методом ЕЫ8А на 26-й день (фиг. 3). Добавление ΝΡ никотина, содержащего 8с1сс1а-7, усиливало опосредованный антителами ответ на никотин в 25 раз. Таким образом, раскрытые нуклеиновые кислоты активны ш νί\Ό и ΝΡ-7, содержащие 8с1сс1а-7, вызывали сильный гуморальный иммунный ответ против никотина у мышей.

Пример 7. Наночастицы, содержащие нуклеиновые кислоты, вызывают гуморальный иммунный ответ у приматов

Смесь ΝΡ никотина, содержащих 8с1сс1а-7 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 1, ΝΡ-7), приготовленную в Примере 5, вводили приматам для изучения индукции гуморальных иммунных ответов. Животные получали всего три вакцинации с 4-недельным интервалом между инъекциями ΝΡ-7 (см. подробный график ниже). Во время каждой процедуры животные находились под наркозом, 10 мг/кг кетамин-НС1, который вводили внутримышечно. Тестируемое вещество в количестве 1 мл вводили подкожным путем. Кратко, кожу в области четырехглавой мышцы брили, протирали спиртом и давали высохнуть. Затем вводили иммунизирующий материал с помощью иглы с размером 23, длиной 2,54 см. Проводили мониторинг состояния животных и возвращали их в клетки, когда они просыпались. Животных взвешивали, когда они находились под наркозом, при каждой процедуре. Образцы крови и 5 мл сыворотки (используемые для анализа антител) получали приблизительно с двухнедельными интервалами по следующей схеме:

Забор крови до иммунизации: день 14

Первая вакцинация: день 0

Забор крови из вены: день 14

Вторая вакцинация: день 28

Забор крови из вены: день 42

Третья вакцинация: день 56

Забор крови из вены: день 70

Забор крови из вены: день 84

Образцы сыворотки делили на аликвоты, хранили при -20°С, и оценивали с целью определения антител против никотина и против носителя с помощью метода ЕЫ8А. Для измерения антиникотиновых антител 9б-луночные планшеты для проведения ЕЫ8А покрывали полилизин-никотином и инкубировали в течение ночи при 4°С. Для измерения антител против носителя 96-луночные планшеты для проведения ЕЫ8А покрывали либо полилизинФЕО в разведении 1:100, либо базовые наночастицы в разведении 1:1000 (такая же композиция, которую использовали для инъекций за исключением того, что базовые наночастицы не содержат никотин) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывали и блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре 10% раствором РВ8 в ΡΕ8. Планшеты отмывали и добавляли образцы сыворотки в верхний ряд планшетов для проведения ЕЫ8А и разводили в 10% растворе РВ8 в ΡΕ8 3-кратно в направлении нижнего ряда планшета. Моноклональное мышиное антинико- 24 030096

тиновое антитело использовали в качестве стандартного положительного контроля в двух вертикальных рядах каждого планшета, в случае планшетов, покрытых полилизин-никотином. В случае планшетов, покрытых полилизин-РЕО и базовой наночастицы, моноклональное кроличье антитело аий-РЕО использовали в качестве положительного контроля. В качестве отрицательных контролей использовали изотипические контрольные антитела или сыворотку неиммунизированных животных. После добавления образца сыворотки планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты отмывали и биотинилированные противообезьяньи 1дО добавляли в планшеты. В качестве стандартов при определении мышиных антител, биотинилированный козий антимышиный 1д (общий) добавляли в планшеты. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, отмывали, и стрептавидин-пероксидазу хрена (8Л-НРР) добавляли в планшеты. После 30 с инкубации при комнатной температуре, планшеты отмывали и добавляли субстрат ТМВ. Планшеты инкубировали в темноте в течение 15 с при комнатной температуре, добавляли стоп-реагент (2Ν Н₂§0₄) в планшеты, и показатели ΘΌ при 450 и 570 нм получали с применением спектрофотометра для прочтения планшетов. Полумаксимальную эффективную концентрацию (ЕС₅₀) антител против никотина рассчитывают для каждого образца на основе логистической кривой, полученной путем четырехпараметрического приближения.

Показатели аффинности сывороточных антител к никотину определяли с помощью тестов равновесного диализа с применением ³Н-меченого никотина. Значения Кй (аффинность антитела) и Втах (концентрация) определяли на основе кривой насыщения свободного и связанного лигандов.

Измерения аффинности у обезьян проводили на 70-й день, через 14 дней после второй бустерной инъекции.

ΝΡ-7 (0,9-8,1 мг) вызывал продукцию антител против никотина в зависимости от дозы. Значительные титры (50000-150000) сохранялись у животных, иммунизированных ΝΡ-7 тремя наиболее высокими дозами, по меньшей мере в течение 2 месяцев после последней бустерной инъекции. Гуморальный иммунный ответ на ΝΡ-7 являлся дозозависимым в течение эксперимента (фиг. 4). Результаты показывают, что ΝΡ-7, содержащий 8с1сс1а-7 в качестве адъюванта, способен вызывать сильный дозозависимый гуморальный иммунный ответ у приматов.

Другие варианты осуществления изобретения

Описаны некоторые варианты осуществления изобретения. Однако следует понимать, что могут быть проведены различные модификации без отступления от существа и объема настоящего изобретения. Таким образом, другие варианты осуществления входят в объем следующих пунктов формулы изобретения.

- 25 030096

Список последовательностей

<110> 8е1есДа Вхозстепсез, 1пс.

СПОСОБЫ, КОМПОЗИЦИИ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ГУМОРАЛЬНОГО ^<12о> ИММУННОГО ОТВЕТА <130> 27454-0005К01

<140> РСТ/и52011/061056

<141> 2011-11-16

<150> из 61/414,194

<151> 2010-11-16

<160> 8

<170> КазДЗЕО для ИтпДоиз, версия 4.0

<210> 1

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 1

СсдЬсдаасд ЬТсдсдаасд ТТсд 24

<210> 2

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 2

СсдЬсдаасд СЪсдсдаасд ЕСсдаасдЕС 30

<210> 3

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 3

ЬсдЕсдаасд ЕЕсдсдаасд ССсдаасдСС аасдЕЕ 36

<210> 4

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 4

ЕсдСсдаасд ЬЪсдсдаасд ДДсдТсдДсд аасдЬТсдсд аасдЫзсд 48

<210> 5

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 5

ТсдДсдаасд ЬСсдсдаасд ЬЬсдЪЪсдаа 30

<210> 6

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 6

ЬсдЕсдаасд ЬЬсдсдаасд ЬЕсддасдСс 30

<210> 7

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 7

ЬсдДсдаасд ЬЬсдсдаасд еЬсдаДсдай 30

<210> 8

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 8

ДсдДсдДДДЬ сддсдсдсдс сд 22

- 26 030096

Claims (27)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Композиция для стимуляции гуморального иммунного ответа и/или увеличения продукции у субъекта по меньшей мере одного цитокина, выбранного из интерферона-альфа, интерферона-гамма, индуцируемого интерфероном-гамма белка-10 (ΙΡ-10), интерлейкина-5 (1Ь-5), интерлейкина-6 (1Ь-6), хемокина макрофагального происхождения (МИС), макрофагального воспалительного белка 1 альфа (ΜΙΡ1α), фактора некроза опухоли альфа (ΤΝΡα), интерлейкина-1 бета (ΙΗ-1β), интерлейкина-10 (ГО-10), интерлейкина-23 (1Б-23), интерлейкина-4 (1Ь-4) и хемокина, выделяемого Т-клетками при активации (ΚΑΝΤΕ8), причем композиция содержит

   выделенную нуклеиновую кислоту, включающую последовательность 5'ТСОТСОААСОТТСОСОААСОТТСО-3' |81Т) ГО Ш: 1], в которой С не метилирован; и

   фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
2. 2. Композиция по п.1, в которой выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит модифицированное основание, модифицированный сахар или модифицированную фосфодиэфирную связь.
3. 3. Композиция по п.2, в которой модифицированная фосфодиэфирная связь представляет собой фосфотиоатную связь.
4. 4. Композиция по п.1, дополнительно содержащая В-клеточный антиген или Т-клеточный антиген.
5. 5. Композиция по п.4, содержащая Т-клеточный антиген.
6. 6. Композиция по п.5, в которой Т-клеточный антиген включает антиген, распознаваемый хелперной Т-клеткой.
7. 7. Композиция по п.4, содержащая В-клеточный антиген.
8. 8. Композиция по п.1, в которой выделенная нуклеиновая кислота связана с носителем.
9. 9. Композиция по п.8, в которой носитель представляет собой белковый носитель.
10. 10. Композиция по п.8, в которой носитель представляет собой синтетический наноноситель.
11. 11. Композиция по п.10, в которой синтетический наноноситель дополнительно связан с Вклеточным или Т-клеточным антигеном.
12. 12. Композиция по п.10, содержащая дополнительный синтетический наноноситель, не связанный с выделенной нуклеиновой кислотой.
13. 13. Композиция по п.12, в которой дополнительный синтетический наноноситель связан с Вклеточным или Т-клеточным антигеном.
14. 14. Композиция по п.13, в которой Т-клеточный антиген включает антиген, распознаваемый хелперной Т-клеткой.
15. 15. Композиция по п.1, в которой выделенная нуклеиновая кислота не содержит модифицированное основание, модифицированный сахар или модифицированную фосфодиэфирную связь.
16. 16. Композиция по п.1, в которой выделенная нуклеиновая кислота состоит из последовательности 81Т) ΙΌ Ш: 1.
17. 17. Композиция по п.1, в которой выделенная нуклеиновая кислота содержит от 24 до 100 нуклеотидов.
18. 18. Композиция по п.17, в которой выделенная нуклеиновая кислота содержит от 24 до 50 нуклеотидов.
19. 19. Способ индукции продукции ГО-6 у субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп.1-18 в количестве, достаточном для индукции продукции ГО-6 у субъекта.
20. 20. Способ индукции продукции интерферона-альфа у субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп.1-18 в количестве, достаточном для индукции продукции интерферонаальфа у субъекта.
21. 21. Способ индукции продукции ΙΡ-10 у субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп.1-18 в количестве, достаточном для индукции продукции ΙΡ-10 у субъекта.
22. 22. Способ индукции гуморального иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп.1-18.
23. 23. Вакцина, включающая композицию по любому из пп.1-18.
24. 24. Выделенная нуклеиновая кислота для стимуляции гуморального иммунного ответа и/или увеличения продукции у субъекта по меньшей мере одного цитокина, выбранного из интерферона-альфа, интерферона-гамма, индуцируемого интерфероном-гамма белка-10 (ΙΡ-10), интерлейкина-5 (ГО-5), интерлейкина-6 (ГО-6), хемокина макрофагального происхождения (МИС), макрофагального воспалительного белка 1 альфа (ΜΙΡ1α), фактора некроза опухоли альфа (ТОТа), интерлейкина-1 бета (ΙΠ-1β), интерлейкина-10 (ГО-10), интерлейкина-23 (ГО-23), интерлейкина-4 (ГО-4) и хемокина, выделяемого Т-клетками при активации (КАКТЕ8), где нуклеиновая кислота содержит последовательность 8Εβ ГО NΟ: 1, в которой С не метилирован.
25. 25. Выделенная нуклеиновая кислота для стимуляции гуморального иммунного ответа и/или увеличения продукции у субъекта по меньшей мере одного цитокина, выбранного из интерферона-альфа, интерферона-гамма, индуцируемого интерфероном-гамма белка-10 (ΙΡ-10), интерлейкина-5 (ГО-5), интерлейкина-6 (ГО-6), хемокина макрофагального происхождения (МИС), макрофагального воспалительного

    - 27 030096

    белка 1 альфа (ΜΙΡ1α), фактора некроза опухоли альфа (ΤΝΡα), интерлейкина-1 бета (1Б-1 β), интерлейкина-10 (1Б-10), интерлейкина-23 (1Б-23), интерлейкина-4 ^Ш-4) и хемокина, выделяемого Т-клетками при активации (ΚΆΝΤΕ5), где нуклеиновая кислота состоит из последовательности 8НО II) ΝΟ: 1, в которой С не метилирован.
26. 26. Способ индукции у субъекта гуморального иммунного ответа против В-клеточного или Тклеточного антигена, включающий введение субъекту композиции по п.4 в количестве, достаточном для индукции гуморального иммунного ответа против В-клеточного антигена или Т-клеточного антигена.
27. 27. Применение композиции по п.4 для индукции у субъекта гуморального иммунного ответа против В-клеточного антигена или Т-клеточного антигена.

    ΙΡΝ-α (пг/мл)

    1.8 ι-

    7909 2395 Зе1ес1а 7 N3